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課題・解決手段

一般式(I)の化合物(式中、Aは、さまざまな6員の窒素含有複素環を表し、Qは、結合、ハロゲン、C1〜4アルキル、O、S、SO2、CO、またはCSであり、X1、X2、X3、およびX4は、9個の特定の置換基によって場合により置換されているかまたは1つが窒素であることができる)、または薬剤として許容されるそのプロドラッグ、塩、水和物、溶媒和物結晶形態、もしくはジアステレオマー担体および式(I)の化合物の少なくとも1つを含む組成物もまた提供される。さらに、式(I)の化合物を投与することによってチロシンキナーゼが関連する疾患状態治療する方法、および式(I)の化合物を投与することによって対象の免疫システムを抑制する方法が提供される。

概要

背景

タンパク質キナーゼは、タンパク質の特定の残基のリン酸化触媒する酵素の一ファミリーである。一般にタンパク質キナーゼはいくつかのグループ分類され、セリンおよび/またはトレオニン残基優先的にリン酸化するグループ、チロシン残基を優先的にリン酸化するグループ、ならびにチロシンおよびSer/Thr残基の両方をリン酸化するグループである。したがってタンパク質キナーゼは、受容体でのサイトカイン作用を含む、核への細胞外シグナル伝達に関与するシグナル伝達経路の主要な要素であり、種々の生物学的事象を誘発する。正常な細胞生理におけるタンパク質キナーゼの多くの役割には、細胞周期の制御、ならびに細胞成長分化アポトーシス細胞移動性、および有糸分裂誘発が含まれる。

タンパク質キナーゼは、これに限定されるものではないが、たとえばタンパク質チロシンキナーゼファミリー(PTK)のメンバーを含み、これはさらに細胞質PTK、および受容体PTK(RTK)に分類することができる。細胞質PTKには、SRCファミリー(BLK、FGR、FYN、HCK、LCK、LYN、SRC、YES、およびYRKを含む)、BRKファミリー(BRK、FRK、SAD、およびSRMを含む)、CSKファミリー(CSKおよびCTKを含む)、BTKファミリー(BTK、ITK、TEC、MKK2、およびTXKを含む)、Janusキナーゼファミリー(JAKI、JAK2、JAK3、およびTyk2を含む)、FAKファミリー(FAKおよびPYK2を含む)、Fesファミリー(FESおよびFERを含む)、ZAP70ファミリー(ZAP70およびSYKを含む)、ACKファミリー(ACK1およびACK2を含む)、ならびにAblファミリー(ABLおよびARGを含む)が含まれる。RTKファミリーには、EGF受容体ファミリー(EGFRHER2、HER3、およびHER4を含む)、インスリン受容体ファミリー(INS-RおよびIGF1-Rを含む)、PDGF受容体ファミリー(PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、KIT、FLK2を含む)、VEGF受容体ファミリー(FLT1、FLK1、およびFLT4を含む)、FGF受容体ファミリー(FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4を含む)、CCK4ファミリー(CCK4を含む)、METファミリー(METおよびRONを含む)、TRKファミリー(TRKA、TRKB、およびTRKCを含む)、AXLファミリー(AXL、MER、およびSKYを含む)、TIE/TEKファミリー(TIEおよびTIE2/TEKファミリーを含む)、EPHファミリー(EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6を含む)、RYKファミリー(RYKを含む)、MCKファミリー(MCKおよびTYRO10を含む)、ROSファミリー(ROSを含む)、RETファミリー(RETを含む)、LTKファミリー(LTKおよびALKを含む)、RORファミリー(ROR1およびROR2を含む)、Muskファミリー(Muskを含む)、LMRファミリー(LMR1、LMR2、およびLMR3を含む)、ならびにSuRTK106ファミリー(SuRTK106を含む)が含まれる。

同様に、セリン/トレオニン特異的キナーゼは、いくつかの異なるサブファミリーを含み、サブファミリーには、細胞外シグナル制御キナーゼ(p42/ERK2およびp44/ERK1)、c-Jun NH2末端キナーゼ(JNK)、cAMP反応エレメント結合タンパク質キナーゼ(CREBK)、cAMP依存性キナーゼ(CAPK)、マイトジェン活性タンパク質キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ(MAPKおよびその関連物質)、ストレス活性化タンパク質キナーゼp38/SAPK2、マイトジェンおよびストレス活性化キナーゼ(MSK)、タンパク質キナーゼ、特にPKA、PKB、およびPKCが含まれる。

さらに、いくつかの病原体ゲノムは、タンパク質キナーゼをコードする遺伝子を有する。たとえば、マラリア原虫Plasmodium falciparum、ならびにHPVおよび肝炎ウイルスなどのウイルスは、キナーゼ関連遺伝子を有すると考えられる。

タンパク質キナーゼの不適切に高い活性は、異常な細胞機能に起因する多くの疾患に関係があるとされている。これは、たとえば酵素の変異、過剰発現、または不適切な活性化に関連するキナーゼの適切な制御機構不全によって、あるいはキナーゼの上流または下流のシグナル伝達にも関与するサイトカインまたは成長因子の過剰または過少産生によって、直接または間接的に生じる可能性がある。これらのすべての例において、キナーゼ作用の選択的阻害が有益な効果を有することが予期され得る。異常なキナーゼ活性が関係しているとされている疾患には、糖尿病再狭窄アテローム性動脈硬化症肝臓および腎臓線維症眼疾患骨髄増殖性およびリンパ増殖性疾患前立腺癌結腸癌乳癌頭頸部癌白血病、およびリンパ腫などの癌、ならびにアトピー性皮膚炎喘息関節リウマチクローン病乾癬クルゾン症候群軟骨形成不全症、および致死性異形成などの自己免疫疾患が含まれる。

タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)のJAKファミリーは、免疫系のいくつかの重要な細胞型の増殖および最終機能のサイトカイン依存性調節において中心的役割を果たす。

現在知られている哺乳動物JAKファミリーの4種のメンバーを直接比較することによって、高度に保存された7つのドメインの存在が明らかとなる(Harpur他、1992)。このPTKファミリーに特徴的な高度に保存されたドメインの命名の探索において、用いた分類はSRC相同(SH)ドメインの処理におけるPawson等のアプローチ(Sadovski等、1986)に従った。これらのドメインは、JAK相同ドメイン1(JH1)と称される最もC末端側の相同ドメインに従って列挙されている。JH1の次のN末端側ドメインは、キナーゼ関連ドメインであり、本明細書ではJH2ドメインと称する。次いで各ドメインは、N末端に位置するJH7まで列挙される。これらのJAK相同(JH)ドメインの高い保存性は、それらのタンパク質が機能する細胞プロセスにおいて、それぞれのドメインが重要な役割を果たす可能性の高いことを示唆している。しかしながら、JAK相同ドメインの境界は任意であり、機能ドメインを規定することもあるが、規定しないこともある。それでもなお、それらの解明は、この種のタンパク質の全体的な構造上の類似性を考慮する一助となる有用な方策である。

PTKのJAKファミリーに最も特徴的な性質は、2つのキナーゼ関連ドメイン(JH1およびJH2)を有することである(Wilks等、1991)。このJAK1の推定PTKドメイン(JH1)はPTKドメインに典型的な高度に保存されたモチーフを含有し、チロシン特異的タンパク質キナーゼ種のメンバーであることの判断材料であると考えられる、サブドメインVIIの11残基C末端側に位置する1022位におけるチロシン残基の存在が含まれる。ヒトJAK1PTKドメイン(255アミノ酸)をPTK種タンパク質の他のメンバーとアラインメントすることによって、他の機能性タンパク質PTKとの相同性が明らかとなった(たとえば、c-fesと28%同一(WilksおよびKurban、1988)、TRKと37%相同(Kozma等、1988))。各JAKファミリーメンバーのJH1ドメインは、活性部位の近くに位置し、基質特異性を規定すると考えられている高度に保存されたサブドメインVIIIモチーフ(JAK2の残基1015から1027)に興味深い特質を有する。このモチーフの保存されたトリプトファンに隣接するフェニルアラニンおよびチロシン残基は、PTKのJAKファミリーに固有のものである。この要素を除いて、JAKファミリーの各メンバーのJH1ドメインは典型的なPTKドメインである。その上、JAKファミリーには、特にATP結合部位やその周辺に高度な配列同一性が存在する(図1)。

いくつかの重要な細胞型の増殖および最終機能のサイトカイン依存性調節において、タンパク質チロシンキナーゼのJAKファミリーが中心的役割を果たすということは、JAKを阻害する薬剤が、それらの酵素に依存する疾患状態の予防および化学療法に有用であることを意味する。現在知られているJAKファミリーの4種の各メンバーの有効かつ特異的な阻害剤は、喘息、およびとりわけ、臓器移植狼瘡多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、I型糖尿病および糖尿病による合併症、癌、アトピー性皮膚炎、自己免疫甲状腺障害潰瘍性大腸炎、クローン病、アルツハイマー病、白血病/リンパ腫などの免疫疾患推進するサイトカインの作用を阻害する手段を提供することになる。

JAK/STAT経路
近年、非タンパク質チロシンキナーゼサイトカイン受容体の下流で特に優れたシグナル伝達経路が明らかにされた。この経路の主要な構成要素は、(i)インターロイキン-4受容体またはインターフェロンγ受容体などのサイトカイン受容体鎖(または複数の鎖)、(ii)PTKのJAKファミリーのメンバー(または複数のメンバー)、(iii)転写因子のSTATファミリーのメンバー(または複数のメンバー)、および(iv)活性化STATが結合する配列特異的DNAエレメントである。

JAK/STATに関する文献の概観は、ウイルスおよび細菌感染などの外界からの刺激に対する宿主免疫応答の増大および先導においてこの経路が重要であるという考えを強く支持するものである。表1および表2にそれを十分に例示する。遺伝子ノックアウト実験によって蓄積された情報は、いくつかの重要な免疫調節サイトカインによって誘発される細胞内シグナル伝達におけるJAKファミリーメンバーの重要性を強調している。したがって、免疫調節の領域においてJAK/STAT経路の阻害(または増強)に由来する治療の可能性は高く、この分野の一連の疾患を治療するための有望な薬剤となることが考えられる。表1および表2に挙げた疾患に加えて、JAKの阻害剤は、臓器移植、ならびに狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、I型糖尿病、自己免疫甲状腺障害、アルツハイマー病、および他の自己免疫疾患などの自己免疫疾患の免疫抑制剤として用いることができる。さらに、JAK阻害剤による前立腺癌などの癌の治療も示唆されている。

Jak 3シグナル伝達
Jakファミリーの他のメンバーは、基本的にすべての組織によって発現するが、JAK3の発現は、造血性細胞に限定されているようである。これは、これら多鎖受容体に共通しているJAK3のガンマ鎖との非共有結合による会合によりIL-2、IL-4、IL-7、IL-9、およびIL-15の受容体を介してシグナル伝達するその基本的役割と一致している。X連鎖重症複合免疫不全(XSCID)の男性は、インターロイキン-2(IL-2)、IL-4、IL-7、IL-9、およびIL-15の受容体の共有の必須成分をコード化する共通のサイトカイン受容体ガンマ鎖(ガンマc)遺伝子に欠陥を有する。JAK3タンパク質のレベル突然変異したかまたは大幅に減少したかのいずれかである患者のXSCID症候群が確認されており、免疫抑制が、JAK3経路を通るシグナル伝達を遮断することに起因するに違いないことを示唆している。マウスにおいて遺伝子をノックアウトさせる研究により、JAK3は、BおよびTリンパ球成熟に重要な役割を果たすのみでなく、JAK3は、T細胞の機能を維持するために構造的に必要であることも示唆されている。IL-2およびIL-4の受容体の下流のシグナル伝達事象におけるJAK3の関与に対する生物化学的証拠とともに総合すれば、これらヒトおよびマウスの突然変異の研究により、JAK3の阻害による免疫活性の調節が、移植片拒絶反応および自己免疫疾患などのT細胞およびB細胞増殖障害の治療に有用であることを証明でき得ることが示唆される。

JAK3シグナル伝達の阻害による長期の免疫調節は、JAK3阻害が選択的に達成され、他のキナーゼ依存性シグナル伝達過程の阻害を伴わない限り治療の大きな可能性を有するはずである。特に、キナーゼのJAKファミリーのメンバーにより共通して保持されている高度の配列の独自性は、Jak3を阻害する化合物が、有害な長期間の影響によりファミリーの他のメンバーもまた阻害する可能性を高める。たとえば、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンの受容体は両方ともシグナル細胞内伝達にJAK2のみを使用するため、長期のJak2の阻害は、赤血球減少症および血小板減少症の原因となり得る。

選択的および不可逆性阻害
PTKは、リン酸基の、ATP分子からタンパク質基質上に位置するチロシン残基への移動を触媒する。当分野で知られている阻害剤は、通常、ATPまたはキナーゼのタンパク質基質と競合する(Levitzki 2000)。ATPの細胞中の濃度は、通常非常に高い(ミリモル単位)ため、ATPと競合する化合物は、前記化合物が細胞内でATPをその結合部位から移動させるために必要な濃度にはできそうでなく、インビボでの活性を欠くことになる。

EGFRに関して試みた別の取り組みは、不可逆挙動でEGFR TKに結合する化合物を設計または選択するものである。そのような化合物は、Pry1998、Discafani 1999 、Smaill 1999、Smaill 2000、Tsou 2001、Smaill 2001、Wissner 2003に開示されている。これらの化合物は、それらが酵素の活性部位に位置するアミノ酸残基共有結合を形成することができ、それが、その化合物のインビトロにおける高められた効能および癌のインビボモデルにおけるヒト腫瘍の増殖の抑制をもたらすという事実に基づく不可逆性阻害剤として機能する。上記不可逆性阻害剤の可逆性阻害剤と比較したときのさらなる利点は、不可逆性阻害剤は、通常速度の受容体のターンオーバーによってのみ制限される長期間のチロシンキナーゼの抑制に使用することができることである。

キナーゼのJAKファミリーのメンバー間の高度なホモロジーが、許容できる選択性を備えた化合物の設計を非常に挑戦的にしている。このファミリーのメンバー間のアミノ酸配列のわずかな違いを有効に利用することによって選択的阻害剤の同定を可能にするものと思われる。タンパク質チロシンキナーゼのJAKファミリーの4つのメンバーの配列比較により、これらキナーゼのATP結合ポケットを含むアミノ酸中に、1つまたは別のファミリーメンバーに向けた阻害薬を標的にするために使用することができるアミノ酸の違いは殆どないことは明らかである。興味深いことに、キナーゼのこのサブファミリーの中のJAK3だけが、ATP結合キャビティフロントリップ(the front lip of the ATP-binding cavity)の近くにシステイン残基を有している。このシステインマイケル受容体などのアルキル化基を持つ官能性により標的にすることによって、これは非常に特効的な不可逆性JAK3阻害剤(図2)を開発する手段を提供するかもしれないことを仮説として立てた。
WilksAF, Harpur AG, KurbanRR, Ralph SJ, Zurcher G, Ziemiecki A. (1991) Two novel protein-tyrosin kinase, each with a second phosphotransferase-related catalytic domain, define a new class of protein kinase. Mol Cell Biol. 11, 2057-65.
Levitzki A. (2000) Protein Tyrosine Kinase Inhibitors as Therapeutic Agents. Top. Curr. Chem. 211, 1-15.

