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技術 脊椎動物の体組織においてエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘発するためのメガヌクレアーゼの使用およびその応用

出願人 セレクティス
発明者 アーノルド,シルヴァインブルノー,シルヴィアカバニオルス,ジャン-ピエールシャメス,パトリックシュリカ,アンドレデュシャトー,フィリップエピナト,ジャン-シャルルグブル,アグネスラクロワ,エマニュエルパケス,フレデリクペレズ-ミショー,クリストフスミス,ジュリアンスルダイヴ,デヴィッド
出願日 2004年1月28日 (16年9ヶ月経過) 出願番号 2006-502491
公開日 2006年8月10日 (14年3ヶ月経過) 公開番号 2006-518372
状態 拒絶査定
技術分野 微生物、その培養処理 化合物または医薬の治療活性 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 酵素・酵素の調製 医薬品製剤 突然変異または遺伝子工学 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 緊張筋 さわら カットエンド 介在部 維持システム 生理信号 ホーリ 単位濃度
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

脊椎動物体組織においてエクスビボかつイントトで相同的組換え誘導するためのメガヌクレアーゼの使用およびゲノム工学および遺伝子治療についてのその適用。

概要

背景

相同遺伝子ターゲティングは、部位特異的で正確なゲノム外科治療(surgery)を達成するため過去に広く利用されていた(ThomasおよびCapecchi, 1986, Nature, 324, 34〜8; Thomasら, 1986, Cell, 44, 419〜28; ThomasおよびCapecchi, 1986, Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 51 Pt 2, 1101〜13; Doetschmanら,1988, PNAS, 85, 8583〜7)。相同的遺伝子ターゲティングは、相同的組換え機構すなわち細胞内因性維持システムの一つに依存している。このシステム進化を通じてよく保護されているので、遺伝子ターゲティングは、細菌、酵母線維真菌哺乳動物昆虫および植物といった異なる生物で利用できる。

一つの直接的な適用は、遺伝子の周囲の調節配列改変することによる遺伝子の発現の調節である(欧州特許第419621号;米国特許第6,528,313号; 同6,528,314号; 同5,272,071号; 同5,641,670号)。突然変異した遺伝子の相同的組換えによる修正はもう一つの適用である(Fischerら, 2002, Isr Med Assoc J, 4, 51〜4)。有害な突然変異は、ゲノムのいずれの別の位置に野生型遺伝子を導入することによって相補できることが多い。しかしこのアプローチ(ランダムトランスジェネシス(transgenesis))には重大な三つの欠点がある。第一に、突然変異した遺伝子が依然として存在する。特定の突然変異は、野生型遺伝子によって相補されないかまたは野生型遺伝子を少なくとも阻害することがある機能の獲得をもたらす。第二に、遺伝子の発現が、周囲の配列の非常に長い範囲に依存することが多い。高等真核生物内で、これら配列は、数百kbにわたって延びることができ、そして細胞周期発達の間または生理信号に対する応答における遺伝子の発現の正確な同調に必要である。トランスジェニック配列は、ほとんどの場合、数kbであるけれども、完全に野生型表現型回復できる方法がない。しかしこの問題は、非常に大きい配列(BAC)で形質転換することによって改善できるが、さらなる技術が必要である。第三に、ランダムトランスジェネシスは、ゲノムのどこにでも挿入を行い、有害な作用の起こる確率がゼロではない遺伝子への挿入は、その遺伝子またはその適正な調節を破壊する。このような有害作用は、SCIDの患者に対する遺伝子治療試験で最近充分に例証されており(Fischerら、上記)、恐らくウイルスが有する導入遺伝子の有害な挿入の結果として白血病症候群の症状になった。

ランダムトランスジェネシスとは対照的に、相同的組換えは、染色体遺伝子座の正確な改変を許容する。これは、ターゲティングベクターによって、遺伝子の欠失、遺伝子の挿入または遺伝子の置換となり得る。さらに、コーディング配列と調節配列の改変を含むわずかな変更を、特定の遺伝子座に導入できる(欧州特許第419621号; 米国特許第6,528,313号; 同6,528,314号; 同5,272,071号; 同5,641,670号; 同6,063,630号)。

これら特定の利点によって、相同的遺伝子ターゲティングはゲノム工学の普遍的な手段でかつ遺伝子治療の唯一の安全な方法になるであろう。しかし相同的組換えを使用することは、ほとんどの細胞でその効率が乏しいので制限される。相同的遺伝子ターゲティングは、酵母:サッカロミセスセレビシエ(Sacchromyces Cerevisiae) (PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、コケフィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens) (SchaeferおよびZryd, 1997, Plant J, 11, 1195〜206)、特定のエシェリキアコリ(Escherichia coli)変異株(Murphy, 1998, J. Bacteriol, 180, 2063〜71; Zhangら, 1998, Nat Genet, 20, 123〜8)、およびDT40などのの細胞系(BuersteddeおよびTakeda, 1991, Cell, 67, 179〜88)では極めて効率的であるが、その効率はほとんどの細胞と生物ではきわめて低いままである。例えば、哺乳類培養細胞では、このような組換え事象は、関連する修正(correcting)DNAまたはターゲティングDNAを取り込んだ一万個の細胞のうち一個の細胞にしか通常起こらない。

その結果、相同的遺伝子ターゲティングの効率を改良するため、多くの方法が用いられている。多数の例として、キメララスティー(chimeraplasty) (Yoonら, 1996, PNAS, 93, 2071〜6)、小断片相同的組換え(Gonczら, 2002, Gene Ther, 9, 691〜4)およびトリプレクスフォーミングオリゴヌクレオチド(Triplex Forming Oligonucleotides) (Gorman and Glazer, 2001, Curr Mol Med, 1, 391-9)がある。しかし、相同的遺伝子ターゲティングを改良する最も強力で効率的な方法は、依然として対象の遺伝子座にDNA二本鎖破壊(DNA double-strand break;DSB)を導入する方法である(米国特許第5,474,896号; 同5,792,632号; 同5,866,361号; 同5,948,678号; 同5,948,678号, 同5,962,327号; 同6,395,959号; 同6,238,924号; 同5,830,729号)。この方法は、哺乳類の細胞におけるターゲティングの効率を幾桁も改善し(Donohoら, 1998, Mol Cell Biol, 18, 4070〜8; Rouetら, 1994, Mol Cell Biol, 14, 8096〜106; Choulikaら, 1995, Mol Cell Biol, 15, 1968〜73; Cohen-Tannoudjiら, 1998, Mol Cell Biol, 18, 1444〜8; PorteusおよびBaltimore, 2003, Science, 300, 763; Porteusら, 2003, Mol Cell Biol, 23, 3558〜65; Millerら, 2003, Mol Cell Biol, 23, 3550〜7)、かつ植物(Puchtaら, 1993, Nucleic AcidsRes, 21, 5034〜40)およびショウジョウバエ(Bibikovaら, 2003, Science, 300, 764)における遺伝子ターゲティングを許容する。

したがって、前記二本鎖の破壊を導入すると、これに伴ってその切断部位のまわりの領域に相同なDNAのターゲティングセグメントが導入され、その結果、その遺伝子座に、ターゲティング配列が効率的に導入される(遺伝子損傷修復または特定の方法での染色体のDNAの変更のいずれかのため)。あるいは、対象の部位に二本鎖の破壊を誘発して、その遺伝子の他のコピー由来の相同の染色体DNA配列が二本鎖破壊の誘発された配列に配列を提供する遺伝子交換事象によって、遺伝子損傷が修正される。この後者のストラテジは、欠損遺伝子の1コピーが疾患の表現型を生ずる(例えば優性突然変異の場合に起こる)かまたは突然変異が遺伝子の両対立遺伝子であるが異なる位置に起こる(複合異型接合突然変異の場合のような)遺伝子疾患を修正する(WO 96/14408号; WO 00/46386号; 米国特許第5,830,729号; Choulikaら, 上記; Donohoら, 上記; Rouet ら, 上記)。

しかし、部位特異的DSBの送達には別の課題があることが分かった。この送達を行うには大きい配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼの使用が必要である。12塩基対より大きい配列を認識するこのような極めて稀な切断エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼ呼称されている。対象のゲノム内で一回だけ切断を行い、その切断部分が対象の遺伝子座に限定されているエンドヌクレアーゼを使用することが理想的で望ましい。

自然状態では、このようなエンドヌクレアーゼは、特にホーミングヌクレアーゼ(ChevalierおよびStoddard, 2001, N.A.R., 29, 3757〜74)により代表される。ホーミングヌクレアーゼは真菌類藻類真性細菌類および古細菌類に見られ、可動性遺伝因子にコードされていることが多い。それらの切断活性が、これら可動性因子拡散を相同的組み換えによって開始する。HO (Haber, 1998, Annu Rev Genet, 32, 561〜99; Haber, 1995, Bioessays, 17, 609〜20)、I-Sce I (JacquierおよびDujon, 1985, Cell, 41, 383〜94; FairheadおよびDujon, 1993, Mol Gen Genet, 240, 170〜8; Colleauxおよび, 1988, PNAS, 85, 6022〜6; Perrinら, 1993, Embo J, 12, 2939〜47; Plessisら, 1992, Genetics, 130, 451〜60)およびI-Tev Iエンドヌクレアーゼ(Bell-Pedersenら, 1989, Gene, 82, 119〜26; Bell-Pedersenら, 1990, Nucleic AcidsRes, 18, 3763〜70; Muellerら, 1996, Genes Dev, 10, 2158〜66)の生物学が、かようなDSB誘発組換え事象の多くの典型である。

HOとI-Sce Iは、相同的遺伝子ターゲティングを、酵母(Haber, 1995, 上記; Fairhead およびDujon, 1993, 上記; Plessisら, 1992, 上記; 米国特許第5,792,632号および同6,238,924号)、哺乳類の培養細胞(Donohoら; Rouetら; Choulikaら; Cohen-Tannoudjiら, 上記; 特許第5,792,632号; 同5,830,729号および6,238,924号)および植物(Puchta ら, 1996, PNAS, 93, 5055〜60; 米国特許第5,792,632号および同6,238,924号)に誘発するために使用されている。またメガヌクレアーゼは、細菌(Posfaiら, 1999, N.A.R., 27, 4409〜15)、酵母(PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、植物(SiebertおよびPuchta, 2002, Plant Cell, 14, 1121〜31; Chiurazziら, 1996, Plant Cell, 8, 2057〜66; Puchta, 1999, Genetics, 152, 1173〜81)、昆虫(Rongら, 2002, Genes Dev, 16, 1568〜81)および哺乳類の培養細胞(LinおよびWaldman, 2001, Genetics, 158,1665〜74; Liangら, 1998, PNAS, 95, 5172〜7)においてDBSが誘発する相同的組換えに基づいた各種の染色体内または染色体間再配列トリガーするのに使用されている。

グループIIのイントロンタンパク質もメガヌクレアーゼとして使用できる。これらタンパク質の生物学は、グループIのイントロンとインテインがコードするホーミングエンドヌクレアーゼの生物学より遥かに複雑である(ChevalierおよびStoddard, 上記)。このタンパク質はイントロンのスプライシングにかかわって、スプライスされたRNA分子とともにリボ核酸粒子を形成する。この複合体は、(標的遺伝子からのDNA鎖中のRNAイントロンの)逆スプライシング、(新規遺伝子中の第二DNA鎖の)ニッキングおよび逆転写酵素(挿入されたRNAをDNA鎖にコピーする)を含む各種の活性を示す。イントロンの標的遺伝子への最終的な挿入は、すべてのこれら活性で決まる。これらタンパク質は、逆転写酵素の活性が突然変異すると、相同的組換えをDSB媒介物(intermediate)で誘発するようである(Karbergら, 2001, Nat. Biotechnol, 19, 1162〜7)。

天然のメガヌクレアーゼを使って、二本鎖破壊による相同的組換えを誘発するためのこのゲノム工学(genome engineering)の方法は、あいにく、組換え事象が要求される位置に前記天然メガヌクレアーゼの認識・切断部位を導入することによって制限される。

今日まで、新しいメガヌクレアーゼ(人工または人造のメガヌクレアーゼ)を作製する第一の方法では、いくつかのキメラ制限酵素が、DNA結合ドメイン(すなわちジンクフィンガードメイン)と触媒ドメイン(天然制限酵素Fok I由来の非特異的DNA切断ドメイン)とのハイブリッドによって製造されている(Smithら, 2000, N.A.R, 28, 3361〜9; Smithら, 1999, Nucleic AcidsRes., 27, 274〜281; Kimら, 1996, PNAS, 93, 1156〜60; KimおよびChandrasegaran, 1994, PNAS, 91, 883〜7; WO 95/09233号; WO 94/18313号; 米国特許第5,436,150号)。得られるいわゆるジンクフィンガーヌクレアーゼを使って、ツメガエル(Xenopus)の卵母細胞での縦列反復組換え(Bibikovaら, 2001, Mol Cell Biol, 21, 289〜97)、ならびに哺乳類の培養細胞系(PorteusおよびBaltimore, 上記)とショウジョウバエ(Bibikovaら, 上記)での相同的遺伝子ターゲティングが誘発されている。

