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課題

ヒト移植拒絶に重要な要因である、異なった末端Galα1−3Galβ1−4GlcNAcを持つ炭水化物部分生産を妨げる方法の提供。

解決手段

α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの正常な発現が少なくとも組織型の一つの器官で妨げられるために、アンチセスRNAをコードするNA構築物の使用、リボザイムをコードするDNAの使用によるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの正常な発現が妨げられたブタの提供。

概要

背景

α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ供与体器官不足は、異種移植が器官利用能代替的手段として役立つ可能性があるという希望に導くことになった。ブタ、とりわけミニブタは、潜在的に大きな利用能、人畜共通性感染症の危険性の少ないこと、器官の適切な大きさおよび社会的かつ倫理的懸念が少ないなどの理由で非ヒト霊長類に対する魅力的選択肢である(サックス,D.H.他、1976年、移植、22巻、559−567ページ:オーチンクロス,H.ジュニア、1988年、移植、46巻、1−20ページ)。しかし異種移植に対する主要な障害は、超急性拒絶激症拒絶)として説明される現象である(ブッシュ他、1972年、アメリカン・ジャーナルオブ・パソロジー、79巻、31−57ページ:オーチンクロス,H.ジュニア、1988年、移植、46巻、1−20ページ)。この現象は非常に早く厳しい体液拒絶であり、これは供与体器官の移植の数分あるいは数時間以内に移植片破壊に導く。激症拒絶は、補体ステム活性化、血液凝固タンパク質の活性化、内皮細胞の活性化および炎症タンパク質の放出を含む複合シリーズ事象で明らかに影響される(ブッシュ他、1972年、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー、79巻、31−57ページ;プラット,J.L.1992年、ASAITOジャーナル、38巻、8−16ページ)。種の間に見られる激症拒絶で根本的な重要性を持つ一連の前もって形成された抗体、所謂自然抗体を意味する情報の累積体が存在する。移植片の受容体が供与体種に激症応答を開始できる循環抗体を持つ種の組み合せは不調和であると説明される。ブタとヒトはそのような不調和種の組み合わせである。

激症拒絶過程は受容体の自然抗体が供与体の器官の細胞に結合する時に開始される(プラット他、1990年、移植、50巻、870−822ページ;プラット他、今日の免疫学、11巻、450−460ページ)。末端Galα1−3Galβ−4GlcNAc構造を運ぶブタN結合炭水化物は、抗ブタ異種反応ヒト自然抗体の主要標的であることが提案されてきた(グッド他、移植紀要、24巻、559−562ページ;サンドリン他、1993年、全米科学アカデミー紀要、アメリカ合衆国、90巻、11391−11395ページ)。ブタ組織およびヒト組織グリコシル化パターンの間の主要な差異は、ブタ細胞および組織に高水準で末端Galα1−3Galβ−4GlcNAc構造が存在することである。この構造は調査された下級哺乳類すべてで高水準で発現されるが、旧世界(アジアヨーロッパ、アフリカ)サル類人猿、およびヒト(狭人類)の細胞および組織では殆ど発現されない(ガリリ,U.およびスワンソン,K.1992年、全米科学アカデミー紀要、88巻、7401−7404ページ;ガリリ他、全米科学アカデミー紀要、84巻、1369−1373ページ)。特異トランスフェラーゼUDP:Galβ1…>4GlcNAc α1…>3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC2.4.1.151;α(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼ)はN−アセチルラクトースアミン炭水化物鎖およびラクトースアミノ多糖類末端ガラクトースを末端ガラクトース残渣に転移する原因であり、それは以下の反応により行われる:

ここでRは糖タンパク質あるいは糖脂質である(ブランケン,W.M.およびバン・デン・アイヒンデン,D.H.、1985年、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー、260巻、12927−12934ページ)。かくしてGalα1−3Galβ−4GlcNAcエピトープ決定基)ができる。マウス(ラーセン他、1988年、全米科学アカデミー紀要、86巻、8227−8231ページ)およびウシ(ジョジアス他、1989年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、264巻、14290−14297ページ)酵素コード化する全長cDNA配列が決定された。加えて、マウスα(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ゲノム体制確立された(ジョジアス他、1992年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、267巻、5534−5541ページ)。

概要

ヒト移植拒絶に重要な要因である、異なった末端Galα1−3Galβ1−4GlcNAcを持つ炭水化物部分生産を妨げる方法の提供。α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの正常な発現が少なくとも組織型の一つの器官で妨げられるために、アンチセスRNAをコードするNA構築物の使用、リボザイムをコードするDNAの使用によるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの正常な発現が妨げられたブタの提供。なし

目的

ブタ組織およびヒト組織のグリコシル化パターンの間の主要な差異は、ブタ細胞および組織に高水準で末端Galα1−3Galβ−4GlcNAc構造が存在することである

効果

実績

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請求項1

α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの正常な発現が少なくとも組織の型の一つの器官において妨げられる一つの遺伝子導入ブタ

請求項2

請求の範囲第1項記載の遺伝子導入ブタであり、前記ブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化するmRNAと結合しその翻訳を妨げる一つの核酸配列生産することを特徴とする遺伝子導入ブタ。

請求項3

請求の範囲第2項記載の遺伝子導入ブタであり、そのためにプロモーターに操作可能に結合される機能的酵素を妨げあるいは発現するの必要なα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼコード化領域のその部分にアンチセンスRNAをコード化するDNAよりなる一つの構築物を含むようにブタのゲノムが修飾されたことを特徴とする遺伝子導入ブタ。

請求項4

請求の範囲第3項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでプロモーターが強力で非組織特異的構築あるいは調節可能プロモーターであることを特徴とする遺伝子導入ブタ。

請求項5

請求の範囲第3項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでプロモーターが強力で組織特異的構築あるいは調節可能プロモーターであることを特徴とする遺伝導入ブタ。

請求項6

リボザイムを生産するように作られたことを特徴とする請求の範囲第1項記載の遺伝子導入ブタ。

請求項7

請求の範囲第6項記載の遺伝子導入ブタであり、それがプロモーターに操作可能に結合されるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼを不活性化するのに必要な少なくともリボザイムのその部分をコード化するDNAよりなる構築物を含むように修飾されたことを特徴とする遺伝子導入ブタ。

請求項8

請求の範囲第7項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでプロモーターが強力で被組織特異的構成あるいは調節可能プロモーターであることを特徴とする遺伝子導入ブタ。

請求項9

請求の範囲第7項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでプロモーターが強力で組織特異的構成あるいは調節可能プロモーターであることを特徴とする遺伝導入ブタ。

請求項10

ブタ卵母細胞から成長するα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼフェらーゼ陰性ブタであり、その前核物質が除去されα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの発現に陰性である多能性ブタ胚幹細胞を導入されたα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ。

請求項11

配列識別番号1および13から24よりなるグループから選択される配列を持つ一つの核酸

請求項12

配列識別番号1で説明された配列を持つことを特徴とする請求項第11項記載の核酸。

請求項13

請求の範囲第11項記載の核酸であって、ここで配列識別番号が配列識別番号13から15よりなるグループから選択されることを特徴とする核酸。

請求項14

請求の範囲第11項記載の核酸であって、ここで配列識別番号が配列識別番号16から21よりなるグループから選択されることを特徴とする核酸。

請求項15

請求の範囲第11項記載の核酸であって、ここで配列識別番号が配列識別番号22から24よりなるグループから選択されることを特徴とする核酸。

請求項16

請求の範囲第1項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでβ(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の正常な発現が同一遺伝子型DNA含有標的化ベクターの前記ブタへの導入により妨げられることを特徴とする遺伝子導入ブタ。

請求項17

ブタ接合体から成長する請求の範囲第16項記載のα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタであり,それはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ染色体遺伝子座において同質遺伝子DNA標的ベクターを用いて相同性組換えにより修飾されたことを特徴とするα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ。

請求項18

請求の範囲第17項記載のα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタであって、ここで同一遺伝子型DNA標的化ベクターが少なくとも約6キロベースの同質遺伝子型DNAおよび無プロモーター選択マーカー遺伝子よりなることを特徴とするα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ。