概要

一般式(I)の化合物(式中、Aは、さまざまな6員の窒素含有複素環を表し、Qは、結合、ハロゲン、C1〜4アルキル、O、S、SO2、CO、またはCSであり、X1、X2、X3、およびX4は、9個の特定の置換基によって場合により置換されているかまたは1つが窒素であることができる)、または薬剤として許容されるそのプロドラッグ、塩、水和物、溶媒和物結晶形態、もしくはジアステレオマー担体および式(I)の化合物の少なくとも1つを含む組成物もまた提供される。さらに、式(I)の化合物を投与することによってチロシンキナーゼが関連する疾患状態を治療する方法、および式(I)の化合物を投与することによって対象の免疫システムを抑制する方法が提供される。

目的

PTKのJAKファミリーに最も特徴的な性質は、2つのキナーゼ関連ドメイン(JH1およびJH2)を有することである

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
3件

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請求項1

下記一般式Iの化合物、または薬剤として許容されるそのプロドラッグ、塩、水和物、溶媒和物結晶形態、またはジアステレオマー。[式中、X1、X2、X3、X4は、それぞれ、1つがZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であるか、またはX1、X2、X3、X4の1つがNであり、その他は1個の炭素がZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であり;Aは、(Dは、H、C1〜4アルキルハロゲンアミノから選択される)から選択される環であり;Qは、結合、ハロゲン、C1〜4アルキル、O、S、SO、SO2、CO、CSであり;Wは、(ii) NR1R2 (R1およびR2は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルCF3、アリールヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C2〜6アルケニルシクロヘタキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキルであるか、またはR1およびR2は、一緒になってO、S、NR3から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成しており、R3は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、COR4から選択され、R4は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリールから選択される)、あるいは(ii) H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C3〜8シクロアルキル、シクロヘタルキル、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキル、であり;Yは、H、ハロゲン、CN、CF3、ニトロ、OH、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR5R6、C1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキル、OC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、OC1〜4アルキルNR5R6、OC1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキルシクロヘタルキル、SC1〜4アルキル、SC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、SC1〜4アルキルNR5R6、NR5R6、NR5COR6、NR5SO2R6であり、R5およびR6は、それぞれ独立に、H、C1〜4アルキルであるか、または一緒になってO、S、NR7から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜6員環を形成していてもよく、R7は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリールから選択され;Zは、から選択され;R8は、H、C1〜4アルキルから選択され;R9およびR10は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR12R13、C1〜4アルキルOR12、C1〜4アルキルヘタリールから選択されるか、または一緒になってO、S、SO、SO2、NR14から選択される原子を場合により含有する5〜8員環を形成していてもよく;R11は、OH、OC1〜4アルキル、NR12R13から選択され;nは、0〜4であり;R12およびR13は、独立に、H、C1〜4アルキルから選択されるか、または一緒になってO、S、NR14から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成していてもよく;R14は、H、C1〜4アルキルから選択される]

請求項2

式Iの前記化合物が下記式IIの化合物である請求項1に記載の化合物、または薬剤として許容されるそのプロドラッグ、塩、水和物、溶媒和物、結晶形態、またはジアステレオマー。[式中、X1、X2、X3、X4は、それぞれ、1つがZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であるか、またはX1、X2、X3、X4の1つがNであり、その他は1個の炭素がZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であり;Aは、(Dは、H、C1〜4アルキル、ハロゲン、アミノから選択される)から選択される環であり;Qは、結合、ハロゲン、C1〜4アルキル、O、S、SO、SO2、CO、CSであり;Wは、(ii) NR1R2 (R1およびR2は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルCF3、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C2〜6アルケニル、シクロヘタルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキルであるか、またはR1およびR2は、一緒になってO、S、NR3から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成しており、R3は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、COR4から選択され、R4は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリールから選択される)、あるいは(ii) Wは、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C3〜8シクロアルキル、シクロヘタルキル、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキル、であり;Yは、H、ハロゲン、CN、CF3、ニトロ、OH、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR5R6、C1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキル、OC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、OC1〜4アルキルNR5R6、OC1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキルシクロヘタルキル、SC1〜4アルキル、SC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、SC1〜4アルキルNR5R6、NR5R6、NR5COR6、NR5SO2R6であり、R5およびR6は、それぞれ独立に、H、C1〜4アルキルであるか、または一緒になってO、S、NR7から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜6員環を形成していてもよく、R7は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリールから選択され;Zは、から選択され;R8は、H、C1〜4アルキルから選択され;R9およびR10は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR12R13、C1〜4アルキルOR12、C1〜4アルキルヘタリールから選択されるか、または一緒になってO、S、SO、SO2、NR14から選択される原子を場合により含有する5〜8員環を形成していてもよく;R11は、OH、OC1〜4アルキル、NR12R13から選択され;nは、0〜4であり;R12およびR13は、独立に、H、C1〜4アルキルから選択されるか、または一緒になってO、S、NR14から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成していてもよく;R14は、H、C1〜4アルキルから選択される]

請求項3

からなる群から選択された請求項1に記載の化合物。

請求項4

不可逆的にJAK-3を阻害する請求項1ないし3のいずれか一項に記載の化合物。

請求項5

JAK 1またはJAK 2よりもJAK 3を選択的に阻害する請求項1ないし4のいずれか一項に記載の化合物。

請求項6

担体および請求項1ないし5のいずれか一項に記載の少なくとも1種の化合物を含む組成物

請求項7

請求項1ないし5のいずれか一項に記載の少なくとも1種の化合物の治療有効量、または請求項6に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、チロシンキナーゼが関連する疾患状態を治療する方法。

請求項8

JAK3が関連する疾患状態を治療する薬剤の調製における請求項1ないし5のいずれか一項に記載の化合物または請求項6に記載の組成物の使用。

請求項9

請求項1ないし5のいずれか一項に記載の少なくとも1種の化合物の治療有効量、または請求項6に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、対象の免疫系を抑制する方法。

請求項10

官能基を含む選択的JAK3阻害剤であって、前記官能基が、JAK3のATP結合キャビティフロントリップの近くのシステイン残基(CYS909)と選択的に相互作用するように位置づけされており、それにより前記阻害剤がJAK2およびJAK1よりもJAK3に対して選択的である選択的JAK3阻害剤。

請求項11

前記官能基が、システイン残基と不可逆的に結合する請求項10に記載の選択的JAK3阻害剤。

請求項12

前記官能基が、アルキル化基である請求項10または請求項11に記載の選択的JAK3阻害剤。

請求項13

前記官能基が、マイケル受容体である請求項10ないし請求項12のいずれか一項に記載の選択的JAK3阻害剤。

技術分野

0001

本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、特にタンパク質チロシンキナーゼのJAKファミリーの阻害剤の分野に関する。

背景技術

0002

タンパク質キナーゼは、タンパク質の特定の残基のリン酸化触媒する酵素の一ファミリーである。一般にタンパク質キナーゼはいくつかのグループ分類され、セリンおよび/またはトレオニン残基優先的にリン酸化するグループ、チロシン残基を優先的にリン酸化するグループ、ならびにチロシンおよびSer/Thr残基の両方をリン酸化するグループである。したがってタンパク質キナーゼは、受容体でのサイトカイン作用を含む、核への細胞外シグナル伝達に関与するシグナル伝達経路の主要な要素であり、種々の生物学的事象を誘発する。正常な細胞生理におけるタンパク質キナーゼの多くの役割には、細胞周期の制御、ならびに細胞成長分化アポトーシス細胞移動性、および有糸分裂誘発が含まれる。

0003

タンパク質キナーゼは、これに限定されるものではないが、たとえばタンパク質チロシンキナーゼファミリー(PTK)のメンバーを含み、これはさらに細胞質PTK、および受容体PTK(RTK)に分類することができる。細胞質PTKには、SRCファミリー(BLK、FGR、FYN、HCK、LCK、LYN、SRC、YES、およびYRKを含む)、BRKファミリー(BRK、FRK、SAD、およびSRMを含む)、CSKファミリー(CSKおよびCTKを含む)、BTKファミリー(BTK、ITK、TEC、MKK2、およびTXKを含む)、Janusキナーゼファミリー(JAKI、JAK2、JAK3、およびTyk2を含む)、FAKファミリー(FAKおよびPYK2を含む)、Fesファミリー(FESおよびFERを含む)、ZAP70ファミリー(ZAP70およびSYKを含む)、ACKファミリー(ACK1およびACK2を含む)、ならびにAblファミリー(ABLおよびARGを含む)が含まれる。RTKファミリーには、EGF受容体ファミリー(EGFRHER2、HER3、およびHER4を含む)、インスリン受容体ファミリー(INS-RおよびIGF1-Rを含む)、PDGF受容体ファミリー(PDGFRα、PDGFRβ、CSF1R、KIT、FLK2を含む)、VEGF受容体ファミリー(FLT1、FLK1、およびFLT4を含む)、FGF受容体ファミリー(FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4を含む)、CCK4ファミリー(CCK4を含む)、METファミリー(METおよびRONを含む)、TRKファミリー(TRKA、TRKB、およびTRKCを含む)、AXLファミリー(AXL、MER、およびSKYを含む)、TIE/TEKファミリー(TIEおよびTIE2/TEKファミリーを含む)、EPHファミリー(EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6を含む)、RYKファミリー(RYKを含む)、MCKファミリー(MCKおよびTYRO10を含む)、ROSファミリー(ROSを含む)、RETファミリー(RETを含む)、LTKファミリー(LTKおよびALKを含む)、RORファミリー(ROR1およびROR2を含む)、Muskファミリー(Muskを含む)、LMRファミリー(LMR1、LMR2、およびLMR3を含む)、ならびにSuRTK106ファミリー(SuRTK106を含む)が含まれる。

0004

同様に、セリン/トレオニン特異的キナーゼは、いくつかの異なるサブファミリーを含み、サブファミリーには、細胞外シグナル制御キナーゼ(p42/ERK2およびp44/ERK1)、c-Jun NH2末端キナーゼ(JNK)、cAMP反応エレメント結合タンパク質キナーゼ(CREBK)、cAMP依存性キナーゼ(CAPK)、マイトジェン活性タンパク質キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ(MAPKおよびその関連物質)、ストレス活性化タンパク質キナーゼp38/SAPK2、マイトジェンおよびストレス活性化キナーゼ(MSK)、タンパク質キナーゼ、特にPKA、PKB、およびPKCが含まれる。

0005

さらに、いくつかの病原体ゲノムは、タンパク質キナーゼをコードする遺伝子を有する。たとえば、マラリア原虫Plasmodium falciparum、ならびにHPVおよび肝炎ウイルスなどのウイルスは、キナーゼ関連遺伝子を有すると考えられる。

0006

タンパク質キナーゼの不適切に高い活性は、異常な細胞機能に起因する多くの疾患に関係があるとされている。これは、たとえば酵素の変異、過剰発現、または不適切な活性化に関連するキナーゼの適切な制御機構不全によって、あるいはキナーゼの上流または下流のシグナル伝達にも関与するサイトカインまたは成長因子の過剰または過少産生によって、直接または間接的に生じる可能性がある。これらのすべての例において、キナーゼ作用の選択的阻害が有益な効果を有することが予期され得る。異常なキナーゼ活性が関係しているとされている疾患には、糖尿病再狭窄アテローム性動脈硬化症肝臓および腎臓線維症眼疾患骨髄増殖性およびリンパ増殖性疾患前立腺癌結腸癌乳癌頭頸部癌白血病、およびリンパ腫などの癌、ならびにアトピー性皮膚炎喘息関節リウマチクローン病乾癬クルゾン症候群軟骨形成不全症、および致死性異形成などの自己免疫疾患が含まれる。

0007

タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)のJAKファミリーは、免疫系のいくつかの重要な細胞型の増殖および最終機能のサイトカイン依存性調節において中心的役割を果たす。

0008

現在知られている哺乳動物JAKファミリーの4種のメンバーを直接比較することによって、高度に保存された7つのドメインの存在が明らかとなる(Harpur他、1992)。このPTKファミリーに特徴的な高度に保存されたドメインの命名の探索において、用いた分類はSRC相同(SH)ドメインの処理におけるPawson等のアプローチ(Sadovski等、1986)に従った。これらのドメインは、JAK相同ドメイン1(JH1)と称される最もC末端側の相同ドメインに従って列挙されている。JH1の次のN末端側ドメインは、キナーゼ関連ドメインであり、本明細書ではJH2ドメインと称する。次いで各ドメインは、N末端に位置するJH7まで列挙される。これらのJAK相同(JH)ドメインの高い保存性は、それらのタンパク質が機能する細胞プロセスにおいて、それぞれのドメインが重要な役割を果たす可能性の高いことを示唆している。しかしながら、JAK相同ドメインの境界は任意であり、機能ドメインを規定することもあるが、規定しないこともある。それでもなお、それらの解明は、この種のタンパク質の全体的な構造上の類似性を考慮する一助となる有用な方策である。

