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課題・解決手段

本発明は、a)食用油アシル受容体基質及び脂肪酸CoA非依存性ジグリセリドグリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む、食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去する方法であって、前記脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基転移させることができる酵素として特徴づけられる、方法に関する。前記ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数である)を含むことが好ましい。また、本発明は、食用油の製造において前記食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去(好ましくは選択的に低減及び/又は除去)するための、食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基を転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用及び食用油を含む食料品の製造において前記食料品の結晶化特性を改善するための前記酵素の使用に関する。

概要

背景

以下の関連出願を参照されたい。1999年7月20日に出願された米国出願第09/750,990号、米国出願第10/409,391号、2003年7月23日に出願された米国出願第60/489,441号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301117.8号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301118.6号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301119.4号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301120.2号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301121.0号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301122.8号、2003年12月24日に出願された英国出願第0330016.7号及び2004年1月15日に出願された国際特許出願PCT/IB2004/000655号。本文中又はこれらの出願手続き中のこれら各出願、これらの各出願において引用された各文書(「出願引用文書」)及び出願引用文書において参照又は引用された各文書、並びにかかる手続き中に提出された特許性を支持するすべての意見書を参照により本明細書に援用する。本文においてはさまざまな文書も引用される(「本願引用文書」)。本願引用文書の各々及び本願引用文書中で引用又は参照された各文書を参照により本明細書に援用する。

油脂は、TAG(triacylglycerol)、DAG(diacylglycerol)、遊離脂肪酸及び他の微量成分の複雑な混合物からなる。これらの混合物の結晶化は、TAGの諸特性(構造、鎖長、不飽和と比較された飽和など)及びこれらのTAGの相互作用に左右される。DAGの存在に関して、以前の研究から、DAGは油及び脂肪の物性に対して重要な効果を有することが判明した。DAGは、結晶化速度、多型変化、融点、結晶サイズ及び晶癖とは異なる(Siew, 2001)。

脂肪種子から抽出されるほとんどの油では、DAGは少量しか存在しないのでDAGの効果はさほど顕著ではない。しかし、主として、DAGを天然に多量に含む油であるパーム油及びオリーブ油においては、これらの油の品質は、DAGが存在する場合には損なわれる。

ギネアアブラヤシ(Elaeis guineensis)から得られるパーム油は、商用的に重要な食用油である。パーム油は、高生産性、低価格、高い熱及び酸化安定性、室温での塑性などいくつかの有利な特性のために、食品産業にとって卓越した脂肪及び油源である。また、他の植物油と比較して、パーム油は、豊富酸化防止剤ビタミンE源である。

精製パーム油の典型的な化学組成は、約93%トリグリセリド、6%ジグリセリド及び1%MAG(monoglyceride)である(Okiy, 1977)。

パーム油が結晶化するときには、これらの成分の複雑な3次元ネットワークが形成される。理論的には、ネットワーク中の構成成分(TAG、DAG及びMAG)が多様であるほど、ネットワークはより複雑となり結晶化はより緩慢に起こるとされている(Jacobsberg & Ho, 1976)。この理論は、Drozdowski (1994)によって確認された。また、彼の研究によれば、トリアシルグリセロール分子における脂肪酸組成の変化が多いほど、異なる結晶相間の転移はより困難になる。

上述したように、パーム油中の高含量のジグリセリドは、その結晶化特性に影響を及ぼす(Okiy et al., 1978, Okiy, 1978)。

かかる油におけるジグリセリドの存在は有害である。特に、食用油(特にパーム油)中のジグリセリドは、低品質の油をもたらし得る。

パーム油並びに他の食用油及び脂肪中のジグリセリド含量に関する問題は、多数の研究の主題となっており、過剰なジグリセリドの問題を克服しようとするさまざまな解決策を文献中に見出すことができる。

日本の酵素製造者Amanoは、そのホームページ(Amano Enzyme Inc., 2004)上で、脂肪及び油中のジグリセリドを除去する酵素プロセス推奨している。このプロセスは、ジグリセリドを遊離脂肪酸とグリセリンに分解することができる酵素LIPASE G「AMANO」50の使用に基づく。この酵素は、DAG(diglyceride)及び/又はMAG(monoglyceride)加水分解性である。生成された遊離脂肪酸は、減圧蒸留又は分別結晶化によって除去される。

EP 0 558 112は、トリグリセリド乳濁液調製物中残留ジグリセリドの酵素加水分解プロセスを記載している。このプロセスは、Amano, Japan(同上)社製Lipase Gを用いたジグリセリドの加水分解に基づく。このプロセスは、乳濁液中の酵素反応をジグリセリドから脂肪酸とグリセリンへの分解用にすることによって促進された。水相は反応後に分離され、酵素は一部再使用される。

JP 62061590は、触媒作用量の水の存在下で部分的グリセリド特異的酵素(例えば、リパーゼ)を用いて、また、脂肪酸、脂肪酸エステル又は他のグリセリド油若しくは脂肪の存在下で1,3−特異的酵素であるリパーゼによって、油又は脂肪を処理することによって製造される、少量のジグリセリドを含むハードバターを教示する。生成物は、カカオバター代替品として使用するのに特に適切なハードバターである。すなわち、リパーゼG及びリゾープスデレマー(Rhizopus deremer)リパーゼ(1,3−特異的酵素)をけい藻土と混合し、顆粒化した。この顆粒パーム中間融点画分(5.7%ジグリセリド、酸価0.25)及び水(部分グリセリド特異的酵素に対して10%)と混合した。この混合物は室温で1時間撹拌され、酵素及び水が除去されて1.2%ジグリセリド(酸価10.5)を含むハードバターが得られた。

したがって、従来技術は、パーム油及び他の食用油中のジグリセリド内容物を酵素反応によって低減又は除去する方法を教示している。これらのプロセスは、遊離脂肪酸及びグリセリン形成中に特異的ジグリセリド加水分解リパーゼを用いたジグリセリドの加水分解に依拠する。次いで、遊離脂肪酸は、減圧蒸留又は分画のようなさまざまなプロセスによって除去することができる。

特異的ジグリセリド加水分解酵素を用いることの欠点は、遊離脂肪酸の不都合な形成である。これらの遊離脂肪酸は、パーム油から除去しなければならない。したがって、遊離脂肪酸の形成は、生成物の損失とみなされることが多い。

遊離脂肪酸形成に起因する遊離脂肪酸の除去及び生成物の損失に付随するこれらの問題を克服するために、本発明者らは、パーム油及び他の植物油中の高ジグリセリド含量に付随するこれらの問題を克服する新しい方法を見出した。

酵素によるパーム油からのジグリセリドの除去は、典型的には1,3特異的トリアシルグリセロール加水分解酵素(E.C.3.1.1.3)であるリパーゼの使用によって教示されてきた(例えば、JP 62061590又はEP 0 652 289参照)。国際公開第00/05396号は、とりわけ、グリセリンと低水分環境においてグリセロール分解を起こすリパーゼとを含むことができる食材の処理を教示する。

しかし、1,3特異的トリアシルグリセロール加水分解酵素(リパーゼ)とDAG/MAG加水分解酵素のどちらも油中の遊離脂肪酸が大きく増加し、モノグリセリドの加水分解も生じる。

しかし、例えば、一部の植物油においては、一部の適用例に対して、モノグリセリドは乳化剤機能をもたらすので、油のモノグリセリド含量を増加させることが望ましい場合がある。したがって、一態様においては、モノグリセリド含量を減少させずにジグリセリド含量を減少させることが好ましい。別の態様においては、ジグリセリドとモノグリセリド含量の両方を減少させることが好ましい場合がある。

リパーゼ酵素は、食用油中に存在するバルク脂質であるTAG(triacylglycerol)の加水分解のためにDAGの有害な増加を招くこともある。

国際公開第2000/36114号、US2003/0028923及びUS2003/0074695においては、DGAT(diacylglycerol acyltransferase)酵素をコードする配列又はそのアンチセンス配列を有する核酸を用いた植物の形質転換が教示される。これらの文献に教示されるDGAT酵素は、DAG(diacylglycerol)がアシルCoAアシル基と結合してTAG(triglyceride)を形成する「ケネディ経路(Kennedy pathway)」において最終ステップ触媒する。したがって、これらの文献は、改変TAG組成物及び/又は内容物を用いたトランスジェニック植物生産を教示している。これらの文献に教示されるDGAT酵素は、本発明による脂質アシル基転移酵素及び/又はジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素ではない。

特に、DGATは、機能するためにアシルCoA又は脂肪酸CoAが存在する必要がある。アシルCoAは、法外に高価であるので、食用油の処理に商用的に使用するのには適さない。しかし、これらの酵素はアシルCoAなしでは働かない。また、脂肪酸CoAに依拠する酵素反応は、工業的に制御することが極めて困難である。

また、これらの文献のすべてが、植物におけるDGAT酵素の発現を抑制すること、したがって植物中のTAGの量を減少させることが望ましい場合が多いことを教示している。これは、食用油中のDAG(diglyceride)を減少させつつTAGの保存及び/又は産生を最終的に必要とする本発明とは極めて対照的である。

国際公開第03/100044号は、リン脂質レシチン)からとりわけDAG(diacylglycerol)へのアシル転移によってTAG(triglyceride)の形成を触媒するPDAT(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase)を教示している。PDATは、アシル供与体としてリン脂質を必要とする。これは、アシル供与体がDAGである本発明とは極めて対照的である。この文献は、本発明による脂質アシル基転移酵素を用いた食用油からのDAGの除去を教示していない。
米国出願第09/750,990号
米国出願第10/409,391号
米国出願第60/489,441号
英国出願第0301117.8号
英国出願第0301118.6号
英国出願第0301119.4号
英国出願第0301120.2号
英国出願第0301121.0号
英国出願第0301122.8号
英国出願第0330016.7号
国際特許出願PCT/IB2004/000655号
EP 0 558 112
JP 62061590
EP 0 652 289
国際公開第00/05396号
国際公開第2000/36114号
US2003/0028923
US2003/0074695
国際公開第03/100044号
Siew, 2001
Okiy, 1977
Jacobsberg & Ho, 1976
Drozdowski (1994)
Okiy et al., 1978
Okiy, 1978
Amano Enzyme Inc., 2004

概要

本発明は、a)食用油をアシル受容体基質及び脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む、食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去する方法であって、前記脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基を転移させることができる酵素として特徴づけられる、方法に関する。前記ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1個又は複数である)を含むことが好ましい。また、本発明は、食用油の製造において前記食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去(好ましくは選択的に低減及び/又は除去)するための、食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基を転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用及び食用油を含む食料品の製造において前記食料品の結晶化特性を改善するための前記酵素の使用に関する。

目的

本発明は、さらに、食料品の製造において前記食料品からジグリセリドを低減及び/又は除去(好ましくは選択的に低減及び/又は除去)するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
2件

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請求項1

a)食用油アシル受容体基質及び脂肪酸CoA非依存性ジグリセリドグリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む、食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去する方法であって、前記脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が食用油中でジグリセリドからグリセリンにアシル基転移させる酵素として特徴づけられる方法。

請求項2

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素がアミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、Sから選択される1つ又は複数のアミノ酸残基である)を含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

食用油中のジグリセリド量が低減される、請求項1に記載の方法。

請求項4

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素がアシル基をジグリセリドからアシル受容体に転移させ、前記アシル受容体がヒドロキシ基(−OH)を含む任意の化合物である、請求項1又は2に記載の方法。

請求項5

ジグリセリドが1,2−ジグリセリドである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

アシル受容体が、食用油に可溶であるアシル受容体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

アシル受容体がアルコールである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

アシル受容体がアルコールである、請求項7に記載の方法。

請求項9

アシル受容体がグリセリンである、請求項8に記載の方法。

請求項10

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、H−309を含む、又は配列番号2若しくは配列番号32で示されるアエロモナスヒドロフィ脂肪分解酵素アミノ酸配列中のHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトミセスサッカロミセスラクトコッカスマイコバクテリウムストレプトコッカスラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルスカンピロバクタービブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリアナイセリアメソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダから選択される1つ又は複数の属の生物から得られる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が以下のアミノ酸配列、すなわち、(i)配列番号2で示されるアミノ酸配列、(ii)配列番号3で示されるアミノ酸配列、(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列、(iv)配列番号5で示されるアミノ酸配列、(v)配列番号6で示されるアミノ酸配列、(vi)配列番号12で示されるアミノ酸配列、(vii)配列番号20で示されるアミノ酸配列、(viii)配列番号22で示されるアミノ酸配列、(ix)配列番号24で示されるアミノ酸配列、(x)配列番号26で示されるアミノ酸配列、(xi)配列番号28で示されるアミノ酸配列、(xii)配列番号30で示されるアミノ酸配列、(xiii)配列番号32で示されるアミノ酸配列、(xiv)配列番号34で示されるアミノ酸配列、(xv)配列番号55で示されるアミノ酸配列、(xvi)配列番号58で示されるアミノ酸配列、(xvii)配列番号60で示されるアミノ酸配列、(xviii)配列番号61で示されるアミノ酸配列、(xix)配列番号63で示されるアミノ酸配列、(xx)配列番号65で示されるアミノ酸配列、(xxi)配列番号67で示されるアミノ酸配列、(xxii)配列番号70で示されるアミノ酸配列、(xxiii)配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号12、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号55、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67又は配列番号70で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するアミノ酸配列から選択される1つ又は複数の配列を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、以下のヌクレオチド配列、すなわち、(a)配列番号7で示されるヌクレオチド配列、(b)配列番号8で示されるヌクレオチド配列、(c)配列番号9で示されるヌクレオチド配列、(d)配列番号10で示されるヌクレオチド配列、(e)配列番号11で示されるヌクレオチド配列、(f)配列番号13で示されるヌクレオチド配列、(g)配列番号21で示されるヌクレオチド配列、(h)配列番号23で示されるヌクレオチド配列、(i)配列番号25で示されるヌクレオチド配列、(j)配列番号27で示されるヌクレオチド配列、(k)配列番号29で示されるヌクレオチド配列、(l)配列番号31で示されるヌクレオチド配列、(m)配列番号33で示されるヌクレオチド配列、(n)配列番号35で示されるヌクレオチド配列、(o)配列番号54で示されるヌクレオチド配列、(p)配列番号59で示されるヌクレオチド配列、(q)配列番号62で示されるヌクレオチド配列、(r)配列番号64で示されるヌクレオチド配列、(s)配列番号66で示されるヌクレオチド配列、(t)配列番号68で示されるヌクレオチド配列、(u)配列番号69で示されるヌクレオチド配列、(v)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号54、配列番号59、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68又は配列番号69で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するヌクレオチド配列から選択される1つ又は複数の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

処理した食用油を1つ又は複数の食品成分と混合して食料品を製造するステップを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

食用油の製造において前記食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去(好ましくは選択的に低減及び/又は除去)するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用。

請求項16

食用油を含む食料品の製造において前記食料品の結晶化特性を改善するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用。

請求項17

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素がアミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、Sから選択される1つ又は複数のアミノ酸残基である)を含む、請求項15又は16に記載の使用。

請求項18

食用油中のジグリセリド量が低減される、請求項15、16又は17のいずれか一項に記載の使用。

請求項19

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素がアシル基をジグリセリドからアシル受容体に転移させ、前記アシル受容体がヒドロキシ基(−OH)を含む任意の化合物である、請求項15から18のいずれか一項に記載の使用。

請求項20

ジグリセリドが1,2−ジグリセリドである、請求項15から19のいずれか一項に記載の使用。

請求項21

アシル受容体が、食用油に可溶であるアシル受容体である、請求項15から20のいずれか一項に記載の使用。

請求項22

アシル受容体がアルコールである、請求項14から19のいずれか一項に記載の使用。

請求項23

アシル受容体がアルコールである、請求項22に記載の使用。

請求項24

アシル受容体がグリセリンである、請求項23に記載の使用。

請求項25

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、H−309を含む、或いは配列番号2又は配列番号32で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含む、請求項15から24のいずれか一項に記載の使用。