技術分野

0001

本発明はα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子発現を欠いたブタに関する。

背景技術

0002

α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ供与体器官不足は、異種移植が器官利用能代替的手段として役立つ可能性があるという希望に導くことになった。ブタ、とりわけミニブタは、潜在的に大きな利用能、人畜共通性感染症の危険性の少ないこと、器官の適切な大きさおよび社会的かつ倫理的懸念が少ないなどの理由で非ヒト霊長類に対する魅力的選択肢である(サックス,D.H.他、1976年、移植、22巻、559−567ページ:オーチンクロス,H.ジュニア、1988年、移植、46巻、1−20ページ)。しかし異種移植に対する主要な障害は、超急性拒絶激症拒絶)として説明される現象である(ブッシュ他、1972年、アメリカン・ジャーナルオブ・パソロジー、79巻、31−57ページ:オーチンクロス,H.ジュニア、1988年、移植、46巻、1−20ページ)。この現象は非常に早く厳しい体液拒絶であり、これは供与体器官の移植の数分あるいは数時間以内に移植片破壊に導く。激症拒絶は、補体ステム活性化、血液凝固タンパク質の活性化、内皮細胞の活性化および炎症タンパク質の放出を含む複合シリーズ事象で明らかに影響される(ブッシュ他、1972年、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー、79巻、31−57ページ;プラット,J.L.1992年、ASAITOジャーナル、38巻、8−16ページ)。種の間に見られる激症拒絶で根本的な重要性を持つ一連の前もって形成された抗体、所謂自然抗体を意味する情報の累積体が存在する。移植片の受容体が供与体種に激症応答を開始できる循環抗体を持つ種の組み合せは不調和であると説明される。ブタとヒトはそのような不調和種の組み合わせである。

0003

激症拒絶過程は受容体の自然抗体が供与体の器官の細胞に結合する時に開始される(プラット他、1990年、移植、50巻、870−822ページ;プラット他、今日の免疫学、11巻、450−460ページ)。末端Galα1−3Galβ−4GlcNAc構造を運ぶブタN結合炭水化物は、抗ブタ異種反応ヒト自然抗体の主要標的であることが提案されてきた(グッド他、移植紀要、24巻、559−562ページ;サンドリン他、1993年、全米科学アカデミー紀要、アメリカ合衆国、90巻、11391−11395ページ)。ブタ組織およびヒト組織グリコシル化パターンの間の主要な差異は、ブタ細胞および組織に高水準で末端Galα1−3Galβ−4GlcNAc構造が存在することである。この構造は調査された下級哺乳類すべてで高水準で発現されるが、旧世界(アジアヨーロッパ、アフリカ)サル類人猿、およびヒト(狭人類)の細胞および組織では殆ど発現されない(ガリリ,U.およびスワンソン,K.1992年、全米科学アカデミー紀要、88巻、7401−7404ページ;ガリリ他、全米科学アカデミー紀要、84巻、1369−1373ページ)。特異トランスフェラーゼUDP:Galβ1…>4GlcNAc α1…>3−ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC2.4.1.151;α(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼ)はN−アセチルラクトースアミン炭水化物鎖およびラクトースアミノ多糖類末端ガラクトースを末端ガラクトース残渣に転移する原因であり、それは以下の反応により行われる:

0004

ここでRは糖タンパク質あるいは糖脂質である(ブランケン,W.M.およびバン・デン・アイヒンデン,D.H.、1985年、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー、260巻、12927−12934ページ)。かくしてGalα1−3Galβ−4GlcNAcエピトープ決定基)ができる。マウス(ラーセン他、1988年、全米科学アカデミー紀要、86巻、8227−8231ページ)およびウシ(ジョジアス他、1989年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、264巻、14290−14297ページ)酵素コード化する全長cDNA配列が決定された。加えて、マウスα(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノム体制確立された(ジョジアス他、1992年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、267巻、5534−5541ページ)。

発明が解決しようとする課題

0005

ブタα(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNA遺伝子の3′領域をコード化する部分配列が決定された(ダブコウスキー他、1993年、移植紀要、25巻、2921ページ)が、全長配列は報告されなかった。5′領域の不在がここで説明される出願にとっては重要である。下級哺乳類とは対照的に、ヒトはα(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼを発現しない。更に、マウス配列に相同であるヒト配列染色体12の処理偽遺伝子および染色体9の不活性化残遺物に対応する(シェーパー他、1992年、ゲノミクス、12巻、613−615ページ)。

課題を解決するための手段

0006

この発明に従って、ブタ器官あるいは組織もしくは細胞は、ブタ移植の異種、とりわけヒト激症拒絶の重要な要素である弁別的末端Galα1−3Galβ1−4GlcNAcエピトープを含む炭水化物成分生産しないであろう。更にこの発明に従って、完全なα(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子抑圧なしで意図された受容体に対し、α(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼの生産量を減少し、その減少の範囲は炭水化物にGalα1−3Galβ1−4GlcNAcエピトープの提供から生じる量を細胞表面に提供されることから阻害し、それにより遺伝子導入動物、器官、組織、細胞あるいは細胞培養免疫的寛容にするのに十分な範囲にするという見地である。

0007

この発明の主要な見地の一つは、発明者が完全なブタα(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNA遺伝子(配列識別番号1)を分離したことである。今や5′末端の配列を特異的に提供する完全cDNA遺伝子の識別、分離および配列化は重要な前進である。何故なら、実施例2に説明するように、この領域はアンチセンス標的化にもっとも効果的であると確認されたためである。その上、マウスおよびウシ相同配列(図2)で比較されるように、α(1、3)ガラクトシルトランスフェラーゼmRNAの領域はこれらの種の間で広範にそれ、それを「交差種」アンチセンス構築物の利用が成功するということから極端に似て非なるものにする。

0008

この発明のも一つの主要な見地は、遺伝子変更動物、より特異的には遺伝子導入キメラあるいはモザイクブタに関するものであり、ここでは、生物活性α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、少なくとも1個の器官、組織あるい細胞型に妨げられる。遺伝子導入動物は、初期成長段階に動物が生殖細胞系、あるいは動物の祖先に導入された遺伝子を運ぶ。遺伝子導入動物での遺伝子変更は、意図的な実験介入の結果としてゲノムに安定して組み込まれる。

0009

典型的には、これは外因性外来DNAもしくは新規構築物の追加より生じる(パルマイター他、1986年、アニュアル・レヴィュー・オブ・ジェネティクス、20巻、465ページ)。胚幹ES)細胞および特異的遺伝子標的化到来とともに、遺伝子導入生成(taonsgenesis)の定義は、今や直接の実験操作により、また内因性遺伝子の発現も調節するエフェクター分子をコードするDNAの安定した組込みにより内因性遺伝子配列の特異的修飾(変更)を含む(ゴスラー他、1986年、全米科学アカデミー紀要、83巻、9065ページ:シュバーツバーク他、1989年、サイエンス、246巻、797ページ;ジョイナー他、ネイチャー、338巻、153ページ)。

0010

遺伝子導入動物を生成する一つの望ましいアプローチは、細胞への望ましくは初期胚段階(通常は、接合体/1細胞段階)で動物の前核へののDNAの顕微注射を含む。説明された通り注射されたDNAは、天然遺伝子物質に組み込まれ、宿主生体の染色体DNAとともに確実に複製を行う。これは生殖細胞系を含む成長生体のすべての細胞に遺伝子導入が行きわたることを可能とする。生殖細胞系に伝達された遺伝子導入DNAは遺伝子導入子の上昇を与える。もしメンデル方式で伝達される場合には、子の半分が遺伝子導入される。創始動物から誘導される遺伝子導入動物すべては遺伝子導入系として引用される。顕微注射された遺伝子導入DNAが1細胞胚以降の段階で染色体DNAに組み込まれるものとすると、すべての細胞が遺伝子導入とはならず、また動物は遺伝子的にモザイクであるとして引用される。遺伝子的にモザイクな動物は、生殖細胞系伝達物質あるいは非伝達物質のいずれかとなる。異種DNA構築物の初期胚細胞への顕微注射の一般的アプローチは、通常優勢効果の生成を制限する。すなわち、導入遺伝子対立遺伝子半接合体)の一つが表現型の発現を起こす(パルマイター他、1986年)マニュアル・レヴィユー・オブ・ジェネティクス、20巻、465ページ)。

