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技術 ケモカイン変異体の治療への使用

出願人 メルクセローノソシエテアノニム
発明者 プルードフット,アマンダウー.イ.ショウ,ジェフリージョンソン,ゾエ
出願日 2004年10月18日 (15年4ヶ月経過) 出願番号 2006-534768
公開日 2007年4月26日 (12年9ヶ月経過) 公開番号 2007-510403
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード UV分光分析法 圧力限界 膨潤容積 セロファン紙 セイル バックグラウンド量 代替的形態 二重フィルタ
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課題・解決手段

ヒトCCL2のようなホモ二量体形成ケモカイン変異体であって、二量体化界面において水素結合パターンを変更させる単一アミノ酸置換を有し、絶対的単量体として作用する変異体は、天然ケモカイン拮抗することができ、また、インビボにおいて抗炎症作用を有する。これらの変異体は、炎症、自己免疫疾患、または感染症治療するための薬学的組成物の有効成分として使用することができる。

概要

背景

ケモカインは、小さな分泌性炎症促進性タンパク質であり、白血球指向的に血液から傷害部位へと移動するのを仲介する。ケモカインファミリーは、このタンパク質ファミリーの特徴である保存的システインの位置によって、一連膜受容体に結合するCケモカイン、C−Cケモカイン、C−X−Cケモカイン、およびC−X3−Cケモカインに構造的に分けることができる(Baggiolini M et al.,1997;Fernandez EJ and Lolis E,2002)。

これらの膜受容体は、全て7へリックス(heptahelical)G−タンパク質共役レセプターであり、ケモカインが標的細胞上でその生物学的活性を発揮するのを可能にし、それらの状態および/または種類によってレセプターの特異的な組み合わせを提示することができる。ケモカインの生理学的作用は、同時発生的相互作用の複雑かつ集積的なシステムによるものであり、これらのレセプターは、しばしば、重複するリガンド特異性を有するため、単一のレセプターが異なったケモカインに結合し、また、単一のケモカインが異なったレセプターに結合することができる。

ケモカインは、通常、傷害部位で産生され、白血球の遊走および活性化をもたらし、炎症、免疫、ホメオスタシス造血および血管形成のプロセスにおいて基本的な役割を果たしている。ケモカインを治療薬として使用することに短所となる点(具体的には、凝集しやすく、無差別に結合すること)があったとしても、これらの分子は、特異的なケモカインおよびそれらのレセプターを、白血球の過剰な動員および活性化を防止する目的で阻害することにより、上記プロセスに関連した病気への治療的介入を行うための優れた標的候補物質であると考えられている(Baggiolini M et al.,2001;Loetscher P and Clark−Lewis I,2001;Godessart N and Kunkel SL,2001)。

構造と活性の関係について調べると、ケモカインには、それらのレセプターと相互作用する可動アミノ末端領域(flexible amino−terminal region)、および2番目のシステインの後にある、立体配置的に固定したループ(conformationally rigid loop)という、2つの主な部位があることが示される。ケモカインは、ループ領域を用いてレセプター上にドッキングし、この接触によってアミノ末端領域の結合が促進され、レセプターの活性化をもたらす。このようにアミノ末端領域が重要なことは、このドメイン改変または短くした天然および合成のケモカインを試験することによっても明らかになっている。アミノ酸タンパク質分解突然変異誘発、または化学修飾の後にこのような処理を行うと、これらの分子を活性化または不活性化することができ、アゴニストおよび/またはアンタゴニストとしての活性を有する化合物を生成する。このように、アミノ末端領域を特異的に改変されたケモカインには、炎症性および自己免疫性の病気を治療する可能性がある(Schwarz and Wells,1999)。

CCL2は、単球遊走因子タンパク質−1(Monocyte Chemoattractant Protein 1:MCP−1)または単球走化活性因子(Monocyte Chemotactic And Activating Factor:MCAF)としても知られているが、様々な炎症性疾患、様々なタイプの腫瘍心臓同種移植片AIDS、および結核における傷害および感染のシグナル応答して、単球およびリンパ球の動員を促進することができるため、炎症において中心的役割を果たしていると見なされている(Yoshumura T et al.,1989;Gu L et al.,1999)。CCL2に関連する生理学的作用が、トランスジェニック動物を用いて広範に研究されており、このケモカインが、炎症モデルにおいて単球の動員を調節するだけでなく、ヘルパーTの応答およびアテローム性動脈硬化症の開始に関係するサイトカイン発現も調節していることを明らかにすることができた。

構造上、CCL2は、C末端にあるαへリックスで覆われたN末端ループおよびβシートからなり、特定の実験条件では単量体として検出されてはいるものの、ホモ二量体を形成する(Handel T et al.,1996;Kim KS et al.,1996;Lubkowski J,et al.,1997)。その他多くのケモカインについては、CCL2に関連した結合活性およびその他の性質における欠失または置換されたアミノ酸の役割を評価するために、N末端切断型または単一部位置換型変異体を発現させてCCL2の突然変異体が作成されている構造−活性研究の例が数多く文献に記載されている(Gong J and Clark−Lewis I,1995;Zhang Y et al.,1996;Steitz SA et al.,1998;Gu L et al.,1999;Hemmerich S et al.,1999;SeetBTet al.,2001)。

特に、CCL2レセプター結合および活性化における二量体化の役割が研究されて、二量体化を妨害する、末端領域における様々な変異が、レセプター結合親和性走化性の促進、アデニル酸シクラーゼの阻害、およびカルシウム流出の促進など、CCL2の作用のいくつかを変更し得ることが示された(Paavola C et al.,1998)。本明細書においてP8A*と呼ばれる、Paavolaによって記載された突然変異体は、二量体化はしないが、本来の能力効力を維持しているのに対し、本明細書においてY13A*と呼ばれる、Paavolaによって記載された別の絶対的な単量体突然変異体(obligate monomeric mutant)は、インビトロにおいて100倍低い結合親和性を有し、インビトロにおいてアデニル酸シクラーゼのそれほど強力でないインヒビターであってカルシウム流出の刺激因子であり、また、細胞培養液中において走化性を促進することができないことが示された。Y13A*と同様、突然変異体である[1+9−76]MCP−1(第2〜8位の残基がないCCL2変異体)は、インビトロにおいてCCL2の作用に拮抗する。

P8A置換を含むCCL2突然変異体の結合特性も、実験モデルにおいて、ウイルスのケモカイン結合タンパク質M3の認識に基づいて調べられ、このウイルスタンパク質がCCL2の突然変異体に効率的に結合することが実証された(Alexander JM et al.,2002)。さらに、CCL2−P8Aなど、ケモカインの単量体変異体は、インビトロでは、完全な活性をもち、二量体型と区別することができないが、インビボでは活性をもたない(Proudfoot A et al.,2003)。

生じたタンパク質の二量体化特性に影響しない残基を含む、CCL2の突然変異体の例が、CCL2に対するアンタゴニストとしての性質を有する分子をもたらすものとして、既に文献に記載されている(米国特許第5739103号、国際公開第03/84993号)。しかし、先行技術には、一部位置換(例えば、プロリンを含む)によって絶対的な単量体変異体となったケモカインの特異的な突然変異体、具体的にはCCL2の突然変異体が、ケモカインのアンタゴニストとして作用し得ることの記載はない。

概要

ヒトCCL2のようなホモ二量体形成ケモカインの変異体であって、二量体化界面において水素結合パターンを変更させる単一アミノ酸置換を有し、絶対的単量体として作用する変異体は、天然のケモカインに拮抗することができ、また、インビボにおいて抗炎症作用を有する。これらの変異体は、炎症、自己免疫疾患、または感染症を治療するための薬学的組成物の有効成分として使用することができる。

目的

本発明の一つの態様は、例えば、自己免疫性、炎症性または感染症など、様々な病気の治療標的として知られているCCL2のような、ホモ二量体を形成するケモカインの絶対的単量体変異体を利用することである

効果

実績

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請求項1

列番号2を含むポリペプチドの薬物としての使用。

請求項2

前記ポリペプチドが、さらに、配列番号2の64位にイソロイシンを含むものである、請求項1に記載の使用。

請求項3

さらに、前記ポリペプチドが、配列番号2および配列番号4の対応する配列の9位、10位、または13位に突然変異を含まないことを特徴とする、請求項1または2に記載の使用。

請求項4

さらに、前記ポリペプチドが、配列番号2および配列番号4の対応する配列において、a)8位、14位、17位、または77位にシステイン、または、b)1位においてアラニンまたはグリシンを含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の使用。

請求項5

前記ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、請求項1から4いずれか1項に記載の使用。

請求項6

自己免疫性炎症性、または感染性疾患治療するための薬物を製造するための、配列番号2を含むポリペプチドの使用。

請求項7

前記ポリペプチドが、さらに、配列番号2の64位にイソロイシンを含む、請求項65に記載の使用。

請求項8

さらに、前記ポリペプチドが、配列番号2および配列番号4の対応する配列の9位、10位、または13位に突然変異を含まないことを特徴とする、請求項6または7に記載の使用。

請求項9

さらに、前記ポリペプチドが、配列番号2および配列番号4の対応する配列において、a)8位、14位、17位、または77位にシステイン、または、b)1位においてアラニンまたはグリシンを含むことを特徴とする、請求項6または7に記載の使用。

請求項10

前記ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域を含む、請求項6から9いずれか1項に記載の使用。

請求項11

請求項12

前記疾患が、関節炎、関節リウマチ(RA)、乾癬性関節炎、骨関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、線維症、アレルギー性または過敏性の疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、癌、敗血症ショック、ウイルスまたはHIVによる感染症、移植、気管支炎、移植片対宿主病(GVHD)およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項7に記載の使用。

請求項13

前記疾患が多発性硬化症である、請求項11に記載の使用。

請求項14

前記疾患が多発性硬化症である、請求項12に記載の使用。

請求項15

配列番号5のヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域に融合した配列番号2の融合ポリペプチドアミノ酸配列

請求項16

配列番号5の融合ポリペプチドをコードする核酸配列

請求項17

請求項15に記載の融合ポリペプチドを産生する方法であって、a)成熟型CCL2−P8Aをコードする核酸配列を、5’末端においてヒトCCL2のシグナル配列をコードする核酸配列、および3’末端においてヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖IgG1の定常領域(セグメント243〜474)をコードする核酸配列に融合している発現ベクターの中にクローニングする工程、b)得られたベクターによってCHO細胞株またはHEK293細胞株形質転換する工程、c)N末端にCCL2−P8A、C末端にIgG1配列を有する組換え融合タンパク質を安定して発現および分泌するクローンを選択する工程、d)培養培地から融合タンパク質を精製する工程を含む方法。

請求項18

本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニストケモカイン変異体スクリーニングする方法であって、a)CCL2において、二量体化する能力遮断する単一点突然変異作出する工程、b)レセプターに結合して、インビトロアゴニスト性質を示す前記変異体を同定する工程、c)上記工程(b)で同定された群から、さらに、腹膜細胞動員阻害することを特徴とする前記変異体を同定する工程を含む方法。

