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図面 (2)

課題

細胞ホスホジエステラーゼ活性化する能力に起因した、yessotoxinsの腫瘍細胞に対する細胞毒性薬としての治療的な使用を提供する。

解決手段

yessotoxinsのヒト腫瘍細胞増殖抑制剤としての治療的な使用であり、yessotoxin(YTX)及びその類似物の作用のメカニズムは、細胞ホスホジエステラーゼの活性化、したがってcAMP細胞毒性ベルの減少に関連する。YTXの投与の後のこの活性化の結果としてヒト肝細胞癌細胞増殖抑制となる。腫瘍プロセスの処置に役立つ薬剤を開発するために、この新生細胞へのYTXの効果を用いることができる。

概要

背景

yessotoxin(以下YTX)及びその天然類似物は、Protoceratium reticulatumとLingolodinium polyedrum種の渦鞭毛藻によって生成され、本来はPatinopecten yessoensisの消化器官から単離される多環式エーテルである(Murata, M., Kumagai, M. ほか, 1987, Tetrahedron Letters, 28, 5869-5872)。その分子は、図1に示すように、エーテル基を持つ11の環と、それに結合する異なるラジカルを有する不飽和側鎖とで形成される。50以上の天然の誘導体の類似物があるが、この図はいくつかのYTX類似物を示す。

YTXは、経口時には毒性がない親油性化合物である(Aune, T., Sorby, R. ほか, 2002, Toxicon, 40, 77-82)。しかし、非常に高い用量を必要とするが腹腔内注射の後に死亡を引き起こす(Tubaro, A., Sosa, S. ほか, 2003, Toxicon, 41, 783-92)。

YTX及びその類似物が有する作用のメカニズムは、その他の毒素のものとは異なる。しばしば一緒に検出されたため、当初下痢毒のグループにそれらを分類した。しかし、それらは下痢を引き起こさず、下痢毒の細胞標的である細胞ホスファターゼに影響しないという点で異なる。それらの作用のメカニズムは他の酵素に関連する。この意味で、YTXによれば、カルシウム依存のメカニズムによって細胞ホスホジエステラーゼ活性が増加するため、環状アデノシンリン酸cAMP)の細胞質ベルが減少することが説明されてきた(Alfonso, A., de la Rosa, L.A. ほか, 2003, Biochem Pharmacol, 65, 193-208)。さらに、YTXは、細胞膜に位置するチャンネルを通してその入口を刺激することで、細胞質のカルシウムレベルを増加させる(De la Rosa, L.A., Alfonso, A. ほか, 2001, Biochem. Pharmacol., 61, 827-833; De la Rosa, L.A., Alfonso, A. ほか, 2001, Cell Signal, 13, 711-716)。汚染された軟体動物中のこれらの毒素の存在を検出する精密な方法を開発するために、ホスホジエステラーゼへの効果を用いてきた(Alfonso, A., Vieytes, M.R. ほか, 2004, Analytical Biochem., 326, 93-99; Pazos, M.J., Alfonso, A. ほか, 2004, Analytical Biochem., 335, 112-118)。11ファミリーのホスホジエステラーゼがあるが、これは薬理学的な観点からとても重要であり、それらの調節が例えば喘息慢性関節リウマチ及び癌などの病気処置に関連する(Houslay, M.D. と Adams, D.R., 2003, Biochem J., 370, 1-18)。

YTXは、カスパーゼ活性のためにヒト神経芽腫細胞及びヒト癌細胞(HeLa株)にアポトーシスプログラム化された細胞死)を誘発する(Leira, F., Alvarez, C. ほか, 2001, Toxicology in vitro, 15, 277-283、 Malaguti, C.,Ciminello, P. ほか, 2002, Toxicol in Vitro, 16, 357-363)。さらに、この毒素は、ヒト肝細胞癌細胞(HEP−G2)とHeLa229細胞への細胞毒性効果を有する。したがって、推測的に、抗腫瘍薬として用いる余地がある。

この二次メッセンジャーの両方のレベルと、タンパク質キナーゼAで生じる活性化のため、cAMP経路細胞増殖に関係する。抗腫瘍薬(例えばシスプラチン)に対する耐性がこのタンパク質不活性化に関連があることが説明されてきたが(Cvijic, M.E., Yang, W.L. ほか, 1998, Pharmacol Ther, 78, 115-28)、タンパク質キナーゼAの抑制は抗腫瘍活性を引き起こす(Wang, H., Cai, Q. ほか, 1999, Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 13989-94)。ちなみに、cAMDのレベルが次第に細胞毒性薬剤に対する耐性に関連する(Mann, S.C., Andrews, P.A. ほか, 1991, Int J Cancer, 48, 866-72、 von Knethen, A., Lotero, A. ほか, 1998, Oncogene, 17, 387-94)。言い換えると、cAMP経路は、細胞増殖を調整するときに重要で複雑な役割を果たす。この理由から、ホスホジエステラーゼに影響する天然又は合成分子、及びHTS(ハイスループットスクリーニングプロトコルに適用可能であるこれらの酵素の活性を研究するための方法についての説明は、新しい処置を開発するためにとても役立つ道具である。この意味で、腫瘍細胞増殖へのYTXsの抑制効果についての説明は、可能な治療用途のためにこれらの分子が薬理学的に重要であることを示唆する。さらに、それらの低い毒性のために、YTXは毒素ではなく、むしろ異なる薬理学的な使用による天然物と考えるべきであると一部の著者は指摘する。