0009

PTKのJAKファミリーに最も特徴的な性質は、2つのキナーゼ関連ドメイン(JH1およびJH2)を有することである(Wilks等、1991)。このJAK1の推定PTKドメイン(JH1)はPTKドメインに典型的な高度に保存されたモチーフを含有し、チロシン特異的タンパク質キナーゼ種のメンバーであることの判断材料であると考えられる、サブドメインVIIの11残基C末端側に位置する1022位におけるチロシン残基の存在が含まれる。ヒトJAK1PTKドメイン(255アミノ酸)をPTK種タンパク質の他のメンバーとアラインメントすることによって、他の機能性タンパク質PTKとの相同性が明らかとなった(たとえば、c-fesと28%同一(WilksおよびKurban、1988)、TRKと37%相同(Kozma等、1988))。各JAKファミリーメンバーのJH1ドメインは、活性部位の近くに位置し、基質特異性を規定すると考えられている高度に保存されたサブドメインVIIIモチーフ(JAK2の残基1015から1027)に興味深い特質を有する。このモチーフの保存されたトリプトファンに隣接するフェニルアラニンおよびチロシン残基は、PTKのJAKファミリーに固有のものである。この要素を除いて、JAKファミリーの各メンバーのJH1ドメインは典型的なPTKドメインである。その上、JAKファミリーには、特にATP結合部位やその周辺に高度な配列同一性が存在する(図1)。

0010

いくつかの重要な細胞型の増殖および最終機能のサイトカイン依存性調節において、タンパク質チロシンキナーゼのJAKファミリーが中心的役割を果たすということは、JAKを阻害する薬剤が、それらの酵素に依存する疾患状態の予防および化学療法に有用であることを意味する。現在知られているJAKファミリーの4種の各メンバーの有効かつ特異的な阻害剤は、喘息、およびとりわけ、臓器移植狼瘡多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、I型糖尿病および糖尿病による合併症、癌、アトピー性皮膚炎、自己免疫甲状腺障害潰瘍性大腸炎、クローン病、アルツハイマー病、白血病/リンパ腫などの免疫疾患推進するサイトカインの作用を阻害する手段を提供することになる。

0011

JAK/STAT経路
近年、非タンパク質チロシンキナーゼサイトカイン受容体の下流で特に優れたシグナル伝達経路が明らかにされた。この経路の主要な構成要素は、(i)インターロイキン-4受容体またはインターフェロンγ受容体などのサイトカイン受容体鎖(または複数の鎖)、(ii)PTKのJAKファミリーのメンバー(または複数のメンバー)、(iii)転写因子のSTATファミリーのメンバー(または複数のメンバー)、および(iv)活性化STATが結合する配列特異的DNAエレメントである。

0012

JAK/STATに関する文献の概観は、ウイルスおよび細菌感染などの外界からの刺激に対する宿主免疫応答の増大および先導においてこの経路が重要であるという考えを強く支持するものである。表1および表2にそれを十分に例示する。遺伝子ノックアウト実験によって蓄積された情報は、いくつかの重要な免疫調節サイトカインによって誘発される細胞内シグナル伝達におけるJAKファミリーメンバーの重要性を強調している。したがって、免疫調節の領域においてJAK/STAT経路の阻害(または増強)に由来する治療の可能性は高く、この分野の一連の疾患を治療するための有望な薬剤となることが考えられる。表1および表2に挙げた疾患に加えて、JAKの阻害剤は、臓器移植、ならびに狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、I型糖尿病、自己免疫甲状腺障害、アルツハイマー病、および他の自己免疫疾患などの自己免疫疾患の免疫抑制剤として用いることができる。さらに、JAK阻害剤による前立腺癌などの癌の治療も示唆されている。

0013

0014

0015

Jak 3シグナル伝達
Jakファミリーの他のメンバーは、基本的にすべての組織によって発現するが、JAK3の発現は、造血性細胞に限定されているようである。これは、これら多鎖受容体に共通しているJAK3のガンマ鎖との非共有結合による会合によりIL-2、IL-4、IL-7、IL-9、およびIL-15の受容体を介してシグナル伝達するその基本的役割と一致している。X連鎖重症複合免疫不全(XSCID)の男性は、インターロイキン-2(IL-2)、IL-4、IL-7、IL-9、およびIL-15の受容体の共有の必須成分をコード化する共通のサイトカイン受容体ガンマ鎖(ガンマc)遺伝子に欠陥を有する。JAK3タンパク質のレベル突然変異したかまたは大幅に減少したかのいずれかである患者のXSCID症候群が確認されており、免疫抑制が、JAK3経路を通るシグナル伝達を遮断することに起因するに違いないことを示唆している。マウスにおいて遺伝子をノックアウトさせる研究により、JAK3は、BおよびTリンパ球成熟に重要な役割を果たすのみでなく、JAK3は、T細胞の機能を維持するために構造的に必要であることも示唆されている。IL-2およびIL-4の受容体の下流のシグナル伝達事象におけるJAK3の関与に対する生物化学的証拠とともに総合すれば、これらヒトおよびマウスの突然変異の研究により、JAK3の阻害による免疫活性の調節が、移植片拒絶反応および自己免疫疾患などのT細胞およびB細胞増殖障害の治療に有用であることを証明でき得ることが示唆される。

0016

JAK3シグナル伝達の阻害による長期の免疫調節は、JAK3阻害が選択的に達成され、他のキナーゼ依存性シグナル伝達過程の阻害を伴わない限り治療の大きな可能性を有するはずである。特に、キナーゼのJAKファミリーのメンバーにより共通して保持されている高度の配列の独自性は、Jak3を阻害する化合物が、有害な長期間の影響によりファミリーの他のメンバーもまた阻害する可能性を高める。たとえば、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンの受容体は両方ともシグナル細胞内伝達にJAK2のみを使用するため、長期のJak2の阻害は、赤血球減少症および血小板減少症の原因となり得る。

0017

選択的および不可逆性阻害
PTKは、リン酸基の、ATP分子からタンパク質基質上に位置するチロシン残基への移動を触媒する。当分野で知られている阻害剤は、通常、ATPまたはキナーゼのタンパク質基質と競合する(Levitzki 2000)。ATPの細胞中の濃度は、通常非常に高い(ミリモル単位)ため、ATPと競合する化合物は、前記化合物が細胞内でATPをその結合部位から移動させるために必要な濃度にはできそうでなく、インビボでの活性を欠くことになる。

0018

EGFRに関して試みた別の取り組みは、不可逆挙動でEGFR TKに結合する化合物を設計または選択するものである。そのような化合物は、Pry1998、Discafani 1999 、Smaill 1999、Smaill 2000、Tsou 2001、Smaill 2001、Wissner 2003に開示されている。これらの化合物は、それらが酵素の活性部位に位置するアミノ酸残基共有結合を形成することができ、それが、その化合物のインビトロにおける高められた効能および癌のインビボモデルにおけるヒト腫瘍の増殖の抑制をもたらすという事実に基づく不可逆性阻害剤として機能する。上記不可逆性阻害剤の可逆性阻害剤と比較したときのさらなる利点は、不可逆性阻害剤は、通常速度の受容体のターンオーバーによってのみ制限される長期間のチロシンキナーゼの抑制に使用することができることである。

0019

キナーゼのJAKファミリーのメンバー間の高度なホモロジーが、許容できる選択性を備えた化合物の設計を非常に挑戦的にしている。このファミリーのメンバー間のアミノ酸配列のわずかな違いを有効に利用することによって選択的阻害剤の同定を可能にするものと思われる。タンパク質チロシンキナーゼのJAKファミリーの4つのメンバーの配列比較により、これらキナーゼのATP結合ポケットを含むアミノ酸中に、1つまたは別のファミリーメンバーに向けた阻害薬を標的にするために使用することができるアミノ酸の違いは殆どないことは明らかである。興味深いことに、キナーゼのこのサブファミリーの中のJAK3だけが、ATP結合キャビティフロントリップ(the front lip of the ATP-binding cavity)の近くにシステイン残基を有している。このシステインマイケル受容体などのアルキル化基を持つ官能性により標的にすることによって、これは非常に特効的な不可逆性JAK3阻害剤(図2)を開発する手段を提供するかもしれないことを仮説として立てた。
WilksAF, Harpur AG, KurbanRR, Ralph SJ, Zurcher G, Ziemiecki A. (1991) Two novel protein-tyrosin kinase, each with a second phosphotransferase-related catalytic domain, define a new class of protein kinase. Mol Cell Biol. 11, 2057-65.
Levitzki A. (2000) Protein Tyrosine Kinase Inhibitors as Therapeutic Agents. Top. Curr. Chem. 211, 1-15.

発明が解決しようとする課題

0020

本発明者らは、マイケル受容体などのアルキル化基を含む2基置換複素環骨格に基づく化合物群が、酵素ヤヌスキナーゼ3の不可逆性および選択的阻害剤であり、免疫抑制剤として、臓器移植、狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、I型糖尿病および糖尿病合併症、喘息、アトピー性皮膚炎、自己免疫甲状腺障害、潰瘍性大腸炎、クローン病、ならびに免疫抑制が望ましいその他の徴候の治療における応用が考えられることを見出した。さらに、これらの化合物は、JAK3が活性化過剰である白血病およびリンパ腫などの増殖性疾患および癌ならびにアルツハイマー病などの疾患の治療における用途を見出すこともできるものと考えられる。

課題を解決するための手段

0021

それに沿って、本発明の第1の態様においては、下記の一般式Iの化合物、または薬剤として許容されるそのプロドラッグ、塩、水和物、溶媒和物結晶形態、またはジアステレオマーを提供する。

0022

0023

[式中、
X1、X2、X3、X4は、それぞれ、1つがZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であるか、またはX1、X2、X3、X4の1つがNであり、その他は1個の炭素がZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であり;
Aは、

0024

0025

(Dは、H、C1〜4アルキルハロゲンアミノから選択される)
から選択される環であり;
Qは、結合、ハロゲン、C1〜4アルキル、O、S、SO、SO2、CO、CSであり;
Wは、
(i) NR1R2 (R1およびR2は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルCF3、アリールヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C2〜6アルケニルシクロヘタキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキルであるか、またはR1およびR2は、一緒になってO、S、NR3から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成しており、R3は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、COR4から選択され、R4は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリールから選択される)、
あるいは
(ii) H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C3〜8シクロアルキル、シクロヘタルキル、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキル、
であり;
Yは、H、ハロゲン、CN、CF3、ニトロ、OH、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR5R6、C1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキル、OC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、OC1〜4アルキルNR5R6、OC1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキルシクロヘタルキル、SC1〜4アルキル、SC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、SC1〜4アルキルNR5R6、NR5R6、NR5COR6、NR5SO2R6であり、R5およびR6は、それぞれ独立に、H、C1〜4アルキルであるか、または一緒になってO、S、NR7から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜6員環を形成していてもよく、R7は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリールから選択され;
Zは、

0026

0027

から選択され;
R8は、H、C1〜4アルキルから選択され;
R9およびR10は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR12R13、C1〜4アルキルOR12、C1〜4アルキルヘタリールから選択されるか、または一緒になってO、S、SO、SO2、NR14から選択される原子を場合により含有する5〜8員環を形成していてもよく;
R11は、OH、OC1〜4アルキル、NR12R13から選択され;
nは、0〜4であり;
R12およびR13は、独立に、H、C1〜4アルキルから選択されるか、または一緒になってO、S、NR14から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成していてもよく;R14は、H、C1〜4アルキルから選択される]

0028

第2の態様において、本発明は、担体および本発明の第1の態様の少なくとも1種の化合物を含む組成物に存する。

0029

第3の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の少なくとも1種の化合物の治療有効量または本発明の第2の態様の組成物の治療有効量を投与することを含む、チロシンキナーゼが関連する疾患状態を治療する方法に存する。

0030

さらなる態様において、本発明は、JAK3が関連する疾患状態を治療する薬剤の調製における第1の態様の化合物または第2の態様の組成物の使用を提供する。

0031

なおさらなる態様において、本発明は、本発明の第1の態様の少なくとも1種の化合物の治療有効量または本発明の第2の態様の組成物の治療有効量を投与することを含む、対象の免疫系を抑制する方法を提供する。

発明を実施するための最良の形態

0032

それに沿って、本発明の第1の態様においては、下記の一般式Iの化合物、または薬剤として許容されるそのプロドラッグ、塩、水和物、溶媒和物、結晶形態、またはジアステレオマーを提供する。

0033

0034

[式中、
X1、X2、X3、X4は、それぞれ、1つがZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であるか、またはX1、X2、X3、X4の1つがNであり、その他は1個の炭素がZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であり;
Aは、

0035

0036

(Dは、H、C1〜4アルキル、ハロゲン、アミノから選択される)
から選択される環であり;
Qは、結合、ハロゲン、C1〜4アルキル、O、S、SO、SO2、CO、CSであり;
Wは、
(i) NR1R2 (R1およびR2は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルCF3、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C2〜6アルケニル、シクロヘタルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキルであるか、またはR1およびR2は、一緒になってO、S、NR3から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成しており、R3は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、COR4から選択され、R4は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリールから選択される)、
あるいは
(ii) H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C3〜8シクロアルキル、シクロヘタルキル、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキル、
であり;
Yは、H、ハロゲン、CN、CF3、ニトロ、OH、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR5R6、C1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキル、OC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、OC1〜4アルキルNR5R6、OC1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキルシクロヘタルキル、SC1〜4アルキル、SC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、SC1〜4アルキルNR5R6、NR5R6、NR5COR6、NR5SO2R6であり、R5およびR6は、それぞれ独立に、H、C1〜4アルキルであるか、または一緒になってO、S、NR7から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜6員環を形成していてもよく、R7は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリールから選択され;
Zは、

0037

0038

から選択され;
R8は、H、C1〜4アルキルから選択され;
R9およびR10は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR12R13、C1〜4アルキルOR12、C1〜4アルキルヘタリールから選択されるか、または一緒になってO、S、SO、SO2、NR14から選択される原子を場合により含有する5〜8員環を形成していてもよく;
R11は、OH、OC1〜4アルキル、NR12R13から選択され;
nは、0〜4であり;
R12およびR13は、独立に、H、C1〜4アルキルから選択されるか、または一緒になってO、S、NR14から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成していてもよく;R14は、H、C1〜4アルキルから選択される]

