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技術 テルペン成分封入中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含有する組成物、それらを製造および使用する方法

出願人 エーデンリサーチピーエルシー
発明者 フランクリン,ラニーオストロフ,ゲリー
出願日 2005年5月20日 (15年6ヶ月経過) 出願番号 2007-517431
公開日 2007年12月27日 (12年11ヶ月経過) 公開番号 2007-538062
状態 特許登録済
技術分野 飼料(2)(一般) 農薬・動植物の保存 医薬品製剤 捕獲、駆除 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 マイクロカプセルの製造
主要キーワード 追加製品 多用途車 生地様 噴霧割合 取り込み結果 漏出速度 暗色領域 総収穫量
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2007年12月27日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、テルペン成分封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物、それらを製造および使用する方法に関する。これらの組成物は、植物、およびヒトを含む動物において、感染を予防および処置するのに適している。

概要

背景

概要

本発明は、テルペン成分封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物、それらを製造および使用する方法に関する。これらの組成物は、植物、およびヒトを含む動物において、感染を予防および処置するのに適している。 なし

目的

それらの組成物は、テルペンの安定性および活性を増大し、テルペンに適切な担体を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
9件

この技術が所属する分野

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請求項1

請求項2

中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、真菌細胞壁である請求項1に記載の組成物。

請求項3

中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、酵母細胞壁である請求項2に記載の組成物。

請求項4

酵母細胞壁が、パン酵母細胞由来する請求項3に記載の組成物。

請求項5

中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、酵母抽出物製造工程の不溶性廃棄物である前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項6

中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、アルカリ抽出されている前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。

請求項7

中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、酸抽出されている前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項8

中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、有機溶媒抽出されている前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項9

中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、1%以上の脂質含量を有する前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項10

中空グルカン粒子または細胞壁粒子の脂質含量が、5重量%以上である請求項9に記載の組成物。

請求項11

脂質含量が、10重量%以上である請求項10に記載の組成物。

請求項12

テルペン成分が、シトラールピネンネロール、β−イオノンゲラニオールカルバクロールオイゲノールカルボン(たとえば、L−カルボン)、テルペニオールアネトールカンファーメントールチモールリモネンネロリドールファルネソールフィトールカロテンビタミンA1)、スクアレン、チモール、トコトリエノールペリリルアルコールボルネオールミルセンシメンカレン、テルペネン、リナロール、またはそれらの混合物からなる群から選択された1種または複数のテルペンを含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項13

テルペン成分が、一般構造C10H16を有するテルペンを含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項14

テルペン成分が、ゲラニオール、チモール、シトラール、カルボン(たとえば、L−カルボン)、オイゲノール、β−イオノン、またはそれらの混合物からなる群から選択された1種または複数のテルペンを含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項15

テルペン成分が、ゲラニオール、チモール、およびオイゲノールの混合物を含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項16

テルペン成分が、チモール100%を含む請求項14に記載の組成物。

請求項17

テルペン成分が、ゲラニオール50重量%、およびチモール50重量%を含む請求項14に記載の組成物。

請求項18

テルペン成分が、オイゲノール50重量%、およびチモール50重量%を含む請求項14に記載の組成物。

請求項19

テルペン成分が、ゲラニオール33重量%、オイゲノール33重量%、およびチモール33重量%を含む請求項14に記載の組成物。

請求項20

テルペン成分が、オイゲノール33重量%、チモール33重量%、およびシトラール33重量%を含む請求項14に記載の組成物。

請求項21

テルペン成分が、ゲラニオール25重量%、オイゲノール25重量%、チモール25重量%、およびシトラール25重量%を含む請求項14に記載の組成物。

請求項22

テルペン成分が、ゲラニオール20重量%、オイゲノール20重量%、シトラール20重量%、チモール20重量%、およびL−カルボン20重量%を含む請求項14に記載の組成物。

請求項23

テルペン成分が、界面活性剤と結合している前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項24

界面活性剤が、ラウリル硫酸ナトリウムポリソルベート20、ポリソルベート80、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリグリセリルエステルモノオレイン酸ポリグリセリル、モノカプリル酸デカグリセリルジカプリル酸プロピレングリコールモノステアリン酸トリグリセロールモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、Tween(登録商標)、Span(登録商標)20、Span(登録商標)40、Span(登録商標)60、Span(登録商標)80、Brig30、またはそれらの2種以上の混合物からなる群から選択される前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項25

1から99体積%のテルペン、0から99体積%の界面活性剤、および1から99%の中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項26

約10から約67重量%のテルペン、約0.1から約10重量%の界面活性剤、および約40から約90重量%の中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む請求項25に記載の組成物。

請求項27

細菌または真菌を殺菌するのに適している前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項28

カビを殺菌するのに適している前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項29

マイコプラズマを殺菌するのに適している前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項30

用いられるテルペンが、食品グレードである前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項31

食品グレードの追加活性成分を含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項32

食品グレードの追加活性成分が、抗微生物剤または酵素である請求項31に記載の組成物。

請求項33

抗微生物剤、抗真菌剤殺虫剤抗炎症剤、または麻酔剤を含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項34

抗酸化剤をさらに含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項35

抗酸化剤が、ローズマリー油ビタミンC、またはビタミンEである請求項34に記載の組成物。

請求項36

乾燥粉末の形態である前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項37

ペレット剤錠剤、または他の固体形態である請求項1〜35のいずれか一項に記載の組成物。

請求項38

液体混入されたとき、組成物の分散を促進する分散剤を含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項39

液体、固体、またはゲル様形態の農業的に、あるいは食品または医薬品として許容される担体または賦形剤との組合せである前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項40

液体に懸濁または溶解された請求項1〜35のいずれか一項に記載の組成物。

請求項41

液体が水である請求項40に記載の組成物。

請求項42

約500から約10000ppmの中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含み、それらの粒子が、約1から約67%のテルペン成分を含有する請求項40または41のいずれかに記載の組成物。

請求項43

約1000から約2000ppmの中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含み、それらの粒子が、約10から約50重量%のテルペン成分を含有する請求項42に記載の組成物。

請求項44

約1ppmから約25pptのテルペン成分を含む請求項40〜43のいずれか一項に記載の組成物。

請求項45

約100から1000ppmのテルペン成分を含む請求項44に記載の組成物。

請求項46

溶液または懸濁液を形成するために、水、食塩水デキストロース水溶液グリセロール、またはエタノールに分散されている請求項1〜39のいずれか一項に記載の組成物。

請求項47

湿潤剤乳化剤、またはpH緩衝剤を含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項48

ヒトまたは動物の食品または飲料液体材料に分散された前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項49

経口投与に適した形態である前記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項50

非経口投与に適した形態である請求項1〜46のいずれか一項に記載の組成物。

請求項51

局所投与に適した形態である請求項1〜46のいずれか一項に記載の組成物。

請求項52

テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を調製する方法であって、a)テルペン成分を提供するステップ、b)中空グルカン粒子または細胞壁粒子を提供するステップ、c)テルペン封入に適した条件下で、テルペン成分をグルカン粒子または細胞壁粒子と共にインキュベートするステップ、およびd)テルペン成分を封入しているグルカン粒子または細胞壁粒子を回収するステップを含む方法。

請求項53

テルペン成分を封入しているグルカン粒子または細胞壁粒子を乾燥するステップをさらに含む請求項52に記載の方法。

請求項54

乾燥が、凍結乾燥流動層乾燥ドラム乾燥、または噴霧乾燥によって達成される請求項53に記載の方法。

請求項55

ステップa)において、テルペン成分が、水性溶媒の懸濁液として提供される請求項52〜54のいずれか一項に記載の方法。

請求項56

テルペン成分が、界面活性剤と結合して提供される請求項55に記載の方法。

請求項57

界面活性剤が、全反応混合物の約0.1から10体積%の濃度のモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである請求項56に記載の方法。

請求項58

ステップa)において、テルペン成分が、水性溶媒の真溶液として提供される請求項52〜54のいずれか一項に記載の方法。

請求項59

ステップb)において、中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、水または他の適切な液体の懸濁液として提供される請求項52〜58のいずれか一項に記載の方法。

請求項60

懸濁液が、1ml当たり約1から1000mgのグルカン粒子または細胞壁粒子を含む請求項59に記載の方法。

請求項61

粒子が、流体力学的体積HV)から1.5HVの体積の液体に分散されている請求項59に記載の方法。

請求項62

ステップb)において、中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、乾燥粉末として提供される請求項52〜58のいずれか一項に記載の方法。

請求項63

ステップc)において、反応が、約20から37℃の温度で大気圧において行われる請求項52〜62のいずれか一項に記載の方法。

請求項64

微生物殺す方法であって、−前記微生物を、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物と接触させるステップを含む方法。

請求項65

植物の感染を処置または予防する方法であって、−テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物を、治療上有効量で、植物、または植物近くの土壌投与するステップを含む方法。

請求項66

植物の感染が、線虫に起因する請求項65に記載の方法。

請求項67

植物の感染が、真菌に起因する請求項65に記載の方法。

請求項68

真菌が、ベト病、ウドンコ病、またはボトリチス腐敗病菌である請求項67に記載の方法。

請求項69

植物がブドウの木である請求項65〜68のいずれか一項に記載の方法。

請求項70

組成物が、植物から作物収穫される21日前以降に投与される請求項65から69のいずれか一項に記載の方法。

請求項71

組成物が、収穫の14日前以降に投与される請求項70に記載の方法。

請求項72

組成物が、収穫の7日前以降に投与される請求項71に記載の方法。

請求項73

組成物が、収穫の3日前以降に投与される請求項72に記載の方法。

請求項74

組成物が、噴霧によって投与される請求項65〜73のいずれか一項に記載の方法。

請求項75

組成物が、500L/Ha以上の割合で噴霧される請求項74に記載の方法。

請求項76

組成物が、900L/Ha以上の割合で噴霧される請求項75に記載の方法。

請求項77

組成物が、1200L/Ha以上の割合で噴霧される請求項76に記載の方法。

請求項78

組成物が、灌漑によって投与される請求項65〜73のいずれか一項に記載の方法。

請求項79

本発明はさらに患者において感染を予防または処置する方法を提供し、−テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物を、治療上有効量で前記患者に投与するステップを含む方法。

請求項80

患者の感染が、黄色ブドウ球菌(Staphylococcusaureus)、アスペルギルスフミガーツス(Aspergilliusfumigatus)、マイコプラズマアイオワエ(Mycoplasmaiowae)、ペニシリウム属(Penicilliumsp.)、またはマイコプラズマニューモニエ(Mycoplasmapneumoniae)に起因する請求項79に記載の方法。

請求項81

組成物が、経口、経膣、経直腸吸入局所、または非経口経路で投与される請求項80に記載の方法。

請求項82

患者または植物において感染の予防または処置に用いるための、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子を含む組成物。

請求項83

患者の感染を処置する薬剤の製造における、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子の使用。

請求項84

感染が、アスペルギルスフミガーツス(Aspergilliusfumigatus)、スクレロチニアホモエオカルパ(Sclerotintahomeocarpa)、リゾクトニアラニー(Rhizoctoniasolani)、コレトトリカムグラミニコーラ(Colletotrichumgraminicola)、またはペニシリウム属(Penicilliumsp.)に起因する請求項83に記載の使用。

発明の詳細な説明

0001

本発明は、テルペン、および中空グルカン粒子、または細胞壁粒子を含む組成物、ならびにそのような組成物を調製するための方法に関する。それらの組成物は、テルペンの安定性および活性を増大し、テルペンに適切な担体を提供する。本発明はさらに、医学獣医学、および農業の分野において、そのような組成物を使用する方法に関する。

0002

テルペンは、自然界に、主として精油の成分として植物に広く存在する化合物である。テルペンのビルディングブロックは、炭化水素イソプレン(C5H8)nである。テルペンの例には、シトラールピネンネロール、β−イオノンゲラニオールカルバクロールオイゲノールカルボンテルペニオール(terpeniol)、アネトールカンファーメントールリモネンネロリドールファルネソールフィトールカロテンビタミンA1)、スクアレンチモールトコトリエノールペリリルアルコールボルネオールミルセンシメン(simene)、カレン、テルペネン、およびリナロールが含まれる。

0003

テルペンは、一般的に安全と認められる物質(Generally Recognized as Safe)(GRAS)として分類されており、香料およびアロマ業界で長年にわたって用いられている。ラットでのシトラールのLD50は、約5g/kgであり、これらの化合物が比較的安全であることをさらに示している。さらに、テルペンは酸素(たとえば、空気)に暴露後、約28日という比較的短い寿命を有する。テルペンはCO2と水に分解する。このテルペンの分解または破壊は、本発明の組成物および方法の安全性および環境保全性を実証している。

0004

テルペンは、癌細胞の増殖を阻害し、腫瘍の大きさを縮小し、コレステロールレベルを低下し、in vitroで微生物に対する殺菌作用を有することが見出されている。Owawunmi(Letters in Applied Microbiology、1993、9(3):105〜108)は、0.01%超のシトラールを含む増殖培地大腸菌(E.coli)の濃度を低減し、0.08%では殺菌作用のあることを示した。米国特許第5673468号は、消毒または防腐性洗浄剤として用いられる、パイン油ベースとするテルペン製剤を記載している。米国特許第5849956号は、コメから発見されたテルペンが抗真菌活性を有することを教示している。米国特許第5939050号は、2または3テルペンの組合せを含む口腔衛生抗微生物製品相乗効果を示したことを記載している。いくつかの米国特許(米国特許第5547677号、第5549901号、第5618840号、第5629021号、第5662957号、第5700679号、第5730989号)は、ある種の水中油型エマルションが抗微生物、アジュバント、および送達特性を有することを教示している。テルペンは、様々な作用機序を介して作用する、有効かつ非毒性の食事性抗腫瘍剤であることがわかっている(Crowell等、Crit.Rev.Oncog.1994、5(1):1〜22;Crowell等、Adv.Exp.Med.Biol.1996、401:131〜136)。テルペン類のゲラニオール、トコトリエノール、ペリリルアルコール、β−イオノン、およびd−リモネンは、肝臓のHMG−CoA還元酵素活性、コレステロール合成の律速段階を抑制し、動物のコレステロールレベルを緩やかに低下する(Elson等、J.Nutr.1994、124:607〜614)。d−リモネンおよびゲラニオールは、乳腫瘍を低減し(Elegbede等、Carcinogenesis、1984、5(5):661〜664;Elegbede等、J.Natl.Cancer Inst.1986、76(2):323〜325;Karlson等、Anticancer Drugs、1996、7(4):422〜429)、移植腫瘍の増殖を抑制した(Yu等、J.Agri.Food Chem.1995、43:2144〜2147)。

