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技術 細胞の培養方法、細胞培養アレイ装置、細胞培養物及び再生医用生体材料

出願人 コニカミノルタエムジー株式会社
発明者 羽生武
出願日 2006年8月10日 (13年7ヶ月経過) 出願番号 2006-217900
公開日 2008年2月21日 (12年1ヶ月経過) 公開番号 2008-035834
状態 未査定
技術分野 微生物・酵素関連装置 酵素,微生物の固定化,処理 微生物、その培養処理 医療用材料
主要キーワード 超音波震動 パルス直流電圧 圧電素子膜 球状組織 振動効果 水溶性有機モノマー 直流パルス電圧 化学的接着
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2008年2月21日)のものです。
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図面 (2)

課題

細胞分化機能を精密かつ迅速に発現させることができる細胞の加速培養方法、であり、この方法により得られる細胞培養物及び人工臓器を提供する。

解決手段

細胞サイズベル超音波振動子を2次元的に配列した細胞培養アレイ装置上に細胞を配置して、該細胞に超音波振動をかけて細胞培養することを特徴とする細胞の培養方法、細胞培養アレイ装置、細胞培養物及び再生医用生体材料

概要

背景

従来、動物細胞の一般的な培養法として広く用いられる単層細胞培養法は、生体内で有していた複雑系の細胞本来培養環境下におかれないため、生存を継続する分化機能を維持することが困難であり、細胞は生存または増殖するものの、生体の複雑系を精密に再現していないため、分化機能の停止や制御困難を招くことがよく知られている。

例えば、初代培養細胞の中でも高度に生体の代謝機能分化した初代肝細胞では、単層培養期間内にその機能が消失してしまい易い。例えば、マウス初代培養肝細胞は、シャーレ内で単層培養を行っても、肝細胞の重要な機能のひとつであるアンモニア代謝能が、通常、培養開始から10代程度で失われてしまうことが知られている。

このため、いったん生体外に分離した細胞を使用して、組織を生体外で再構築させることにより細胞の分化機能の発現を高める方法として、スフェロイド球状組織体)培養方法コラーゲンゲルを利用した3次元培養方法などの培養方法等が種々開発されている。

生体外で組織を再構築する細胞培養方法の1つとして、生体から分離した細胞を生体外で培養することにより組織を再構築して医用生体材料を作製する具体例としては、繊維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に、表皮角化細胞を培養して表皮層角質層を作製することが試みられている。また、人工肝臓として用いるための肝細胞培養が記載されて(例えば、特許文献1参照。)いる。細胞の培養方法として、健康な細胞の成長刺激して治癒中の組織の顆粒化及び上皮化を助けることが記載されているが(例えば、特許文献2参照。)、この方法は超音定常波創傷表面に向けるように超音波変換器位置決めして、超音定常波が創傷エネルギーを付与し、創傷を治癒すると記載されていて、酸素の取り込み、炭酸ガスの放出という細胞の物質移動に着目して細胞培養する技術とし細胞サイズベル超音波振動子を使用していないため、マクロ振動効果であり、個々の細胞に精密に制御した振動を与えるものでなかった。
特開2002−247978号公報 (段落0008)
特表2004−538039号公報

概要

細胞の分化機能を精密かつ迅速に発現させることができる細胞の加速培養方法、であり、この方法により得られる細胞培養物及び人工臓器を提供する。細胞サイズレベルの超音波振動子を2次元的に配列した細胞培養アレイ装置上に細胞を配置して、該細胞に超音波振動をかけて細胞培養することを特徴とする細胞の培養方法、細胞培養アレイ装置、細胞培養物及び再生医用生体材料

目的

本発明の目的は、細胞の分化機能を精密かつ迅速に発現させることができる細胞の加速培養方法、であり、この方法により得られる細胞培養物及び人工臓器を提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

