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課題

クロストリジウムパーフリンゲンスの産生する未知毒素、及び、この毒素及び/又はそのトキソイドを用いたクロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌用ワクチン及び毒素を指標とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出方法の提供。

解決手段

未知の毒素として、クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌MC18株培養液濃縮液から得られたマウスに対する未知の致死成分を精製して大腸菌に組み込み、発現蛋白を毒素のモノクローナルで特定した特定なアミノ酸配列からなるタンパク質

概要

背景

クロストリジウムパーフリンゲンス芽胞形成偏性嫌気性グラム陽性桿菌で、α、β、ε及びι毒素の4種の毒素の産生パターンでA、B、C、D及びEの5つの型に分けられる。この中でC型菌は子、子、子に対して出血性腸炎毒血症を引き起こし、動物死亡させることもある(非特許文献1、2を参照。)。

これまでクロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌のワクチンには、β毒素を主体とする毒素をホルマリン無毒化した免疫原性誘導体トキソイド)が用いられてきた(非特許文献3などを参照。)。β毒素以外ではA型菌においてα毒素の特定なアミノ酸からなるペプチドをヒト又は動物に投与感染防御免疫応答を誘発するワクチン組成物報告がある(特許文献1を参照。)。一般にホルマリンによる無毒化は蛋白変性によって免疫原性の低下が避けられず、β毒素においても顕著に影響を受けるとされているが、これを回避するためにクロストリジウム・パーフリンゲンスの非毒性変異株及びその断片を用いるワクチンが報告されている(特許文献2を参照。)。またクロストリジウムワクチン投与の副作用軽減するためアジュバントサポニン使用した2種以上のクロストリジウムバクテリンまたはトキソイドからなる多成分系ワクチンが報告されている(特許文献3を参照。)。しかしながら、これら報告には、クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生する新規な毒素に関する記載はない。

特許第3370672号公報
特表平8−510206号公報
特開平11−103872号公報
J.Clin.Microbiol.1997.35:p228−232
Vet.Microbiol.2001.82:p1−9
ヨーロッパ薬局方1997
J.Bacteriol.1992.174:p6707−6710
Infect.Immun.2000.68:p6378−6383
J.Biol.Chem.1997.272:p11074−11078
J.Biol.Chem.2000.275:p13228−13234
J.Biol.Chem.2004.279:p49876−49882

概要

クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生する未知の毒素、及び、この毒素及び/又はそのトキソイドを用いたクロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌用ワクチン及び毒素を指標とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出方法の提供。未知の毒素として、クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌MC18株培養液濃縮液から得られたマウスに対する未知の致死成分を精製して大腸菌に組み込み、発現蛋白を毒素のモノクローナルで特定した特定なアミノ酸配列からなるタンパク質。なし

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質

請求項2

配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個アミノ酸置換欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列からなり、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質。

請求項3

細胞毒性を有することを特徴とする請求項1〜2に記載のタンパク質。

請求項4

クロストリジウムパーフリンゲンスが産生することを特徴とする請求項1〜3に記載のタンパク質。

請求項5

請求項1〜2に記載のタンパク質のいずれかをコードするDNA。

請求項6

配列番号1に記載の遺伝子の一部あるいは全部を遺伝子組換え技術で作製した組換えタンパク質

請求項7

請求項1〜2に記載のタンパク質のいずれかに対する抗体。

請求項8

抗体がモノクローナル抗体である請求項7に記載の抗体。

請求項9

請求項1〜4のタンパク質またはその免疫原性誘導体を含有するクロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌感染症ワクチン

請求項10

請求項1〜4のタンパク質を検出することを特徴とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出方法

技術分野

0001

本発明は、クロストリジウムパーフリンゲンスのうち、多くのC型菌が産生する新規毒素に関する。またこの毒素及び/又はそのトキソイドを用いたクロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌用ワクチン及び毒素を指標とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出方法に関わる。

背景技術

0002

クロストリジウム・パーフリンゲンスは芽胞形成偏性嫌気性グラム陽性桿菌で、α、β、ε及びι毒素の4種の毒素の産生パターンでA、B、C、D及びEの5つの型に分けられる。この中でC型菌は子、子、子に対して出血性腸炎毒血症を引き起こし、動物死亡させることもある(非特許文献1、2を参照。)。