0005

テルペンはさらに、in vitroで細菌および真菌(Chaumont等、Ann.Pharm.Fr.1992、50(3):156〜166;Moleyar等、Int.J.Food Microbiol、1992、16(4):337〜342;およびPattnaik等、Microbios、1997、89(358):39〜46)、ならびにいくつかの内部および外部寄生生物(Hooser等、J.Am.Vet.Med.Assoc.1986、189(8):905〜908)の増殖を阻害することがわかっている。ゲラニオールは、カリウム漏出速度を増大し、膜流動性を妨げることによって、カンジダアルビカンス(Candida albicans)およびサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株の増殖を阻害することがわかっている(Bard等、Lipids、1998、23(6):534〜538)。β−イオノンは、胞子発芽の阻害、および寒天での増殖阻害によって判別された抗真菌活性を有する(Mikhlin等、A.Prikl.Biokhim.Mikrobiol、1983、19:795〜803;Salt等、Adam.Physiol.Molec.Plant Path、1986、28:287〜297)。テプレノンゲラニルゲラニルアセトン)は、ヘリコバクターピロリ(H.pylori)に抗菌作用を有する(Ishii、Int.J.Med.Microbiol.Virol.Parasitol.Infect.Dis.1993、280(1−2):239〜243)。1%のローズ油を含む市販製品Rosanolは、いくつかの細菌(シュードモナス(Pseudomonas)、ブドウ球菌(Staphylococus)、大腸菌、およびヘリコバクターピロリ)の増殖を阻害することが示されている。ゲラニオールは、ローズ油の活性成分(75%)である。ローズ油とゲラニオールは2mg/lの濃度で、in vitroにおいてヘリコバクターピロリの増殖を阻害した。いくつかの薬草剤の抽出物は、ヘリコバクターピロリに阻害作用を有することが示されており、もっとも有効なものはデカーシノールアンゲレート(decursinol angelate)、デカーシンマグノロールベルベリン桂皮酸デカーシノール、および没食子酸である(Bae等、Biol.Pharm.Bull.1998、21(9)990〜992)。カシューアップルアナカルド酸、および(E)−2−ヘキセナールは、ヘリコバクターピロリに対して殺菌作用を示した。

0006

ジテルペン、すなわちトリコラダルA(trichorabdal A)(R.トリコカルパ由来)は、ヘリコバクターピロリに対して非常に強い抗菌作用を示した(Kadota等、Zentralbl.Bakteriol、1997、287(1):63〜67)。

0007

11種の異なるテルペンの溶液が、in vitro試験病原性細菌の増殖の阻害に有効であり、100ppmから1000ppmの範囲のレベルが有効であった。テルペンは1%ポリソルベート20を含む水に希釈された(Kim等、J.Agric.Food Chem.1995、43:2839〜2845)。

0008

微生物に対するテルペンの様々な作用様式が存在する可能性があり、それらは(1)細胞膜リン脂質二重層を妨げ、(2)種々の酵素系(HMG還元酵素)を阻害し、(3)遺伝物質を破壊または不活化することができる。テルペンの作用様式が非常に基本的であるため、たとえばコレステロールを遮断するため、感染因子はテルペンに対する耐性を作ることができないと考えられている。

0009

しかしながら、テルペンの使用にはいくつかの欠点がある。それらには以下のものが含まれる。
−テルペンは液体であるため、取り扱いが困難となり、ある種の目的には不適切となり得る。
−テルペンはあまり水と混和性でなく、水性エマルションを調製するために、一般に洗剤界面活性剤、または他の乳化剤の使用を必要とする。しかしながら、高剪断下でテルペンを混合することによって、安定な溶液を得ることができる。
乾燥粉末テルペン製剤は、一般に低重量パーセントのテルペンを含むのみである。
−テルペンは、水性エマルション系酸化する傾向があり、長期貯蔵が問題となる。

0010

成分送達系を提供するための現在の噴霧被覆、押し出し、コアセルベーション分子封入、および噴霧乾燥/冷却の技法には限界がある。

0011

パン酵母細胞壁はパン酵母細胞に由来し、不溶性バイオポリマー、β−1,3−グルカン、β−1,6−グルカン、マンナン、およびキチンからなる。それらは典型的に、空洞を囲む厚さわずか0.2〜0.3ミクロン外皮膜を有する直径2〜4ミクロンのミクロスフェアである。この物質は相当な液体保持能力を有し、典型的にその重量の5〜25倍の液体を吸収する。外皮は充分に多孔性であり、150000ダルトンまでの大きさのペイロードが外皮を通過し、球形粒子中空の空洞に吸収されることができる。パン酵母細胞壁は、いくつかの独特な特性を有し、それらの特性には熱安定性(たとえば、121℃まで)、剪断安定性、pH安定性(たとえば、pH2〜12)、および高濃度で著しい粘性を形成しないことが含まれる。その物理的特性に加えて、この組成物は心血管および免疫増強的な健康上の利益をもたらす天然の健康的な食物繊維を含有する。

0012

酵母細胞壁は、酵母細胞可溶性成分から不溶性粒子画分を抽出および精製することによって、酵母細胞から調製される。真菌細胞壁は、酵母抽出物製造の不溶性副生成物から生成することができる。さらに、酵母細胞は、酵母細胞壁を破壊することなく、水酸化物水溶液で処理することができ、それにより細胞のタンパク質および細胞内タンパク質消化され、酵母細胞壁成分は著しくタンパク質に汚染されないまま残され、実質的に変化していないβ(1−6)およびβ(1−3)結合グルカンの細胞壁を有することになる。全グルカン粒子およびそれらを調製する方法のより詳しい説明は、Jamas等によって、米国特許第4810646号、ならびに同時係属米国特許出願第166929号、第297752号、および第297982号に記載されている。Novogen Research Pty Ltd.に譲渡された米国特許第6242594号は、アルカリ抽出、酸抽出、次いで有機溶媒で抽出し、最後に乾燥することによって、酵母グルカン粒子を調製する方法を記載している。AS Biotech−Mackzymalに譲渡された米国特許第5401727号は、酵母グルカン粒子を得る方法、ならびに水生動物において抵抗力を高めるために、およびワクチン接種のアジュバントとしてそれらを用いる方法を開示している。Alpha−Beta Technology Inc.に譲渡された米国特許第5607677号は、種々の薬剤を送達するためのアジュバントおよび送達パッケージとしての中空全グルカン粒子の使用を開示している。上述の特許および出願の教示は、参照により本明細書の一部とする。

0013

他の種類の酵母および真菌細胞は、グルカンを含有しない細胞壁を有する。そのような酵母および真菌の細胞壁は、細胞壁粒子を得るために上述したものと類似の技法によって単離できる。

0014

さらに、多くの植物、藻類、細菌、および他の微生物の細胞も細胞壁を含む。細胞壁の構造および構成は微生物間で異なるが、一般に強固であり、比較的不活性な構造である。酵母に関して上に述べたような通常の技法によって、そのような細胞由来の細胞壁粒子を得ることができる。

0015

本出願人等はここに、テルペンを吸収させ、中空グルカン粒子または細胞壁粒子内部に安定に封入できることを見出した。そのような粒子へのテルペンの封入は、粒子をテルペンと共にインキュベートすることによって達成できる。

0016

本発明によれば、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物が提供される。

0017

本明細書では、「中空グルカン粒子」という用語には、構造成分としてグルカンを含む任意の中空粒子が含まれる。したがって、特にこの用語には、酵母細胞壁(精製または未精製形態)、または中空全グルカン粒子が含まれる。「細胞壁粒子」という用語は、グルカンが構造成分ではない、細胞の壁(精製または未精製形態)を含む粒子を指す。適切な粒子には、植物、藻類、真菌、または細菌細胞の細胞壁が含まれる。細胞壁粒子は一般に、それらが由来する細胞の形状を保持しており、したがって中空グルカン粒子のように、テルペン成分の封入に適した中空の中心腔を提供する。

0018

本発明では、中空グルカン粒子または細胞壁粒子は安定にテルペン成分を封入できる必要がある。一般にこれは、中空グルカン粒子または細胞壁粒子が、テルペン成分(一般に、テルペン成分は比較的高濃度である)と共にインキュベートされる間、その構造を維持できなければならず、テルペン成分が、粒子内に移動できなければならないことを意味する。中空グルカン粒子および細胞壁粒子は一般に、比較的不活性な材料から形成され、多孔性であり、したがって一般に、中空グルカン粒子および細胞壁粒子はテルペン成分を封入できると想定され得る。

0019

本発明による組成物は、細菌、ウイルスマイコプラズマ、真菌、および/または線虫を含む種々の感染因子に対して有効である。

0020

本発明による組成物は、以下の利点を提供することができる。
−テルペンのペイロードを最大にする。
−封入されていないペイロードを最小にする。
−ペイロード安定性を制御する。
−ペイロード放出動態を制御する。
−質量および均一性を増大するために、液体テルペンの固体形態を作る。
−テルペンの取り扱いおよび適用を簡易にする。
−テルペンのにおいおよび味をマスキングする。

0021

特に適切な中空グルカン粒子または細胞壁粒子は、真菌細胞壁、好ましくは酵母細胞壁である。酵母細胞壁は、それらが由来する酵母細胞の三次元構造を保持する酵母細胞の調剤である。したがって酵母細胞壁は、テルペン成分が酵母細胞壁内部に封入されることを可能にする中空構造を有する。酵母壁は、適切にはパン酵母細胞に由来することができる(Sigma Chemical Corp.、St.Louis、MOから入手可能)。所望の特性を有する酵母細胞壁粒子は、Nutricell MOS 55の商品名で、Biorigin(Sao Paolo、Brazil)から得ることもできる。これらの粒子は、サッカロマイセスセレビシエの噴霧乾燥抽出物である。

0022

代替となる粒子は、SAF−Mannan(SAF Agri、Minneapolis、MN)、およびNutrex(Sensient Technologies、Milwaukee、WI)の商品名で知られているものである。これらは、酵母抽出物製造工程からの不溶性廃棄流である、中空グルカン粒子である。酵母抽出物の生成中、部分的に自己消化された酵母細胞の可溶性成分は除去されるが、不溶性残留物はテルペンの取り込みに適した材料である。これらの中空グルカン粒子は、約25〜35重量%のβ−1,3−グルカンを含む。これらの材料の重要な特性は、それらが10重量%超の脂質を含有し、テルペンの吸収に非常に有効なことである。さらに、廃棄流産物であるため、それらは中空グルカン粒子の比較的安価な供給源である。

0023

より高い純度を有する代替となる中空グルカン粒子は、Nutricepts(Nutricepts Inc.、Burnsville、MN)およびASA Biotechによって製造されるものである。これらの粒子は、追加の細胞内成分を除去し、細胞壁のマンノプロテイン外層を除去して、グルカン50〜65重量%の粒子を生じるように、アルカリ抽出されている。

0024

より高い純度の中空グルカン粒子は、Biopolymer EngineeringのWGP粒子である。これらの粒子は、追加の酵母成分を除去して、グルカン75〜85重量%の生成物を生じるように、酸抽出されている。

0025

非常に純度の高い中空グルカン粒子は、Alpha−beta Technology Inc.(Worcester、MA)のAdjuvax(商標)、およびNovogen(Stamford、CT)の微粒子グルカンである。これらの粒子は、残留脂質を除去し、それにより粒子が90重量%超のグルカンを含むように、有機溶媒抽出されている。

0026

いくつかの実施形態において、たとえば予想される汚染物質を厳密に制御する必要がある場合、高純度のグルカン粒子または細胞壁粒子が必要とされる可能性がある。このような場合、他の純度の低い生成物より、さらに純度の高い粒子が好ましい。他の実施形態では、経済的理由から、純度の低い粒子が好ましく、それらの粒子も、テルペンの吸収においてより有効であることがわかっている。

0027

好ましくは、中空グルカン粒子または細胞壁粒子は、脂質1または2重量%のような、わずかな脂質含量を有する。わずかな含量の脂質が、テルペン成分を封入する粒子の能力を高めることができる。好ましくは、中空グルカン粒子または細胞壁粒子の脂質含量は、5重量%以上、より好ましくは10重量%以上である。

0028

場合によって、本発明のテルペン成分は、界面活性剤と会合させることができる。界面活性剤は、非イオン性カチオン性、またはアニオン性であることができる。適切な界面活性剤の例には、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリグリセリルエステルモノオレイン酸ポリグリセリル、モノカプリル酸デカグリセリルジカプリル酸プロピレングリコールモノステアリン酸トリグリセロールポリオキシエチレンソルビタン、モノオレエート、Tween(登録商標)、Span(登録商標)20、Span(登録商標)40、Span(登録商標)60、Span(登録商標)80、Brig30、またはそれらの混合物が含まれる。界面活性剤は、エマルションにおいてテルペン成分を保持するように作用し、さらに中空グルカン粒子または細胞壁粒子へのテルペン成分の封入を助ける。