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請求項1

細胞サイズベル超音波振動子を2次元的に配列した細胞培養アレイ装置上に細胞を配置して、該細胞に超音波振動をかけて細胞培養することを特徴とする細胞の培養方法

請求項2

前記細胞サイズレベルの超音波振動子が有機薄膜で形成されていることを特徴とする細胞培養アレイ装置。

請求項3

超音波振動子に両親媒性ポリマー化学結合で固定し、該ポリマー上に培養細胞を積層し、周波数100kHz〜100MHzの超音波振動をかけることを特徴とする請求項1に記載の細胞の培養方法。

請求項4

細胞に両親媒性有機薄膜上で周波数1MHz〜100MHz、超音波エネルギーとして0.1mW〜100W/m2の超音波振動をかけることを特徴とする請求項1に記載の細胞の培養方法。

請求項5

請求項1、3又は4のいずれか1項に記載の細胞の培養方法により得られることを特徴とする細胞培養物

請求項6

請求項5に記載の細胞培養物を用いることを特徴とする再生医用生体材料

技術分野

0001

本発明は、細胞培養組織培養等の分野において利用される細胞の培養を加速する方法、この方法により得られる細胞培養物及びこの細胞培養物を用いた再生医用生体材料に関する。特に、細胞の分化機能を加速して精密且つ厳密に発現或いはさらに維持できる細胞の培養方法、この方法により得られる細胞培養物及びこの細胞培養物を用いた医用生体材料に関する。

背景技術

0002

従来、動物細胞の一般的な培養法として広く用いられる単層細胞培養法は、生体内で有していた複雑系の細胞本来培養環境下におかれないため、生存を継続する分化機能を維持することが困難であり、細胞は生存または増殖するものの、生体の複雑系を精密に再現していないため、分化機能の停止や制御困難を招くことがよく知られている。

0003

例えば、初代培養細胞の中でも高度に生体の代謝機能分化した初代肝細胞では、単層培養期間内にその機能が消失してしまい易い。例えば、マウス初代培養肝細胞は、シャーレ内で単層培養を行っても、肝細胞の重要な機能のひとつであるアンモニア代謝能が、通常、培養開始から10代程度で失われてしまうことが知られている。

0004

このため、いったん生体外に分離した細胞を使用して、組織を生体外で再構築させることにより細胞の分化機能の発現を高める方法として、スフェロイド球状組織体)培養方法やコラーゲンゲルを利用した3次元培養方法などの培養方法等が種々開発されている。

0005

生体外で組織を再構築する細胞培養方法の1つとして、生体から分離した細胞を生体外で培養することにより組織を再構築して医用生体材料を作製する具体例としては、繊維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に、表皮角化細胞を培養して表皮層角質層を作製することが試みられている。また、人工肝臓として用いるための肝細胞培養が記載されて(例えば、特許文献1参照。)いる。細胞の培養方法として、健康な細胞の成長刺激して治癒中の組織の顆粒化及び上皮化を助けることが記載されているが(例えば、特許文献2参照。)、この方法は超音定常波創傷表面に向けるように超音波変換器位置決めして、超音定常波が創傷エネルギーを付与し、創傷を治癒すると記載されていて、酸素の取り込み、炭酸ガスの放出という細胞の物質移動に着目して細胞培養する技術とし細胞サイズベル超音波振動子を使用していないため、マクロ振動効果であり、個々の細胞に精密に制御した振動を与えるものでなかった。
特開2002−247978号公報 (段落0008)
特表2004−538039号公報

発明が解決しようとする課題

0006

本発明の目的は、細胞の分化機能を精密かつ迅速に発現させることができる細胞の加速培養方法、であり、この方法により得られる細胞培養物及び人工臓器を提供することにある。

課題を解決するための手段

0007

本発明の上記目的は、以下の構成により達成することができる。

0008

1.細胞サイズレベルの超音波振動子を2次元的に配列した細胞培養アレイ装置上に細胞を配置して、該細胞に超音波振動をかけて細胞培養することを特徴とする細胞の培養方法。