0003

これまでクロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌のワクチンには、β毒素を主体とする毒素をホルマリン無毒化した免疫原性誘導体(トキソイド)が用いられてきた(非特許文献3などを参照。)。β毒素以外ではA型菌においてα毒素の特定なアミノ酸からなるペプチドをヒト又は動物に投与感染防御免疫応答を誘発するワクチン組成物報告がある(特許文献1を参照。)。一般にホルマリンによる無毒化は蛋白変性によって免疫原性の低下が避けられず、β毒素においても顕著に影響を受けるとされているが、これを回避するためにクロストリジウム・パーフリンゲンスの非毒性変異株及びその断片を用いるワクチンが報告されている(特許文献2を参照。)。またクロストリジウムワクチン投与の副作用軽減するためアジュバントサポニン使用した2種以上のクロストリジウムバクテリンまたはトキソイドからなる多成分系ワクチンが報告されている(特許文献3を参照。)。しかしながら、これら報告には、クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生する新規な毒素に関する記載はない。

0004

特許第3370672号公報
特表平8−510206号公報
特開平11−103872号公報
J.Clin.Microbiol.1997.35:p228−232
Vet.Microbiol.2001.82:p1−9
ヨーロッパ薬局方1997
J.Bacteriol.1992.174:p6707−6710
Infect.Immun.2000.68:p6378−6383
J.Biol.Chem.1997.272:p11074−11078
J.Biol.Chem.2000.275:p13228−13234
J.Biol.Chem.2004.279:p49876−49882

発明が解決しようとする課題

0005

現在、クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生する毒素は、α,β,ε及びι毒素をはじめとする約10種が知られているに過ぎない。より効果的なワクチンを開発するためにはクロストリジウム・パーフリンゲンスが産生する毒素の全てを明らかにすることが望ましく、未知の毒素の発見及び解明が待たれていた。

課題を解決するための手段

0006

本発明者は、クロストリジウム・パーフリンゲンスの5つの毒素型の内、C型菌の培養液から培養細胞に対して強い毒性を示し、哺乳動物に対して致死性を有する未知の毒素を発見した。さらに、この毒素を精製し、アミノ酸配列及びこのアミノ酸をコードする塩基配列を決定した。この毒素の産生能をC型菌5株について調べたところ、全ての株がその毒素を産生し、毒素の産生は確認できなかったものの、B型菌にもその遺伝子が確認された。本毒素の生理活性は不明であるが、毒素あるいはトキソイドを含むワクチンへの利用、毒素を指標とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出、医薬品への応用等が期待される。

0007

本発明で開示する毒素(以下、本毒素という。)は、クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌から得られた配列番号1に示すアミノ酸からなるタンパク質である。このタンパク質の生理活性等は十分に解明されていないものの、高度な細胞毒性が認められることより毒素と認められる。配列番号1のアミノ配列から求めた分子量は191キロダルトンであり、クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生毒素なかでは最も分子量が大きい。本毒素と異なる菌種既知毒素との相同性は、クロストリジウム・ディフィシルtoxin A (308キロダルトン):39%、クロストリジウム・ディフィシル toxin B (269キロダルトン) :38% 、クロストリジウム・ソルデリー lethal toxin (270キロダルトン) :39%、クロストリジウム・ノビイ α毒素 (250キロダルトン):30% の値を示した。これら既知の毒素よりも小さい本毒素は、既知の毒素のN末端側から中央部に相同性を認め、既知の毒素のC末端側に相当する部分を認めなかった。既知の毒素は何れも糖転移酵素活性を有し、低分子量G蛋白阻害作用を有する。そのアミノ酸配列には、その酵素活性に必要なDXDモチーフを保存している。さらに、何れもN末端側に毒素活性、中央部に細胞侵入するための構造、C末端側に細胞に結合するための構造を有している。本毒素のN末端側は既知の毒素に相同性を認めるだけでなく、このDXDモチーフを保存しており、本毒素は糖転移酵素活性を有すると思われた。しかし、C末端側の細胞に結合するための構造を持たない本毒素は、それでも強い細胞毒性を示しており、糖転移酵素の研究の材料としては、非常に有用な毒素と考えられる。(既知の毒素の報告については、非特許文献4〜8を参照。)。

