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技術 試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬

出願人 株式会社シノテスト
発明者 金子恵美子磯江準一
出願日 2006年3月6日 (12年9ヶ月経過) 出願番号 2006-058868
公開日 2007年9月20日 (11年2ヶ月経過) 公開番号 2007-240163
状態 特許登録済
技術分野 化学反応による材料の光学的調査・分析 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 陰イオン性化合物 ブロムクレゾールグリーン 水溶液試料 フルオレセイン骨格 測定妨害物質 界面活性剤不含 温度一定 汎用自動分析装置
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2007年9月20日)のものです。
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図面 (9)

課題

測定に掛かるコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院でも使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬を提供することを目的とする。

解決手段

本発明は、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液吸光度を測定することからなる、試料中のタンパク質の測定方法である。 また、本発明は、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含有する、試料中のタンパク質の測定試薬である。

概要

背景

血清又は血漿タンパク質濃度は、脱水網内系疾患又は慢性感染症等において高値となる。また、血漿タンパク漏出栄養不良又は肝機能障害等において低値となる。

このように血清又は血漿のタンパク質濃度は、各種疾患又は各種病態に伴って変化するので、その測定は疾患の診断及び治療において重視されている。

また、尿中のタンパク質は、腎疾患心疾患血液疾患、黄だん又は高熱等において出現する。

この尿中のタンパク質を測定することも、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

また、タンパク質の一種であるアルブミンは、血液濃縮状態において血清又は血漿中の濃度が高値となる。そして、先天性無アルブミン血症肝実質障害、栄養摂取不足火傷出血ショックタンパク漏出性胃腸炎吸収不良症候群又は消耗性疾患等において血清又は血漿中の濃度が低値となる。
この血清又は血漿中のアルブミンを測定することは、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)の濃度は、健常者においては極めて微量なものであり、その基準参考値は6.5±5.1mg/L未満(随時尿)である。
この尿中のアルブミンは、糖尿病性腎症慢性糸球体腎炎潜在期若しくは良性腎硬化症などの非糖尿病性腎疾患、尿路感染症高血圧又はうっ血性心不全等において出現する。
そして、尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)を測定することは、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

従来の総タンパク質測定方法(並びに測定試薬測定キット)としては、まず、タンパク質と結合するとその色調を変える色素担体含浸させた試験片を用いる方法がある。しかし、この試験片を用いる方法は、検出限界が100〜200mg/Lであり、試料中に微量に含まれるタンパク質を測定することができないものであった。また、この方法は、試料中の他の物質非結合態色素の影響を受けて、測定誤差が生じる場合もあった。

また、タンパク質中の4個のペプチド結合アルカリ溶液中で2価の銅イオンキレート結合して紫色に発色する反応を利用するBiuret法は、検出限界が100mg/Lであり、測定の感度は低いものであった。

そして、やはり2価の銅イオンとフェノール試薬を用いるLowry法は、検出限界が25mg/Lと、Biuret法よりは感度は高いが、試料中の微量のタンパク質の測定には、いまだ感度は不充分なものであった。

また、ピロガロールレッドモリブデン錯体酸性条件下でタンパク質と結合することにより青紫色に変色する反応を利用するピロガロールレッド・モリブデン錯体発色法は、検出限界が20mg/LとLowry法よりも感度は高いが、やはり試料中の微量のタンパク質の測定には感度は不充分であった。

上述したように従来の総タンパク質の測定方法、測定試薬及び測定キットは、検出限界が高く、すなわち測定の感度が低いものであり、試料中の微量のタンパク質の測定においては、感度は不充分なものであった。
従来のアルブミンの測定方法及び測定試薬としては、ブロムクレゾールグリーンBCG)がクエン酸酸性下でアルブミンと結合し、青色を呈することを利用し、この発色による吸光度の増加を測定して試料中のアルブミン濃度を求めるBCG法が知られていた。
また、ブロモクレゾールパープル(BCP)がアルブミンと結合し、青色を呈することを利用し、この発色による吸光度の増加を測定して試料中のアルブミン濃度を求めるBCP法も知られていた。

このBCG法及びBCP法は、多くの病院で使用されている汎用自動分析装置に適用でき、これにより簡便かつ短時間の内に測定を行うことができる方法であるが、尿中のアルブミンのように、試料中に極めて微量にしか存在しないアルブミンの測定においては、測定の感度は充分とは言えないものであった。
そこで、尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)の測定には、より高感度放射免疫測定法酵素免疫測定法免疫比濁法又はラテックス凝集反応法等の免疫学的測定法測定原理とする測定方法及び測定試薬が従来用いられてきた(測定感度:5〜30mg/L)。
しかしながら、これらの免疫学的測定試薬は共通して、アルブミンに特異的に結合する抗体を動物等より調製し、それを原料とするため、測定試薬のコストが高いという難点があった。
更に、この抗体を動物等より調製するため、抗体のロットにより感度に差が生じることがあり、一定感度の測定試薬の提供が難しいということもあった。
また、これらの免疫学的測定法及び測定試薬には、汎用自動分析装置で測定を行うことができず専用の測定装置でないと測定が行えなかったり、測定に時間が掛かったり、又は測定操作が煩雑であるという難点を有するものもあった。

臨床検査法提要」(改訂第32版)、第171頁〜第177頁、金原出版、2005年
「臨床検査法提要」(改訂第32版)、第473頁〜第481頁、金原出版、2005年

概要

測定に掛かるコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院でも使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬を提供することを目的とする。本発明は、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度を測定することからなる、試料中のタンパク質の測定方法である。 また、本発明は、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含有する、試料中のタンパク質の測定試薬である。

目的

本発明の課題は、測定に掛かるコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬を提供することである。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

試料フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液吸光度を測定することからなる、試料中のタンパク質測定方法

請求項2

試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のpHをpH5.0以下とすることを特徴とする請求項1記載の試料中のタンパク質の測定方法。

請求項3

混合液のpHをpH5.0以下とすることを、当該混合液に酸性溶液を添加することにより行うことを特徴とする請求項2記載の試料中のタンパク質の測定方法。

請求項4

界面活性剤が、非イオン性界面活性剤及び/又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の試料中のタンパク質の測定方法。

請求項5

界面活性剤が、混合液中で当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度であることを特徴とする請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の試料中のタンパク質の測定方法。

請求項6

フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物が、エリスロシンBであることを特徴とする請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の試料中のタンパク質の測定方法。

請求項7

タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の試料中のタンパク質の測定方法。

請求項8

フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含有する、試料中のタンパク質の測定試薬

請求項9

少なくともフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含有する溶液からなる第1試薬と、酸性溶液からなる第2試薬との組み合わせよりなり、界面活性剤が当該第1試薬及び/又は当該第2試薬に添加されていることを特徴とする請求項8記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

請求項10

酸性溶液からなる第2試薬が、試料及び第1試薬を混合した混合液に当該第2試薬を添加することにより、当該混合液のpHをpH5.0以下とすることができるものであることを特徴とする請求項9記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