もう一つのアプローチは、II型の制限ヌクレアーゼのようにDNA結合活性触媒活性とを単独の構造単位内に包埋することからなる。しかし認識配列の長さを長くしようとするかまたはこれら酵素特異性を変えようとすると、触媒活性が失われるか、または酵素の構造、基質認識および触媒作用の緊密な相互依存による特異性が全面的に低下する(Lanioら, 2000, Protein Eng., 13, 275〜281)。

ホーミングヌクレアーゼに基づいて、Chevalierら(2002, Molecular Cell, 10, 895〜905)はホーミングヌクレアーゼI-Dmo IとI-Cre Iのドメインを融合することによって、高度に特異的な人工エンドヌクレアーゼを作製した。得られた酵素は、長いキメラDNA標的部位に結合してそれをその天然の親と等しい速度で正確に切断する。しかし、この実験は、新しい特異性を有するあるエンドヌクレアーゼをもたらすが、いずれの望ましいポリヌクレオチド配列を認識し切断するエンドヌクレアーゼを見つけるのに利用できない。

核酸化学化合物融合体はもう一つのクラスの人工のメガヌクレアーゼであり、DNAの結合性と特異性はオリゴヌクレオチドに依存し、切断はそのオリゴヌクレオチドに連結された化学化合物に依存する。該化学化合物は、内因性切断活性を持っているかまたはトポイソメラーゼ類と複合体を形成するとき切断することができる(Arimondoら, 2001, Angew Chem Int Ed Engl, 40, 3045〜3048; ArimondoおよびHelene, 2001, Curr Med Chem Anti-Canc Agents, 1, 219〜35)。

したがって、メガヌクレアーゼ誘発組換えは、ゲノムに標的される改変を導入するのに極めて強力な手段になるであろう。さらに、組換え事象が必要な位置でDNAを切断できる、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ由来のまたは天然のホーミングエンドヌクレアーゼ由来の新しいメガヌクレアーゼを開発すると、意のままに妥当な効率でいずれの所定の遺伝子座にターゲティングを行うことができる。

それにもかかわらず、この技術を動物に使うことは、ショウジョウバエの場合(Bibikovaら、2003, 上記) (この場合この技術を使って生きている動物内の生殖細胞系と体組織に組換えを誘発できた)を除いて、これまで、この技術はほとんどの場合、培養細胞内におけるインビトロまたはエクスビボでの適用に制限されていることが、従来技術の上記分析結果から明らかである。

生物全体において体組織に組換えを誘発するためにこの技術を用い得ることは以下に述べるように極めて有利である。
−この技術は、動物モデルにおける組織特異的なゲノム工学または遺伝子組換え生物内の外来配列の除去(これら外来配列による形質がもはや有用でなくなったとき)に使用できる。二つの縦列反復の間のDSBが非常に高レベルの相同的組換えを誘発して一つの繰返し部分をすべての介在部分とともに欠失させるが(PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、これは適切な設計で導入遺伝子を除くのに容易に利用できる。

−もう一つの重要な応用は、メガヌクレアーゼが誘発する組換えの遺伝子治療における使用である。多くの場合、エクスビボのアプローチを用い得る。すなわち前駆幹細胞を患者から取り出し、エクスビボで治して欠陥組織移植して戻す。これまでエクスビボの方法はほとんどの場合、SCIDなどの症候群の血球に対して使われてきた(相同的組換えの代わりにランダム挿入が利用されたが) (Fischerら, 上記)。幹細胞のこの操作は、他の組織に対する魅力的な方法になる。しかし、イントトメガヌクレアーゼ誘発組換えを使うと、前記エクスビボのステップバイパスして、治療できる組織の範囲を拡大できるだろう。

しかし、この方法が簡単でない以下の二つの重要な理由がある。
−第一に、この方法は、メガヌクレアーゼを適当な組織内に送達する必要がある。

−第二に、生体内の細胞は、培養細胞または生殖細胞と同じ挙動を必ずしもしない。培養細胞および初期の(およびときには後期の)生殖細胞は分裂する細胞であり、G1、S、G2およびM期を通過する。対照的に、成熟動物の大部分の細胞は分化された細胞でありG0期に固定される。多くの試験結果が、相同的組換えが細胞周期のすべての期で同じ効率でないことを示しおよび/または示唆している(Takataら, 1998, Embo J, 17, 5497〜508; KadykおよびHartwell, 1992, Genetics, 132, 387〜402; Gasiorら, 2001, PNAS, 98, 8411〜8; Essersら,1997,Cell, 89,195〜204)。一般に、異なる組織は相同的遺伝子変換のための別個の進歩(proficiency)を有する。したがって、組換えの進歩がほとんど分かっていない特定の細胞型に依存する相同的組換えによる遺伝子ターゲティングおよびメガヌクレアーゼ誘発ゲノム工学が、生物全体でまたはエクスビボアプローチに使用できるかどうか明らかでない。

驚くべきことには、適当なターゲティング構築物とメガヌクレアーゼ発現ベクターを使うことによって、本発明者らは、脊椎動物の体組織内にエクスビボかつイントトで目的とする相同的組換えを実際に誘発できることを示した。

したがって、メガヌクレアーゼは、特定の配列を修復し、特定の配列を改変するため、対象の内因性遺伝子減弱させるかまたは活性化させるため、対象の内因性遺伝子もしくはその一部分を不活性化するかもしくは欠失させるため、対象の部位に突然変異を導入するため、または外因性遺伝子もしくはその一部分を脊椎動物の体組織に導入するために使用できる。

それゆえ、これらの結果は、実験の目的のための哺乳類体組織内の効率的な部位特異的ゲノム操作の基礎確立し、かつ遺伝子ターゲティングによる突然変異の治癒的な修正の可能性を高める。

概要

脊椎動物の体組織においてエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘導するためのメガヌクレアーゼの使用およびゲノム工学および遺伝子治療についてのその適用。

目的

したがって、本発明の目的は、メガヌクレアーゼを使って、脊椎動物の体組織内にエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘発することである。

効果

実績

技術文献被引用数
9件
牽制数
8件

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請求項1

少なくとも1つのメガヌクレアーゼの、遺伝子疾患の予防、改善または治療を必要とする脊椎動物において該遺伝子疾患を予防、改善または治療するための、該脊椎動物にいずれの手段により投与される医薬品を製造するための使用。

請求項2

少なくとも1つのメガヌクレアーゼの、DNA媒介物提示する感染性因子により引き起こされる疾患の予防、改善または治療を必要とする脊椎動物において該疾患を予防、改善または治療するための、該脊椎動物にいずれの手段により投与される医薬品を製造するための使用。

請求項3

少なくとも1つのメガヌクレアーゼの、該メガヌクレアーゼをヒト以外の脊椎動物の体内に導入することによる治療以外の目的のためのヒト以外の脊椎動物の体組織ゲノム工学のための使用。

請求項4

前記メガヌクレアーゼが、ポリペプチドまたはプロモーター、例えば組織特異的プロモーターおよび/または誘導性プロモーターを含む適切な転写調節要素の制御下に該ポリペプチドをエンコードする配列を含むポリヌクレオチド構築物のいずれかとして用いることができることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の使用。

請求項5

前記メガヌクレアーゼが、単独でまたは適切な賦形剤もしくは担体の少なくともいずれかおよび/またはターゲティングDNAとともに投与されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載の使用。

請求項6

前記適切な賦形剤が、リポソームポリエチレンイミンおよび膜転位ペプチドからなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の使用。

請求項7

前記DNAのターゲティング断片が、標的遺伝子座相同性共有する配列で挟まれる対象の部位を改変する配列を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1つに記載の使用。

請求項8

記相同な配列が、前記標的遺伝子座と少なくとも50 bp、好ましくは100 bpより多く、より好ましくは200 bpより多くを有することを特徴とする請求項7に記載の使用。

請求項9

対象の部位を改変する前記配列が、遺伝子損傷修復するための遺伝子の正しい配列であることを特徴とする請求項7または8に記載の使用。

請求項10

前記メガヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼジンクフィンガーヌクレアーゼおよびいずれの当初のメガヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼ変異型であって、当初のメガヌクレアーゼの部位とは異なる認識・切断部位を示す変異型からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1つに記載の使用。

請求項11

前記メガヌクレアーゼをエンコードする前記配列および/またはDNAの前記ターゲティング断片がベクターに挿入されていることを特徴とする請求項1〜6または10のいずれか1つに記載の使用。

請求項12

前記メガヌクレアーゼが、実質的に非免疫原性であることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の使用。

請求項13

前記メガヌクレアーゼが、単一遺伝子劣性疾患の予防、改善または治療のために対象の部位を修復可能な配列を含む請求項7で規定したDNAのターゲティング断片とともに用いられることを特徴とする請求項1および4〜12のいずれか1つに記載の使用。

請求項14

前記メガヌクレアーゼが、トリヌクレオチド反復疾患の予防、改善または治療のために単独であるいは少なくとも1つの適切な賦形剤および/または担体とともに用いられることを特徴とする請求項1および4〜12のいずれか1つに記載の使用。

請求項15

前記メガヌクレアーゼが、優性または複合異型接合突然変異を原因とする遺伝子疾患を予防、改善または治療するために単独であるいは少なくとも1つの適切な賦形剤および/または担体とともに用いられることを特徴とする請求項1および4〜12のいずれか1つに記載の使用。

請求項16

前記感染性因子がウイルスであることを特徴とする請求項2および7〜12のいずれか1つに記載の使用。

請求項17

前記ウイルスが、HIVHBVHTLV、HPVおよびHSVからなる群より選択されることを特徴とする請求項16に記載の使用。

請求項18

前記メガヌクレアーゼをエンコードする前記配列およびDNAの前記ターゲティング断片が同じベクターに挿入されていることを特徴とする請求項1〜17のいずれか1つに記載の使用。

技術分野

0001

本発明は、脊椎動物体組織においてエクスビボ(ex vivo)かつイントト(in toto)で相同的組換えを誘発するためのメガヌクレアーゼの使用およびゲノム工学および遺伝子治療へのその適用に関する。

背景技術

0002

相同遺伝子ターゲティングは、部位特異的で正確なゲノム外科治療(surgery)を達成するため過去に広く利用されていた(ThomasおよびCapecchi, 1986, Nature, 324, 34〜8; Thomasら, 1986, Cell, 44, 419〜28; ThomasおよびCapecchi, 1986, Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 51 Pt 2, 1101〜13; Doetschmanら,1988, PNAS, 85, 8583〜7)。相同的遺伝子ターゲティングは、相同的組換え機構すなわち細胞内因性維持システムの一つに依存している。このシステム進化を通じてよく保護されているので、遺伝子ターゲティングは、細菌、酵母線維真菌哺乳動物昆虫および植物といった異なる生物で利用できる。

0003

一つの直接的な適用は、遺伝子の周囲の調節配列改変することによる遺伝子の発現の調節である(欧州特許第419621号;米国特許第6,528,313号; 同6,528,314号; 同5,272,071号; 同5,641,670号)。突然変異した遺伝子の相同的組換えによる修正はもう一つの適用である(Fischerら, 2002, Isr Med Assoc J, 4, 51〜4)。有害な突然変異は、ゲノムのいずれの別の位置に野生型遺伝子を導入することによって相補できることが多い。しかしこのアプローチ(ランダムトランスジェネシス(transgenesis))には重大な三つの欠点がある。第一に、突然変異した遺伝子が依然として存在する。特定の突然変異は、野生型遺伝子によって相補されないかまたは野生型遺伝子を少なくとも阻害することがある機能の獲得をもたらす。第二に、遺伝子の発現が、周囲の配列の非常に長い範囲に依存することが多い。高等真核生物内で、これら配列は、数百kbにわたって延びることができ、そして細胞周期発達の間または生理信号に対する応答における遺伝子の発現の正確な同調に必要である。トランスジェニック配列は、ほとんどの場合、数kbであるけれども、完全に野生型表現型回復できる方法がない。しかしこの問題は、非常に大きい配列(BAC)で形質転換することによって改善できるが、さらなる技術が必要である。第三に、ランダムトランスジェネシスは、ゲノムのどこにでも挿入を行い、有害な作用の起こる確率がゼロではない遺伝子への挿入は、その遺伝子またはその適正な調節を破壊する。このような有害作用は、SCIDの患者に対する遺伝子治療試験で最近充分に例証されており(Fischerら、上記)、恐らくウイルスが有する導入遺伝子の有害な挿入の結果として白血病症候群の症状になった。

0004

ランダムトランスジェネシスとは対照的に、相同的組換えは、染色体遺伝子座の正確な改変を許容する。これは、ターゲティングベクターによって、遺伝子の欠失、遺伝子の挿入または遺伝子の置換となり得る。さらに、コーディング配列と調節配列の改変を含むわずかな変更を、特定の遺伝子座に導入できる(欧州特許第419621号; 米国特許第6,528,313号; 同6,528,314号; 同5,272,071号; 同5,641,670号; 同6,063,630号)。