0011

も一つの望ましいアプローチにおいて、動物は胚幹(ES)細胞媒介遺伝子導入生成により遺伝子的に変更される(ゴスラー他、1986年、全米科学アカデミー紀要、83巻、9065ページ)。ES細胞系は、胚盤胞(相対的に成長の初期段階の胚)の内細胞塊(ICM)から、もしくは胚体内生にある始原生殖細胞の移動よりのいずれかにより、初期胚から誘導される。それは多くの継代にわたり試験管内で培養されるポテンシャルを有し(すなわち、それは条件的不死となり)、またそれは多能性、あるいは全能性(すなわちすべての細胞型に分化しおよびそれらを生じることが可能)である。ES細胞は受容体の胚盤胞に導入され、それは成長のため出産予定日まで養母子宮に移される。ES細胞を注射された受容体胚盤胞は宿主胚および胚幹細胞からの助力によりキメラ動物に成長することができる。ES細胞は、優勢効果を生じ、全遺伝子を不活性化し、あるいは点突然変異を含む微妙な変化を導入する異種遺伝子構築のいずれかにより形質移入することができる。定義された遺伝子変更のためのクローン選別続き少数のES細胞は受容体の胚(胚盤胞あるいは桑実胚)に再導入することができ、ここではそれは生殖細胞系を含む動物のすべての組織に分化し、かくして設計された遺伝子修飾で動物の安定した系を発生させる。全能性ブタ胚幹細胞は遺伝子変更により、異型接合(+/−)突然変異体、望ましくは無効対立遺伝子、特にこのような胚幹細胞内で相同性替えにより生産されたものを持つことができる。選択肢としては、相同性組換えによる遺伝子標的事象は、同じ遺伝子座で細胞のクローンを産出する2回のラウンドで実行され、同型接合(−/−)突然変異体、望ましくは無効突然変異体に帰着する(ラミレスソリス他、メソッズ・インエンイモロジー,225巻、855ページ)。

0012

この発明の望ましい実施例において、一つのDNA配列はブタの天然遺伝子物質に組み込まれてアンチセンスRNAを生産し、このRNAが遺伝子導入ブタにおけるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する天然mRNAに結合しその翻訳を妨げる。

0013

特に望ましい実施例において、遺伝子導入ブタのゲノムは修飾されて、生物活性酵素の全体あるいは一部の発現を妨げるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼコード化領域相補的なDNAよりなる一つの構築物を含む。「組込みアンチセンス配列」という語が使用される場合、それは非天然核酸配列の一つであり、それが細胞の遺伝子物質に組込まれ、これが細胞の遺伝子物質により生産されるmRNAに相補的でありかつそれと結合する一つのmRNAを生産するために(構造的にあるいは誘発的に)転写されそのためその発現を調節あるいは阻害するような抗酸配列を意味する。

0014

この発明のも一つの実施例において、非突然変異体から得る細胞あるいは細胞系は1個あるいは両方の対立遺伝子で不活性化されたα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼで組込みアンチセンス配列の利用を通じて作られ、この配列は前記細胞あるいは細胞系でα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する天然mRNAに結合してその翻訳を妨げる。実施例3で転写されるRNA配列のような組込みアンチセンス配列は電気穿孔法レトロウィルス形質導入あるいはリポフェクション(lipofection)などの各種の手段により細胞に運ばれる。

0015

も一つの望ましい実施例において、遺伝子導入ブタはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼmRNAを特異性で切断するリボザイム触媒RNA)を生産するために作られる。リボザイムは他のRNA分子に関し酵素として作用するか、もしくは自己スプライシングもしくは自己切断のような反応で分子間で作用することで酵素活性を持ちRNAの特異領域である。(ロング,D.M、およびアーレンベック,O.C,1993年FASEBジャーナル,7巻、25−30ページ)。ある種のリボザイムは「ハンマーヘッド」と呼ばれる一般に約30個だけのヌクレオチドの小さい構造領域を含む。ハンマーヘッドは切断される基質領域に特異的な補体である2個の線状領域により隣接されているRNAのループである。基質の切断を実施するハンマーヘッドリボザイムの部位はステムループあるいはハンマーヘッドの基礎である。図3で示されるように、この発明のリボザイムは、α(1,3)ガラクトシルランスフェラーゼcDNA遺伝子の5′末端に近い領域に相補的であるフランキング(隣接)配列を持つ。

0016

リボザイムのDNAは動物、組織あるいは細胞の遺伝子物質に組込まれ、(構造的あるいは誘発的に)転写されて、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼと選択的に結合してそれを切断できるリボザイムを産出する。それが触媒分子であるために、このような各リボザイムは多重基質分子を切断することができる。

0017

リボザイムの触媒的「ステムループ」はα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼmRNAの領域に相補的な配列により隣接される。特に望ましい実施例において、遺伝子導入ブタは修飾され、そのプロモーター操作的に結合するα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼのmRNAを不活性化するのに必要な触媒的RNAの一部をコード化するDNAよりなる構築物を組込む

0018

この発明のも一つの実施例において、非突然変異体から得る細胞あるいは細胞系は、前記細胞あるいは細胞系にあるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する天然mRNAに結合し、それを切断する組込みリボザイム配列の使用を通じて1個もしくは両方の対立遺伝子で不活性化されたα(1,3)
ガラクトシルトランスフェラーゼで作られる。実施例4で転写されるRNA配列のような組込みリボザイム配列は、電気穿孔法、レトロウイルス形質導入あるいはリポフェクションなどの各種の手段により細胞に伝達される。

0019

培養ブタ胚幹細胞を用いるも一つの実施例において、突然変異、望ましくは無効(ヌル)突然変異がα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する天然ゲノム遺伝子座で遺伝子を標的化することにより導入される。ES細胞の相同性組換えによる遺伝子標的化は、天然遺伝子に対する広範な配列相同性を含むが、生物活性タンパク質を生成するのにとりわけ重要な遺伝子のある位置で突然変異に特異的な構築物を用いて行われる。従って突然変異は翻訳、転写、あるいはタンパク質の機能領域をコード化するもののいずれかにとって重要な領域に位置することができる。遺伝子標的構築物を相同的に組換え、遺伝子「ノックアウト」構築物と名づけられるESクローンの選別は特異的マーカー遺伝子を用いて行うことができる。その標準手順は2種の薬品選択マーカーの組み合わせを使用することであり、その一つは正の選択のもの(マーカーが発現される場合には薬品の存在下で生存)およびも一つは負の選択のもの(マーカーが発現される場合には薬品の存在下で殺害)である。標的化ベクターの望ましい、一つのタイプは、薬品G418内で正の選択を行うネオマイシンホスホトランスフェラーゼネオ)遺伝子であり、また同様にガンシクロビル内で選択的殺害を行う単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−tk)を含む。正負選択(PNS)と名付けられたG418およびガンシクロビルの薬品選択(マンサウアー他、1988年、ネイチャー、336巻、348ページ;タビュレヴィッチ他、1991年、細胞、65巻、1153ページ)は、ランダム組込み事象よりも遺伝子標的化を受けるES細胞クローンの富化を可能にする。相同性組換え遺伝子事象の確認はサザン分析で行なわれる。

0020

α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ標準化構築物の設計は実施例6で説明される。ここで適用される手順はネオ(ネオマイシン耐性)の組込みにもとづく正の選択を用いて、望ましくはカセット内でホスホグリセレートキナーゼPGK−1)プロモーターを用いてα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子配列の2個の異なった領域に相補的な隣接オリゴヌクレオチドとともに内因性α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に逆方向で行われる。ネオに代わって他の正の選択マーカーを使用できることは理解される。ネオ遺伝子はその制御下でネオ遺伝子プロモーターに連結される。第2隣接配列の下流にはHSV−tk遺伝子があり、もしそれがゲノムに組込まれるとチミジンキナーゼの生産をコード化し、細胞がガンシクロビルにより殺害され易くなる(負の選択)。HSV−tk遺伝子でなくネオ遺伝子を組込むとα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼへの組込みが起こり、そのような形質転換される細胞の正と負の選択が提供される。