請求項11

界面活性剤が、非イオン性界面活性剤及び/又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項8〜請求項10のいずれか1項に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

請求項12

界面活性剤が、混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度となるような濃度に設定されていることを特徴とする請求項8〜請求項11のいずれか1項に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

請求項13

フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物が、エリスロシンBであることを特徴とする請求項8〜請求項12のいずれか1項に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

請求項14

タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする請求項8〜請求項13のいずれか1項に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

技術分野

0001

本発明は、試料中に微量に含まれるタンパク質を非常に高感度に測定することができる測定方法及び測定試薬に関する。本発明は、分析化学生命科学、及び医療の分野において有用であり、特に臨床検査分野において有用なものである。

背景技術

0002

血清又は血漿タンパク質濃度は、脱水網内系疾患又は慢性感染症等において高値となる。また、血漿タンパク漏出栄養不良又は肝機能障害等において低値となる。

0003

このように血清又は血漿のタンパク質濃度は、各種疾患又は各種病態に伴って変化するので、その測定は疾患の診断及び治療において重視されている。

0004

また、尿中のタンパク質は、腎疾患心疾患血液疾患、黄だん又は高熱等において出現する。

0005

この尿中のタンパク質を測定することも、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

0006

また、タンパク質の一種であるアルブミンは、血液濃縮状態において血清又は血漿中の濃度が高値となる。そして、先天性無アルブミン血症肝実質障害、栄養摂取不足火傷出血ショックタンパク漏出性胃腸炎吸収不良症候群又は消耗性疾患等において血清又は血漿中の濃度が低値となる。
この血清又は血漿中のアルブミンを測定することは、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

0007

尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)の濃度は、健常者においては極めて微量なものであり、その基準参考値は6.5±5.1mg/L未満(随時尿)である。
この尿中のアルブミンは、糖尿病性腎症慢性糸球体腎炎潜在期若しくは良性腎硬化症などの非糖尿病性腎疾患、尿路感染症高血圧又はうっ血性心不全等において出現する。
そして、尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)を測定することは、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。

0008

従来の総タンパク質の測定方法(並びに測定試薬、測定キット)としては、まず、タンパク質と結合するとその色調を変える色素担体含浸させた試験片を用いる方法がある。しかし、この試験片を用いる方法は、検出限界が100〜200mg/Lであり、試料中に微量に含まれるタンパク質を測定することができないものであった。また、この方法は、試料中の他の物質非結合態色素の影響を受けて、測定誤差が生じる場合もあった。

0009

また、タンパク質中の4個のペプチド結合アルカリ溶液中で2価の銅イオンキレート結合して紫色に発色する反応を利用するBiuret法は、検出限界が100mg/Lであり、測定の感度は低いものであった。

0010

そして、やはり2価の銅イオンとフェノール試薬を用いるLowry法は、検出限界が25mg/Lと、Biuret法よりは感度は高いが、試料中の微量のタンパク質の測定には、いまだ感度は不充分なものであった。

0011

また、ピロガロールレッドモリブデン錯体酸性条件下でタンパク質と結合することにより青紫色に変色する反応を利用するピロガロールレッド・モリブデン錯体発色法は、検出限界が20mg/LとLowry法よりも感度は高いが、やはり試料中の微量のタンパク質の測定には感度は不充分であった。

0012

上述したように従来の総タンパク質の測定方法、測定試薬及び測定キットは、検出限界が高く、すなわち測定の感度が低いものであり、試料中の微量のタンパク質の測定においては、感度は不充分なものであった。
従来のアルブミンの測定方法及び測定試薬としては、ブロムクレゾールグリーンBCG)がクエン酸酸性下でアルブミンと結合し、青色を呈することを利用し、この発色による吸光度の増加を測定して試料中のアルブミン濃度を求めるBCG法が知られていた。
また、ブロモクレゾールパープル(BCP)がアルブミンと結合し、青色を呈することを利用し、この発色による吸光度の増加を測定して試料中のアルブミン濃度を求めるBCP法も知られていた。

0013

このBCG法及びBCP法は、多くの病院で使用されている汎用自動分析装置に適用でき、これにより簡便かつ短時間の内に測定を行うことができる方法であるが、尿中のアルブミンのように、試料中に極めて微量にしか存在しないアルブミンの測定においては、測定の感度は充分とは言えないものであった。
そこで、尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)の測定には、より高感度な放射免疫測定法酵素免疫測定法免疫比濁法又はラテックス凝集反応法等の免疫学的測定法測定原理とする測定方法及び測定試薬が従来用いられてきた(測定感度:5〜30mg/L)。
しかしながら、これらの免疫学的測定試薬は共通して、アルブミンに特異的に結合する抗体を動物等より調製し、それを原料とするため、測定試薬のコストが高いという難点があった。
更に、この抗体を動物等より調製するため、抗体のロットにより感度に差が生じることがあり、一定感度の測定試薬の提供が難しいということもあった。
また、これらの免疫学的測定法及び測定試薬には、汎用自動分析装置で測定を行うことができず専用の測定装置でないと測定が行えなかったり、測定に時間が掛かったり、又は測定操作が煩雑であるという難点を有するものもあった。

0014

「臨床検査法提要」(改訂第32版)、第171頁〜第177頁、金原出版、2005年
「臨床検査法提要」(改訂第32版)、第473頁〜第481頁、金原出版、2005年

発明が解決しようとする課題

0015

本発明の課題は、測定に掛かるコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬を提供することである。

課題を解決するための手段

0016

本発明は、以下の発明を包含するものである。
(1)試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度を測定することからなる、試料中のタンパク質の測定方法。
(2) 試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のpHをpH5.0以下とすることを特徴とする前記(1)に記載の試料中のタンパク質の測定方法。
(3) 混合液のpHをpH5.0以下とすることを、当該混合液に酸性溶液を添加することにより行うことを特徴とする前記(2)に記載の試料中のタンパク質の測定方法。
(4) 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤及び/又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれか1つに記載の試料中のタンパク質の測定方法。
(5) 界面活性剤が、混合液中で当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度であることを特徴とする前記(1)〜(4)のいずれか1つに記載の試料中のタンパク質の測定方法。
(6) フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物が、エリスロシンBであることを特徴とする前記(1)〜(5)のいずれか1つに記載の試料中のタンパク質の測定方法。
(7) タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする前記(1)〜(6)のいずれか1つに記載の試料中のタンパク質の測定方法。
(8) フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含有する、試料中のタンパク質の測定試薬。
(9) 少なくともフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含有する溶液からなる第1試薬と、酸性溶液からなる第2試薬との組み合わせよりなり、界面活性剤が当該第1試薬及び/又は当該第2試薬に添加されていることを特徴とする前記(8)に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
(10) 酸性溶液からなる第2試薬が、試料及び第1試薬を混合した混合液に当該第2試薬を添加することにより、当該混合液のpHをpH5.0以下とすることができるものであることを特徴とする前記(9)に記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
(11) 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤及び/又は陽イオン性界面活性剤であることを特徴とする前記(8)〜(10)のいずれか1つに記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
(12) 界面活性剤が、混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度となるような濃度に設定されていることを特徴とする前記(8)〜(11)のいずれか1つに記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
(13) フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物が、エリスロシンBであることを特徴とする前記(8)〜(12)のいずれか1つに記載の試料中のタンパク質の測定試薬。
(14) タンパク質が、アルブミンであることを特徴とする前記(8)〜(13)のいずれか1つに記載の試料中のタンパク質の測定試薬。