0005

これら特定の利点によって、相同的遺伝子ターゲティングはゲノム工学の普遍的な手段でかつ遺伝子治療の唯一の安全な方法になるであろう。しかし相同的組換えを使用することは、ほとんどの細胞でその効率が乏しいので制限される。相同的遺伝子ターゲティングは、酵母:サッカロミセスセレビシエ(Sacchromyces Cerevisiae) (PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、コケフィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens) (SchaeferおよびZryd, 1997, Plant J, 11, 1195〜206)、特定のエシェリキアコリ(Escherichia coli)変異株(Murphy, 1998, J. Bacteriol, 180, 2063〜71; Zhangら, 1998, Nat Genet, 20, 123〜8)、およびDT40などのの細胞系(BuersteddeおよびTakeda, 1991, Cell, 67, 179〜88)では極めて効率的であるが、その効率はほとんどの細胞と生物ではきわめて低いままである。例えば、哺乳類培養細胞では、このような組換え事象は、関連する修正(correcting)DNAまたはターゲティングDNAを取り込んだ一万個の細胞のうち一個の細胞にしか通常起こらない。

0006

その結果、相同的遺伝子ターゲティングの効率を改良するため、多くの方法が用いられている。多数の例として、キメララスティー(chimeraplasty) (Yoonら, 1996, PNAS, 93, 2071〜6)、小断片相同的組換え(Gonczら, 2002, Gene Ther, 9, 691〜4)およびトリプレクスフォーミングオリゴヌクレオチド(Triplex Forming Oligonucleotides) (Gorman and Glazer, 2001, Curr Mol Med, 1, 391-9)がある。しかし、相同的遺伝子ターゲティングを改良する最も強力で効率的な方法は、依然として対象の遺伝子座にDNA二本鎖破壊(DNA double-strand break;DSB)を導入する方法である(米国特許第5,474,896号; 同5,792,632号; 同5,866,361号; 同5,948,678号; 同5,948,678号, 同5,962,327号; 同6,395,959号; 同6,238,924号; 同5,830,729号)。この方法は、哺乳類の細胞におけるターゲティングの効率を幾桁も改善し(Donohoら, 1998, Mol Cell Biol, 18, 4070〜8; Rouetら, 1994, Mol Cell Biol, 14, 8096〜106; Choulikaら, 1995, Mol Cell Biol, 15, 1968〜73; Cohen-Tannoudjiら, 1998, Mol Cell Biol, 18, 1444〜8; PorteusおよびBaltimore, 2003, Science, 300, 763; Porteusら, 2003, Mol Cell Biol, 23, 3558〜65; Millerら, 2003, Mol Cell Biol, 23, 3550〜7)、かつ植物(Puchtaら, 1993, Nucleic AcidsRes, 21, 5034〜40)およびショウジョウバエ(Bibikovaら, 2003, Science, 300, 764)における遺伝子ターゲティングを許容する。

0007

したがって、前記二本鎖の破壊を導入すると、これに伴ってその切断部位のまわりの領域に相同なDNAのターゲティングセグメントが導入され、その結果、その遺伝子座に、ターゲティング配列が効率的に導入される(遺伝子損傷修復または特定の方法での染色体のDNAの変更のいずれかのため)。あるいは、対象の部位に二本鎖の破壊を誘発して、その遺伝子の他のコピー由来の相同の染色体DNA配列が二本鎖破壊の誘発された配列に配列を提供する遺伝子交換事象によって、遺伝子損傷が修正される。この後者のストラテジは、欠損遺伝子の1コピーが疾患の表現型を生ずる(例えば優性突然変異の場合に起こる)かまたは突然変異が遺伝子の両対立遺伝子であるが異なる位置に起こる(複合異型接合突然変異の場合のような)遺伝子疾患を修正する(WO 96/14408号; WO 00/46386号; 米国特許第5,830,729号; Choulikaら, 上記; Donohoら, 上記; Rouet ら, 上記)。

0008

しかし、部位特異的DSBの送達には別の課題があることが分かった。この送達を行うには大きい配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼの使用が必要である。12塩基対より大きい配列を認識するこのような極めて稀な切断エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼと呼称されている。対象のゲノム内で一回だけ切断を行い、その切断部分が対象の遺伝子座に限定されているエンドヌクレアーゼを使用することが理想的で望ましい。

0009

自然状態では、このようなエンドヌクレアーゼは、特にホーミングヌクレアーゼ(ChevalierおよびStoddard, 2001, N.A.R., 29, 3757〜74)により代表される。ホーミングヌクレアーゼは真菌類藻類真性細菌類および古細菌類に見られ、可動性遺伝因子にコードされていることが多い。それらの切断活性が、これら可動性因子拡散を相同的組み換えによって開始する。HO (Haber, 1998, Annu Rev Genet, 32, 561〜99; Haber, 1995, Bioessays, 17, 609〜20)、I-Sce I (JacquierおよびDujon, 1985, Cell, 41, 383〜94; FairheadおよびDujon, 1993, Mol Gen Genet, 240, 170〜8; Colleauxおよび, 1988, PNAS, 85, 6022〜6; Perrinら, 1993, Embo J, 12, 2939〜47; Plessisら, 1992, Genetics, 130, 451〜60)およびI-Tev Iエンドヌクレアーゼ(Bell-Pedersenら, 1989, Gene, 82, 119〜26; Bell-Pedersenら, 1990, Nucleic AcidsRes, 18, 3763〜70; Muellerら, 1996, Genes Dev, 10, 2158〜66)の生物学が、かようなDSB誘発組換え事象の多くの典型である。

0010

HOとI-Sce Iは、相同的遺伝子ターゲティングを、酵母(Haber, 1995, 上記; Fairhead およびDujon, 1993, 上記; Plessisら, 1992, 上記; 米国特許第5,792,632号および同6,238,924号)、哺乳類の培養細胞(Donohoら; Rouetら; Choulikaら; Cohen-Tannoudjiら, 上記; 特許第5,792,632号; 同5,830,729号および6,238,924号)および植物(Puchta ら, 1996, PNAS, 93, 5055〜60; 米国特許第5,792,632号および同6,238,924号)に誘発するために使用されている。またメガヌクレアーゼは、細菌(Posfaiら, 1999, N.A.R., 27, 4409〜15)、酵母(PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、植物(SiebertおよびPuchta, 2002, Plant Cell, 14, 1121〜31; Chiurazziら, 1996, Plant Cell, 8, 2057〜66; Puchta, 1999, Genetics, 152, 1173〜81)、昆虫(Rongら, 2002, Genes Dev, 16, 1568〜81)および哺乳類の培養細胞(LinおよびWaldman, 2001, Genetics, 158,1665〜74; Liangら, 1998, PNAS, 95, 5172〜7)においてDBSが誘発する相同的組換えに基づいた各種の染色体内または染色体間再配列トリガーするのに使用されている。

0011

グループIIのイントロンタンパク質もメガヌクレアーゼとして使用できる。これらタンパク質の生物学は、グループIのイントロンとインテインがコードするホーミングエンドヌクレアーゼの生物学より遥かに複雑である(ChevalierおよびStoddard, 上記)。このタンパク質はイントロンのスプライシングにかかわって、スプライスされたRNA分子とともにリボ核酸粒子を形成する。この複合体は、(標的遺伝子からのDNA鎖中のRNAイントロンの)逆スプライシング、(新規遺伝子中の第二DNA鎖の)ニッキングおよび逆転写酵素(挿入されたRNAをDNA鎖にコピーする)を含む各種の活性を示す。イントロンの標的遺伝子への最終的な挿入は、すべてのこれら活性で決まる。これらタンパク質は、逆転写酵素の活性が突然変異すると、相同的組換えをDSB媒介物(intermediate)で誘発するようである(Karbergら, 2001, Nat. Biotechnol, 19, 1162〜7)。

0012

天然のメガヌクレアーゼを使って、二本鎖破壊による相同的組換えを誘発するためのこのゲノム工学(genome engineering)の方法は、あいにく、組換え事象が要求される位置に前記天然メガヌクレアーゼの認識・切断部位を導入することによって制限される。

0013

今日まで、新しいメガヌクレアーゼ(人工または人造のメガヌクレアーゼ)を作製する第一の方法では、いくつかのキメラ制限酵素が、DNA結合ドメイン(すなわちジンクフィンガードメイン)と触媒ドメイン(天然制限酵素Fok I由来の非特異的DNA切断ドメイン)とのハイブリッドによって製造されている(Smithら, 2000, N.A.R, 28, 3361〜9; Smithら, 1999, Nucleic AcidsRes., 27, 274〜281; Kimら, 1996, PNAS, 93, 1156〜60; KimおよびChandrasegaran, 1994, PNAS, 91, 883〜7; WO 95/09233号; WO 94/18313号; 米国特許第5,436,150号)。得られるいわゆるジンクフィンガーヌクレアーゼを使って、ツメガエル(Xenopus)の卵母細胞での縦列反復組換え(Bibikovaら, 2001, Mol Cell Biol, 21, 289〜97)、ならびに哺乳類の培養細胞系(PorteusおよびBaltimore, 上記)とショウジョウバエ(Bibikovaら, 上記)での相同的遺伝子ターゲティングが誘発されている。

0014

もう一つのアプローチは、II型の制限ヌクレアーゼのようにDNA結合活性触媒活性とを単独の構造単位内に包埋することからなる。しかし認識配列の長さを長くしようとするかまたはこれら酵素特異性を変えようとすると、触媒活性が失われるか、または酵素の構造、基質認識および触媒作用の緊密な相互依存による特異性が全面的に低下する(Lanioら, 2000, Protein Eng., 13, 275〜281)。

0015

ホーミングヌクレアーゼに基づいて、Chevalierら(2002, Molecular Cell, 10, 895〜905)はホーミングヌクレアーゼI-Dmo IとI-Cre Iのドメインを融合することによって、高度に特異的な人工エンドヌクレアーゼを作製した。得られた酵素は、長いキメラDNA標的部位に結合してそれをその天然の親と等しい速度で正確に切断する。しかし、この実験は、新しい特異性を有するあるエンドヌクレアーゼをもたらすが、いずれの望ましいポリヌクレオチド配列を認識し切断するエンドヌクレアーゼを見つけるのに利用できない。

0016

核酸化学化合物融合体はもう一つのクラスの人工のメガヌクレアーゼであり、DNAの結合性と特異性はオリゴヌクレオチドに依存し、切断はそのオリゴヌクレオチドに連結された化学化合物に依存する。該化学化合物は、内因性切断活性を持っているかまたはトポイソメラーゼ類と複合体を形成するとき切断することができる(Arimondoら, 2001, Angew Chem Int Ed Engl, 40, 3045〜3048; ArimondoおよびHelene, 2001, Curr Med Chem Anti-Canc Agents, 1, 219〜35)。

0017

したがって、メガヌクレアーゼ誘発組換えは、ゲノムに標的される改変を導入するのに極めて強力な手段になるであろう。さらに、組換え事象が必要な位置でDNAを切断できる、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ由来のまたは天然のホーミングエンドヌクレアーゼ由来の新しいメガヌクレアーゼを開発すると、意のままに妥当な効率でいずれの所定の遺伝子座にターゲティングを行うことができる。

0018

それにもかかわらず、この技術を動物に使うことは、ショウジョウバエの場合(Bibikovaら、2003, 上記) (この場合この技術を使って生きている動物内の生殖細胞系と体組織に組換えを誘発できた)を除いて、これまで、この技術はほとんどの場合、培養細胞内におけるインビトロまたはエクスビボでの適用に制限されていることが、従来技術の上記分析結果から明らかである。

0019

生物全体において体組織に組換えを誘発するためにこの技術を用い得ることは以下に述べるように極めて有利である。
−この技術は、動物モデルにおける組織特異的なゲノム工学または遺伝子組換え生物内の外来配列の除去(これら外来配列による形質がもはや有用でなくなったとき)に使用できる。二つの縦列反復の間のDSBが非常に高レベルの相同的組換えを誘発して一つの繰返し部分をすべての介在部分とともに欠失させるが(PaquesおよびHaber, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63, 349〜404)、これは適切な設計で導入遺伝子を除くのに容易に利用できる。

0020

−もう一つの重要な応用は、メガヌクレアーゼが誘発する組換えの遺伝子治療における使用である。多くの場合、エクスビボのアプローチを用い得る。すなわち前駆幹細胞を患者から取り出し、エクスビボで治して欠陥組織移植して戻す。これまでエクスビボの方法はほとんどの場合、SCIDなどの症候群の血球に対して使われてきた(相同的組換えの代わりにランダム挿入が利用されたが) (Fischerら, 上記)。幹細胞のこの操作は、他の組織に対する魅力的な方法になる。しかし、イントトメガヌクレアーゼ誘発組換えを使うと、前記エクスビボのステップバイパスして、治療できる組織の範囲を拡大できるだろう。

0021

しかし、この方法が簡単でない以下の二つの重要な理由がある。
−第一に、この方法は、メガヌクレアーゼを適当な組織内に送達する必要がある。

0022

−第二に、生体内の細胞は、培養細胞または生殖細胞と同じ挙動を必ずしもしない。培養細胞および初期の(およびときには後期の)生殖細胞は分裂する細胞であり、G1、S、G2およびM期を通過する。対照的に、成熟動物の大部分の細胞は分化された細胞でありG0期に固定される。多くの試験結果が、相同的組換えが細胞周期のすべての期で同じ効率でないことを示しおよび/または示唆している(Takataら, 1998, Embo J, 17, 5497〜508; KadykおよびHartwell, 1992, Genetics, 132, 387〜402; Gasiorら, 2001, PNAS, 98, 8411〜8; Essersら,1997,Cell, 89,195〜204)。一般に、異なる組織は相同的遺伝子変換のための別個の進歩(proficiency)を有する。したがって、組換えの進歩がほとんど分かっていない特定の細胞型に依存する相同的組換えによる遺伝子ターゲティングおよびメガヌクレアーゼ誘発ゲノム工学が、生物全体でまたはエクスビボアプローチに使用できるかどうか明らかでない。