0039

好ましい実施形態において、前記化合物は、下記の一般式IIの化合物、または薬剤として許容されるそのプロドラッグ、塩、水和物、溶媒和物、結晶形態、またはジアステレオマーから選択される。

0040

0041

[式中、
X1、X2、X3、X4は、それぞれ、1つがZで置換されていて残りが独立にYで置換されている炭素であるか、またはX1、X2、X3、X4の1つがNであり、その他は1個の炭素がZで置換されていて残りが独立にYで置換された炭素であり;
Aは、

0042

0043

(Dは、H、C1〜4アルキル、ハロゲン、アミノから選択される)
から選択される環であり;
Qは、結合、ハロゲン、C1〜4アルキル、O、S、SO、SO2、CO、CSであり;
Wは、
(i) NR1R2 (R1およびR2は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルCF3、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C2〜6アルケニル、シクロヘタルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキルであるか、またはR1およびR2は、一緒になってO、S、NR3から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成しており、R3は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、COR4から選択され、R4は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリールから選択される)、
あるいは
(ii) Wは、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C3〜8シクロアルキル、シクロヘタルキル、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリール、C3〜8シクロアルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキル、
であり;
Yは、H、ハロゲン、CN、CF3、ニトロ、OH、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR5R6、C1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキル、OC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、OC1〜4アルキルNR5R6、OC1〜4アルキルヘタリール、OC1〜4アルキルシクロヘタルキル、SC1〜4アルキル、SC2〜4アルキルOC1〜4アルキル、SC1〜4アルキルNR5R6、NR5R6、NR5COR6、NR5SO2R6であり、R5およびR6は、それぞれ独立に、H、C1〜4アルキルであるか、または一緒になってO、S、NR7から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜6員環を形成していてもよく、R7は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリールから選択され;
Zは、

0044

0045

から選択され;
R8は、H、C1〜4アルキルから選択され;
R9およびR10は、独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルNR12R13、C1〜4アルキルOR12、C1〜4アルキルヘタリールから選択されるか、または一緒になってO、S、SO、SO2、NR14から選択される原子を場合により含有する5〜8員環を形成していてもよく;
R11は、OH、OC1〜4アルキル、NR12R13から選択され;
nは、0〜4であり;
R12およびR13は、独立に、H、C1〜4アルキルから選択されるか、または一緒になってO、S、NR14から選択される原子を場合により含有する、場合により置換されている3〜8員環を形成していてもよく;R14は、H、C1〜4アルキルから選択される]

0046

上の記述において、以下の通り理解されよう:
C1〜4アルキルは、非置換または場合によって置換されている直鎖または枝分れアルキル鎖を意味する。
アリールは、非置換または場合によって置換されているフェニルまたはナフチルを意味する。
ヘタリールは、非置換または場合によって置換されているO、N、Sから選択された1種または複数のヘテロ原子を含有する5または6員環複素芳香族環を意味する。
シクロアルキルは、3〜8員の飽和環を意味する。
シクロヘタルキルは、O、S、NR15から選択された1〜3個のヘテロ原子を含有する3〜8員の飽和環を意味し、R15は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリールである。
置換基は、ハロゲン、C1〜4アルキル、CF3、CN、ニトロ、アリール、ヘタリール、OCF3、OC1〜4アルキル、OC2〜5アルキルNR16R17、Oアリール、Oヘタリール、CO2R16、CONR16R17、ニトロ、NR16R17、NR16COR17、NR16SO2R17から選択され、R16、R17は、それぞれ独立に、H、C1〜4アルキル、C1〜4アルキルシクロアルキル、C1〜4アルキルシクロヘタルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリールであるか、または結合しておりO、S、NR18から選択された原子を場合によって含有している場合によって置換されている3〜8員環を形成していてもよく、ここでR18は、H、C1〜4アルキル、アリール、ヘタリール、C1〜4アルキルアリール、C1〜4アルキルヘタリールから選択される。

0047

式Iの化合物は、JAK3を不可逆的に阻害することができる。一般に、酵素の可逆的阻害剤の結合の強さは、阻害剤と酵素の活性部位の間の相互作用平衡定数の反映であるIC50値によって測定される。不可逆的阻害剤は、一旦その阻害剤が結合すると、活性部位を離れず、測定されるIC50は、それ故時間とともに良くなる(すなわち数値が減少する)ため、明白なIC50を示す。たとえば、実施例20の化合物は、酵素との20分のインキュション後(ATPの添加前)、〜40nMの「IC50」を示すのに対して、その「IC50」は、90分のプレインキュベーション後には7nMに低下する。

0048

式Iの化合物は、JAK1またはJAK2よりもJAK3を選択的に阻害することが好ましい。「選択的に阻害する」という語は、JAK3に対するその化合物の明白なIC50が、JAK1またはJAK2に対するIC50より10倍を超える低さ(すなわち、より有効)であることを意味するものと定義する。

0049

本発明の化合物には、すべての配座異性体(たとえば、シスおよびトランス異性体)が含まれる。本発明の化合物は不斉中心を有し、したがって、種々のエナンチオマーおよびジアステレオマー形態で存在する。本発明は、本発明の化合物のすべての光学異性体および立体異性体、ならびにそれらの混合物の使用に関し、さらにそれらを使用または含有することのできるすべての薬剤組成物および治療方法に関する。式Iの化合物は、互変異性体として存在することもできる。本発明は、そのようなすべての互変異性体、およびそれらの混合物の使用に関する。

0050

本発明はさらに、式Iの化合物のプロドラッグを含有する薬剤組成物を包含する。本発明はさらに、JAKなどのタンパク質キナーゼの阻害によって治療または予防することのできる障害を治療または予防する方法であって、式Iの化合物のプロドラッグを投与することを含む方法を包含する。遊離アミノ、アミドヒドロキシ、またはカルボキシル基を有する式Iの化合物は、プロドラッグに転換することができる。プロドラッグには、アミノ酸残基、または2個以上(たとえば2、3、または4個)のアミノ酸残基のポリペプチド鎖が、式Iの化合物の遊離アミノ、ヒドロキシ、およびカルボン酸基ペプチド結合を介して共有結合している化合物が含まれる。アミノ酸残基には、一般的に3文字記号で示される20種の天然アミノ酸が含まれ、さらに4-ヒドロキシプロリンヒドロキシリシンデモシン(demosine)、イソデモシン(isodemosine)、3-メチルヒスチジンノルブリン(norvlin)、ベータアラニンガンマアミノ酪酸シトルリンホモシステインホモセリンオルニチン、およびメチオニンスルホンが含まれる。プロドラッグにはさらに、カーボネートカルバメート、アミド、およびアルキルエステルが、カルボニル炭素プロドラッグ側鎖を介して上記の式Iの置換基に共有結合している化合物が含まれる。プロドラッグにはさらに、リン-酸素結合を介して式Iの化合物の遊離ヒドロキシルに結合している式Iの化合物のリン酸誘導体(酸、酸の塩、またはエステルなど)が含まれる。

0051

化合物がキラル中心を有する場合、その化合物は、精製した異性体としてまたは任意の割合の異性体の混合物として使用することができる。しかしながら、その混合物は、好ましい異性体を、少なくとも70%、80%、90%、95%、または99%含むことが好ましい。

0052

なおさらに好ましい実施形態において、前記化合物は、実施例に提示されている化合物から選択する。より好ましくは、前記化合物は、表3に提示されている化合物から選択する。

0053

第2の態様において、本発明は、担体、および本発明の第1の態様の少なくとも1種の化合物を含む組成物にある。

0054

第3の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の第1の態様の少なくとも1種の化合物、または治療有効量の本発明の第2の態様の組成物を投与することを含む、チロシンキナーゼ関連疾患状態を治療する方法にある。

0055

さらに好ましい態様において、疾患状態としては、JAK1、JAK2、JAK3、またはTYK2を含む。

0056

本発明の好ましい実施形態において、疾患状態は、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎(湿疹)、およびアレルギー性鼻炎などのアトピーアレルギー性接触皮膚炎および過敏性肺炎などの細胞媒介過敏症全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、若年性関節炎シェーグレン症候群強皮症多発性筋炎強直性脊椎炎乾癬性関節炎などのリウマチ病、I型糖尿病、自己免疫甲状腺障害、およびアルツハイマー病などの他の自己免疫疾患、エプスタインバーウイルス(EBV)、B型肝炎C型肝炎HIVHTLV1、水痘-帯状疱疹ウイルス(VZV)、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)などのウイルス疾患、白血病、リンパ腫、および前立腺癌などの癌からなる群から選択される。

0057

本明細書では、「チロシンキナーゼ関連疾患状態」という用語は、異常なチロシンキナーゼ活性、特にJAK活性に起因し、および/または1種または複数のそれらの酵素の阻害によって緩和される障害を指す。

0058

さらなる態様において、本発明は、JAK3関連疾患状態を治療するための薬剤の調製において記載した化合物の使用を提供する。

0059

なおさらなる態様において、本発明は、本発明の第1の態様の少なくとも1種の化合物の治療有効量または本発明の第2の態様の組成物の治療有効量を投与することを含む、対象の免疫系を抑制する方法を提供する。

0060

好ましくは、免疫系を抑制する方法は、狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、I型糖尿病および糖尿病による合併症、癌、喘息、アトピー性皮膚炎、自己免疫甲状腺障害、潰瘍性大腸炎、クローン病、およびアルツハイマー病から選択される疾患状態の治療に対するものである。

0061

好ましくは、免疫系を抑制する前記方法は、対象への移植に対応する免疫系を修正するものである。より好ましくは、その移植は、臓器移植または組織移植である。

0062

本発明は、JAK3関連障害を治療することのできる有効量の式IまたはIIの少なくとも1種の化合物、および薬剤として許容されるビヒクルまたは希釈剤を含む薬剤組成物を提供する。本発明の組成物は、以下に記載する他の治療剤を含有することができ、薬剤製剤の分野で良く知られているような技術に従って、たとえば通常の固体または液体ビヒクルまたは希釈剤、ならびに所望の投与形態に適した種類の薬剤添加剤(たとえば、賦形剤結合剤保存剤、安定剤、香味剤など)を用いて製剤化することができる。

0063

式IまたはIIの化合物は、たとえば錠剤カプセル剤顆粒剤、または粉剤などの形態で経口投与舌下投与腔内投与、皮下、静脈内、筋内、または槽内注射、あるいは注入技法などにより非経口投与(たとえば、無菌注入可能水性または非水性溶液または懸濁液として)、吸入スプレーなどにより経鼻投与クリームまたは軟膏などの形態で局所投与、あるいは坐剤などの形態で直腸投与などの任意の適切な手段によって、薬剤として許容される非毒性ビヒクルまたは希釈剤を含有する投与単位製剤で投与することができる。この化合物は、たとえば即時放出または持続放出に適した形態で投与することができる。即時放出または持続放出は、本発明の化合物を含む適切な薬剤組成物を用いて、あるいは特に持続放出の場合には、皮下インプラントまたは浸透圧ポンプなどの装置を用いて達成することができる。

0064

ヒトなどの霊長類に加えて、本発明の方法に従って他の種々の哺乳動物を治療することができる。たとえば、これに限定されるものではないが、雌ウシヒツジヤギウマイヌネコモルモットラット、あるいは他のウシ類、ヒツジ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類齧歯類、またはマウス類を含む哺乳動物を治療することができる。しかしながら、本方法は、鳥類(たとえば、ニワトリ)などの他の種で実施することもできる。

0065

炎症および感染に関連する疾患および状態を、本発明の方法を用いて治療することができる。好ましい実施形態において、この疾患または状態は、炎症応答を調節するために、好酸球および/またはリンパ球の作用が阻害または促進される疾患または状態である。

0066

上記方法で治療される、JAK3阻害が望まれる対象は、これに限定されるものではないが、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、あるいは他のウシ類、ヒツジ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類、齧歯類、またはマウス類を含む哺乳動物であり、好ましくはヒトの男性または女性である。

0067

「治療有効量」という用語は、研究者獣医師医師、または他の臨床医学者が求める、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘出する対象組成物の量を意味する。

0068

本明細書では、「組成物」という用語は、指定量の指定成分を含む生成物、ならびに指定量の指定成分の組合せから直接または間接的に得られる任意の生成物を包含するものである。「薬剤として許容される」とは、担体、希釈剤、または賦形剤が、製剤の他の成分と適合性であり、受容者に有害であってはならないことを意味する。

0069

化合物の「投与」および/または化合物を「投与する」という用語は、治療を必要とする個体に本発明の化合物を提供することを意味するものであると理解されるべきである。

0070

本発明の化合物を投与するための薬剤組成物は、好都合には投与単位形態で提供することができ、薬学分野で良く知られている任意の方法によって調製することができる。すべての方法は、1種または複数の補助成分を構成する担体と活性成分とを混合するステップを含む。一般に、この薬剤組成物は、活性成分を液体担体、または微細に分割された固体担体、あるいはその両方と均一かつ十分に混合し、その後、必要であれば所望の製剤に成形することによって調製される。薬剤組成物において、活性な対象化合物は、疾患の経過または状態に所望の効果を生じるのに十分な量で含まれる。本明細書では、「組成物」という用語は、指定量の指定成分を含む生成物、ならびに指定量の指定成分の組合せから直接または間接的に得られる任意の生成物を包含するものである。

0071

活性成分を含有する薬剤組成物は、たとえば錠剤、トローチ剤ロゼンジ剤、水性または油性懸濁剤分散性粉剤または顆粒剤、エマルション硬質または軟質カプセル剤、あるいはシロップ剤、またはエリキシル剤などの、経口使用に適した形態であることができる。経口で用いる組成物は、薬剤組成物を製造するために当分野で知られている任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、薬剤として外見が良く風味の良い製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤からなるグループから選択された1種または複数の薬剤を含有させることができる。錠剤は、錠剤の製造に適した薬剤として許容される非毒性賦形剤と混合した活性成分を含有する。それらの賦形剤は、たとえば炭酸カルシウム炭酸ナトリウム乳糖リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤コーンスターチまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤デンプンゼラチン、またはアカシアなどの結合剤、ならびにステアリン酸マグネシウムステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤であることができる。錠剤は被覆されていなくてもよく、あるいは消化管での崩壊および吸収を遅らせ、それによって長期間にわたる持続性作用を提供するために、既知の技法によって被覆されていてもよい。たとえば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。それらを被覆して、放出を制御する浸透性治療錠剤を形成することもできる。