請求項19

ホモ二量体形成ケモカイン単量体変異体活性成分として含む医薬組成物であって、前記変異体が、前記ケモカインの二量体化界面における水素結合パターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られる組成物

請求項20

前記単量体変異体が、a)CCL2−P8A(配列番号2)、b)CCL2*−P8A(配列番号4)、c)(a)または(b)の活性型突然変異体、またはd)(a)、(b)または(c)を含むポリペプチド、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列から選択される、請求項19に記載の医薬組成物。

請求項21

前記単量体変異体が、活性画分先駆物質、塩、誘導体複合体または結合体の形態である、請求項18または19に記載の医薬組成物。

請求項22

有効量のホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を投与することを含む、自己免疫性、炎症性、または感染性疾患を治療または予防するための方法であって、前記変異体が、前記ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られる方法。

請求項23

前記単量体変異体が、a)CCL2−P8A(配列番号2)、b)CCL2*−P8A(配列番号4)、c)(a)または(b)の活性型変異体、またはd)(a)、(b)または(c)を含むポリペプチド、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列から選択される、請求項21に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、ケモカイン変異体、および具体的にはヒトCCL2変異体新規治療への使用法に関する。

背景技術

0002

ケモカインは、小さな分泌性炎症促進性タンパク質であり、白血球指向的に血液から傷害部位へと移動するのを仲介する。ケモカインファミリーは、このタンパク質ファミリーの特徴である保存的システインの位置によって、一連膜受容体に結合するCケモカイン、C−Cケモカイン、C−X−Cケモカイン、およびC−X3−Cケモカインに構造的に分けることができる(Baggiolini M et al.,1997;Fernandez EJ and Lolis E,2002)。

0003

これらの膜受容体は、全て7へリックス(heptahelical)G−タンパク質共役レセプターであり、ケモカインが標的細胞上でその生物学的活性を発揮するのを可能にし、それらの状態および/または種類によってレセプターの特異的な組み合わせを提示することができる。ケモカインの生理学的作用は、同時発生的相互作用の複雑かつ集積的なシステムによるものであり、これらのレセプターは、しばしば、重複するリガンド特異性を有するため、単一のレセプターが異なったケモカインに結合し、また、単一のケモカインが異なったレセプターに結合することができる。

0004

ケモカインは、通常、傷害部位で産生され、白血球の遊走および活性化をもたらし、炎症、免疫、ホメオスタシス造血および血管形成のプロセスにおいて基本的な役割を果たしている。ケモカインを治療薬として使用することに短所となる点(具体的には、凝集しやすく、無差別に結合すること)があったとしても、これらの分子は、特異的なケモカインおよびそれらのレセプターを、白血球の過剰な動員および活性化を防止する目的で阻害することにより、上記プロセスに関連した病気への治療的介入を行うための優れた標的候補物質であると考えられている(Baggiolini M et al.,2001;Loetscher P and Clark−Lewis I,2001;Godessart N and Kunkel SL,2001)。

0005

構造と活性の関係について調べると、ケモカインには、それらのレセプターと相互作用する可動アミノ末端領域(flexible amino−terminal region)、および2番目のシステインの後にある、立体配置的に固定したループ(conformationally rigid loop)という、2つの主な部位があることが示される。ケモカインは、ループ領域を用いてレセプター上にドッキングし、この接触によってアミノ末端領域の結合が促進され、レセプターの活性化をもたらす。このようにアミノ末端領域が重要なことは、このドメイン改変または短くした天然および合成のケモカインを試験することによっても明らかになっている。アミノ酸タンパク質分解突然変異誘発、または化学修飾の後にこのような処理を行うと、これらの分子を活性化または不活性化することができ、アゴニストおよび/またはアンタゴニストとしての活性を有する化合物を生成する。このように、アミノ末端領域を特異的に改変されたケモカインには、炎症性および自己免疫性の病気を治療する可能性がある(Schwarz and Wells,1999)。

0006

CCL2は、単球遊走因子タンパク質−1(Monocyte Chemoattractant Protein 1:MCP−1)または単球走化活性因子(Monocyte Chemotactic And Activating Factor:MCAF)としても知られているが、様々な炎症性疾患、様々なタイプの腫瘍心臓同種移植片AIDS、および結核における傷害および感染のシグナル応答して、単球およびリンパ球の動員を促進することができるため、炎症において中心的役割を果たしていると見なされている(Yoshumura T et al.,1989;Gu L et al.,1999)。CCL2に関連する生理学的作用が、トランスジェニック動物を用いて広範に研究されており、このケモカインが、炎症モデルにおいて単球の動員を調節するだけでなく、ヘルパーTの応答およびアテローム性動脈硬化症の開始に関係するサイトカイン発現も調節していることを明らかにすることができた。

0007

構造上、CCL2は、C末端にあるαへリックスで覆われたN末端ループおよびβシートからなり、特定の実験条件では単量体として検出されてはいるものの、ホモ二量体を形成する(Handel T et al.,1996;Kim KS et al.,1996;Lubkowski J,et al.,1997)。その他多くのケモカインについては、CCL2に関連した結合活性およびその他の性質における欠失または置換されたアミノ酸の役割を評価するために、N末端切断型または単一部位置換型の変異体を発現させてCCL2の突然変異体が作成されている構造−活性研究の例が数多く文献に記載されている(Gong J and Clark−Lewis I,1995;Zhang Y et al.,1996;Steitz SA et al.,1998;Gu L et al.,1999;Hemmerich S et al.,1999;SeetBTet al.,2001)。

0008

特に、CCL2レセプター結合および活性化における二量体化の役割が研究されて、二量体化を妨害する、末端領域における様々な変異が、レセプター結合親和性走化性の促進、アデニル酸シクラーゼの阻害、およびカルシウム流出の促進など、CCL2の作用のいくつかを変更し得ることが示された(Paavola C et al.,1998)。本明細書においてP8A*と呼ばれる、Paavolaによって記載された突然変異体は、二量体化はしないが、本来の能力効力を維持しているのに対し、本明細書においてY13A*と呼ばれる、Paavolaによって記載された別の絶対的な単量体突然変異体(obligate monomeric mutant)は、インビトロにおいて100倍低い結合親和性を有し、インビトロにおいてアデニル酸シクラーゼのそれほど強力でないインヒビターであってカルシウム流出の刺激因子であり、また、細胞培養液中において走化性を促進することができないことが示された。Y13A*と同様、突然変異体である[1+9−76]MCP−1(第2〜8位の残基がないCCL2変異体)は、インビトロにおいてCCL2の作用に拮抗する。

0009

P8A置換を含むCCL2突然変異体の結合特性も、実験モデルにおいて、ウイルスのケモカイン結合タンパク質M3の認識に基づいて調べられ、このウイルスタンパク質がCCL2の突然変異体に効率的に結合することが実証された(Alexander JM et al.,2002)。さらに、CCL2−P8Aなど、ケモカインの単量体変異体は、インビトロでは、完全な活性をもち、二量体型と区別することができないが、インビボでは活性をもたない(Proudfoot A et al.,2003)。

0010

生じたタンパク質の二量体化特性に影響しない残基を含む、CCL2の突然変異体の例が、CCL2に対するアンタゴニストとしての性質を有する分子をもたらすものとして、既に文献に記載されている(米国特許第5739103号、国際公開第03/84993号)。しかし、先行技術には、一部位置換(例えば、プロリンを含む)によって絶対的な単量体変異体となったケモカインの特異的な突然変異体、具体的にはCCL2の突然変異体が、ケモカインのアンタゴニストとして作用し得ることの記載はない。

発明が解決しようとする課題

0011

驚くべきことに、CCL2のようなホモ二量体を形成するケモカインの変異体であって、二量体化界面において水素結合パターンを変更させる単一アミノ酸置換を有するために、インビトロにおいて、レセプターに結合し、かつアゴニストの性質を有する絶対的単量体を生じさせる変異体が、インビボにおいて、天然のケモカインに拮抗することができ、また、抗炎症作用をもつことが発見された。

0012

本明細書に記載された変異体は、薬剤として有用である。配列番号2を含むポリペプチド、および、さらに配列番号2の第64位のイソロイシンへの突然変異を有する配列番号2を含むポリペプチド(配列番号4)が薬剤として有用である。

0013

本明細書に記載された変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療するための薬剤として有用である。配列番号2を含むポリペプチド、および配列番号2の第64位のイソロイシンにさらに突然変異を有する配列番号2を含むポリペプチド(配列番号4)が、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療するための薬剤として有用である。一例において、配列番号2を含むポリペプチド、および配列番号2の第64位のイソロイシンにさらに突然変異を有する配列番号2を含むポリペプチド(配列番号4)は、多発性硬化症を治療するための薬剤として有用である。

0014

本明細書に記載された変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染症を治療する方法において、さらに有用である。そのような方法は、本発明の単量体変異体であって、該ケモカインの二量体化界面において水素結合パターンを変更させる、少なくとも1つのアミノ酸置換によって生じる変異体を有効量投与することを含む。このような方法において使用可能な単量体変異体の例は、a)配列番号2を含むポリペプチド、b)配列番号4を含むポリペプチド、c)a)またはb)の活性型突然変異体、d)a)、b)またはc)、および該ケモカイン以外のタンパク質に属するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに、これらの活性型の画分、前駆体、塩、誘導体複合体または結合体という形態の対応分子である。

0015

さらに、本発明は、本発明の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体を含むポリペプチドを含有する薬学的組成物を含む。

0016

さらに、本発明は、非ケモカインタンパク質の配列に本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体を融合させたもの、例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に配列番号2のアミノ酸配列を融合させたもの(配列番号5)を含む融合タンパク質を含む。本発明は、さらに、これらの融合タンパク質を産生する方法を含む。

0017

さらに、本発明は、本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法
a)二量体化する能力を阻害する単一点突然変異をCCL2の中に作出すること、
b)レセプターに結合し、インビトロにおいてアゴニスト特性を示す該変異体を同定すること、
c)上記b)で同定された群に由来する該変異体であって、さらに、腹膜細胞の動員を阻害する特徴をもつ変異体を同定すること。

0018

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。

発明を実施するための最良の形態

0019

先行技術における上記の証拠を考慮しても、レセプターに結合し、インビトロにおいてアゴニストとしての性質を有する絶対的単量体となるように水素結合のパターンを変更する、二量化界面における少なくとも一つのアミノ酸置換によって生じたCCL2変異体が、インビボにおいてCCL2を拮抗することができ、また、一般的に細胞の動員および/または炎症反応を阻害することもできるということを示唆するものは存在しない。

0020

単一のアミノ酸置換は、ヒトの成熟CCL2の8位にあることが好ましく、具体的には、8位におけるプロリンをアラニンで置換することからなる。これらの変異体は、ヒト成熟CCL2の9、10または13位に対応する位置にさらなる変異を含まない。