0009

2.前記細胞サイズレベルの超音波振動子が有機薄膜で形成されていることを特徴とする細胞培養アレイ装置。

0010

3.超音波振動子に両親媒性ポリマー化学結合で固定し、該ポリマー上に培養細胞を積層し、周波数100kHz〜100MHzの超音波振動をかけることを特徴とする前記1に記載の細胞の培養方法。

0011

4.細胞に両親媒性有機薄膜上で周波数1MHz〜100MHz、超音波エネルギーとして0.1mW〜100W/m2の超音波振動をかけることを特徴とする前記1に記載の細胞の培養方法。

0012

5.前記1、3又は4のいずれか1項に記載の細胞の培養方法により得られることを特徴とする細胞培養物。

0013

6.前記5に記載の細胞培養物を用いることを特徴とする再生医用生体材料。

発明の効果

0014

本発明により、細胞の分化機能を精密かつ迅速に発現させることができる細胞の加速培養方法、であり、この方法により得られる細胞培養物及び人工臓器を提供することができた。

発明を実施するための最良の形態

0015

本発明を更に詳しく説明する。前記目的を達成するために本発明者は鋭意研究を重ね、細胞に超音波震動を与えることにより細胞を高い生理活性接触に高揚し、細胞を精密に加速培養することにより、細胞本来が持つ機能を厳密且つ迅速に発現させ、長期大塚政尚間に亘って細胞を増殖分化培養できることを見出した。また、本発明者は、各種の有用な細胞を細胞培養用培地中で培養することにより比較的速やかに相互に影響しあうネットワーク構造組織体が形成され、この組織体を培養することにより、培養中の細胞の多様な機能の発現、維持が迅速に現われることを見出した。

0016

本発明の細胞の培養方法は、細胞に超音波振動をかけることにより細胞の代謝機能を促進し、細胞を加速培養する方法である。本発明において、超音波振動は、超音波振動子に電流を流すとことによって発生させることができる。その方法の一つとして圧電素子の両端に電極をつけ、圧電材料固有共振周波数直流パルス電圧を加えると、共振現象によって超音波が発生させることができる。こららに最適な物質は、水晶チタン酸バリウムPZTチタン酸ジルコン酸鉛)、或いは、フッ化ビニリデンやフッ化ビニリデンとトリフッ化エチレンなどの共重合体尿素樹脂等を使用する高分子圧電素子が知られている。本発明では、薄膜形成がし易く、生体毒性の少ない有機圧電素子を使用することが好ましい
本発明では、細胞を超音波振動を与えるために、薄膜超音波振動子の上に両親媒性ポリマーを細胞培養基材として重畳することが好ましい。親水性疎水性とが温度変化により可逆的に変化する所謂両親媒性高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材は、疎水性条件下では細胞と優れた接着性を示すため、細胞を好適に培養、増殖させることができ、また親水性条件下では、細胞との接着性を低下させることができるため、タンパク質加水分解酵素化学薬品を使用せずに細胞を剥離できるため、細胞の破損や、基材の剥離混入を生じることなく、容易に細胞の回収が可能である。さらに、疎水性から親水性、あるいは親水性から疎水性への変化が迅速であるため、温度をはじめとする外部環境を変化させる際に細胞に与える影響が少ないので好ましい。高分子ヒドロゲルの親水性と疎水性とが変化する臨界温度は、細胞を好適に培養・剥離できることから、該臨界温度が5〜50℃程度の温度範囲にあることが好ましい。