発明の効果

0017

本発明の試料中のタンパク質の測定方法は、測定に掛かるコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質を高感度に測定することができる、という効果を有するものである。

0018

また、本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、そのコストが低いものであって、専用装置ではなく多くの病院で使用されている汎用自動分析装置にも適用でき、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質を高感度に測定することができる、という効果を有するものである。

発明を実施するための最良の形態

0019

〔I〕.試料中のタンパク質の測定方法
1.本発明の試料中のタンパク質の測定方法
本発明の試料中のタンパク質の測定方法は、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度を測定することからなるものである。
2.試料
本発明における試料としては、タンパク質を含む可能性がある試料であれば特に限定されないが、例えば、ヒト若しくは動物に由来する試料、植物に由来する試料、微生物に由来する試料、食物、飲料、薬剤、試薬、又は環境試料等を挙げることができる。

0020

ヒト若しくは動物に由来する試料は、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、大便精液髄液唾液腹水、若しくは羊水;脳、心臓腎臓、若しくは肝臓などの臓器毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織;又は細胞等を挙げることができる。

0021

食物は、特に限定されず、例えば、食肉野菜穀物果物水産物、又は加工食品等を挙げることができる。

0022

飲料は、特に限定されず、例えば、ジュース牛乳コーヒー、又は酒類等を挙げることができる。

0023

薬剤は、特に限定されず、例えば、輸液注射液散剤、又は錠剤等を挙げることができる。

0024

なお、測定に用いる試料の形態は、液体である必要があるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。

0025

また、必要に応じて、希釈又は濃縮処理を行ってもよい。
3.タンパク質
本発明におけるタンパク質とは、試料中に含まれる(又は含まれる可能性のある)タンパク質であって、測定を行おうとするものである。

0026

このタンパク質としては、種々のタンパク質が対象となり、例えば、総タンパク質やアルブミン等を挙げることができるが、本発明においては、このタンパク質が試料中に微量にしか存在しないタンパク質である場合に好適である。
この試料中に微量にしか存在しないタンパク質として、例えば、尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)やベンス・ジョンズタンパク等を挙げることができる。
特に、尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)の測定に好適である。
4.フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
本発明におけるフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物は、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であれば、特に限定されずに用いることができる。

0027

このフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物としては、例えば、キサンテン系色素等を挙げることができる。

0028

このキサンテン系色素としては、例えば、エリスロシンB、エオシンYエオシンB、フロキシンB又はローズベンガル等を挙げることができる。

0029

フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物としては、エリスロシンBが特に好ましい。

0030

このフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物の濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中のタンパク質を測定することができないので、少なくとも試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液中の濃度で、0.1μM以上であることが好ましく、0.5μM以上であることがより好ましく、0.7μM以上であることが特に好ましい。

0031

また、このフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物の濃度は、高すぎると試薬ブランク(試薬盲検)も高い値となってしまうということがあるので、少なくとも試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液中の濃度で、1,000μM以下であることが好ましく、100μM以下であることがより好ましく、50μM以下であることが特に好ましい。
5.界面活性剤
本発明における界面活性剤は、界面活性剤であれば、特に限定されずに用いることができる。

0032

この界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤を挙げることができる。

0033

試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を、界面活性剤と接触させると、界面活性剤を接触させない場合に比べて、測定により得られる吸光度が高いものとなり、高感度化させることができる。

0034

また、この界面活性剤との接触により、試薬ブランク(試薬盲検)の値(吸光度)が低減する。

0035

この試料の測定により得られる吸光度が高くなること、及び試薬ブランク(試薬盲検)の値(吸光度)が低減することにより、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)は大きなものとなり、すなわち、より大きな吸光度差の値が得られることになるので、測定の感度は高いものとなり、高感度化が達成される。
よって、この界面活性剤との接触により、試料中の微量のタンパク質の測定が可能となる。

0036

この界面活性剤との接触により、試料の測定において得られる吸光度が高くなることは、界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤と陽イオン性界面活性剤の混合物である場合に顕著である。

0037

また、この界面活性剤との接触により、試薬ブランク(試薬盲検)の値(吸光度)が低減することは、界面活性剤が非イオン性界面活性剤である場合に顕著である。

0038

よって、本発明においては、この界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤と陽イオン性界面活性剤の混合物であることがより好ましく、特に非イオン性界面活性剤が好ましい。

0039

この界面活性剤の濃度は、低すぎると前記の界面活性剤と接触させることによる効果が充分に得られないので、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液中の濃度で、0.1μM以上であることが好ましく、20μM以上であることがより好ましく、40μM以上であることが特に好ましい。

0040

なお、この界面活性剤の濃度は、高すぎると前記の界面活性剤と接触させることによる効果が却って弱まることがある。

0041

これより、本発明において界面活性剤は、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液中における濃度が、当該界面活性剤の臨界ミセル濃度(CMC)未満の濃度であることが好ましい。
非イオン性界面活性剤及び陽イオン性界面活性剤の具体例として、その化合物名及びその臨界ミセル濃度(CMC)等を、「表1」、「表2」及び「表3」に示した。

0042

0043

0044

0045

本発明における界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤である「トライトンX−100(Triton X-100)」〔ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル〕(臨界ミセル濃度:0.35mM)及び「ツイーン20(Tween 20)」〔ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウリン酸エステル〕(臨界ミセル濃度:3.2mM;18℃)、並びに陽イオン性界面活性剤である「ゼフィラミン(Zephiramine)」〔ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム塩酸塩〕(臨界ミセル濃度:0.37mM)が特に好ましい。

0046

例えば、このトライトンX−100においては、前記混合液中における濃度が、臨界ミセル濃度である0.35mM未満であることが好ましく、0.15mM以下であることがより好ましく、0.11mM以下であることが特に好ましい。
6.試料中のタンパク質の測定
本発明における試料中のタンパク質の測定について、以下説明を行う。
(1)試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤の接触
試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させることであるが、前記の試料、前記のフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び前記の界面活性剤を接触させることができれば、どのような方法でもよい。
この接触時のフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤のそれぞれの濃度については、前記の通りである。

0047

この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させることは、1段階で行ってもよく、又は2段階以上の多段階により行ってもよい。

0048

前記接触を1段階で行う場合は、試料と、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤の混合物(例えば測定試薬)を接触させる。