請求項26

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトミセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダから選択される1つ又は複数の属の生物から得られる、請求項15から25のいずれか一項に記載の使用。

請求項27

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が以下のアミノ酸配列、すなわち、(i)配列番号2で示されるアミノ酸配列、(ii)配列番号3で示されるアミノ酸配列、(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列、(iv)配列番号5で示されるアミノ酸配列、(v)配列番号6で示されるアミノ酸配列、(vi)配列番号12で示されるアミノ酸配列、(vii)配列番号20で示されるアミノ酸配列、(viii)配列番号22で示されるアミノ酸配列、(ix)配列番号24で示されるアミノ酸配列、(x)配列番号26で示されるアミノ酸配列、(xi)配列番号28で示されるアミノ酸配列、(xii)配列番号30で示されるアミノ酸配列、(xiii)配列番号32で示されるアミノ酸配列、(xiv)配列番号34で示されるアミノ酸配列、(xv)配列番号55で示されるアミノ酸配列、(xvi)配列番号58で示されるアミノ酸配列、(xvii)配列番号60で示されるアミノ酸配列、(xviii)配列番号61で示されるアミノ酸配列、(xix)配列番号63で示されるアミノ酸配列、(xx)配列番号65で示されるアミノ酸配列、(xxi)配列番号67で示されるアミノ酸配列、(xxii)配列番号70で示されるアミノ酸配列、(xxiii)配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号12、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号55、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67又は配列番号70で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するアミノ酸配列から選択される1つ又は複数の配列を含む、請求項15から26のいずれか一項に記載の使用。

請求項28

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、以下のヌクレオチド配列、すなわち、(a)配列番号7で示されるヌクレオチド配列、(b)配列番号8で示されるヌクレオチド配列、(c)配列番号9で示されるヌクレオチド配列、(d)配列番号10で示されるヌクレオチド配列、(e)配列番号11で示されるヌクレオチド配列、(f)配列番号13で示されるヌクレオチド配列、(g)配列番号21で示されるヌクレオチド配列、(h)配列番号23で示されるヌクレオチド配列、(i)配列番号25で示されるヌクレオチド配列、(j)配列番号27で示されるヌクレオチド配列、(k)配列番号29で示されるヌクレオチド配列、(l)配列番号31で示されるヌクレオチド配列、(m)配列番号33で示されるヌクレオチド配列、(n)配列番号35で示されるヌクレオチド配列、(o)配列番号54で示されるヌクレオチド配列、(p)配列番号59で示されるヌクレオチド配列、(q)配列番号62で示されるヌクレオチド配列、(r)配列番号64で示されるヌクレオチド配列、(s)配列番号66で示されるヌクレオチド配列、(t)配列番号68で示されるヌクレオチド配列(u)配列番号69で示されるヌクレオチド配列、(v)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号54、配列番号59、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68又は配列番号69で示される配列のいずれか1つと75%以上同一であるヌクレオチド配列から選択される1つ又は複数の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項15から27のいずれか一項に記載の使用。

請求項29

脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が結晶化阻害剤と併用される、請求項15から28のいずれか一項に記載の使用。

請求項30

添付の明細書本文及び図に関して実質的に上述された方法。

請求項31

添付の明細書本文及び図に関して実質的に上述された使用。

技術分野

0001

本発明は、食用油からジグリセリド(好ましくは1,2−ジアシルグリセリド)を酵素によって除去及び/又は低減する新規方法に関する。

背景技術

0002

以下の関連出願を参照されたい。1999年7月20日に出願された米国出願第09/750,990号、米国出願第10/409,391号、2003年7月23日に出願された米国出願第60/489,441号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301117.8号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301118.6号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301119.4号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301120.2号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301121.0号、2003年1月17日に出願された英国出願第0301122.8号、2003年12月24日に出願された英国出願第0330016.7号及び2004年1月15日に出願された国際特許出願PCT/IB2004/000655号。本文中又はこれらの出願手続き中のこれら各出願、これらの各出願において引用された各文書(「出願引用文書」)及び出願引用文書において参照又は引用された各文書、並びにかかる手続き中に提出された特許性を支持するすべての意見書を参照により本明細書に援用する。本文においてはさまざまな文書も引用される(「本願引用文書」)。本願引用文書の各々及び本願引用文書中で引用又は参照された各文書を参照により本明細書に援用する。

0003

油脂は、TAG(triacylglycerol)、DAG(diacylglycerol)、遊離脂肪酸及び他の微量成分の複雑な混合物からなる。これらの混合物の結晶化は、TAGの諸特性(構造、鎖長、不飽和と比較された飽和など)及びこれらのTAGの相互作用に左右される。DAGの存在に関して、以前の研究から、DAGは油及び脂肪の物性に対して重要な効果を有することが判明した。DAGは、結晶化速度、多型変化、融点、結晶サイズ及び晶癖とは異なる(Siew, 2001)。

0004

脂肪種子から抽出されるほとんどの油では、DAGは少量しか存在しないのでDAGの効果はさほど顕著ではない。しかし、主として、DAGを天然に多量に含む油であるパーム油及びオリーブ油においては、これらの油の品質は、DAGが存在する場合には損なわれる。

0005

ギネアアブラヤシ(Elaeis guineensis)から得られるパーム油は、商用的に重要な食用油である。パーム油は、高生産性、低価格、高い熱及び酸化安定性、室温での塑性などいくつかの有利な特性のために、食品産業にとって卓越した脂肪及び油源である。また、他の植物油と比較して、パーム油は、豊富酸化防止剤ビタミンE源である。

0006

精製パーム油の典型的な化学組成は、約93%トリグリセリド、6%ジグリセリド及び1%MAG(monoglyceride)である(Okiy, 1977)。

0007

パーム油が結晶化するときには、これらの成分の複雑な3次元ネットワークが形成される。理論的には、ネットワーク中の構成成分(TAG、DAG及びMAG)が多様であるほど、ネットワークはより複雑となり結晶化はより緩慢に起こるとされている(Jacobsberg & Ho, 1976)。この理論は、Drozdowski (1994)によって確認された。また、彼の研究によれば、トリアシルグリセロール分子における脂肪酸組成の変化が多いほど、異なる結晶相間の転移はより困難になる。

0008

上述したように、パーム油中の高含量のジグリセリドは、その結晶化特性に影響を及ぼす(Okiy et al., 1978, Okiy, 1978)。

0009

かかる油におけるジグリセリドの存在は有害である。特に、食用油(特にパーム油)中のジグリセリドは、低品質の油をもたらし得る。

0010

パーム油並びに他の食用油及び脂肪中のジグリセリド含量に関する問題は、多数の研究の主題となっており、過剰なジグリセリドの問題を克服しようとするさまざまな解決策を文献中に見出すことができる。

0011

日本の酵素製造者Amanoは、そのホームページ(Amano Enzyme Inc., 2004)上で、脂肪及び油中のジグリセリドを除去する酵素プロセス推奨している。このプロセスは、ジグリセリドを遊離脂肪酸とグリセリンに分解することができる酵素LIPASE G「AMANO」50の使用に基づく。この酵素は、DAG(diglyceride)及び/又はMAG(monoglyceride)加水分解性である。生成された遊離脂肪酸は、減圧蒸留又は分別結晶化によって除去される。

0012

EP 0 558 112は、トリグリセリド乳濁液調製物中残留ジグリセリドの酵素加水分解プロセスを記載している。このプロセスは、Amano, Japan(同上)社製Lipase Gを用いたジグリセリドの加水分解に基づく。このプロセスは、乳濁液中の酵素反応をジグリセリドから脂肪酸とグリセリンへの分解用にすることによって促進された。水相は反応後に分離され、酵素は一部再使用される。

0013

JP 62061590は、触媒作用量の水の存在下で部分的グリセリド特異的酵素(例えば、リパーゼ)を用いて、また、脂肪酸、脂肪酸エステル又は他のグリセリド油若しくは脂肪の存在下で1,3−特異的酵素であるリパーゼによって、油又は脂肪を処理することによって製造される、少量のジグリセリドを含むハードバターを教示する。生成物は、カカオバター代替品として使用するのに特に適切なハードバターである。すなわち、リパーゼG及びリゾープスデレマー(Rhizopus deremer)リパーゼ(1,3−特異的酵素)をけい藻土と混合し、顆粒化した。この顆粒パーム中間融点画分(5.7%ジグリセリド、酸価0.25)及び水(部分グリセリド特異的酵素に対して10%)と混合した。この混合物は室温で1時間撹拌され、酵素及び水が除去されて1.2%ジグリセリド(酸価10.5)を含むハードバターが得られた。

0014

したがって、従来技術は、パーム油及び他の食用油中のジグリセリド内容物を酵素反応によって低減又は除去する方法を教示している。これらのプロセスは、遊離脂肪酸及びグリセリン形成中に特異的ジグリセリド加水分解リパーゼを用いたジグリセリドの加水分解に依拠する。次いで、遊離脂肪酸は、減圧蒸留又は分画のようなさまざまなプロセスによって除去することができる。

0015

特異的ジグリセリド加水分解酵素を用いることの欠点は、遊離脂肪酸の不都合な形成である。これらの遊離脂肪酸は、パーム油から除去しなければならない。したがって、遊離脂肪酸の形成は、生成物の損失とみなされることが多い。

0016

遊離脂肪酸形成に起因する遊離脂肪酸の除去及び生成物の損失に付随するこれらの問題を克服するために、本発明者らは、パーム油及び他の植物油中の高ジグリセリド含量に付随するこれらの問題を克服する新しい方法を見出した。

0017

酵素によるパーム油からのジグリセリドの除去は、典型的には1,3特異的トリアシルグリセロール加水分解酵素(E.C.3.1.1.3)であるリパーゼの使用によって教示されてきた(例えば、JP 62061590又はEP 0 652 289参照)。国際公開第00/05396号は、とりわけ、グリセリンと低水分環境においてグリセロール分解を起こすリパーゼとを含むことができる食材の処理を教示する。

0018

しかし、1,3特異的トリアシルグリセロール加水分解酵素(リパーゼ)とDAG/MAG加水分解酵素のどちらも油中の遊離脂肪酸が大きく増加し、モノグリセリドの加水分解も生じる。

0019

しかし、例えば、一部の植物油においては、一部の適用例に対して、モノグリセリドは乳化剤機能をもたらすので、油のモノグリセリド含量を増加させることが望ましい場合がある。したがって、一態様においては、モノグリセリド含量を減少させずにジグリセリド含量を減少させることが好ましい。別の態様においては、ジグリセリドとモノグリセリド含量の両方を減少させることが好ましい場合がある。

0020

リパーゼ酵素は、食用油中に存在するバルク脂質であるTAG(triacylglycerol)の加水分解のためにDAGの有害な増加を招くこともある。

0021

国際公開第2000/36114号、US2003/0028923及びUS2003/0074695においては、DGAT(diacylglycerol acyltransferase)酵素をコードする配列又はそのアンチセンス配列を有する核酸を用いた植物の形質転換が教示される。これらの文献に教示されるDGAT酵素は、DAG(diacylglycerol)がアシルCoAアシル基と結合してTAG(triglyceride)を形成する「ケネディ経路(Kennedy pathway)」において最終ステップ触媒する。したがって、これらの文献は、改変TAG組成物及び/又は内容物を用いたトランスジェニック植物生産を教示している。これらの文献に教示されるDGAT酵素は、本発明による脂質アシル基転移酵素及び/又はジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素ではない。

0022

特に、DGATは、機能するためにアシルCoA又は脂肪酸CoAが存在する必要がある。アシルCoAは、法外に高価であるので、食用油の処理に商用的に使用するのには適さない。しかし、これらの酵素はアシルCoAなしでは働かない。また、脂肪酸CoAに依拠する酵素反応は、工業的に制御することが極めて困難である。

0023

また、これらの文献のすべてが、植物におけるDGAT酵素の発現を抑制すること、したがって植物中のTAGの量を減少させることが望ましい場合が多いことを教示している。これは、食用油中のDAG(diglyceride)を減少させつつTAGの保存及び/又は産生を最終的に必要とする本発明とは極めて対照的である。

0024

国際公開第03/100044号は、リン脂質レシチン)からとりわけDAG(diacylglycerol)へのアシル転移によってTAG(triglyceride)の形成を触媒するPDAT(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase)を教示している。PDATは、アシル供与体としてリン脂質を必要とする。これは、アシル供与体がDAGである本発明とは極めて対照的である。この文献は、本発明による脂質アシル基転移酵素を用いた食用油からのDAGの除去を教示していない。
米国出願第09/750,990号
米国出願第10/409,391号
米国出願第60/489,441号
英国出願第0301117.8号
英国出願第0301118.6号
英国出願第0301119.4号
英国出願第0301120.2号
英国出願第0301121.0号
英国出願第0301122.8号
英国出願第0330016.7号
国際特許出願PCT/IB2004/000655号
EP 0 558 112
JP 62061590
EP 0 652 289
国際公開第00/05396号
国際公開第2000/36114号
US2003/0028923
US2003/0074695
国際公開第03/100044号
Siew, 2001
Okiy, 1977
Jacobsberg & Ho, 1976
Drozdowski (1994)
Okiy et al., 1978
Okiy, 1978
Amano Enzyme Inc., 2004

課題を解決するための手段

0025

本明細書に規定される脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素、具体的には脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素を使用すると、ジグリセリド(好ましくは1,2−ジグリセリド)が食用油から選択的に低減及び/又は除去されることが見出された。

0026

本明細書では「選択的」という用語は、食用油環境において酵素がDAG(diglyceride)、好ましくは1,2−ジグリセリドをTAG(triacylglyceride)又はMAG(monoglyceride)に優先的な基質として利用することを意味する。したがって、油中のトリグリセリド量を変えずに(又は実質的に変えずに)ジグリセリドを食用油から除去及び/又は低減することができる。油中のモノグリセリド量不変(又は実質的に不変)のままか、又は増加することがある。一部の適用例においては、油中のモノグリセリド量は減少することがある。

0027

本発明の一態様においては、a)食料品又はその一部をアシル受容体基質及び脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む、食料品からジグリセリドを低減及び/又は除去する方法であって、前記脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる方法が提供される。

0028

本発明のさらに別の態様においては、a)食用油をアシル受容体基質及び脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素と混合するステップを含む食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去する方法であって、前記脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる方法が提供される。

0029

適切には、本発明による方法は、さらに、処理した食用油又はその一部を1つ又は複数の食品成分に添加して、例えばマーガリンスプレッドなどの食料品を製造するステップを含むことができる。

0030

本発明は、さらに、食料品の製造において前記食料品からジグリセリドを低減及び/又は除去(好ましくは選択的に低減及び/又は除去)するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。

0031

さらに別の態様においては、本発明は、さらに、食料品の製造において前記食料品の結晶化特性を改善するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。

0032

別の態様においては本発明は、食用油の製造において前記食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去(好ましくは選択的に低減及び/又は除去)するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。

0033

別の態様においては本発明は、食用油の製造において前記食用油の結晶化特性を改善するための、食用油中でアシル基をジグリセリドからグリセリンに転移させることができる酵素として特徴づけられる脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。

発明を実施するための最良の形態

0034

本明細書では「脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素」及び「脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素」という用語は、(一般に、国際生化学分子生物連合の命名委員会酵素命名法推奨(1992)に従ってE.C.2.3.1.xに分類される)アシル基転移酵素活性を有する酵素を意味し、それによってこの酵素は、ジグリセリドから1個又は複数の受容体基質にアシル基を転移させることが可能である)。