0017

このような重合体を与える水溶性有機モノマーの例としては、N−置換アクリルアミド誘導体、N,N−ジ置換アクリルアミド誘導体、N−置換メタクリルアミド誘導体、N,N−ジ置換メタクリルアミド誘導体などを好ましく使用することができ、具体的にはN−イソプロピルアクリルアミド、N−イソプロピルメタクリルアミド、N−n−プロピルアクリルアミド、N−n−プロピルメタクリルアミド、N−シクロプロピルアクリルアミド、N−シクロプロピルメタクリルアミド、N−エトキシエチルアクリルアミド、N−エトキシエチルメタクリルアミド、N−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、N−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、N−エチルアクリルアミド、N−エチル−N−メチルアクリルアミド、N,N−ジエチルアクリルアミド、N−メチル−N−n−プロピルアクリルアミド、N−メチル−N−イソプロピルアクリルアミド、N−アクリロイルペリディン、N−アクリロイルピロリジンが挙げられる。

0018

かかる有機モノマーの重合体としては、例えば、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N−n−プロピルアクリルアミド)、ポリ(N−シクロプロピルメタクリルアミド)、ポリ(N−イソプロピルメタクリルアミド)、ポリ(N−n−プロピルメタクリルアミド)、ポリ(N−エトキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N−エトキシエチルメタクリルアミド)、ポリ(N−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド)、ポリ(N−テトラフルフリルメタクリルアミド)、ポリ(N−エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N−ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N−アクリロイルピペリディン)、ポリ(N−アクリロイルピロリディン)が挙げられる。

0019

また水溶性有機モノマーの重合体としては、以上のような単一水溶性有機モノマーからの重合体の他、これらから選ばれる複数の異なる水溶性有機モノマーを重合して得られる共重合体を用いることも有効である。また上記水溶性有機モノマーからなる重合体が好ましいが、上記水溶性有機モノマーとそれ以外の水溶性有機モノマーまたは有機溶媒可溶性有機モノマーとの共重合体も、得られた重合体が親水性及び疎水性の両方を示すものであれば使用することが出来る。共重合に用いられる有機モノマーとしては、具体的にはN−アルキルアクリルアミド、N,N−ジアルキルアクリルアミド、アクリルアミド等のアクリルアミド類、または、N−アルキルメタクリルアミド、N,N−ジアルキルメタクリルアミド、メタクリルアミド等のメタクリルアミド類が挙げられる。なお、より好ましくは、N−アルキルアクリルアミドまたはN,N−ジアルキルアクリルアミドが用いられる。アルキル基としては、炭素数が1〜4のものが好ましく選択される。その他には、アクリロイルモルフォリン、N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、N−アクリロイルメチルホモペラディン、N−アクリロイルメチルピペラディン等も用いることが出来る。

0020

本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルには、その特性を改良する目的で、重合時に公知慣用有機架橋剤を使用してもよい。使用する有機架橋剤濃度は特に限定されず、目的に応じて選択できる。使用できる有機架橋剤としては、従来から公知のN,N’−メチレンビスアクリルアミド、N,N’−プロピレンビスアクリルアミド、ジ(アクリルアミドメチルエーテル、1,2−ジアクリルアミドエチレングリコール、1,3−ジアクリロイルエチレンウレア、エチレンジアクリレート、N,N’−ジアリルタータジアミド、N,N’−ビスアクリルシスタミンなどの二官能性化合物や、トリアリルシアヌレートトリアリルイソシアヌレートなどの三官能性化合物が例示できる。

0021

本発明の細胞培養基材には、得られた高分子ヒドロゲル材料を慣用の方法で乾燥し、溶媒の一部もしくは全部を除去して乾燥物とすることもできる。かかる乾燥物は、水または水と混和する有機溶媒などの溶媒を再び含ませることにより、可逆的に細胞培養基材としての高分子ヒドロゲル材料を再生することが出来る。

0022

両親媒性ポリマーを超音波振動子上に単なる重畳では、超音波振動子と両親媒性ポリマーが超音波振動で分離や剥離してしまうので、物理的又は化学的接着を施すことが好ましく、特に化学的接着していることが好ましい。有機圧電素子の場合、電極として、有機導電性ポリマーを使用する場合には、有機基とを化学結合で固定することが可能である。化学結合の方式は、エステル結合エーテル結合尿素結合アミド結合グラフト化により結合、水素結合、又はこれらの結合の組み合わせでもよい。有機導電性ポリマーを使用しない場合には、無機導電性薄膜状でもよい。この場合は、金属電極上に吸着力を使用して固定化を図ってもよい。例えば、メルカプト残基を導入して、金電極上に吸着固定することもできる。