0021

上記に説明した置換の例は、CCL2−P8Aと呼ばれる成熟型のCCL2の単量体変異体であり、8位におけるプロリンのアラニンへの単一置換(配列番号2)を含むものとして、または、64位のメチオニンのイソロイシン(配列番号4)へのさらなる置換(タンパク質発現を改善する)を含むものとして発現させることができる変異体である。8位プロリン−8がアラニン(水素結合を形成することが可能な、異なった配向性化学基を有するアミノ酸)に置換されると、絶対的単量体として作用するCCL2変異体が生じる。CCL2−P8AおよびCCL2*−P8Aは、同等の活性を有する分子とみなすことができる。

0022

したがって、CCL2−P8AおよびCCL2*−P8Aと呼ばれる、これらCCL2の特定の絶対的単量体変異体について想定し得る医薬的用途、方法および組成物は、CCL2の、または二量体として天然活性を有する他のケモカインの任意の他の絶対的単量体変異体であって、同様な方法で作成されるものについても想定し得る。これらの変異体は、天然ケモカインに対して、CCL2−P8AおよびCCL2*−P8Aと同様のアンタゴニストおよびインヒビターとしての性質を示すはずであるから、医学的に応用することができるはずである。

0023

本発明の一つの態様は、例えば、自己免疫性、炎症性または感染症など、様々な病気の治療標的として知られているCCL2のような、ホモ二量体を形成するケモカインの絶対的単量体変異体を利用することである。このような変異体は、前述のケモカインの二量化界面における水素結合のパターンを変更して、レセプターに結合し、インビトロにおいては作用薬としての性質を、インビボにおいては拮抗薬としての性質を有する、薬学的組成物中の有効成分、具体的には、自己免疫性、炎症性または感染症を治療または予防するための有効成分としての絶対的単量体をもたらす、少なくとも1つのアミノ酸置換によって生じる。これらインビボにおける拮抗薬としての性質は、炎症性分子(CCL2自体、チオグリコール酸またはオボアルブミンなどのケモカイン)で誘導した後に生じる、腹膜における作用細胞の動員のような性質を評価することができるアッセイにおいて明らかにすることができる。

0024

絶対的単量体変異体は、水素結合のパターンを変更する、二量体化界面における単一アミノ酸置換から生じさせることも可能である。より好ましくは、プロリンが、ホモ二量体のようなタンパク質複合体の形成に関連する立体特異的な水素結合の形成に特に関係することが周知のアミノ酸であるため、単一アミノ酸置換は、プロリンをプロリン以外のアミノ酸と置換するものとなるはずである。あるいは、単一アミノ酸置換は、プロリン以外のアミノ酸をプロリンに置換して、水素結合の立体特異性を変えるものとなるはずである。

0025

薬学的組成物の有効成分として用いることができる、上記に定義されたホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の代替的形態には、a)活性を有する突然変異体、またはb)前記の変異体または前記の活性を有する変異体を含むポリペプチド、および前記のケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列などがある。

0026

「活性を有する」という用語は、このような代替的化合物が、本発明のCCL2突然変異体の機能的特徴を維持する必要がある、すなわち、インビボにおいてCCL2に拮抗し、細胞の動員および/または炎症反応を阻害する必要がある、ということを意味する。

0027

本明細書において定義する絶対的単量体ケモカインアンタゴニストは、本発明に係る活性型化合物として、活性画分先駆物質、塩、誘導体、複合体または結合体の形で存在することもできる。

0028

これら代替的化合物は、本明細書中に開示される基本的な特徴に影響を及ぼさない、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の配列が変更された分子を包含することを意図する。例えば、CCL2*−P8Aは、正常なCCL2活性を維持しているが、組換え発現に関して改良された性質を有するCCL2の突然変異体(CCL2−M641またはCCL2*)に基づいて作成されている。

0029

上記したCCL2−P8AをCCL2のアンタゴニストとして用いて本明細書に例示されている、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体のアンタゴニストとしての性質を、活性を有する突然変異体中で維持することができ、さらに増強することも可能である。このカテゴリーの分子は、前記配列の天然型および合成型類似体であって、当分野において既知であり、下記の実施例においても開示されている手段によって測定すると、本発明において特徴付けられた生化学的活性を、同等またはより高いレベルで示すという条件で、1個以上のアミノ酸残基が付加、欠失または置換されている類似体を含む。

0030

天然の類似体は、マウスのCCL2(SWISSPROTアクセッション番号 P10148)のように、他の生物において同定されているヒトケモカインタンパク質に該当する配列であることを意図する。ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の人為的類似体とは、既知の化学合成法、および/または部位特異的突然変異導入技術、コードDNA配列のレベルにおけるコンビナトリアル技術(DNAシャッフリングファージディスプレイ選抜など)、コンピュターによるデザイン研究、またはこれらに適切な任意の他の既知技術であって、先行技術および下記の実施例に示された教示内容を用いて当業者によって日常的に取得および試験することができる、実質的に対応する変異または短縮されたペプチドまたはポリペプチドの有限のセットを提供する技術によって調製されるポリペプチドを意図する。

0031

例えば、具体的な人為的突然変異体は、CCL2の別の位置で置換されていて、CCL2アンタゴニストを作成するために関連があることが分かっている1個以上のアミノ酸を有する可能性がある(国際公開番号03/84993)。

0032

本発明によれば、活性を有する突然変異体における好ましい変化は、一般に「保存的」置換または「安全な」置換として知られていて、非塩基性残基を含むものである。保存的アミノ酸置換は、分子の構造および生化学的機能を保存するために、十分に類似した化学的特性を有するアミノ酸をもつものである。特に挿入または欠失が、例えば10個よりも少ない、好ましくは3個よりも少ない少数のアミノ酸を含むのみで、かつ、タンパク質またはペプチドの機能的立体構造にとって決定的に重要なアミノ酸を除去も置換もしない場合であれば、上記した配列において機能を変更することなしにアミノ酸の挿入および欠失を行うこともできるのは明らかある。

0033

文献には、天然のタンパク質の配列および/または構造についての統計学的および物理化学的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の選択を行うことができる多くのモデルが提供されている(Rogov SI and Nekrasov AN,2001)。タンパク質の設計実験によって、アミノ酸の特定のサブセットを用いると、折りたたみ可能で活性を有するタンパク質が産生されることが明らかになっており、タンパク質構造の中により容易に取り込まれやすく、機能的・構造的なホモログおよびパラログを検出するために用いることができる、アミノ酸の「同義」置換を分類するのに役立っている(Murphy LR et al.,2000)。同義アミノ酸基およびより好ましい同義の基は、表Iに記載されている基である。例えば、CCL2*およびCCL2*−P8Aに共通している、イソロイシンによる64位のメチオニンの置換は、同一の基準を用いて選択されたものである。

0034

上記したホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体の活性を有する突然変異体のさらなるグループは、ペプチド模倣物ペプチドミメティクスとも呼ばれる)であり、ペプチドまたはポリペプチドの本質は、アミノ酸側鎖、アミノ酸のキラリティー、および/またはペプチド骨格のレベルで化学的に改変されている。これらの改変は、調製、効能および/または薬物動態の特徴に関して同一または改善された性質を有するホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を提供することを目的としている。

0035

例えば、対象者に注射した後ペプチドがペプチダーゼにより切断されやすくなる場合には、特に感度の高いペプチド結合非分解性ペプチド模倣物で置換することにより、より安定し、そのため治療薬としてより有用なペプチドを提供することができる。同様に、Lアミノ酸残基の置換は、タンパク質分解に対するペプチドの感度を低くして、最終的にペプチド以外の有機化合物と同じようにする標準的な方法である。また、t−ブチルオキシカルボニルアセチルセイル(theyl)、サクシニルメトキシサクシニル、スベリル(suberyl)アジピル、アゼライル(azelayl)、ダンシルベンジルオキシカルボニルフルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル(methoxyazelayl)、メトキシアジピル、メトキシスベリル(methoxysuberyl)、および2,4−ジニトロフェニルなどのアミノ末端ブロッキング基も有用である。高い効力、長期にわたる活性、精製の容易さおよび/または半減期の増大を提供するその他の多くの改変が、当分野において知られている(国際公開番号02/10195;Villain M et al.,2001)。

0036

ペプチド模倣物に含まれる、アミノ酸に対する好ましい代替的「同義」基は、表IIに記載したものである。アミノ酸誘導体の非網羅的なリストには、アミノイソ酪酸(Aib)、ヒドロキシプロリン(Hyp)、1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−COOH、インドリン−2−カルボン酸、4−ジフルオロ−プロリン、L−チアゾリジン−4−カルボン酸、L−ホモプロリン、3,4−デヒドロ−プロリン、3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンシクロヘキシルグリシン、およびフェニルグリシンが含まれる。

0037

「アミノ酸誘導体」とは、20種類の遺伝子をコードする天然アミノ酸の一つを除くアミノ酸またはアミノ酸様化学物質を意図する。具体的には、アミノ酸誘導体は、直鎖状分枝状、または環状の置換アルキル部分または非置換アルキル部分を含み、1つ以上のヘテロ原子を含むことが可能である。該アミノ酸誘導体は、デノボで作成するか、または、商業的供給源から入手可能である(Calbiochem−Novabiochem AG,Switzerland;Bachem,USA)。

0038

ペプチド模倣物および非ペプチド模倣物の合成および開発の技術は、当分野において周知である(Hruby VJ and Balse PM,2000;Golebiowski A et al.,2001)。インビトロおよびインビボの翻訳系を用いて、タンパク質の構造および機能を探索および/または改良するための、非天然アミノ酸をタンパク質に取り込む様々な方法も、文献に開示されている(Daugherty DA,2000)。

0039

本発明は、薬学的組成物中における有効成分として、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体およびその活性を有する突然変異体を用いることを開示し、また、それらのアミノ酸配列、および前記ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることも開示する。この後者の非相同の配列は、医薬品への応用性を損なうことなしに、さらなる特性を提供するはずである。このような追加的特性の例は、精製処理法の簡略化、体液中における半減期の延長、または細胞外への局在化である。この後者の特徴は、上記の定義に含まれる融合タンパク質またはキメラタンパク質の具体的なグループを定義する上で特に重要である。なぜなら、それは、これらのペプチドの単離および精製が容易になるばかりでなく、CCL2が他の分子と自然に相互作用を行う場所に、これらの単量体変異体を局在化することを可能にするからである。

0040

部分、リガンドおよびリンカーの設計、また、融合タンパク質を構築、精製、検出および使用する方法および方策についても文献において広く議論されている(Nilsson J et al.,1997;「Applications of chimeric genes and hybrid proteins」,MethodsEnzymol.Vol.326−328,Academic Press,2000;国際公開番号01/77137)。これら上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体の代替形態を作成するために用いることができる付加的タンパク質配列は、膜結合性タンパク質の細胞外ドメイン免疫グロブリン定常領域Fc領域)、多量体形成ドメイン、細胞外タンパク質シグナルペプチド含有タンパク質、輸出シグナル含有タンパク質の配列である。単量体変異体に融合させるためにこれらの配列を1つ以上選ぶことは、該因子の具体的な用途にとって有効である。この付加的タンパク質配列が、細胞外への輸出シグナルまたはシグナルペプチドを含有するタンパク質の配列のように、単量体変異体を細胞外の場所に分泌することができる場合には、該因子を、さらなる処理を考慮してより容易に培養細胞から採集して精製することができるか、または、代わりに細胞を直接用いるか、投与することができる。