毒素のファミリー、YTXsの特定の特性及びそれらの作用のメカニズムについてのより詳しい説明は、本発明に関連するもとの出願及び分割出願の詳細な説明に示される。

概要

細胞ホスホジエステラーゼを活性化する能力に起因した、yessotoxinsの腫瘍細胞に対する細胞毒性薬としての治療的な使用を提供する。yessotoxinsのヒト腫瘍細胞増殖抑制剤としての治療的な使用であり、yessotoxin(YTX)及びその類似物の作用のメカニズムは、細胞ホスホジエステラーゼの活性化、したがってcAMPの細胞毒性レベルの減少に関連する。YTXの投与の後のこの活性化の結果としてヒト肝細胞癌細胞の増殖抑制となる。腫瘍プロセスの処置に役立つ薬剤を開発するために、この新生細胞へのYTXの効果を用いることができる。

目的

効果

実績

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請求項1

細胞ホスホジエステラーゼ中に毒素によって生じる活性化に基づいた、yessotoxins(YTXs)のヒト腫瘍細胞増殖抑制剤としての治療的な使用であって、yessotoxin(YTX)及び化学的類似物(YTXs)の活性化作用の、細胞死活性剤としてのホスホジエステラーゼの活性についての使用、又は細胞標的としてPDEsを用いるための使用。

請求項2

新生細胞へのYTXsの効果の、抗腫瘍化合物としての請求項1に記載された使用。

請求項3

腫瘍プロセスの処置のために用いる化合物の製造での請求項1に記載されたYTXs及びその誘導体の使用。

請求項4

ホスホジエステラーゼ修飾を伴う新生物形成の処置のために用いる化合物の製造での請求項1に記載されたYTXs及びその誘導体の使用。

請求項5

YTXの高脂肪溶解性で低毒性に基づいた、新生物形成のプロセスの処置で有用であるその他の有効成分のための基材賦形剤としての使用。

請求項6

HTS(ハイスループットスクリーニングプロトコルでのPDEsの活性化の請求項1に記載された使用。

技術分野

0001

本発明は、細胞ホスホジエステラーゼ活性化する能力に起因した、yessotoxinsの腫瘍細胞に対する細胞毒性薬としての治療的な使用に関する。

背景技術

0002

yessotoxin(以下YTX)及びその天然類似物は、Protoceratium reticulatumとLingolodinium polyedrum種の渦鞭毛藻によって生成され、本来はPatinopecten yessoensisの消化器官から単離される多環式エーテルである(Murata, M., Kumagai, M. ほか, 1987, Tetrahedron Letters, 28, 5869-5872)。その分子は、図1に示すように、エーテル基を持つ11の環と、それに結合する異なるラジカルを有する不飽和側鎖とで形成される。50以上の天然の誘導体の類似物があるが、この図はいくつかのYTX類似物を示す。

0003

YTXは、経口時には毒性がない親油性化合物である(Aune, T., Sorby, R. ほか, 2002, Toxicon, 40, 77-82)。しかし、非常に高い用量を必要とするが腹腔内注射の後に死亡を引き起こす(Tubaro, A., Sosa, S. ほか, 2003, Toxicon, 41, 783-92)。

0004

YTX及びその類似物が有する作用のメカニズムは、その他の毒素のものとは異なる。しばしば一緒に検出されたため、当初下痢毒のグループにそれらを分類した。しかし、それらは下痢を引き起こさず、下痢毒の細胞標的である細胞ホスファターゼに影響しないという点で異なる。それらの作用のメカニズムは他の酵素に関連する。この意味で、YTXによれば、カルシウム依存のメカニズムによって細胞ホスホジエステラーゼの活性が増加するため、環状アデノシンリン酸cAMP)の細胞質ベルが減少することが説明されてきた(Alfonso, A., de la Rosa, L.A. ほか, 2003, Biochem Pharmacol, 65, 193-208)。さらに、YTXは、細胞膜に位置するチャンネルを通してその入口を刺激することで、細胞質のカルシウムレベルを増加させる(De la Rosa, L.A., Alfonso, A. ほか, 2001, Biochem. Pharmacol., 61, 827-833; De la Rosa, L.A., Alfonso, A. ほか, 2001, Cell Signal, 13, 711-716)。汚染された軟体動物中のこれらの毒素の存在を検出する精密な方法を開発するために、ホスホジエステラーゼへの効果を用いてきた(Alfonso, A., Vieytes, M.R. ほか, 2004, Analytical Biochem., 326, 93-99; Pazos, M.J., Alfonso, A. ほか, 2004, Analytical Biochem., 335, 112-118)。11ファミリーのホスホジエステラーゼがあるが、これは薬理学的な観点からとても重要であり、それらの調節が例えば喘息慢性関節リウマチ及び癌などの病気処置に関連する(Houslay, M.D. と Adams, D.R., 2003, Biochem J., 370, 1-18)。