0072

経口で用いるための製剤は、たとえば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンなどの不活性固体希釈剤と活性成分が混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、あるいは水、またはたとえば落花生油パラフィン油、またはオリーブ油などの油性媒体と活性成分が混合されている軟ゼラチンカプセル剤として提供することもできる。

0073

水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤と混合した活性材料を含有する。そのような賦形剤は、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウムメチルセルロースヒドロキシプロピルメチルセルロースアルギン酸ナトリウムポリビニルピロリドントラガカントゴムアカシアゴムなどの懸濁化剤であり、分散剤または湿潤剤は、たとえばレシチンなどの天然ホスファチド、またはアルキレンオキシド脂肪酸縮合生成物、たとえばステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシド長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、たとえばヘプタデカエチレンオキシセタノール、または脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなど、または脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、たとえばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであることができる。水性懸濁剤はさらに、1種または複数の保存剤、たとえばp-ヒドロキシ安息香酸エチルまたはn-プロピル、1種または複数の着色剤、1種または複数の香味剤、および1種または複数の甘味剤、たとえばショ糖またはサッカリンなどを含有することができる。

0074

油性懸濁剤は、たとえば落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油などの植物油、またはパラフィン油などの鉱油に活性成分を懸濁することによって製剤化することができる。油性懸濁剤は、たとえば蜜ロウ固形パラフィン、またはセチルアルコールなどの増粘剤を含有することができる。風味の良い経口製剤を提供するために、上記のような甘味剤、および香味剤を添加することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤を添加して保存することができる。

0075

水を添加して水性懸濁剤を調製するのに適した分散性粉剤および顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および1種または複数の保存剤と混合した活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤の例は、前に述べたものである。他の賦形剤、たとえば甘味剤、香味剤、および着色剤などを含むこともできる。

0076

本発明の薬剤組成物は、水中油型エマルションの形態であることもできる。油相は、オリーブ油または落花生油などの植物油、あるいはパラフィン油などの鉱油、あるいはそれらの混合物であることができる。適切な乳化剤は、アカシアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然ゴムダイズ、レシチンなどの天然ホスファチド、およびモノオレイン酸ソルビタンなどの脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導されるエステルまたは部分エステル、およびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどのエチレンオキシドと前記部分エステルの縮合生成物であることができる。エマルションはさらに、甘味剤および香味剤を含有することができる。

0077

シロップ剤およびエリキシル剤は、グリセロールプロピレングリコール、ソルビトール、またはショ糖などの甘味剤を用いて製剤化することができる。そのような製剤はさらに、粘滑剤、保存剤、香味剤、および着色剤を含むことができる。

0078

薬剤組成物は、注射可能な無菌水性または油性懸濁剤の形態であることができる。この懸濁剤は、前述の適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を用いて、当分野で知られている技術に従って製剤化することができる。注射可能な無菌製剤は、たとえば1,3-ブタンジオール溶液など、非経口として許容される非毒性希釈剤または溶媒の無菌注射可能溶液または懸濁液であることもできる。用いることのできる許容ビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌固定油も慣習的に溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無菌固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射可能剤の製剤に有用である。

0079

本発明の化合物は、薬剤を直腸投与するための坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、常温では固体であるが直腸温度では液体であるために、直腸融解して薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって調製できる。そのような材料は、カカオ脂およびポリエチレングリコールである。

0080

局所使用の場合、本発明の化合物を含有するクリーム、軟膏、ゼリー、溶液、または懸濁液などが用いられる(この適用に関して、局所適用には口腔洗浄剤および咽頭洗浄剤が含まれる)。

0081

本発明の化合物は、リポソームの形態で投与することもできる。当分野で知られている通り、リポソームは一般にリン脂質または他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体に分散された単層または多層水和液晶によって形成される。リポソームを形成することのできる、生理的に許容され代謝可能な任意の非毒性脂質を用いることができる。リポソーム形態の本発明の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤などを含有できる。好ましい脂質は、天然および合成のリン脂質およびホスファチジルコリンである。リポソームを形成する方法は当分野で知られている。

0082

本発明の薬剤組成物および方法はさらに、上記の疾患状態の治療に通常用いられる、本明細書に記載の他の治療上活性な化合物を含むことができる。併用療法に用いる適切な薬剤は、通常の薬学原理に従って、当業者によって選択されることができる。この治療剤の組合せは、相乗的に作用し、上記の種々の障害を治療または予防する可能性がある。このアプローチを用いることによって、各薬剤の用量を減らし、それにより副作用の可能性を低減しながら、治療効果を得られる可能性がある。

0083

他の治療剤の例には以下のものが含まれる。シクロスポリン(たとえば、シクロスポリンA)、CTLA4-Ig、抗体、たとえばICAM-3、抗IL-2受容体(抗Tac)、抗CD45RB、抗CD2、抗CD3(OKT-3)、抗CD4、抗CD80、抗CD86など、CD40とgp39の相互作用を遮断する薬剤、たとえばCD40および/またはgp39に特異的な抗体(すなわちCD154)、CD40およびgp39から構築された融合タンパク質(CD401gおよびCD8gp39)など、阻害剤、たとえばデオキシスパガリン(DSG)などのNF-カッパB機能の核転座阻害剤、HMGCoA還元酵素阻害剤(ロバスタチンおよびシンバスタチン)などのコレステロール生合成阻害剤イブプロフェンアスピリンアセトアミノフェンレフルノミド、デオキシスパガリン、アザチオプリンなどの非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、ロフェコキシブおよびセレコキシブなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤プレドニゾロンまたはデキサメタゾンなどのステロイド金化合物メトトレキサート、FK506(タクロリムス、プログラフ)、ミコフェノレートモフェチルなどの抗増殖剤、アザチオプリン、VP-16、エトポシドフルダラビンシスプラチン、およびシクロホスファミドなどの細胞傷害性剤、テニダップ、抗TNF抗体、または可溶性TNF受容体などのTNF-α阻害剤、およびラパマイシン(シロリムスまたはラパミューン)、あるいはそれらの誘導体である。

0084

本発明の化合物と組み合わせて他の治療剤が用いられるとき、それらの薬剤は、たとえばPhysician Desk Reference(PDR)に記載の量、または他の方法で当業者によって決定された量で用いることができる。

0085

タンパク質チロシンキナーゼの阻害を要する状態の治療または予防において、適切な用量レベルは一般に、1日当たり、患者の体重1kg当たり約0.01から500mgであり、これを単回または複数回で投与することができる。好ましくは、用量レベルは、約0.1から約250mg/kg/日、より好ましくは約0.5から約100mg/kg/日である。適切な用量レベルは、約0.01から250mg/kg/日、約0.05から100mg/kg/日、または約0.1から50mg/kg/日であることができる。この範囲内で、用量は、0.05から0.5、0.5から5、または5から50mg/kg/日であることができる。経口投与の場合、組成物は、好ましくは1.0から1000ミリグラムの活性成分を含有する錠剤、特に治療を受ける患者の症状に合わせて用量を調節するために1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0、および1000.0ミリグラムの活性成分を含有する錠剤の形態で提供される。化合物は、1日1回から4回、好ましくは1日1回または2回の投与計画で投与することができる。

0086

しかしながら、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルおよび投与頻度は一様でなく、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用期間、年齢、体重、全身健康状態性別食事、投与形態および時間、排出速度、併用薬剤、特定の状態の重篤度、および治療を受けている宿主を含む種々の要因によって決まるのは当然である。

0087

本発明の性質がより明確に理解されるように、本発明の好ましい形態を、以下の非限定の実施例を参照して説明する。

0088

(実施例)
材料および方法
化合物合成
一般式Iの化合物は、ジハロヘテロ環から一般に調製される。

0089

Qが、結合であり、Wがアミノであるとき、その合成は、モノアミノ-モノハロ中間体を発生する求核芳香族置換から始めることができる。

0090

求核芳香族置換は、一般的には、エタノールイソプロパノール、t-ブタノールジオキサン、THF、DMFトルエン、またはキシレンなどの溶媒中でジハロゲン化へテロ環アミンを付加することにより行われる。その反応は、一般的には、過剰のアミンまたは非求核性塩基たとえばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなど、あるいは無機塩基たとえば炭酸カリウムまたは炭酸ナトリウムなどの存在下、高温で行う。

0091

別法では、アミノ置換基は、遷移金属を触媒とするアミノ化反応により導入することができる。上記変換のための代表的な触媒としては、Pd(OAc)2/P(t-Bu)3、Pd2(dba)3/BINAPおよびPd(OAc)2/BINAPが挙げられる。これらの反応は、一般的には、トルエンまたはジオキサン等の溶媒中で炭酸セシウムまたはナトリウムもしくはカリウムt-ブトキシド等の塩基の存在下で室温から還流までの温度範囲で実施する。

0092

これらの化合物の合成の第1ステップで使用するアミンは、市販されているし、当業者に良く知られている方法を用いて調製することもできる。

0093

Qが結合であり、Wがアリール、ヘタリールまたはその他類似の炭素結合系であるとき、合成は、一般的には、ジハロヘテロ環と適当に官能化されているカップリングパートナーの間のクロスカップリング反応から始まる。代表的なカップリングパートナーは、ボロン酸またはエステル(鈴木カップリング:たとえばMiyauraおよびSuzuki 1995を参照)、スタンナン(スチルカップリング:たとえばStille 1988を参照)、グリニャール試薬(熊田カップリング:Kumada、TamaoおよびSumitani 1988)、または有機亜鉛化学種(根カップリング:Negishi 2002)である。鈴木カップリングが好ましいカップリング法であり、DME、THF、DMF、エタノール、プロパノール、トルエン、または1,4-ジオキサン等の溶媒中で、炭酸カリウム、水酸化リチウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウムフッ化カリウム、またはリン酸カリウム等の塩基の存在下で一般的には行う。その反応は、高温で実施することができ、採用するパラジウム触媒は、Pd(PPh3)4、Pd(OAc)2、[PdCl2(dppf)]、Pd2(dba)3/P(t-Bu)3から選択することができる。

0094

QがCOである場合、合成は、ハロ基を有する必須のヘタリールカルボン酸から始まる。その酸のアミド誘導体は、アミンを、ジクロロメタンテトラヒドロフラン、または1,4-ジオキサン等の溶媒中で、ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドジイソプロピルカルボジイミド、またはカルボニルジイミダゾール等のカップリング試薬を用いて、酸とカップリングすることによって容易に形成することができる。別法では、その酸は、当業者には良く知られている手順を用いて、塩化チオニル塩化オキサリル炭酸ビス(トリクロロメチル)、または塩化シアヌルを用いてそれぞれの酸塩化物に、あるいは、たとえばクロギ酸t-ブチルを用いて酸無水物化学種の混合物に変換することができる。その酸塩化物または酸無水物誘導体の混合物は、次に所望のアミンと、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、または酢酸エチル等の溶媒中で、好ましくは、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、または固相同等物等の塩基の存在下、室温または高温で反応させてそのアミドを生成することができる。その酸塩化物は、また、所望のアミドを生成させるために、好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または炭酸ナトリウム等の無機塩基が存在する水性条件下で必要なアミンと反応させることもできる。

0095

チオアミドは、当業者には良く知られている方法により上で形成されたアミドから調製することができ、トルエン等の溶媒中の高温での前記アミドのローソン試薬(Lawesson's reagent)との反応を含む。

0096

合成の第2ステップは、モノハロ中間体のベンゾイミダゾールまたはアザベンゾイミダゾールとの求核芳香族置換反応を含む。その反応は、一般的には、ベンゾイミダゾールまたはアザベンゾイミダゾールの塩を用いて、THF、DMF、DMA、NMP、トルエン、またはキシレン等の溶媒中で室温から還流温度で行う。ベンゾイミダゾールまたはアザベンゾイミダゾールの塩は、水素化ナトリウムまたは水素化カリウム等の金属水素化物との反応、あるいは炭酸セシウムとの反応により調製される。別法では、金属触媒によるカップリング反応を使用してベンゾイミダゾールまたはアザベンゾイミダゾール環を導入することができる。代表的な金属触媒としては、Pd(OAc)2/dppf、PdCl2/dppe、Pd2(OAc)2/P(t-Bu)3、(CuOTf)2・PhHが挙げられる。その反応は、炭酸セシウム、炭酸ルビジウム、炭酸カリウム、ナトリウムt-ブトキシド、またはリン酸カリウム等の塩基を用い、室温から還流までのキシレン、トルエン、またはDMF等の溶媒中で一般的には行う。相間移動試薬(たとえば臭化セトリモニウム)、または銅錯化剤(たとえばフェナントロリン)等の補助試薬もまたその反応で使用することができる。

0097

別法では、上で概説した反応順序は、上で概説した方法を用いるベンゾイミダゾールまたはアザベンゾイミダゾールのジハロヘテロ環へのカップリングから始めて、上で概説した手順を用いる第2の置換基の複素環核への導入を続けることにより逆にすることができる。

0098

一般式Iの化合物への別法の経路には、ベンゾイミダゾールまたはアザベンゾイミダゾールと有機金属試薬の間の銅が媒介する反応が含まれる(たとえばFinet、2002を参照)。好ましい有機金属試薬は、ボロン酸である。

0099

本発明の一般式Iの化合物中に存在するチオール反応性部分(置換基Zの一部として描かれている)は、上で説明した合成方法で使用した官能基に既に存在していてもよいし、合成手順最終段階で導入してもよい。たとえば、チオール反応性部分は、適当な酸とカップリングすることにより、遊離のヒドロキシルまたはアミノ置換基を有する化合物中に導入することができる。これは、一般的には、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、または1,4-ジオキサン等の溶媒中で、ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、またはカルボニルジイミダゾール等のカップリング試薬を用いて達成される。別法では、当業者には良く知られている手順を用いて、たとえばクロロギ酸t-ブチルを用いて形成された酸の、適当な酸無水物化学種の混合物、または適当な酸塩化物誘導体は、アミンまたはアルコール部分と、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、または酢酸エチル等の溶媒中で、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、または固相同等物等の塩基の存在下、室温または高温で反応させて所望の化合物を生成することができる。