0021

同質遺伝子型DNAを用いるも一つの望ましい実施例において、接合体などの生物システムにおいてすら高頻度相同的組換えを実行することが可能となり、この接合体は綿密な選択実験記録の使用には向かず、従って、これまでは相同的組換えを指示する正のマーカー属性を示した細胞分離の適切な候補者ではなかった。標的受容体細胞の染色体部分のそれと事実上同一である同質遺伝子型DNAを含む標的化ベクターの使用は、その後遺伝子導入動物に成長する標的接合体に使用できる。これらの接合体細胞の使用は、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する染色体遺伝子座で望ましくは突然変異、望ましくは無効突然変異を生産することである。かくしてこれらのベクターは、天然遺伝子に対する広範な配列相同性を含み、しかもまた生物活性タンパク質を生産するのに極めて重要な遺伝子内部分で特異的な突然変異を含む。従って、突然変異は翻訳、転写あるいはタンパク質の機能領域を被覆するもののいずれかにとって重要な領域に位置を占めることができる。同質遺伝子型DNAを用いて達成される高い割合の相同的組換えが、「ノックアウト」実施例と関連して前に述べたられたように遺伝子標的構築物を相同的に組換えたクローンの選択の必要性を避けさせるため、前に述べた標準選択手順の必要性を避けることが可能となる。

0022

より詳細には、この実施例において、PC%が1−2キロベースDNA断片を識別し抽出するのに使用され、これを次いで接合体注射のために選択されたミニブタ系にもっとも多く存在する領域あるいは対立遺伝子を識別するために制限断片多形消化を受ける。既知挿入ベクターが使用されるが、しかし従来の技術に記された置換ベクターも利用できる。僅か2,3キロベースの連続同質遺伝子型DNAを必要とする同質遺伝子型置換ベクターとともにDNA配列を使用することも可能である。このようにして、高度に効果的な組換えを行うことが可能となるため、標的化ベクター組換え接合体を選別する必要はない。むしろPCRを用いるゲノムDNA選別は、子ブタが生まれた後に行うことができる。天然α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座を標的とする遺伝子導入を受けたと見做されるこれらの遺伝子導入創始動物(すなわちこの遺伝子に関して異型接合体無効突然変異体)は異種交配され、この遺伝子座にとっては同型接合体無効突然変異体を生産し、その結果抗体あるいはレクチン結合検定より確認できるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトを来す。

0023

このブタは望ましくは核移転実験記録を用いてその前核物段が除去され全能性ブタ胚幹細胞を導入されたブタ卵母細胞から成長するα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタである(プラザー他、1989年、バイオロジカル・リプロダクション、41巻、414ページ)。核移転のため使用されるES細胞はα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は陰性であり、あるいは選択肢としては、核移転のため使用される全能性ES細胞は標的様式においてα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の少なくとも1個の対立遺伝子に突然変異する。

0024

このブタは望ましくはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を欠いており、胚盤胞注射あるい桑実胚凝集によりES細胞から生成されるキメラ動物から繁殖される。望ましい無効突然変異キメラ動物を生成するES細胞は、相同的組換えにより遺伝子標的を用いるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座の少なくとも1個の対立遺伝子で突然変異された。

0025

キメラブタは望ましくは、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの1個の対立遺伝子を突然変異されたES細胞で構成される。突然変異ES細胞から誘導されるのはまた雄性もしくは雌性配偶子の生殖細胞系であり、それはこの突然変異の子孫への継代が可能となり、また異型接合体突然変異体姉妹細胞ブタを繁殖させてα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座で同型接合体突然変異体動物の産出を可能にする。更に説明されるのは、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質を欠く(つまりα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質の発現の欠除特徴づけられる)ブタであり、細胞表面に、もしあっても機能的Galα1−3Galβ1−4GlcNAcエピトープ含有炭水化物抗原を殆ど持っていないブタである。更に説明されているものは、遺伝子導入ブタを生産する方法およびこの発明の異型接合ブタあるいは同型接合ブタから組織を生産する方法である。この発明は更にブタ細胞系のような細胞系に関し、ここではα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が移植のための組織および細胞の源泉として1個もしくは両方の対立遺伝子を不活性化しこのような細胞に使用される。

0026

この発明の遺伝子導入ブタ、より詳細には半接合体、異型接合体あるいは同型接合体突然変異動物から得られた組織、器官および精製あるいは事実上精製された細胞は、組織、器官あるいは細胞を必要とするヒトを含む他の哺乳類に異種移植のため使用することができる。α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ不活性細胞はそれ自身治療あるいは療法/臨床製品になり得る。例えば、不活性のα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼを与えられたケラチノサイト黄斑変性に使用できるし、また欠損α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼを与えられた膵臓細胞は受容体に膵臓産物(および機能)を元に戻すことができる。も一つの実施例においては、この方法で生産された不活性α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼは既知の方法を用いて受容体に提供される治療薬などの製品をコード化する対象を得る。この実施例では、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損組織、器官あるいは細胞は、コード化製品のための伝達ビヒクルとして役立つ。例えば、繊維芽細胞あるいは内皮細胞などのα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損細胞は、治療薬、例えば供与体組織移植を増すサイトカイン因子VIII、因子IX、エリスロポイエチンインシュリン、ヒト主要組織適合遺伝子複合体MHC)分子あるいは成長ホルモンなどをコード化する遺伝子で形質移入され、このコード化製品の必要個人に導入することができる。

0027

選択肢としては、受容体の胚盤胞は注射され、あるいは桑実胚が全能性胚幹細胞で凝集塊状化され、相同性組換えにより生産される突然変異、望ましくはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の少なくとも1個の対立遺伝子を持つキメラブタを産出する。キメラブタは、望ましくはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の1個の対立遺伝子を突然変異されたES細胞により構成されている。突然変異ES細胞から誘導されるのはまた生殖細胞であり、これは子孫にまで継代して突然変異が残り、異型接合体突然変異姉妹細胞ブタの繁殖はα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座で、同型接合体突然変異体動物を産出する。更に説明されているのは、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質を欠損するブタ(すなわち、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質を基本的には発現しないことにより特徴付けられるもの)であり、もしあったとしても、細胞表面に官能Galの1−3Galβ1−4GlcNAcエピトープ含有炭水化物抗原を殆ど持たないブタが産出される。更に説明されているのは、遺伝子導入ブタの生産方法およびこの発明の異型接合体ブタあるいは同型接合体ブタから得る組織の生産方法である。更にこの発明は細胞系、たとえばブタ細胞系に関し、ここではα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は1個もしくは両方の対立遺伝子上で不活性化し、また移植用の組織、器官および細胞の源泉としてこのような細胞系を利用することに関する。

0028

キメラブタおよびα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子不活性化に同型接合体のブタおよび組織培養、ここでα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質合成および細胞表面Galα1−3Galβ1−4GlNAcエピトープ含有炭化水素細胞表面マーカー発現が欠失しているものが開示される。特に関心の深いものは、精製細胞型であり、これはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ発現が欠損しているものである。このような細胞型は、繊維芽細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞および内皮細胞を含む。

0029

この発明の一つの実施例において、前記の変更されたブタ細胞は受容体で必要とされる細胞を提供するか、遺伝子治療を提供するために使用される。Galα(1−3)Galβ1−4GlcNAエピトープ含有炭水化物細胞表面抗原を欠失する細胞は培養され卵母細胞に移植される。

0030

無効突然変異体α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座を持つ胚幹細胞はブタ胚盤胞に導入され、それは次いで偽妊娠ブタに導入される。胚はキメラブタ子孫にて成長する。野生型メスと交配されると、キメラオスは胚幹細胞内にあるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ不活性化をその子孫に伝達し、これは不活性化に対し異型接合体である。α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子不活性化に異型接合であるブタは交配されて、突然変異に対し同型接合体(−/−)であるブタを生産する。