0005

YTXは、カスパーゼ活性のためにヒト神経芽腫細胞及びヒト癌細胞(HeLa株)にアポトーシスプログラム化された細胞死)を誘発する(Leira, F., Alvarez, C. ほか, 2001, Toxicology in vitro, 15, 277-283、 Malaguti, C.,Ciminello, P. ほか, 2002, Toxicol in Vitro, 16, 357-363)。さらに、この毒素は、ヒト肝細胞癌細胞(HEP−G2)とHeLa229細胞への細胞毒性効果を有する。したがって、推測的に、抗腫瘍薬として用いる余地がある。

0006

この二次メッセンジャーの両方のレベルと、タンパク質キナーゼAで生じる活性化のため、cAMP経路細胞増殖に関係する。抗腫瘍薬(例えばシスプラチン)に対する耐性がこのタンパク質不活性化に関連があることが説明されてきたが(Cvijic, M.E., Yang, W.L. ほか, 1998, Pharmacol Ther, 78, 115-28)、タンパク質キナーゼAの抑制は抗腫瘍活性を引き起こす(Wang, H., Cai, Q. ほか, 1999, Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 13989-94)。ちなみに、cAMDのレベルが次第に細胞毒性薬剤に対する耐性に関連する(Mann, S.C., Andrews, P.A. ほか, 1991, Int J Cancer, 48, 866-72、 von Knethen, A., Lotero, A. ほか, 1998, Oncogene, 17, 387-94)。言い換えると、cAMP経路は、細胞増殖を調整するときに重要で複雑な役割を果たす。この理由から、ホスホジエステラーゼに影響する天然又は合成分子、及びHTS(ハイスループットスクリーニングプロトコルに適用可能であるこれらの酵素の活性を研究するための方法についての説明は、新しい処置を開発するためにとても役立つ道具である。この意味で、腫瘍細胞増殖へのYTXsの抑制効果についての説明は、可能な治療用途のためにこれらの分子が薬理学的に重要であることを示唆する。さらに、それらの低い毒性のために、YTXは毒素ではなく、むしろ異なる薬理学的な使用による天然物と考えるべきであると一部の著者は指摘する。

0007

毒素のファミリー、YTXsの特定の特性及びそれらの作用のメカニズムについてのより詳しい説明は、本発明に関連するもとの出願及び分割出願の詳細な説明に示される。

課題を解決するための手段

0008

発明を実施するための最良の形態

0009

本発明では、細胞ホスホジエステラーゼを活性化する能力に従った、YTXsの細胞増殖抑制剤としての使用について説明する。

0010

使用:ホスホジエステラーゼを活性化するYTX及び化合物新生細胞増殖抑制剤としての使用。

0011

新生細胞増殖抑制剤は、新薬の抗新生物特性を説明するために広く用いられる抗腫瘍活性の指標である。YTXはヒト肝細胞癌細胞に対し細胞毒性であることがわかってきた。さらに、この毒素は神経芽腫細胞にアポトーシスを誘発することが説明されている(Leira, F., Alvarez, C. ほか, 2001, Toxicology in vitro, 15, 277-283)。これは全て、YTXを抗腫瘍薬として用いる余地があることを示す。肝臓癌腫瘍細胞に対する細胞毒性薬としてのYTXの能力をこの使用では定量する。文献に説明された異なるプロトコルに従って、細胞増殖抑制を決定することができる。以下で説明されるこれらのプロトコルの1つでは、クリスタルバイオレットの染色と引き続くアセチル化によってHEP−G2の細胞株で反応を定量する。

0012

(実施の形態)
a.マイクロ滴定プレート上にウェルあたり10000細胞の密度でHEP−G2細胞を播種する。37℃の成長培地で24時間、5%のCO2でそれらをインキュベートする。