0035

したがって、本発明による「脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素」又は「脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素」は、(一般にE.C.2.3.1.xに分類される)アシル基転移酵素活性を有するが、DGAT(diacylglycerol acyltransferase)でもPDAT(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase)でもない酵素である。DGATは、一般にE.C.2.3.1.20に分類される。PDATは、一般にE.C.2.3.1.158に分類される。したがって、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素又は脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、アシル基転移酵素活性を有するが、E.C.2.3.1.20又はE.C.2.3.1.158に分類される酵素ではない酵素である。

0036

本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素又は脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、食用油中でアシル基をDAGからグリセリンに転移させることができる酵素である。したがって、本発明による酵素によって触媒される反応は、
DAG(diglyceride)+グリセリン → 2MAG(monoglyceride)
である。

0037

これは、ケネディプロセスにおける最終ステップ、すなわち、
1,2−DAG+アシルCoA→CoA+TAG(triacylglycerol)
を触媒するDGAT(diacylglycerol acyltransferase)(又はジアシルグリセロールO−アシル基転移酵素)として知られる酵素とは極めて対照的である(かかる酵素は、E.C.2.3.1.20に分類される)。

0038

不確かさを回避するために、DGATは、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素でも脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素でもない。

0039

本発明による酵素によって触媒される反応は、PDAT(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase)として知られる酵素によって触媒される反応、すなわち、
(レシチンなどの)リン脂質+1,2−DAG → TAG(triacylglycerol)+リゾリン脂質
とも極めて対照的である。

0040

不確かさを回避するために、PDATは、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素でも脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素でもない。

0041

本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素又は脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、E.C.2.3.1.73に分類される酵素であることが好ましい。

0042

適切には、脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、膜非依存性とすることができ、すなわち膜アンカー又は膜貫通ドメインが存在することによってその自然環境において膜と結合していないタンパク質とすることができる。

0043

不確かさを回避するために、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、国際公開第03/100044号、国際公開第2000/36114号、US2003/0028923又はUS2003/0074695のいずれか1つに教示される酵素ではない。

0044

この酵素は、アシル基転移酵素活性を有するのみならず、(一般にE.C.3.1.1.xに分類される)リパーゼ活性、例えば、ホスホリパーゼ活性も有することができる。

0045

本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素である。これらの用語は、本明細書では区別なく使用することができる。

0046

本発明による脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、Sから選択される1つ又は複数のアミノ酸残基)を含むアシル基転移酵素であることが好ましい。

0047

本明細書では「ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素」という用語は、「脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素」という用語と同義である。

0048

不確かさを回避するために、「脂肪酸CoA」という用語は、「アシルCoA」、「脂肪酸酵素CoA」及び「アシルCo酵素A」という用語と同じである。これらの用語は、本明細書では区別なく使用することができる。

0049

本発明による方法又は使用に使用される食用油は、粗製油(crude oil)の形とすることができ、又は精製油とすることができる。

0050

一実施形態においては、ジグリセリド量は完全に除去されるのではなく低減されることが好ましい。

0051

本明細書では「低減」という用語は、本発明による酵素で処理した食用油中のジグリセリド量が酵素処理前の食用油中のジグリセリド量よりも少ないことを意味する。

0052

ジグリセリドは、食用油から完全には除去されないことが好ましい。

0053

マーガリン及び/又はショートニング中の処理油の使用など一部の適用例においては、ジグリセリド量、特に1,2ジグリセリドは、脂肪混合物の結晶化速度が小さなベータ結晶を生成する点まで低減されるべきである。パーム油中の全ジグリセリドに対する1,2−ジグリセリド量は、油の年数及び貯蔵条件に左右される。市販油の場合、1,3ジグリセリド:1,2ジグリセリドの比は1.8:3.3である。1,2ジグリセリドの除去は、結晶化特性に最も影響を及ぼす。

0054

業者には容易に明らかなとおり、ジグリセリド量の低減は、反応時間及び反応温度によって制御することができる。固定化酵素を含む流通反応装置においては、反応は流量によって制御することができる。

0055

好ましくは、本発明の方法及び/又は使用に使用される脂質アシル基転移酵素は、アシル基をジグリセリドからアシル受容体に転移させることができる。前記アシル受容体は、ヒドロキシ基(−OH)を含む任意の化合物である。

0056

適切には、本明細書では「ジグリセリド」という用語は、1,2−ジグリセリド又は1,3−ジグリセリドの1個又は複数を意味する。ジグリセリドは1,2−ジグリセリドであることが好ましい。

0057

「ジグリセリド」及び「ジアシルグリセロール」という用語は、本明細書では区別なく使用される。

0058

「ジグリセリド」という用語は、DGDG(digalactosyldiglyceride)及び/又はレシチン、例えば、ホスファチジルコリン包含しない。

0059

アシル受容体は、食用油に可溶であるものが好ましい。

0060

適切には、アシル受容体は、グリセリン並びにその混合物及び誘導体を含めて、例えばエタノール多価アルコールなどのアルコールとすることができる。適切には、アシル受容体は、ステロールスタノールヒドロキシ酸ソルビトールソルビタン又は他の炭水化物の1個又は複数とすることができる。

0061

好ましい一実施形態においては、アシル受容体はグリセリンである。

0062

したがって、一実施形態においては本発明は、a)食用油をグリセリンと脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の両方と混合するステップを含む、食用油からジグリセリドを低減及び/又は除去する方法であって、前記脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素が、アシル転移酵素活性を有し、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、Sから選択される1つ又は複数のアミノ酸残基)を含む酵素として特徴づけられる方法を提供する。

0063

本発明によるアシル受容体は水ではないことが好ましい。

0064

アシル受容体はモノグリセリド及び/又はジグリセリドではないことが好ましい。

0065

好ましくは、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、脂質基質脂肪酸残基グリセリン骨格の間のアシル結合を切断することができ、好ましくは、脂質基質はジグリセリドであり、好ましくは1,2−ジグリセリドである。

0066

本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、トリグリセリド及び/又はモノグリセリドに作用しないことが好ましい。換言すれば、好ましくは、脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、ジグリセリドに選択的であり、好ましくは1,2−ジグリセリドに選択的である。この脂質基質は、本明細書では「脂質アシル供与体」と記述することができる。

0067

したがって、本発明によれば、以下の有利な諸特性、すなわち、食用油のジグリセリド含量の低減、食用油のトリグリセリド含量の低減のない食用油のジグリセリド含量の低減、モノグリセリド含量の増加のない食用油のジグリセリド含量の低減、食用油のジグリセリド含量の低減とモノグリセリド含量の増加、食用油のジグリセリドの低減及びモノグリセリド含量の低減、食用油中の脂肪酸含量の大きな増加のない食用油のジグリセリド含量の低減の1つ又は複数を達成することができる。

0068

好ましくは、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、脂肪酸アシル基をジグリセリド(好ましくは1,2−DAG)からアルコール(好ましくはグリセリン)に転移させることによってアルコール分解反応(好ましくはグリセロール分解)を実施し、それによって2個のモノグリセリド分子、すなわちジグリセリドから1個とグリセリンから1個を、受容されたアシル基と一緒に生成する。

0069

GDSXモチーフのXはLであることが好ましい。すなわち、本発明による酵素は、アミノ酸配列モチーフGSDLを含むことが好ましい。

0070

GDSXモチーフは、4個の保存アミノ酸からなる。このモチーフ内のセリンは、脂質アシル基転移酵素の触媒作用性セリンであることが好ましい。適切には、GDSXモチーフのセリンは、Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064)に教示されたアエロモナスヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)脂肪分解酵素中のSer−16に対応する位置に存在することができる。

0071

タンパク質が本発明によるGDSXモチーフを有するかどうかを判定するために、配列をpfamデータベースのHMM(hidden markov model)プロファイルと比較することが好ましい。

0072

Pfamは、タンパク質ドメインファミリーのデータベースである。Pfamは、各ファミリーに対して検証された(curated)複数の配列アラインメント及び新しい配列中のこれらのドメインを特定するためのプロファイルHMM(hidden Markov model)を含む。Pfamの序論は、Bateman A et al. (2002) Nucleic AcidsRes. 30; 276-280にある。隠れマルコフモデルは、タンパク質を分類するためのいくつかのデータベースにおいて使用されている。総説として、Bateman A and Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245を参照されたい。
"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=12230032&dopt=Abstract
"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list#uids=11752314&dopt=Abstract

0073

隠れマルコフモデルの詳細な説明、及びそのモデルをPfamデータベースに適用する方法については、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4を参照されたい。Hammerソフトウェアパッケージは、Washington University, St Louis, USAから入手することができる。

0074

或いは、GDSXモチーフは、Hammerソフトウェアパッケージを用いて特定することができる。その説明は、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4及びその中の参考文献にある。HMMER2プロファイルは本明細書に記載されている。

0075

FAMデータベースには、例えば、現在は以下のウェブサイトにあるいくつかのサーバーを介して接続することができる。
"http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml" http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
"http://pfam.wustl.edu/" http://pfam.wustl.edu/
"http://pfam.jouy.inra.fr/" http://pfam.jouy.inra.fr/
"http://pfam.cgb.ki.se/" http://pfam.cgb.ki.se/

0076

このデータベースは、タンパク質配列を入力することができる検索機能を提供している。次いで、データベースのデフォルトパラメータを用いて、タンパク質配列をPfamドメインの有無について解析する。GDSXドメインは、このデータベースにおいて確立されたドメインであり、したがってあらゆる検索配列中にその存在が認められる。データベースは、検索配列に対してPfam00657コンセンサス配列アラインメントを返す。

0077

アエロモナスサルモニシダ(Aeromonas salmonicida)又はアエロモナス・ヒドロフィラを含めて、
a)手引書
上記手順に従って、目的タンパク質とPfam00657コンセンサス配列とのアラインメント及びP10480とPfam00657コンセンサス配列とのアラインメントを得る、
又は
b)データベース
によって複数のアラインメントを得ることができる。
データベースは、Pfam00657コンセンサス配列の特定後に、検索配列のアラインメントをPfam00657コンセンサス配列のシードアラインメントに示す選択肢を提供する。P10480はこのシードアラインメントの一部であり、GCAT_AERHYで示される。検索配列とP10480の両方は同じ枠内に示される。

0078

アエロモナス・ヒドロフィラ基準配列
アエロモナス・ヒドロフィラGDSXリパーゼの残基は、NCBIファイルP10480中で番号付与されている。本文中の番号は、好ましい実施形態において本発明の脂質アシル基転移酵素中に存在する特定のアミノ酸残基を求めるために本発明において使用されるファイル中の番号である。

0079

Pfamアラインメントを実施した(図33及び34)。
以下の保存残基は認識することができ、好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される酵素中に存在することができる。
ブロック1 −GDSXブロック
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28 29 30 31 32 33 34 35
ブロック2 − GANDYブロック
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
ブロック3 − HPTブロック
His
309

0080

ここで、「hid」は、Met、Ile、Leu、Val、Ala、Gly、Cys、His、Lys、Trp、Tyr、Pheから選択される疎水性残基を意味する。

0081

本発明の組成物/方法に使用される脂質アシル基転移酵素は、Pfam00657コンセンサス配列を用いてアラインメントさせることができることが好ましい。

0082

pfam00657ドメインファミリーのHMM(hidden markov model)プロファイルとの正の一致(positive match)によって、本発明によるGDSL又はGDSXドメインの存在が示されることが好ましい。

0083

好ましくは、Pfam00657コンセンサス配列とアラインメントさせたときに、本発明の組成物/方法に使用される脂質アシル基転移酵素は、GDSxブロック、GANDYブロック、HPTブロックの少なくとも1個、好ましくは2個以上、好ましくは3個以上を有する。適切には、脂質アシル基転移酵素は、GDSxブロック及びGANDYブロックを有することができる。或いは、この酵素は、GDSxブロック及びHPTブロックを有することができる。この酵素は、少なくともGDSxブロックを含むことが好ましい。

0084

好ましくは、Pfam00657コンセンサス配列とアラインメントさせたときに、本発明の組成物/方法に使用される酵素は、基準A.ヒドロフィラポリペプチド配列、すなわち配列番号32:28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34Ser、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309Hisと比較されたときに、以下のアミノ酸残基の少なくとも1個、好ましくは2個以上、好ましくは3個以上、好ましくは4個以上、好ましくは5個以上、好ましくは6個以上、好ましくは7個以上、好ましくは8個以上、好ましくは9個以上、好ましくは10個以上、好ましくは11個以上、好ましくは12個以上、好ましくは13個以上、好ましくは14個以上、好ましくは15個以上を有する。

0085

pfam00657GDSXドメインは、このドメインを有するタンパク質を他の酵素から識別する一義的な識別子である。

0086

pfam00657コンセンサス配列を図1に配列番号1として示す。この配列は、本明細書ではpfam00657.6と記述されることもあるpfamファミリー00657、データベースバージョン6の識別子から誘導される。

0087

このコンセンサス配列は、今後公開されるpfamデータベースを使用して更新することができる。

0088

例えば、図33及び34に、本明細書ではpfam00657.11と記述されることもあるデータベースバージョン11由来のファミリー00657のpfamアラインメントを示す。

0089

GDSx、GANDY及びHPTブロックは、公開された両方のデータベースのpfamファミリー00657に存在する。将来公開されるpfamデータベースを使用して、pfamファミリー00657を特定することができる。

0090

本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の判定基準を用いて特徴づけできることが好ましい。
(i)本酵素は、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
(ii)本酵素は、アミノ酸配列モチーフGDSX(式中、Xは以下のアミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、Sから選択される1つ又は複数のアミノ酸残基)を含む。
(iii)本酵素は、His−309を含む、又は図2(配列番号2又は配列番号32)に示
されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含む。

0091

GDSXモチーフのアミノ酸残基はLであることが好ましい。

0092

配列番号2又は配列番号32においては、最初の18アミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のHis−309は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のHis−291に一致する。

0093

好ましくは、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の触媒作用の3つ組、すなわち、Ser−34、Asp−134及びHis−309を含む、或いは図2(配列番号2)又は図28(配列番号32)に示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のSer−34、Asp−134及びHis−309に対応する位置のそれぞれセリン残基アスパラギン酸残基及びヒスチジン残基を含む。上述したように、配列番号2又は配列番号32で示される配列においては、最初の18アミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のSer−34、Asp−134及びHis−309は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のSer−16、Asp−116及びHis−291に一致する。pfam00657コンセンサス配列においては、図1(配列番号1)に示されるように、活性部位残基は、Ser−7、Asp−157及びHis−348に対応する。

0094

本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の判定基準を用いて特徴づけできることが好ましい。
(i)本酵素は、第1の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシル基転移酵素活性を有する。
(ii)本酵素は、少なくともGly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−134及びHis−309を含む、或いは図2(配列番号2)又は図28(配列番号32)に示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のそれぞれGly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−134及びHis−309に対応する位置のグリシンアスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジン残基を含む。

0095

適切には、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトミセスサッカロミセスラクトコッカスマイコバクテリウムストレプトコッカスラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム(Desulfitobacterium)、バチルスカンピロバクタービブリオナシエ(Vibrionaceae)、キシレラ(Xylella)、スルフォロブス(Sulfolobus)、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリアナイセリアメソルヒゾビウム(Mesorhizobium)、ラルストニア(Ralstonia)、ザントモナス及びカンジダの1種類若しくは複数由来の生物から得ることができ、好ましくは得られる。

0096

適切には、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の生物、すなわち、アエロモナス・ヒドロフィラ、アエロモナス・サルモニシダ、ストレプトマイセス・コエリコラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・リモサス(Streptomyces rimosus)、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、ラクトバチルス・ヘルベティクス(Lactobacillus helveticus)、デサルフィトバクテリウム・デハロナンス(Desulfitobacterium dehalogenans)、バチルス種、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ビブリオナシエ、キシレラ・ファスジオサ(Xylella fastidiosa)、スルフォロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ナイセリア・メニンティディス(Neisseria meningitidis)、メソルヒゾビウム・ロティ(Mesorhizobium loti)、ラルストニア・ソラナセアルム(Ralstonia solanacearum)、ザントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、ザントモナス・アクソノポディス(Xanthomonas axonopodis)及びカンジダ・パラシロシス(Candida parapsilosis)の1種類若しくは複数から得ることができ、好ましくは得られる。