0023

超音波振動は連続して1回でかけてもよく、又は、複数回に分けて間欠的にかけてもよい。目的や細胞の状態に応じた方法を選択することができる。また、細胞に超音波振動を加える時間は、細胞が増殖分化を継続している間、連続しても間欠的でもコンピュータ管理で様々な態様で実施することができる。超音波振動の方向は、細胞の上下左右いずれでもよい。細胞に振動を掛ける際に、細胞の寸法変化が生じるような場合には、細胞が破壊されないレベルまで伸縮振動を掛けることができる。伸縮振動による変化は、細胞間のネットワークが破壊や損傷が生じないレベルに抑える必要があるが、細胞と細胞の隙間の距離が離れすぎないように振動することが必要である。また、細胞に付与するエネルギーは、0.1mW〜100Wであり、細胞培養の促進には、0.1W〜10Wが好ましく、細部培養の抑制や停止には10Wから100Wが好ましい。

0024

両親媒性膜は、細胞は通過させないが水、塩類蛋白質などの培養液成分は通過させる通孔を多数有する膜が好ましく、通常0.1〜5μm程度、特に0.2〜3μm程度の通孔を有するものであることが好ましい。両親媒性膜の厚さは、膜の適度の強度及び良好な物質透過性が保たれる範囲であればよく、特に限定されないが、通常1〜200μm程度、特に20〜100μm程度のものが好適に採用される。

0025

両親媒性膜上に細胞を載せるに当たっては、細胞が概ね2〜200層程度、特に5〜100層程度重なり合った積層体が得られるように、細胞数を調整することが望ましい。積層体体において細胞が多数重なりすぎている場合には積層体の中央層部の細胞が栄養不足ガス交換不足になり、細胞の重なりが少なすぎる場合は細胞数が少なく十分な機能を発揮する積層体が形成され難い。上記範囲であればこのような問題は生じない。

0026

積層体の細胞数は、例えば積層体の載った透過性膜切り出し、これをホルマリン固定後、パラフィン包切片を作製して顕微鏡観察することにより確認することができる。

0027

本発明方法の対象となる細胞としては、特に限定されるものではないが、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、マウス、ラット等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。

0028

本発明方法は、特に、細胞の機能維持が困難な初代培養細胞の培養に適する。初代培養細胞は、軟骨、骨、皮膚、神経、口腔消化管肝臓膵臓腎臓腺組織副腎心臓筋肉脂肪組織結合組織生殖器眼球、血管、骨髄又は血液のいずれの組織に由来するものであってもよい。細胞は、単一組織に由来する単一種類の細胞を用いることもできるが、由来の異なる複数種の細胞を用いることもできる。

0029

具体的には、例えば、軟骨細胞骨芽細胞、表皮角化細胞、メラニン細胞神経細胞神経幹細胞グリア細胞、肝細胞、腸上皮細胞膵β細胞外分泌細胞、腎糸球体内皮細胞尿細管上皮細胞乳腺細胞甲状腺細胞唾液腺細胞副腎皮質細胞副腎髄質細胞心筋細胞骨格筋細胞平滑筋細胞脂肪細胞脂肪前駆細胞水晶体細胞角膜細胞血管内皮細胞骨髄間質細胞又はリンパ球などを使用できる。細胞は、1種を単独で又は2種以上を組み合わせて用いることができる。

0030

このようにして得られた細胞培養物は、例えば医用生体材料用の細胞として使用できる。本発明において、再生医用生体材料とは、ヒト等の動物の組織の代替物として使用される材料をいう。再生医用生体材料としては、培養された細胞の種類に応じて、人工膵臓人工脾臓人工腎臓人工心臓のような人工臓器、人工消化管人工血管人工皮膚、人工神経、人工骨人工軟骨人工内耳人工水晶体人工角膜など、又はこれらの一部分が挙げられる。