0031

精製され、あるいは事実上精製されたα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損細胞はここで説明されたように生産された組織あるいは遺伝子導入もしはキメラブタから得ることができる。選択肢としては、それはここで説明されたように、正常な(変更されていない)供与体ブタおよび変更されたものから得ることができる。これらの細胞は次いで移植に有用な大量の細胞を生産する既知の方法で培養することができる。更に、細胞系、例えばブタ細胞系、そこでα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が分裂したもの望ましくは対立遺伝子は、移植のための組織や細胞の源泉として有用である。

0032

実施例1
ブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNAの分離および特性化
これまでに説明されているλZAPIIブタ脾臓cDNAライブラリー(グスタフソン他、1990年、全米科学アカデミー紀要、87巻、9798−9802ページ)がクローン化α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNAプローブでのハイブリッド形成により選別された(ジョジアス他、1989年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー,264巻、14290−14297ページ)。ウシα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNA配列のジェンバンクアクセス番号はJ04989である。ウシα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNAプローブは、オランダライデン大学、デービッド・ジョジアス博士好意で提供された。このプローブはメガプライムDNA標識システム(英国、エイマシャム・インターナシナル)を用いて32P−dATP放射線標識された。正(陽性)のクローンはポリメラーが連鎖反応(PCR)で確認され、ウシα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNA配列から誘導されるプライマー(配列識別番号2および配列識別番号3)が使用された。配列識別番号2はウシα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド712−729に一致し、また配列識別番号3はウシα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド1501−1508に一致する。正のクローンから得られる組換えpBluescriptプラスミドヘルパーファージR408(英国、ケンブリッジ、ストラータジェン社)の助けを得て自動的に切除された大腸菌菌株TG1(ATCC39078)で増幅された。プラスミドDNAは、業者の指示に従ってマジックミニプレップキット(英国、サザンプトン、プロメガ社)を用いて準備され、DNAはEcoRI切断で特性付けられた。DNA配列化は、T7DNAポリメラーゼ配列化キット(英国、ミルトンケイズ,ファーマシア・バイオシステムズ社)を使って業者の指示に従ってジデオキシ終結法により行われた。合成オリゴヌクレオチドプライマー、配列識別番号4−12が使用された。配列識別番号4はストラータンジュSKカタログ番号300305(カリホルニア、ラホーラ、ストラータジェン社)である。配列識別番号5はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド94−111の逆補体に一致する。配列識別番号6ブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド163−180に一致する。配列識別番号7はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオトド442−959の逆補体に一致する。配列識別番号8はブタ補体およびウシα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド538−555および982−999にそれぞれ一致する。配列識別番号9はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド596−615の逆補体に一致する。配列識別番号10ブタ(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド682−699に一致する。配列識別番号11はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド847−864に一致する。配列識別番号12はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド970−987の逆補体に一致する。

0033

4個の正のクローンがウシα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNAプローブを用いてハイブリッド形成による選別で約2×104個のプラークから得られた(ジョジアス他、1989年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、264巻;14290−14297ページ)。これらクローンの3個はPCRにより正(陽性)であることが確認された。ヘルパーファージとともにλZap IIからの自動切除により生成される3個のpBluescriptプラスミドのそれぞれはEcoRI切断で決定されるように約2.5キロベースの挿入断片を含んでいた。pSα13GT1と名付けられた1個のクローンは次の研究のために選択された。

0034

pSの13GT1のDNA配列分析は1113塩基読み取り枠を明らかにし(配列識別番号1および図1参照)、公開されたウシcDNA配列と86%の同一性を示し(ジョジアス他、1989年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー264巻、14290−14297ページ)、またウシおよびマウスα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼアミノ酸配列をそれぞれ85%および76%の同一性で371個のアミノ酸タンパク質をコード化した(図2)。

0035

実施例2
α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ発現のアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害
3個のアンチセンス5′および3′ホスホチオエート保護オリゴヌクレオチド(S−オリゴヌクレオチド,配列識別番号13−15)が、ブタ一次内皮細胞培養(ブタ大動脈より得たもの)およびブタB−細胞系を使って試験管内で検査される(L231、動物細胞培養ヨーロッパコレクション、英国、ソールスベリポートダウンセンターフォアアプライド・マイクロバイオロジー・アンドリサーチ)。配列識別番号13はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcNDAヌクレオチド16−35の逆補体に一致する。配列識別番号14はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNAヌクレオチド31−53の逆補体に一致する。配列識別番号15はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNAヌクレオド6−23の逆補体に一致する。3個のアンチセンスオリゴヌクレオチドすべては、翻訳開始を取り囲むmRNAの5′領域に指向する。アンチセンス配列からランダム化されたナンセンスS−オリゴヌクレオチドは同じモル濃度で対照として使用される。

0036

ブタ内皮細胞は説明されているように、血管の管腔面を削ってミニチャーブタ大動脈から取り出される(ライアン他、組織と細胞、12巻、619−635ページ)。この細胞は20%のウシ胎児血清(メリーランドゲイザーズバーグ、ジブBRL)およびゲンタマイシンで補充されたM199培地に懸濁され、25cm2の組織培養フラスコプレートされ、フィブロネクチン(5μg/cm2)およびラミニン(1μg/cm2)で前コートされる。150μg/mlの内皮細胞成長補足剤マサチューセッツベッドフォードコラボレイティブ・リサーチ)が培養の開始に当り加えられる。培養は2−3日毎に培地を半分とりかえて維持される。ブタリンパ芽球細胞系L231はDMEM、10%のウシ胎児血清、10%のNCTC−109、1%のグルタミン、1%のペンストレップ(すべてメリーランド、ゲイザーズバーグ、ジブコBRL)および5×102Mの2−メルカプトエタノール(ミズーリ、セントルイスシグマ)で維持される。L−231細胞は3日毎に細胞を1:3に分配して継代培養される。

0037

細胞処理に関しては、S−オリゴヌクレオチドが加えられて最終濃度が5−10μMになるように成長細胞に24時間毎、典型的には48時間になるように加えられ、次いで処理細胞が(ノーザンブロット分析により)α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼmRNAの水準、およびヒトAB血清による細胞のエピトープの発現ならびにFITC−標識マウス抗ヒト二次試薬(抗ヒトIgMおよびIgG)を検査される。

0038

実施例3
組込みアンチセンス構築物の調製と用途
我々はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの生産を特異的に阻害する組込みアンチセンス構築物の能力を研究している。形質移入細胞におけるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの特異的阻害は激症現象における酵素の寄与を評価することを可能にする。サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御の下で、ベクターはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼアンチセンスmRNAを発現するように構築される。特にpSα13GT1はNotIおよびEcoRVで切断され、それはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNA配列のヌクレオチド531に至るまでのpBluescriptポリリンカー配列の部分を含む長さ537塩基対の制限断片を生成する。このDNA断片は発現ベクターpcDNA3(カリホルニア、サンジエゴ、インバイトゲン)にクローンされ、同じ酵素で切断される。生成ベクターは従って、pcDNA3に位置するCMVプロモーターに関連してアンチセンス方向にブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼを含む。この構築物は電気穿孔法あるいはDNAを哺乳類細胞に導入する他の効果的な方法を用いてブタ内皮細胞およびL231ブタリンパ芽球細胞系(実施例2で説明したように成長するもの)に形質移入される。アンチセンスRNAの効果はα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のノーザンブロット分析およびヒト血清成分(すなわち天然抗体)の結合度合の両方によってモニターされる。