0097

一態様においては、好ましくは、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、アエロモナス・ヒドロフィラ又はアエロモナス・サルモニシダの1種類又は複数から得ることができ、好ましくは得られる。

0098

適切には、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列の1個又は複数を含む。
(i)配列番号2で示されるアミノ酸配列(図2参照)
(ii)配列番号3で示されるアミノ酸配列(図3参照)
(iii)配列番号4で示されるアミノ酸配列(図4参照)
(iv)配列番号5で示されるアミノ酸配列(図5参照)
(v)配列番号6で示されるアミノ酸配列(図6参照)
(vi)配列番号12で示されるアミノ酸配列(図14参照)
(vii)配列番号20で示されるアミノ酸配列(図16
(viii)配列番号22で示されるアミノ酸配列(図18
(ix)配列番号24で示されるアミノ酸配列(図20参照)
(x)配列番号26で示されるアミノ酸配列(図22
(xi)配列番号28で示されるアミノ酸配列(図24
(xii)配列番号30で示されるアミノ酸配列(図26
(xiii)配列番号32で示されるアミノ酸配列(図28
(xiv)配列番号34で示されるアミノ酸配列(図30
(xv)配列番号55で示されるアミノ酸配列(図52
(xvi)配列番号58で示されるアミノ酸配列
(xvii)配列番号60で示されるアミノ酸配列
(xviii)配列番号61で示されるアミノ酸配列
(xix)配列番号63で示されるアミノ酸配列
(xx)配列番号65で示されるアミノ酸配列
(xxi)配列番号67で示されるアミノ酸配列
(xxii)配列番号70で示されるアミノ酸配列、
(xxiii)配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号12、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号55、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67又は配列番号70で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するアミノ酸配列。

0099

適切には、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、配列番号2、配列番号3、配列番号32又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含み、或いは配列番号2で示されるアミノ酸配列、配列番号3で示されるアミノ酸配列、配列番号32で示されるアミノ酸配列又は配列番号34で示されるアミノ酸配列と75%以上、好ましくは80%以上、好ましくは85%以上、好ましくは90%以上、好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。

0100

本発明では、同一性の程度は、同じ配列要素の数に基づく。本発明による同一性の程度は、GCプログラムパッケージ(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711)(Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45)に付属したGAPなどの当分野で公知のコンピュータプログラムによって、以下のポリペプチド配列比較設定、すなわち、GAPクリエーションペナルティー(creation penalty)3.0及びGAPエクステンションペナルティー(extension penalty)0.1を用いて、適切に決定することができる。

0101

適切には、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号12、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号55、配列番号58、配列番号60、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67又は配列番号70で示される配列のいずれか1つと80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。

0102

適切には、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列の1個又は複数を含む。
(a)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基1〜100で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基101〜200で示されるアミノ酸配列、
(c)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基201〜300で示されるアミノ酸配列、或いは
(d)上記(a)〜(c)に定義されたアミノ酸配列のいずれか1つと75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列。

0103

適切には、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列の1個又は複数を含む。
(a)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基28〜39で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基77〜88で示されるアミノ酸配列、
(c)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基126〜136で示されるアミノ酸配列、
(d)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基163〜175で示されるアミノ酸配列、
(e)配列番号2又は配列番号32のアミノ酸残基304〜311で示されるアミノ酸配列、或いは
(f)上記(a)〜(e)に定義されたアミノ酸配列のいずれか1つと75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列。

0104

適切には、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下のヌクレオチド配列、すなわち、
(a)配列番号7で示されるヌクレオチド配列(図9参照)、
(b)配列番号8で示されるヌクレオチド配列(図10参照)、
(c)配列番号9で示されるヌクレオチド配列(図11参照)、
(d)配列番号10で示されるヌクレオチド配列(図12参照)、
(e)配列番号11で示されるヌクレオチド配列(図13参照)、
(f)配列番号13で示されるヌクレオチド配列(図15参照)、
(g)配列番号21で示されるヌクレオチド配列(図17参照)、
(h)配列番号23で示されるヌクレオチド配列(図19参照)、
(i)配列番号25で示されるヌクレオチド配列(図21参照)、
(j)配列番号27で示されるヌクレオチド配列(図23参照)、
(k)配列番号29で示されるヌクレオチド配列(図25参照)、
(l)配列番号31で示されるヌクレオチド配列(図27参照)、
(m)配列番号33で示されるヌクレオチド配列(図29参照)、
(n)配列番号35で示されるヌクレオチド配列(図31参照)、
(o)配列番号54で示されるヌクレオチド配列(図51)、
(p)配列番号59で示されるヌクレオチド配列、
(q)配列番号62で示されるヌクレオチド配列、
(r)配列番号64で示されるヌクレオチド配列、
(s)配列番号66で示されるヌクレオチド配列、
(t)配列番号68で示されるヌクレオチド配列、
(u)配列番号69で示されるヌクレオチド配列、
(v)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号54、配列番号59、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68又は配列番号69で示される配列のいずれか1つと75%以上の相同性を有するヌクレオチド配列
の発現によって産生されるアミノ酸配列、或いはこれらのヌクレオチド配列の1個又は複数を含むことができる。

0105

適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33又は配列番号35、配列番号54、配列番号59、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68又は配列番号69で示される配列のいずれか1つと80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の相同性を有するとすることができる。

0106

一態様においては、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、LCAT(lecithin:cholesterol acyltransferase)又はその変異体(例えば、分子進化によって造られた変異体)とすることができる。

0107

適切なLCATは当分野で公知であり、例えば以下の生物、すなわち、哺乳動物ラットマウスヒヨコキイロショウジョウバエアラビドプシス(Arabidopsis)及びオリサティバ(Oryza sativa)を含めた植物、線虫真菌並びに酵母の1種類又は複数から得ることができる。

0108

一実施形態においては、本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, DenmarkのDanisco A/S社によって、特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GBにおいて2003年12月22日にそれぞれアクセッション番号NICMB 41204及びNCIMB 41205として寄託されたpPet12aAhydro及びpPet12aASalmoを含む大腸菌(E. coli)系統TOP 10から得ることができ、好ましくは得られる脂質アシル基転移酵素とすることができる。

0109

本発明による方法を実施するときには、生成物は、食料品中の遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに生成されることが好ましい。

0110

本明細書では「転移酵素」という用語は、「脂質アシル基転移酵素」という用語と区別なく使用される。

0111

適切には、本明細書に規定される脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、以下の反応、すなわち、エステル交換、エステル転移、アルコール分解、加水分解の1種類又は複数を触媒する。

0112

「エステル交換」という用語は、脂質供与体と脂質受容体の間の酵素によって触媒されたアシル基転移を意味する。ここで、脂質供与体は遊離アシル基ではない。

0113

本明細書では「エステル転移」という用語は、(遊離脂肪酸以外の)脂質供与体から(水以外の)アシル受容体への酵素によって触媒されたアシル基転移を意味する。

0114

本明細書では「アルコール分解」という用語は、生成物の一方がアルコールのHと結合し、もう一方の生成物がアルコールのOR基と結合するような、アルコールROHとの反応による酸誘導体共有結合の酵素による切断を指す。

0115

本明細書では「アルコール」という用語は、ヒドロキシル基を含むアルキル化合物を指す。

0116

本明細書では「加水分解」という用語は、脂質から水分子OH基への酵素によって触媒されたアシル基転移を指す。加水分解に起因するアシル転移には水分子の分離が必要である。

0117

本明細書では「遊離脂肪酸を増加させずに、又は実質的に増加させずに」という用語は、本発明による脂質アシル基転移酵素が、食用油環境において100%転移酵素活性を有する(すなわち、加水分解活性を持たずに、アシル基の100%をアシル供与体からアシル受容体に転移させる)ことが好ましいが、脂質アシル供与体中のアシル基の100%未満をアシル受容体に転移させてもよいことを意味する。この場合、好ましくは、アシル基転移酵素活性は、全酵素活性の少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、より好ましくは少なくとも98%を占める。%転移酵素活性(すなわち、全酵素活性の百分率としての転移酵素活性)は、以下のプロトコールによって求めることができる。

0118

%アシル基転移酵素活性を求めるプロトコール:
本発明による脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素が添加された食用油は、以下の詳細な手順に従って、酵素反応後にCHCl3:CH3OH 2:1で抽出し、脂質材料を含む有機相を単離し、GLCによって分析することができる。GLC分析から遊離脂肪酸及びジグリセリドの量が求められる。本発明による酵素が添加されていない対照食用油も同様に分析される。

0119

計算:
GLC分析の結果から、遊離脂肪酸の増加及びジグリセリドの減少を計算することができる。
Δ%脂肪酸=%脂肪酸(酵素)−%脂肪酸(対照)、
Mv Fa=脂肪酸の平均分子量、
Δ%ジグリセリド=%ジグリセリド(対照)−%ジグリセリド(酵素)、
Mv Di=ジグリセリドの平均分子量、
転移酵素活性は、全酵素活性の百分率として計算される。

0120

食用油中の遊離脂肪酸が増加する場合には、遊離脂肪酸は実質的に、すなわち著しく増加しないことが好ましい。すなわち、遊離脂肪酸の増加が食用油の品質に悪影響を及ぼさないことを意味する。

0121

本発明の一部の態様においては、本明細書では「遊離脂肪酸を実質的に増加させずに」という用語は、本発明による脂質アシル基転移酵素で処理した食用油中の遊離脂肪酸の量が、例えば、従来のリパーゼ、例えばシュードモナスセパシア(Pseudomonas cepacia)リパーゼ(Lipase PS, Amano Japan)又はリゾープスオリゼ(Rhizopus oryzae)リパーゼ(LipaseF, Amano Japan)のときに生成される遊離脂肪酸の量など、本発明による脂質アシル基転移酵素以外の酵素が使用されたときに食用油又は組成物中で生成される遊離脂肪酸の量よりも少ないことを意味する。

0122

適切には、反応後に食用油中に残留するグリセリンは、例えば、遠心分離又は減圧蒸留によって除去することができる。

0123

酵素は、酵素反応後に食用油から場合によっては除去してもよい。或いは、酵素を単に失活させて食用油中に残留させることができる。適切には、酵素は、例えば熱によって失活させることができる。

0124

一実施形態においては、本発明の方法に使用される脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は固定化することができる。酵素を固定する場合には、アシル受容体と食用油を含む混合物を、例えば固定化酵素を含むカラムに通すことができる。酵素を固定することによって、酵素を容易に再使用することができる。

0125

適切には、固定化酵素は、アシル受容体と食用油を2相系として含む反応混合物を含む流通反応装置又は回分式反応装置において使用することができる。反応混合物を場合によっては撹拌又は超音波処理してもよい。例えば、反応が平衡に達した後に、反応混合物と固定化酵素を分離することができる。適切には、(過剰のグリセリンなどの)過剰のアシル受容体は、反応後に、例えば遠心分離又は減圧蒸留によって除去することができる。

0126

固定化脂質アシル基転移酵素は、当分野で公知の固定化技術を用いて調製することができる。固定化酵素を調製する方法は多数あり、それらは当業者には明らかである(例えば、EP 0 746 608又はBalcao V.M., Paiva A.L., Malcata F.X., Enzyme Microb Technol. 1996 May 1;18(6):392-416又はRetz M.T., Jaeger K.E. Chem Phys Lipids. 1998 Jun;93(1-2):3-14;Bornscheuer U.T., Bessler C, Srinivas R, Krishna S.H. Trends Biotechnol. 2002 Oct;20(10):433-7;Plou et al, J. Biotechnology 92 (2002) 55-66;Warmuth et al., 1992. Bio Forum 9, 282-283;Ferrer et al., 2000. J. Chem. Technol. Biotechnol. 75, 1-8又はChristensen et al., 1998. Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105; Petersen and Christenen, 2000, Applied Biocatalysis. Harwood Academic Publishers, Amsterdamに記載の技術(これらの各々を参照により本明細書に援用する)。本発明において使用することができる技術としては、例えば、Eupergit Cへの共有結合性カップリングポリプロピレンへの吸着及びシリカ造粒(silica-granulation)が挙げられる。

0127

好ましくは、食用油は、ジグリセリド、好ましくは多量のジグリセリドを含有する食用油である。

0128

好ましくは、食用油は以下の油、すなわち、パーム油から抽出又は誘導される油、パームオレインパームステアリン、パーム中間留分又は任意のパーム油留分或いはオリーブ油の1種類又は複数である。

0129

より好ましくは、食用油は、パーム油及び/又はパームオレイン及び/又はパームステアリンである。

0130

食用油、アシル受容体基質及び脂質アシル基転移酵素の混合に関しては、当業者は容易に理解するとおり、これは、任意の組み合わせ及び/又は順序で実施することができる。単なる例として、アシル受容体基質を食用油と混合し、続いて脂質アシル基転移酵素を添加することができる。或いは、食用油を脂質アシル基転移酵素と混合し、続いてアシル受容体基質を添加することができる。或いは、脂質アシル基転移酵素とアシル受容体基質を混合し、続いてこの酵素/基質混合物を食用油と混合することができる。或いは、全3物質(すなわち食用油、アシル受容体基質及び脂質アシル基転移酵素)を同時に混合できることは言うまでもない。

0131

本方法は、食用油の融点を超える温度で実施されることが好ましい。

0132

適切には、本方法は、30〜50℃、好ましくは35〜45℃、好ましくは40〜45℃の温度で実施することができる。

0133

酵素は、粗製又は精製食用油に添加されることが好ましい。本発明は、構成要素を含む水と混合するときには食用油の酵素処理を包含しないことが好ましい。したがって、本発明は、食用油自体の処理、すなわち低水分環境における処理を想定する。

0134

水は、本発明による方法の前又は間に油に添加することができるが、最も好ましい実施形態においては水は添加されない。水が食用油中に存在する場合には、好ましくは10%未満の水が存在し、より好ましくは7.5%未満、5%未満、1%未満、0.5%未満、0.4%未満、0.3%未満、0.2%未満又は0.1%未満の水が存在する。適切には、0.1%から1%の水が食用油中に存在することができる。

0135

一実施形態においては、本発明によるプロセスに使用される食用油は、1個又は複数のアシル供与体を補充することができ、且つ/又は1個若しくは複数のアシル受容体を補充することができ、且つ/又は1個若しくは複数のアシル受容体と1個若しくは複数のアシル供与体の両方を補充することができる。「補充する」とは、アシル供与体及び/又はアシル受容体が、食用油中に天然に存在せず、本発明による脂質アシル基転移酵素と食用油を接触させるのと同時、その直後及び/又はその直前に添加されることを意味する。

0136

適切には、補充のアシル供与体はDAG以外とすることができる。適切には、補充のアシル供与体は、例えばリン脂質(例えば、レシチン)とすることができる。

0137

適切には、補充のアシル受容体はグリセリンとすることができる。しかし、適切には、補充のアシル受容体は、グリセリン以外のアシル受容体、例えば植物ステロール及び/又は例えば植物スタノールとすることができる。適切には、補充のアシル受容体は、グリセリンと1個又は複数のさらなるアシル受容体の組み合わせとすることができる。

0138

リン脂質が補充された油を使用すると、追加の乳化剤(リゾリン脂質)を油中で生成させることができる。植物ステロール及び/又は植物スタノールが補充された油を使用すると、両方の食用油(edible both)において植物ステロールエステル及び/又は植物スタノールエステルを生成することができる。植物ステロールエステルと植物スタノールエステルはどちらも食事組み入れると血清コレステロール低減効果を有すると報告されている。