0100

当業者は、場合によっては上記の反応が妥当収率および効率で進行するように、上で合成について説明した反応の順序は、ある特定の状況では変更するかもしれず、ある官能基は、誘導体化(すなわち保護する)することを必要とする場合があることは理解されよう。官能性を保護する様式は、当業者には良く知られており、たとえばGreene に記載されている(Greene、1999)。上記の反応順序により形成された生成物は、当業者には良く知られた技術を用いてさらに誘導体化することができる。

0101

典型的な合成を以下に記す。

0102

(実施例1)
6-クロロ-N-[(1R)-1-フェニルエチル]ピラジン-2-アミン

0103

0104

R-α-メチルベンジルアミン(0.57g、4.7mmol)および2,6-ジクロロピラジン(0.6388g、4.29mmol)のジオキサン(2.5mL)の溶液を、N2下で48時間加熱還流した。溶媒を除去し、生成物をトルエン-ヘキサンから結晶化した(0.82g、82%)。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.58 (d, J = 6.6Hz, 3H, CH3)、4.88 (m, 1H, CH)、5.07 (d, 1H, NH)、7.24〜7.36 (m, 5H, Ar-H)、7.61 (s, 1H, pyraz-H)、7.79 (s, 1H, pyraz-H)。

0105

(実施例2)
N-(t-ブチル)-6-クロロピラジン-2-アミン

0106

0107

t-ブチルアミン(14.9g、20mmol)、2,6-ジクロロピラジン(6.0g、40mmol)、ヒューニッヒ塩基(10mL)、およびエトキシエタノール(6mL)の混合物を、密封管中で、18時間130℃で加熱した。溶媒を真空で除去し、残留物をCH2Cl2(100mL)中に取り、濾過した。その濾液をH2O(2×20mL)、ブライン(20mL)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)した。CH2Cl2により溶離するクロマトグラフィーにより、白色固体の生成物(5.4g、72%)を分離した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.44 (s, 9H, CH3)、4.68 (br s, 1H, NH)、7.71 (s, 1H, pyraz-H)、7.72 (s, 1H, pyraz-H)。

0108

(実施例3)
6-クロロ-N-[(1R)-1-(3-メトキシフェニル)エチル]ピラジン-2-アミン

0109

0110

実施例1と類似の手順での、R-α-メチルベンジルアミン(1.0g、6.6mmol)および2,6-ジクロロピラジン(0.440g、2.95mmol)の反応により、生成物(517mg、67%)を提供した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.59 (d, J = 6.9Hz, 3H, CH3)、3.81 (s, 3H, OCH3)、4.87 (m, 1H, CH)、5.47 (br s, 1H, NH)、6.79〜7.30 (m, 4H, Ar-H)、7.66 (s, 1H, pyraz-H)、7.79 (s, 1H, pyraz-H)。

0111

(実施例4)
6-クロロ-N-フェニルピラジン-2-アミン

0112

0113

2,6-ジクロロピラジン(1g,6.7mmol)およびアニリン(1.25g,13.4mmol)のDIPEA(2.5mL、13.4mmol)を含有するエトキシエタノール(20mL)の溶液を、N2下で3日間加熱還流した。その溶液を、減圧下で濃縮し、残留物をEtOAc(50mL)に溶解し、H2O(50mL)、1MのHCl(2×50mL)、H2O(50mL)、およびブライン(50mL)で続けて洗浄した。乾燥(Na2SO4)後、溶媒を減圧下で除去し、残留物を、EtOAc-ヘキサン(20:80〜50:50)を用いて溶離するクロマトグラフにかけ、下の画分から純粋な生成物を分離した(230mg、17%)。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ6.62 (br s, 1H, NH)、7.11〜7.20 (m, 1H, ArH)、7.38 (br s, 2H, ArH)、7.40 (s, 2H, ArH)、7.98 (s, 1H, pyraz-H)、8.11 (s, 1H, pyraz-H)。

0114

(実施例5)
6-クロロ-N-[(1R)-1-(4-メチルフェニル)エチル]ピラジン-2-アミン

0115

0116

実施例1と類似の手順での、α-(R)-4-メジチルベンジルアミン(250mg、1.85mmol)および2,6-ジクロロピラジン(0.251g、1.67mmol)の反応により、生成物(199.5mg、48%)を提供した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.56 (d, 3H, J = 6.9Hz, CH3)、2.33 (s, 3H, CH3)、4.84 (m, 1H, CH)、5.05 (br s, 1H, NH)、7.15 (AA'XX', 2H, Ar-H)、7.24 (AA'XX', 2H, Ar-H)、7.60 (s, 1H, pyraz-H)、7.78 (s, 1H, pyraz-H)。

0117

(実施例6)
6-クロロ-N-(4-モルホリン-4-イルフェニル)ピラジン-2-アミン

0118

0119

実施例1と類似の手順での、4-モルホリノアニリン(2.15g、12.1mmol)および2,6-ジクロロピラジン(0.756g、5.03mmol)の反応により、生成物(0.54g、37%)を提供した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ3.25 (br s, 4H, CH2)、3.99 (br s, 4H, CH2)、7.05〜7.17 (m, 2H, ArH)、7.42〜7.54 (m, 2H, ArH)、7.94 (s, 1H, pyraz-H)、8.04 (s, 1H, pyraz-H)、8.06 (s, 1H, NH)。

0120

(実施例7)
6-クロロ-N-(2-フリルメチル)ピラジン-2-アミン

0121

0122

実施例1と類似の手順での、フルフリルアミンおよび2,6-ジクロロピラジンの反応により、生成物(98%)を提供した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ4.57 (d, J = 5.7Hz, 2H,NCH2)、5.01 (s, broad, 1H, NH)、6.30 (d, J = 3.3Hz, 1H,フラニル-H)、6.35〜6.33 (m, 2H, フラニル-H)、7.81 (s, 1H, pyraz.-H)、7.84 (s, 1H, pyraz.-H)。

0123

(実施例8)
6-クロロ-N-(ピリジン-3-イルメチル)ピラジン-2-アミン

0124

0125

キシレン(25ml)中の混合物、2,6-ジクロロピラジン(0.671mmol)および3-ピコリルアミン(2.014mmol)を、一晩還流させた。溶媒蒸発後得られた残留物を、CH2Cl2(100ml)と水(100ml)の中に懸濁させた。有機層を分離し、水層をCH2Cl2(3×50ml)で抽出した。一緒にした有機抽出液をブライン(1×100ml)で洗浄し、乾燥して(Na2SO4)、溶媒を真空で除去した。その残留物を、次に、ヘキサン:酢酸エチル勾配混合物により溶離するカラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物を提供した(93%)。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ4.61(d, J = 5.7Hz, 2H,NCH2)、5.29 (s, broad, 1H, NH)、7.27 (m, 1H, pyrid.-H)、7.30 (m, 1H, pyrid.-H)、7.71 (d, J = 7.8Hz, 1H, pyrid.-H)、7.85 (s, 1H, pyrid.-H)、8.54 (s, broad, 1H, pyraz.-H)、8.61 (s, broad, 1H, pyraz.-H)。

0126

(実施例9)
N-ベンジル-6-クロロ-N-メチルピラジン-2-アミン

0127

0128

実施例1と類似の手順での、N-メチルベンジルアミンおよび2,6-ジクロロピラジンの反応により、生成物(70%)を提供した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ3.11 (s, 3H,NCH3)、4.78 (s, 2H, ArCH2N)、7.24 (d, J = 6.9Hz, 2H, ArH)、7.37〜7.28 (m, 4H, ArH)、7.81 (s, 1H, pyraz.-H)、7.88 (s, 1H, pyraz.-H)。

0129

(実施例10)
1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン

0130

0131

メタノール(250mL)中の5-ニトロベンゾイミダゾール(10.0g、61.3mmol)の溶液を、10%Pd/C(0.40g)の存在下、大気圧で20時間水素化した。その混合物をCelite(登録商標)により濾過し、減圧下で溶媒を除去して純粋な生成物(8.1g、100%)を提供した。
1H-n.m.r. (CD3OD) δ6.75 (dd, 1H, J = 8.4および2.0Hz, benzimid-H)、6.92 (d, 1H, J = 2.0Hz, benzimid-H)、7.36 (d, 1H, J = 8.4Hz, benzimid-H)、7.92 (s, 1H, benzimid-H)。

0132

(実施例11)
1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミンおよび1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0133

0134

DMF(20mL)中の1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン(2.93g、22mmol)、N-(t-ブチル)-6-クロロピラジン-2-アミン(3.71g、20mmol)および炭酸セシウム(9.12g、28mmol)の混合物を、N2下で48時間加熱した。その混合物を室温まで冷却してすぐに濾過し、濾液を真空で濃縮した。その残留物をCHCl3で抽出し、溶媒を減圧下で除去した。その残留物を、CH2Cl2-MeOH(98:2〜93:7)を用いてクロマトグラフにかけ、極性の小さい画分から、1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(1.38g)を生じさせ、
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.51 (s, 9H, C(CH3)3)、3.80 (br s, 2H, NH2)、4.84 (br s, 1H, NH)、6.74 (dd, 1H, J = 8.4, 2.2Hz, benzimid-H)、7.21 (d, 1H, J = 2.0Hz, benzimid-H)、7.62 (d, 1H, J = 9.2Hz, benzimid-H)、7.79 (s, 1H, pyraz-H)、8.07 (s, 1H, pyraz-H)、8.17 (s, 1H, benzimid-H)。
極性のそれより大きい画分から、1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン(1.54g)を生じさせた。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.51 (s, 9H, C(CH3)3)、3.48 (br s, 2H, NH2)、4.86 (s, 1H, NH)、6.79 (dd, 1H, J = 8.6, 2.2Hz, benzimid-H)、7.14 (d, 1H, J = 2.0Hz, benzimid-H)、7.70 (d, 1H, J = 8.6Hz, benzimid-H)、7.78 (s, 1H, pyraz-H)、8.07 (s, 1H, pyraz-H)、8.47 (s, 1H, benzimid-H)。

0135

(実施例12)
1-{6-([(1S)-1-フェニルエチル]アミノ)ピラジン-2-イル}-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミンおよび1-(6-([(1S)-1-フェニルエチル]アミノ)ピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0136

0137

N2下の無水DMF(10mL)中の5-アミノ-ベンゾイミダゾール(290mg、2.2mmol)の撹拌溶液に、炭酸セシウム(980mg)を加えた。得られた混合物を70℃で60分間撹拌した。これにDMF(5mL)中の6-クロロ-N-[(1S)-1-フェニルエチル]ピラジン-2-アミン(470mg)を加え、得られた混合物を次に48時間加熱還流させた。DMFを減圧下で除去し、その残留物をクロロホルム希釈した。有機層をNa2CO3水溶液で洗浄し、乾燥(Na2SO4)して溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を提供した。溶離液としてジクロロメタン-メタノール(95:5〜92:8)を用いるカラムクロマトグラフィーにより、未反応の出発材料から2つの画分を分離した。高い方のRf画分は、6-異性体(276mg、42%)であることが認められた。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.64 (d, 3H, J = 6.9Hz, CH3)、2.90 (br s, 2H, NH2)、5.05 (m, 1H, CH)、5.21 (d, 1H, NH)、6.70 (dd, 1H, J = 8.7, 2.1Hz, benzimid-H)、6.97 (d, 1H, J = 1.8Hz, benzimid-H)、7.28〜7.43 (m, 5H, Ph-H)、7.58 (d, 1H, J = 8.4Hz, benzimid-H)、7.84 (s, 1H, pyraz-H)、8.08 (s, 1H, pyraz-H)、8.21 (s, 1H, benzimid-H)。m/z (ES) 331 (M++H)。
低い方の画分は、5-異性体(170mg、26%)であることが認められた。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.64 (d, 3H, J = 6.9Hz, CH3)、2.85 (br s, 2H, NH2)、5.01 (m, 1H, CH)、5.19 (d, 1H, NH)、6.70 (dd, 1H, J = 8.7, 2.1Hz, benzimid-H)、7.11 (d, 1H, J = 1.8Hz, benzimid-H)、7.29〜7.40 (m, 5H, Ph-H)、7.51 (d, 1H, J = 8.7Hz, benzimid-H)、7.81 (s, 1H, pyraz-H)、8.10 (s, 1H, pyraz-H)、8.32 (s, 1H, benzimid-H)。
m/z (ES) 331 (M++H)。

0138

(実施例13)
1-(6-クロロピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミンおよび1-(6-クロロピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0139

0140

DMF(6mL)中の1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン(0.8g、6mmol)、2,6-ジクロロピラジンン(0.9g、6.0mmol)および炭酸セシウム(2.73g、8.4mmol)の混合物を、N2下で6時間加熱した。その混合物を室温まで冷却してすぐにジクロロメタン-メタノール(6:1、30mL)で希釈し、濾過し、濾液を真空で濃縮した。その残留物を、CH2Cl2-MeOH(98:2〜94:6)を用いてクロマトグラフにかけ、極性の小さい画分から、1-(6-クロロピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(398mg)を生じさせ、
1H-n.m.r. (CDCl3) δ6.74 (dd, 1H, J = 8.2, 2.2Hz, benzimid-H)、7.40 (d, 1H, J = 2.2Hz, benzimid-H)、7.51 (d, 1H, J = 8.2Hz, benzimid-H)、8.40 (s, 1H, pyraz-H)、8.48 (s, 1H, pyraz-H)、8.83 (s, 1H, benzimid-H)。
極性のそれより大きい画分から、1-(6-クロロピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン(435mg)を生じさせた。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ6.79 (dd, 1H, J = 8.8, 2.2Hz, benzimid-H)、7.03 (d, 1H, J = 2.2Hz, benzimid-H)、7.86 (d, 1H, J = 9.0Hz, benzimid-H)、8.44 (s, 1H, pyraz-H)、8.52 (s, 1H, pyraz-H)、8.82 (s, 1H, benzimid-H)。