0041

上記したホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体は、他の好ましい形態、例えば活性画分、前駆体、塩類、誘導体、結合体または複合体として用いることもできる。

0042

「画分」という用語は、化合物自体のポリペプチド鎖の任意の断片を単独で、または、それに結合した関連分子または残基、例えば糖類またはリン酸塩類の残基と結合して、または、元のポリペプチドまたはペプチドが凝集したものを意味する。このような分子は、通常は一次配列を変更しないその他の改変、例えばインビボまたはインビトロにおけるペプチドの化学的誘導体化(アセチル化またはカルボキシル化)、リン酸化パターンを改変してできるもの(ホスホチロシン残基、ホスホセリン残基またはホスホトレオニン残基の導入)、または、ペプチドの合成およびプロセッシングもしくはさらなる加工の工程におけるペプチドのグリコシル化(ペプチドを、例えば哺乳動物グリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響する酵素に曝露して行われる)によって作成することも可能である。

0043

「前駆体」は、細胞または身体に投与する前後に代謝上および酵素的な処理によって、本発明の化合物に変換することができる化合物である。

0044

本明細書において「塩類」という用語は、カルボキシル基の塩、および本発明のペプチド、ポリペプチド、またはそれらの類似体のアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は、当分野において既知の手段により形成することができ、例えばナトリウム塩カルシウム塩アンモニウム塩第二鉄塩または亜鉛塩などの無機塩類、および、例えばトリエタノールアミンアルギニンもしくはリジンピペリジン、プロケインなどのアミン類によって形成される塩など、有機塩基を有する塩を含む。酸付加塩は、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸を有する塩、および、例えば、酢酸シュウ酸などの有機酸を有する塩を含む。このような塩のいずれも、本発明のペプチドおよびポリペプチド、またはそれらの類似体と、本質的に同様の活性を有する。

0045

本明細書で用いる「誘導体」という用語は、アミノ酸部分の側鎖上、またはN末端基またはC末端基上に存在する官能基から、既知の方法に従って調製することができる誘導体を意味する。このような誘導体は、例えば、カルボキシル基のエステルまたは脂肪アミド、および遊離アミノ基のN−アシル誘導体、または遊離ヒドロキシル基のO−アシル誘導体を含み、アシル基によって、例えばアルカノイル基またはアロイル基として形成される。

0046

上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体の有用な結合体または複合体は、受容タンパク質または他のタンパク質(放射性または蛍光性標識、ビオチン)、治療効力細胞毒性薬)、または、ポリエチレングリコールおよび他の天然型または合成型のポリマーなど薬物送達効力に関わる因子の改良という当分野において既知の分子および方法を用いて作成することができる(Harris JM and Chess RB,2003;Greenwald RB et al.,2003;Pillai O and Panchagnula R,2001)。残基が、ポリマーに結合しやすい側鎖(すなわち、例えばリジン、アスパラギン酸グルタミン酸、システイン、ヒスチジンのような、官能基を有するアミノ酸の側鎖)を有していれば、それらを結合に用いることができる。または、これらの部位にある残基は、ポリマーに結合しやすい側鎖を有する様々なアミノ酸で置換することができる。また、遺伝子にコードされたアミノ酸の側鎖を、ポリマーに結合するように化学的に改変するか、または適切な側鎖官能基を有する非天然アミノ酸を用いることができる。ポリマーの結合は、アンタゴニストの特定の位置に天然に存在するアミノ酸の側鎖、または、アンタゴニストの特定の位置に天然に存在するアミノ酸を置換する天然または非天然のアミノ酸の側鎖に対してだけでなく、標的位置においてアミノ酸の側鎖に結合している炭水化物部分または他の部分に対しても起こる可能性がある。

0047

これらの目的に適するポリマーは、生体適合性を有する。すなわち、生体系に対して非毒性であり、このようなポリマーは多数知られている。このようなポリマーは、天然状態疎水性もしく親水性生物分解性もしくは非生物分解性、またはそれらの組み合わせであってもよい。これらのポリマーには、天然のポリマー(コラーゲンゼラチンセルロースヒアルロン酸など)、および合成ポリマーポリエステルポリオルトエステル無水物など)が含まれる。疎水性の非分解性ポリマーの例は、ポリジメチルシロキサンポリウレタンポリテトラフルオロエチレンポリエチレンポリ塩化ビニルおよびポリメチルメタリレートなどである。親水性の非分解性ポリマーの例は、ポリ(メタクリル酸2−ヒドロキシエチル)、ポリビニルアルコール、ポリ(N−ビニルピロリドン)、ポリアルキレンポリアクリルアミドおよびこれらのコポリマーなどである。好適なポリマーは、順次反復単位として、ポリエチレングリコール(PEG)のようなエチレンオキシドを含む。

0048

好ましい結合方法は、ペプチドの合成および化学的ライゲーションを組み合わせて用いる。都合のよいことに、水溶性ポリマーの結合は、生物分解性のリンカーを介して、特にタンパク質のアミノ末端領域において行われる。このような修飾によって、前駆体(または「プロドラッグ」)型のタンパク質が提供され、それは、リンカーが分解されるとポリマー修飾をもたないタンパク質を放出する。

0049

一般的な手順として、上記のホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体は、組換えDNA関連技術および化学合成技術など、当分野において既知の処理法によって作出し調製することが可能である。

0050

オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)発行の「A Practical Approach」シリーズ中の数巻(「DNA Cloning 2;Expression Systems」,1995;「DNA Cloning 4.Mammalian Systems」,1996;「Protein Expression」,1999;「Protein Purification Techniques」,2001など、多くの本や概説書に、ベクター、および原核生物(例えば大腸菌)または真核生物宿主細胞を用いて組換タンパク質クローニングして産生する方法についての教示が記載されている。

0051

本発明による別の実施形態は、本明細書に記載の絶対的単量体ケモカイン変異体アンタゴニストをコードする核酸配列である。

0052

ホモ二量体形成ケモカインの絶対的単量体変異体をコードするDNA配列を、適当なエピソーム・ベクターまたは非相同的組込みベクターであって、任意の適当な手段(形質転換形質移入接合プロトプラスト融合電気穿孔法リン酸カルシウム沈殿法、直接的マイクロインジェクション法など)によって適切な宿主細胞に導入されて、それらを形質転換することができるベクターを挿入してライゲーションすることができる。具体的なプラスミドベクターまたはウイルスベクターを選択する上で重要な要素には、ベクターを含む受容細胞を、ベクターを含まないそれら受容細胞から識別して選択することの容易さ、具体的な宿主において望ましいベクターのコピー数、および異なる種の宿主細胞間でベクターを「往復する」ことを可能にすることが望ましいか否か、などが含まれる。

0053

ベクターは、原核または真核宿主細胞中において、該細胞中において構成的に活性があるか、または誘導的に活性を有するかが選択されている転写開始終結調節配列の制御下で、本発明のアンタゴニストを含む単離タンパク質または融合タンパク質を発現させるものでなければならない。そして、このような細胞の中で実質的に濃縮された細胞株を単離して安定した細胞株を生じることができる。

0054

真核宿主(例えば、酵母菌昆虫または哺乳動物の細胞)では、宿主の性質に応じて、様々な転写および翻訳の調節配列を用いることができる。それらは、アデノウイルスウシパピローマウイルスシミアン・ウイルスなどのウイルス性由来源から派生させることができるが、この場合には、調節シグナルは、高レベルで発現する特定の遺伝子に結合している。具体例は、ヘルペスウイルスのTKプロモーターSV40初期プロモーター、酵母菌のgal4遺伝子プロモーターなどである。抑制および活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択して、遺伝子の発現を調節することができる。発現ベクターを含む宿主細胞が選択できるようにする1つ以上のマーカーを導入しても、導入DNAにより安定的に形質転換されている細胞を選択することができる。該マーカーは、栄養要求性宿主(auxotropic host)に対する光栄養(phototrophy)、例えば抗生物質のような殺生物剤耐性、または銅などの重金属などを提供する。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるDNA遺伝子配列に直接連結させるか、同時形質転換によって同一細胞に導入することができる。タンパク質の最適な合成を行うためには、さらに別の要素が必要とされる。

0055

宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよい。適正な部位における適正な折りたたみまたはグリコシル化など、タンパク質分子に対して翻訳後修飾を行うため、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳動物細胞など、真核細胞宿主が好ましい。また、酵母菌細胞も、グリコシル化など、翻訳後ペプチド修飾を行うことができる。酵母菌中で所望のタンパク質を産生させるために利用することができる強力なプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用する組換えDNA法が多数ある。酵母菌は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物中のリーダー配列を認識して、リーダー配列を有するペプチド(すなわちプレ−ペプチド)を分泌する。

0056

組換えポリペプチドを長期間、高収率で産生させるためには、安定した発現が好ましい。例えば、目的とするポリペプチドを安定して発現する細胞株を、ウイルスの複製開始点および/または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別々のベクター上に含むことができる発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクター導入後、細胞を1〜2日間富化培地で増殖させてから、選択培地切り替えてもよい。選択可能マーカーの目的は、選抜に対する耐性を付与することであり、それが存在することによって、導入配列の発現に成功した細胞の増殖および回収が可能となる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。そして、そのような細胞中で実質的に濃縮された細胞株を単離して、安定的な細胞株を生じることができる。

0057

発現宿主として利用可能な哺乳動物の細胞株は当分野において既知であり、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、仔ハムスター腎臓(BHK)細胞、サルの腎臓(COS)細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞HEK293細胞、バウズ(Bowes)メラノーマ細胞、およびヒト肝細胞癌(例えばHep G2)細胞、ならびにその他の多くの細胞株など、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。バキュロウイルス系では、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系の材料が、特に、「MaxBac」キット(Invitrogen社)として、キットの形で市販されている。

0058

化学合成技術の例は、固相合成および液相合成である。固相合成としては、例えば、合成されるペプチドのC末端に相当するアミノ酸を、有機溶媒中では不溶性支持体に結合させ、適切な保護基で保護されたアミノ基および側鎖官能基を有するアミノ酸が、C末端からN末端まで一つ一つ順番縮合される反応、および、樹脂またはペプチドのアミノ基の保護基に結合しているアミノ酸が放出される反応を交互に繰り返すことによって、このようにしてペプチド鎖伸長する合成法がある。固相合成法は、用いる保護基の種類により、大きくは、tBoc法とFmoc法に分けられる。一般的に用いられる保護基は、アミノ基に対してはtBoc(t−ブトキシカルボニル基)、Cl−Z(2−クロロベンジルオキシカルボニル基)、Br−Z(2−ブロモベンジルオキシカルボニル基)、Bzl(ベンジル基)、Fmoc(9−フルオレニルメトキシカルボニル基)、Mbh(4,4’−ジメトキシジベンズヒドリル基)、Mtr(4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル基)、Trt(トリチル基)、Tos(トシル基)、Z(ベンジルオキシカルボニル基)およびCl2−Bzl(2,6−ジクロロベンジル基)などであり、グアニジノ基に対してはNO2(ニトロ基)およびPmc(2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル基)、およびヒドロキシル基に対してはtBu(t−ブチル基)などである。所望のペプチドの合成後、保護基を脱保護反応にかけ、固体支持体から切り離す。このようなペプチド切断反応は、Boc法ではフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸によって行うことができ、Fmoc法ではTFAを用いて実施することができる。全合成CCL2タンパク質は文献に開示されている(Brown A et al.,1996)。