0029

本発明のテルペン成分は、単一のテルペン、またはテルペンの混合物を含むことができる。テルペンの混合物は、相乗効果をもたらし得る。

0030

本明細書では、「テルペン」という用語は、式(C5H8)nのテルペンだけでなく、テルペンアルデヒド、またはテルペンポリマーなどのテルペン誘導体包含する。天然および合成テルペンが含まれ、たとえば、モノテルペンセスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、およびテトラテルペンである。さらに、化合物の単一名への言及は、その化合物の種々の異性体を包含するものとする。たとえば、シトラールという用語には、cis異性体シトラール−a(または、ゲラニアール)、およびtrans異性体シトラール−b(または、ネラール)が含まれる。

0031

テルペンは、それらを含有する抽出物または精油の名称、たとえばレモングラス油(シトラール含有)でも知られていることに留意されたい。

0032

米国の規制の妨げを受けず、EPA規制40C.F.R.Part 152(その全体を参照により本明細書の一部とする)に挙げられているテルペンが本発明での使用に適している。

0033

特に本発明での使用に適しているテルペンには、シトラール、ピネン、ネロール、β−イオノン、ゲラニオール、カルバクロール、オイゲノール、カルボン(たとえば、L−カルボン)、テルペニオール、アネトール、カンファー、メントール、チモール、リモネン、ネロリドール、ファルネソール、フィトール、カロテン(ビタミンA1)、スクアレン、チモール、トコトリエノール、ペリリルアルコール、ボルネオール、ミルセン、シメン、カレン、テルペネン、リナロール、およびそれらの混合物からなる群から選択されたものが含まれる。

0034

好ましくは、本発明に用いられるテルペンは、一般構造C10H16を有するものであり、このサブグループは一般に感染因子に対してより有効である。

0035

より好ましくは、テルペン成分は、ゲラニオール、チモール、シトラール、カルボン(たとえば、L−カルボン)、オイゲノール、およびβ−イオノンからなる群から選択されたテルペンを含む。

0036

このテルペンは真菌植物感染の処置又は予防に特に有効であることが示されているため、テルペン成分は、適切にはチモールを含むことができる。

0037

特に適した他のテルペンは、いくつかの微生物に対して特に有効であることが実証されているシトラールである。

0038

ゲラニオール、チモール、およびオイゲノールの組合せは、植物感染に対抗するのに特に有効であることが実証されており、したがって、特に適したテルペン成分である。

0039

植物感染の処置に高い有効性を示している他のテルペン製剤には、以下のものが含まれる(パーセントは重量による)。
−100%チモール、
−50%ゲラニオール、および50%チモール、
−50%オイゲノール、および50%チモール、
−33%ゲラニオール、33%オイゲノール、および33%チモール、
−33%オイゲノール、33%チモール、および33%シトラール、
−25%ゲラニオール、25%オイゲノール、25%チモール、および25%シトラール、
−20%ゲラニオール、20%オイゲノール、20%シトラール、20%チモール、および20%L−カルボン。

0040

したがって、上述の製剤のいずれかを含むテルペン成分が、本発明での使用に特に適している。

0041

一実施形態において、テルペン成分は、酸素を含有する1種または複数のテルペンを含む。シトラール、たとえばシトラール95は、酸素添加C10H16テルペン、C10H16O CAS No.5392−40−5(3,7−ジメチル−2,6−オクタジエン−1−アール)である。シトラールの安定な懸濁液は、約2500ppmまで形成することができる。シトラールは、約500ppmまで溶液として製造することができる。25pptシトラールのシトラールを取り込んでいる中空グルカン粒子の安定な懸濁液を製造することができる。

0042

本発明の組成物は、1から99体積%のテルペン、0から99体積%の界面活性剤、および1から99%の中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含むことができる。より詳細には、組成物は、約10重量%から約67重量%のテルペン、約0.1〜10%の界面活性剤、および約40〜90%の中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含むことができる。

0043

適切には、本発明の組成物は、約500から約10000ppmの中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含み、これらの粒子は、約1から約67%のテルペン成分を含有する。好ましくは、組成物は、約1000から約2000ppmの中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含み、これらの粒子は、約10から約50%のテルペン成分を含有する。

0044

特定の組成物には、たとえば、細菌および真菌の場合、67%までのL−カルボン、67%までのオイゲノール、67%までのシトラール、67%までのチモールおよびL−カルボン、67%までのゲラニオール、または67%までのシトラールおよびL−カルボンおよびオイゲノール、ならびに1%のTween(登録商標)80を含む、水または標準0.9%食塩水中のテルペン封入中空グルカン粒子または細胞壁粒子、カビの場合、67%までのシトラール、および1%のTween(登録商標)80を含む、水または標準0.9%食塩水中のテルペン封入中空グルカン粒子または細胞壁粒子、あるいはマイコプラズマの場合、67%までのシトラール、67%までのL−カルボンおよびオイゲノール、67%までのオイゲノール、67%までのゲラニオール、または67%までのゲラニオールおよびチモール、ならびに1%のTween(登録商標)80を含む、水または標準0.9%食塩水中のテルペン封入中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含むことができる。

0045

1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、130、140、150、160、175、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1250、1375、1425、1500、1600、1750、または2000ppmのテルペン封入中空グルカン粒子または細胞壁粒子の濃度を、本発明の組成物および方法において、有効濃度として用いることができる。さらに高い濃度(25ppt(すなわち1000分の1)まで)を製造することができ、本発明において有用である可能性がある。

0046

本発明の組成物は、約1ppmから約25ppt(25000ppm)のテルペン成分、好ましくは100から2000ppmのテルペン成分、たとえば250、500、1000、2000ppmのテルペン成分を含むことができる。

0047

本発明のテルペン、界面活性剤、および他の成分は、容易に購入できるか、または合成化学者に一般に知られている技法を用いて合成することができる。

0048

本発明に用いられるテルペンは、安全および規制上の理由から、少なくとも食品グレードのテルペン(米国FDAまたは米国外の同等の国内規制機関によって規定されたもの)であることが非常に好ましい。

0049

場合によって、組成物は、テルペン成分に加えて、他の食品グレードの活性成分、たとえば他の抗微生物剤酵素などを含むことができる。

0050

場合によって、組成物は、テルペン成分に加えて、さらなる活性剤、たとえば抗微生物剤、抗真菌剤殺虫剤抗炎症剤麻酔剤などを含むことができる。適切な薬剤には、以下のものが含まれる。
−抗真菌剤:細胞壁ヒドロリアーゼ(中空グルカン粒子または細胞壁粒子を分解しないと想定される)、細胞壁合成阻害剤、標準的な抗真菌剤、
抗菌剤防腐剤、細胞壁加水分解酵素、合成阻害剤、抗生物質
−殺虫剤:天然殺虫剤、キチナーゼ

0051

この組成物は、テルペンの酸化を低減するために、抗酸化剤を含むことができる。そのような抗酸化剤の例は、ローズマリー油ビタミンC、またはビタミンEであることができる。

0052

本発明の組成物は、乾燥粉末の形態であることができる。組成物は、液体、固体、またはゲル様形態で、農業的に、あるいは食品または医薬品として許容される担体または賦形剤と組み合わせて提供することができる。

0053

固体組成物の場合、適切な担体には、医薬品グレードマンニトールラクトースデンプンステアリン酸マグネシウムサッカリンナトリウムタルクセルロースグルコーススクロース炭酸マグネシウムなどが含まれる。適切には、製剤は、錠剤またはペレット剤の形態である。適切であれば、担体はヒトまたは動物の食品材料であることもできる。さらに、通常の農業用担体も用いることができる。

0054

組成物のペレット剤、錠剤、または他の固体形態は、好ましくは、たとえば水などの液体に混入されたときに、組成物の分散を促進する分散剤も含有することができる。適切な分散剤には、キサンタンガムマルトデキストリンアルギン酸塩などが含まれる。

0055

液体組成物は、たとえば、組成物を水、食塩水、デキストロース水溶液グリセロールエタノールなどに分散して、溶液または懸濁液を形成することによって調製することができる。所望であれば、これらの組成物は、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤(たとえば、酢酸ナトリウムモノラウリン酸ソルビタントリエタノールアミン酢酸ナトリウム、またはオレイン酸トリエタノールアミン)などの少量の非毒性補助物質を含有することができる。そのような液体組成物を調製する方法は、当業者に知られているかまたは明らかであり、たとえば、参照により本明細書の一部とするRemington:The Science and Practice of Pharmacy;Lippincott、Williams、Wilkins(2000年12月15日)を参照されたい。液体組成物も、ヒトまたは動物の食品または飲料液体材料に組成物を分散することによって調製することができる。さらに、適切な農業用液体賦形剤を用いることができる。

0056

経口投与用錠剤および顆粒剤は、一般に好ましい。錠剤は、結合剤および潤滑剤を含有することができる。微粉または顆粒剤は、希釈剤、分散剤、および/または界面活性剤を含有することができ、水またはシロップ中に存在させることができる。カプセル剤または小袋剤は、好都合には、乾燥状態の組成物を含有できる。組成物の非水性溶液または懸濁液も適しており、懸濁化剤を含有することができる。所望であるか、または必要である場合、香料、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、または乳化剤を含有させることができる。当然ながら、経口送達方法として、食品または飲料材料の使用も適している。

0057

非経口投与は一般に、注射を特徴とする。注射剤の場合、一般に、組成物に用いられるすべての材料、および用いられる任意の賦形剤は、医薬品グレードでなければならないことが理解されるであろう。注射剤は、液体溶液、エマルション、または懸濁液、注射前に液体に溶解、懸濁するのに適した固体形態、あるいはエマルションとして、通常の形態で調製することができる。非経口投与の別のアプローチには、一定レベルの投与量が維持されるように、徐放または持続放出系を使用することが含まれる。たとえば、参照により本明細書の一部とする、米国特許第3710795号を参照されたい。非経口用の調剤はさらに、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤を含有することができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコールポリエチレングリコール植物油オリーブ油など)、および注射可能有機エステルオレイン酸エチルなど)である。水性担体には、水、アルコール性水性溶液、エマルション、または懸濁液が含まれ、食塩水、および緩衝媒質が含まれる。他の非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液リンゲル液デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈に用いるビヒクルには、流体栄養補給剤電解質補給剤(リンゲル液デキストロースをベースとするものなど)などが含まれる。保存剤、または他の添加剤、たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤不活性ガスなども存在できる。

0058

局所投与の場合、液剤懸濁剤ローション剤クリーム、ゲル、軟膏ドロップ坐剤噴霧剤、および粉剤を用いることができる。必要であるか、または所望であれば、通常の薬剤担体水性粉末、または油性基剤、増粘剤などを用いることができる。

0059

本発明はさらに、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を調製する方法を提供し、前記方法は、
a)テルペン成分を提供するステップ
b)中空グルカン粒子または細胞壁粒子を提供するステップ、
c)テルペン封入に適した条件下で、テルペン成分をグルカン粒子または細胞壁粒子と共にインキュベートするステップ、および
d)テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を回収するステップを含む。

0060

場合によって、上述の方法はさらに、テルペン成分を封入している粒子を乾燥するステップを含むことができる。乾燥はいくつかの方法で達成することができ、凍結乾燥流動層乾燥ドラム乾燥、または噴霧乾燥を挙げることができるが、いずれもよく知られた方法である。

0061

上述のステップa)において、テルペン成分は、適切には、場合によって界面活性剤の存在下、水性溶媒の懸濁液として提供される。適切には、溶媒は水である。適切な界面活性剤は、Tween80(モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン)であり、好ましくは、界面活性剤は全反応混合物の約0.1から10体積%、より好ましくは約1%の濃度で存在する。あるいは、テルペン成分は、溶媒、たとえば水の真溶液として提供することもできる。水のテルペン真溶液は、真溶液が得られるまで、高剪断下、水中でテルペンを混合することによって得ることができる。国際公開第03/020024号パンフレットは、水のテルペン真溶液の形成に関するさらなる詳細を提供している。

0062

上述のステップb)において、中空グルカン粒子または細胞壁粒子は、適切には、水または他の適切な液体の懸濁液として提供される。適切には、懸濁液は、1ml当たり約1から1000mgの粒子、好ましくは200から400mg/mlの粒子を含む。あるいは、粒子は乾燥粉末として提供し、テルペン−界面活性剤懸濁液に添加することができる。

0063

あるいは、粒子は、最小限度に粒子を水和するのに充分であるが、著しく過剰ではない液体に提供される。「流体力学的体積」(HV)という用語は、最小限度に粒子を水和するのに必要とされる液体の体積を説明するために用いられる。したがって適切には、粒子は、HVからHVの1.5倍(1.5HV)の範囲となる体積で提供される。これによって、それに続く乾燥ステップがより効率的になる。また、低量の液体が用いられる場合(すなわち、およそHVから1.5HV)、最終生成物ペレットまたはヌードル形態に押し出すことも可能であり、流動層乾燥に好都合である。

0064

テルペン成分は、室温で中空グルカン粒子または細胞壁粒子に封入され得ることが見出された。しかしながら、封入速度は37℃で増大するが、温度は組成物の任意の成分の沸点または変性温度より低く維持されるべきである。したがって、上述の方法のステップc)の適切な条件は、20から37℃の温度で大気圧である。特定の封入反応に関する条件の最適化は、通常の実験の問題であろう。

0065

本発明はさらに、微生物を殺す方法を提供し、前記方法は、
a)前記微生物を、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物と接触させるステップを含む。

0066

適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

0067

本発明はさらに、患者において感染を予防または処置する方法を提供し、前記方法は、
a)テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物を、治療上有効量で前記患者に投与するステップを含む。