0049

前記接触を2段階以上の多段階で行う場合、その順序として次のものを挙げることができる。
(a)試料とフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに界面活性剤を接触させる。
(b) 試料と界面活性剤を接触させ、次にこれにフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させる。
(c) フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物と界面活性剤を接触させ、次にこれに試料を接触させる。

0050

この、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤を接触させる時間であるが、30秒間以上であることが好ましく、1分間以上であることがより好ましく、3分間以上であることが特に好ましい。
この、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤を接触させる温度であるが、特に限定はない。但し、60℃以上であると、タンパク質が変性する可能性があるので、0〜50℃が好ましく、5〜45℃がより好ましく、15〜40℃が特に好ましい。
(2)pH
本発明においては、試料、及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のpHを、pH5.0以下とすることが好ましい。

0051

前記接触後に、前記混合液のpHをpH5.0以下とすることにより、測定により得られる吸光度が更に高いものとなり、かつ試薬ブランク(試薬盲検)の値(吸光度)を低減させることができる。

0052

この試料の測定により得られる吸光度が高くなり、かつ試薬ブランク(試薬盲検)の値(吸光度)が低減することにより、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)はより大きなものとなり、すなわち、より大きな吸光度差の値が得られることになり、高い測定の感度が得られるようになるので好ましい。

0053

前記接触後に、前記混合液のpHをpH5.0以下とすることが好ましいのであるが、このpHをpH4.0以下とすることにより前記吸光度差の値を更に大きくすることができるのでより好ましく、同じ理由によりこのpHをpH3.5以下とすることが特に好ましい。

0054

なお、この試料、及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のpHを、pH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とすることは、これが達成できれば、どのような方法で行ってもよい。

0055

例えば、少なくとも試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液に、酸性の溶液である酸性溶液を添加することより、当該混合液のpHをpH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とさせてもよい。

0056

なお、もちろん、この酸性溶液は、前記混合液に添加することにより、当該混合液のpHをpH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とすることができるような、酸性物質含有量、pH又は添加量等のものでなければならない。

0057

この酸性溶液としては、例えば、クエン酸水溶液酢酸水溶液塩酸水溶液硝酸水溶液、又は硫酸水溶液等を挙げることができる。
この試料、及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のpHを、pH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とすることの順序として、本発明において次のものを挙げることができる。
(A) 試料と、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤の混合物(例えば測定試薬)を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のpHを、pH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とする。
(B) 試料とフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに界面活性剤を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のpHを、pH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とする。
(C) 試料と界面活性剤を接触させ、次にこれにフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のpHを、pH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とする。
(D) フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物と界面活性剤を接触させ、次にこれに試料を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のpHを、pH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とする。
(E) 試料とフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに酸性溶液を添加する等により当該混合液のpHを、pH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とし、次にこの当該混合液に界面活性剤を接触させる。
(F) 試料とフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させ、次にこれに界面活性剤を含む酸性溶液を添加し、当該混合液のpHを、pH5.0以下(より好ましくはpH4.0以下、特に好ましくはpH3.5以下)とする。
(3)吸光度測定
本発明の測定方法においては、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を接触させ、この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度の測定を行い、試料中のタンパク質の濃度を求める。

0058

この試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含む混合液の吸光度の測定であるが、当該混合液が有する吸収極大波長又は近辺の波長において吸光度の測定を行う。

0059

そして、この試料を測定したときの吸光度(測定値)を、測定を行うタンパク質の濃度が既知の試料(標準液標準物質)を測定したときの吸光度(測定値)で除して、この標準液のタンパク質の濃度の値を乗じることにより、試料中に含まれていたタンパク質の濃度を算出することができる。

0060

なお、前記の試料を測定したときの吸光度(測定値)、及び測定を行うタンパク質の濃度既知の試料(標準液、標準物質)を測定したときの吸光度(測定値)は、測定を行うタンパク質を全く含まない純水又は生理食塩水等を試料として測定を行い得られた試薬ブランク(試薬盲検)の吸光度を差し引いたものである。
(4)測定操作例
汎用自動分析装置により本発明の試料中のタンパク質の測定方法を実施する際の操作の一例を以下に示す。
〔1〕フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンB、及び非イオン性界面活性剤であるトライトンX−100を含有するタンパク質測定試薬の第1試薬と、クエン酸水溶液からなるタンパク質測定試薬の第2試薬とを各々、使用する汎用自動分析装置装置に適合した容器に入れる。
〔2〕 これらの試薬が入った容器の各々を、前記自動分析装置の所定の位置に置く。
〔3〕 また、タンパク質の測定を行う試料も前記自動分析装置に適合した容器に入れ、所定の位置に置く。
〔4〕 使用する測定試薬、及び測定を行おうとする試料等についての測定条件測定パラメータ)等を前記自動分析装置に入力し、設定する。
〔5〕 そして、試料の測定を開始する。

0061

通常は、試料と前記の測定試薬の第1試薬のそれぞれをピペットプローブ)又はチューブ等で反応セル反応キュベット)に分注し、混合、接触させ、第1段階の反応系を形成させて、温度一定の条件下に保ち、第1段階の反応を行わせる。
〔6〕 一定時間後(第1段階の反応の終了後)、この反応セル(反応キュベット)内の試料と測定試薬の第1試薬との反応液(第1段階の反応系)について、予め設定した波長における吸光度値を測定する。
〔7〕 次に、この反応セル(反応キュベット)内の反応液に、前記の測定試薬の第2試薬をピペット(プローブ)又はチューブ等で分注し、混合、接触させ、第2段階の反応系を形成させて、温度一定の条件下に保ち、第2段階の反応を行わせる。
〔8〕 一定時間後(第2段階の反応の終了後)、この反応セル(反応キュベット)内の試料と測定試薬の第1試薬及び第2試薬との反応液(第2段階の反応系)について、前記〔6〕の波長における吸光度値を測定する。
〔9〕 試料に替えて純水について、前記〔5〕〜〔8〕の操作を行い、試薬ブランク(試薬盲検)の吸光度値を測定する。
〔10〕 前記〔8〕で得た吸光度値より試薬ブランク(試薬盲検)の吸光度値を差し引いたものから、前記〔6〕で得た吸光度値より試薬ブランク(試薬盲検)の吸光度値を差し引いたものを減じて、吸光度差の値を算出する。
〔11〕 前記〔10〕で算出した吸光度差の値と、測定を行うタンパク質の濃度が既知の試料(標準液)における吸光度差の値〔検量線〕とを比較することにより、試料中含まれていたタンパク質の濃度を算出して得る。
〔II〕.試料中のタンパク質の測定試薬
1.本発明の試料中のタンパク質の測定試薬
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤を含有するものである。
2.試料
本発明における試料は、前記の「〔I〕.試料中のタンパク質の測定方法」の「2.試料」において記載した通りである。
3.タンパク質
本発明におけるタンパク質は、前記の「〔I〕.試料中のタンパク質の測定方法」の「3.タンパク質」において記載した通りである。
4.フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
本発明におけるフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物は、前記の「〔I〕.試料中のタンパク質の測定方法」の「4.フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物」において記載した通りであるが、ここで記載した濃度が、試料に含まれていたタンパク質と、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物との接触時に当該混合液中において達成されるように、このフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を測定試薬に含有させることが好ましい。
5.界面活性剤
本発明における界面活性剤は、前記の「〔I〕.試料中のタンパク質の測定方法」の「5.界面活性剤」において記載した通りである。
この界面活性剤は、試料に含まれていたタンパク質及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物との接触時に、当該混合液中において当該界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度となるような濃度になるよう、この界面活性剤を測定試薬に含有させることが好ましい。
6.測定試薬の構成
(1)構成
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、2試薬又は3試薬以上の構成からなることが好ましい。