0059

上記ホモ二量体形成ケモカインの合成または組換え単量体変異体の精製は、この目的にとって既知の方法のいずれか1つ、すなわち、抽出、沈殿クロマトグラフィー電気泳動などを含む従来の処理法によって行うことが可能である。本発明のタンパク質を精製するために優先して用いることができる更なる精製処理法は、モノクローナル抗体またはアフィニティーグループを用いるアフィニティークロマトグラフィーであり、標的タンパク質を結合し、カラム内部に含まれるゲルマトリックス上で産生されて固定化される。タンパク質を含有する不純な調製物をカラム通過させる。タンパク質は、ヘパリンまたは特異的抗体によってカラムに結合するが、不純物は通過する。洗浄後、pHまたはイオン強度を変えてタンパク質をゲルから溶出させる。あるいは、HPLC高速液体クロマトグラフィー)を用いることもできる。タンパク質精製に広く用いられている水−アセトニトリル溶媒を用いて溶出を行うこともできる。

0060

ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療または予防するための薬学的組成物に使用することができる。特に、多発性硬化症の動物モデルについての実施例で提供された結果は、これらの単量体変異体を、多発性硬化症を治療または予防するための薬学的組成物に使用できることを示している。

0061

本発明の別の態様は、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体であって、該ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換によってできる変異体であり、薬物として使用される。このような変異体の例は、CCL2−P8AおよびCCL2*−P8Aとして、本明細書中に開示されている。しかし、本明細書の教示により、他のケモカインの配列および活性に基づいて、類似分子を同定、産生および試験することが可能になる。

0062

特に、これらの単量体変異体は、
a)CCL2−P8A(配列番号2)、
b)CCL2*−P8A(配列番号4)、
c)(a)または(b)の活性型突然変異体、または
d)(a)、(b)、または(c)を含むポリペプチド、および該ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列、
および、それらの活性画分、前駆体、塩類、誘導体、複合体または接合体の形になった、対応する単量体変異体から選択することができる。

0063

本発明の別の態様は、有効成分としてホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を含む薬学的組成物であって、該変異体は、CCL2−P8AまたはCCL2*−P8Aなど、該ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から生じたものであり、選択的には、上記の形(活性型突然変異体、それらを含むポリペプチド、または結合体など)、およびそれらをコードするDNAまたは発現する細胞の形になっている単量体である。

0064

本発明の薬学的組成物は、動物への投与に適した、適切な薬学的に許容できる担体生体適合媒体および添加物(例えば生理食塩水)を含むことができ、最終的には、活性化合物を医薬上用いることができる調製物に加工しやすくする(賦形剤、安定剤または希釈剤のような)補助剤を含むことができる。薬学的組成物は、許容できる方法で調合して、投与方式の必要に適合させることができる。例えば、薬物送達のために生体材料およびその他のポリマーを用いること、また、特定の投与方式の有効性を確認するための様々な技術およびモデルも文献に開示されている(Luo B and PrestwichGD,2001;Cleland JL et al.,2001)。

0065

「有効量」は、病気の経過および重度に影響を与えて、そのような病状を軽減または緩和するのに十分な有効成分の量を指す。有効量は投与経路および患者の状態に応じて決まる。

0066

「薬学的に許容できる」は、有効成分の生物活性の効果を妨げず、投与される宿主に対して毒性を有さない担体を含むことを意味する。例えば、非経口投与するためには、上記活性成分を、生理食塩水、デキストロース溶液血清アルブミンおよびリンゲル液のような媒体に入れて注射するための単位投与形態に処方することができる。また、担体は、デンプン、セルロース、タルクグルコースラクトーススクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉チョークシリカゲルステアリン酸マグネシウムステアリン酸ナトリウムモノステアリン酸グリセロール塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクグリセロールプロピレングリコール、水、エタノール、ならびに、石油、動物、野菜または合成物に由来する油(ピーナッツ油大豆油鉱油ゴマ油)などの様々な油から選択することもできる。

0067

有効成分の所望の血中濃度確立するために、当業者は、許容されているいかなる投与方法を用いることも、決定することもできる。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経口、または口腔粘膜経路など、様々な非経口経路によることが可能である。非経口投与は、所定の速度で、好ましくは、正確な投薬量単回投与に適した単位投与形態でポリペプチドを長時間にわたって投与するために、ボーラス注射によって、また、蓄積注射浸透圧ポンプなど、時間をかけて次第に灌流するか、制御された放出投薬形態によって行うことができる。非経口投与のための調製物は、水性または非水性の無菌溶液、懸濁液、乳液などであり、当分野において既知の補助剤または賦形剤を含むことも可能であり、常法に従って調製することができる。また、活性化合物の懸濁液を適当な油性注射懸濁液として投与してもよい。適当な脂溶性溶媒または媒体には、例えばゴマ油などの脂肪油、または、例えばゴマ油のような合成脂肪酸エステル、または、例えばオイレンエチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルなどがある。懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことができる水性注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウムソルビトールおよび/またはデキストランを含む。選択的には、該懸濁液は安定剤を含むことも可能である。薬学的組成物は、注射によって投与するのに適した溶液を含み、また、約0.01〜99%の、好ましくは20〜75%の活性化合物を、賦形剤とともに含む。直腸から投与することができる組成物は坐薬などである。

0068

当然ながら、投与される用量は、被投与者年齢性別健康状態、体重、もし受けているならば、同時に受けている治療の種類、治療頻度、および所望とする効果の性質に応じて異なると理解されるべきである。当業者に理解され、決定されているように、用量は、個々の被験体に応じて調整しなければならない。個々の治療に必要な総投薬量を複数回または単回で投与することができる。本発明の薬学的組成物は単独で、または当該症状に向けた別の治療薬、または該症状の別の病徴に向けられた他の治療薬とともに投与することができる。通常、有効成分の1日の用量は、体重1kgあたり0.01〜100mgである。分割投与または持続放出形態で投与されるときは、1日当たり1kgにつき通常1〜40mgが、所望の結果を得るために有効である。2回目または後続の投与は、初回または前回各自に投与された用量と同一か、それよりも少ないか、または多い投薬量で実施することができる。

0069

本発明の別の目的は、ケモカインの二量体化界面における水素結合のパターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換から得られた、ホモ二量体形成ケモカインの単量体変異体を有効量投与することを含む、自己免疫性または炎症性(多発性硬化症など)、または感染症を治療または予防する方法である。このような方法において用いることができる単量体変異体の例は以下のものである。
a)CCL2−P8A(配列番号2)、
b)CCL2*−P8A(配列番号4)、
c)(a)または(b)の活性型突然変異体、
d)(a)、(b)、または(c)を含むポリペプチド、および該ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列、
および、それらの活性画分、前駆体、塩類、誘導体、複合体または接合体の形になった、対応する単量体変異体。

0070

本発明の使用、変異体および方法に関する、上記の自己免疫性、炎症性または感染症の非限定的なリストは以下の通りである。関節炎関節リウマチ(RA)、乾癬性関節炎骨関節炎全身性エリテマトーデスSLE)、全身性硬化症強皮症多発性筋炎糸球体腎炎線維症、線維症、アレルギー性または過敏性の疾患、皮膚炎喘息慢性閉塞性肺疾患COPD)、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、癌、敗血症ショック、ウイルスまたはHIVによる感染症、移植気管支炎移植片対宿主病(GVHD)およびアテローム性動脈硬化症。

0071

本発明のポリペプチドおよび関連試薬の治療的用途は、動物の細胞、組織およびモデルを用いた、インビボまたはインビトロの測定法を用いて、(安全性、薬理動態および有効性について)評価することができる(Coleman RA et al.,2001;LiAP,2001,MethodsMol.Biol vol.138,「Chemokines Protocols」,Proudfoot A et al.,編、Humana Press Inc.,2000;Methods Enzymol,vol.287 and 288,Academic Press,1997)。

0072

本発明の別の態様は、本明細書に記載の絶対的単量体アンタゴニスト・ケモカイン変異体をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法である。
a)CCL2において、二量体化する能力を阻害する単一点突然変異を作出する工程、
b)レセプターに結合して、インビトロでアゴニストの性質を示す該変異体を同定する工程、
c)上記工程(b)で同定された群から、さらに、腹膜細胞動員を阻害することを特徴とする該変異体を同定する工程。

0073

これらの性質のこの評価法は、当分野において既知の伝統的な技術であり、実施例中において示されており、炎症および腹膜細胞動員を誘発することが知られている分子、例えば、CCL2そのもの、チオグリコール酸またはオボアルブミンなどのケモカインを適用するものである。

0074

特定の実施形態に関連して本発明を説明してきたが、その記載内容は、全ての改変および代用を含み、当業者は、請求の範囲の意味と目的を逸脱することなく実施することができる。

0075

以下の実施例を用いて本発明を説明するが、それらを、本発明を限定するものとは決して解釈すべきではない。

0076

実施例1:組換えタンパク質のクローニング、発現、および精製
成熟CCL2(図1;配列番号1)およびCCL2−P8A突然変異体タンパク質図1;配列番号2)、成熟CCL2*(図1;配列番号3)、およびCCL2*−P8A突然変異体タンパク質(図1;配列番号4)を、前駆体分子の24〜99位の分節に相当するヒトCCL2/MCP−1の成熟型の配列に基づいて、文献(Paavola CD et al,1998)に記載されたようにして、大腸菌において組換えタンパク質として作成および発現させた。CCL2*およびCCL2*−P8Aについては、64位のメチオニンをイソロイシンで置換すると、64位にメチオニン−スルホキシドを含む分子種が形成されるのを排除することによって、突然変異体の純度および均質性が向上する。

0077

簡単に説明すると、大腸菌で発現させるのに最適なコドン使用と、成熟型のヒトCCL2またはCCL2*をコードする配列の5’末端に付加されたメチオニンに対応するコドンを用いて、標準的な遺伝子合成技術によって、CCL2*に対するCCL2の遺伝子を構築した。8位にアラニンを含む突然変異体コンストラクトを、CCL2またはCCL2*を鋳型ポリメラーゼ連鎖反応による突然変異誘発法によって作出し、pET3aベクター(Novagen社)のXhoI部位とNdeI部位の間にクローニングした。

0078

CCL2*に基づくタンパク質をコードするプラスミドを用いてTAP302細胞を形質転換したが、この細胞は、細胞内酸化還元電位に、より確実にジスルフィド結合の形成をもたらせしめるよう、チオレドキシン還元酵素ノックアウトによって改造されているBL21 pLys S細胞である。この系統を用いると、細胞でジスルフィド結合が形成されて、リフォールディング(再折り畳み)ステップの必要がなくなると考えられる。