0039

実施例4
ブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼmRNAを不活性化するリボザイム配列
この実施例はブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼmRNA配列を切断するように特に設計されたリボザイム配列をコード化するベクターの構築方法を説明する。
リボザイム配列の設計はコンセンサス作用ハンマーヘッドリボザイム配列にもとづくものである(ラフナー他、1990年、バイオケミストリー、29巻、10695−10702ページ)。我々はシス作用ハンマーヘッドリボザイム配列(デンマン,R.B.,1993年、バイオテクニクス、15巻、1090−1095ページ)をモデルとしてジェネティックコンピュータグループウィスコシン、マジソン)から利用できるプログラムに合わせてズーカー十進法を使用した。リボザイム標的配列は、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼmRNA配列内で識別された。各潜在的リボザイム配列のための一つのリボザイム配列ファイルは、標的配列にもとづき、またmRNA標的配列をリボザイムの触媒鎖と結合する5個のヌクレオチドを利用して生成される。標的ファイルはRNAFOLDを用いて最低エネルギー構造に折り込まれる。非リボザイム構造を持つ配列は取り除かれる。図3は、配列識別番号16と一致するリボザイムを使用するリボザイム標的RNA二次構造の一つを図示する。小さい矢印はステムIおよびステムIIIの間でmRNAの切断部分を示す。

0040

リボザイム(配列識別番号16−21)をコード化する合成オリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼNotIおよびXbaIのオーバーハングに一致する末端を使ってアプライド・バイオシステムのオリゴヌクレオチド合成機(カリホルニア、フォスター・シティ)で作られた。二重螺旋DNAは哺乳類発現クローニングベクターpcDNA3(カリホルニア,インバイトロゲン)にクローンされる。リボザイムの発現はpcDNA3に存在するCMVプロモーターの制御下にある。転写物はリボザイム配列に対して5′および3′の両方で約140個のヌクレオチドよりなる。転写配列発現水準はノーザンブロット分析により確認される。もしもRNA水準が低ければより長期でもっと安定した転写物を生成するために追加の配列が転写物に含まれる。

0041

この構築物は電気穿孔法を用いてブタ一次内皮細胞、ブタB細胞(L−231)に形質移入される。またこのベクターは、ブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するプラスミドでCOS7細胞に同時形質移入される。COS7細胞は内在性α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼを発現しないので、導入されたブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現に関してリボザイムの存在の効果はたやすく確認される。

0042

実施例5
α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ合成を阻害するアンチセンスあるいはリボザイムRNAを生産する遺伝子導入ブタ
このアプローチは接合体段階(1細胞胚)でブタ胚の前核の一つに遺伝子導入DNAを直接顕微注射する必要がある。注射された1細胞胚は出産まで成長させるために受容体養母若雌ブタに転移される(ハマー他、1985年、ネイチャー、315巻、680ページ;パーセル他、1989年、サイエンス、244巻、1281ページ)。
このアプローチを成功裡に達成するために重要なことは、供与体ブタ、望ましくはハプロタイプ(染色体減数)特異的ミニブタの年齢と重量である。最適のものとしては、動物は8乃至10ヶ月で70乃至85ポンドのものである。これは遺伝子導入のための顕微注射にとっては最適な1細胞胚の供給を得る確率を増加させる。数多くの胚供与体からこの段階での胚コレクションの正確なタイミングを得られるように、若雌ブタは合成黄体ホルモン(レギュメート、Regumate)の調製を用いて同調される。ホルモン移植組織は胚コレクションの日の30日前に指定された若雌ブタに適用される。それから20日後、コレクションの10日前に、移植組織は除去され、過剰排卵、つまり顕微注射用の胚数増加を誘発するために追加ホルモンで処置される。移植組織除去の3日後に動物は400乃至1000IUの妊馬血清ゴナドロピンPMSG)で処置され、また750IUのヒト柔毛ゴナドトロピン(hCG)で3,4日後に処置される。これらの動物はhCGの注射の後連続2日間人工受精(AI)により繁殖される。

0043

胚コレクションは以下のように行われる。hCGの最初の注射3日後に、動物はテラゾール(3mg/1b.)、ロンパン(2mg/1b.)およびアトビン(1mg/1b.)の筋肉注射で麻酔される。正中線開腹が行われ生殖道が一次体外へ露出される。接合体のコレクションは卵管膨大部カニューレ挿入し卵管を前もって39℃にあたためた10乃至15mlの食塩加リン酸緩衝液洗浄することで行われる。コレクションに続いて供与体動物はUSDA(米国農務省ガイドラインに従って手術からの回復を用意される。胚コレクションを2回行われた動物は、USDAガイドラインに従って安楽死させられる。

0044

接合体前核への遺伝子導入DNAの注射は、以下のように行われる。接合体は10%のウシ胎児血清を補足したハムF12培地で38℃、5%の炭酸ガス雰囲気で維持される。注射に際しては接合体はHEPES塩を含む修飾BMOC−2培地に入れられ(エバート他、1984年、ジャーナル・オブ・エンブリオロジカル・エクペリメント・アンド・モルフォロジー、84巻、91−103ページ)、胚脂質を分離して前核を視覚化するため13,000×gで遠心分離される。胚は軽パラフィン油でおおわれた同じ培地を含む注射チャンバ陥凹スライド)に置かれる。顕微注射はノマルスキー光学器械とナリシゲ顕微操作装置を備えたニコンダイヤホット逆転顕微鏡で行われる。40倍率レンズパワーを用いて胚は支持ピペットを持つ場所に置かれ、導入遺伝子(2g/ml)を含むDNA溶液裏込めされるガラス針で注射される。導入遺伝子約500コピーに等しい約2ピコリットル溶液(DNA4フェムトグラム)の注射が約50%の前核膨張によってモニターされる。注射される胚は受容体動物に移転される前に恒温器に置かれる。

0045

受容体動物は供与体動物と同じように準備されるが過剰排卵はされない。注射胚の移転の前に、受容体若雌ブタは麻酔され、腹部外科的に縦方向切開で開かれ卵巣は一時露出される。数多くの黄体をともなう卵巣の同側にある卵管は洗い流され、動物が生殖的に健康であるかどうかを評価するため胚が検査される。遺伝子導入で注射された約4乃至6個の接合体は洗われた卵管に移され、腹部切開は縫合され、動物は回復のためあたたかい場所に置かれる。妊娠の状態が超音波により25日から開始してモニターされ、あるいは移植の予想される約1週か後からモニターされる。妊娠受容体は子を生むまで別の所に入れられる。

0046

新生子ブタは遺伝子導入の染色体への組込みを分析される。ゲノムDNAは穿孔あるいは血液サンプルから抽出され、最初の選別はPCRを用いて行われる。潜在的に遺伝子導入陽性の動物はサザン分析で確認される。遺伝子導入創始動物は更に発現の水準、表現型および生殖細胞系伝達を含む分析を受ける。内皮細胞を含む選択的組織のRNAからのノーザン分析は遺伝子導入発現の水準を決定するために行われる。またヒト血清からの抗体結合に関する流動細胞光度測定分析およびヒト天然抗体により認識されるブタ細胞の補体仲介細胞溶解を含む免疫検定は遺伝子導入効果を評価するために行われた。前記の基準を満足する動物は遺伝子導入系の繁殖にとっての創始者として使用される。もし創始遺伝子導入動物が必要条件の一部を満足するのに過ぎないならば、遺伝子導入子孫の繁殖および特異的交配は同型接合体動物における遺伝子導入効果を検定するために行われる。

0047

実施例6
ブタ胚幹細胞を使用する同種組換えによるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ無効突然変異体とされたブタ
ブタの同種組換えによる遺伝子標的化は、以下のものを含むいくつかの成分を必要とする。(A)陽性/陰性薬物選択マーカー遺伝子を含む突然変異遺伝子標的化構築物(タビュレビッチ他、1991年、細胞、65巻、1153ページ)
;(B)胚幹細胞培養、および、(C)培養細胞から動物を再構築する実験的発生学、がそれである。