0068

適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

0069

患者の感染は、任意の感染因子に起因するものであることができる。それらの感染因子の例には、これに限定されるものではないが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、アスペルギルスフミガーツス(Aspergillius fumigatus)、マイコプラズマアイオワエ(Mycoplasma iowae)、ペニシリウム属(Penicillium sp.)、およびマイコプラズマニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)が含まれる。

0070

内部投与の場合、組成物は、経口、経膣、経直腸吸入、または非経口経路、たとえば、皮内、皮下、筋内、腹腔内、直腸内、動脈内、リンパ内、静脈内、髄腔内、および気管内経路で投与することができる。これらの経路に適した組成物の製剤は、上述のものである。

0071

外部処置の場合、組成物は、局所的に、たとえばクリーム剤、または軟膏剤として、あるいは創傷を処置するための乾燥粉剤として適用することができる。

0072

上述の方法において投与されるテルペンの量は、所望の結果、すなわち感染の予防および/または処置を達成するのに明らかに充分な量であるべきだが、患者に重大な毒性作用を誘発するレベルであるべきではない。

0073

当然ながら、投与される組成物の量は、処置される患者に対する投与様式、すなわち体重、年齢、状態、性別、および対象における疾患の程度、ならびに処方する医師の判断によって決まることになる。投与量、投与計画、および投与経路は多様であり得る。当業者は、当分野の一般知識、および下に記載する実施例の手順に基づいて、所与の適用での抗感染量を容易に決定することができるであろう。本明細書では、「患者」という用語は、処置が適用される任意の個体、ヒトまたは動物を指すものであることに留意されたい。したがって、患者は、家庭で飼われる動物(たとえば、ネコイヌなど)、家畜(たとえば、ウシウマブタヒツジヤギなど)、実験動物(たとえば、マウスウサギ、ラット、モルモットなど)、、およびであることができる。適切には、対象は哺乳類、特に霊長類、たとえばヒトである。

0074

さらなる実施形態において、本発明は、植物の感染を処置または予防する方法を提供し、前記方法は、
a)テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物を、治療上有効量で、植物、または植物近くの土壌に投与するステップを含む。

0075

適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

0076

テルペンは、いくつかの植物病原体を除去することが示されており(国際公開第03/020024号パンフレットを参照のこと)、さらに同時係属米国特許出願第60/538627号に記載のとおり、重要な植物寄生生物である線虫を有効に殺す。しかしながら、テルペン単独の懸濁液または溶液は、やや不安定であり、土壌環境で急速に分解し、したがって有効性を失う。

0077

中空グルカン粒子または細胞壁粒子にテルペン成分を取り込むことによって、テルペンの放出速度および分解を低減し、したがって、土壌でのテルペンの作用期間を延長することができる。

0078

適切には、上述の方法で処置または予防される植物の感染は、線虫による感染である。

0079

処置または予防することのできる他の植物感染には、真菌植物感染、特に植物の表面に影響を及ぼすものが含まれる。そのような感染には、ベト病、ウドンコ病、またはボトリチス腐敗病(botrytis bunch rot)が含まれ、これらの感染は特にブドウの木に影響を及ぼす。

0080

一実施形態において、植物感染は、以下の1種または複数に起因することができる。
アスペルギルスフミガーツス、スクレロチニアホモエオカルパ(Sclerotinta homeocarpa)、リゾクトニアラニー(Rhizoctonia solani)、コレトトリカムグラミニコーラ(Colletotrichum graminicola)、またはペニシリウム属。

0081

テルペンをベースとする植物処置の利点は、収穫直前に適用できることである。

0082

通常の多くの処置は、処置区域再入するまでに長期間を要する(一般に3週)。これは、所望の時点に作物を収穫することができないため、収穫直前の植物病害の発生は通常の処置では、処置を行えないことを意味している。本発明の組成物は、適切には、収穫までの任意の時点、たとえば、収穫前21日、収穫前14日、収穫前7日、あるいは収穫前3日またはそれ以降であっても適用できる。

0083

封入テルペンは、特にブドウのベト病、ウドンコ病、およびボトリチス房腐敗病の処置に有効性を示し、したがって、本発明は、これらの疾病を処置または予防する方法を提供する。

0084

植物感染の予防は、予防手段として、植物を封入テルペンで定期的に処置することによって達成できる。

0085

適切には、本発明の組成物は、噴霧によって適用される。これは、植物の表面に影響を及ぼす植物病害の処置に特に適している。噴霧の場合、水に2g/lの組成物を含む調剤を用いることができる。2から4g/lの濃度が特に有効であり、必要に応じて、4g/lを超える濃度を用いることができる。明らかに、用いられる組成物の濃度は、病原因子を殺すかまたは阻害するのに充分であるが、処置される植物を害するほど高濃度でないことが重要である。

0086

植物に噴霧するとき、500L/Ha以上の割合が、植物を被覆するのに適している。良好な被覆を確保するために、好ましくは900L/Ha以上、より好ましくは1200L/Ha以上の割合が用いられる。ブドウの木を処置する場合、1200L/Ha以上の割合が適切に有効であることが証明されている。

0087

本発明の組成物は、別法として灌漑によって適用することもできる。これは、線虫、あるいは他の土壌媒介性病原体または寄生生物を処置するのに特に適している。

0088

さらなる実施形態において、本発明はさらに、患者または植物において感染の予防または処置に用いるための、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物を提供する。適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

0089

さらなる実施形態において、本発明は、微生物に起因する感染を処置する薬剤の製造における、テルペン成分を封入している中空グルカン粒子または細胞壁粒子を含む組成物の使用を提供する。適切な組成物は、上により詳細に定義したものである。

0090

本発明を以下の非限定的な実施例および図を参照してさらに説明する。

0091

以下の実施例は、当業者が本発明を製造または実行することをさらに可能にするために提供されるものである。実施例は単に例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。他に別段の指示のないかぎり、部は体積部または重量部であり、指示されるとおり、温度はセ氏温度(℃)であるか、または周囲温度であり、圧力は大気圧であるか、または大気圧に近い圧力である。組成物、および組成物を製造または使用する条件、たとえば、成分の濃度、望ましい溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに記載の組成物および方法から得られる結果を最適化するために用いることのできる他の範囲および条件には、多数の変形および組合せがある。それらの最適化には、合理的かつ通常の実験のみを必要とする。

0092

実施例1−パン酵母粒子および精製酵母グルカン粒子へのテルペン取り込みの実証
以下のプロトコルを実施して、テルペンが酵母細胞壁および他の中空グルカン粒子に取り込まれることを実証した。

0093

150μlのテルペンを100μlの10%Tween80水溶液および250mlの水と混合することによって、シトラールとL−カルボンとのエマルションを調製した。

0094

パン酵母粒子(YP)、またはLevacan(商標)酵母グルカン粒子(YGP)、Savory Systems International Inc.、Branchburg、NJから入手可能、を水と混合して、250mg/mlの懸濁液を形成した。

0095

500μlのYPまたはYGP懸濁液、および250μlのテルペンエマルションを混合し、継続的に撹拌しながら、一晩インキュベートした。500μlのYPまたはYGP懸濁液、および500μlの水をコントロールとして用いた。次いで、外部のエマルションがなくなるまで、粒子を水で洗浄した。その後、乾燥するまで、粒子調剤を凍結および凍結乾燥した。

0096

その後、粒子を再水和し、光学顕微鏡検査した。結果を図1から4に示す。

0097

図1は、その中心に暗色領域を有する球形構造を示し、これらは空の中空グルカン粒子である。図2および3は、明色の内部を有する膨張した外観の球形構造を示し、これらは中心腔に封入されたテルペンを含む粒子であり、図2はシトラール、図3はL−カルボンである。図2および3では、たとえば図2の上部、中央のわずか左に、遊離テルペンの小さな塊も認められる。図4は、水に懸濁されたテルペンの小さな泡としてテルペンエマルションを示している。

0098

実施例2−パン酵母細胞壁粒子(YP)でのシトラールおよびL−カルボンの最大取り込みレベルの決定
以下のプロトコルを実施して、YPに取り込まれるテルペンの最大量を求めた。

0099

−4.5gのテルペンを0.3mlの水と超音波処理することによって、L−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。
−4.5gのTween80を40.5mlの水で超音波処理することによって、10%Tween80溶液を調製した。
−YPを水と混合して、20mg/mlの懸濁液を形成することによって、YP懸濁液を調製した。
−表1に記載したとおり、封入反応を設定した。

0100

シトラールまたはL−カルボン−水エマルションを、室温で一晩、YPおよびTween80界面活性剤と混合した。試料を14000×gで10分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。結果を、表1の遊離テルペンと表示した右側の列に示す。

0101

「遊離テルペン」という表現は、遠心分離した反応混合物において可視であるテルペンの存在を指す。遊離テルペンの不在は、テルペンが粒子に完全に吸収されていることを示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、粒子に吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの最大容量として記録した。

0102

0103

結果からわかるように、YP10mg当たり、少なくとも16.5μlのL−カルボンテルペンエマルション、または少なくとも5μlのシトラールエマルションを、YPは吸収および封入することができる。

0104

実施例3−界面活性剤によるテルペン取り込み改善の実証、およびTween80:テルペンの最適比の決定
以下のプロトコルを実施して、界面活性剤の存在がテルペンの取り込みを改善することを実証し、YPのテルペン取り込み反応に必要とされるTween80界面活性剤の最小量を求めた。

0105

−4.5gのテルペンを0.3mlの水と超音波処理することによって、L−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。
−4.5gのTween80を40.5mlの水で超音波処理することによって、10%Tween80溶液を調製した。
−YPを水と混合して、250mg/mlの懸濁液を形成することによって、パンYP懸濁液を調製した。

0106

取り込み反応を、下記の表2に示したとおり設定した。

0107

シトラールまたはL−カルボン−水エマルションを、室温で一晩、0〜10体積%のTween80界面活性剤を含むYPと混合した。試料を14000×gで10分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。結果を、表2の遊離テルペンと表示した右側の列に示す。

0108

「遊離テルペン」という表現は、遠心分離した反応混合物において可視であるテルペンの存在を指す。遊離テルペンの不在は、テルペンがYPに完全に吸収され、封入されていることを示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、YPに吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの最大容量として記録した。

0109

0110

結果からわかるように、1%のTween80の濃度(すなわち、1000μlの反応混合物中、100μlの10%Tween80)は、上述の反応において、テルペンの完全な取り込みを可能にするのに充分である。2%のTween80は結果を改善しないが、濃度0.33%では遊離テルペンが観察された。これは以下のことを示唆する。
a)界面活性剤の不在下、テルペンはYP粒子に吸収されるが、界面活性剤の存在は、テルペンの吸収を著しく増大する。
b)約1%のTween80の濃度は、適切な取り込みを確保し、同時にYP粒子のテルペンペイロードを最大にするので、YPの取り込みに最適である。

0111

実施例4−高濃度のパン酵母細胞壁粒子(YP)の最大テルペン取り込みおよび封入の決定
以下のプロトコルを実施して、YPが高濃度であるときに、YPに取り込まれるテルペンの最大量を決定した。

0112

−4.5gのテルペンを3mlの1%Tweenと超音波処理することによって、L−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。
−0.5gのTween80を9.5mlの水で超音波処理することによって、5%Tween80溶液を調製した。
−YPを水と混合して、250mg/mlの懸濁液を形成することによって、YP懸濁液を調製した。
−表3に示したとおり、封入反応を設定した。

0113

シトラールまたはL−カルボン−水エマルションを、室温で一晩、YPおよびTween80界面活性剤と混合した。試料を14000×gで10分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。結果を、表3の遊離テルペンと表示した右側の列に示す。

0114

「遊離テルペン」という表現は、遠心分離した反応混合物において可視であるテルペンの存在を指す。遊離テルペンの不在は、テルペンがYPに完全に吸収されていることを示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、YPに吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの最大容量として記録した。

0115

0116

表3の結果からわかるように、YPが高濃度であるとき、YPはテルペンを吸収および封入することができる。YP125mg当たり、少なくとも112.5μlのL−カルボンテルペンエマルション、または少なくとも75μlのシトラールテルペンエマルションを、YPは吸収および封入した。これは、テルペン封入反応が、試験範囲内のYP濃度に依存していないことを実証している。

0117

実施例5−テルペン吸収に関する市販粒子スクリーニング
以下のプロトコルを実施して、様々な種類の粒子の取り込み特性を分析した。研究した粒子は、パン酵母細胞壁粒子(Baker’s Yeast Cell Wall Particles)(Sigma Chmical Corp.、St.Louis、MO)、Nutrex(商標)Walls(Sensient Technologies、Milwaukee、WI)、SAFMannan(商標)(SAF Agri、Minneapolis、MN)、Nutricept Walls(商標)(Nutricepts Inc.、Burnsville、MN)、Levacan(商標)(Savory Systems International Inc.、Branchburg、NJ)、およびWGP(商標)(Alpha−beta Technology Inc.、Worcester、MA)であった。

0118

7gのテルペンを3mlの3.3%Tween80と超音波処理することによって、L−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。

0119

下記の表4は、純度と、1mg当たりの酵母粒子数および充填固体の重量/体積比とを比較するものである。

0120

0121

表4から、1mg当たりの粒子数は純度に反比例することが結論づけられる。したがって、WGPの1mg当たりの粒子数は、パンYPよりほぼ10倍多い。

0122

YP懸濁液を以下のように調製した。
−YP 250mg/ml 1%Tween80を混合することによって、パン酵母細胞壁粒子懸濁液(YP)を調製した。
−Nutrex YGP 163mg/ml 1%Tween80を混合することによって、Nutrex懸濁液を調製した。
−Biospringer YGP 234mg/ml 1%Tween80を混合することによって、SAFMannan懸濁液を調製した。
−Nutricepts YGP 99mg/ml 1%Tween80を混合することによって、Nutricepts懸濁液を調製した。
−Lev YGP 217mg/ml 1%Tween80を混合することによって、Levacan懸濁液を調製した。
−WGP YGP 121mg/ml 1%Tween80を混合することによって、WGP懸濁液を調製した。