0023

驚くべきことには、適当なターゲティング構築物とメガヌクレアーゼ発現ベクターを使うことによって、本発明者らは、脊椎動物の体組織内にエクスビボかつイントトで目的とする相同的組換えを実際に誘発できることを示した。

0024

したがって、メガヌクレアーゼは、特定の配列を修復し、特定の配列を改変するため、対象の内因性遺伝子減弱させるかまたは活性化させるため、対象の内因性遺伝子もしくはその一部分を不活性化するかもしくは欠失させるため、対象の部位に突然変異を導入するため、または外因性遺伝子もしくはその一部分を脊椎動物の体組織に導入するために使用できる。

0025

それゆえ、これらの結果は、実験の目的のための哺乳類体組織内の効率的な部位特異的ゲノム操作の基礎確立し、かつ遺伝子ターゲティングによる突然変異の治癒的な修正の可能性を高める。

発明が解決しようとする課題

0026

したがって、本発明の目的は、メガヌクレアーゼを使って、脊椎動物の体組織内にエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘発することである。

0027

動物モデルの作製(組織特異的ゲノム外科治療(surgery):ノックインまたはノックアウト)を含む研究;農学的バイオテクノロジー(形質の付加または除去、マーカーの除去、タンパク質の作製)および治療(遺伝子治療:エクスビボとイントトでの遺伝子修復および抗ウイルス治療:エクスビボとイントトでのウイルスの除去)といった異なる分野に用途がある。

課題を解決するための手段

0028

したがって、本発明は、遺伝子疾患の予防、改善または治療を必要とする脊椎動物において該遺伝子疾患を予防、改善または治療するための、該脊椎動物にいずれの手段により投与される医薬品を製造するための少なくとも1つのメガヌクレアーゼの使用に関する。

0029

また本発明は、DNA媒介物を提示する感染性因子により引き起こされる疾患の予防、改善または治療を必要とする脊椎動物において該疾患を予防、改善または治療するための、該脊椎動物にいずれの手段により投与される医薬品を製造するための少なくとも一種のメガヌクレアーゼの使用に関する。好ましくは、該感染因子はウイルスである。

0030

本発明の別の目的は、メガヌクレアーゼをヒト以外の脊椎動物の体内に導入することにより、治療目的以外のためにヒト以外の脊椎動物の体組織のゲノム工学のための少なくとも一種のメガヌクレアーゼの使用に関する。

発明を実施するための最良の形態

0031

−定義
本願において、用語「メガヌクレアーゼ」は、少なくとも12bp、好ましくは12bp〜60bpの大きいポリヌクレオチド認識部位を有する二本鎖エンドヌクレアーゼを意味する。該メガヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼまたは高レアカットエンドヌクレアーゼ(very rare-cutting endonuclease)とも呼ばれる。このメガヌクレアーゼはモノマーまたはダイマーである。このメガヌクレアーゼには、ホーミングエンドヌクレアーゼのような天然のメガヌクレアーゼのみならず、グループIのイントロンとインテインのホーミングエンドヌクレアーゼまたはジンクフィンガータンパク質もしくはグループIIのイントロンタンパク質のような他のタンパク質または化学化合物に融合された核酸などの化合物のいずれかに由来する高い特異性を付与された人工もしくは人造のメガヌクレアーゼが含まれる。

0032

特に、人工のメガヌクレアーゼとしては、いわゆる「カスタムメイドメガヌクレアーゼ」を含み、これは、天然もしくは非天然のいずれの当初のメガヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼであり、当初のメガヌクレアーゼの部位とは異なる認識・切断部位を示す。ジンクフィンガーヌクレアーゼもカスタムメイドメガヌクレアーゼとみなすことができる。「異なる」は、カスタムメイドメガヌクレアーゼが新規の部位を、天然のメガヌクレアーゼより少なくとも10倍、好ましくは少なくとも50倍、より好ましくは少なくとも100倍の効率で切断することを意味する。「天然の」は、目的物を天然に見つけることができることを意味する。例えば、生物体内に存在し、天然の起源から単離することができかつ人間が意図的に実験室で改変していないメガヌクレアーゼは天然である。

0033

用語「イントト(in toto)」は、メガヌクレアーゼが誘発する相同的組換え事象が、脊椎動物の体内のインビボで起こることを意味し、該メガヌクレアーゼは前記脊椎動物の体内に通常の手段で導入される。

0034

用語「エクスビボ(ex vivo)」は、メガヌクレアーゼが誘発する相同的組換え事象が、脊椎動物の体から取り出した体細胞内で起こることを意味し、該メガヌクレアーゼは通常の手段で前記脊椎動物の細胞中に導入され(エクスビボ)、次にその改変された細胞は前記脊椎動物の体内に戻される。

0035

用語「体組織」は、生殖細胞株を除く、前駆細胞(幹細胞)から充分に分化した細胞までのあらゆるタイプの細胞を含む、生物の体内のあらゆる組織を意味する。

0036

同一性(identity)」とは、2つの核酸分子またはポリペプチド間の配列の同一性をいう。同一性は、比較のために整列させ得る各配列における位置を比較することにより決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められるとき、該分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性(similarity)または同一性の程度は、核酸配列共有する位置における同一または適合する(matching)ヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin、Madison、Wis.)の部分として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む種々の整列アルゴリズムおよび/またはプログラムを、2つの配列の間の同一性を計算するのに用いることができ、例えばデフォルト設定で用い得る。

0037

「相同な(homologous)」により、別の配列と配列間の相同的組換えを導くのに充分な同一性を有し、具体的には少なくとも95%、好ましくは97%、より好ましくは99%の同一性を有する配列を意図する。

0038

本明細書において用いられる「対象の部位」、「標的部位」および「特異的部位」の用語は、そこで二本鎖破壊(切断)がメガヌクレアーゼにより導入される明確な(distinct)DNAの位置、好ましくは染色体の位置をいう。

0039

本明細書において用いられるように、「個体」の用語は、哺乳動物と共に他の脊椎動物(例えば鳥類魚類および爬虫類)を含む。本明細書で用いられる「哺乳動物」および「哺乳類」の用語は、その幼体に哺乳しかつ生体の幼体を出産する(真獣類または胎盤性の哺乳動物)かまたは産卵する(後獣亜網または非胎盤性の哺乳動物)かいずれかの単孔類有袋類および胎盤性のいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳類の種の例は、ヒトおよび他の霊長類(例えばサルチンパンジー)、げっ歯類(例えばラットマウスモルモット)および反芻動物(例えばウシブタウマ)を含む。

0040

「遺伝子疾患」により、部分的または完全に、直接的または間接的に1つもしくはいくつかの遺伝子における異常を原因とするいずれの疾患を意図する。該異常は、突然変異、挿入または欠失であり得る。該突然変異は、点状の(punctual)突然変異であり得る。該異常は、遺伝子のコーディング配列またはその調節配列に影響し得る。該異常は、ゲノム配列の構造またはエンコードされたmRNAの構造もしくは安定性に影響し得る。該遺伝子疾患は、劣性または優性であり得る。

0041

ベクター」の語は、それが連結されている別の核酸を移すことができる核酸分子のことをいう。

0042

−メガヌクレアーゼ
本発明による上記使用の別の実施形態では、上記のメガヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ変異型からなる群から選択される。

0043

−ホーミングエンドヌクレアーゼは先に引用したChevalierとStoddardの文献に記載されているエンドヌクレアーゼである。

0044

−カスタムメイドメガヌクレアーゼ
−ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガードメインに基づくメガヌクレアーゼは、先に引用したSmithらの文献に記載された構造を有する。該メガヌクレアーゼは二つの融合タンパク質ヘテロダイマーである。各融合タンパク質は、リンカーを介してヌクレアーゼドメイン(Fok Iエンドヌクレアーゼまたは他のエンドクレア−ゼ由来)に連結されたZif268(または他のジンクフィンガータンパク質)に由来するDNA結合ドメインを含む。DNA標的部位は、DNA結合ドメインで結合された二つの9bpの外部領域および0-15bpの中央のスペーサー領域を含む。各モノマーにおけるDNA結合ジンクフィンガードメインは、IsalanおよびChoo (2001, MethodsMol Biol, 148,417〜29)、Isalanら(2001, Nat. Biotechnol, 19, 656〜60)ならびにIsalanおよびChoo (2001, Methods Enzymol, 340,593〜609)に記載されているように9bpの外部領域の一つに結合するように選択されている。上記諸筆者が述べているように、選択はファージディスプレイで実施できるが、Youngら(2000, PNAS, 97, 7382〜7)およびBaeら(2003, Nat Biotechnol, 21,275〜80)に記載されているように、酵母中または細菌の2ハイブリッド系でのスクリーニングなどの他の方法によっても行われる。また特異性を高めるために、Klugおよび共同研究者ら(Mooreら, 2001, PNAS, 98,1432〜6 ; Papworthら, 2003, PNAS, 100,1621〜6 ; Reynoldsら, 2003, PNAS, 100,1615〜20 ; Mooreら, 2001, PNAS, 98, 1437〜41)に記載されているように、六つのフィンガーモチーフを有するDNA結合ドメインも用い得る。しかし、ヌクレオチド切断活性がFokIドメインに依存している場合は、それぞれFokIの触媒部位(各FokI触媒ドメインは一つの鎖だけ切断する)に結合する二つのモノマーを使わねばならず、二本鎖切断を達成するのにこのような二つのドメインを用いる。

0045

−メガヌクレアーゼ変異型
カスタムメイドメガヌクレアーゼは、標的DNA配列を切断できるメガヌクレアーゼと定義する。この定義は、メガヌクレアーゼ変異型のライブラリを調製し、そして選択および/またはスクリーニングにより標的DNA配列を切断できる変異型を分離する工程を含む方法で製造されるいずれのメガヌクレアーゼ変異型を含む。多様性を導入することによって当初のメガヌクレアーゼから誘導された該カスタムメイドメガヌクレアーゼは、当初のメガヌクレアーゼの部位とは異なる認識・切断部位を示す。

0046

多様性は、メガヌクレアーゼ中に当業者に入手可能ないずれの方法により導入することができる。好ましくは、多様性は標的突然変異導入(例えばカセット突然変異導入、オリゴヌクレオチド定方向コドン突然変異導入、標的ランダム突然変異導入)、ランダム突然変異導入(例えば突然変異誘発株、Neurospora crassa系(米国特許第6,232,112号;WO01/70946号、誤りの多い(error-prone)PCR)、DNAシャッフリング定方向突然変異またはこれらの技術の組み合わせにより導入される(Current Protocols in Molecular Biology, 第8章 "Mutagenesis in cloned DNA", Ausubelら編, John Wiley and Sonsを参照)。メガヌクレアーゼ変異型は、当初のメガヌクレアーゼの標的突然変異誘発により製造されるのが好ましい。多様性は、DNA標的と接触するかまたはDNA標的と(直接的または間接的に)相互作用する残基の位置に導入される。多様性は、DNA標的と相互作用する領域に導入されるのが好ましく、相互作用するアミノ酸の位置に導入されるのがより好ましい。標的突然変異誘発により作製されたライブラリにおいて、20のアミノ酸を選択された可変性の位置に導入することができる。好ましくは、可変性の位置に存在するアミノ酸は、タンパク質-DNA相互作用に一般的に含まれることが知られているアミノ酸である。より具体的には、これらのアミノ酸は、一般的に親水性アミノ酸である。より好ましくは、可変性の位置に存在するアミノ酸は、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yを含む。任意に、可変性の位置に存在するアミノ酸は、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yからなる群より選択される。合成または修飾アミノ酸も用いることができる。

0047

定方向ライブラリ(directed library)を作製する好ましい方法のひとつは、多様性を導入しなければならない位置での縮重コドンの使用である。いくつかの種類の縮重コドンを使用することができる。縮重コドンN N K ([ATCG] [ATCG] [TG])は、20のアミノ酸と1つの停止をエンコードする32の異なるコドンを導く。縮重コドンN V K ([ATCG] [ACG] [TG])は、15のアミノ酸と1つの停止コドンをエンコードする24の異なるコドンを導く。縮重コドンV V K ([ACG] [ACG] [TG])は、12のアミノ酸(A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)と停止なしをエンコードする18の異なるコドンを導く。縮重コドンR V K ([AG] [ACG] [TG])は、9つのアミノ酸(A、D、E、G、K、N、R、S、T)をエンコードする12の異なるコドンを導く。好ましくは、12のアミノ酸(A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)をエンコードする18の異なるコドンを導く縮重コドンV V K ([ACG] [ACG] [TG])をライブラリの作製に用いる。実際に、V V K縮重コドンはいずれの停止コドンも含有せずかつ全ての親水性アミノ酸を含む。