0048

標的構築物は大抵のα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子にまたがるゲノムクローンから誘導され、ミニチャーブタの主要組織適合遺伝子複合体(MHC)ハプロタイプd/dから得られる同質遺伝子型DNAより作られるライブラリーから分離される。このゲノムクローンの断片は、胚幹(ES)細胞を標的化する遺伝子として特異的に成長した陽性/陰性選択マーカーカセットに導入され、pPNTと名付けられる(タビュレビッツ他、1991年、細胞、65巻、1153ページ)。この遺伝子標的カセットは陽性の選択マーカーとして細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(ネオ)を含み、これはG418で細胞の選択を可能にする。ネオ遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター−1(PGK−1)のようなES細胞での高水準での発現を保証する一つのプロモーターにより調節される。陰性選択は単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSv−tk)遺伝子の発現により達成することができ、これはガンシクロビル内で細胞の選択的殺害を可能にする。ネオ遺伝子と同じように、HSV−tk遺伝子はPGK−1プロモーターにより調節される。標的カセットpPNTにおいて、ネオおよびHSV−tk遺伝子の間にユニークで便利なクローニング部位があり、これは翻訳開始シグナルAUGの上流にあるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノム断片を導入するのに適切な部位(例えばイントロン2および4にあるSalI部位)である。この約2キロベースのDNA断片は、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座で切形あるいは残査ペプチドが生成されないように確実にするためにPGK−ネオカセットの転写方向に逆の配向でクローンされる。エキソン4の下流にあるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座のゲノム配列、約5キロベースがネオ遺伝子の5′末端でpPNTに導入される。pPNT−アルファGT1と名付けられたこの標的構築は線状化され、電気穿孔法によりブタES細胞に形質移入される。G418(150乃至300μg/ml)およびガンシクロビルの二重選択は、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座でES細胞のクローンを標的突然変異でまずクローンを分離することで行われる。相同性組換えクローンの確認はサザン分析で行われる。

0049

α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座の1個の対立遺伝子について標的突然変異誘発を受けるES細胞クローンは試験管内で突然変異誘発の第2ラウンドを受けるか、もしくは突然変異を含む動物の再形成に使用される。

0050

試験管内での突然変異誘発の第2ラウンドはヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼhygを陽性選択マーカー遺伝子として使用し相似性標的構築を使って行うことができる。

0051

動物の再形成に関する限りは、この方法は核移転、胚盤胞注射あるいは桑実胚凝集を含む。望ましいルートは、供与体細胞と受容体胚の間にキメラを産み出す胚盤胞注射あるいは桑実胚凝集のいずれかを含む。これら両方の方法に関して、胚は以下のように用意される。胚供与体/受容体若雌ブタは実施例5に記述されるように同調されつがわされる。人工受精あるいは天然のつがいの6日後に、若雌ブタは前記の通り外科手術の準備をされ、麻酔され、(38℃で)前もってあたためられた食塩加リン酸緩衝液(PBS)を用いて子宮を逆流洗浄される。透明帯被包された胚盤胞はHEPES緩衝培地(ホウィッテンもしくはTL−HEPES)を含む陥凹スライドに置かれ、約15乃至20個のES細胞がガラス注射針と20μmの開口部とナリシゲ顕微操作装置を使って胞胚腔に注射される。注射された胚は次いで出産までの成長のために受容体養母若雌ブタに注射され、妊娠は超音波を用いてモニターされる。子孫は、血液、皮膚および組織生検材料ならびにネオおよびhyg遺伝子に対する相補性プライマーから抽出されるDNAサンプルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてキメラ現象を分析される。キメラの生殖細胞系伝達はPCRを用いて検定され、組織サンプルの原位置ハイブリット形成は雄性および雌性生殖腺から得る。ES細胞遺伝子型を生殖細胞系に伝達する雄性および雌性キメラは同型接合体突然変異体動物を産出するために交配される。α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの発現およびヒト天然抗体のこれら動物の内皮細胞への結合に関する突然変異体動物の分析は、ブタにおける遺伝子ノックアウトアプローチの有効性を評価するために最終検査として使用される。

0052

実施例7
接合体を標的とする同質遺伝子型DNAを用いるα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの無効突然変異体に作られたブタ
同質遺伝子型DNAあるいは標的ベクターおよび染色体内の標的DNAとの間にある配列と事実上同一のDNAは、相同性組換え事象の頻度および従って遺伝子標的化効率を大きく増加させる。同質遺伝子型DNA標的ベクターを使って80%もしくはそれ以上の標的化頻度がマウス胚幹細胞で達成される。対照的に、非同質遺伝子型DNAベクターは通常約0.5%乃至5%の標的化頻度で産出し、その大きさの度合は同質遺伝子型DNAベクターより約2桁小さい。驚くべきことに、同質遺伝子型DNA構築物はランダム組込みより相同性組換えにより染色体に優勢に組込まれる。その結果遺伝子の標的突然変異誘発は、従って精密な選択実験記録にもとづかない動物および接合体をも含む生物体システム内で行うことができる。

0053

遺伝子標的化アプローチにおける同質遺伝子型DNAの重要性は、テリール他、全米科学アカデミー紀要、89巻、5128−5132ページ(1992年)
およびまたPCT/US92/07184ではじめて説明された。

0054

同質遺伝子型アプローチを実行可能にするためには、標的化ベクターは標的とされる生体のDNAと同一であるDNA源から構築されなければならない。理想的には、同質遺伝子型DNAはすべての遺伝子座が同型接合体である動物の近交系で行われる。この近交系のすべての動物は従って同質遺伝子型標的化ベクターの源泉として役立つことができる。近交系の動物が欠除する場合には、遺伝子座は数多くの異なった対立遺伝子で構成され得る。かくして同質遺伝子型ベクターは標的化遺伝子置換が試みられる個別のものから誘導され得る。更に標的化ベクターは1個の対立遺伝子のみに対し同質遺伝子型である。

0055

ハプロタイプ特異的ミニチャーブタの場合、同質遺伝子型遺伝子標的化ベクターは容易にMHC遺伝子座から誘導される。その理由はゲノム領域がいくつかの世代にわたり同型接合子で維持されるからである。α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に対するcDNA配列が決定されており(実施例1)、またゲノムクローンも最近生成されたので、今や遺伝子を染色体上に位置づける(遺伝地図化mapする)ことが可能になり、それによりα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座遺伝子内で多形現象を避けることができる。

0056

多形現象の遺伝地図化は以下の通り行われる。密接に関連するミニブタのグループで姉妹細胞、および/もしくは親/子孫のいずれであるかが識別される。高分子量のDNAが抽出され、PCR反応がエキソン6からエキソン7更にイントロン6にわたる配列を増幅するために設計される。ブタ遺伝子のエキソン5から9までの体制はマウス遺伝子のそれと相同であることが知られている(図4、ジョジアス、D.H.,シェイパー,N.L.キム,D.,バン・デン・アイヒンデン,D.およびジョエル・H・シェイパー,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、167巻、5534−5541ページ(1992年))。図4でマウスα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子エキソンのゲノム体制は1−9で標識され、立体ボックス型で示される。イントロン配列は細い線で表される。エキソン6の5′オリゴは下記の配列:5′−TCC GAG CTGGTTTAA CAA TGGGTA−3′ (配列識別番号25)を含み、またエキソン7にある3′オリゴは下記の配列:5′−TCT TCGTGG TAA CTG TGA GTC CTA−3′ (配列識別番号26)を含む。PCR断片は約1および2キロベース長である。PCR−RFLPを検定するために4個カッターを使用する制限消化がしばしば切断されることを予期して行われる。このような4個カッターは、BstU I(CGCG)、Hae III(GGCC)、Hha I(GCGC)、Sau3A(GATC)、Rsa I(GTAC)およびTaq I(TCGA)を含み、これらは工業的にニューイングランド・バイオラブ(マサチューセッツ、ビバリー)から利用可能である。親動物および子孫、同じく姉妹細胞の間からも得られる制限断片のパターンにもとづき、動物のグループに存在する異なった対立遺伝子数を決定することは可能である。PCR−RFLPが異なった動物にある異なった対立遺伝子の間で明らかな配列多形現象を産み出さない場合には、T7あるいはT4リゾベースを用いるDNA配列化あるいは酵素誤対合切断(EMC)を含む代替的方法を採用することができる。追加の動物が次いでα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座で特異的対立遺伝子を識別するために同じような方法で分析される。