0062

特に2試薬からなることが好ましい。

0063

前記測定試薬が第1試薬及び第2試薬の2試薬からなる場合、この2つの試薬にそれぞれ含まれる成分の構成として次のものを挙げることができる。
(a)第1試薬:フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
第2試薬:界面活性剤
(b)第1試薬: フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、界面活性剤
第2試薬: 界面活性剤
(c)第1試薬: 界面活性剤
第2試薬: フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
(d)第1試薬: 界面活性剤
第2試薬: フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、界面活性剤
(e)第1試薬: フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤
第2試薬:緩衝剤
(f)第1試薬: フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤
第2試薬: 界面活性剤、緩衝剤等
(2)酸性溶液
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬は、少なくともフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含有する溶液からなる第1試薬と、酸性溶液からなる第2試薬との組み合わせよりなり、界面活性剤が当該第1試薬及び/又は当該第2試薬に添加されているものであることが好ましい。

0064

なお、前記の酸性溶液からなる第2試薬は、試料及び第1試薬を混合した混合液に当該第2試薬を添加することにより、当該混合液のpHをpH5.0以下とすることができるものである。
この酸性溶液及びpHについての詳細は、前記の「〔I〕.試料中のタンパク質の測定方法」の「6.試料中のタンパク質の測定」の「(2)pH」において記載した通りである。
なお、本発明の試料中のタンパク質の測定試薬が、少なくともフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含有する溶液からなる第1試薬と、酸性溶液からなる第2試薬との組み合わせよりなる場合、この2つの試薬にそれぞれ含まれる成分の構成として次のものを挙げることができる。
(A)第1試薬: フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤
第2試薬: 酸性溶液
(B)第1試薬: フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物、及び界面活性剤
第2試薬: 界面活性剤を含む酸性溶液
(C)第1試薬: フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物
第2試薬: 界面活性剤を含む酸性溶液
7.他の成分
本発明の試料中のタンパク質の測定試薬においては、必要に応じて、更に、緩衝剤、アルカリ金属若しくはアルカリ土類金属などのイオン又はこれを含む塩;キレート剤アジ化ナトリウム抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤;糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤活性化剤;試料中に含まれる測定妨害物質消去若しくは影響抑制に関わる物質;又は他の試薬成分等を適宜必要に応じて存在させることができる。

0065

そして、前記の緩衝剤としては、測定上必要なpHの範囲に緩衝能を有する緩衝剤を存在させることが好ましい。

0066

このような緩衝剤としては、例えば、MES、Bis−Tris、Bis−Trisプロパン、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、無機リン酸無機リン酸塩ホウ酸ホウ酸塩グリシングリシルグリシンイミダゾール、又はトリス(ヒドロキシメチルアミノメタン〔Tris〕等を挙げることができる。

0067

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこの実施例の記載により限定されるものではない。
〔実施例1〕(本発明の測定方法及び測定試薬における界面活性剤の効果の確認)
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、界面活性剤の効果を確認した。
1.試薬
(1)第1試薬
第1試薬として、エリスロシンB(和光純薬工業社)を純水に溶解し、102μM エリスロシンB水溶液を調製した。
(2)第2試薬
第2試薬として、クエン酸(和光純薬工業社)を純水に溶解し、500mMクエン酸水溶液を調製した。
(3)第3試薬
第3試薬として、下記の試薬を各々調製した。
(a)界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、純水を用意した。
(b)トライトンX−100試薬
トライトンX−100試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、6.4mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(c)ツイーン20試薬
ツイーン20試薬として、ツイーン20を純水に溶解し、0.4mM ツイーン20水溶液を調製した。
(d)ゼフィラミン試薬
ゼフィラミン試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、4mM ゼフィラミン水溶液を調製した。
2.試料
(イ)タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミンHSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、2.0mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ロ)タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
3.測定
(1) 前記2の(イ)のタンパク質含有試料の3,660μLに、前記1の(1)の第1試薬を80μL、前記1の(2)の第2試薬を160μL、及び前記1の(3)の第3試薬の(a)の界面活性剤不含試薬を100μL添加し、混合し、混合液とした。
(2) 次に、前記(1)の混合液を、分光光度計により、波長を400nmから700nmまでスキャンして吸光度を測定し、前記混合液の吸収曲線を記録した。
(3) 前記2の(イ)のタンパク質含有試料に替えて前記2の(ロ)のタンパク質不含試料を試料とする他は前記(1)及び(2)の記載の通りに操作を行い、吸収曲線を記録した。

0068

試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸収曲線、及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の前記吸収曲線を、図1に示した。
(4) 前記1の(3)の第2試薬の(a)の界面活性剤不含試薬に替えて、前記1の(3)の第2試薬の(b)のトライトンX−100試薬を第2試薬とする他は、前記(1)、(2)及び(3)の記載の通りに操作を行い、試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸収曲線、及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の前記吸収曲線を示した図2を得た。
(5) 前記1の(3)の第2試薬の(a)の界面活性剤不含試薬に替えて、前記1の(3)の第2試薬の(c)のツイーン20試薬を第2試薬とする他は、前記(1)、(2)及び(3)の記載の通りに操作を行い、試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸収曲線、及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の前記吸収曲線を示した図3を得た。
(6) 前記1の(3)の第2試薬の(a)の界面活性剤不含試薬に替えて、前記1の(3)の第2試薬の(d)のゼフィラミン試薬を第2試薬とする他は、前記(1)、(2)及び(3)の記載の通りに操作を行い、試料としてタンパク質含有試料を用いた場合の前記吸収曲線、及び試料としてタンパク質不含試料を用いた場合の前記吸収曲線を示した図4を得た。
4.測定結果
(1)図1及び図2より、以下のことが分かる。

0069

非イオン性界面活性剤であるトライトンX−100を測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンB及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が著しく高くなっている。

0070

また、このトライトンX−100を測定試薬に含有させ、エリスロシンB及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク(試薬盲検)〕の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が顕著に低減している。