0139

Lipozyme(登録商標TLIM、1,3特異的リパーゼ(Novozymes, Denmark)などの固定化リパーゼを用いた酵素のエステル交換は、食事用の油中のトランス脂肪酸量を低減するために、且つ/又は食用油及び脂肪の融解特性を改変するために使用される。

0140

エステル交換中、食用油のトリグリセリド中のポリ不飽和脂肪酸の1個又は2個は、パーム油などのトランス脂肪酸の少ない別の油から得られる脂肪酸で置換することができる。パーム油から脂肪酸を転移させることによって、トランス脂肪酸を導入せずに食用油の融点を変えることができる。リパーゼの固定化は、US5776741、US4798793及びUS5156963に記載されている。US6284501は、リン脂質のエステル交換を記載する。

0141

固定化転移酵素は、リパーゼに対して使用されるのと同じ技術を用いて生成させることができる。

0142

一実施形態においては、本明細書に記載された脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、エステル交換リパーゼと併用することができる。リパーゼエステル交換ステップとアシル転移酵素ステップは、好ましくは別個に実施される。

0143

さらに別の態様においては、本明細書に記載された脂肪酸CoA非依存性脂質アシル基転移酵素は、従来の結晶化阻害剤と併用することができる。

0144

さらに別の態様においては、本発明は、食用油を含む食料品中の結晶化特性を改善する方法であって、食用油をアシル受容体基質及び本明細書に記載された脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素(場合によってはさらに結晶化阻害剤)と混合するステップを含む方法を提供する。

0145

一実施形態においては本発明は、食料品の結晶化特性を改善するための食用油を含む食料品調製物中の脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素を提供する。

0146

適切には、1個又は複数のさらなる結晶化阻害剤を場合によっては添加してもよい。

0147

本発明は、さらに、食料品の結晶化特性を改善するための食用油を含む前記食料品の製造における本明細書に記載された脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。

0148

別の態様においては、本発明は、食料品の結晶化特性を改善するための食用油を含む前記食料品の製造におけるさらなる結晶化阻害剤と組み合わされた本明細書に記載された脂肪酸CoA非依存性ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の使用を提供する。

0149

さらなる結晶化阻害剤は、例えばトリステアリン酸ソルビタン、レシチン、PGE又はポリソルベートの1個又は複数などの任意の従来の結晶化阻害剤とすることができる。

0150

利点
食用油からジグリセリドを除去するため又は食用油中のジグリセリドを低減するための、本明細書に教示される方法の使用による本発明において、特に特許請求の範囲の方法において使用される本明細書に教示される酵素の選択による本発明において、トリグリセリドを減少させず、且つ/又はFFA(free fatty acid)をさほど増加させずに、モノ及びジグリセリドを上回るジグリセリドの選択的な低減を実施することができる。

0151

本発明の方法は食用油の遊離脂肪酸含量を実質的に増加させずに実施することができることから、生成物損失の問題が克服される。

0152

粗製パーム油を従来のリパーゼで処理する場合には、精油中に遊離脂肪酸を除去する必要があるが、精製パーム油を本発明による脂質アシル基転移酵素で処理する(したがって、粗製パーム油を従来のリパーゼで処理する必要がない)場合には、遊離脂肪酸含量は実質的に増加しないので遊離脂肪酸を除去する必要がない。

0153

それに加えて、又はそれとは別に、本発明は、モノグリセリド量をさほど減少させずに、食用油からジグリセリドを除去し、又は食用油中のジグリセリドを低減する。

0154

それに加えて、又はそれとは別に、本発明は、食用油中のモノグリセリド量を増加させつつ、食用油からジグリセリドを除去し、又は食用油中のジグリセリドを低減する。これは、モノグリセリドを基質として利用し、したがって食用油中のモノグリセリド量を減少させる従来技術の酵素とは対照的である。

0155

本発明は、脂肪酸CoAを添加する必要がないので有利である。これは、アシルCoA依存性DGATとは極めて対照的である。もっと正確に言えば、本発明による酵素は、安価な商品であるグリセリンの存在(及び必要に応じて添加)に依拠する。

0156

パーム油中のジグリセリド除去/低減の商業的妥当性
ジグリセリドは、パームを主成分とするマーガリン及びショートニングにおける結晶化を遅延させる。

0157

長年、本発明者らは、パーム油消費成長着実に増加するのを見てきている。これは、一つにはその土地で入手できるためであり、一つには経済性のためであり、主としては性能のためである。マーガリン/ショートニングタイプ製品中にパーム油が存在すると、油混合物のβ’品質が向上することが判明した。しかし、パーム油の使用は、パームステアリン及びパームオレインの使用に以前は制限され、パーム核及びその留分が一部使用された。現在、菓子及び食品加工業者が極めて特異的な融解プロファイルを求めているので、パーム油の使用はより多様化している。

0158

顧客は配合物中のパーム油の使用を増加させようとしており、業界は結晶化の問題を且つてないほど取り上げている。「結晶促進(pro-crystal)」プロモーターを添加してトランスの少ない配合物又はトランスのない配合物における結晶化を惹起し、それによって使用前の後結晶(post crystal)形成を防止又は遅延させる必要がある場合。トリステアリン酸ソルビタン、レシチン、PGE、ポリソルベートなど、後結晶成長を緩慢にし、遅延させる結晶化防止剤(anti-crystalliser)への関心も増してきている。これは、ジグリセリドが多量に存在する現れである。

0159

本発明の商業的利点は、以下の1つ又は複数とすることができる。
a)加工中及び/又はその後の使用中に追加のモノグリセリドを食用油に添加する必要性を低下させる。モノグリセリドは、食品ステムにおいて広く用いられている乳化剤である。
b)ジグリセリドを約6〜8%から約4〜5%に、さらにそれ以上減少させる。
c)プラント工場能力適応性を増大させ、したがって製造間接費を低減する。
d)後結晶化問題を大きく減少させる。
e)一部の配合物においては、一部の完全飽和油脂トリグリセリドを除去することができる。というのは、本発明者らは結晶促進の必要性を低下させるからである。この点で、製造者は、従来、結晶形成を「促進」し販売後の製品における望ましくない結晶形成遅延を克服するために、完全飽和トリグリセリドを配合物に添加している。かかる結晶形成は、製造中に結晶成長を遅延させて所望の結晶タイプ(すなわち、マーガリン及びショートニングの場合には好ましくはベータ−プライム)にするのに十分な濃度のジグリセリドを含む配合物中にかなりの量のパーム油又はその成分が含まれるしるしである。しかし、本発明によって処理したパーム油を使用することによって、ジグリセリド含量は所与の混合物又は配合物内で十分に低減され、結晶成長を助けるために追加の完全飽和トリグリセリドを添加する必要性がより重要でなくなる。
f)大きなプロセス変更なしで、パームを主体とする混合物がより多様化し、液体油コストが上昇する。
g)結晶化防止剤を置換することができ、且つ/又は結晶化防止剤を一部置換することができる。

0160

Bトランス脂肪酸
現在、食品におけるトランス酸の使用に反対する立法及び世論がある(Fodevareministeriet, Denmark 2003)。そして、これは性能問題をもたらした。製造者は、可能であれば、パームを主成分とする溶液切り替えたいと考えるかもしれない。というのは、この油タイプはC:16:0及びC:18:0異性体の量が多いからである。その結果、パームを以前は使用しなかった経済組織においてパームの消費が増加し始めている。

0161

菓子製品におけるジグリセリドの結晶化阻害
CBE(Cocoa Butter Equivalent)は、分留されたパーム油、特にPMF(palm mid fraction)、分留されたシアバター脂肪、多数の他の新奇な脂肪などの特殊な脂肪から処方される。コスト的な理由のため、CBE中にできるだけ多量のPMFを含めることが有利である。実際、多数のCBEはパーム留分のみを含むことができる。チョコレート製造の最も繊細な局面は、脂肪の結晶化である。ジグリセリドは結晶化に対して負の影響を及ぼし、例えば、成形品の取り出しは極めて重大な問題となり得る(Siew, 2001)。

0162

結晶品質
トリグリセリド品質は性能に大きく影響する。これは、標準82%脂肪テーブルマガリン用の典型的なトランス酸含有油配合物の例から、ともに類似したSFCプロファイルを有する典型的なエステル交換パームステアリン留分とパーム核を硬質原料(hard stock)として含むトランス非含有品に対して明らかである。結晶化の速度及び品質の低下は、「オイリングアウト(oiling out)」として知られる徴候をもたらし得る。そのため、硬質MAGなどの結晶プロモーターが必要になる。また、結晶安定化結晶形成(crystal stabilized crystal formation)の遅延は、「ざらつき(sandiness)」として知られる徴候をもたらし、それによって所望の結晶タイプの転換は、最終的により安定なベータ型戻り、砂のようにざらざらした食感を与える。この徴候は、工業製品の特定の問題である。

0163

いくつかの用途
脂肪改変
マーガリン、スプレッド、菓子/チョコレートなどの高脂肪固形食品に使用される脂肪の化学的製造中に、トランス脂肪酸は水素化プロセス硬化)中に食用油に導入される。これによって、食用油の融解温度が変更されて、最終食品、例えば、室温で固形であるが塗り広げられるテーブルマーガリン又は保存中は固形であるが口の中で溶融するチョコレートの適切な粘ちゅう性が確保される。

0164

しかし、化学的製造は、環境及び健康に有害と考えられるへキサンなどの多量の溶媒を使用し、変性油/脂肪を食品成分として使用する前に溶媒を完全に除去する必要がある。

0165

多数の国々においては、食品製造への部分水素化の使用は法律及び法的規制によって制限されており、多数の主要な食品製造業者は、現在、代替低トランス代替品に転換しつつある。

0166

本発明の方法によって調製される油は、マーガリン及び/又はスプレッドの成分として使用することができる。

0167

カカオ脂代用品カカオ代用脂
カカオ脂は、口の中で溶融する固形菓子を与える独特の組成物を含む。より安価な代替品でカカオ脂を置換するために、植物油を水素化してトランス脂肪酸を生成させ、それによって食用油の融点を上昇させて、体温で溶融する類似の固形菓子が得られる。かかる変性植物油はCBE(cocoa butter equivalent)として知られ、或いは改変脂肪がチョコレート製品の諸特性を向上させる場合にはCBR(cocoa butter replacement)として知られる。CBE及びCBRに付随する1つの大きな問題は、植物油の水素化によって健康及び温度に有害と考えられるトランス脂肪が生成することである。このため、融解温度がそれよりも高い低トランス植物油又はその画分が使用される。パーム油及びパーム油留分は、トランスCBR/CBEが少ない主成分としてこの点で有利であると考えられる。

0168

CBR(cocoa butter replacement)脂肪は、非調質(non-tempering)、後硬化(post hardening)減少、安定性ブルーム耐性などチョコレート製品に好ましい特性を付与するのに使用される。パーム油などの非ラウリン酸/非トランス脂肪を使用することが特に望ましい。CBRに使用される脂肪の結晶化特性は、上記好ましい特性を維持しつつ口中での生成物融解との適切なバランスを確保するのに鍵となる役割を果たす。CBR混合物におけるパーム油などの低トランス脂肪の使用は、健康上の理由のため特に望ましい。CBRにおけるパーム油の使用は、EP0293194に記載されている。

0169

本発明のプロセスによって調製された油は、カカオ脂代用品及び/又はカカオ代用脂として例えば脂肪混合物中のチョコレート用成分として使用することができる。

0170

本発明に従って使用されるいくつかのジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の配列
本発明に従って及び/又は本発明の方法において使用するのに適切なジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素は、以下のアミノ酸配列のいずれか1つを含むことができ、且つ/又は以下のヌクレオチド配列によってコードすることができる。

0171

テルモビフィダ(Termobifida)\フスカ(fusca)GDSx 548 aa
配列番号58
ZP00058717
1 mlphpagerg evgaffallv gtpqdrrlrl echetrplrg rcgcgerrvp pltlpgdgvl
61 cttsstrdae tvwrkhlqpr pdggfrphlg vgcllagqgs pgvlwcgreg crfevcrrdt
121 pglsrtrngd ssppfragws lppkcgeisq sarktpavpr ysllrtdrpd gprgrfvgsg
181 praatrrrlf lgipalvlvt altlvlavpt gretlwrmwc eatqdwclgv pvdsrgqpae
241 dgeflllspv qaatwgnyya lgdsyssgdg ardyypgtav kggcwrsana ypelvaeayd
301 faghlsflac sgqrgyamld aidevgsqld wnsphtslvt igiggndlgf stvlktcmvr
361 vplldskact dqedairkrm akfettfeel isevrtrapd arilvvgypr ifpeeptgay
421 ytltasnqrw lnetiqefnq qlaeavavhd eeiaasggvg svefvdvyha ldgheigsde
481 pwvngvqlrd latgvtvdrs tfhpnaaghr avgervieqi etgpgrplya tfavvagatv
541 dtlagevg

配列番号59
nt
1 ggtggtgaac cagaacaccc ggtcgtcggc gtgggcgtcc aggtgcaggt gcaggttctt
61 caactgctcc agcaggatgc cgccgtggcc gtgcacgatg gccttgggca ggcctgtggt
121 ccccgacgag tacagcaccc atagcggatg gtcgaacggc agcggggtga actccagttc
181 cgcgccttcg cccgcggctt cgaactccgc ccaggacagg gtgtcggcga cagggccgca
241 gcccaggtac ggcaggacga cggtgtgctg caggctgggc atgccgtcgc gcagggcttt
301 gagcacgtca cggcggtcga agtccttacc gccgtagcgg tagccgtcca cggccagcag
361 cactttcggt tcgatctgcg cgaaccggtc gaggacgctg cgcaccccga agtcggggga
421 acaggacgac caggtcgcac cgatcgcggc gcaggcgagg aatgcggccg tcgcctcggc
481 gatgttcggc aggtaggcca cgacccggtc gccggggccc accccgaggc tgcggagggc
541 cgcagcgatc gcggcggtgc gggtccgcag ttctccccag gtccactcgg tcaacggccg
601 gagttcggac gcgtgccgga tcgccacggc tgatgggtca cggtcgcgga agatgtgctc
661 ggcgtagttg agggtggcgc cggggaacca gacggcgccg ggcatggcgt cggaggcgag
721 cactgtggtg tacggggtgg cggcgcgcac ccggtagtac tcccagatcg cggaccagaa
781 tccttcgagg tcggttaccg accagcgcca cagtgcctcg tagtccggtg cgtccacacc
841 gcggtgctcc cgcacccagc gggtgaacgc ggtgaggttg gcgcgttctt tgcgctcctc
901 gtcgggactc cacaggatcg gcggctgcgg cttgagtgtc atgaaacgcg accccttcgt
961 ggacggtgcg gatgcggtga gcgtcgggtg cctcccctaa cgctccccgg tgacggagtg
1021 ttgtgcacca catctagcac gcgggacgcg gaaaccgtat ggagaaaaca cctacaaccc
1081 cggccggacg gtgggtttcg gccacactta ggggtcgggt gcctgcttgc cgggcagggc
1141 agtcccgggg tgctgtggtg cgggcgggag ggctgtcgct tcgaggtgtg ccggcgggac
1201 actccgggcc tcagccgtac ccgcaacggg gacagttctc ctcccttccg ggctggatgg
1261 tcccttcccc cgaaatgcgg cgagatctcc cagtcagccc ggaaaacacc cgctgtgccc
1321 aggtactctt tgcttcgaac agacaggccg gacggtccac gggggaggtt tgtgggcagc
1381 ggaccacgtg cggcgaccag acgacggttg ttcctcggta tccccgctct tgtacttgtg
1441 acagcgctca cgctggtctt ggctgtcccg acggggcgcg agacgctgtg gcgcatgtgg
1501 tgtgaggcca cccaggactg gtgcctgggg gtgccggtcg actcccgcgg acagcctgcg
1561 gaggacggcg agtttctgct gctttctccg gtccaggcag cgacctgggg gaactattac
1621 gcgctcgggg attcgtactc ttcgggggac ggggcccgcg actactatcc cggcaccgcg
1681 gtgaagggcg gttgctggcg gtccgctaac gcctatccgg agctggtcgc cgaagcctac
1741 gacttcgccg gacacttgtc gttcctggcc tgcagcggcc agcgcggcta cgccatgctt
1801 gacgctatcg acgaggtcgg ctcgcagctg gactggaact cccctcacac gtcgctggtg
1861 acgatcggga tcggcggcaa cgatctgggg ttctccacgg ttttgaagac ctgcatggtg
1921 cgggtgccgc tgctggacag caaggcgtgc acggaccagg aggacgctat ccgcaagcgg
1981 atggcgaaat tcgagacgac gtttgaagag ctcatcagcg aagtgcgcac ccgcgcgccg
2041 gacgcccgga tccttgtcgt gggctacccc cggatttttc cggaggaacc gaccggcgcc
2101 tactacacgc tgaccgcgag caaccagcgg tggctcaacg aaaccattca ggagttcaac
2161 cagcagctcg ccgaggctgt cgcggtccac gacgaggaga ttgccgcgtc gggcggggtg
2221 ggcagcgtgg agttcgtgga cgtctaccac gcgttggacg gccacgagat cggctcggac
2281 gagccgtggg tgaacggggt gcagttgcgg gacctcgcca ccggggtgac tgtggaccgc
2341 agtaccttcc accccaacgc cgctgggcac cgggcggtcg gtgagcgggt catcgagcag
2401 atcgaaaccg gcccgggccg tccgctctat gccactttcg cggtggtggc gggggcgacc
2461 gtggacactc tcgcgggcga ggtggggtga cccggcttac cgtccggccc gcaggtctgc
2521 gagcactgcg gcgatctggt ccactgccca gtgcagttcg tcttcggtga tgaccagcgg
2581 cggggagagc cggatcgttg agccgtgcgt gtctttgacg agcacacccc gctgcaggag
2641 ccgttcgcac agttctcttc cggtggccag agtcgggtcg acgtcgatcc cagcccacag
2701 gccgatgctg cgggccgcga ccacgccgtt gccgaccagt tggtcgaggc gggcgcgcag
2761 cacgggggcg agggcgcgga catggtccag gtaagggccg tcgcggacga ggctcaccac
2821 ggcagtgccg accgcgcagg cgagggcgtt gccgccgaag gtgctgccgt gctggccggg
2881 gcggatcacg tcgaagactt ccgcgtcgcc taccgccgcc gccacgggca ggatgccgcc
2941 gcccagcgct ttgccgaaca ggtagatatc ggcgtcgact ccgctgtggt cgcaggcccg
//