0123

上述の粒子の充填体積は同一であり、等しい数の粒子が分析されたことを意味する。

0124

表5に示したとおり、取り込み反応を設定し、一晩インキュベートした。試料を14000×gで10分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現、およびペレットの封入テルペンの色を記録した。結果を、表5の右側2列に示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、粒子に吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの容量として記録した。

0125

0126

結果から、以下の結論に達した。
−低脂質含量の精製粒子は、テルペン吸収において、有効性が低かった。
−純度の低い粒子は、テルペン吸収において、より有効であった。
−SAF−Mannan(商標)に封入されたとき、シトラールの黄色分解生成物は形成しなかった。
−試験した単一テルペンレベルでの質的取り込みに基づいて、SAF Mannan(商標)が最良であり、Nutrex(商標)が2番、パン酵母細胞壁粒子が3番であると考えられる。

0127

実施例6−種々の粒子および種々のインキュベーション温度でのテルペン取り込み速度
以下のプロトコルを適用して、種々の酵母粒子の取り込み速度を比較した。

0128

7gのテルペンを3mlの3.3%Tween80と超音波処理することによって、L−カルボンとシトラールとのエマルションを調製した。

0129

1mlの10%Tween80を10mlの水で超音波処理することによって、1%Tween80溶液を調製した。
−5gのパンYPを20mlの1%Tween80に混合することによって、パンYPを調製した。
−2gのNutrex(商標)YGPを20mlの1%Tween80に混合することによって、Nutrex(商標)YGP懸濁液を調製した。
−2gのSAFMannan(商標)を20mlの1%Tween80に混合することによって、SAF Mannan(商標)懸濁液を調製した。

0130

表6に示したとおり、取り込み反応を設定した。

0131

反応物を、室温または37℃で、1、3、6、9、および24時間インキュベートした。インキュベートした後、試料を14000×gで10分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。結果を、表6の右側2列に示す。遊離テルペンの不在から明らかとなる、粒子に吸収されるテルペンの最大容量を、吸収テルペンエマルションの容量として記録した。封入ペレットの色を24時間の時点で記録した。

0132

0133

表6に示した結果および他の観察から、以下の結論を得ることができる。
−テルペンの取り込み反応には1から3時間を要する。
−テルペンの取り込みは、室温より37℃で速く起こる。
−SAFMannan(商標)は2つの理由から好ましい粒子であると考えられる。
−両方のテルペンを、より速く、より完全に取り込む。
−37℃で24時間後、シトラール分解の特徴である黄色の不在から明らかなように、シトラールは取り込まれたときに安定なままである。

0134

実施例7−粒子取り込みに関する一連の単一テルペンおよびテルペン組合せのスクリーニング
以下のプロトコルを適用して、パンYPとSAFMannan(商標)の取り込み効率を比較した。

0135

テルペンエマルションを以下のとおり調製した。
−L−カルボン1.5mlの3.3%Tween80に4.5gのL−カルボン。
−シトラール1.5mlの3.3%Tween80に4.5gのシトラール。
−チモール/L−カルボン混合物(T/L) 1.5mlの3.3%Tween80に2.25gのチモールおよび2.25gのL−カルボン。
−オイゲノール1.5mlの3.3%Tween80に4.5gのオイゲノール。
−ゲラニオール1.5mlの3.3%Tween80に4.5gのゲラニオール。
−シトラール/L−カルボン/オイゲノール混合物(C/L/E) 1.5mlの3.3%Tween80に1.5gのシトラール、1.5gのL−カルボン、および1.5gのオイゲノール。

0136

これらの実験には、0.75:0.3:0.05の比率のテルペン:水:界面活性剤を含むエマルションを用いた。

0137

表7および8に示したとおり、増加容量のテルペンエマルションを、室温で一晩、250mg/mlのパンYPまたは250mg/mlのSAFMannan(商標)と混合した。試料を14000×gで10分間遠心分離し、水層に浮遊する遊離テルペンの出現を記録した。遊離テルペンの不在から明らかとなる、パンYPまたはSAF Mannan(商標)に吸収されるテルペンエマルションの最大容量を、吸収テルペンエマルションの容量として記録した。ペレットの封入テルペンの色を記録した。表7および8の結果は、すべての単一テルペンおよびテルペン組合せが、パンYPまたはSAF Mannan粒子の両方に効率よく取り込まれたことを示している。

0138

0139

0140

結果から、以下の観察を行った。
−すべてのテルペンが、パンYPおよびSAFMannanに取り込まれると考えられた。
−SAF Mannanは、パンYPに比べて高いテルペン取り込み能力を有する。
−テルペンの2種および3種混合物も効率よく取り込まれると考えられる。
−テルペンオイゲノールはペレットとの会合が認められているため、粒子および水より高い密度を有すると考えられる。
−SAF Mannanでは、シトラールおよびゲラニオールの場合、取り込みレベルが高く、粒子が軽いと、水層の表面に取り込み粒子が浮遊した。
−シトラールは、SAF Mannanによって酸化から保護されたが、パンYPでは保護されなかった。

0141

種粒子のおよその最大取り込み量を求め、以下の表9および10に示す。取り込みパーセントは、存在する粒子の量に対する取り込まれたテルペンの量の比を表す(重量)。

0142

0143

0144

実施例8−水性エマルションおよび封入テルペン製剤におけるテルペン安定性の評価
黄色酸化生成物の形成に関してシトラール製剤を観察することによって、テルペン安定性を評価した。表5〜8の右側の列に示したように、シトラールエマルションおよびシトラール封入パンYPは、経時的に徐々に黄色が増した。しかしながら、経時的な黄色の低減または不在から明らかなように、シトラールのSAFMannan(商標)への封入によって、シトラール安定性が増大した。

0145

実施例9−最小量の水でのテルペンの取り込み
以下のプロトコルを行って、取り込み製剤を流動層乾燥器に直接押し出すことを可能にするために、非常に高い酵母粒子(YP)固体濃度で、YPにテルペンの取り込みおよび封入を行うことのできる可能性を評価した。SAFMannan(商標)粒子を完全に水和する最小量の水は、固体1g当たり水3.53gであると求められた。これは粒子の流体力学的体積(HV)または水吸収能力を定義する。この量の水では、水和粒子は、チキソトロピー性、すなわちマヨネーズのようなずれ揺変性である固い生地粘稠度を有する。HVを超える40%までの水を添加することによって、粘度の高い流動性ペーストを生じる。上の実施例で用いた標準的な反応は、3×HVの水で行った。

0146

一連のテルペン(L−カルボン)取り込み反応は、粒子:テルペン:Tweenの比率(1:0.44:0.04)を一定に保ち、系の水の量をHV(3.53g)からHV+40%の水(4.92g)に変化させて行った。コントロールは、3×HVの水、粒子のみ、およびテルペンのみの反応を用いる標準的な取り込み系であった。一晩インキュベートした後、混合物の試料を、遊離テルペンおよび粒子へのテルペン取り込みの証拠に関して顕微鏡によって評価し、15分間にわたって反転した管で流れを評価することによって物流特性を評価した。さらに、反応混合物を5×HVで水和し、ボルテックスして粒子の完全な分散液を得て、テルペンを封入した粒子の沈殿物を遠心分離することによって、遊離油の存在を評価した。結果を、表11、および図7から12に示す。図7から12は、以下の管の取り込み結果を示す。
図7−管3
図8−管5
図9−管6
図10−管8
図11−管10
図12−管11

0147

0148

表11、および図7から12に示した結果は、評価を行ったすべての水の比率で、粒子へのテルペン取り込みおよび封入が起こったことを実証している。驚いたことに、粒子を水和する最小量の水を用いる、固い生地の粘稠度を有する反応において取り込み反応が行われたときにも、同等の取り込みが起こった。遊離テルペンの不在は、顕微鏡によって観察され(図7から12)、さらにテルペンのみのコントロールと比較して上澄みの混濁が著しく低減していることから明らかなように、上澄みの低量のテルペンにおいて観察された。

0149

これらの結果は、テルペンを中空グルカン粒子に取り込む条件に関する理解を広げる。取り込み工程中に粒子を水和する最小量の水を用いる柔軟性によって、反応混合物が標準的な食品グレードの表面一掃生地ミキサーを用いる展性生地様の粘稠度である条件でテルペンを取り込むことが可能になるであろう。最終的な高固体テルペン取り込み混合物の粘稠度は、流動層乾燥のためにヌードルおよびペレットを形成する直接押し出しに適している。

0150

この様式でスケールアップ生産するための適切な設備には以下が必要とされる。
−ゴーリンホモジナイザ、または安定なテルペンエマルションを製造する同等物
−表面一掃生地混合槽
押し出し機
−流動層乾燥器

0151

実施例10−再水和時、テルペン成分を封入する乾燥中空グルカン粒子分散液において分散を促進する間隙親水コロイド剤の評価
以下のプロトコルを適用して、水和時に、テルペン封入乾燥中空グルカン粒子製剤の分散を増大する間隙親水コロイドの効果を評価した。
−SAFMannan(商標)粒子
−0.1%Tween80
−L−カルボン
−キサンタンガム0.1%Tween80中1w/v%

0152

表12に示したとおり、1.1gのL−カルボンエマルション(0.75:0.3:0.05の比率のL−カルボン:水:界面活性剤)を、1gのSAFMannan、および0〜1%のキサンタンガムを含有する4.4gの0.1%Tween80とインキュベートして、SAF MannanにL−カルボンを取り込むことによって、L−カルボン封入乾燥中空グルカン粒子の水分散液に対するキサンタンガム増量の効果を評価した。

0153

0154

表12、および図13から20の結果は、テルペン封入粒子の乾燥中に高分子量親水コロイドを用いることによって、均一懸濁液への微粒子の水和および分散が促進されることを実証している。そのような親水コロイド剤の他の例は、マルトデキストリン、アルギン酸塩などである。

0155

取り込まれたテルペンの安定性を高め、テルペンの持続放出を提供するために、ペレットコーティングを用いることも有益である可能性がある。

0156

実施例11−黄色ブドウ球菌に対するテルペンエマルション、新鮮パンYPおよびSAFMannan封入テルペン、ならびに凍結乾燥パンYPおよびSAF Mannan封入テルペンの最小阻止濃度MIC)の評価
新鮮中空グルカン粒子封入テルペン製剤と凍結乾燥中空グルカン粒子封入テルペン製剤のMICを比較するために行ったプロトコルの結果を下記の表13に示す。単純テルペンエマルションも試験し、比較のために結果を示す。

0157

0158

上記の結果から得た結論は以下のとおりである。
−中空グルカン粒子に取り込まれるテルペンは、テルペンMICを高めると考えられる。一般に、新鮮テルペンエマルションは、封入製剤より〜4〜375倍効力が低い。
−SAFMannan(商標)に取り込まれたテルペンは、パンYPよりわずかに良好に機能する。
新しく取り込まれたテルペン組成物は、凍結乾燥組成物よりわずかに良好に機能する(凍結乾燥中に乾燥組成物からテルペンがいくらか揮発する可能性がある)。
−水性エマルションのテルペンは少なくとも3週間安定である。

0159

実施例12−黄色ブドウ球菌に対するパイロットプラントスケールでの封入テルペンの有効性
黄色ブドウ球菌に対して、パイロットプラントスケールで製造された封入テルペンおよび混合物を用いて抗微生物アッセイを行った。材料を含有する新鮮および凍結乾燥封入テルペン試料は共に、強い抗微生物活性を実証した。結果を下記の表14に要約する。

0160

テルペンを2.5kgスケールでSAFMannan(商標)に封入した。3種のテルペン(ゲラニオール275g、オイゲノール385g、およびチモール440g)の混合物を100gのTween80および8Lの水に溶解し、均質化した。SAF Mannan(商標)(2.5kg)を添加して、均質懸濁液を形成した。その懸濁液をゴーリンホモジナイザに通して粒径を小さくし、ホモジネートを室温で一晩インキュベートした。封入テルペンの試料を除去し、室温で貯蔵した。次いで、残留する封入テルペンをトレイで凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥封入テルペン粉末を粉砕し、室温で貯蔵した。

0161

0162

パイロットプラントスケールでは、新鮮試料および凍結乾燥試料は共に、w/wテルペンベースで等しく有効であった。

0163

大量調製の結果に基づいて、黄色ブドウ球菌に対する凍結乾燥製剤予測効用量は、200ppm(〜50重量%のテルペンを含有する製剤)または0.2g/水Lである。

0164

実施例13−マイコバクテリウム(Mycobacterium)に対する封入テルペンの有効性
テルペンエマルションを以下のように調製した。
−シトラール1.5mlの3.3%Tween80に4.5gのシトラール。
−L−カルボン/オイゲノール1.5mlの3.3%Tween80に2.25gのL−カルボンおよび2.25gのオイゲノール。
−オイゲノール 1.5mlの3.3%Tween80に4.5gのオイゲノール。
−ゲラニオール1.5mlの3.3%Tween80に4.5gのゲラニオール。
−ゲラニオール/チモール混合物1.5mlの3.3%Tween80に2.25gのゲラニオールおよび2.25gのチモール。
−コントロールエマルション 6mlの1%Tween80。