0071

これらのことより、非イオン性界面活性剤であるトライトンX−100を測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンB及び試料と接触させた場合には、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)がより大きなものとなり、高い測定の感度が得られるようになったことが確かめられた。
(2)図1及び図3より、以下のことが分かる。

0072

非イオン性界面活性剤であるツイーン20を測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンB及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が著しく高くなっている。

0073

また、このツイーン20を測定試薬に含有させ、エリスロシンB及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク(試薬盲検)〕の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が明らかに低減している。

0074

これらのことより、非イオン性界面活性剤であるツイーン20を測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンB及び試料と接触させた場合には、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)がより大きなものとなり、高い測定の感度が得られるようになったことが確かめられた。
(3)図1及び図4より、以下のことが分かる。

0075

陽イオン性界面活性剤であるゼフィラミンを測定試薬に含有させ、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物であるエリスロシンB及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度が著しく高くなっている。

0076

なお、このゼフィラミンを測定試薬に含有させ、エリスロシンB及び試料と接触させた場合には、測定試薬に含有させず接触させない場合に比べて、タンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク(試薬盲検)〕の吸収曲線の吸収極大及び近辺の吸光度は高くなっている。

0077

しかしながら、この場合でも、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)は、測定試薬にゼフィラミンを含有させ接触させたときの方が、測定試薬に含有させず接触させない場合よりも、より大きなものとなり、この場合も、高い測定の感度が得られるようになったことが確かめられた。
〔実施例2〕(本発明の測定方法及び測定試薬における界面活性剤の濃度と効果の関係の確認)
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、界面活性剤であるトライトンX−100の濃度と効果の関係を確認した。
1.試薬
(1)第1試薬
第1試薬として、エリスロシンB(和光純薬工業社)を純水に溶解し、102μM エリスロシンB水溶液を調製した。
(2)第2試薬
第2試薬として、クエン酸(和光純薬工業社)を純水に溶解し、500mMクエン酸水溶液を調製した。
(3)第3試薬
第3試薬として、下記の試薬を各々調製した。
(a)界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、純水を用意した。
(b)トライトンX−100試薬
(イ)1.6mM トライトンX−100含有試薬
1.6mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、1.6mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(ロ)3.2mM トライトンX−100含有試薬
3.2mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、3.2mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(ハ)4.8mM トライトンX−100含有試薬
4.8mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、4.8mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(ニ)6.4mM トライトンX−100含有試薬
6.4mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、6.4mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(ホ)8mM トライトンX−100含有試薬
8mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、8mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(ヘ)9.6mM トライトンX−100含有試薬
9.6mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、9.6mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(ト)12.8mM トライトンX−100含有試薬
12.8mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、12.8mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(チ)16mM トライトンX−100含有試薬
16mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、16mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(リ)19.2mM トライトンX−100含有試薬
19.2mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、19.2mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(ヌ)25.6mM トライトンX−100含有試薬
25.6mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、25.6mM トライトンX−100水溶液を調製した。
(ル)32mM トライトンX−100含有試薬
32mM トライトンX−100含有試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、32mM トライトンX−100水溶液を調製した。
2.試料
(イ)タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、1.5mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ロ)タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
3.測定
(1) 前記2の(イ)のタンパク質含有試料の3,660μLに、前記1の(1)の第1試薬を80μL、前記1の(2)の第2試薬を160μL、及び前記1の(3)の第3試薬の(a)の界面活性剤不含試薬を100μL添加し、混合し、混合液とした。
(2) 次に、前記(1)の混合液を、分光光度計により、波長547nmにおける吸光度を測定した。
(3) 前記2の(イ)のタンパク質含有試料に替えて前記2の(ロ)のタンパク質不含試料を試料とする他は、前記(1)及び(2)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
(4) 次に、前記1の(3)の第3試薬の(a)の界面活性剤不含試薬に替えて、前記1の(3)の第3試薬の(b)トライトンX−100試薬の(イ)1.6mM トライトンX−100含有試薬〜(ル)32mM トライトンX−100含有試薬の計11種類の第3試薬をそれぞれ用いる他は、前記(1)、(2)及び(3)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
(5) 前記(1)〜(4)における各第3試薬を用いた場合の、タンパク質含有試料を測定したときの吸光度、及びタンパク質不含試料を測定したときの吸光度を、図5に示した。
4.測定結果
この図5より、以下のことが分かる。

0078

試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物(エリスロシンB)及び界面活性剤(トライトンX−100)を含む混合液中で、界面活性剤(トライトンX−100)の濃度が、この界面活性剤(トライトンX−100)の臨界ミセル濃度(CMC)である0.35mM以上においては、濃度が0.35mM未満のときに比べて、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸光度が低減しており、またタンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク(試薬盲検)〕の吸光度が増加している。
すなわち、前記混合液中における界面活性剤(トライトンX−100)の濃度が、その臨界ミセル濃度(CMC)である0.35mM以上においては、濃度が0.35mM未満のときに比べて、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)がより小さくなり、測定の感度が減少し、界面活性剤(トライトンX−100)を含有及び接触させることの効果が弱まっていることが分かる。
このことより、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤(トライトンX−100)を含む混合液中での界面活性剤(トライトンX−100)の濃度は、この界面活性剤(トライトンX−100)の臨界ミセル濃度(CMC)未満の濃度であることが好ましいことが分かる。
〔実施例3〕(本発明の測定方法及び測定試薬における界面活性剤の濃度と効果の関係の確認)
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、界面活性剤であるゼフィラミンの濃度と効果の関係を確認した。
1.試薬
(1)第1試薬
第1試薬として、エリスロシンB(和光純薬工業社)を純水に溶解し、102μM エリスロシンB水溶液を調製した。
(2)第2試薬
第2試薬として、クエン酸(和光純薬工業社)を純水に溶解し、500mMクエン酸水溶液を調製した。
(3)第3試薬
第3試薬として、下記の試薬を各々調製した。
(a)界面活性剤不含試薬
界面活性剤を含まない界面活性剤不含試薬として、純水を用意した。
(b)ゼフィラミン試薬
(イ)4mM ゼフィラミン含有試薬
4mM ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、4mM ゼフィラミン水溶液を調製した。
(ロ)8mM ゼフィラミン含有試薬
8mM ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、8mM ゼフィラミン水溶液を調製した。
(ハ)15mM ゼフィラミン含有試薬
15mM ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、15mM ゼフィラミン水溶液を調製した。
(ニ)20mM ゼフィラミン含有試薬
20mM ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、20mM ゼフィラミン水溶液を調製した。
(ホ)30mM ゼフィラミン含有試薬
30mM ゼフィラミン含有試薬として、ゼフィラミンを純水に溶解し、30mM ゼフィラミン水溶液を調製した。
2.試料
(イ)タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、2.0mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ロ)タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
3.測定
(1) 前記2の(イ)のタンパク質含有試料の3,660μLに、前記1の(1)の第1試薬を80μL、前記1の(2)の第2試薬を160μL、及び前記1の(3)の第3試薬の(a)の界面活性剤不含試薬を100μL添加し、混合し、混合液とした。
(2) 次に、前記(1)の混合液を、分光光度計により、波長547nmにおける吸光度を測定した。
(3) 前記2の(イ)のタンパク質含有試料に替えて前記2の(ロ)のタンパク質不含試料を試料とする他は、前記(1)及び(2)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
(4) 次に、前記1の(3)の第3試薬の(a)の界面活性剤不含試薬に替えて、前記1の(3)の第3試薬の(b)ゼフィラミン試薬の(イ)4mM ゼフィラミン含有試薬〜(ホ)30mM ゼフィラミン含有試薬の計5種類の第3試薬をそれぞれ用いる他は、前記(1)、(2)及び(3)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
(5) 前記(1)〜(4)における各第3試薬を用いた場合の、タンパク質含有試料を測定したときの吸光度、及びタンパク質不含試料を測定したときの吸光度を、図6に示した。
4.測定結果
この図6より、以下のことが分かる。