0048

定方向ライブラリを作製した場合、DNA標的と相互作用するアミノ酸についての知見が有用である。この知見は、例えばX線結晶解析アラニンスキャンまたは架橋実験により提供することができる。DNA標的と相互作用するアミノ酸は、相同性タンパク質との配列アラインメントにより導き出すこともできる。

0049

カスタムメイドメガヌクレアーゼは、いずれの当初のメガヌクレアーゼに由来する。任意に、当初のメガヌクレアーゼは、その天然の認識・切断部位が標的DNA部位に最も近いように選択される。好ましくは、当初のメガヌクレアーゼは、上記の定義で示すようにホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼは、よく保存されたアミノ酸モチーフに基づいて4つの別々のファミリー、つまりLAGLIDADGファミリー、GIY-YIGファミリー、His-CysボックスファミリーおよびHNHファミリーに分けられる(Chevalierら, 2001, N.A.R, 29, 3757〜3774)。

0050

いくつかのホーミングエンドヌクレアーゼ、すなわちI-Dmo I、PI-Sce I、PI-Pfu I、I-Cre I、I-Ppo IおよびE-Dre IとよばれるハイブリッドホーミングエンドヌクレアーゼI-Dmo I / I-Cre Iの詳細な3次元構造既知である(Chevalierら, 2001, Nat Struct Biol, 8, 312〜316; Duanら, 1997, Cell, 89, 555〜564; Heathら, 1997, Nat Struct Biol, 4, 468〜476; Huら, 2000, J Biol Chem, 275, 2705〜2712; Ichiyanagiら, 2000, J Mol Biol, 300, 889〜901; Juricaら, 1998, Mol Cell, 2, 469〜476; Polandら, 2000, J Biol Chem, 275, 16408〜16413; Silvaら, 1999, J Mol Biol, 286, 1123〜1136 ; Chevalierら, 2002, Molecular Cell, 10, 895〜905)。

0051

LAGLIDADGファミリーは、それらの最も一般的に保存された配列モチーフ(12残基配列の1または2コピー:ジ-ドデカペプチド、LAGLIDADGモチーフともよばれる)により集められたタンパク質の最も大きいファミリーである。1つのドデカペプチドを有するホーミングエンドヌクレアーゼ(D)は、約20 kDaの分子質量で、ホモダイマーとして作用する。2コピーを有するホーミングエンドヌクレアーゼ(DD)は、各モチーフの間に70〜150の残基を有する25 kDa (230 AA)〜50 kDa (HO, 545 AA)の範囲であり、モノマーとして作用する。切断は認識部位の中で起こり、3'OH突出を有する4 ntのジグザグカットを残す。I-Ceu IおよびI-Cre Iは、1つのドデカペプチドモチーフを有するホモダイマーホーミングエンドヌクレアーゼを表す(モノドデカペプチド)。I-Dmo I、I-Sce I、PI-Pfu IおよびPI-Sce Iは、2つのドデカペプチドモチーフを有するモノマーホーミングエンドヌクレアーゼを表す。

0052

当初のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko IおよびPI-Tsp I;好ましくはI-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Pfu I、PI-Tli I、PI-Mtu IおよびI-Ceu I;より好ましくはI-Dmo I、I-Cre I、PI-Sce IおよびPI-Pfu Iからなる群から選択され;さらに好ましくはI-Cre Iである。

0053

LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの4つの構造、すなわちI-Dmo I、PI-Sce I、PI-Pfu IおよびI-Cre Iの構造は、LAGIDADGモチーフの機能的重要性およびDNA結合界面性質を明らかにする。ホモダイマーホーミングエンドヌクレアーゼの核のαββαββα折り畳みは、モノマーホーミングエンドヌクレアーゼ中で2回繰り返され、該モノマーに擬ダイマー構造を(peudo-dimeric structure)与える。各ドメインまたはサブユニットの最初のαヘリックスは、明確なLAGLIDADGモチーフを含有する。各タンパク質の2つのLAGLIDADGヘリックスは、密に詰まったダイマーまたはドメイン界面を形成する。DNA結合界面は、逆平行βシートに折り畳まれる各ドメインまたはサブユニットの4つのβ鎖により形成される。最小のDNA結合部分は、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ中にβヘアピンとして(ループまたはターンにより連結された2つのβ鎖)規定され得るが、このような2つのβヘアピンは4ストランドのβシートに連結される。

0054

各ドメインまたはサブユニットは、半分の認識部位(half recognition site)と相互作用する。「外部の」四分認識部位(《external》 quarter recognition site)は、各ドメインまたはサブユニットの2つのβヘアピンの1つだけとのその相互作用により規定することができる。

0055

よって、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼ変異型は、いくつかの定方向ライブラリにおいて断片化されることができる。当初のメガヌクレアーゼ進化のためのこの断片化アプローチは、より大きい多様性(ある一つの位置および/またはより多様化された位置でのより多くのアミノ酸)の導入を許容する。各ライブラリにおいて、多様性は、半分の認識部位または四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ導入され、標的DNAは、導入された多様性を含む領域と相互作用する部分についてのみ改変される。より具体的には、新規な半分の部位を探索する場合、多様性は1つのドメインまたはサブユニットの4ストランドのβシートに導入されるのが好ましく、より好ましくはこの構造中のDNAと相互作用するアミノ酸の位置である。新規な四分部位を探索する場合、多様性は対応するβヘアピン中に導入され、より好ましくはこの構造のDNAと相互作用するアミノ酸の位置である。

0056

好ましくは、ライブラリの組は、標的DNA部位の全体をカバーする。よって、ライブラリが半分の部位と相互作用する領域にのみ多様性を含む場合、少なくとも2つ、好ましくは2つのライブラリが必要である。しかしながら、当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合、半分の部位のアプローチでは1つのライブラリで充分である。ライブラリが四分部位と相互作用する領域にのみ多様性を含む場合、少なくとも4つ、好ましくは4つのライブラリが必要である。当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合、四分部位のアプローチでは2つのライブラリで充分であり得る。

0057

一次ライブラリ(primary library)の選択またはスクリーニングの後、一次ライブラリから選択された要素は、選択の新たなサイクルのための次のライブラリに融合されるかまたは組み合わされる。例えば2つのライブラリをシャッフリングにより融合することができる。次いで、選択の新たなサイクルは、全体の標的DNA部位について行うことができる。任意に、選択の新たなサイクルは、最初のライブラリが四分部位に基づくのであれば、半分の標的DNA部位について行うことができる。続いて、半分の部位の選択および/またはスクリーニングの結果を組み合わせて、全体の標的DNA部位についてスクリーニングすることができる最終的なライブラリを得る。
代わりに、各ライブラリからの最もよい要素を一緒にして、標的DNA部位に結合して切断できるメガヌクレアーゼを得る。

0058

他のアプローチにおいて、半分の認識部位または四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ位置する多様性を有するライブラリを製造する。次いで、このライブラリの選択またはスクリーニングの後、ライブラリから選択された要素は、認識部位との相互作用に関与する別の領域に多様性を導入するように改変され、次のライブラリを導く。ライブラリは、完全な標的DNA部位が選択されたメガヌクレアーゼにより結合されかつ切断されるまで作製される。

0059

より具体的には、ダイマーホーミングエンドヌクレアーゼ(I-Cre IおよびI-Ceu Iのような)について、ライブラリは、半分の部位と相互作用する領域にのみ多様性を導入することにより作製でき、該半分の部位は当初のホーミングエンドヌクレアーゼの1つのモノマーに対応する。このライブラリは、標的DNA配列の各半分の部位についての選択および/またはスクリーニングに用いることができる。ライブラリから陽性の要素が各半分の部位について選択された場合、最初の半分の部位についての変異型と他の半分の部位についての変異型は、全体の標的DNA配列に結合して切断するために一緒にされる。代わりに、陽性の変異型は、単鎖メガヌクレアーゼ(single chain meganuclease)構造に導入され得る。実施例1で説明するように、単鎖メガヌクレアーゼは、当初のダイマーホーミングメガヌクレアーゼの2つのモノマーがリンカーにより共有結合した酵素である。

0060

四分部位によるアプローチを当初のダイマーホーミングエンドヌクレアーゼから選択すると、各四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ多様性を導入することにより、少なくとも2つのライブラリが作製される。一次ライブラリの選択またはスクリーニングの後、一次ライブラリから選択された変異型を、半分の部位についての新たな選択サイクルのための次のライブラリに融合させる。代わりに、各ライブラリからの最もよい要素を一緒にして、半分の部位に結合できるモノマーを得る。そうでなければ、四分認識部位との相互作用に関与する領域内にのみ多様性を有するライブラリを製造する。次いで、このライブラリの選択またはスクリーニングの後、ライブラリから選択された要素を、他の四分部位との相互作用に関与する領域に多様性を導入するように改変して次のライブラリを導く。この第二のライブラリの選択および/またはスクリーニングは、半分の部位に結合できる変異型モノマーを導く。ライブラリから陽性の要素が各半分の部位について選択される場合、最初の半分の部位についての変異型と、他の半分の部位についての変異型を、標的DNA配列に結合して切断するために一緒にする。代わりに、陽性の変異型を単鎖メガヌクレアーゼ構造内に導入することができる。

0061

好ましくは、所望のポリヌクレオチド標的を認識して切断するカスタムメイドメガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iの指向性の進化(directed evolution)に由来する。ホーミングエンドヌクレアーゼはホモダイマーであるので、この場合のアプローチは半分の認識部位または四分部位のいずれかに基づく。
指向性の進化は、I-Cre I変異型のライブラリに基づく。これらのI-Cre I変異型は、ポリヌクレオチド標的と相互作用することが予想されるいくつかの位置でアミノ酸の多様性を示す。

0062

I-CreエンドヌクレアーゼとそのDNA標的とのX線構造により、次の位置が関係することが予想された:Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140。Seligmanら(上記)は、S32およびT140は、DNA認識に比較的重要ではないとみられることを示した。

0063

I-Cre I変異型の組は、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140からなる群より選択される位置にアミノ酸多様性を導入することにより製造される。好ましい実施形態において、I-Cre I変異型の組は、位置a) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70、T140;b) Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70;c) Q26、K28、N30、Y33、Q44、R68、R70;またはd) Q26、K28、Y33、Q38、Q44、R68、R70に多様性を導入することにより製造される。好ましくは、I-Cre I変異型の組は、位置Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70に多様性を導入することにより製造される。

0064

任意に、I-Cre IのD75残基は、Nのような非荷電のアミノ酸に変異され得る。実際に、このアミノ酸は、ライブラリにおいて改変されることが好ましい2つの残基と相互作用する。この電荷が構造の核に存在するので、この電荷をなくすのが好ましい。

0065

ホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iの進化アプローチが四分認識部位に基づく場合、βヘアピン(4ストランドのβシート内)により表されるDNA結合残基を置換することが実際的な解決である。これらの残基は制限された長さの要素(すなわち25残基未満)の一部分であるので、例えばカセット置換によりこれらの残基を一度に一緒に変異させることができる。構造1g9y (その標的二本鎖DNAと一緒のI-CreI)の視覚検査は、第一のβヘアピンが、標的の最後の6つの塩基(すなわち塩基-12〜-7または塩基+7〜+12)の認識に独特なまたは主要な貢献をするものであることを示す。よって、残基S22〜残基Q44まで、より好ましくは残基I24〜残基T42までの置換は、標的部位の最後の6つの塩基についての新規な相互作用特異性を特定するのに充分であるはずである。より好ましくは、DNAと直接相互作用する残基は、改変されるはずである:I24、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、S40およびT42。代わりに(またはさらに)、非常に末端にある24bp長のDNA標的と相互作用するβヘアピンの中間のターンは、DNA塩基の置換に耐性があるであろう短いフレキシブルなループにより置換することができる。例えば、残基30〜36は、2、3、4、5または6のグリシン残基により置換され得る。このストラテジは、類似の3D構造を示す全てのメガヌクレアーゼで試験する価値がある。第二のヘアピンは、単一の単位として同様に置換され得る(残基Y66〜I77まで)。しかしながら、このヘアピンは主に内部の四分部位(塩基-6〜-1または+1〜+6)と相互作用するが、ヘアピンから離れた他の残基(すなわちS22、Q44およびT46)は、相互作用の特異性を指向させる役割を果たすことができる。つまり、ライブラリは残基Y66、R68、R70、V73、D75およびI77を置換することによりつくることができる。並行して、S22、Q44およびT46は、さわらないままにしておくか、小さい極性アミノ酸(G、SまたはT;より好ましくはSまたはT)により置換するかまたは無作為化されるかしてライブラリに寄与することができる。別々のライブラリから選択された突然変異体(無作為化された残基がI24、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、S40およびT42である第一のものならびに無作為化された残基がY66、R68、R70、V73、D75およびI77である第二のもの)は、相同DNA領域での組換えに基づく標準的なDNAシャッフリング法により一緒にすることができる(すなわち、残基43〜残基65の間の領域をコードするDNAは厳密に保存される)。しかしながら、第二のライブラリが残基S22、Q44およびT46の突然変異を含む場合、組換えは実現不可能になり、より古典的なDNA/タンパク質工学が必要である。