0008

本毒素は、培養液上清濃縮液電気泳動により見出された。実施例1に記載したように用いた手法は全て常法によるものである。本毒素に対するモノクローナル抗体も、一般的製法によって得たものである。得られたモノクローナル抗体をカラム担体に結合し、アフィニティカラムに使用することも公知の手段である。このアフィニティカラムによって精製した本毒素は、マウスに対する致死性は高くないものの、培養細胞に対して強い毒性を示した。細胞毒性は、コロニー法等の常法により判定できる。例えばVero細胞CHO細胞において、約1.6ng/mLの濃度で細胞毒性を認めた。

0009

本毒素の塩基配列は以下のように決定された。1)菌体から抽出したDNAを酵素処理する。2)処理したDNAをλファージに組み込む。3)λファージを感染させた大腸菌発現する蛋白をモノクローナル抗体で検出する。4)毒素を産生するλファージをファージミドpBK−CMVに改変クローニングサイトの塩基配列を決定する。アミノ酸配列はこの塩基配列に基づいて決定され、分子量はアミノ酸配列から決定した。クロストリジウム・パーフリンゲンスの既知毒素はもちろん、GenBank等のデータベースにも該当配列は存在せず、本毒素は新規な物質であることが確認された。

0010

クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌MC18株の培養液中から発見されたが、後にCP46、Shi2、Chi8及び3511−2の培養液にも産生が認められたことより、クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌全般の産生毒素の一つと考えられる。本毒素は、希釈又は無毒化してワクチンに使用できる。無毒化はホルマリン等の化学的処理が好ましい。適量の不活化毒素をマウスの筋肉内に注射すれば、約1ヶ月後に本毒素に対する血中抗体価の上昇が観測され、本毒素に対する免疫が誘導されたことが確認できた。

発明の効果

0011

本発明の毒素又はトキソイドを含有するワクチンを投与された動物は本毒素に対する抗体を付与されその毒素の影響から免れることができる。本毒素の精製に用いたモノクローナル抗体は、クロストリジウム・パーフリンゲンスの培養菌液中の毒素検出に有用であり、菌の同定にも利用される。

発明を実施するための最良の形態

0012

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

0013

毒素の探索法
クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌MC18株培養液の除菌ろ過液限外ろ過膜濃縮し、これをG6000PWゲルろ過カラム分画した。各分画の一部をマウスに注射し、マウスが死亡した分画を集めた。これをDEAE−5PWイオン交換クロマトグラフィーでさらに分画し、各分画のマウス致死性を確認した。その結果、一分画のみに致死性を認めた。この分画をSDS−PAGEで構成蛋白について調べたところ、マーカー蛋白の分子量170〜212キロダルトンの間に一本の蛋白バンド高純度で確認した。この蛋白バンドは他の分画には認められなかった。図1参照。

0014

毒素の性状
この毒素に対するモノクローナル抗体でアフィニティカラムを作製し、クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌MC18株培養液の除菌ろ過液から毒素を精製した。この精製した毒素のマウスに対する半数致死量は、体重1Kg当たり545μgであった。この精製毒素を96穴マイクロプレートに培養したVero細胞に接種したところ、毒素濃度1.6ngまで細胞毒性を認めた。

0015

塩基配列の決定法
クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌MC18株菌体からEasy−DNA kit (インビトロジェン)を用いてDNAを抽出した。DNA20μgを0.0625 UのSau3AIで37℃1時間酵素処理し、これをλファージZap Express vector digested with BamHI(ストラタジーン)に使用説明書に従って組み込んだ。このλファージを使用説明書に従って、大腸菌XL1−BlueMRF'に感染させ、組み込んだDNAに対する蛋白を発現させた。発見した毒素に対するモノクローナル抗体でその毒素遺伝子を組み込まれたλファージを検出した。毒素遺伝子を組み込まれたλファージは仕様書に従ってファージミドpBK−CMVに改変した。ファージミドのクローニングサイトの塩基配列をBigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (アプライバイオシステム)を用いて 3730xI DNA Analyzer (アプライド バイオシステム)で遺伝子配列を読み取った。塩基配列の推定アミノ酸配列から算出したこの蛋白の分子量は191キロダルトンであった。