0165

SAF−Mannan(商標)(2.5g)を、3mlの各エマルションおよび7mlの1%Tween80と混合し、一晩インキュベートして、テルペンおよびテルペン混合物を封入した。封入テルペン製剤を凍結および凍結乾燥し、粉末を微粉に粉砕した。封入テルペンの懸濁液(25mg/ml)および非封入テルペンエマルションを、マイコバクテリウムに対する抗菌活性に関してアッセイした。結果を表15に示す。

0166

0167

実施例14−封入テルペンの殺線虫活性
シトラールを封入する酵母細胞壁の調製は、上述の手順に従って調製した。中空グルカン粒子は17.5%のシトラールを含有し、粒子は1000ppmの濃度で試験調剤に存在した。これはテルペンが175ppmの濃度で実際上存在したことを意味する。

0168

1.0mlの試験調剤を、根こぶ線虫を含む0.1から0.15mlの水に添加した。コントロールとして、水1.0を線虫に添加した。

0169

前述のとおり観察を行い、24および48時間後の殺虫率を評価した(すなわち死亡率)。下記の表16に示した結果は、2組の結果の平均である。

0170

0171

これらの結果は、テルペンを封入している中空グルカン粒子が、わずか175ppmのシトラール濃度に相当する粒子濃度1000ppmで、根こぶ線虫の殺虫に有効であることを実証している。

0172

したがって、テルペンを封入している中空グルカン粒子は、殺線虫剤として、溶液中のテルペン、または界面活性剤を含むテルペンと同程度に有効であると考えられる。テルペンが粒子内部に封入されているにもかかわらず、殺線虫活性は保持される。溶液中のテルペンまたは界面活性剤を含むテルペンの場合と同様に、より高濃度の中空グルカン粒子内テルペン、またはより高濃度の粒子によって、さらに高い殺虫率がもたらされることが予期され得る。

0173

実施例15−封入テルペンおよび非封入テルペンの殺真菌性
以下のプロトコルを実施して、種々のテルペン組合せの殺真菌性を評価し、封入組成物と非封入組成物との有効性を比較した。

0174

様々なテルペン製剤の抗真菌性の評価
マイクロタイタープレートアッセイを用いて、種々の病原体に対する、一連のテルペン化合物の最小阻止濃度(MIC)を評価した。各有機体に用いたアッセイは後に詳しく記載するが、重要な一般的特徴は次のとおりである。

0175

このアッセイは、静止(増殖阻害)活性と殺菌(殺傷)活性とを識別するために、2つのインキュベーション期間を用いる。第1のインキュベーション期間は、増殖阻害を評価できるが、単なる増殖の阻止と細胞の殺傷とを識別できない。第2のインキュベーション期間の目的は、テルペン暴露を生存する任意の休眠細胞または阻害細胞が増殖する充分な時間および栄養分を与えることである。テルペンへの暴露によって殺傷された細胞は新鮮培地で増殖しないが、静真菌作用によって阻害された任意の細胞は、第2のインキュベーション期間に反応し、増殖するはずである。

0176

合計で31種の異なるテルペン製剤を用いて(表17)、初期スクリーニング実験を行った。活性の強いテルペン製剤のサブセットを用いて(表18)、これらの実験を繰り返した。

0177

グルカン粒子に封入された2:1:2の比率のテルペンゲラニオール、オイゲノール、およびチモールの組合せも試験した。この試料はYP−GETと称される。封入形態と比較するために、同じ比率の非封入ゲラニオール、オイゲノール、およびチモールの組合せも試験した。

0178

サッカロマイセスセレビシエを用いるMICアッセイ
96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに、100μLのアリコートでサッカロマイセスセレビシエ(5×105細胞/mL、YPD増殖培地)を添加した。プレート毎に少なくとも1列を細胞のみのコントロールと指定し、それらのウェルにはテルペンを加えなかった。種々のテルペン製剤のアリコート(100μL)を残りの列の第1行に加え、1つの行から次の行に合計で7回、100μLを移すことによって、連続的に2倍希釈を行った。最後に、すべてのウェルが確実に同じ容量を含有するように、最終行から100μLを捨てた。マイクロタイタープレートを30℃で一晩、静的にインキュベートした。

0179

インキュベートした後、増殖の阻害を記録した(混濁がないことによって明らかとなる)。増殖阻害(≧75%)は顕微鏡によって視覚的に確認した。

0180

各製剤のMICを求めた後、マイクロタイタープレートを遠心分離し、非混濁ウェルから使用済み培地を除去した。細胞を新鮮培地(100μL)に再懸濁し、プレートを再び30℃で一晩インキュベートした。前と同様に増殖阻害の評価を行った。

0181

混合接種物を用いるMICアッセイ
サッカロマイセスセレビシエに関して記載したとおり、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、種々のテルペン製剤を連続的に希釈した。次いで、5μLの混合接種物(カビの生じたブドウの葉から濃度5×104細胞/mLに調製)と共に、融解YPD寒天をウェルに添加した。プレートを室温で24時間、静的にインキュベートし、胞子の増殖を顕微鏡によって視覚的に評価した。

0182

固体培地を使用したため、新鮮培地での第2のインキュベーション期間は実施できなかった。

0183

コレトトリカムグラミニコーラを用いるMICアッセイ
サッカロマイセスセレビシエに関して記載したとおり、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、種々のテルペン製剤を連続的に希釈した。コレトトリカムグラミニコーラ(300胞子/ウェル)を希釈テルペンに添加し、プレートを室温で48時間、静的にインキュベートした。胞子の発と増殖とを顕微鏡によって視覚的に評価した。

0184

各製剤のMICを求めた後、マイクロタイタープレートを遠心分離し、増殖阻害ウェルから使用済み培地を除去した。胞子を新鮮培地(100μL)に再懸濁し、プレートを再び室温で一晩インキュベートした。前と同様に増殖阻害の評価を行った。

0185

0186

0187

混合接種物
混合接種物の使用はいくつかの問題を提起する。調剤間の胞子含量の変動によってアッセイ間の再現性が不良となり、汚染生物の増殖が胞子発芽の評価を妨げる。単細胞酵母種は、特に胞子増殖のマスキングに問題がある。このアッセイから正確なデータは得られなかったが、テルペンの阻害効果は観察された。

0188

より多数の胞子が用いられたため(約50/ウェル対約10/ウェル)、初期スクリーニングアッセイに比べて、繰り返しアッセイの記録において胞子の同定が容易であった。したがって、繰り返しアッセイで得られたデータは、より信頼できるMICの推定値を提供する可能性がある。

0189

コレトトリカムグラミニコーラ
初期スクリーニングアッセイと比較して、繰り返しアッセイで得られるMICが一般的に高いのは、以下の理由による可能性がある。
・1週間前のテルペン溶液の使用。
・初期スクリーニングアッセイで用いられたものと比べて高い生存能力を有し、したがって殺菌がより困難である可能性のある新しく調製された胞子の使用。

0190

中空グルカン粒子に封入されたときの同じテルペン製剤と遊離エマルションとしてのテルペン製剤との比較:サッカロマイセスセレビシエMICアッセイ
96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルにYPD増殖培地(100μl)を添加し、第1行に種々のテルペン製剤のアリコートを加え、この行では総量を200μlとした。1列を細胞のみのコントロールと指定し、それらのウェルにはテルペンを加えなかった。1つの行から次の行に合計で7回、100μlを移すことによって、連続的な2倍希釈を行った。最後に、すべてのウェルが確実に同じ容量を含有するように、最終行から100μlを捨てた。次いで、各ウェルに100μlのアリコートでサッカロマイセスセレビシエ(5×105細胞/ml、YPD増殖培地)を添加し、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、各ウェルの620nmでの吸光度(A620)を測定した。マイクロタイタープレートを30℃で一晩、静的にインキュベートした。

0191

インキュベートした後、再びA620を測定し、増殖の阻害(≧75%)に関してプレートを評価した。増殖阻害は顕微鏡検査によって視覚的に確認した。

0192

遊離テルペンエマルションは、各製剤のMICを求めた後、マイクロタイタープレートを遠心分離し、増殖阻害ウェルから使用済み培地を除去した。細胞を新鮮培地(100μl)に再懸濁し、プレートを再び30℃で一晩インキュベートした。前と同様に増殖阻害の評価を行った。

0193

MICと殺真菌MICの結果を表19に要約する。

0194

結果

0195

テルペンエマルションおよび酵母封入テルペンの両方で、MICは典型的に≦125ppmであり、もっとも活性な製剤は〜60ppmで増殖を阻害した。テルペンエマルションで得られたMIC値は、それぞれの酵母封入製剤で得られた値と類似していた。異なる値が得られた場合、およそ1回の2倍希釈分のみ相違していた。

0196

遊離テルペンエマルションの多くは増殖阻害MICで殺真菌性であり、大多数が2倍高い濃度で殺真菌活性を示した。

0197

これらの結果は、グルカン粒子に封入されたテルペンが、少なくとも非封入形態と同程度に真菌の殺菌に有効であることを実証している。さらに、用いられた封入組成物は、45日間4℃で貯蔵されており、最適以下の〜4重量%のテルペン含量を有するため、能力が低減された可能性がある。

0198

殺真菌活性を求めるアッセイは遠心分離ステップを含み、これはウェルの底部に細胞のペレットを生成することによって、増殖培地において残留するテルペンから微生物細胞を分離しようとする試みである。次いで、このペレットを新鮮培地に再懸濁し、テルペン不在下で2回目のインキュベートを行う。しかしながら、遠心分離ステップは、微生物細胞と酵母粒子を区別することができず、したがって、酵母封入テルペンを用いるとき、細胞ペレットはテルペンを取り込んだ酵母粒子も含有する。結果として、その後、酵母粒子と微生物細胞の両方が新鮮培地に再懸濁される。

0199

この方法論上の問題は、以下の理由から、上述の実験で得られた結果に影響を及ぼすとは考えられない。
・これまでの実験で、テルペンエマルションは、テルペンを取り込んだ酵母粒子の代わりに用いられ、殺真菌活性が明らかに示されている。
・封入テルペンは拡散によって放出され、封入テルペンの濃度と周囲の培地に放出されたテルペンの濃度は急速に平衡に達する。したがって、遠心分離および新鮮培地への再懸濁後、増殖培地の放出テルペンの濃度は、増殖阻害活性に必要とされる濃度をはるかに下回る可能性が高い。
・殺真菌MICウェルの内容物を固体寒天増殖培地に平板培養したとき、増殖は見られなかった。固体増殖培地に平板培養されたとき、大量の寒天プレート全体にわたって残留テルペンが拡散することにより、増殖阻害を引き起こすことができないほど低い局所テルペン濃度となる。したがって、殺真菌MICウェルの内容物で増殖が起こらないのは、初期の殺真菌活性によるものに相違ない。対照的に、殺真菌MICより低いMICが得られ、MICウェルの内容物が固体寒天増殖培地に平板培養されたとき、増殖が観察され、静真菌効果が示唆された。

0200

実施例16−野外試験用封入テルペン組成物の調製
以下のプロトコルの目的は、その後の野外試験のために、中空グルカン粒子にテルペン組成物を封入することであった。

0201

材料:
チモール(Alpha−Gamma Corporation)
オイゲノール(Alpha−Gamma Corporation)
ゲラニオール(Alpha−Gamma Corporation)
1%Tween80(Alpha−Gamma Corporation)
酵母細胞壁粒子
キサンタンガム

0202

酵母細胞壁粒子は、Nutricell MOS55の商品名でBiorigin(Sao Paolo、Brazil)から入手したものであり、Acucareira Quata S.A.、Usina Quata、Quata−Sao Paolo−Brazil−Zip Code 19780 000製であった。これらの粒子は、サッカロマイセスセレビシエの噴霧乾燥細胞壁抽出物であり、薄いベージュから黄褐色の流動性粉末である。

0203

プロトコル:以下のプロトコルは1kgの粒子に適していたが、大量生産のために簡単にスケールアップできる。
1.テルペン混合物の調製−ガラスフラスコでゲラニオール375g+オイゲノール525g+チモール600gを混合し、撹拌する。
2.2ガロンの白色バケツで62gのTween80を6.2lの水に混合することによって、6.2lの1%Tween80を調製する。混合して、溶液を形成する。
3.6.2gのキサンタンガムをTween溶液に添加し、撹拌して溶解する。
4.ポリトロンミキサを用い、白色バケツで1.5kgのテルペン混合物+6.2lの1%Tween80/0.1%キサンタンガムを混合することによって、テルペンエマルションを調製する。
5.1000gの酵母細胞壁粒子を添加し、ペイントミキサを用いて混合して、均一な懸濁液を形成する。
6.ステップ4のテルペンエマルションを酵母細胞壁粒子に混合しながら添加し、薄いマヨネーズ様粘稠度とする。
7.テルペン混合物をに注ぎ、一晩インキュベートする。

0204

結果:中空グルカン粒子に封入されたゲラニオール、オイゲノール、およびチモールをペーストとして得た。このペーストは、通常の噴霧乾燥技法によって、容易に乾燥粉末に変換された。このペーストは、以下のプロトコルの「液体」組成物であり、「粉末」は噴霧乾燥形態である。

0205

実施例17−ベト病に対する封入テルペン組成物の野外試験
ブドウのベト病はプラスパラビチコラ(Plasmopara viticola)に起因し、これは世界的にブドウに感染し、収穫量およびワイン品質の点から、ブドウ栽培者にとって破壊的な損失となり得る。この真菌は果実と木のすべての緑色部分攻撃し、葉を枯らし、花と果実を腐らせる。この疾病は、葉の上面の不規則な淡黄色または黄緑色の斑点、葉の病変部の下面を覆う密集した灰白色の綿様の真菌生育物として発現する。果実も綿毛の生育物で覆われる可能性があり、感染の時期に応じて、色になり柔らかくなるか、またはまったく柔らかくならない可能性がある。ベト病は、風や雨による胞子の分散によって広がり、感染には湿潤な条件を必要とする。これは高湿な環境で特に問題となる。この疾病の管理には、殺真菌剤を初期に適用し、その後、適切な間隔で反復適用することによる、予防措置推奨されている。一部の処置には耐性が生じており、異なる殺真菌剤を交代で用いることによって耐性の発現を最小限度にすることはできるが、依然として問題である。