0066

ホーミングエンドヌクレアーゼI-Cre Iの進化アプローチが四分認識部位に基づく場合、I-Cre I変異型のライブラリは、a) I24、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、S40およびT42;またはb) Y66、R68、R70、V73、D75およびI77からなる群より選択される位置で多様性を導入することにより製造される。選択肢b)において、多様性はS22、Q44およびT46からなる群より選択される位置においても導入することができる。

0067

代わりに、所望のポリヌクレオチド標的を認識して切断するカスタムメイドメガヌクレアーゼは、単鎖I-Cre Iエンドヌクレアーゼの指向性の進化により製造することもできる。単鎖I-Cre I変異型の組は、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70、Q123、K125、N127、S129、Y130、Q135、Q141、R165、R167からなる群より選択される位置にアミノ酸多様性を導入することにより製造される。

0068

メガヌクレアーゼの2つの特性、すなわち標的DNA配列に結合できる能力とそれを切断できる能力は、選択工程および/またはスクリーニング工程に用いることができる。

0069

メガヌクレアーゼ変異型は、選択かつスクリーニングされるか、またはスクリーニングだけされ得る。選択および/またはスクリーニングは、メガヌクレアーゼの標的DNA配列を切断する能力について直接行うことができる。代わりに、選択および/またはスクリーニングは、標的DNA配列に対する結合能力について、次いでメガヌクレアーゼのそれを切断する能力について行うことができる。好ましくは、カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法は、次の各工程:
a) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程;
b) 結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程;
c) 結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程;
d) 結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程;
e) 切断活性の選択工程およびスクリーニング工程;または
f) 切断活性のスクリーニング工程
を含むかまたはこれらの工程からなる。

0070

より好ましくは、カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法は、次の工程:結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程を含むかまたはこれらの工程からなる。結合能力に基づく選択工程の後の結合能力についてのスクリーニングアッセイは、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型のライブラリの濃縮(enrichment)を評価するために行うことができる。

0071

選択およびスクリーニングアッセイは、二本鎖切断が導入されなければならないDNA領域またはその断片について行なわれる。
好ましくは、標的配列は少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは18〜40、より好ましくは18〜30ヌクレオチドを含む。ダイマーメガヌクレアーゼの場合、標的DNAポリヌクレオチドは、結合だけのために少なくとも8ヌクレオチドに減少させることができる。好ましくは、標的DNAポリヌクレオチドの長さは、10kb未満、好ましくは3 kb未満、より好ましくは1 kb未満である。DNA結合アッセイについて、標的DNAポリヌクレオチドの長さは、好ましくは500 bp未満、より好ましくは200 bp未満である。

0072

いずれの標的配列を、それをしかるべく切断可能なカスタムメイドメガヌクレアーゼを作製するのに用いることができる。任意に、標的配列は、当初のメガヌクレアーゼの元来の認識・切断部位と最大の同一性を示すように選択される。
よって、二本鎖破壊が導入されなければならないDNA領域を分析して、当初のメガヌクレアーゼの元来の認識・切断部位と少なくとも25%の同一性、好ましくは50%の同一性、より好ましくは75%の同一性を有する少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは18〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜30ヌクレオチドの少なくとも1、2、3または5の配列を選択する。

0073

標的DNA配列は、メガヌクレアーゼ変異型ライブラリのタイプに適合させる。ライブラリが半分の部位のアプローチに基づく場合、選択/スクリーニングに用いられる標的DNA配列は、元来の半分の部位および所望のDNA配列の半分の部位を含む。ライブラリが四分部位アプローチに基づく場合、選択/スクリーニングに用いられる標的DNA配列は、元来の部位の4分の3と所望のDNA配列の4分の1の部位とを含む。

0074

選択工程および/またはスクリーニング工程から得られるメガヌクレアーゼ変異型は、多様性の導入の別のサイクルのためのインプットに任意になることができる。
選択工程および/またはスクリーニング工程により選択された陽性のメガヌクレアーゼ変異型は、インビトロおよび/またはエクスビボの切断アッセイにより確認される。

0075

結合能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型の選択およびスクリーニングは、切断活性に影響を及ぼさない条件を用いて行なわれなければならない。例えば、ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの切断活性のためにマンガンまたはマグネシウムを必要とする。よって、このタイプのホーミングエンドヌクレアーゼ変異型についての結合アッセイは、マンガンまたはマグネシウムなしで、好ましくはカルシウムにより置換して行なわれる。

0076

結合選択アッセイは、標的DNAポリヌクレオチドに結合できるメガヌクレアーゼの変異型の濃縮に基づく。よって、ライブラリによりエンコードされるメガヌクレアーゼ変異型は、固定化された標的DNAポリヌクレオチドと共に、固定化された標的DNAポリヌクレオチドに結合するメガヌクレアーゼ変異型がいずれの結合能力も示さないものから差異に基づいて分配され得るように、インキュベートされる。固定化された標的DNAポリヌクレオチドと結合するメガヌクレアーゼ変異型は、次いで親和性濃縮と増幅後続の回のために回収されて増幅される。親和性の濃縮および増幅を数回行った後に、このようにして選択されるライブラリのメンバーを単離することができる。任意に、選択されるメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列が決定され、それにより標的DNA配列に結合できるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。

0077

メガヌクレアーゼ変異型の選択は、遺伝子型と表現型とを連結する系、例えばファージディスプレイ(WO91/17271号、WO91/18980号ならびにWO91/19818号およびWO93/08278号;これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)、リボソームディスプレイ(Hanes & Pluckthun, PNAS, 1997, 第94巻, 4937〜4942;He & Taussig, Nucl. AcidsRes. (1997) 第25巻, p 5132〜5143)およびmRNA-タンパク質融合(WO00/47775号;US第5,843,701号;Tabuchiら FEBSLetters 508 (2001) 309〜312;これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)を必要とする。

0078

ファージディスプレイは、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質との融合としての繊維状バクテリオファージの表面上のメガヌクレアーゼ変異型の提示に関係する。メガヌクレアーゼ変異型のライブラリは、ファージ染色体またはファージミドに、バクテリオファージコートタンパク質、好ましくはpIIIタンパク質とのタンパク質融合体を得るように導入される。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、メガヌクレアーゼのモノマー変異型は、ディスプレイされるように導入され、そして一定のモノマーがペリプラズムにおいて産生されるように導入することができる。バクテリオファージライブラリは、DNAに結合し得る要素を選択するために固定化標的DNA配列とインキュベートすることができる。

0079

mRNA-タンパク質融合系は、1013の異なるメガヌクレアーゼ変異型から選択する可能性を開く。この系は、翻訳の最後に共有的mRNA-タンパク質融合に導くmRNAの3'末端にピューロマイシンを介してmRNAとエンコードされるタンパク質との間の連結を創造することにある。よって、メガヌクレアーゼ変異型のコーディング領域を含む二本鎖DNAライブラリは、3'ピューロマイシンを含有する翻訳のためのmRNA鋳型再生するのに用いられる。mRNA-ピューロマイシンコンジュゲートは、インビトロで翻訳されてmRNA-メガヌクレアーゼ融合体がつくられる。cDNA合成の後、該融合体は、固定化標的DNAポリヌクレオチドに結合する能力について試験される。次いで、PCRを用いて、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型に富む二本鎖DNAを作製する。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、一定のモノマーはこのモノマーをエンコードするDNAもしくはmRNAとして、またはモノマータンパク質のいずれかとして導入することができる。この場合、単鎖メガヌクレアーゼを用いるアプローチが好ましく用いられる。

0080

リボソームディスプレイは、翻訳のためのmRNA鋳型を作製するために使用されるメガヌクレアーゼ変異型のコーディング配列を含む二本鎖DNAライブラリを含む。短いインキュベーションの後、Mg2+の添加および低温でのインキュベーションまたは翻訳阻害剤の添加により翻訳を停止する。次いでリボソーム複合体を、固定化された標的DNAポリヌクレオチドに結合する能力について試験する。選択されたmRNAは、cDNAを構築するのに用いられ、PCRは、結合能力を提示するメガヌクレアーゼ変異型に富む二本鎖DNAを作製する。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、一定のモノマーは、このモノマーをエンコードするDNAもしくはmRNAまたはモノマータンパク質のいずれかとして導入される。この場合、単鎖メガヌクレアーゼを用いるアプローチが好ましく用いられる。

0081

標的DNA配列は、固体支持体上に固定化され得る。該固体支持体は、カラム常磁性ビーズまたはマイクロプレートウェルであり得る。例えば、標的DNA配列を含むポリヌクレオチドは一方の末端でリガンド(例えばビオチン)を提示し、該リガンドはリガンドの標的(例えばビオチンが用いられる場合はストレプトアビジン)をもつ固体支持体上への固定化を許容する。

0082

メガヌクレアーゼ変異型の選択は、これらのメガヌクレアーゼの結合または切断能力に基づくスクリーニングアッセイにより、通常、モニターすることができる。しかしながら、選択されたメガヌクレアーゼ変異型は、切断能力に基づく選択工程に直接導入することもできる。

0083

スクリーニングアッセイを行うために、選択されたメガヌクレアーゼ変異型をクローニングする必要がある。選択をファージディスプレイシステムを用いて行った場合、各メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするクローンを容易に単離することができる。選択をmRNA-タンパク質融合またはリボソームディスプレイにより行なった場合、選択されたメガヌクレアーゼ変異型は発現ベクターにサブクローニングされなければならない。

0084

スクリーニングアッセイは、標的DNAポリヌクレオチドが固定化されたマイクロプレート(96、384または1536ウェル)で行なわれるのが好ましい。メガヌクレアーゼ変異型の発現の後、これらの変異型を固定化標的DNAポリヌクレオチドと共にインキュベートする。メガヌクレアーゼ変異型の発現は、インビボまたはインビトロのいずれかで、好ましくはインビトロ発現系により行うことができる。好ましくは、メガヌクレアーゼ変異型は、標的ポリヌクレオチドとのインキュベーションの前に精製される。次いで、保持されたメガヌクレアーゼ変異型を検出する。検出は、当業者に公知のいくつかの手段により行うことができる。例えば、ファージを用いる場合は、検出はファージに対する抗体を用いて(ELISA)行うことができる。そうでなければ、発現を、放射活性のメガヌクレアーゼを得るために、S35アミノ酸の存在下に行うことができる。つまり、結合を放射活性測定により評価する。本発明は、メガヌクレアーゼによるDNA結合の検出の当業者に入手可能な他の手段も考慮する。

0085

任意に、陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列を決定し、それにより標的DNA配列に結合できるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。
陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型は、その切断能力について試験しなければならない。よって、該メガヌクレアーゼ変異型は、切断の選択および/またはスクリーニング実験、好ましくはインビボ切断スクリーニングアッセイに組み込まれる。任意に、該メガヌクレアーゼ変異型は、インビトロ切断アッセイにより試験できる。

0086

スクリーニングアッセイは、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型の濃縮を評価するためにだけ用いることもできる。この評価は、結合能力に基づく選択の新しい回が必要であるか、または選択されたライブラリを切断の選択および/またはスクリーニング、好ましくはインビボでの切断の選択および/またはスクリーニングに付すことができるかを決定する助けとなる。

0087

切断能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型の選択およびスクリーニングは、切断活性に影響を及ぼさない条件下で行なわれなければならない。切断能力に基づく選択および/またはスクリーニングにおいて用いられるメガヌクレアーゼ変異型は、メガヌクレアーゼ変異型の最初のライブラリまたは結合活性について選択および/またはスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型のいずれかであり得る。

0088

必要であれば、選択および/またはスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型は、インビトロおよびインビボ切断アッセイのために適切な発現ベクターにサブクローニングされる。このようなサブクローニング工程は、バッチにおいてまたは個別に行うことができる。より具体的には、当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合。サブクローニング工程は、単鎖メガヌクレアーゼ構造内への選択されたライブラリの導入を許容する。2つのライブラリが2つの半分の認識・切断部位について選択および/またはスクリーニングされた場合、サブクローニング工程は、単鎖メガヌクレアーゼ構造内で2つの選択されたライブラリを一緒にすることを許容する。

0089

メガヌクレアーゼ変異型の切断能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択の一般的な原理は、二本鎖破壊が正の選択マーカーの活性化または負の選択マーカーの不活性化に導くことである。

0090

選択が負の選択マーカーの不活性化に基づく場合、該方法は、負の選択マーカーと所望のメガヌクレアーゼについての標的DNA配列のコーディング配列を含む発現ベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを含む発現ベクターを含有する細胞の使用を含む。好ましくは、該発現ベクターはプラスミドである。好ましくは、該標的DNA配列は、負の選択遺伝子の近くまたは負の選択遺伝子内のいずれか、好ましくは負の選択遺伝子の発現を駆動するプロモーターとORFとの間に位置する。負の選択マーカーの発現は、メガヌクレアーゼ変異型が切断する機会を有するまで細胞を生存したままにするために、条件的(conditional)でなければならない。このような条件的発現は、条件的プロモーターを用いて容易に行うことができる。しかしながら、用い得る他の条件的システムもある。メガヌクレアーゼ変異型を発現カセット内に導入する。メガヌクレアーゼをエンコードする配列は、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターに動作可能に連結する。もちろん、プロモーターはアッセイで用いられる細胞と矛盾しない。メガヌクレアーゼ変異型が標的DNAを切断する能力を有する場合、負のマーカー遺伝子全体もしくはその部分(コーディング配列またはプロモーター)の欠失またはベクターの分解のいずれかにより負の選択マーカーは不活性化される。負の選択条件での培養は、標的DNA配列を切断できるメガヌクレアーゼ変異型を含む細胞の選択を許容する。