0057

一度いくつかの対立遺伝子が識別されると、標的化構築は接合体注射のために選択されたミニブタ系にもっとも豊富に存在するこれら対立遺伝子に対して準備される。

0058

遺伝子標的化構築は以下のように生成される。一つのゲノムライブラリーは、ラムダFIX II、ラムダEMBL4あるいはラムダダッシュII(ストラータジェン・クローニング・システム)を含むラムダ置換ベクター内で作られる。
このライブラリーは次いで約50,000プラーク/15cmプレートの濃度にプレートされ、ブタα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン9に特異的なプローブで選別される。プローブはPCRを使って生成され、これは標準実験記録:35サイクル、60℃で20秒のアニール、72℃で40秒の拡張、および94℃で20秒の変性を使用して行われる。挿入断片の大きさが約15キロベースの陽性クローンは次いでpSP72を含むプラスミドベクターサブクローンされ、挿入ベクターあるいは置換ベクターのいずれかとして標的化のため操作される。

0059

挿入ベクターはヘイスティおよびブラッドレーが説明したように設計される(哺乳類細胞に対する遺伝子標的化、遺伝子標的化:現実的アプローチ、アレクサンドラ・L・ジョイナー編、IRLプレス、1993年)。挿入ベクターは相同性組換えにより天然遺伝子座への組込みを生じるためには1回だけの交差(乗換え)を必要とする。ベクターの2個の末端が組換え遺伝子的であることで知られる二本鎖切断は染色体の隣接配列に位置している。望ましくは挿入ベクターの組込み部位はα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン8の開始部分にある。従ってイントロン8の全長は最小数の誤対合を選ぶ相同性および同一の配列として含まれる。酵素の触媒領域をコード化するエキソン9はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、あるいはIRESβゼオと名付けられたその誘導体などの選択マーカーにより置換される。イントロン7からの下流、つまり選択マーカーの3′配列にはエキソン8およびイントロン8が含まれ、ベクターの開始に隣接する部位で終結する。この構築物の標的化頻度は30乃至50%の範囲にある。これらすべての構築物は標準のクローニング手順で作られる。

0060

置換ベクターについては更にヘイスティおよびブラッドレーの前掲同書に広範に説明されている。挿入ベクターよりも概念的により直接的に、ここで発せられる置換ベクターはα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座でのゲノム配列のある伸長を持つ基本的には共直線性断片である。望ましくは、同質遺伝子型置換ベクターが構築されるDNA配列は約6乃至10キロベースの連続性DNAを含む。このDNAはミニブタから得たα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座のある対立遺伝子のエキソン4の開始およびイントロン8の末端の間の領域に一致する。触媒領域をコード化するエキソン9は選択マーカー遺伝子、例えばネオ遺伝子、あるいはその機能的類似体で置換される。置換ベクターの3′末端は、約1キロベースの同質遺伝子型DNAを含むエキソン9にある3′未翻訳領域を含む。選択マーカーのどちらかの側の一つにある2個の交差は突然変異体標的化ベクターを組込ませ野生型遺伝子を置換する。

0061

特にミニブタの接合体段階(1細胞胚)においてブタ胚の前核の一つに同質遺伝子型遺伝子導入DNAを顕微注射することについては、前に説明された実験記録の修飾によってこれを達成することができる(ハマー他、1985年、ネイチャー、315巻、680ページ;パーセル他、1989年、サイエンス、244巻、1281ページ)。最適には、ミニブタは8乃至10ケ月のもので重さ70乃至85ポンドである。これは1細胞胚供与体の適切な供給を得る確率を拡大させる。若雌ブタは合成黄体ホルモン(レギュメート)の調製を用いて同調される。ホルモンの移植は胚コレクションの日の30日前に指定若雌ブタに適用される。その20日後、つまりコレクションの10日前に移植片は除去され、動物は過剰排卵を誘発するために、つまり顕微注射のための胚の数を増やすために追加のホルモンで処理される。移植片除去の3日後に動物は400乃至1000IUの妊馬血清ゴナドトロピン(PMSG)で、またその3,4日後に750IUのヒト繊手性ゴナドトロピン(hCG)で処理される。これらの動物はhCG注射の後2日連続して人工受精で繁殖される。

0062

胚のコレクションは次のように行われる。hCG注射の3日後、動物はテラゾール(3mg/1b)、ロンパン(2mg/1b)およびアトロピン(1mg/1b)の筋肉内注射で麻酔される。正中線開腹が行われ、生殖道は一時対外へ露出される。接合体のコレクションは卵管の膨大部にカニューレ挿入し卵管を前もって39℃にあたためた10乃至15mlの食塩加リン酸緩衝液で洗浄することで行われる。コレクションに続いて供与体動物はUSDAガイドラインに従って手術からの回復を用意される。胚コレクションを2回行われた動物は、USDAガイドラインに従って安楽死させられる。

0063

接合体前核への遺伝子導入DNAの注射は以下のように行われる。接合体は10%のウシ胎児血清を補足したハムF12培地で38℃、5%の炭酸ガス雰囲気で維持される。注射に際して接合体はBMOC培地に入れられ、胚脂質を分離して前核を視覚化するため13,000gで遠心チャンバ(陥凹スライド)に置かれる。顕微注射はノマルスキー光学器械とナリシゲ顕微操作装置を備えたニコンダイヤホット逆転顕微鏡で行われる。40倍率のレンズパワーを用いて胚は支持ピペットを持つ場所に置かれ、導入遺伝子(2mg/ml)を含むDNA溶液を裏込めされるガラス針で注射される。導入遺伝子約500コピーに等しい約2ピコリットルの溶液(DNA4フェムトグラム)の注射が約50%の前核膨張によってモニターされる。注射される胚は受容体動物に移転される前に恒温器に置かれる。

0064

受容体動物は供与体動物と同じように準備されるが過剰排卵はされない。注射胚の移転の前に、受容体若雌ブタは麻酔され、腹部は外科的に縦方向切開で開かれ卵巣は一時露出される。数多くの黄体をともなう卵巣の同側にある卵管は洗い流され、動物が生殖的に健康であるかどうかを評価するため検査される。遺伝子導入で注射された約4乃至6個の接合体は洗われた卵管に移され、腹部切開は縫合され、動物は回復のためあたたかい場所に置かれる。妊娠の状態が超音波により25日から開始してモニターされ、あるいは移植の予想される約1週間後からモニターされる。妊娠受容体は子を生むまで別の所に入れられる。

0065

新生子ブタは遺伝子導入の染色体への組込みを分析される。ゲノムDNAは耳穿孔あるいは血液サンプルから抽出され、最初の選別はPCRを用いて行われる。潜在的に遺伝子導入陽性の動物はサザン分析で確認される。遺伝子導入創始動物はサザン分析を用いて遺伝子導入組込みの遺伝子座に関し、更に分析を受ける。天然α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に対して遺伝子導入標的化する、すなわちその遺伝子に対して異型接合体突然変異体であるこれらの動物は成長し繁殖して追加の異型接合体突然変異体創始動物となる。メンデル遺伝学を応用することで、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼに対し同型接合体突然変異体である動物を繁殖させることが可能になる。レクチン14およびヒト前形成天然抗体を使った機能的検定は、次いでブタ細胞に関するGalα(1,3)Galエピトープの発現を考察し、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を確認するために使用される。

図面の簡単な説明

0066

371個のアミノ酸タンパク質をコード化する1113塩基対の読み取り枠を持つα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの完全cDNA配列を図示する。 371個のアミノ酸タンパク質をコード化する1113塩基対の読み取り枠を持つα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼの完全cDNA配列を図示する。ブタ、ウシ、およびマウスα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNA遺伝子によりコード化されたタンパク質配列を比較する。 ブタ、ウシ、およびマウスα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼcDNA遺伝子によりコード化されたタンパク質配列を比較する。 α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼを標的化する交流ハンマーヘッドリボザイムの二次構造を図示する。 マウスα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼのゲノム体制を図示する。エキソンは1−9として標識され、固形ボックス型で示される。イントロン配列は細い線で表示される。

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