0206

この試験の目的は、ブドウのベト病の予防に関して、液体または粉末(噴霧乾燥)製剤として供給される実施例16の封入テルペン製剤(YGP−GET)の有効性を調べることであった。

0207

Kir−Yianniブドウ畑のサイト20に、それぞれ0.1haに及ぶ4つの隣接するブロックを特定した。

0208

Kir−Yianniは海抜300mにある35haのブドウ畑である。西はカシ混合林に接し、と東には果樹園とブドウ畑を見渡す。

0209

4つのブロックはすべて、テルペン製剤を適用する前に、複数の製品で処置されていた。2004年6月26日、用量0.5g/lまたは2g/lで、テルペン粉末製剤を4つのブロックの2つに噴霧した(図21の概略図を参照のこと)。3つ目のブロックを、通常のボルドー液(Bordeaux mix)および水和硫黄剤で処置し、残りのブロックは、未処置のままとした。翌週にわたって、各ブロックのブドウをベト病の徴候に関してモニターした。

0210

Kir−Yianniブドウ畑のサイト18に、それぞれ0.1haに及ぶ4つの隣接するさらなるブロックを特定した。4つのブロックはすべて、テルペン製剤を適用する前に、複数の製品で処置されていた。2004年6月26日、用量1g/lまたは4g/lで、テルペン液体製剤を4つのブロックの2つに噴霧した(図21)(注記:テルペン液体製剤1gは、1mlの体積を有する)。残りの2ブロックのうち、1つは未処置のままとし、1つは2004年6月28日に、ベト病の通常の処置剤であるMikal(登録商標)を噴霧した。翌週にわたって、各ブロックのブドウをベト病の徴候に関してモニターした。

0211

両方のサイトにおいて、テルペン製品は、1200L/Haの割合で適用した。

0212

ブドウの以下の生長段階を記録した。
−発芽、2004年3月26日
開花、2004年6月1日
−ヴェレゾン、2004年8月6日

0213

本試験の適用は、ヴェレゾン前に行った。

0214

2004年の生育期例外的に遅く、全期間を通じて湿潤であった。ベト病の疾病圧力は極めて高く、ボトリチスのレベルは高く、ウドンコ病の圧力は中程度であった。粉末および液体YGP−GET製剤はいずれも室温で貯蔵した。特別な貯蔵条件は用いなかった。

0215

比較製品の詳細
粉末製剤試験:ボルドー液、Manica Spa、Italy製造、Moscholios Chemicals SAによってGreeceで包装;水和硫黄剤
液体製剤試験:Mikal(登録商標)(ホセチルAl50%、ホルペット25%)、Bayer CropScience製造、Bayer Hellas SAによってGreeceで流通。これらの比較製品は以下のように適用した。用量15g/lで発芽前に1回適用、その後、用量6.5g/lで1年毎にさらに2回適用。3回の適用はすべて1000L/Haの噴霧割合を用いた。
粉末製剤試験:ボルドー液(2g/l)および水和硫黄剤(2.2g/l)を2004年6月26日に適用した。
液体製剤試験:Mikal(3.2g/l)を2004年6月28日に適用した。

0216

ベト病の症状に関してブドウの木を視覚的に検査した。疾病の発症は、葉に平均2つの油性斑点があることを特徴とした。さらなる斑点の出現を予防する処置は、ベト病に対して有効な防御を提供するとみなした。

0217

結果
YGP−GET粉末製剤(噴霧乾燥)
ボルドー液による通常の処置は、ベト病に対して良好な防御を提供した。コントロールのブドウの木では、ベト病の軽度の症状が観察された。0.5g/lのテルペン製品濃度は防御せず、2g/lのテルペン製品濃度は、コントロールよりわずかに良好な防御を提供した。注記:直前に殺虫剤処置を行ったため、このサイトの疾病圧力は非常に低かった。

0218

粉末製剤は非常に細かく、空中に分散するため、溶解が困難であった。このことが製品の有効性に悪影響を及ぼした可能性がある。

0219

YGP−GET液体製剤
用量4g/lで投与したとき、このテルペン製剤は露出樹冠でベト病に対して優れた防御を提供した。1g/lの用量では防御されなかった。コントロールのブロックでは、ベト病の重篤な症状が認められた。

0220

液体製剤は使用が容易であり、心地よいにおいを有した。

0221

考察
ベト病は収穫量およびワインの品質に影響を及ぼすため、ブドウ栽培者にとって破壊的な損失となり得る。ひとたび定着すると、感染は急速に広がることができるため、この疾病の管理は予防が中心となる。粉末製剤を噴霧したサイトにおいて、YGP−GETは、低用量(0.5g/l)では有効性を示さず、2g/lの用量では通常の処置剤より有効性が低かった。このサイトでは、直前の殺虫剤適用により疾病圧力が低く、それがテルペン処置の外見上の有効性を限定した可能性がある。しかしながら、2g/l未満のテルペン製品の用量は不充分であるとみなされた。

0222

液体製剤を噴霧したサイトでは、4g/lの高い用量レベルで、露出樹冠に優れた防御が提供された。このサイトでは過度植物生長によって、樹冠内部の古い生育物に比べて、外部の若い枝の処置がより有効であった。この処置は浸透性でないため、テルペン製品による完全な葉面被覆が有用である。通常の浸透性処置剤に用いられるより約30%増の量で、テルペン処置剤を用いて良好な被覆が達成されると推定される。

0223

結論:
YGP−GET液体製剤の葉面適用は、4g/lの濃度でベト病の制御に非常に有効であった。より低い濃度である0.5g/lの粉末、および1g/lの液体は有効でなかった。

0224

実施例18−ウドンコ病に対する封入テルペン組成物の野外試験
ブドウのウドンコ病は、真菌のウンキヌラネカトル(Uncinula necator)に起因し、ブドウの木の生長、果実の品質、および木の耐性を低下させる。ワイン用のブドウでは、果実のわずか3%の感染レベルであってもワインの品質に影響を及ぼし得る。この疾病は、粉末状で白色の葉の被覆物に拡大する真菌生育物の小さな灰白色の斑点を特徴とする。この真菌生育物は果実にも生じることがあり、果実が割れる可能性がある。暖かく湿潤な条件を必要とするベト病とは対照的に、ウドンコ病は、雨天条件ではなく、湿気のある日陰好むため、より乾燥した生育期に問題となり得る。ウドンコ病の管理には、殺真菌剤を初期に適用し、その後、適切な間隔で反復適用することによる、予防措置が推奨されている。

0225

この研究は、ブドウのウドンコ病の予防に関して、YGP−GET組成物適用の有効性を調べることを目的とした。

0226

Kir−Yianniブドウ畑のサイト18に、それぞれ0.1haに及ぶ3つの隣接するブロックを特定した。2004年7月19日、用量2ml/lでYGP−GET液体製剤を3つのブロックの1つに噴霧し、1つは未処置のままとした。残りのブロックは、通常の処置剤であるEquesion(2.5g/l)、Alliete(0.9g/l)、およびPunch(0.075ml/l)を噴霧した(図22を参照のこと)。翌週にわたって、各ブロックのブドウの木をウドンコ病の徴候に関してモニターした。

0227

Kir−Yianniブドウ畑のサイト20に、それぞれ0.1haに及ぶ3つの隣接するさらなるブロックを特定した。2004年7月20日、用量2ml/lでYGP−GET液体製剤を3つのブロックの1つに噴霧し、残りの2つのブロックは未処置のままとした(図22を参照のこと)。翌週にわたって、各ブロックのブドウの木をウドンコ病の徴候に関してモニターした。

0228

いずれのサイトも、それらのブロックは複数の製品で事前に処置されており、テルペン製品の事前適用が含まれる。

0229

すべてのテルペン処置剤は、完全な被覆を確実にするために、1200L/Haの割合で適用した。

0230

ブドウの以下の生長段階を記録した。
−発芽、2004年3月26日
−開花、2004年6月1日
−ヴェレゾン、2004年8月6日

0231

本試験の適用は、ヴェレゾン前に行った。

0232

2004年の生育期は例外的に遅く、全期間を通じて湿潤であった。ベト病の疾病圧力は極めて高く、ボトリチスのレベルは高く、ウドンコ病の圧力は中程度であった。

0233

比較製品の詳細
サイト20では比較製品を用いなかった。サイト18に用いた比較処置を以下に詳しく述べる。

0234

Punch(登録商標)(フルシラゾール40%)、Dupont
2004年7月19日、製造業者使用説明書に従って、ウドンコ病の予防処置剤として、用量0.075ml/lでPunchを適用した。

0235

追加製品の詳細
サイト20では追加の製品を用いなかった。サイト18に用いた追加製品を以下に詳しく述べる。
Equesion系(ファモキサドン22.5%、およびシモキサニル30%)
Alliete(ホセチルAl80%)

0236

2004年7月19日、ベト病の予防処置剤として、Equesion(2.5g/l)およびAlliete(0.9g/l)を適用した。用量は製造業者の使用説明書に従って決定した。

0237

これらの比較製品および追加製品は、総合害虫管理スケジュールの通常の処置剤である。

0238

ブドウの木をウドンコ病の症状に関して視覚的に検査した。

0239

結果:
サイト18
コントロールブロックでは、花硬およびの約20%が黒色であったが、これはウドンコ病の中程度の感染を示している。通常の処置を行ったブロック、およびテルペン処置を行ったブロックでは、すべての茎と房が緑色であったが、これは適切な防御が提供されたことを示している。

0240

サイト20
いずれのブロックでも、ウドンコ病感染の証拠は認められなかった。

0241

追加的観察
生育期の終わりに、サイト18および20のブロックは、ブドウ畑の残りの部分と比べて、概して疾病による低いストレスを示した。

0242

ウドンコ病感染は、ブドウの木の生長、果実の品質、および木の耐冬性を低下させることによって、栽培者に相当な損失をもたらす。さらに、果実のわずか3%の感染レベルであってもワインの品質に影響を及ぼし得る。ひとたび定着すると、感染は急速に広がることができるため、この疾病の管理は予防が中心となる。この研究では、サイト18において、テルペン製品YGP−GETの適用はウドンコ病感染を有効に予防し、テルペン製品が示した制御レベルは、通常の処置剤によって提供されるものと同等であった。しかしながら、ウドンコ病感染が不足していたため、サイト20の結果は確定的でない。感染の不足は、この研究に先立って、殺虫剤が広範に適用され、疾病圧力の低下をもたらしたためであると思われる。

0243

サイト18および20において、疾病によるストレスが低レベルであることは、これらのサイトに適用された初期のテルペン処置が長期的な感染の制御に有益である可能性のあることを示唆している。

0244

結論:
YGP−GETは、通常の処置剤によって提供されるものと同等の制御レベルで、ウドンコ病感染を有効に予防した。

0245

実施例18−ウドンコ病に対する封入テルペン組成物のさらなる野外試験
この研究は、Grimson Seedless食用ブドウのウドンコ病の処置に関して、YGP−GETの有効性を調べることを目的とした。

0246

Tsigarasブドウ畑(Kir−Yianniブドウ畑の約80km南)の0.1haのプロットは、2004年7月1日のCisteine適用中、不注意で未処置のまま残された。このプロットのブドウの木は、その後、葉、茎、および果実にウドンコ病の重い症状を示した。2004年7月12日、この未処置プロットに1200L/Haの割合で、3ml/lの液体YGP−GET製剤を噴霧し、ブドウ畑の残りの部分に、比較製品Roganaを噴霧した。24時間後、ウドンコ病の症状に関して、ブドウの木を評価した。

0247

ブドウの木は、高リラ型トレリス(high lyre trellis)システムに仕立てられた。

0248

比較製品の詳細
Rogana(フェンコナゾール5%、ビノカップ(binocap)16%)、BASF(BASF Agro Hellas S.A.、Athens、Greece)製造

0249

2004年7月12日、ウドンコ病の処置剤として、Tsigarasブドウ畑にRoganaを適用した。用量は製造業者の使用説明書に従って決定した。

0250

ブドウの木をウドンコ病の症状に関して視覚的に検査した。

0251

結果:
YGP−GETの適用前、ウドンコ病の重い症状が明らかであった。YGP−GETのわずか24時間後、ウドンコ病の白色の粉が黒色に変わったが、これは有効な抗真菌活性を示している。この時点で疾病が有効に阻止されたため、さらなる処置剤は適用しなかった。YGP−GETは通常の処置剤と同等の有効性を示した。

0252

考察:
この研究では、YGP−GETを用いて、定着したウドンコ病感染が迅速かつ有効に処置された。適用のわずか24時間後、それ以前には重症であったウドンコ病感染が、テルペン製品を適用することにより、通常の処置剤と同等の有効性で阻止された。

0253

この研究から得られた予備データは、YGP−GETが予防的能力を示すことに加えて、定着した真菌感染の処置にも有効である可能性を示唆している。

0254

実施例19−ウドンコ病に対する封入テルペン組成物のさらなる野外試験
背景および原理
本試験では、有機製品を用いてウドンコ病を制御するタスマニアのブドウ畑(Frogmore Creek Vineyard、Hathaway Trading Pty Ltd、Box 187、Richmond TAS 7025、Australia)のプログラムの一部として、YGP−GETの使用を調べた。この研究の目的は、シャルドネ種のブドウの木において、ウドンコ病の有機的制御におけるYGP−GET適用の短期有効性を調べることであった。