0079

試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物(エリスロシンB)及び界面活性剤(ゼフィラミン)を含む混合液中で、界面活性剤(ゼフィラミン)の濃度が増すと、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸光度、及びタンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク(試薬盲検)〕の吸光度はともに増加する。

0080

しかしながら、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)、すなわち測定の感度は、この界面活性剤(ゼフィラミン)の臨界ミセル濃度(CMC)である0.37mM以上においては、濃度が0.37mM未満のときに比べて、より小さくなっている。
このことより、試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物及び界面活性剤(ゼフィラミン)を含む混合液中での界面活性剤(ゼフィラミン)の濃度は、この界面活性剤(ゼフィラミン)の臨界ミセル濃度(CMC)未満の濃度であることがより好ましいことが分かる。
〔実施例4〕(本発明の測定方法及び測定試薬における効果とpHとの関係の確認)
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における効果と、pHとの関係を確認した。
1.試薬
(1)第1試薬
第1試薬として、エリスロシンB(和光純薬工業社)を純水に溶解し、102μM エリスロシンB水溶液を調製した。
(2)第2試薬
第2試薬として、下記の試薬を各々調製した。
(a)クエン酸不含試薬
クエン酸を含まないクエン酸不含試薬として、純水を用意した。
(b)125mM クエン酸含有試薬
125mM クエン酸含有試薬として、クエン酸(和光純薬工業社)を純水に溶解し、125mMクエン酸水溶液を調製した。
(c)500mM クエン酸含有試薬
500mM クエン酸含有試薬として、クエン酸(和光純薬工業社)を純水に溶解し、500mM クエン酸水溶液を調製した。
(d)2,500mM クエン酸含有試薬
2,500mM クエン酸含有試薬として、クエン酸(和光純薬工業社)を純水に溶解し、2,500mM クエン酸水溶液を調製した。
(3)第3試薬
第3試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、6.4mM トライトンX−100水溶液を調製した。
2.試料
(イ)タンパク質含有試料
タンパク質を含むタンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、1.5mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ロ)タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
3.測定
(1) 前記2の(イ)のタンパク質含有試料の3,660μLに、前記1の(1)の第1試薬を80μL、前記1の(2)の第2試薬の(a)クエン酸不含試薬を160μL、及び前記1の(3)の第3試薬を100μL添加し、混合し、混合液とした。
(2) 次に、前記(1)の混合液を、分光光度計により、波長547nmにおける吸光度を測定した。
(3) 前記2の(イ)のタンパク質含有試料に替えて前記2の(ロ)のタンパク質不含試料を試料とする他は、前記(1)及び(2)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
(4) 次に、前記1の(2)の第2試薬の(a)のクエン酸不含試薬に替えて、前記1の(2)の第2試薬の(b)125mM クエン酸含有試薬〜(d)2,500mM クエン酸含有試薬の計3種類の第2試薬をそれぞれ用いる他は、前記(1)、(2)及び(3)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
(5) なお、前記1の(2)の各第2試薬を用いたときの、試料、第1試薬、第2試薬及び第3試薬を混合した混合液のpHは、以下の通りであった。
(a)クエン酸不含試薬: pH5.3
(b)125mM クエン酸含有試薬: pH3.5
(c)500mM クエン酸含有試薬: pH2.3
(d)2,500mM クエン酸含有試薬: pH2.0
(6) 前記(1)〜(4)における各第2試薬を用いた場合の、タンパク質含有試料を測定したときの吸光度、及びタンパク質不含試料を測定したときの吸光度を、図7に示した。
4.測定結果
この図7より、以下のことが分かる。

0081

試料、第1試薬、第2試薬及び第3試薬を混合した混合液中、すなわち試料、フルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物(エリスロシンB)及び界面活性剤(トライトンX−100)を含む混合液中で、pHが5.3の場合は、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)は小さいものであり、測定の感度は高くはない。

0082

しかしながら、前記混合液中のpHが、pH5.0、pH4.0、pH3.5と下がるにつれ、タンパク質含有試料を測定したときの混合液の吸光度は増加し、かつタンパク質不含試料を測定したときの混合液〔試薬ブランク(試薬盲検)〕の吸光度は低減している。

0083

この試料の測定により得られる吸光度が高くなり、かつ試薬ブランク(試薬盲検)の値(吸光度)が低減することにより、測定により得られる吸光度差の値(試料測定時の吸光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いたもの)はより大きなものとなり、すなわち、より大きな吸光度差の値が得られることになり、高い測定の感度が得られるようになる。
よって、本発明においては、試料、及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を接触させた後、少なくともこの試料及びフルオレセイン骨格を有する陰イオン性化合物を含む混合液のpHを、pH5.0以下とすることが好ましく、pH4.0以下とすることがより好ましく、pH3.5以下とすることが特に好ましいことが分かる。
〔実施例5〕(本発明の測定方法及び測定試薬における検量線の作成)
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における検量線を作成した。
1.試薬
(1)第1試薬
第1試薬として、エリスロシンB(和光純薬工業社)を純水に溶解し、102μM エリスロシンB水溶液を調製した。
(2)第2試薬
第2試薬として、クエン酸(和光純薬工業社)を純水に溶解し、500mMクエン酸水溶液を調製した。
(3)第3試薬
第3試薬として、トライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕を純水に溶解し、6.4mM トライトンX−100水溶液を調製した。
2.試料
(イ)0.25mg/Lタンパク質含有試料
0.25mg/L タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、0.25mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ロ)0.50mg/L タンパク質含有試料
0.50mg/L タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、0.50mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ハ)0.75mg/L タンパク質含有試料
0.75mg/L タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、0.75mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ニ)1.00mg/L タンパク質含有試料
1.00mg/L タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、1.00mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ホ)1.50mg/L タンパク質含有試料
1.50mg/L タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、1.50mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ヘ)2.00mg/L タンパク質含有試料
2.00mg/L タンパク質含有試料として、ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、2.00mg/Lのヒト血清アルブミン水溶液を調製した。
(ト)タンパク質不含試料
タンパク質を含まないタンパク質不含試料として、純水を用意した。
3.測定
(1) 前記2の(イ)の0.25mg/L タンパク質含有試料の3,660μLに、前記1の(1)の第1試薬を80μL、前記1の(2)の第2試薬を160μL、及び前記1の(3)の第3試薬を100μL添加し、混合し、混合液とした。
(2) 次に、前記(1)の混合液を、分光光度計により、波長547nmにおける吸光度を測定した。
(3) 前記2の(イ)の0.25mg/L タンパク質含有試料に替えて前記2の(ロ)0.50mg/L タンパク質含有試料〜(ヘ)2.00mg/L タンパク質含有試料及び(ト)タンパク質不含試料をそれぞれ試料とする他は、前記(1)及び(2)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
(4) 前記(1)〜(3)において、各試料を測定したときの吸光度と、その試料中のタンパク質であるヒト血清アルブミンの濃度との関係を示した図である検量線を図8に示した。
4.測定結果
この検量線を示した図8より、試料中のヒト血清アルブミンの濃度が0mg/Lから1.5mg/Lという極めて微量な範囲においても、良好な直線性が得られていることが分かる。