0013

b.異なる濃度のYTXを添加し、37℃で48時間、5%のCO2でそれをインキュベートする。

0014

c.10μLの11%グルタルアルデヒドを添加し細胞を固定し、15分間それをインキュベートする。蒸留水で3〜4回それを洗浄する。

0015

d.クリスタルバイオレットの0.1%溶液を添加し、15分間プレート振動する。

0016

e.蒸留水で洗浄することで染料を取り除き、続けてそれを乾燥する。

0017

f.10%の酢酸を添加し、15分間振動を維持する。

0018

g.595ナノメートル分光光度計吸光度を読み取る。

0019

h.このプロトコルで10μMのYTXが約82+/−1%の細胞増殖の抑制を誘発することがわかった。

0020

(文献)
Alfonso, A., de la Rosa, L. A., Vieytes, M. R., Yasumoto, T. and Botana, L. M. (2003). "Yessotoxin a novel phycotoxin, activates phosphodiesterase activity. Effect of yessotoxin oncAMPlevels in human lymphocytes." Biochem Pharmacol 65: 193-208.
Alfonso, A., Vieytes, M. R., Yasumoto, T. and Botana, L. M. (2004). "A rapid microplate fluorescent method to detect yessotoxins based on their capacity to activate phosphodiesterases." Analytical Biochem. 326: 93-99.
Aune, T., Sorby, R., Yasumoto, T., Ramstad, H. and Landsverk, T. (2002). "Comparison of oral and intraperitoneal toxicity of yessotoxin towards mice." Toxicon 40(1): 77-82.
Cvijic, M. E., Yang, W. L. and Chin, K. V. (1998). "Cisplatin resistance in cyclicAMP-dependent protein kinase mutants." Pharmacol Ther 78(2): 115-28.
De la Rosa, L. A., Alfonso, A., Vilarino, N., Vieytes, M. R. and Botana, L. M. (2001). "Modulation of cytosolic calcium levels of human lymphocytes by yessotoxin, a novel marine phycotoxin." Biochem. Pharmacol. 61(7): 827-833.
De la Rosa, L. A., Alfonso, A., Vilarino, N., Vieytes, M. R., Yasumoto, T. and Botana, L. M. (2001). "Maitotoxin-induced calcium entry in human lymphocytes - Modulation by yessotoxin, Ca2+ channel blockers and kinases." Cell Signal 13(10): 711-716.
Houslay, M. D. and Adams, D. R. (2003). "PDE4 cAMP phosphodiesterases: modular enzymes that orchestrate signalling cross-talk, desentization and compartmentalization." Biochem J. 370: 1-18.
Leira, F., Alvarez, C., Vieites, J. M., Vieytes, M. R. and Botana, L. M. (2001). "Okadaic acid and yessotoxin induce caspase-3 mediated apoptosis in neuroblastoma cells. Characterization of distinct apoptotic changes induced by these phycotoxins in the BE(2)-M17 cell line by means of new fluorimetric microplate assays." Toxicology in vitro 15: 277-283.
Malaguti, C., Ciminello, P., Fattorusso, E. and Rossini, G. P. (2002). "Caspase activation and death induced by yessotoxin in HeLa cells." Toxicol in Vitro 16(4): 357-363.
Mann, S. C., Andrews, P. A. and Howell, S. B. (1991). "Modulation of cis-diamminedichloroplatinum(II) accumulation and sensitivity by forskolin and 3-isobutyl-1-methylxanthine in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cells." Int J Cancer 48(6): 866-72.
Murata, M., Kumagai, M., Lee, J. S. and Yasumoto, T. (1987). "Isolation and structure of Yessotoxin, a novel polyether compound implicated in diarrhetic shellfish poisoning." Tetrahedron Letters 28: 5869-5872.
Pazos, M. J., Alfonso, A., Vieytes, M. R., Yasumoto, T., Vieites, J. M. and Botana, L. M. (2004). "Resonant mirror biosensor detection method based on yessotoxin-phosphodiesterase interactions." Analytical Biochem. 335: 112-118.
Tubaro, A., Sosa, S., Carbonatto, M., Altinier, G., Vita, F., Melato, M., Satake, M. and Yasumoto, T. (2003). "Oral and intraperitoneal acute toxicity studies of yessotoxin and homoyessotoxins in mice." Toxicon 41(7): 783-92.
von Knethen, A., Lotero, A. and Brune, B. (1998). "Etoposide and cisplatin induced apoptosis in activated RAW 264.7 macrophages is attenuated by cAMP-induced gene expression." Oncogene 17(3): 387-94.
Wang, H., Cai, Q., Zeng, X., Yu, D., Agrawal, S. and Zhang, R. (1999). "Antitumor activity and pharmacokinetics of a mixed-backbone antisense oligonucleotide targeted to theRIalpha subunit of protein kinase A after oral administration." Proc Natl Acad Sci U S A 96(24): 13989-94.

図面の簡単な説明

0021

図1は側鎖置換で区別されるYTXのいくつかの自然類似物である。

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