テルモビフィダ\フスカ\−GDSx
配列番号60
1 vgsgpraatr rrlflgipal vlvtaltlvl avptgretlw rmwceatqdw clgvpvdsrg
61 qpaedgefll lspvqaatwg nyyalgdsys sgdgardyyp gtavkggcwr sanaypelva
121 eaydfaghls flacsgqrgy amldaidevg sqldwnspht slvtigiggn dlgfstvlkt
181 cmvrvpllds kactdqedai rkrmakfett feelisevrt rapdarilvv gyprifpeep
241 tgayytltas nqrwlnetiq efnqqlaeav avhdeeiaas ggvgsvefvd vyhaldghei
301 gsdepwvngv qlrdlatgvt vdrstfhpna aghravgerv ieqietgpgr plyatfavva
361 gatvdtlage vg

コリネバクテリウムエフィシエンス(effciens)\GDSx 300 aa
配列番号61
1 mrttviaasa llllagcadg areetagapp gessggiree gaeastsitd vyialgdsya
61 amggrdqplr gepfclrssg nypellhaev tdltcqgavt gdlleprtlg ertlpaqvda
121 ltedttlvtl siggndlgfg evagcireri agenaddcvd llgetigeql dqlppqldrv
181 heairdragd aqvvvtgylp lvsagdcpel gdvseadrrw aveltgqine tvreaaerhd
241 alfvlpddad ehtscappqq rwadiqgqqt dayplhptsa gheamaaavr dalglepvqp
//

配列番号62
nt
1 ttctggggtg ttatggggtt gttatcggct cgtcctgggt ggatcccgcc aggtggggta
61 ttcacggggg acttttgtgt ccaacagccg agaatgagtg ccctgagcgg tgggaatgag
121 gtgggcgggg ctgtgtcgcc atgagggggc ggcgggctct gtggtgcccc gcgacccccg
181 gccccggtga gcggtgaatg aaatccggct gtaatcagca tcccgtgccc accccgtcgg
241 ggaggtcagc gcccggagtg tctacgcagt cggatcctct cggactcggc catgctgtcg
301 gcagcatcgc gctcccgggt cttggcgtcc ctcggctgtt ctgcctgctg tccctggaag
361 gcgaaatgat caccggggag tgatacaccg gtggtctcat cccggatgcc cacttcggcg
421 ccatccggca attcgggcag ctccgggtgg aagtaggtgg catccgatgc gtcggtgacg
481 ccatagtggg cgaagatctc atcctgctcg agggtgctca ggccactctc cggatcgata
541 tcgggggcgt ccttgatggc gtccttgctg aaaccgaggt gcagcttgtg ggcttccaat
601 ttcgcaccac ggagcgggac gaggctggaa tgacggccga agagcccgtg gtggacctca
661 acgaaggtgg gtagtcccgt gtcatcattg aggaacacgc cctccaccgc acccagcttg
721 tggccggagt tgtcgtaggc gctggcatcc agaagggaaa cgatctcata tttgtcggtg
781 tgctcagaca tgatcttcct ttgctgtcgg tgtctggtac taccacggta gggctgaatg
841 caactgttat ttttctgtta ttttaggaat tggtccatat cccacaggct ggctgtggtc
901 aaatcgtcat caagtaatcc ctgtcacaca aaatgggtgg tgggagccct ggtcgcggtt
961 ccgtgggagg cgccgtgccc cgcaggatcg tcggcatcgg cggatctggc cggtaccccg
1021 cggtgaataa aatcattctg taaccttcat cacggttggt tttaggtatc cgcccctttc
1081 gtcctgaccc cgtccccggc gcgcgggagc ccgcgggttg cggtagacag gggagacgtg
1141 gacaccatga ggacaacggt catcgcagca agcgcattac tccttctcgc cggatgcgcg
1201 gatggggccc gggaggagac cgccggtgca ccgccgggtg agtcctccgg gggcatccgg
1261 gaggaggggg cggaggcgtc gacaagcatc accgacgtct acatcgccct cggggattcc
1321 tatgcggcga tgggcgggcg ggatcagccg ttacggggtg agccgttctg cctgcgctcg
1381 tccggtaatt acccggaact cctccacgca gaggtcaccg atctcacctg ccagggggcg
1441 gtgaccgggg atctgctcga acccaggacg ctgggggagc gcacgctgcc ggcgcaggtg
1501 gatgcgctga cggaggacac caccctggtc accctctcca tcgggggcaa tgacctcgga
1561 ttcggggagg tggcgggatg catccgggaa cggatcgccg gggagaacgc tgatgattgc
1621 gtggacctgc tgggggaaac catcggggag cagctcgatc agcttccccc gcagctggac
1681 cgcgtgcacg aggctatccg ggaccgcgcc ggggacgcgc aggttgtggt caccggttac
1741 ctgccgctcg tgtctgccgg ggactgcccc gaactggggg atgtctccga ggcggatcgt
1801 cgttgggcgg ttgagctgac cgggcagatc aacgagaccg tgcgcgaggc ggccgaacga
1861 cacgatgccc tctttgtcct gcccgacgat gccgatgagc acaccagttg tgcaccccca
1921 cagcagcgct gggcggatat ccagggccaa cagaccgatg cctatccgct gcacccgacc
1981 tccgccggcc atgaggcgat ggccgccgcc gtccgggacg cgctgggcct ggaaccggtc
2041 cagccgtagc gccgggcgcg cgcttgtcga cgaccaaccc atgccaggct gcagtcacat
2101 ccgcacatag cgcgcgcggg cgatggagta cgcaccatag aggatgagcc cgatgccgac
2161 gatgatgagc agcacactgc cgaagggttg ttccccgagg gtgcgcagag ccgagtccag
2221 acctgcggcc tgctccggat catgggccca accggcgatg acgatcaaca cccccaggat
2281 cccgaaggcg ataccacggg cgacataacc ggctgttccg gtgatgatga tcgcggtccc
2341 gacctgccct gaccccgcac ccgcctccag atcctcccgg aaatcccggg tggccccctt
2401 ccagaggttg tagacacccg cccccagtac caccagcccg gcgaccacaa ccagcaccac
2461 accccagggt tgggatagga cggtggcggt gacatcggtg gcggtctccc catcggaggt
2521 gctgccgccc cgggcgaagg tggaggtggt caccgccagg gagaagtaga ccatggccat
2581 gaccgccccc ttggcccttt ccttgaggtc ctcgcccgcc agcagctggc tcaattgcca
2641 gagtcccagg gccgccaggg cgatgacggc aacccacagg aggaactgcc cacccggagc
2701 ctccgcgatg gtggccaggg cacctgaatt cgaggcctca tcacccgaac cgccggatcc
2761 agtggcgatg cgcaccgcga tccacccgat gaggatgtgc agtatgccca ggacaatgaa
2821 accacctctg gccagggtgg tcagcgcggg gtggtcctcg gcctggtcgg cagcccgttc
2881 gatcgtccgt ttcgcggatc tggtgtcgcc cttatccata gctcccattg aaccgccttg
2941 aggggtgggc ggccactgtc agggcggatt gtgatctgaa ctgtgatgtt ccatcaaccc
//

ノボスフィンゴビウム(Novosphingobium)\アロマティシボランス(aromaticivorans)\GDSx 284 aa
配列番号63
ZP00094165
1 mgqvklfarr capvllalag lapaatvare aplaegaryv algssfaagp gvgpnapgsp
61 ercgrgtlny phllaealkl dlvdatcsga tthhvlgpwn evppqidsvn gdtrlvtlti
121 ggndvsfvgn ifaaacekma spdprcgkwr eiteeewqad eermrsivrq iharaplarv
181 vvvdyitvlp psgtcaamai spdrlaqsrs aakrlarita rvareegasl lkfshisrrh
241 hpcsakpwsn glsapaddgi pvhpnrlgha eaaaalvklv klmk
//

配列番号64
1 tgccggaact caagcggcgt ctagccgaac tcatgcccga aagcgcgtgg cactatcccg
61 aagaccaggt ctcggacgcc agcgagcgcc tgatggccgc cgaaatcacg cgcgaacagc
121 tctaccgcca gctccacgac gagctgccct atgacagtac cgtacgtccc gagaagtacc
181 tccatcgcaa ggacggttcg atcgagatcc accagcagat cgtgattgcc cgcgagacac
241 agcgtccgat cgtgctgggc aagggtggcg cgaagatcaa ggcgatcgga gaggccgcac
301 gcaaggaact ttcgcaattg ctcgacacca aggtgcacct gttcctgcat gtgaaggtcg
361 acgagcgctg ggccgacgcc aaggaaatct acgaggaaat cggcctcgaa tgggtcaagt
421 gaagctcttc gcgcgccgct gcgccccagt acttctcgcc cttgccgggc tggctccggc
481 ggctacggtc gcgcgggaag caccgctggc cgaaggcgcg cgttacgttg cgctgggaag
541 ctccttcgcc gcaggtccgg gcgtggggcc caacgcgccc ggatcgcccg aacgctgcgg
601 ccggggcacg ctcaactacc cgcacctgct cgccgaggcg ctcaagctcg atctcgtcga
661 tgcgacctgc agcggcgcga cgacccacca cgtgctgggc ccctggaacg aggttccccc
721 tcagatcgac agcgtgaatg gcgacacccg cctcgtcacc ctgaccatcg gcggaaacga
781 tgtgtcgttc gtcggcaaca tcttcgccgc cgcttgcgag aagatggcgt cgcccgatcc
841 gcgctgcggc aagtggcggg agatcaccga ggaagagtgg caggccgacg aggagcggat
901 gcgctccatc gtacgccaga tccacgcccg cgcgcctctc gcccgggtgg tggtggtcga
961 ttacatcacg gtcctgccgc catcaggcac ttgcgctgcc atggcgattt cgccggaccg
1021 gctggcccag agccgcagcg ccgcgaaacg gcttgcccgg attaccgcac gggtcgcgcg
1081 agaagagggt gcatcgctgc tcaagttctc gcatatctcg cgccggcacc atccatgctc
1141 tgccaagccc tggagcaacg gcctttccgc cccggccgac gacggcatcc cggtccatcc
1201 gaaccggctc ggacatgctg aagcggcagc ggcgctggtc aagcttgtga aattgatgaa
1261 gtagctactg cactgatttc aaatagtatt gcctgtcagc tttccagccc ggattgttgc
1321 agcgcaacag aaacttgtcc gtaatggatt gatggtttat gtcgctcgca aattgccgtc
1381 gaagggaacg ggcgcgtcgc tcgttaacgt cctgggtgca gcagtgacgg agcgcgtgga
1441 tgagtgatac tggcggtgtc atcggtgtac gcgccgccat tcccatgcct gtacgcgccg
//

S.コエリコラー(coelicolor)\GDSx 268 aa
配列番号65
NP625998.
1 mrrfrlvgfl sslvlaagaa ltgaataqaa qpaaadgyva lgdsyssgvg agsyisssgd
61 ckrstkahpy lwaaahspst fdftacsgar tgdvlsgqlg plssgtglvs isiggndagf
121 adtmttcvlq sessclsria taeayvdstl pgkldgvysa isdkapnahv vvigyprfyk
181 lgttciglse tkrtainkas dhlntvlaqr aaahgftfgd vrttftghel csgspwlhsv
241 nwlnigesyh ptaagqsggy lpvlngaa
//