0091

負の選択マーカーを含むベクターは、メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターの導入前にトランスフェクションされるのが好ましい。任意に、負の選択マーカーを含むベクターは、細胞内でエピソームの形で保存され得る。代わりに、負の選択マーカーを含むベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターは、細胞に共トランスフェクションすることができる。細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。好ましくは、原核細胞はE. coliである。好ましくは、真核細胞は酵母細胞である。負の選択マーカーは細胞にとって直接または間接的に毒性のタンパク質である。例えば、負の選択マーカーは、細菌についてはトキシン、翻訳阻害剤、バーナーゼ(barnase)および抗生物質、酵母については5FOA(5-フルオロ-オロチン酸)培地と用いるURA3、α-AA培地(アルファ-アジピン酸)と用いるLYS2、および高等真核細胞についてはチミジンキナーゼからなる群から選択することができる。負のマーカー選択の例については、Gruenら, 2002, Nucleic AcidsResearch, 30, e29を参照。この開示は参照として本明細書に組み込まれる。

0092

選択が正の選択マーカーの活性化に基づく場合、該方法は、不活性な正の選択マーカーと所望のメガヌクレアーゼについての標的DNA配列とを含む発現ベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを含む発現ベクターを含む細胞の使用を含む。任意に、不活性な正の選択マーカー、標的DNA配列およびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリは、同じベクター上にあることができる(WO 02/44409号を参照)。好ましくは、該発現ベクターはプラスミドである。メガヌクレアーゼ変異型は、発現カセット中に導入される。メガヌクレアーゼエンコード配列は、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターに動作可能に連結することができる。もちろん、プロモーターはアッセイで用いられる細胞と矛盾しない。例えば、正の選択マーカーは、細菌については抗生物質耐性(例えばテトラサイクリンリファンピシンおよびアンピシリン耐性)または栄養要求性マーカー、酵母についてはTRP1、URA3または栄養要求性マーカー、および高等真核細胞についてはネオマイシンまたはピューロマイシンであり得る。任意に、正の選択マーカーは細菌と酵母の両方に矛盾しない栄養要求性マーカーであり得る(例えばURA3、LYS2、TRP1およびLEU2)。不活性な正の選択マーカー遺伝子および標的DNA配列は、二本鎖破壊が活性な正のマーカーにおいてマーカーの転位(rearrangement)を導くように配置されなければならない。2種の修復プロセスは、活性な正の選択マーカー、すなわち一本鎖アニーリング(SSA)または遺伝子変換(GC)に導くことができる。

0093

インビボ一本鎖アニーリング組換え試験(SSA)は当業者に周知であり、例えばRudinら(Genetics 1989, 122, 519〜534 ; Fishman-Lobell & Haber (Science 1992, 258, 480〜4); Linら(Mol. Cell. Biol., 1984, 4, 1020〜1034)およびRouetら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6064〜6068)に開示される。これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。

0094

メガヌクレアーゼ変異型を試験するために、細胞内、好ましくは細菌または酵母細胞でのSSAに基づくインビボアッセイが開発されている。例えば、該方法は酵母細胞を用いる。この生物は、高い頻度で相同的組換えを介してそのDNAを自然に組み換える点で有利である。
このインビボ試験は、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製される二本鎖破壊により誘発される正の選択マーカーのSSAによる修復に基づく。標的は、標的DNA配列を含む介在配列により分離される内部重複を有する改変された正の選択遺伝子からなる。内部重複は、少なくとも50 bp、好ましくは少なくとも200 bpを含むべきである。SSA試験の効率は、内部重複のサイズにより増加する。介在配列は少なくとも標的DNA配列である。介在配列は、細胞が自発的組換え事象により正の選択マーカーを修復していないことを確かめることを許容する選択マーカーを任意に含み得る。正の選択マーカー遺伝子は、アッセイにおいて用いる細胞に関連する構成性プロモーターに動作可能に連結されるのが好ましい。該アッセイ方法によると、細胞は、活性なメガヌクレアーゼ変異型により導入された二本鎖破壊の後にSSA事象が起こる場合にのみ選択される。

0095

任意に、各ベクターは細胞内にプラスミドが存在することを確実にするために選択可能なマーカーを含み得る。この選択可能なマーカーの存在は、酵母細胞内で行われるアッセイについて好ましい。例えば、酵母について、標的遺伝子を含む第一の構築物は、形質転換された酵母がいずれのロイシンも含有しない合成培地上で増殖するのを許容するLeu2選択マーカーを含むことができ、第二の構築物は、形質転換された酵母がいずれのトリプトファンも含有しない合成培地上で増殖するのを許容するTrp1選択マーカーを含むことができる。

0096

正の選択マーカーを含むベクターは、メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターの導入の前にトランスフェクションされるのが好ましい。任意に、正の選択マーカーを含むベクターは、細胞内でエピソームの形で保持され得る。代わりに、正の選択マーカーを含むベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターは、細胞内に共トランスフェクションすることができる。

0097

メガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択は、遺伝子変換アッセイを用いて行うこともできる。例えば、選択ベクターは、欠失または変異と欠失の位置にメガヌクレアーゼのための標的DNA配列の挿入とを有する第一の改変された正の選択遺伝子を含む。正の選択遺伝子は、標的DNA配列を含む挿入による遺伝子の分断により不活性化されることもできる。選択構築物は、欠失の境をなす正の選択マーカー遺伝子配列で両側を挟まれる欠失された正の選択マーカー遺伝子のセグメントをさらに含む。境界配列は、両側にある正の選択マーカー遺伝子と少なくとも100 bp、好ましくは少なくとも300 pbの相同性を含む。標的DNA配列内で活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製された二本鎖破壊は、遺伝子変換事象を引き起こし、機能的な正の選択マーカー遺伝子をもたらす。この種類のアッセイは、次の文献に記載される:Rudinら(Genetics 1989, 122, 519〜534)、Fishman-Lobell & Haber (Science 1992, 258, 480〜4)、Paques & Haber (Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 6765〜6771)。これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる。

0098

そうでなければ、メガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択は、染色体標的上での組換えアッセイにより行うことができる。組換えはSSAまたは遺伝子変換の機構に基づくことができる。

0099

SSAに基づく第一の例は次のとおりである。所望のメガヌクレアーゼ変異型についての標的DNA配列を含む介在配列により分離される内部重複(internal duplication)を有する改変された正の選択遺伝子を、細胞の染色体内へ導入する。内部重複は、少なくとも50 bp、好ましくは少なくとも200 bpを含むべきである。SSA試験の効率は、内部重複のサイズにより増加する。介在配列は少なくとも標的DNA配列である。細胞内でのメガヌクレアーゼ変異型の生成を許容する発現構築物での細胞のトランスフェクションにより、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製した二本鎖破壊の相同的組換えによる修復が機能的な正の選択マーカー遺伝子を導く。

0100

遺伝子変換に基づく別の例は、次のとおりである。所望のメガヌクレアーゼ変異型についての標的DNA配列を含む変異された非機能的な正の選択マーカー遺伝子を、細胞の染色体内へ導入する。該標的DNA配列は、変異の近傍、好ましくは変異から1kb未満、より好ましくは変異の周囲500 bp、200 bpまたは100 bp未満になければならない。変異領域に対応する機能的な正の選択マーカー遺伝子の断片と細胞内でメガヌクレアーゼ変異型の産生を許容する発現構築物とで細胞をトランスフェクションすることにより、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製された二本鎖破壊の相同的組換えによる修復は、機能的な正の選択マーカー遺伝子を導く。代わりに、修復を許容する機能的な正の選択マーカーの断片を、染色体上に組み込むことができる。この種類のアッセイは、次の文献に記載される:Rouetら(Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜8106);Choulikaら(Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜1973);Donohoら(Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070〜4078)。これらの開示は本明細書に参照により組み込まれる。

0101

選択されたクローンは、標的DNA配列を切断する能力を示すメガヌクレアーゼ変異型を含む。スクリーニングアッセイにより選択を確認するのが好ましい。このスクリーニングアッセイは、インビボまたはインビトロ、好ましくはインビボで行うことができる。
任意に、陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列を決定し、それにより標的DNA配列を切断することができるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。

0102

スクリーニングアッセイを行うために、選択されたメガヌクレアーゼ変異型をクローニングする必要があり、切断アッセイは各クローンについて個別に行われる必要がある。
スクリーニングについてのインビボ切断アッセイは、選択工程で用いられるものと類似である。これは、負の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のいずれかの不活性化あるいは正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のいずれかの活性化に基づくことができる。
レポーター遺伝子により、容易にアッセイされる物質、例えばβ-ガラクトシダーゼルシフェラーゼアルカリホスファターゼ、緑蛍光タンパク質チロシナーゼ、DsRedタンパク質をエンコードするいずれの核酸を意図する。レポーター遺伝子は、アッセイにおいて用いられる細胞に関係する構成性プロモーター(例えばCMVプロモーター)に動作可能に連結されるのが好ましい。

0103

このスクリーニングアッセイで用いられる細胞は、原核細胞、好ましくはE. coli、または真核細胞、好ましくは酵母細胞または哺乳動物細胞であり得る。より具体的には、エクスビボ切断アッセイによる陽性のメガヌクレアーゼ変異型の確認のために哺乳動物細胞を用いるのが興味深い。

0104

メガヌクレアーゼ変異型による標的DNA配列またはその一部分の認識および切断は、当業者に公知のいずれの方法によりアッセイすることができる。
メガヌクレアーゼ変異型の活性を試験するある方法は、標的DNA配列またはその一部分を含むポリヌクレオチド基質に対するインビトロ切断アッセイを用いることである。該ポリヌクレオチド基質は、
−全体の標的DNA部位;
−半分の標的DNA部位と半分の元来の部位;または
−4分の1の標的DNA部位と4分の3の元来の部位
に対応する合成標的部位であり得る。

0105

該ポリヌクレオチド基質は、直鎖状または環状であることができ、唯一の切断部位を含むのが好ましい。アッセイされたメガヌクレアーゼ変異型は、適切な条件においてポリヌクレオチド基質とインキュベートされる。得られるポリヌクレオチドは、いずれの既知の方法、例えばアガロース上での電気泳動またはクロマトグラフィーにより分析される。ポリヌクレオチド基質が直線化されたプラスミドである場合、メガヌクレアーゼ活性は2つのバンド(生成物)の出現および元来の全長の基質のバンドの消滅により検出される。好ましくは、該アッセイされたメガヌクレアーゼ変異型は、得られるポリヌクレオチドの分析の前に例えばプロテイナーゼKにより消化される。例えば、ポリヌクレオチド基質は、標的部位の配列を含むポリヌクレオチドのプラスミド内へのTAまたは制限酵素クローニングによる導入により、任意にプラスミドの直線化を続けて製造される。好ましくは、このような直線化は、標的DNA配列の周囲では行なわない。Wangら, 1997, Nucleic Acid Research, 25, 3767〜3776;Examples, Materials & Methods"in vitro activity assays"のセクションの実施例、および当初のホーミングエンドヌクレアーゼの特徴付けの文献を参照。

0106

代わりに、このようなインビトロ切断アッセイは、蛍光体に連結されたポリヌクレオチド基質を用いて行うことができ、このような基質は標的DNA配列を含む。これらのポリヌクレオチド基質は、固体支持体に固定化される。該固体支持体は、好ましくはマイクロプレート(96、384または1536ウェル)である。例えば、標的DNA配列を含むポリヌクレオチドは、一方の末端でリガンド(例えばビオチン)を提示し、該リガンドはリガンドの標的(ビオチンを用いる場合は例えばストレプトアビジン)を有する固体支持体上への固定化を許容する。固定化された末端の反対側の末端は、蛍光体と連結される。切断は、固体支持体からの蛍光色素の放出により蛍光の減少を導く。

0107

そうでなければ、いくつかのインビトロ切断アッセイは、蛍光消失に基づくことができる。蛍光体(例えばFAMまたはTAMRA)および消光物質(例えばDABCYL)は、ポリヌクレオチド基質上に、消光物質が蛍光発光を阻害するように位置する。消光は、ポリヌクレオチド基質上でメガヌクレアーゼ変異型による切断が起こるときに撤廃される。この消光アッセイのいくつかの例は、Eisenschmidtら(2002, Journal of Biotechnology, 96, 185〜191)およびWO 02/42497号に説明され、これらの文献の開示は本明細書中に参照として組み込まれる。