0141

(実施例14)
1-{6-[(シクロプロピルメチル)アミノ]ピラジン-2-イル}-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0142

0143

DIPEA(140μL)を含有するエトキシエタノール(2mL)中の1-(6-クロロピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(100mg、0.41mmol)およびシクロプロピルメチルアミン(424μL、4.1mmol)の溶液をN2下で一晩加熱還流させた。その溶液を減圧下で濃縮し、残留物をEtOAc(20mL)に溶解し、H2O(20mL)、1MのHCl(2×20mL)、H2O(20mL)、およびブライン(20mL)で続けて洗浄した。乾燥(Na2SO4)後、溶媒を減圧下で除去し、残留物を、ジクロロメタン-メタノール(9:1〜94:6)を用いて溶離するクロマトグラフにかけ、下の画分から純粋な生成物を分離した(98mg)。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ0.28〜0.36 (m, 2H, CH2)、0.57〜0.66 (m, 2H, CH2)、1.08〜1.22 (m, 1H, CH)、3.27〜3.34 (m, 2H, CH2)、3.79 (br s, 2H, NH2)、5.02 (m, 1H, NH)、6.74 (dd, 1H, J = 8.6, 2.2Hz, benzimid-H)、7.33 (d, 1H, J = 2.2Hz, benzimid-H)、7.61 (d, 1H, J = 9.2Hz, benzimid-H)、7.84 (s, 1H, pyraz-H)、8.10 (s, 1H, pyraz-H)、8.35 (s, 1H, benzimid-H)。

0144

(実施例15)
1-[6-(イソプロピルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0145

0146

DIPEA(140μL)を含有するエトキシエタノール(2mL)中の1-(6-クロロピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(100mg、0.41mmol)およびイソプロピルアミン(350μL、4.1mmol)の溶液をN2下の密封管中で一晩加熱した。その溶液を減圧下で濃縮し、残留物をEtOAc(20mL)に溶解し、H2O(20mL)、およびブライン(20mL)で続けて洗浄した。乾燥(Na2SO4)後、溶媒を減圧下で除去し、残留物を、ジクロロメタン-メタノール(9:1〜94:6)を用いて溶離するクロマトグラフにかけ、下の画分から純粋な生成物を分離した(102mg)。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.33 (d, 6H, J = 6.4Hz, CH3)、3.79 (br s, 2H, NH2)、4.05〜4.21 (m, 1H, CH)、4.72 (m, 1H, J = 7.2Hz, NH)、6.75 (dd, 1H, J = 8.6, 2.2Hz, benzimid-H)、7.32 (d, 1H, J = 2.0Hz, benzimid-H)、7.61 (d, 1H, J = 8.4Hz, benzimid-H)、7.79 (s, 1H, pyraz-H)、8.09 (s, 1H, pyraz-H)、8.35 (s, 1H, benzimid-H)。

0147

(実施例16)
1-[6-(ジエチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0148

0149

DIPEA(140μL)を含有するエトキシエタノール(2mL)中の1-(6-クロロピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(100mg、0.41mmol)およびジエチルアミン(430μL、4.1mmol)の溶液をN2下の密封管中で一晩加熱した。その溶液を減圧下で濃縮し、残留物をEtOAc(20mL)に溶解し、H2O(20mL)、およびブライン(20mL)で続けて洗浄した。乾燥(Na2SO4)後、溶媒を減圧下で除去し、残留物を、ジクロロメタン-メタノール(9:1〜94:6)を用いて溶離するクロマトグラフにかけ、下の画分から純粋な生成物を分離した(110mg)。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.28 (t, 6H, J = 7.1Hz, CH3)、3.61 (q, 4H, J = 7.1Hz, CH2)、3.78 (br s, 2H, NH2)、6.74 (dd, 1H, J = 8.6, 2.2Hz, benzimid-H)、7.32 (d, 1H, J = 2.4Hz, benzimid-H)、7.61 (d, 1H, J = 8.8Hz, benzimid-H)、7.91 (s, 1H, pyraz-H)、8.06 (s, 1H, pyraz-H)、8.36 (s, 1H, benzimid-H)。

0150

(実施例17)
1-(6-ピリジン-4-イルピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0151

0152

窒素下、トルエン-n-プロパノール(2mL、3:1)中の1-(6-クロロピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(50mg、0.20mmol)、4-ピリジルボロン酸(30mg、0.24mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(23mg、0.02mmol)の混合物を、2Mの炭酸ナトリウム水溶液(0.14mL、0.84mmol)で処理した。得られた混合物を、加熱還流させながら一晩激しく撹拌した。冷却してすぐに、その混合物を酢酸エチル(10mL)で希釈し、H2O(1×10mL)で洗浄した。水相を、酢酸エチル(10mL)で抽出し、有機層を合わせて、0.5MのNa2CO3、ブラインで洗浄し、次いで乾燥(Na2SO4)した。真空で溶媒を除去して、粗生成物をもたらし、それを溶離液としてジクロロメタン-メタノール(98:2〜91:9)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物(32mg)を提供した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ3.88 (s, broad, 2H, NH2)、6.80 (dd., 1H, J = 8.6および2.0Hz, benzimid-H)、7.46 (d, 1H, J = 2.0Hz, benzimid-H)、7.67 (d, 1H, J = 8.6Hz, benzimid-H)、7.98〜8.01 (m, 2H, pyrid-H)、8.49 (s, 1H, pyraz-H)、8.84〜8.87 (m, 2H, pyrid-H)、8.99 (s, 1H, pyraz-H)、9.05 (s, 1H, benzimid-H)。

0153

(実施例18)
N-{1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル)]-1H-ベンゾイミダゾール-6-イル}プロパン-2-インアミド

0154

0155

N2下の無水ジクロロメタン(2.5mL)中の1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル)]-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(70mg、0.25mmol)の撹拌溶液に、トリエチルアミン(86μl)、EDAC.HCl(60mg)、4-(1-ピロリジノ)ピリジン(4mg)、およびプロピオル酸(18.5μL)を加えた。得られた混合物を次に室温で一晩撹拌し、CH2Cl2(10mL)で希釈し、H2O(2×10mL)、0.5MのNa2CO3(10mL)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)した。溶媒を減圧下で除去し、その残留物を、溶離液としてジクロロメタン-メタノール(99:1〜91:9)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、純粋な生成物(1.8mg)を分離した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.52 (s, 9H, CH3)、4.76 (br s, 1H, NH)、5.78 (br s, 1H, CH)、6.75 (dd, 1H, J = 8.4, 2.2Hz, ArH)、7.22 (d, 1H, J = 2.2Hz, ArH)、7.63 (d, 1H, J = 8.0Hz, Ar-H)、7.79 (s, 1H, pyraz-H)、8.08 (s, 1H, pyraz-H)、8.37 (s, 1H, benzimid-H)。

0156

(実施例19)
N-[1-(6-{[(1S)-1-フェニルエチル]アミノ}ピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-イル]アクリルアミド

0157

0158

N2下の無水THF(2mL)中の1-(6-{[(1S)-1-フェニルエチル]アミノ}ピラジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(67mg、0.2mmol)の撹拌溶液に、トリエチルアミン(67μl、0.48mmol)、EDAC.HCl(46mg、0.24mmol)、4-(1-ピロリジノ)ピリジン(触媒量)、およびアクリル酸(17mg、0.24mmol)を加えた。得られた混合物を次に室温で一晩撹拌し、H2O(10mL)で希釈し、その混合物をEtOAc(2×10mL)で抽出した。一緒に合わせた有機層を飽和Na2CO3水溶液で洗浄し、乾燥(Na2SO4)して溶媒を真空で除去した。その残留物を、溶離液としてジクロロメタン-メタノール(98:2〜94:6)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、純粋な生成物(25mg)を分離した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.62 (d, 3H, J = 6.8Hz, CH3)、5.01〜5.13 (m, 1H, CH)、5.38 (d, 1H, J = 6.4Hz, NH)、5.78 (dd, 1H, J = 9.8, 2.0Hz, CH)、6.24〜6.52 (m, 2H, 2×CH)、7.29〜7.44 (m, 6H, ArH)、7.70〜7.74 (m, 2H, Ar-H)、7.82 (s, 1H, pyraz-H)、8.11 (s, 1H, pyraz-H)、8.33 (s, 1H, benzimid-H)、8.42 (s, 1H, CONH)。

0159

(実施例20)
N-{1-[6-(t-ブチルアミノ)ピリジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-イル}アクリルアミド

0160

0161

N2下の無水ジクロロメタン(2mL)中の1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン(22mg、0.08mmol)の撹拌溶液に、トリエチルアミン(33μL、0.24mmol)、EDAC.HCl(22mg、0.12mmol)、4-(1-ピロリジノ)ピリジン(触媒量)、およびアクリル酸(8μL、0.12mmol)を加えた。得られた混合物を次に室温で3日間撹拌し、H2O(10mL)で希釈し、有機層を分離し、水相をCH2Cl2(10mL)で抽出した。一緒に合わせた有機層を乾燥(Na2SO4)し、溶媒を真空で除去した。その残留物を、溶離液としてジクロロメタン-メタノール(98:2〜93:7)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、純粋な生成物(10mg)を分離した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.50 (s, 9H, CH3)、4.89 (br s, 1H, NH)、5.77 (dd, 1H, J = 10.0, 2.0Hz, CH)、6.24〜6.51 (m, 2H, 2×CH)、7.25 (dd, 1H, J = 8.6, 2.0Hz, ArH)、7.76 (d, 1H, J = 8.8Hz, Ar-H)、7.83 (s, 1H, pyraz-H)、7.88 (br s, 1H, CONH)、8.13 (s, 1H, pyraz-H)、8.52 (s, 1H, benzimid-H)、8.56 (s, 1H, ArH)。

0162

(実施例21)
N-{1-[6-(t-ブチルアミノ)ピリジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-5-イル}アクリルアミド

0163

0164

N2下の無水ジクロロメタン(2mL)中の1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン(20mg、0.08mmol)の撹拌溶液に、トリエチルアミン(33μL、0.24mmol)、EDAC.HCl(22mg、0.12mmol)、4-(1-ピロリジノ)ピリジン(触媒量)、およびアクリル酸(8μL、0.12mmol)を加えた。得られた混合物を次に室温で3日間撹拌し、H2O(10mL)で希釈し、有機層を分離し、水相をCH2Cl2(10mL)で抽出した。一緒に合わせた有機層を乾燥(Na2SO4)し、溶媒を真空で除去した。その残留物を、溶離液としてジクロロメタン-メタノール(98:2〜92:8)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、純粋な生成物(10mg)を分離した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.52 (s, 9H, CH3)、4.87 (br s, 1H, NH)、5.77 (dd, 1H, J = 9.8, 2.0Hz, CH)、6.31 (dd, 1H, J = 16.6, 9.8Hz, = CH(H))、6.48 (dd, 1H, J = 16.6, 2.0Hz, = CH(H))、7.73〜7.81 (m, 2H, pyraz-H + ArH)、7.89 (d, 1H, J = 8.8Hz, ArH)、8.01 (s, 1H, ArH)、8.10 (s, 1H, pyraz-H)、8.55 (s, 1H, benzimid-H)。

0165

(実施例22)
N-{1-[6-(t-ブチルアミノ)ピリジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-イル}-2-メチルアクリルアミド

0166

0167

実施例21と同じ手順に従うが、アクリル酸の代わりにメタクリル酸を使用して、1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン(57mg)から、N-{1-[6-(t-ブチルアミノ)ピリジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-イル}-2-メチルアクリルアミド(54mg)を得た。
1H-n.m.r. (CDCl3 + d4-MeOD) δ1.43 (s, 9H, CH3)、2.00 (br s, 3H, CH3)、5.42 (br s, 1H, = CH(H))、5.77 (br s, 1H, = CH(H))、7.32 (dd, 1H, J = 8.2, 2.0Hz, ArH)、7.67 (d, 1H, J = 8.8Hz, ArH)、7.74 (s, 1H, pyraz-H)、7.99 (s, 1H, pyraz-H)、8.38 (d, 1H, J = 2.0Hz, ArH)、8.46 (s, 1H, benzimid-H)。

0168

(実施例23)
1-{6-[(2-メチルフェニル)アミノ]ピラジン-2-イル}-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0169

0170

トルエン(2mL)中のクロロピラジン(100mg、0.40mmol)の撹拌溶液に、o-トルイジン(0.1mL、0.93mmol)、Pd[P(t-Bu)3]2(10mg)、およびナトリウムt-ブトキシド(58mg、0.6mmol)を加えた。その溶液を80℃で一晩加熱し、室温まで冷却してすぐにEtOAc(20mL)で希釈した。有機層を回収し、水層をEtOAc(20mL)で抽出し、一緒に合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、乾燥(Na2SO4)した。減圧下で溶媒を除去することにより、油状残留物が与えられ、それをCH2Cl2-MeOH(98:2→94:6)を用いてクロマトグラフにかけ、黄白色油状物としての所望の生成物(52mg、41%)を分離した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ2.34 (s, 3H, CH3)、3.70 (s, 2H, NH2)、6.61 (s, 1H, NH)、6.71 (dd, 1H, J = 8.6, 2.2Hz, ArH)、7.19〜7.36 (m, 4H, ArH)、7.53〜7.60 (m, 2H, ArH)、7.99 (s, 1H, pyraz-H)、8.27 (s, 1H, pyraz-H)、8.36 (s, 1H, benzimid-H)。

0171

(実施例24)
(2L)-N-{1-[6-(t-ブチルアミノ)ピラジン-2-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-6-イル}-3-ピリジン-3-イルアクリルアミド