0079

コンストラクトは全て、標準的な分子生物学技術(PCRによる突然変異誘発および増幅、DNA配列決定、制限酵素切断)によって取得および調節された。MCP−1(P8A)の正しい配列を含むクローンの1つを用いて、大腸菌の中でタンパク質を産生させた。また、このプラスミドを用いて、BL21 Star(商標)(DE3)(Invitrogen社、カタログ番号C−6010−03)またはBL21 DE3(Novagen社カタログ番号69387−3)も形質転換した。

0080

CCL2、CCL2*、およびCCL2*−P8Aを、超音波破砕の工程、溶解工程、およびクロマトグラフィー工程(SP−セファロース・カラム;10mM K2PO4,pH 7.5におけるNaClの勾配によって溶出)を用いて、原論文の記載通りに発現および精製する。ピーク画分をまとめ、逆相HPLC(5−μmの粒子サイズおよび300−Åの孔径をもつC18カラム)によってさらに精製した。0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの勾配を次第に増加させてタンパク質を溶出したが、一般的には、タンパク質は、34±5%アセトニトリルで溶出された。次に、それらを凍結乾燥させ、35mM Tris、pH 8中で1mg/mlに溶解し、15μgのアミノペプチダーゼニュージャージー州、ロックヒル(Rock Hill,NJ)にあるPeprotech社)/1mgのタンパク質と室温にて36時間反応させ、逆相HPLCによって再精製した。アミノペプチダーゼ処理によって、N末端のメチオニンのみが取り除かれ、組換えタンパク質のN末端配列決定によって調べると、N末端グルタミンまたはN末端ピロ−グルタミン酸のいずれか(この違いによる生物活性への影響はない)が生じていた。

0081

そして、このタンパク質を凍結乾燥し、水で1〜5mg/mlに溶解して、小分けにして80℃で保存した。

0082

より大量の組換えタンパク質、また、特にはCCL2−P8Aを、これらのタンパク質を産生する大腸菌菌株の大量発酵培養液から得られた細胞沈殿物から出発する精製を行うために設計された別プロトコールを用いても採取した。通常、5Lの発酵装置は、約200g湿重量の細胞沈殿物を産生し、50Lの発酵装置は1.8kg湿重量の細胞沈殿物を産生する。ここに記載した精製処理では、200g湿重量の細胞沈殿物を処理する。

0083

細胞沈殿物を融解して、グラム湿重量あたり3mlの切断用バッファー(50mM Tris/HClバッファー、pH 8.0(カタログ番号20092391、Biosolve社))で、10mMのMgCl2(カタログ番号63065、Fluka社)、5mMのベンズアミジン/HCl(カタログ番号12073、Fluka社)、1mMの1,4 DLジチオスレイトール(DTT)(カタログ番号43819、Fluka社)、1mMのフッ化フェニルメチルスルホニルPMSF)(カタログ番号78830、Fluka社)*、20mg/L DNase(Fluka社)(カタログ番号DN−25、Sigma社)を含むものを加えた。この懸濁液をポリトロン(Polytron)でホモジナイズして、断片や塊を含まない良好なホモジネートを得た。全ての操作を4℃で行った。ホモジナイズした細菌懸濁液を、フレンチプレス(French Press)機械細胞破砕装置差圧)に移し入れた。パッセージ回数は、一般的には、1500バールで2〜4時間であった。細胞の破砕を、SDS−PAGEをクマシー・ブルーで染色して測定した。

0084

ライセートをGSA遠心分離管分注して、Sorval RC5C(16,300×g)により4℃で90分間、10,000rpmで遠心分離した。遠心分離後、上清中に目的の可溶性タンパク質が検出できないことをSDS−PAGE分析により確認した後上清を捨てた。沈殿物をスパチュラで遠心分離管から取り出して、予め重さを量っておいたビーカーの中に移して、沈殿物の重さを量った。ビーカー中で、この沈殿物1gあたり5mlの脱イオン水を加え、マグネチックスターラーを用いて4℃で30分間撹拌して沈殿物を洗った。この懸濁液を、GSA遠心分離管に入れ、Sorval RC5C(16,300×g)を用いて4℃で60分間、10,000rpmで遠心分離した。この洗浄工程を3回繰り返した。各遠心分離の後、上清中に目的の可溶性タンパク質が検出できないことをSDS−PAGE分析により確認した後上清を捨てた。

0085

この沈殿物を、1mMの1,4 DLジチオスレイトール(DTT)(カタログ番号43819、Fluka社)および6 Mのグアニジウム/HCl(カタログ番号50950、Fluka社)を含む、調製したばかりの封入体抽出用バッファー(100mM Tris/HClバッファー、pH 8.0(カタログ番号20092391、Biosolve社)に、細胞沈殿物25gあたり100mlのバッファーという割合でポリトロンを用いて可溶化した。この溶液を60℃で30分間加熱してから撹拌して、確実に単量体化した後、室温まで冷却した。このホモジネートをTi45遠心分離管に分注して、Beckman L−60(100,000×g)を用いて35,000rpmで超遠心分離した。上清を0.8〜0.2mmフィルター(SpiralCap(カタログ番号12069、PALL社)で濾過し、SDS−PAGEで解析し、クマシー蛋白質測定試薬(Pierce社)を、キットとともに配布されたプロトコールに従って用いて定量した。

0086

目的とする組換えタンパク質を、供給業者(Amersham Pharmacia社)の指示に従って充填されたSource 30 RPC樹脂を含むFineLine 35 Pilotカラム上に捕捉した。使用後、製造業者(Amersham Pharmacia社)によって提供された洗浄処理法に従って、カラムを再生させる。細胞沈殿物100gに対して、直径3.5mm×高さ23cmのカラムに全部で220ml(1カラム容量に等しい)のSource 30 RPCを充填する。このカラムを、AKTAFPLC(Amersham Pharmacia社)に据える。流速を10ml/分とし、最大圧力を1 MPaにした。試料をロードする前に、脱イオン水で2カラム容量分(440ml)を洗浄した。洗浄後、発煙37%HCl(カタログ番号84426、Fluka社)でpH 7.5に調整された5CV(カラム容量)の平衡化用バッファー(100mM Tris/HClバッファー(カタログ番号20092391:Biosolve社)で平衡化した。

0087

グアニジウム/HClに溶解させたIbs(封入体)を、5ml/分というゆっくりとした速度でカラム上にロードした。そして、5カラム容量の平衡化用バッファーで洗浄した後、5CVのバッファーA(0.1% TFAトリフルオロ酢酸(カタログ番号28904、Pierce社)および99.9%の蒸留水)でカラムを洗浄した。バッファーB(0.1% TFAトリフルオロ酢酸(カタログ番号28904、Pierce社)、9.9%の蒸留水、90%アセトニトリル(UN1648、Baker社))の0%から100%までの直線的勾配を用いて、流速10ml/分、および1 MPA圧力限界で10 CVにわたってタンパク質を溶出する。10mlの画分を回収した。検出されたピークは全て、SDS−PAGE、HPLCによって分析し、UV−分光法によって定量した。目的のタンパク質を含む画分を集めて、その量をUV−分光法によって測定した。

0088

タンパク質を、0.1mMの還元型グルタチオン(カタログ番号G−4251、Sigma社)および0.01mMの酸化型グルタチオン(カタログ番号120 000 250、Acros Organic社)を含む復元用バッファー(100mM Tris/HClバッファー、pH 8.0(カタログ番号20092391、Biosolve社)に10倍希釈することにより復元して、約0.1mg/mlという最終濃度を得た。Source 30 RPCを集めたものを一滴ずつ復元用バッファーに加えた。容量が大きい場合には、蠕動ポンプを用いてこれを行うことも可能である。溶液を4℃で一晩撹拌した。この溶液は、復元されていないタンパク質が沈殿するため、しばしばって見える。復元用バッファーにおける最終濃度0.1から0.4mg/分の範囲で、等量の復元されたタンパク質が得られた(40〜50%)。出発材料のpHおよびアセトニトリルは、復元工程に影響しない。復元の後、HPLCによってリフォールディングを追跡することも可能である。

0089

0.8mmのプレフィルターの後に0.22mmのフィルターからなる二重フィルター付き高流量蠕動ポンプを用いて復元溶液を濾過した。次に、清澄になった溶液を、UV−スペクトルによって定量した後Hiload SPセファロースHP上のカチオン交換によって濃縮した。イオン交換カラムのサイズは、タンパク質の量に依存する。500ミリグラムよりも少ないときは、16/10カラム(1CV=20ml)、500〜1000mgのときは26/10カラム(1 CV=50ml)、また、1〜2グラムのときは50/5カラム(1 CV=100ml)を用いた。

0090

カラムは、供給業者(Amersham Pharmacia社)の指示に従って充填した。カラムを2CVの脱イオン水で洗浄してから、4 CVのカチオン交換バッファーA(NaOH(カタログ番号71690(Fluka社))でpHを4.5に調整した50mM酢酸(Fluka社))で平衡化した。溶液を、酢酸でpH 4.5に調整し、伝導率を10 mSより小さくなるよう調整した。選択したカラム毎に供給業者の推奨する流速でタンパク質溶液をロードした後、5 CVのバッファーAでカラムを洗浄した。0%から100%までのバッファーB(2 M NaCl(カタログ番号71380(Fluka社)を含むバッファーA)の直線勾配を用いて、20 CVにわたってタンパク質を溶出した。画分のサイズは、カラムのサイズに応じて決まった。検出されたピークは全て、SDS−PAGE、HPLCによって分析し、UV−分光法によって定量した。解析後、AS900652を含む画分を集めて、UV−スペクトルで定量し、HPLCで分析した。

0091

メチオニン・アミノペプチダーゼ(MAP)を用いて酵素的にN末端メチオニンの除去を行った後、精製工程を行った。簡単に説明すると、試料は、まず、3.5 kDのカットオフ値膜チューブを用いて透析して、切断用バッファー(35mM Tris/HClバッファー、pH 7.5(カタログ番号20092391、Biosolve社)の中に入れた。透析用バッファーを24時間の間に3回変えた。メチオニン・アミノペプチダーゼ(MAP)を、1:10000(W:W、酵素:タンパク質)の比率でタンパク質溶液に加えた。切断を室温で48時間行った。次に、切断されたタンパク質を、上記したようにカチオン交換によって精製した。SDS−PAGEによって評価すると、タンパク質は純度98%よりも高かった。

0092

AKTA精製装置(Pharmacia社)を用いて、所望のタンパク質をさらに精製した。この装置を1 M NaOHで1時間クリーニングし、滅菌水で洗浄し、0.22mmフィルターで濾過したバッファー(0.1% TFA(トリフルオロ酢酸)(カタログ番号28904、Pierce社)および99.9%の蒸留水)で平衡化した。G−25ファイン・セファロースXK50/30カラムを用いてタンパク質を脱塩した。カラムを、1CVの1 M NaOHその後4 CVの滅菌水で洗浄してから、5 CVの0.1% TFAで平衡化した。最適な脱塩条件のために、450mlのG−25ファイン・セファロース上で、50から100mlの試料を脱塩する。容量が100mlよりも大きくなるまで、この脱塩工程を繰り返す。試料は、ロードする前に0.22mmフィルターで濾過した。流速10ml/分および最大圧力1 MPaで、1.5 CVの0.1% TFAによってカラムを溶出する。10mlの画分を滅菌チューブの中に回収する。解析後、タンパク質を含む画分を集め、無菌条件下UV−スペクトルで定量し、HPLC、SDS−PAGE、および質量分析法で解析する。