配列番号66
1 cccggcggcc cgtgcaggag cagcagccgg cccgcgatgt cctcgggcgt cgtcttcatc
61 aggccgtcca tcgcgtcggc gaccggcgcc gtgtagttgg cccggacctc gtcccaggtg
121 cccgcggcga tctggcgggt ggtgcggtgc gggccgcgcc gaggggagac gtaccagaag
181 cccatcgtca cgttctccgg ctgcggttcg ggctcgtccg ccgctccgtc cgtcgcctcg
241 ccgagcacct tctcggcgag gtcggcgctg gtcgccgtca ccgtgacgtc ggcgccccgg
301 ctccagcgcg agatcagcag cgtccagccg tcgccctccg ccagcgtcgc gctgcggtcg
361 tcgtcgcggg cgatccgcag cacgcgcgcg ccgggcggca gcagcgtggc gccggaccgt
421 acgcggtcga tgttcgccgc gtgcgagtac ggctgctcac ccgtggcgaa acggccgagg
481 aacagcgcgt cgacgacgtc ggacggggag tcgctgtcgt ccacgttgag ccggatcggc
541 agggcttcgt gcgggttcac ggacatgtcg ccatgatcgg gcacccggcc gccgcgtgca
601 cccgctttcc cgggcacgca cgacaggggc tttctcgccg tcttccgtcc gaacttgaac
661 gagtgtcagc catttcttgg catggacact tccagtcaac gcgcgtagct gctaccacgg
721 ttgtggcagc aatcctgcta agggaggttc catgagacgt ttccgacttg tcggcttcct
781 gagttcgctc gtcctcgccg ccggcgccgc cctcaccggg gcagcgaccg cccaggcggc
841 ccaacccgcc gccgccgacg gctatgtggc cctcggcgac tcctactcct ccggggtcgg
901 agcgggcagc tacatcagct cgagcggcga ctgcaagcgc agcacgaagg cccatcccta
961 cctgtgggcg gccgcccact cgccctccac gttcgacttc accgcctgtt ccggcgcccg
1021 tacgggtgat gttctctccg gacagctcgg cccgctcagc tccggcaccg gcctcgtctc
1081 gatcagcatc ggcggcaacg acgccggttt cgccgacacc atgacgacct gtgtgctcca
1141 gtccgagagc tcctgcctgt cgcggatcgc caccgccgag gcgtacgtcg actcgacgct
1201 gcccggcaag ctcgacggcg tctactcggc aatcagcgac aaggcgccga acgcccacgt
1261 cgtcgtcatc ggctacccgc gcttctacaa gctcggcacc acctgcatcg gcctgtccga
1321 gaccaagcgg acggcgatca acaaggcctc cgaccacctc aacaccgtcc tcgcccagcg
1381 cgccgccgcc cacggcttca ccttcggcga cgtacgcacc accttcaccg gccacgagct
1441 gtgctccggc agcccctggc tgcacagcgt caactggctg aacatcggcg agtcgtacca
1501 ccccaccgcg gccggccagt ccggtggcta cctgccggtc ctcaacggcg ccgcctgacc
1561 tcaggcggaa ggagaagaag aaggagcgga gggagacgag gagtgggagg ccccgcccga
1621 cggggtcccc gtccccgtct ccgtctccgt cccggtcccg caagtcaccg agaacgccac
1681 cgcgtcggac gtggcccgca ccggactccg cacctccacg cgcacggcac tctcgaacgc
1741 gccggtgtcg tcgtgcgtcg tcaccaccac gccgtcctgg cgcgagcgct cgccgcccga
1801 cgggaaggac agcgtccgcc accccggatc ggagaccgac ccgtccgcgg tcacccaccg
1861 gtagccgacc tccgcgggca gccgcccgac cgtgaacgtc gccgtgaacg cgggtgcccg
1921 gtcgtgcggc ggcggacagg cccccgagta gtgggtgcgc gagcccacca cggtcacctc
1981 caccgactgc gctgcggggc
//

S.アベルチリス(avermitilis)\GDSx 269 aa
配列番号67
NP827753.
1 mrrsritayv tslllavgca ltgaataqas paaaatgyva lgdsyssgvg agsylsssgd
61 ckrsskaypy lwqaahspss fsfmacsgar tgdvlanqlg tlnsstglvs ltiggndagf
121 sdvmttcvlq sdsaclsrin takayvdstl pgqldsvyta istkapsahv avlgyprfyk
181 lggsclagls etkrsainda adylnsaiak raadhgftfg dvkstftghe icssstwlhs
241 ldllnigqsy hptaagqsgg ylpvmnsva
//

配列番号68
1 ccaccgccgg gtcggcggcg agtctcctgg cctcggtcgc ggagaggttg gccgtgtagc
61 cgttcagcgc ggcgccgaac gtcttcttca ccgtgccgcc gtactcgttg atcaggccct
121 tgcccttgct cgacgcggcc ttgaagccgg tgcccttctt gagcgtgacg atgtagctgc
181 ccttgatcgc ggtgggggag ccggcggcga gcaccgtgcc ctcggccggg gtggcctggg
241 cgggcagtgc ggtgaatccg cccacgaggg cgccggtcgc cacggcggtt atcgcggcga
301 tccggatctt cttgctacgc agctgtgcca tacgagggag tcctcctctg ggcagcggcg
361 cgcctgggtg gggcgcacgg ctgtgggggg tgcgcgcgtc atcacgcaca cggccctgga
421 gcgtcgtgtt ccgccctggg ttgagtaaag cctcggccat ctacgggggt ggctcaaggg
481 agttgagacc ctgtcatgag tctgacatga gcacgcaatc aacggggccg tgagcacccc
541 ggggcgaccc cggaaagtgc cgagaagtct tggcatggac acttcctgtc aacacgcgta
601 gctggtacga cggttacggc agagatcctg ctaaagggag gttccatgag acgttcccga
661 attacggcat acgtgacctc actcctcctc gccgtcggct gcgccctcac cggggcagcg
721 acggcgcagg cgtccccagc cgccgcggcc acgggctatg tggccctcgg cgactcgtac
781 tcgtccggtg tcggcgccgg cagctacctc agctccagcg gcgactgcaa gcgcagttcg
841 aaggcctatc cgtacctctg gcaggccgcg cattcaccct cgtcgttcag tttcatggct
901 tgctcgggcg ctcgtacggg tgatgtcctg gccaatcagc tcggcaccct gaactcgtcc
961 accggcctgg tctccctcac catcggaggc aacgacgcgg gcttctccga cgtcatgacg
1021 acctgtgtgc tccagtccga cagcgcctgc ctctcccgca tcaacacggc gaaggcgtac
1081 gtcgactcca ccctgcccgg ccaactcgac agcgtgtaca cggcgatcag cacgaaggcc
1141 ccgtcggccc atgtggccgt gctgggctac ccccgcttct acaaactggg cggctcctgc
1201 ctcgcgggcc tctcggagac caagcggtcc gccatcaacg acgcggccga ctatctgaac
1261 agcgccatcg ccaagcgcgc cgccgaccac ggcttcacct tcggcgacgt caagagcacc
1321 ttcaccggcc atgagatctg ctccagcagc acctggctgc acagtctcga cctgctgaac
1381 atcggccagt cctaccaccc gaccgcggcc ggccagtccg gcggctatct gccggtcatg
1441 aacagcgtgg cctgagctcc cacggcctga atttttaagg cctgaatttt taaggcgaag
1501 gtgaaccgga agcggaggcc ccgtccgtcg gggtctccgt cgcacaggtc accgagaacg
1561 gcacggagtt ggacgtcgtg cgcaccgggt cgcgcacctc gacggcgatc tcgttcgaga
1621 tcgttccgct cgtgtcgtac gtggtgacga acacctgctt ctgctgggtc tttccgccgc
1681 tcgccgggaa ggacagcgtc ttccagcccg gatccgggac ctcgcccttc ttggtcaccc
1741 agcggtactc cacctcgacc ggcacccggc ccaccgtgaa ggtcgccgtg aacgtgggcg
1801 cctgggcggt gggcggcggg caggcaccgg agtagtcggt gtgcacgccg gtgaccgtca
1861 ccttcacgga ctgggccggc ggggtcgtcg taccgccgcc gccaccgccg cctcccggag
1921 tggagcccga gctgtggtcg cccccgccgt cggcgttgtc gtcctcgggg gttttcgaac
//

ストレプトミセスジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素
配列番号69
ACAGGCCGATGCACGGAACCGTACCTTTCCGCAGTGAAGCGCTCTCCCCCCATCGTTCGC
CGGGACTTCATCCGCGATTTTGGCATGAACACTTCCTTCAACGCGCGTAGCTTGCTACAA
GTGCGGCAGCAGACCCGCTCGTTGGAGGCTCAGTGAGATTGACCCGATCCCTGTCGGCCG
CATCCGTCATCGTCTTCGCCCTGCTGCTCGCGCTGCTGGGCATCAGCCCGGCCCAGGCAG
CCGGCCCGGCCTATGTGGCCCTGGGGGATTCCTATTCCTCGGGCAACGGCGCCGGAAGTT
ACATCGATTCGAGCGGTGACTGTCACCGCAGCAACAACGCGTACCCCGCCCGCTGGGCGG
CGGCCAACGCACCGTCCTCCTTCACCTTCGCGGCCTGCTCGGGAGCGGTGACCACGGATG
TGATCAACAATCAGCTGGGCGCCCTCAACGCGTCCACCGGCCTGGTGAGCATCACCATCG
GCGGCAATGACGCGGGCTTCGCGGACGCGATGACCACCTGCGTCACCAGCTCGGACAGCA
CCTGCCTCAACCGGCTGGCCACCGCCACCAACTACATCAACACCACCCTGCTCGCCCGGC
TCGACGCGGTCTACAGCCAGATCAAGGCCCGTGCCCCCAACGCCCGCGTGGTCGTCCTCG
GCTACCCGCGCATGTACCTGGCCTCGAACCCCTGGTACTGCCTGGGCCTGAGCAACACCA
AGCGCGCGGCCATCAACACCACCGCCGACACCCTCAACTCGGTGATCTCCTCCCGGGCCA
CCGCCCACGGATTCCGATTCGGCGATGTCCGCCCGACCTTCAACAACCACGAACTGTTCT
TCGGCAACGACTGGCTGCACTCACTCACCCTGCCGGTGTGGGAGTCGTACCACCCCACCA
GCACGGGCCATCAGAGCGGCTATCTGCCGGTCCTCAACGCCAACAGCTCGACCTGATCAA
CGCACGGCCGTGCCCGCCCCGCGCGTCACGCTCGGCGCGGGCGCCGCAGCGCGTTGATCA
GCCCACAGTGCCGGTGACGGTCCCACCGTCACGGTCGAGGGTGTACGTCACGGTGGCGCC
GCTCCAGAAGTGGAACGTCAGCAGGACCGTGGAGCCGTCCCTGACCTCGTCGAAGAACTC
CGGGGTCAGCGTGATCACCCCTCCCCCGTAGCCGGGGGCGAAGGCGGCGCCGAACTCCTT
GTAGGACGTCCAGTCGTGCGGCCCGGCGTTGCCACCGTCCGCGTAGACCGCTTCCATGGT
CGCCAGCCGGTCCCCGCGGAACTCGGTGGGGATGTCCGTGCCCAAGGTGGTCCCGGTGGT
GTCCGAGAGCACCGGGGGCTCGTACCGGATGATGTGCAGATCCAAAGAATT
ストレプトミセス ジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素
配列番号70
MRLTRSLSAASVIVFALLLALLGISPAQAAGPAYVALGDSYSSGNGAGSYIDSSGDCHRSN
NAYPARWAAANAPSSFTFAACSGAVTTDVINNQLGALNASTGLVSITIGGNDAGFADAMTT
CVTSSDSTCLNRLATATNYINTTLLARLDAVYSQIKARAPNARVVVLGYPRMYLASNPWYC
LGLSNTKRAAINTTADTLNSVISSRATAHGFRFGDVRPTFNNHELFFGNDWLHSLTLPVWE
SYHPTSTGHQSGYLPVLNANSST

0172

本発明によるジグリセリド:グリセリンアシル基転移酵素の特定
パーム油中のジグリセリドの酵素による低減に対するアッセイ
7%ジグリセリドを含有するパーム油1グラム蓋付ガラスに計量する。
グリセリン50mg及び酵素溶液10μlを添加する。反応混合物を加熱チャンバ中で磁気撹拌機を用いて40℃で20時間撹拌する。100℃に10分間加熱することによって酵素反応を停止させる。酵素溶液の代わりに水10μlを添加した基準試料を同様に処理する。試料標準手順(以下参照)に従ってGLCによって分析し、脂肪酸、モノグリセリド及びジグリセリドの量を計算する。
計算:
GLC分析の結果から、遊離脂肪酸の増加及びジグリセリドの減少を計算することができる。
Δ%脂肪酸=%脂肪酸(酵素)−%脂肪酸(対照)、
Mv Fa=脂肪酸の平均分子量、
Δ%ジグリセリド=%ジグリセリド(対照)−%ジグリセリド(酵素)、
Mv Di=ジグリセリドの平均分子量、
転移酵素活性は、全酵素活性の百分率として計算される。

0173

GLC分析
WCOT溶融シリカカラム12.5m×0.25mm ID×0.1μ膜厚5%フェニルメチルシリコーン(Chrompack社製CP Sil 8 CB)を備えたPerkin Elmer社製Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
キャリアガスヘリウム
インジェクター.PSSIコールドスプリット注入初期温度50℃ 385℃に昇温)、体積1.0μl
検出器FID:395℃
乾燥器プログラム: 1 2 3
乾燥器温度、℃ 90 280 350
等温、時間、min 1 0 10
昇温速度、℃/min 15 4

0174

試料調製:内部標準ヘプタデカン0.5mg/mlを含むヘプタンピリジン2:1 9mlに試料30mgを溶解した。試料溶液300μlをクリンプバイアルに移し、MSTFA(N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid)300μlを添加し、60℃で20分間反応させた。

0175

単離
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、単離された形であることが好ましい。「単離された」という用語は、配列が本来天然に付随し、天然に存在する少なくとも1個の他の成分から、その配列が少なくとも実質的に遊離されていることを意味する。

0176

精製
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、精製された形であることが好ましい。「精製された」という用語は、配列が比較的純粋な状態、例えば少なくとも純度約51%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも純度約90%、少なくとも純度約95%又は少なくとも純度約98%であることを意味する。

0177

本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチド又は改変に適切であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生するあらゆる細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で周知である。

0178

例えば、ゲノムDNA及び/又はcDNAライブラリは、ポリペプチドを産生する生物から得られる染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構築することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が知られている場合には、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを、生物から調製されるゲノムライブラリから特定することができる。或いは、別の既知のポリペプチド遺伝子と相同な配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを特定することができる。後者の場合には、厳密性のより低いハイブリッド形成条件及び洗浄条件が使用される。

0179

或いは、ポリペプチドをコードするクローンは、ゲノムDNAの断片をプラスミドなどの発現ベクターに挿入し、得られたゲノムDNAライブラリで酵素陰性細菌を形質転換し、次いでポリペプチドによって阻害される酵素を含む寒天上に形質転換細菌を播くことによって特定することができ、それによってポリペプチドを発現するクローンを特定することができる。

0180

さらなる別法においては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準方法、例えば、Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869に記載されたホスホラミダイト法又はMatthes et al (1984)EMBO J. 3, p 801-805に記載された方法によって合成して調製することができる。ホスホラミダイト法においては、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成装置中で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクタークローン化される。

0181

ヌクレオチド配列は、標準技術に従って合成、ゲノム又はcDNA起源の断片を(適宜)連結することによって調製された混合ゲノム・合成起源、混合合成・cDNA起源又は混合ゲノム・cDNA起源とすることができる。連結された各断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。DNA配列は、例えば、US 4,683,202又はSaiki R K et al (Science (1988) 239, pp 487-491)に記載された特異的プライマーを用いたPCR(polymerase chain reaction)によって調製することもできる。

0182

ヌクレオチド配列
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書では「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列並びに(その部分などの)その変異体、相同体、断片及び誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖であろうとアンチセンス鎖であろうと、2本鎖でも1本鎖でもよいゲノム、合成又は組換え起源とすることができる。

0183

本発明では「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA及びRNAを含む。この用語は、コード配列のDNA、より好ましくはcDNAを意味することが好ましい。

0184

好ましい実施形態においては、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、やはりその天然環境にあるその天然に付随する配列に連結されたときに、その天然環境における未変性ヌクレオチド配列を包含しない。参照を容易にするために、本発明者らはこの好ましい実施形態を「変性(non-native)ヌクレオチド配列」と称する。この点で、「未変性ヌクレオチド配列」という用語は、その本来の環境にあるヌクレオチド配列全体であって、それが天然に付随し、やはりその本来の環境にあるプロモーター全体に動作可能に連結されるときのヌクレオチド配列全体を意味する。したがって、本発明のポリペプチドは、その固有の生物中のヌクレオチド配列によって発現され得るが、そのヌクレオチド配列は、その生物中の天然に付随するプロモーターの制御下にはない。

0185

このポリペプチドは、未変性ポリペプチドではないことが好ましい。この点で、「未変性ポリペプチド」という用語は、その本来の環境にあり、その未変性ヌクレオチド配列によって発現されたときのポリペプチド全体を意味する。

0186

一般に、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えDNA技術を用いて調製される(すなわち、組換えDNA)。しかし、本発明の別の実施形態においては、このヌクレオチド配列は、当分野で周知の化学的方法によって全体的又は部分的に合成することができる(CaruthersMHet al (1980) Nuc AcidsRes Symp Ser 215-23及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232参照)。

0187

分子進化
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離された後に、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が特定された後に、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましいことがあり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を変異させることが望ましいことがある。