0031

以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

0032

実施例1
超音波振動子を具備した細胞培養アレイ装置の作製
図1を用い、本発明の細胞培養アレイ装置の作製方法を模式的に説明する。尚、図1ホールを3個で示している。

0033

基体1として、厚さ50mm、長さ10cm、幅5cmのポリエチレンテレフタレート樹脂に直径100μm、深さ200μmのホールが50μm間隔に2次元的に1000個配列した図1(a)に示す基体1を用意した。このホールの底に銀電極2を設置し(図1(b))、その上に図1(c)に示す圧電素子膜3として尿素樹脂を30μm形成させた。尿素樹脂の形成は、3,3′−ジメチルジフェニル−4,4′−ジイソシアナート0.1モル(29g)と3,3′−ジメチルジフェニル−4,4′−ジアミン0.1モル(24g)を予め、室温下で重合させて、DMFに溶解させた液をインクジェットでホール内に打ち込み恒率乾燥域まで乾燥させた。その後、図1(d)に示すインクジェットで銀ペーストを打ち込み還元反応により銀電極4を形成させた。銀電極4にパルス直流電圧を掛けて分極処理を行い圧電性を付与した。分極処理条件としては、電圧は120V、パルス幅は100μsec、パルス間隔を10msecで実施し、減率乾燥しながら重合を進めると同時に分極処理を実施した。このホール内の電極上に図1(e)に示すように、インクジェットで両親媒性ポリマー膜5としてイソプロピルアクリルアミドを打ち込み、電子線照射で重合を行い、2μm厚で被覆し、細胞培養アレイ装置を作製した。

0034

細胞の培養
上記作製した細胞培養アレイ装置に培養細胞6を播種して細胞の培養を行った。培養する細胞は、ヒト肝上皮細胞由来のガン細胞HepG2細胞株(大日本製薬株式会社製)を使用した。培養は、ウシ胎児血清(ICN製)を10%含有するミニマムエッセンシャルイーグル培地(SIGMA製)(ピルビン酸(ICN製)及び非必須アミノ酸(ICN製)を添加剤として含有)使用し、5%炭酸ガス充填37℃恒温器内で行った。超音波振動は、2MHz、1W/cm2で2時間ごとに10分間与えた。播種してから1週間後、この細胞培養アレイを、20℃恒温槽内に5分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養アレイ上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この取り出した細胞についてトリプシンEDTA処理を行い、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数計測したところ、培養開始時には8.2×102個であった細胞数が、培養後は5.3×103個に増加したことが確認された。尚比較として、超音波振動を与えない場合には、細胞数は4.6×103個であった。

0035

細胞サイズの圧電素子が2次元に配置された細胞培養アレイ上で細胞を培養すると細胞の増殖が促進されることがわかった。超音波エネルギーを0.1mWまで下げると次第に培養促進効果は少なくなり、0.05mW以下では効果がみられなかった。

0036

実施例2
実施例1と同様な実験を実施したが、ここでは、超音波振動のエネルギーを12W/cm2与えた結果ガン細胞が死滅していることを確認した。細胞培養で抑制や停止を行うことがわかった。しかも、どの細胞も一様且つ、均一に抑制していることが顕微鏡観察から知ることができた。癌細胞培養抑制は3W以上から効果を発現していて、20W以上では、2日目に細胞が死滅していることが確認された。無害化した細胞の死滅から採取できるDNA,プロテイン等を治療に役立てることができる。

図面の簡単な説明

0037

本発明の細胞培養アレイ装置の作製方法の模式的説明図である。

符号の説明

0038

1基体
2銀電極
3圧電素子膜
4 銀電極
5両親媒性ポリマー膜
6 細胞

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