0084

このことより、その基準範囲が6.5±5.1mg/L未満(随時尿)という極めて微量な尿中のアルブミン(尿中微量アルブミン)についても、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬であれは、精確に測定することが可能であることが分かる。
〔実施例6〕(本発明の測定方法及び測定試薬並びに他法の検出限界及び定量限界
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬、並びに他法の検出限界及び定量限界を確かめた。
〔I〕.本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬
1.試薬
(1)第1試薬
第1試薬として、エリスロシンB(和光純薬工業社)、及びトライトンX−100(ナカライテスク社)〔分子量:625〕をそれぞれ純水に溶解し、102μM エリスロシンB及び0.373mM トライトンX−100を含む水溶液を調製した。
(2)第2試薬
第2試薬として、クエン酸(和光純薬工業社)を純水に溶解し、500mMクエン酸水溶液を調製した。
2.試料
(イ)ヒト血清アルブミン〔HSA〕(シグマ社)を純水に溶解し、これを純水で段階的に希釈して、ヒト血清アルブミン水溶液の希釈系列を用意した。
(ロ)タンパク質不含試料として、純水を用意した。
(ハ)標準液として、濃度既知のヒト血清アルブミン水溶液を用意した。
3.測定
(1) 前記2の(イ)の各濃度のヒト血清アルブミン水溶液試料の50μLに、前記1の(1)の第1試薬を150μL、及び前記1の(2)の第2試薬を150μL添加し、混合し、混合液とした。
(2) 次に、前記(1)の混合液の波長547nmにおける吸光度を測定した。
(3) 次に、前記(ロ)のタンパク質不含試料について、前記(1)及び(2)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した(試薬ブランク)。
(4) 次に、前記(ハ)の標準液について、前記(1)及び(2)の記載の通りに操作を行い、吸光度を測定した。
(5) 前記2の(イ)の各濃度のヒト血清アルブミン水溶液試料のそれぞれについて、測定により得られた吸光度から、前記(3)で得られたタンパク質不含試料における吸光度(試薬ブランク)を差し引いた。

0085

次に、この吸光度を、前記(4)で求めた標準液の吸光度で除し、次にこの標準液のヒト血清アルブミン濃度を乗ずることにより、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の濃度を求めた。
(6) 前記(1)〜(5)の操作を計12回繰り返して行い、各ヒト血清アルブミン水溶液試料について、計12の測定値(濃度)を求めた。
〔II〕.免疫比濁法
1.試薬
免疫比濁法による尿試料中のアルブミン(微量アルブミン)の測定試薬である「マイクロアルブミン−HAテスト」(和光純薬工業)を用いた。
2.試料
前記〔I〕の2の試料を使用した。
3.測定
日立7170S形自動分析装置を使用し、当該試薬の添付文書等で指定された方法に従って、前記2の試料の測定を行い、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の濃度を求めた。

0086

なお、前記の各試料の測定は12重測定を行った。
〔II〕.PR法
1.試薬
PR法による試料中のタンパク質の測定試薬である「プロテインアッセイラピッドキット」(和光純薬工業)を用いた。
2.試料
前記〔I〕の2の試料を使用した。
3.測定
当該試薬の添付文書等で指定された方法に準じ、マイクロプレート法により、前記2の試料の測定を行い、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の濃度を求めた。

0087

なお、前記の各試料の測定は12重測定を行った。
〔III〕.SSA法
1.試薬
SSA法による試料中のタンパク質の測定試薬である「スルホサリチル酸」(和光純薬工業)を用いた。
2.試料
前記〔I〕の2の試料を使用した。
3.測定
当該試薬の添付文書等で指定された方法に準じ、マイクロプレート法により、前記2の試料の測定を行い、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の濃度を求めた。なお、当該試薬は検量線の範囲が狭いため、前記試料を2〜10倍純水で希釈して測定した。

0088

この前記の各試料の測定は12重測定を行った。
〔IV〕.検出限界及び定量限界
前記〔I〕の本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬、前記〔II〕の免疫比濁法、前記〔III〕のPR法、並びに前記〔IV〕のSSA法のそれぞれにおける、各ヒト血清アルブミン水溶液試料の12重測定の測定値より標準偏差を算出し、検出限界(3σ)及び定量限界(10σ)を求めた。

0089

これを、表4に示した。

0090

0091

4.測定結果
この表4より、本発明の試料中のタンパク質の測定試薬及び測定方法における検出限界及び定量限界は、他法のPR法及びSSA法の検出限界及び定量限界よりもはるかに優れ、免疫比濁法の検出限界及び定量限界にも勝るものであることが分かる。

0092

このことよりも、本発明の試料中のタンパク質の測定試薬及び測定方法は、その測定に掛かるコストが低いものでありながら、免疫比濁法に勝る測定の感度を有し、尿試料中のアルブミンのような試料中に微量にしか存在しないタンパク質を、精確に測定することができるものであることが確かめられた。

図面の簡単な説明

0093

本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬において、界面活性剤を接触、含有させないときの吸収曲線を示した図である。
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬において、非イオン性界面活性剤であるトライトンX−100を接触、含有させたときの吸収曲線を示した図である。
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬において、非イオン性界面活性剤であるツイーン20を接触、含有させたときの吸収曲線を示した図である。
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬において、陽イオン性界面活性剤であるゼフィラミンを接触、含有させたときの吸収曲線を示した図である。
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、非イオン性界面活性剤であるトライトンX−100の濃度とその効果との関係を示した図である。
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、陽イオン性界面活性剤であるゼフィラミンの濃度とその効果との関係を示した図である。
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、効果とpHとの関係を示した図である。
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬における、検量線を示した図である。

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