0188

変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。

0189

適切な方法は、Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p646-649)に開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)に記載されている。

0190

上述したものなどの部位特異的変異誘発の代わりに、例えば、Stratagene社製GeneMorphPCR変異誘発キット、Clontech社製Diversify PCRランダム変異誘発キットなどの市販キットを用いて変異をランダムに導入することができる。EP 0 583 265は、PCRに基づく変異誘発を最適化する方法に言及している。この方法は、EP 0 866 796に記載されたものなどの変異原性DNAアナログの使用と組み合わせることもできる。誤りを犯しやすいPCR技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシル基転移酵素の変異体の生成に適している。国際公開第0206457号は、リパーゼの分子進化について言及している。

0191

新規配列を得る第3の方法は、任意の数のDnase Iなどの制限酵素又は酵素を用いて異なるヌクレオチド配列を断片化し、機能タンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再び組み立てることである。或いは、完全ヌクレオチド配列の再組み立て中に、1個又は複数の異なるヌクレオチド配列を用い、変異を導入することができる。DNAシャフリング及びファミリーシャフリング技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシル基転移酵素変異体の製造に適している。「シャフリング」を実施する適切な方法は、EP0 752 008、EP1 138 763、EP1 103 606にある。シャフリングは、US6,180,406及び国際公開第01/34835号に記載された別の形のDNA変異誘発と組み合わせることもできる。

0192

したがって、多数の部位特異的又は無作為な変異をヌクレオチド配列中インビボ又はインビトロで生じさせ、続いて、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかを様々な手段によってスクリーニングすることができる。コンピュータ及びエキソ媒介(exo mediated)組換え方法(国際公開第00/58517号、US6,344,328、US6,361,974参照)を用いて、例えば、生成される変異体が、既知の酵素又はタンパク質に対して極めて低い相同性を有する分子進化を実施することができる。それによって得られるかかる変異体は、既知の転移酵素に構造がかなり類似しているが、極めて低いアミノ酸配列相同性を有することができる。

0193

さらに、非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の変異体又は自然変異体は、野生型又は他の変異体若しくは自然変異体と組み換えて新しい変異体を生成することもできる。かかる新しい変異体も、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかによってスクリーニングすることができる。

0194

上述及び類似の分子進化方法を適用することによって、タンパク質構造又は機能の予備知識なしに、好ましい諸特性を有する本発明の酵素の変異体を特定し選択することができ、予測不可能であるが有益な突然変異体又は変異体を生成することができる。当分野では、酵素活性を最適化又は変更するために分子進化を適用した例が多数ある。かかる例としては、以下、すなわち、宿主細胞中又はインビトロで最適化された発現及び/又は活性、酵素活性の増大、基質及び/又は生成物特異性の変化、酵素又は構造安定性の増大又は低下、好ましい環境条件、例えば温度、pH、基質における酵素活性/特異性の変化の1つ又は複数が挙げられるが、これらだけに限定されない。

0195

当業者には明らかなように、分子進化ツールを使用して、酵素を変化させて酵素の機能を改善することができる。

0196

適切には、本発明において使用される脂質アシル基転移酵素は変異体とすることができ、すなわち、親酵素と比較したときに少なくとも1個のアミノ酸置換欠失又は付加を含むことができる。酵素変異体は、親酵素と少なくとも25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%の相同性を保持する。適切な親酵素としては、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有する任意の酵素などが挙げられる。親酵素は、pfam00657コンセンサス配列と整合することが好ましい。

0197

好ましい実施形態においては、脂質アシル基転移酵素変異体は、GDSx、GANDY及びHPTブロック中のpfam00657コンセンサス配列アミノ酸残基の少なくとも1個若しくは複数を保持し、又は含む。

0198

水系環境において脂質アシル基転移酵素活性がない又は低いリパーゼなどの酵素は、分子進化ツールを用いて変異させて転移酵素活性を導入し又は高めることができ、それによって本発明の組成物及び方法に使用するのに適切なかなりの転移酵素活性を有する脂質アシル基転移酵素を生成することができる。

0199

適切には、本発明において使用される脂質アシル基転移酵素は、極性脂質、好ましくはリン脂質及び/又は糖脂質に対する酵素活性が親酵素よりも高い変異体とすることができる。かかる変異体は、リゾ極性脂質に対しても低い活性を有するか、又は活性を持たないことが好ましい。極性脂質、リン脂質及び/又は糖脂質に対する高い活性は、加水分解及び/又は転移酵素活性或いは両方の組み合わせの結果かもしれない。

0200

本発明に使用される脂質アシル基転移酵素変異体は、トリグリセリド及び/又はモノグリセリド及び/又はジグリセリドに対して親酵素よりも低い活性を有することができる。

0201

適切には、本酵素変異体は、トリグリセリド及び/又はモノグリセリド及び/又はジグリセリドに対して活性を持たなくすることができる。

0202

或いは、本発明に使用される酵素変異体は、トリグリセリドに対して高い活性を有することができ、且つ/又は以下、すなわち、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドの1個若しくは複数に対しても高い活性を有することができる。

0203

脂質アシル基転移酵素の変異体は公知であり、かかる変異体の1個若しくは複数は、本発明による方法及び使用並びに/又は本発明による酵素組成物に使用するのに適切なことがある。単なる例として、脂質アシル基転移酵素の変異体は、以下の参考文献、すなわち、Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3): 2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3):587-99に記載されており、本発明によって使用することができる。

0204

アミノ酸配列
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列も包含する。

0205

本明細書では「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び/又は「タンパク質」という用語と同義である。「アミノ酸配列」という用語が「ペプチド」という用語と同義である場合もある。

0206

アミノ酸配列は、適切な出所から調製/単離することができ、或いは組換えDNA技術を用いて合成又は調製することができる。

0207

適切には、アミノ酸配列は、本明細書に教示される単離ポリペプチドから標準技術によって得ることができる。

0208

単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定するのに適切な一方法は以下のとおりである。

0209

精製ポリペプチド凍結乾燥させ、その凍結乾燥材料100μgを8M尿素と0.4M炭酸水素アンモニウム、pH8.4の混合物50μlに溶解させることができる。溶解されたタンパク質を変性し、窒素で覆い、45mMジチオスレイトール5μlを添加した後に、50℃で15分間還元することができる。室温に冷却後、100mMヨードアセトアミド5μlを添加し、窒素下、暗所において室温で15分間システイン残基誘導体化することができる。

0210

水135μl及びエンドプロテアーゼLys−C 5μgの5μl水溶液を上記反応混合物に添加し、窒素下37℃で24時間消化することができる。

0211

生成したペプチドは、逆相HPLCによってVYDAC C18カラム(0.46×15cm;10μm;The Separation Group, California, USA)上で溶媒A:0.1%TFA水溶液及び溶媒B:0.1%TFAのアセトニトリル溶液を用いて分離することができる。選択されたペプチドをDevelosil C18カラム上で同じ溶媒系を用いて再度クロマトグラフにかけた後、N末端の配列を決定することができる。配列決定は、Applied Biosystems 476A配列決定装置を用い、製造者(Applied Biosystems, California, USA)の指示に従ってパルス液体高速サイクル(pulsed liquid fast cycles)を用いて実施することができる。

0212

配列同一性又は配列相同性
本発明は、本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、或いはかかるポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列の使用も包含する(以下「相同配列」と記述する)。ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は「同一性」と同等とみなすことができる。

0213

相同アミノ酸配列及び/又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持するポリペプチド及び/又は酵素の活性を高めるポリペプチドを提供及び/又はコードすべきである。

0214

本明細書において、相同配列は、対象配列に少なくとも75、85又は90%同一、好ましくは少なくとも95又は98%同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は類似性の点から考えることもできるが(すなわち、類似の化学特性/機能を有するアミノ酸残基)、本発明では配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。

0215

本明細書において相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(対象配列)に少なくとも75、85又は90%同一、好ましくは少なくとも95又は98%同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含む。相同性は類似性の点から考えることもできるが(すなわち、類似の化学特性/機能を有するアミノ酸残基)、本発明では配列同一性の点から相同性を表現することが好ましい。

0216

相同性比較は、目視によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを利用して実施することができる。これらの市販コンピュータプログラムは、2個以上の配列間の%相同性を計算することができる。

0217

%相同性は、隣接配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列はもう一方の配列とアラインメントさせ、一方の配列中の各アミノ酸はもう一方の配列中の対応するアミノ酸と1回に1個の残基が直接比較される。これは、「ギャップのない」アラインメントと呼ばれる。一般に、かかるギャップのないアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。

0218

これは極めて単純で一貫性のある方法ではあるが、例えば、それ以外は同一である配列対における1つの挿入又は欠失によって後続のアミノ酸残基がアラインメントから排除され、したがって、全体的なアラインメントを実施したときに%相同性が大きく低下する可能性があることを考慮していない。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体の相同性スコアを不当に減少させずに、起こり得る挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、「ギャップ」を配列アラインメントに挿入して局所的相同性が最大になるようにすることによって実施される。

0219

しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸の場合に、2個の比較配列間の高い関連性を反映してギャップができるだけ少ない配列アラインメントが、ギャップが多い配列アラインメントよりも高いスコアが得られるように、アラインメント中に存在する各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に対しては比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基に対してはペナルティを減少させる「アフィンギャップコスト」が一般に使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適なアラインメントを生じることは言うまでもない。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、かかるソフトウエアを配列比較に用いるときには、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを使用するときには、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対しては−12であり、各伸長に対しては−4である。

0220

したがって、最大%相同性の計算は、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントを作成する必要がある。このようなアラインメントを実行するのに適切なコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ(Devereux et al 1984 Nuc. AcidsResearch 12 p387)である。配列比較を実施することができる他のソフトウエアの例としては、BLASTパッケージ(Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18参照)、FASTA(Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410)、GENEWORKS比ツールスイートなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。BLASTとFASTAの両方ともオフライン及びオンライン検索で利用可能である(Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60参照)。しかし、一部の適用例では、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。BLAST 2 Sequencesと呼ばれる新しいツールは、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較することもできる(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照)。

0221

最終%相同性は同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセス自体は全か無か対比較には一般に基づいていない。その代わり、化学的類似度又は進化距離に基づいて各対ごとの比較に対してスコアが割り当てられるスケールド類度スコアマトリックス(scaled similarity score matrix)が一般に使用される。通常使用されるかかるマトリックスの例は、BLASTプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるBLOSUM62マトリックスである。GCG Wisconsinプログラムは、公開デフォルト値又はもし提供されていれば個別のシンボル比較表(symbol comparison table)を一般に使用する(さらなる詳細については利用者マニュアルを参照されたい)。一部の適用例では、GCGパッケージの場合には公開デフォルト値を、他のソフトウエアの場合にはBLOSUM62などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。

0222

或いは、相同性百分率は、CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244)に類似したアルゴリズムに基づくDNASIS(商標)(Hitachi Software社製)の複数のアラインメント機能を用いて計算することができる。

0223

ソフトウエアが最適なアラインメントを作成した後に、%相同性、好ましくは%配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウエアは、一般に、配列比較の一部としてこれを実行し、数値結果を与える。

0224

配列は、サイレントな変化をもたらし機能的に等価な物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含むこともある。物質の二次結合活性(secondary binding activity)が保持される限り、残基の極性電荷溶解性、疎水性、親水性及び/又は両親媒性における類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を実施することができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられ、正に帯電したアミノ酸としてはリジンアルギニンなどが挙げられ、類似した親水性値を有する無電荷極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシンイソロイシンバリン、グリシン、アラニンアスパラギングルタミン、セリン、トレオニンフェニルアラニンチロシンなどが挙げられる。

0225

保存的置換は、例えば下表に従って実施することができる。第2カラムの同じブロックのアミノ酸及び好ましくは第3カラムの同じ行のアミノ酸は互いに置換することができる。

0226

0227

本発明は、起こり得る相同置換(置換と交換は、本明細書ではともに、既存のアミノ酸残基と別の残基を取り替えることを意味する)、すなわち、塩基性残基と塩基性残基、酸性残基と酸性残基、極性残基と極性残基などの同種(like−for−like)置換も包含する。非相同置換、すなわち、1クラスの残基から別のクラスの残基への非相同置換、或いはオルニチン(以後、Zと記述する)、ジアミノ酪酸オルニチン(以後、Bと記述する)、ノルロイシンオルニチン(以後、Oと記述する)、ピリイルアラニン(pyriylalanine)、チエニルアラニンナフチルアラニン、フェニルグリシンなどの人為的なアミノ酸の介在も含む非相同置換も起こることがある。

0228

交換は、人為的(unnatural)アミノ酸によっても成されうる。

0229

変異体アミノ酸配列は、グリシン、β−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチルプロピル基などのアルキル基を含めて、配列の任意の2個のアミノ酸残基の間に挿入することができる適切なスペーサー基を含むことができる。さらに別の形の変異は、1個又は複数のペプトイド型アミノ酸残基の存在を含み、当業者には十分知られている。不確かさを回避するために、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基が残基のα−炭素ではなく窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を意味するために使用される。ペプトイド型ペプチドを調製する方法は当分野、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, TrendsBiotechnol. (1995) 13(4), 132-134において公知である。

0230

本発明に使用されるヌクレオチド配列又は本明細書に規定される具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、合成又は改変ヌクレオチドをその中に含むことができる。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる改変タイプが当分野で知られている。これらの改変は、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格並びに/或いは分子の3’末端及び/又は5’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加を含む。本発明では、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、当分野で利用可能な任意の方法によって改変できることを理解されたい。かかる改変は、ヌクレオチド配列のインビボでの活性を高め又は寿命延ばすために実施することができる。

0231

本発明は、本明細書に考察される配列又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的であるヌクレオチド配列の使用も包含する。配列がその断片に相補的である場合には、その配列をプローブとして使用して他の生物などにおける類似のコード配列を特定することができる。

0232

本発明の配列に100%相同ではないが、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、いくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載される配列の他の変異体は、例えば、ある範囲の個体、例えば、異なる集団からの個体で構成されるDNAライブラリを探索することによって得ることができる。また、他のウイルス/細菌又は細胞の相同体、特に哺乳動物細胞(例えばラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞)中にある細胞相同体を得ることができ、かかる相同体及びその断片は、一般に、本明細書の配列リストに示される配列と選択的にハイブリッド形成することができる。かかる配列は、他の動物種から作製されたcDNAライブラリ又はゲノムDNAライブラリを探索することによって、また、添付された配列リスト中の配列のいずれか1つの全部又は一部を含むプローブを用いて中度から高度の厳密性の条件下でかかるライブラリを探索することによって、得ることができる。本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得るために、類似の考察が適用される。

0233

変異体及び系統/種相同体は、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを使用した縮重PCRによって得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体/相同体から得られるアミノ酸配列をアラインメントさせることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で公知のコンピュータソフトウエアを使用して実施することができる。例えば、GCG Wisconsin PileUpプログラムが広く用いられる。

0234

縮重PCRに使用されるプライマーは、1個又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される厳密性よりも低い厳密性の条件で使用される。

0235

或いは、かかるポリヌクレオチドは、特徴の明らかな配列の部位特異的変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に対してコドン優先度を最適化するためにサイレントなコドン配列変化が必要な場合に有用となり得る。制限ポリペプチド認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性又は機能を変えるために、別の配列変化が望まれる場合もある。

0236

本発明のポリヌクレオチド(ヌクレオチド配列)を使用して、プライマー、例えばPCRプライマー選択的増幅反応用プライマー、プローブ、例えば放射性又は非放射性標識を用いて従来の手段によって明示用標識(revealing label)で標識されたプローブを作製することができ、或いはこのポリヌクレオチドをベクターにクローン化することができる。かかるプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、例えば、少なくとも25、30又は40ヌクレオチド長であり、本明細書において使用される本発明のポリヌクレオチドという用語によってやはり包含される。

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