0093

DeltaPrepHPLC(WATERS社)の予備的な逆相クロマトグラフィー(RPC)を用いて、残留した混入物を取り除く。試料を、0.1% TFAに酸性化し、バッファーA(0.1% TFAトリフルオロ酢酸(カタログ番号28904、Pierce社)および99.9%の蒸留水)で平衡化したVydac C8 RPC(カタログ番号208TB101522、Vydac社)上にロードした。バッファーB(0.1% TFAトリフルオロ酢酸(カタログ番号28904、Pierce社)、99%アセトニトリル(UN1648、Baker社))の0%から100%までの直線的勾配を用いて、流速25ml/分および700バールの圧力限界で10CVにわたってタンパク質を溶出した。検出されたピークは全て、SDS−PAGE、HPLCによって分析し、UV−分光法によって定量した。解析後、AS900652を含む画分を集めて、UV−スペクトルで定量し、必要に応じて小分けにしてから凍結乾燥させた。タンパク質は、−20℃または−80℃で保存する。

0094

組換えタンパク質は、UV−VIS分光光度計(Uvikon system,KONTRON社)を用い、UV分光分析法によって定量する。水晶製キュベット(QS 1.000,HELLMA社)をバッファーの参照用に用い、もう一方のキュベットが試料を含む。350 nmから240 nmまでのスキャン結果を測定し、また、280 nmにおける吸光度を用いて、ProtParam,Expasyを用いてアミノ酸組成物から得られた吸光係数(extinction coefficient)を基準として、定量を測定した。

0095

NuPAGE 10%ゲル(カタログ番号NP0301、Invitrogen社)を用いてSDS−PAGE解析を行った。試料用バッファー(カタログ番号LC2676、Invitrogen社)で試料を2倍に希釈し、95℃で5分間加熱した。標準用タンパク質ラダーを分子量の基準として用いた。10μlの分子量標準溶液と20μlのタンパク質試料を適当なウエルにロードした。電気泳動用バッファーはMES(カタログ番号NP0002、Invitrogen社)であった。泳動は、供給業者の指示に従って、200V、12mA、および25Wで35分間(PowerEase500、Invitrogen社)で行った。

0096

NuPAGEゲルを、蒸留水中10%酢酸、30%メタノールの中で0.1% R250クマシー・ブルーによって30分間染色し、蒸留水中10%酢酸、30%メタノールの中で、ゆっくりと揺らしながらバックグラウンド量が無色になるまで脱染した。そして、ゲルを水で何度か洗浄した後、2枚のセロファン紙(Invitrogen社)の間に挟んで乾燥用溶液(Invitrogen社)の中に10分間埋め込んでから、ミニチュアプレスに載せて、ゲルが薄いシートとして保存できるようにした。または、ゲルをSimplyBlue Safe染色プロトコール(カタログ番号LC6065、Invitrogen社)を用いて染色した。

0097

ウォーターズ(WATERS)社から入手したAllianceHPLC装置を、0.1% TFAに平衡化した解析用C8 Aquapore RP−300 7m(直径0.2cm×22cm)とともに用いた。予め酸性化しておいた10〜50mgの最終0.1%TFAを注入した。タンパク質は、25〜50%のアセトニトリルの勾配により20CVにわたり溶出した。

0098

質量スペクトル解析およびN末端配列解析によって、組換えタンパク質の同一性を確認した。精製された材料について、正しいN末端配列であるQPDAINAAVTが得られた。

0099

主な分子種については、2つのジスルフィド結合をもつタンパク質鎖の理論上の質量に対応する質量である8655 Daが得られた。N末端のグルタミン残基ピログルタミン酸に修飾されたものに対応する、17 Daの小さな質量をもつ別の分子種も観察された。この修飾が存在しても、タンパク質の活性には影響を与えない。

0100

実施例2:細胞アッセイ
材料および方法
ケモカイン誘導による腹膜細胞動員の測定法
8から12週の雌のBalb/Cマウス(Janvier,France)を、通常の動物を閉じこめる条件の下で、標準的な12時間の明/暗周期飼育食餌と水を自由に与えて飼育した。3〜6匹のマウスからなるグループに、200μlの食塩水LPSを含まないNaCl 0.9%(w/v))、または200μlのこの溶液に、1回の注射あたり10μgのCCL2またはCCL2−P8Aを含むものを腹腔内注射した。CCL2誘導による腹膜細胞動員に対するCCL2−P8Aの阻害効果を調べる研究では、これらの分子を、CCL2を腹腔内注射する30分前に腹腔内に投与した。全ての分子は、上記した濃度とバッファー(食塩水)で投与された。CCL2またはCCL2−P8Aを最後に注射してから4時間たったところでマウスを殺処理した。

0101

チオグリコール酸誘導による腹膜細胞動員の測定法が公開されている(Mishell B,1980)。簡単に説明すると、30gの無水チオグリコール酸培地(Becton Dickinson社)を1リットルの冷たい蒸留水に懸濁し、次に、沸騰するまで加熱して粉末を完全に溶かしてチオグリコール酸培地を調製した。そして、この培地を、100mlボトルに分けてオートクレーブした。冷却した後、培地を室温暗黒下で少なくとも1ヶ月保存した。1日目にCCL2*−P8Aを投与した30分後に200μlの3%チオグルコール酸溶液を3匹のグループのマウスに腹腔内注射して細胞動員を誘導した。その後3日間CCL2*を投与した(2、3、および4日目)。デキサメタゾン(Sigma社)は、陽性対照として使用され、10mg/kgで腹膜内から投与された。5日間たったところでマウスを殺処理した。

0102

前記アッセイにおける細胞動員を評価するために腹腔洗浄を以下のように行った。マウスをプレキシグラス製の箱の中でCO2の濃度を上げて窒息させた。70%エタノールで皮膚を消毒した。皮膚の外層を取り除いて、腹膜を露出させた。5mlの氷冷PBSリン酸緩衝食塩水)で腹腔を3回洗浄して、液体を、上に置いた15mlのポリスチレン製のFalconチューブ(Becton Dickinson)に集めた。各洗浄をするときには、腹腔を軽くマッサージした。洗浄液を425×gで遠心分離し、上清を捨て、得られた細胞沈殿物を、1mlのPBSにやさしく何度もピペッティングして再懸濁した。10μlの細胞懸濁液を90μlのトリパンブルーで染色し、Neubauer血球計算器を用いて、各1mm2の領域4つで計数して、全細胞数を数えた。血球計算器に添付されている使用説明書に従って、4つの計数結果の平均値を出して、希釈係数10を掛け、再び10を掛けて、1μlあたりの細胞数を算出した。最後に、この総数を1000倍(1mlに等しい)して、回収した全細胞数を得た。

0103

結果
成熟した組換えヒトCCL2/MCP−1およびCCL2*と呼ばれる突然変異型、ならびに、これらに対応するCCL2−P8A および CCL2*−P8A(図1)と呼ばれる絶対的単量体突然変異体を大腸菌の中で発現させた。

0104

文献には、CCL2におけるP8A突然変異が、レセプターを発現する細胞や、ウイルスレセプター様タンパク質に対する結合に影響することなく、しかし、関連したアッセイ法において既知のCCL2アンタゴニストの活性を示すこともなく、CCL2二量体の形成を阻害することが明確に示されている(Paaavola CD et al.,1998の表1記載の(1+9−76)MCP−1参照;Alexander JM et al.,2002)。

0105

CCL2の絶対的単量体型は、細胞に基づいたアッセイ法で行われるアッセイにおいて、特異的かつ意外な性質を示す。腹膜細胞動員アッセイにおいて、CCL2*−P8AおよびCCL2−P8Aは、天然のCCL2ほど細胞を動員することができない(図2)。さらに、これらの分子は、用量依存的な様式で、CCL2誘導による(図3A)、およびチオグリコール酸誘導によるマクロファージ動員を阻害することができる(図3B)。後者のアッセイにおいて、CCL2−P8Aは、陽性対照(デキサメタゾン、既知の炎症性化合物)と同じくらい効果的に見える。

0106

実施例3:動物の疾患モデルにおけるCCL2−p8Aの性質
材料および方法
オボアルブミン誘導による肺炎症モデル
オボアルブミン誘導による肺炎症モデルは、公開されているように実施されていた(Blyth DI et al.,1996)。25μ1のオボアルブミン(2mg/ml)、250μlの水酸化アルミニウムを、LPSを含まない0.9% NaCl(食塩水)725μlの中で混合してから、4℃で3〜4時間沈殿させて調製したものである、2mgの水酸化アルミニウム2%(Serva)に沈殿させた10μgの鶏卵アルブミンを全容量200μ1にしたものを腹腔内注射して、6匹のマウスのグループに感作した。感作してから15日後、15日目から19日目まで毎日吸入麻酔イソフルレン)下で、50μlの食塩水に入れた15μgのオボアルブミンを鼻腔内投与して6匹のマウスのグループを処理および抗原投与した。各抗原投与の30分前に、CCL2−P8A(200μl、腹腔内注射1回分あたり10μg)を投与した。細胞動員および細胞計測数を評価するために、上記実施例2に記載されたように腹腔内洗浄を行った。

0107

AE実験的自己免疫性脳脊髄炎)モデル
チャールズリバー・イタリー(Charles River Italy:EAEに対する感受性が記録されている選抜系統;Sahrbacher UC et al.,1998)に由来するC57B1/6マウスを、0.5mgのヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含む完全フロインドアジュバント(CFA,Difco,Detroit,U.S.A.)に入った200μgのMOG35-55ペプチド(Neosystem,Strasbourg,France)からなる乳液0.2 mLを左脇腹に皮下注射することにより免疫する(0日目)。その直後、400μLのバッファー(0.5 M NaCl,0.017% Triton X−100,0.015 M Tris,pH=7.5)に溶解した500ngの百日咳毒素(List Biological Lab社、Campbell,CA,U.S.A.)の静脈注射を受ける。2日目に、動物に500ngの百日咳毒素の2回目の静脈注射をする。7日目に、2回目の投薬である、CFAに入った200μgのMOG35-55ペプチドを右脇腹に皮下注射して、マウスに投与する。ほぼ8日から10日目に始まって、この処理は、尻尾から前肢まで上ってくる少しずつ進行する麻痺をもたらす。7日目から、以下の臨床スコアを用いて、麻痺が存在するか、動物を個体ごとに試験した。;
0=病気の徴候ない
0.5=尾の部分的麻痺
1=尾の麻痺
1.5=尾の麻痺+部分的な片側性後肢の麻痺
2=尾の麻痺+後肢が弱る、または部分的な後肢の麻痺
2.5=尾の麻痺+部分的な後肢の麻痺(骨盤下部)
3=尾の麻痺=完全的な後肢の麻痺
3.5=尾の麻痺+完全的な後肢の麻痺+失禁
4=尾の麻痺+後肢の麻痺+前肢の弱りまたは部分的麻痺
5=瀕死または死亡