0255

この試験では、ブドウの木(シャルドネ種)を2005年2月7日にテルペン製品で処置するか、または未処置のまま(コントロール)とした。事前の有機処置によって抑制されていたが、試験前のウドンコ病の重症度は商業的に許容できないレベルであるとみなされ、6つの積極的処置プロットと6つのコントロールプロットは同等であった。作物段階はおよそE−L33−34(ヴェレゾン前)であった。

0256

YGP−GET(4ml/l)(液体製剤)を、事前にミルクで処置されていた6つのシャルドネプロットに噴霧した。6つのシャルドネプロットを未処置のコントロールとしたが、それらのプロットは事前に油/ホエーで処置されていた。プロット当たりの木の数は、典型的に7本であった。

0257

このプロトコルに用いたYGP−GETの組成の詳細を表20に示す。

0258

0259

ウドンコ病の重症度を、テルペン処置3日前に評価し、処置3日後に再び評価した。各プロットにおいて、無作為に20房のブドウを選択し(各パネルサイドで10房)、活性なウドンコ病菌コロニーが被覆している房の面積パーセントとして、疾病の重症度を評価した。その後、栽培者が試験領域全体に硫黄および植物油ベースの噴霧補助剤(Synertrol Horti油)を噴霧したため、さらなる評価は不可能であった。

0260

処置される植物の数/領域
試験製品:事前にミルクで処置されている、6つのシャルドネプロット(合計でブドウの木約42本)に、YGP−GET(4ml/l)を適用する。
コントロール:コントロールとして用いる6つのシャルドネプロット(合計でブドウの木約42本)には処置剤を適用しなかったが、それらのプロットは事前に油/ホエーで処置されていた。

0261

栽培方法
ブロックB2にヴィティスヴィニフェラ(Vitis vinifera)(シャルドネ種)のブドウ:アーチ型の茎を持つバーチカルシュートポジショニング

0262

栽培配置
間隔:列間の距離2.5m、木の間(列内)の距離1.25m、ヘクタール当たりのブドウ3200本。列の方位は北から南であった。

0263

樹冠密度
ポイントコドラート法を用いて、シャルドネの木の試験前における樹冠密度の特徴を明らかにした(表21)。事前に硫黄で処置したか、または未処置であるシャルドネプロット内において、樹冠の代表的な部分を選択することによって、2005年1月13日に測定を行った。各処置前のそれぞれのプロットで10個の測定を行った(すなわち、硫黄処置プロットで合計60個の測定、未処置コントロールプロットで60個の測定)。さらに、3つの直立した枝(プロット当たり)の節の長さと数を測定した。

0264

0265

一般的条件
実験材料によるこれらのプロットの前処置は、未処置コントロールと比較して、ウドンコ病を抑制した。しかしながら、ミルク処置プロット、および油/ホエー処置プロットの両方で同等であったが、ウドンコ病のレベルは商業的に許容されないレベルであるとみなされた。

0266

適用方法、用量、および投与計画
2005年2月7日、多用途車平板トレイに搭載したポンプホースリールに接続したハンドガンを用いて、YGP−GET処置剤(4ml/l)を適用した。噴霧はポンプ圧1500〜1600kPa(200〜230psi)で駆動し、約63ml/秒で送達した。通常の処置剤の標準的噴霧量(約900L/Ha)を用いた。

0267

活性なウドンコ病菌コロニーが被覆しているブドウの房の面積(%)として評価されるウドンコ病の重症度を、各プロットで無作為に選択した20房(各パネルサイドで10房)に関して評価した。疾病の重症度を、YGP−GET処置剤の適用3日前、2005年2月4日に評価し、テルペン適用の3日後、2005年2月10日に再び評価した。

0268

逆正弦変換を用いてデータを変換して、平均分離度を求めた。

0269

結果
処置前、テルペンで処置する6プロットのシャルドネ種ブドウの房におけるウドンコ病の平均重症度(20.4%)は、6つのコントロールプロットの平均重症度(23.2%、表22)と類似していた。これらのデータの逆正弦変換に基づく統計的分析によって、処置前の疾病重症度に有意差のないことが見出された(表23)。

0270

しかしながら、処置3日後、ウドンコ病の平均重症度は、コントロールで37.8%であったのに対し、YGP−GET処置した房では23.8%であった(表22)。これらのデータの逆正弦変換は、より狭い面積が活性ウドンコ病菌コロニーで被覆されていたテルペン処置したブドウの房に統計的な有意差を示した(p=0.058、表23)。

0271

0272

0273

考察:
ウドンコ病によるブドウの木の感染は、木の生長、および耐性、ならびに果実やワインの品質に有害な影響を及ぼすことによって、栽培者に相当な損失をもたらし得る。有機的に管理されたブドウ畑では、栽培者は、元素硫黄などの処置剤の代替物を探している。

0274

この研究は、オーストラリア、タスマニアの有機ブドウ畑において、液体製剤としての封入テルペン製剤(4ml/l)のウドンコ病制御における有効性を調べた。テルペン適用のわずか3週間前に他の実験処置剤を用いたが、ウドンコ病感染レベルは依然として商業的に許容されないレベルとみなされた。シャルドネの木をYGP−GETで処置して3日後、処置したブドウのウドンコ病の重症度は、未処置コントロールの重症度より有意に低かった。未処置コントロールでは、処置前評価と処置後評価との間の6日間に、感染の重症度が悪化したが、処置した木では不変であった。したがって、処置前に胞子形成ウドンコ病菌のコロニーが定着していたブドウの房において、YGP−GETは疾病増大を減速させたと考えられる。推定されるところでは、存在するコロニーはある程度胞子形成を続けたが、コロニーの拡大は阻害された。その後、栽培者が試験領域全体に硫黄を噴霧したため、さらに長期間の有効性評価は不可能であった。

0275

これらの有望なデータは、ブドウの木のウドンコ病制御におけるYGP−GETの有効性を実証している。

0276

実施例20−ボトリチスに対する封入テルペン組成物の野外試験
ブドウのボトリチス房腐敗病は、果実の収穫に重大な損失をもたらし得る一般的な真菌であるボトリチスシネレア(Botrytis cinerea)に起因する。果実が感染の主たる部位であるが、この疾病は花と葉にも影響を及ぼし得る。初期には、感染した果実は軟らかく、水気が多く見え高湿度で水分の多い条件下では、灰色の真菌生育物に覆われることもある。時間が経過すると、感染した果実はしなびて、落下する。ボトリチスは、空気循環の悪い高湿度条件を好み、割れているか、または損傷した果実が、特に感染の拡大を受けやすい。ボトリチスの管理方策には、良好な空気循環を促進すること、損傷を防ぐこと、生育期の適切な時期に殺真菌剤を適用することが含まれる。

0277

この研究の目的は、ブドウのボトリチス感染の処置における、YGP−GETの有効性を調べることであった。

0278

2004年10月中旬(Teldor(登録商標)適用3週間後)、Kir−Yianniでのボトリチスの出現は、付随する立ち入り禁止期間によって計画された収穫が妨げられるため、通常の農薬で処置することができなかった。したがって、2つの隣接する0.1haのプロットをブドウ畑のサイト7に特定し、2004年10月12日、それらのプロットの1つを4ml/lのYGP−GET液体製剤で処置し、他方は未処置のままとした(図23を参照のこと)。3日後に作物を収穫し、各プロットの感染果実の比率を求めた(総収穫量の重量%)。その後、処置プロットおよび非処置プロット両方の非感染果実を、発酵槽で混合した。

0279

サイト7は、テルペン製剤の適用前に複数の製品で処置されていたが、依然としてボトリチス感染を示した。

0280

ブドウの木には、1200L/Haの割合で、4ml/lのYGP−GET液体製剤を単回適用した。

0281

ブドウの以下の生長段階を記録した。
−発芽、2004年3月26日
−開花、2004年6月1日
−ヴェレゾン、2004年8月6日
−収穫、2004年10月15日

0282

本研究の適用は、収穫3日前に行った。

0283

2004年の生育期は例外的に遅く、全期間を通じて湿潤であった。ベト病の疾病圧力は極めて高く、ウドンコ病の圧力は中程度であり、ボトリチスのレベルは高かった。

0284

ここでは収穫前の殺虫剤期間制限のため、他の方法では処置できなかったボトリチス感染に対するYGP−GETの潜在的有効性を評価するために、YGP−GETを適用した。

0285

テルペン製品適用前のサイトの視覚的評価によって、ボトリチス感染の証拠が明らかとなった。収穫後、果実をコンベヤベルトに広げ、感染した果実を手作業で非感染果実から分離し、その後粉砕した。感染果実の比率は、それぞれのプロットに関して、総収穫量の(重量)パーセントとして算出した。

0286

結果
YGP−GET適用前のサイトの視覚的評価によって、ボトリチス感染の証拠が明らかとなった。収穫後(YGP−GET適用3日後)、感染果実の比率は、処置プロットおよび未処置プロットでそれぞれ13%および23%であった。試験領域は統計的有意性を評価するには充分でなかった。しかしながら、YGP−GET処置は疾病の進行を明らかに減速した。

0287

未処置プロットおよびテルペン処置プロットの非感染果実を混合することによって、発酵は影響を受けなかった。

0288

考察
ボトリチスの通常の処置は、収穫3週間前に停止しなければならず、作物の収穫量および品質に相当な損害が生じる期間が残される。収穫まで用いることができるか、または現存する製品より収穫間近まで継続できる処置剤の開発は、作物の収穫量およびワインの品質に著しい改善をもたらすことができ、栽培者に相当な利益となるであろう。本研究において、テルペン製品YGP−GETによる処置は、収穫のわずか3日前に、定着したボトリチス感染の進行を明らかに減速し、未処置プロットに比べて、テルペン処置プロットの感染果実の比率を低下させた。さらに、収穫間近にYGP−GETを用いたにもかかわらず、処置ブドウと未処置ブドウの組合せによって発酵は影響を受けなかった。

0289

これらの結果は、YGP−GETが、定着したボトリチス感染の衝撃の低減に有効であり、その後の発酵に有害な影響を与えることなく、収穫近くに用いることができることを示唆している。

0290

実施例21−定着したベト病の処置に関する封入テルペンの評価、およびその後のブドウ品質の評価
2004年8月25日、250リットル当たり1000gの割合で組成物を適用して、YGP−GETの試験を行った。

0291

100%感染し、ベト病によって実質的に葉が損失しているカベルネソービニヨンのブドウ畑に噴霧した。残存する葉は、ベト病の典型的な徴候である葉の上部の黄色斑点および葉の底部の綿毛状生育物から明らかなように、ベト病の斑点が感染していた。葉の多くはほぼ全体が黄色であったが、これは実質的な感染を示している。この葉の損失および感染は一般にブドウの成熟を遅らせ、多くの場合、これらのブドウはワイン製造に適した完全に熟したブドウにはならない。

0292

ブドウの木に時折、完全に未成熟(すなわち、直径〜1cmで長円形の硬い暗緑色の果実)の房が認められたことは、これらの木がヴェレゾン前、おそらく開花時かそれ以前に感染した可能性が高いことを示していた。初期に銅(ボルドー、または塩基性硫酸銅)の適用は用いられなかった。このブドウ畑は、先の収穫においてカベルネソービニヨンから作物が生産されない程度にまで重度に感染していた。ベト病菌を接触致死させるための炭酸水素カリウム処置剤、それに続く長期的な浸透性防御のためのスチルブリン(Stilbourin)適用にもかかわらず、前年の葉の損失は100%であった。

0293

2004年9月19日、本試験で処置したブドウを摘み、粉砕し、ブドウ液について以下の観察を行った(表24)。

0294

0295

これらの結果は、処置した木のブドウは未処置のブドウより熟していることを示している。ブドウ自体の観察は、未処置のブドウは平均して、ヴェレゾンを過ぎたばかりのブドウであることを示す、薄い色で、一部は透明なピンク/紫/緑の色合いであるが、処置したブドウは平均して、完全に熟しているか、またはほぼ完全に熟しているブドウに特有の濃い紫色であり、不透明であることを示した。

0296

これらのブドウの試食により、処置したブドウは、熟したカベルネソービニヨンに特有の風味豊かな味わいを有したが、未処置のブドウは風味豊かな味わいではなかった。未処置のブドウは、青リンゴ酸味があり、これは良好なワインの製造には不適切な高いリンゴ酸酒石酸比であろうことを示している。

0297

これらのブドウの相違を実証し、処置したブドウがワイン製造に適していることを実証するために、これらのブドウからワインを製造する準備として、ブドウを粉砕し、茎を取った。ブドウ栽培者は、この処置剤がワインの風味に影響を及ぼすであろうと懸念していたが、本出願人の提案で、栽培者はYGP−GET適用の翌日に処置したブドウを試食し、残存する味も香りもないことを見出した。

0298

処置したブドウと未処置のブドウとの相違は、ブドウ液の色においてさらに実証される。未処置のブドウの果汁は、淡い緑がかった色/無色(白ワインブドウ液にやや似ている)であり、処置したブドウの果汁は、粉砕直後の熟したカベルネソービニヨン種のブドウに特有のピンクがかった色であった。これらの結果は、少なくとも短期間では、YGP−GETは、殺菌しベト病の再感染を阻止することにより、晩のブドウ畑の処置に有効であることを示している。

0299

ベト病の制御におけるYGP−GETの長期有効性に関するさらなる調査が役立つであろうが、提示された結果は、YGP−GETが有用な処置剤であることを示している。

0300

遅発性ベト病は作物を壊滅させるが、現在のところ、収穫の直前に適用でき、防御を提供する能力を保持する有効な処置剤はない。YGP−GETの大きな長所は、迅速に殺菌し、他の接触性殺真菌剤より長期にわたってその有効性を維持することである。

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