0016

毒素産生株の検討
本毒素の産生状況をA、B及びC型菌の計18株についてイムノドットブロット法で、この毒素に対するモノクロナル抗体を使用して調べた。即ち、各培養上清試料0.4mLを、予め湿らせたPVDF膜(Immobilon−P、Millipore Corp. Bedford,MA)の細片に塗布した。膜を、0.15M NaCl、0.02%(w/v)アジ化ナトリウム及び0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2に溶解した5%脱脂粉乳ブロッキング溶液に入れ、ゆるやかに撹拌しながら室温で少なくとも1時間インキュベートした後、ブロッキング溶液をデカントした。検出は、抗毒素モノクローナル抗体、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体及び染色体基質ジアミノベンチジンを用い、標準法に従って実施した。その結果は表1に示すように、A型菌12株とB型菌1株はその毒素を産生せず、C型菌5株は全てその毒素を産生していることが確認された。

0017

0018

本毒素遺伝子保有株の検討
実施例4と同一の株について本毒素の遺伝子保有状況を調べた。液体培地で培養した菌液を10,000×gで10分遠心して上清を除去した後、菌を元の1/10量の精製水で浮遊した。これを10分間煮沸した後、再び遠心し、その上清をPCRテンプレートとした。プライマーは、配列番号1の配列を基に、以下のように設計した。:
Forward Primer: 5'- ATATAGAGTCAAGCAGTGGAG -3'
Reverse Primer: 5'- GGAATACCACTTGATATACCTG -3'
反応液は50μL中、PCR緩衝液(Mg2+フリー)に2.5mM MgCl2、0.2mM dNTP mixture、2.5単位LA Taq DNA polymerase(TaKaRa)、50 pM プライマー及び5μLのテンプレートを用いた。PCRは、94℃5分処理の後、熱変性:94℃,1分、アニーリング:55℃,1分、伸長:72℃,1分を1サイクルとして30回繰り返し、最後に72℃、7分で行った。得られた増幅産物を1.5%アガロースで電気泳動を行い、466bpのDNAのバンドの有無を確認した。その結果、本毒素産生に関わる遺伝子はC型以外にもB型で認められ、他の型でも産生し得ることが判明した。

0019

0020

ワクチンの製造
クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌MC18株を培地トリプチケースペプトン5%、酵母エキス1%、L−システイン塩酸塩0.05%、pH7.4)に37℃で静止期まで培養し、培養後ホルマリンを0.5%の割合で加え、37℃、3日間感作してトキソイドを作成した。このトキソイドを10,000×gで30分遠心して菌を除去し、その上清を限外濾過器で10倍に濃縮した。濃縮液に水酸化アルミニウムゲルアジュバントを10%の割合で加えてワクチンを作製した。

0021

ワクチンの投与及び抗体価測定
実施例6で得たワクチン0.2mLをモルモットの筋肉内に3週間隔で2回注射した。2回目注射から2週後に被検モルモットから採血し、本毒素の中和抗体を96穴マイクロプレートに培養したVero細胞を用いて測定した。2.0×105個/mLに調整した細胞を96穴マイクロプレートに1穴当たり0.1mLずつ分注し、一夜培養した。翌日、細胞毒性4単位の本毒素と2倍階段希釈した血清当量混合し、37℃、1時間感作した。感作後、Vero細胞の培養液を除き、そこに血清で感作した毒素を0.1mLずつ加えた。これを炭酸ガス孵卵器に入れ細胞を3日間観察した。このモルモット血清には本毒素4単位の細胞毒性を血清2,500〜5,000倍希釈でも中和する抗体が得られた。

図面の簡単な説明

0022

クロストリジウム・パーフリンゲンスC型菌MC18株培養液から得た致死性分画のSDS−PAGE

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