0108

化合物または媒体による治療を、免疫後7日目に各動物に対して開始し、21日間継続する(処理グループあたり動物10〜12頭)。インターフェロン−βとCCL2−P8Aを、1日に1回、10ml/kgPBSに可溶化させて、図に示した容量でそれぞれ皮下または静脈内に投与した。

0109

遅延型接触過敏症モデル
接触過敏症を測定するためにマウス耳腫脹(ear−swelling)試験を、前述のように行った(Garrigue JL et al.,1994)。簡単に説明すると、アセトンオリーブ油(4:1)中0.5%の2,4−ジニトロフルオロベンゼン(DNFB;Sigma Chemical社)溶液25μ1を、毛を剃った腹に局所的に施用してマウスを感作した。5日後、同じ媒体中の0.2% DNFBを右耳に適用し、媒体だけを左耳に適用した。5日目にマウス(1グループあたりn=6)を、0.05、0.5または5mg/kg(それぞれ1、10または100マイクログラム/マウス)のCCL2−P8A、デキサメタゾン(1mg/kg)、または対照グループではPBSだけを腹腔内投与して処理した。この処理は、DNFBを投与する30分前に行われた。ダイアル厚さ測定計(Mitutoyo社)での厚さを測定した。投与後の値から投与前の値を引いて、また、さらに、媒体投与された反対側の耳で検出された膨張を全て引いて、耳の膨張を評価した。

0110

結果
ケモカインアンタゴニストとしてのCCL2−P8Aの治療薬作用の可能性を、炎症および自己免疫疾患の動物モデルで試験した。

0111

CCL2*−P8Aを疾患モデルである、オボアルブミン誘導による肺炎で試験した。アレルギー性肺炎のこの古典的なモデルでは、免疫反応を増強するために感作期間中水酸化アルミニウムアジュバントとともにオボアルブミンでマウスを感作し、その後、5日間連続してオボアルブミンを鼻腔内投与して抗原投与するが、この期間中ずっとCCL2−P8Aを腹腔内投与した。また、この場合、CCL2−P8Aは、細胞動員を阻害することができた(図4)。

0112

第2のモデルでは、ヒトの中枢神経系の自己免疫性の炎症性脱髄疾患を治療するためのケモカイン(CCL2を含む)のアンタゴニストを確認するために利用されてきた周知の多発性硬化症モデルであるEAE(実験的自己免疫性脳脊髄炎)モデルでCCL2−P8を試験した(Mahad DJ and Ransohoff RM,2003;Izikson L et al.,2002)。CCL−P8Aは、EAE誘発化合物で処理した後、臨床スコアで評価すると中程度または重度の病気を示す動物で試験した。これら2つの動物グループをそれぞれ5つのサブグループに分け、うち3つを異なった量のCCL2−P8Aで処理し、残りの2つを陰性対照(媒体のみで処理した)または陽性対照(多発性硬化症を治療するための一般的な治療用産物であるインターフェロン−βで処理した)として用いた。動物の状態の変化を、処理期間(21日間)中に測定した臨床スコアに基づいて比較した。両疾患モデルにおいて、CCL2−P8A(0.15mg/kgまで低下させた投薬量で)は、統計学的に有意に動物の状態を改善する。CCL−P8Aを用いたときに観察される臨床スコアの減少は、少なくとも、インターフェロン−βを治療薬として用いたときに観察される臨床スコアの減少に匹敵する。(図5)。

0113

別の疾患モデルである接触過敏症モデルを用いて、T細胞によって仲介される皮膚炎に対するCCL2−P8Aの治療効果の可能性を評価した。接触過敏症(CHS)は、ランゲルハンス細胞(LC)依存性のT細胞介在型皮膚免疫反応で、インビボにおけるLC活性(皮膚上抗原の取り込み、リンパ節への移動、および無処理T細胞への抗原提示)が最高になっていることを反映するものである。このモデルは、乾癬およびアレルギー性接触皮膚炎のような皮膚科学的適応症に対する化合物の特徴を調べるために十分に確立されている(Xu H et al.1996)。それは、感作期間およびその後の抗原投与を含み、皮膚の浮腫および細胞浸潤物の形成を伴う皮膚炎をもたらす。浮腫は、抗原投与部位(マウスの耳)でノギスにより測定することができる。この過剰反応疾患の発症におけるケモカインの関与、特にCCL2の関与が示されていた(Mitsui G et al.,2003;Mizumoto N et al.,2001)。抗原(この場合DNFB)を投与する30分前にCCL2−P8Aを腹腔内投与すると、処理後1日で、既知の抗炎症性化合物(デキサメタゾン)を用いたときに観察される膨張の減少に匹敵し得る膨張の減少がもたらされる。対照用マウスは、抗原投与して得られたが、その前に感作させるか、させないで、T細胞依存性炎症および浮腫が形成されるか否かが決まる(図6)。

0114

したがって、ホモ二量体形成CC−ケモカインの単量体変異体であって、二量体化界面における水素結合パターンを変更する少なくとも一つのアミノ酸置換によって生じた変異体は、インビボ細胞動員アッセイ法において、またヒト疾患の動物モデルにおいても、ケモカイン仲介型細胞動員のインヒビターであるが、このことは、これが、薬学的組成物を調製するために使用することができ、また治療法において使用することもできるケモカイン変異体を作成するための新しい方法であることを示唆している。

0115

実施例4:CCL2−P8Aの代替型
上記開示されたケモカイン変異体の代替型を、特定の特徴を改善するものとして当分野で既知の突然変異を導入することによって作成することができる。

0116

CCL2−P8Aの異なる位置に1つ以上の単一アミノ酸の置換および/または付加を導入することができる(図7A)。CCL2−P8Aは、天然のグルタミンN末端残基を失った成熟タンパク質として、または、グルタミンの前のN末端に付加的な小型の残基(アラニンやグリシンなど)を付加して発現させることができ、その結果、この残基は露出した状態に置かれることなく、ピログルタミン酸型に自然に変換されることがなくなる(Gong J and Clark−LewisI,1995)。また、CCL−P8Aは、5番目のシステインを利用して特異的ペグ化反応が可能になるよう突然変異させることもできる。これらのペグ化部位は、内部アミノ酸(例えば、1回の改変で単量体化とペグ化の両方をもたらすことができる14位または17位のアスパラギン、およびさらには8位)、またはC末端(天然のC末端スレオニン後ろにシステインを直接付加することによる)のいずれかのレベルで取り込むことが可能である。

0117

この配列を、循環血液中における組換えタンパク質の安定性と有効性を向上させることが知られているタンパク質ドメインである、免疫グロブリンドメインの定常領域に融合させることによって、CCL2−P8Aのさらなる変異体を得ることができる。得られた融合タンパク質は、融合タンパク質を培養培地に分泌させるのに適した発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞(CHO細胞またはHEK293細胞など)によって直接発現させることができる。好ましい構成において、成熟型CCL2−P8Aをコードする核酸配列は、5’末端においてヒトCCL2のシグナル配列をコードする核酸配列、および3’末端においてヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖IgG1(NCBIアクセッション番号CAA75302)の定常領域(セグメント246〜467)をコードする核酸配列に融合している発現ベクターの中にクローニングされる。得られたベクターを用いてCHO細胞株またはHEK293細胞株を形質転換することができ、N末端にCCL2−P8A、C末端にIgG1配列を有する組換え融合タンパク質を安定して発現および分泌するクローン(図7B)を選択することができる。そして、生産規模を上げるため、および培養培地から組換え融合タンパク質を精製するためにこのクローンを用いることができる。あるいは、ヒト免疫グロブリンのラムダ重鎖IgG1の定常領域(セグメント243〜474)とCCL2−P8Aをコードする核酸の位置を逆にすることもでき、得られたタンパク質を、依然としてヒトCCL2のシグナル配列を用いるか、任意の別のシグナル配列を用いて発現および分泌させることができる。

図面の簡単な説明

0118

ヒト成熟CCL2(SWISSPROTアクセッション番号P13500、配列番号1)、成熟CCL2+P8A(配列番号2)、成熟CCL2*(配列番号3)、成熟CCL2*−P8A(配列番号4)のアミノ酸配列。CCL2*およびCCL2*−P8Aの第64位におけるイソロイシンへの突然変異(M64I)が四角で囲まれており、関連突然変異P8Aをボールド体下線で示す。
腹膜細胞動員アッセイ法において、組換えヒトCCL2およびCCL2−P8Aの細胞動員活性をベースラインと比較したグラフ
2種類の異なる誘導物質であるCCL2(図A)またはチオグリコール酸(図B)を用いた、腹膜細胞動員アッセイ法におけるCCL2−P8Aの用量応答阻害活性を示すグラフ。結果を、ベースライン量、陰性対照(媒体のみ、食塩水)および陽性対照であるデキサメタゾン(Dex、図Bのみ)と比較する。
オボアルブミン誘導肺炎症アッセイ法におけるCCL2−P8Aの阻害活性を示すグラフ。結果を、ベースライン量、および陰性対照(食塩水)と比較する。
EAE(実験的自己免疫性脳脊髄炎)と呼ばれる多発性硬化症の動物モデルにおいて、動物が、臨床スコアの低い(2以下:A)軽い病気か、または、臨床スコアの高い(少なくとも3:B)重い病気を示す場合に、臨床スコアの減少に対するCCL2−P8Aの効力を示すグラフである。データを、媒体のみ(陰性対照)、または、EAEモデルに関する陽性対照(マウスのインターフェロンβ)を用いて観察されるデータと比較してある。各グラフの下にあるアステリスクの数は、各時点で陰性対照と比較した場合に見られた効果の統計的有意性の程度を示している(一元配置分散分析の後にフィッシャー検定して計算すると、*はp<0.05を意味し、**はp<0.01を意味し、および***はp<0.001を意味する)。
皮膚炎の動物モデル(感作されたマウスの耳にDNFBによって引き起こされる炎症)に様々な用量で投与された場合のCCL2−P8Aの阻害活性、すなわち、処理後の耳の膨潤容積に対するCCL2−P8Aの効果を示すグラフであって、以下の対照と比較したものである。感作されていないが、5日目にDNFBを抗原投与された動物(A)、感作され、抗原を投与されたが、媒体のみで処理された動物(B)、およびデキサメタゾン(Dex、CCL2−P8Aと同じ方法で投与された)で処理された動物。値は、6日目(処理および抗原投与後の日数)に測定された。
単一/複数のアミノ酸付加および/または置換によって(A)、または、ヒト免疫グロブリンのλ重鎖IgG1の第243〜474位の残基への融合(B、CCL2シグナル配列を二重下線で、成熟型CCL2−P8Aを下線で示す)によって生成することができるCCL2−P8Aの代替形態。

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