0172

0173

無水エタノール(5mL)中のアルキン(30mg、0.07mmol)の撹拌溶液に、リンドラー触媒(3mg)を加えた。次にその混合物を水素ガスパージし、大気圧のH2のもとで3時間撹拌した。触媒を、Celite(登録商標)により濾過して除去し、溶媒を真空で除去した。EtOAc-MeOH (9:1)を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより、粘着性のある半固体としての純粋な生成物(13mg、43%)を分離した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.50 (s, 9H, C(CH3)3)、4.93 (s, 1H, NH)、6.26 (d, 1H, J = 12.6Hz, C = CH)、6.82 (d, 1H, J = 12.6Hz, C = CH)、7.14 (dd, 1H, J = 8.7, 2.1Hz, ArH)、7.25〜7.29 (m, 1H, pyridine-H)、7.74 (d, 1H, J = 8.7Hz, ArH)、7.82 (s, 1H, pyraz-H)、8.07 (br s, 1H, CONH)、8.09 (s, 1H, pyraz-H)、8.13〜8.16 (m, 1H, pyridine-H)、8.47 (d, 1H, J = 1.8Hz, pyridine-H)、8.50 (s, 1H, benzimid-H)、8.51〜8.53 (m, 1H, pyridine-H)、8.63 (d, 1H, J = 2.1Hz, ArH)。
m/z (EI): 413 (M+)。

0174

(実施例25)
N-(t-ブチル)-6-クロロピラジン-2-カルボキサミド

0175

0176

塩化チオニル(1mL、13.7mmol)を、トルエン(5mL)中の酸(315mg、2mmol)の懸濁液に加えた。DMFの1滴を次に加え、室温で10分間撹拌した後、その混合物を1時間加熱して還流させた。その反応物を室温まで冷却し、トルエンおよび過剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。次いでトルエン(1mL)をその残留物に加え、これを減圧下で除去した。この処理を繰り返し、次にCH2Cl2(10mL)を加え、得られた溶液を0℃に冷却した。t-ブチルアミン(0.45mL、4.3mmol)およびトリエチルアミン(1.1mL、8.0mmol)を次に加え、その溶液を室温で一晩撹拌した。その溶液をCH2Cl2(10mL)およびH2O(10mL)で希釈し、有機層を集め、Na2CO3水溶液で洗浄し、次いで乾燥(Na2SO4)した。溶媒を真空で除去し、残留物をCH2Cl2-MeOH(95:5)を用いるフラッシュクロマトグラフィーを用いて油状物としての純粋な生成物(290mg、68%)を分離した。
1H-n.m.r. (CDCl3) δ1.49 (s, 9H, C(CH3)3)、7.48 (br s, 1H, NH)、8.72 (s, 1H, pyraz-H)、9.27 (s, 1H, pyraz-H)。
m/z (EI): 413 (M+)。

0177

(実施例26)
1-(6-メトキシピリジン-3-イル)-5-ニトロ-1H-ベンゾイミダゾールおよび1-(6-メトキシピリジン-3-イル)-6-ニトロ-1H-ベンゾイミダゾール

0178

0179

5-ニトロベンゾイミダゾール(650mg、4mmol)、2-メトキシ-5-ピリジルボロン酸(420mg、2.6mmol)、酢酸銅(II)(1.09g、6mmol)、および粉末状の4Åモレキュラーシーブの混合物を、ピリジン(0.65mL)を含有するCH2Cl2(40mL)中で激しく撹拌し、大気中で3日間撹拌した。その混合物を、次にCelite(登録商標)により濾過し、フィルターパッドをCH2Cl2-MeOH(4:1)で洗浄した。濾液と洗液とを合わせ、真空で濃縮して残留物をCH2Cl2-MeOH(100:0→95:5)を用いてクロマトグラフにかけて、白色固体(272mg、37%)としての生成物(位置異性体の1:1の混合物として)を分離した。
m/z (EI):270(M+)。

0180

(実施例27)
1-(6-メトキシピリジン-3-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミンおよび1-(6-メトキシピリジン-3-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミン

0181

0182

実施例26から誘導された位置異性体の混合物(270mg、1mmol)を、実施例10で概説した手順に従い水素化した。粗生成物を、CH2Cl2-MeOH(98:2→95:5)で溶離するクロマトグラフにかけて、極性の低い画分から6異性体(84mg)、および極性の画分から5異性体を分離した(122mg)。
6異性体
1H-n.m.r. (CDCl3) δ3.88 (br s, 2H, NH2)、4.01 (s, 3H, OCH3)、6.64 (d, 1H, J = 2.1Hz, benzimid-H)、6.72 (dd, 1H, J = 8.7, 2.1Hz, benzimid-H)、6.92 (d, 1H, J = 9.0Hz, benzimid-H)、7.61〜7.68 (m, 2H, pyr-H)、7.82 (s, 1H, benzimid-H)、8.30 (d, 1H, J = 2.7Hz, pyr-H)。
5異性体
1H-n.m.r. (CDCl3) δ3.11 (br s, 2H, NH2)、4.01 (s, 3H, OCH3)、6.75 (dd, 1H, J = 8.4, 2.1Hz, benzimid-H)、6.92 (d, 1H, J = 8.7Hz, benzimid-H)、7.15 (d, 1H, J = 2.1Hz, benzimid-H)、7.18 (d, 1H, J = 8.7Hz, pyr-H)、7.68 (dd, 1H, J = 8.7, 2.7Hz, pyr-H)、7.91 (s, 1H, benzimid-H)、8.31 (d, 1H, J = 2.7Hz, pyr-H)。

0183

(実施例28)
1-(5-ブロモピリジン-3-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミンおよび1-(5-ブロモピリジン-3-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン

0184

0185

DMSO(10mL)中の3,5-ジブロモピリジン(2.37g、10mmol)、5-アミノベンゾイミダゾール(1.60g、12mmol)、および炭酸セシウム(4.9g、15mmol)を、150℃で18時間加熱した。その溶液を室温まで冷却してすぐにCHCl3(40mL)で希釈し、Celite(登録商標)により濾過し、その濾液を真空で濃縮した。その残留物をEtOAc-MeOH(100:0→95:5)で溶離するクロマトグラフ(シリカ予備吸着)にかけ、極性の低い画分から6異性体、およびより極性の高い画分から5異性体を分離した。
6異性体
1H-n.m.r. (CDCl3) δ3.82 (br s, 2H, NH2)、6.75〜6.78 (m, 2H)、7.64 (d, 1H, J = 9.0Hz, benzimid-H)、7.89 (s, 1H)、8.01 (dd, 1H, J = 2.1Hz, pyr-H)、8.75 (br s, 2H)。
5異性体
1H-n.m.r. (CDCl3) δ3.74 (br s, 2H, NH2)、6.79 (dd, 1H, J = 8.7, 2.1Hz, benzimid-H)、7.15 (d, 1H, J = 2.1Hz, benzimid-H)、7.31 (d, 1H, J = 8.7Hz, benzimid-H)、7.99 (s, 1H, benzimid-H)、8.01 (dd, 1H, J = 2.1, 2.1Hz, pyr-H)、8.74〜8.77 (m, 2H, pyr-H)。

0186

(実施例29)
1-(6-ブロモピリジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-アミンおよび1-(6-ブロモピリジン-2-イル)-1H-ベンゾイミダゾール-5-アミン

0187

0188

実施例28に概説したものと同様の手順を使用した、2,6-ジブロモピリジンの5-アミノベンゾイミダゾールおよび炭酸セシウムとのDMSO中の150℃における反応により、クロマトグラフィーにより分離した2つの位置異性体生成物を提供した。
6異性体
1H-n.m.r. (CDCl3) δ3.83 (br s, 2H, NH2)、6.75 (dd, 1H, J = 8.4, 2.1Hz, benzimid.-H)、7.42〜7.47 (m, 3H)、7.60 (d, 1H, J = 8.4Hz)、7.71 (dd, 1H, J = 7.8Hz)、8.33 (s, 1H)。
5異性体
1H-n.m.r. (CDCl3) δ6.81 (dd, 1H, J = 8.7, 2.1Hz, benzimid-H)、7.12 (d, 1H, J = 8.1Hz, benzimid-H)、7.40〜7.48 (m, 2H)、7.70 (dd, 1H, J = 7.8, 7.8Hz, pyr-H)、7.89 (d, 1H, J = 8.7Hz, benzimid-H)、8.46 (s, 1H)。

0189

上で説明したものと類似した手順を使用して、以下の化合物を調製した:

0190

0191

スクリーニング
化合物の希釈
スクリーニングのために、化合物を96ウェルプレートで20μMの濃度に希釈した。アッセイの前に、プレートを30分間37℃で温めた。

0192

JAKチロシンキナーゼドメイン生産
JAKキナーゼドメインを以下のように生産した。

0193

JAK1
ヒトJAK1のキナーゼドメインを、以下のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、U937mRNAから増幅した。
XHOI-J1 5'-CCGCTC GAG ACT GAAGTG GAC CCC ACACAT-3'(配列番号1)
J1-KPNT5'-CGG GGTACCTTATTTTAA AAGTGCTTCAAA-3'(配列番号2)

0194

JAK1PCR産物を、XhoIおよびKpnI部位を介してpFastBacHTb発現ベクター(Gibco)にクローニングした。次いで、JAK1プラスミドをDH10Bacコンピテントセル(Gibco)に形質転換し、生産した組換えバキュロウイルスを、Sf9昆虫細胞へのトランスフェクション用に調製した。

0195

JAK2
ヒトJAK2のキナーゼドメインを、以下のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、U937mRNAから増幅した。
SALi-jk2 5'-ACGCGT CGA CGGTGCCTT TGA AGA CCG GGA T-3'(配列番号3)
jk2-NOTI 5'-ATAGTTTAG CGG CCG CTC AGA ATG AAGGTC ATT T-3'(配列番号4)

0196

JAK2PCR産物を、SAlIおよびNotI部位を介してpFastBacHTc発現ベクター(Gibco)にクローニングした。次いで、JAK2プラスミドをDH10Bacコンピテントセル(Gibco)に形質転換し、生産した組換えバキュロウイルスを、Sf9昆虫細胞へのトランスフェクション用に調製した。

0197

JAK3
ヒトJAK3のキナーゼドメインを、以下のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、U937mRNAから増幅した。
XHOI-J3 5'-CCGCTC GAGTATGCCTGCCAA GAC CCCACG-3'(配列番号5)
J3-KPNI 5'-CGG GGTACCCTA TGA AAA GGA CAG GGA GTG-3'(配列番号6)

0198

JAK3PCR産物を、XhoIおよびKpnI部位を介してpFastBacHTb発現ベクター(Gibco)にクローニングした。次いで、JAK3プラスミドをDH10Bacコンピテントセル(Gibco)に形質転換し、生産した組換えバキュロウイルスを、Sf9昆虫細胞へのトランスフェクション用に調製した。

0199

TYK2
ヒトTYK2のキナーゼドメインを、以下のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、A549mRNAから増幅した。
HT2EK 5'-GGAGCACTC GAG ATGGTA GCA CAC AAC CAG GTG-3'(配列番号7)
ITY2.2R 5'-GGA GCA GGA ATT CCGGCG CTG CCG GTC AAA TCT GG-3'(配列番号8)

0200

TYK2PCR産物を、EcoRI部位を介してpBlueBacHis2A(Invitrogen)にクローニングした。生産した組換えTYK2バキュロウイルスを、Sf9昆虫細胞へのトランスフェクション用に調製した。

0201

キナーゼドメインの大量生産
JAKファミリーの各メンバーからのバキュロウイルス産物を、High Five無血清培地(Invitrogen)で細胞密度約1〜2×106細胞/mlに増殖させた5リットルのHigh Five細胞(Invitrogen)に感染させた。細胞を、0.8〜3.0の感染多重度(MOI)でウイルスに感染させた。細胞を回収し、溶解した。JAKキナーゼドメインを、Probond(Invitrogen)ニッケルキレートアフィニティカラムで、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。

0202

アッセイプロトコル
96ウェル捕捉ベースELISAアッセイ、またはAlphascreenタンパク質チロシンキナーゼキットを用いる384ウェルOptiplate(Packard)で、キナーゼアッセイを行った。いずれの場合も、50mMHEPES、pH7.5、10mM MgCl2、150mM NaCl、および10μM〜1mMATPの存在下、約1.5μgのアフィニティ精製PTKドメインを用いた。基質として、ビオチン化基質ビオチン-EGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(配列番号9)(最終濃度5μM)を用いた。ELISAアッセイでは、ペルオキシダーゼ結合抗ホスホチロシン抗体PY20を用い、アビジン被覆ELISAプレートに移した後、チロシンリン酸化を定量した。Alphascreenアッセイでは、抑制光下、Alphascreenホスホチロシンアクセプタービーズ、続いてストレプトアビジンドナービーズを加えた。ELISAプレートはBMG Fluorostar、AlphascreenプレートはPackard Fusion Alphaで読み取った。ATPを加える15分前に、アッセイに阻害剤を添加した。DMSO濃度が1%を超えないようにして、阻害剤をDMSO水溶液に添加した。

0203

結果
選択された化合物の活性を表3に示す。20μMの濃度でJAK活性の50%を阻害する能力を示した化合物を「+」とする(標準条件下で測定、方法を参照のこと)。

0204

0205

本明細書を通じて、「含む(comprise)」という語、または「含む(comprises)」もしくは「含んでいる(comprising)」などの変形形態は、記載した要素、整数、段階、または要素、整数、もしくは段階の群を含むことを意味するものであるが、他の任意の要素、整数、段階、または要素、整数、もしくは段階の群を除外するものではないことが理解されよう。

0206

本明細書に記載したすべての刊行物は参照により本明細書に組み込む。本明細書に含まれるいずれの文書、行為、材料、装置、論文などに関する議論は、単に本発明の背景を提供することを目的とするものである。それらの事項のいずれかまたはすべては、従来技術の基礎の一部を構成することを認めるものとして理解されるべきではなく、あるいは本出願の各請求項の優先日前にそれらがオーストラリアまたはその他の場所に存在したものとして本発明に関する分野の共通の一般知識であったことを認めるものとして理解されるべきものではない。

0207

幅広く記載した本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において示した本発明に、多くの変更および/または修正を加えることができることは当業者であれば理解するであろう。したがって本発明の実施形態は、あらゆる点において例示的なものであり、制限的なものであると考えるべきではない。

0208

図面の簡単な説明

0209

選択されたJakキナーゼのアミノ酸の配列アラインメントを示す図である。
システイン残基を表すJak3キナーゼATP結合ポケットのモデルを示す図である。

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