0108

−ターゲティングDNA
本発明の上記使用の第一実施形態において、標的の遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる対象の部位を改変する配列を含むDNAのターゲティング断片(またはターゲティングDNA)が、必要に応じて(下記のメガヌクレアーゼの送達の章参照)、前記脊椎動物(ヒトまたは非ヒト)の体内に導入される。少なくとも50bp、好ましくは100bpを超える、より好ましくは200bpを超える相同配列が使用されるのが好ましい。対象の部位を改変する配列は、遺伝子の損傷を修復するための遺伝子の正しい配列であり得る(遺伝子治療)。あるいは、対象の部位を改変する前記配列は、ある種の特定の方法で染色体DNAを変えるために使う他の配列でもよく、その配列としては、特定の配列を改変したり、対象の内因性遺伝子を減弱もしくは活性化させたり、対象の内因性遺伝子もしくはその一部分を不活性化もしくは欠失させたり、対象の部位に突然変異を導入したり、または外因性遺伝子もしくはその一部分を導入するために使用される配列がある。このような染色体DNAの変更は、ゲノム工学(動物モデル、タンパク質の製造)または抗ウイルス治療に利用される。

0109

−メガヌクレアーゼの送達
メガヌクレアーゼは、ポリペプチドまたはプロモーター例えば組織特異的プロモーターおよび/または誘導性プロモーターを含む適当な転写制御要素の制御下で、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物として使用できる。誘導性プロモーターの例は、重金属の濃度増大で誘発される真核メタロチオネインプロモーター、イソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド(IPTG)に応答して誘発される原核lacZプロモーターおよび温度上昇で誘発される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ前立腺特異的抗原(PSA)、α-アンチトリプシンプロテアーゼ、ヒト界面活性剤(SP) Aタンパク質とBタンパク質、β-カゼインおよび酸性ホエータンパク質の遺伝子である。このプロモーターは、当該技術分野で周知の通常の手段で、単独または少なくとも適当な賦形剤もしくは担体および/またはターゲティングDNAと組み合わせて、個体の体細胞中に導入される。

0110

本発明の使用の有利な実施形態によれば、メガヌクレアーゼ(ポリペプチド)は、
リポソーム類、例えばポリエチレンイミン(PEI)と結合する。この場合、その結合物が投与されて体細胞の標的に導入される;または
−膜転位ペプチド(membrane translocating peptide) (Bonetta, 2002, The Sientist, 16, 38; Fordら, Gene Ther, 2001, 8, 1〜4 ; WadiaおよびDowdy, 2002, Curr Opin Biotechnol, 13, 52〜56)と結合する。この場合、該ペプチドとの融合体がある。

0111

メガヌクレアーゼは、特定のメガヌクレアーゼと細胞型に適した当該技術分野で広く知られている方法にしたがって、個体から体組織に導入することもできる。

0112

本発明の使用の別の有利な実施形態によれば、メガヌクレアーゼ(該メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド)および/またはターゲティングDNAがベクターに挿入される。ターゲティングDNAおよび/またはメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、種々の方法により細胞に導入することができる(例えば注入、形質転換、トランスフェクション、直接の取り込み(direct uptake)、発射物打込み(projectile bombardment)、リポソーム)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて細胞内で安定的にまたは一過的に発現することができる。真核細胞における発現の技術は、当業者に周知である(Current Protocols in Human Genetics:第12章 "Vecto Therapy"と第13章 "Delivery Systems for Gene Therapy"を参照)。任意に、組換えタンパク質核局在化シグナルを組み込んで、それが核内で発現されることを確実にすることが好ましい。

0113

メガヌクレアーゼをコードする配列とターゲティングDNAは、同じベクターに挿入すると有利である。

0114

本発明で使用できるベクターとしては、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体の、非染色体の、半合成もしくは合成のDNAからなる直線状もしくは環状のDNAもしくはRNAの分子を含む。好ましいベクターは、自立複製することができるベクター(エピソームベクター)および/またはそのベクターが連結されている核酸を発現できるベクター(発現ベクター)である。多種類の適切なベクターが、当業者に知られており、購入できる。

0115

ウイルスベクターは、レトロウイルスアデノウイルスパルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルスオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病および水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹およびセンダイ)のようなマイナス鎖RNAウイルスピコルナウイルスおよびαウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1型および2型エプスタイン-バーウイルスサイトメガロウイルス)およびポックスウイルス(例えばワクシニア鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えばノーウォークウイルス、トガウイルスフラビウイルスレオウイルスパポバウイルスヘパドナウイルス(hepadnavirus)、および肝炎ウイルスを含む。
レトロウイルスの例は、トリ白血病-肉腫、哺乳動物C型B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLVグループ、レンチウイルススプマウイルス(Coffin, J. M.、Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology、第3版、B. N. Fieldsら編、Lippincott- Raven Publishers、Philadelphia、1996)を含む。その他の例は、マウス白血病ウイルスマウス肉腫ウイルスマウス乳腺癌ウイルス、ウシ白血病ウイルスネコ白血病ウイルスネコ肉腫ウイルストリ白血病ウイルスヒトT細胞白血病ウイルスヒヒ内在性ウイルステナガザル白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全性ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびレンチウイルスを含む。ベクターのその他の例は、例えばMcVeyら、米国特許第5,801,030号に記載され、この教示は本明細書に参照として組み込まれる。

0116

ベクターは、選択マーカー(selectable marker) (例えば、真核細胞培養にはネオマイシンホスホトランスフェラーゼヒスチジノールデヒドロゲナーゼジヒドロ葉酸レダクターゼハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼグルタミンシンセターゼ、およびハイポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼエス・セレビシエにはTRP1;イー・コリではテトラサイクリン、リファンピシンまたはアンピシリン耐性など)を含み得る。

0117

一旦細胞内に入ると、メガヌクレアーゼ、ならびにもし存在するならばターゲティングDNAおよび/またはメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、細胞により細胞質から核内の活動する部位に取り込まれるかまたは移動される。

0118

メガヌクレアーゼならびに切断部位の周囲の領域に相同なターゲティングDNAおよび/またはカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、当該技術において一般に知られた投与経路を用いて個体に導入することができる。投与は、局所的または内部的(internal)あるいは患者に治療剤を導入するのに適したいずれの他の経路によるものであり得る。局所的投与は、皮膚への塗布または目、もしくはへの適用によるものであり得る。内部的投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹膜内、動脈内もしくは静脈内またはいずれの他の適切な経路により行い得る。本発明の組成物経口摂取によるかまたは呼吸直腸もしくはにより投与することが有利な場合もあり得る。

0119

メガヌクレアーゼおよびベクターは、医薬的に許容される担体、例えば食塩水滅菌水リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液中に投与することができる。典型的には、治療の適用のために、メガヌクレアーゼは、計画された投与経路に適切な医薬的に許容される賦形剤と組み合わせる。種々の医薬的に許容される賦形剤が周知であり、そのうちメガヌクレアーゼを感染の部位に効果的に送達するものが選択できる。American Pharmaceutical Associationにより出版されるHANDBOOK OFPHARMACEUTICAL EXCIPIENTSは、本発明の使用のための適切な賦形剤についての有用な指針である。構成物は、受容者がその投与に耐え得る場合は「医薬的に許容される賦形剤」とよばれる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、静脈内投与に適する医薬的に許容される賦形剤の一例である。投与の形態は、標的細胞の位置が好ましい。

0120

投与頻度を含む、個体に投与される本発明のメガヌクレアーゼまたはベクターの用量は、投与の形態および経路;受容者のサイズ、年齢性別、健康、体重および食餌;治療される疾患または障害の性質および症状の程度;並行して行う治療の種類、治療の頻度および所望される効果を含む種々の因子に応じて変動する。医薬的な剤形およびそれらの使用の簡単なレビューについては、PHARMACEUTICALDOSAGEFORMS AND THEIR USE (1985) (Hanshuber Publishers, Berne, Switzerland)を参照。

0121

治療の目的のために、カスタムメイドメガヌクレアーゼと医薬的に許容される賦形剤とは治療上有効量で投与される。このような組み合わせは、投与される量が生理的に意義がある場合に「治療上有効量」で投与されるという。剤は、その存在が受容者の生理機能に検出できる変化をもたらす場合に、生理的に意義がある。本発明の関係において、剤は、その存在が標的疾患の1以上の症状の重篤度の減少または障害もしくは異常のゲノムの修正またはウイルス感染の阻害をもたらす場合に、生理的に意義がある。

0122

本発明のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、実質的に非免疫原性であり、すなわち有害な免疫応答をほとんどまたは全く発生させない。この種類の有害な免疫反応緩和または消去する種々の方法を、本発明の方法に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、N-ホルミルメチオニンを実質的に有さない。望ましくない免疫反応を回避するための別の方法は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコール(「PEG」)またはポリプロピレングリコール(「PPG」)と結合させることである(好ましくは平均分子量(MW)が500〜20,000ダルトン)。例えばDavisら(US第4,179,337号)に記載されるようなPEGまたはPPGとの結合は、抗ウイルス活性を有する非免疫原性の生理活性水溶性エンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供することができる。ポリエチレンポリプロピレングリコールコポリマーを用いる類似の方法がSaiferら(US第5,006,333号)に記載されている。

0123

−遺伝子治療
本発明による遺伝子治療のためのメガヌクレアーゼの使用は、遺伝子疾患(単一遺伝子の劣性疾患、トリヌクレオチド反復疾患または優性および複合の異型接合突然変異により起こる疾患)のタイプによって変わる。

0124

したがって、本発明のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、単一遺伝子劣性疾患を予防、改善または治癒するために対象の部位を修復する配列を含む上記で規定したターゲティングDNAと組み合わせて使用する。

0125

この場合、メガヌクレアーゼの使用は、(a)個体の体組織において、該メガヌクレアーゼの少なくとも一つの認識・切断部位を含む対象の部位に二本鎖切断を誘発する工程、および(b)個体中にターゲティングDNAを導入する工程を少なくとも有し、該ターゲティングDNAは、(1)切断部位のまわりの領域と相同性を共有するDNAおよび(2)ターゲティングDNAと染色体DNAの間の組換えによって対象の部位を修復するDNAを含む。該ターゲティングDNAは、該ターゲティングDNAを対象の部位に導入するのに適切な条件下で個体に導入される。

0126

単一遺伝子劣性疾患としては、限定されないが、対応する体組織内の下記の遺伝子に影響する疾患を含む。
肝臓アポリポタンパク質欠損症(apo A-I遺伝子またはapo B遺伝子);家族性高コレステロール血症(FH;LDL受容体遺伝子);ウイルソン病(WND遺伝子);鎌状赤血球貧血(ヘモグロビンβ遺伝子(HBB));α-1抗トリプシン欠損症(α-1抗トリプシン遺伝子);遺伝性血色素症(HFE遺伝子);血友病Aまたは血友病B(IX因子またはX遺伝子);アミノ酸症(チロシン血症(フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子(FAH));フェニルケトン尿症(フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子(PAH)など)、
嚢胞性線維症(CFTR: 嚢胞性線維症膜貫通制御因子)、
−筋肉:肢帯筋ジストロフィー(α、β、γまたはδ-サルコグカン遺伝子)、
腎臓多嚢胞性腎臓病(PKHDI)、
網膜色素性網膜炎(ロドプシン遺伝子)、
中枢神経系(CNS):ティサックス病;レッシュ・ナイハン症候群(HPRT遺伝子)。

0127

本発明の別の実施形態では、メガヌクレアーゼを単独でまたは少なくとも一つの適当な賦形剤および/または担体と組み合わせて、トリヌクレオチド反復病を予防、改善または治癒するために使用する。

0128

この場合、メガヌクレアーゼの認識・切断部位を挟むトリヌクレオチド反復((CGG)n、(CAG)nまたは(GAA)n)を染色体内相同的組換えで除去する。より正確には、メガヌクレアーゼの使用は、個体の体組織において、切断部位のまわりの領域に相同な染色体DNAが対象の部位で除去されて該対象の部位を修復する(染色体内相同的組換え)のに適当な条件下で、該メガヌクレアーゼの少なくとも一つの認識・切断部位を含む対象の部位に二本鎖破壊を誘発することを含む。

0129

トリヌクレオチド反復疾患としては限定されないが、下記のような遺伝子に影響を与える疾患を含む。
脆弱性X症候群:CGG反復FMR1遺伝子、
−脆弱性XE症候群:CCG反復、FMR2遺伝子、
フリードライヒ運動失調症:GAA反復、X25遺伝子、
緊張筋ジストロフィーCAG反復DMPK遺伝子、
ハンチントン病:CAG反復、HD遺伝子、
骨髄小脳性運動失調:CAG反復、SCA1,2,3,6,7および8遺伝子、
ホーリバー(Haw river)症候群:GAA反復、DRPLA遺伝子。

0130

本発明のさらに別の実施形態において、メガヌクレアーゼを単独で、または上記で規定したターゲティングDNAおよび/または少なくとも一つの適当な賦形剤および/または担体と組み合わせて、優性または複合の異種接合突然変異により起こる遺伝子疾患を予防、改善または治癒するために使用する。

0131

したがって、以下の二つの場合がある。
1. 単独で使用するメガヌクレアーゼ:突然変異の部位における二本鎖破壊を用いて、遺伝子の別のコピーからの相同染色体DNA配列が、該二本鎖破壊が誘発された配列に配列を提供する遺伝子変換事象(染色体間相同的組換え)を介して遺伝子の損傷を修正する。より詳しく述べると、このメガヌクレアーゼの使用は、個体の体組織において該メガヌクレアーゼの少なくとも一つの認識・切断部位を含む対象の部位に、切断部位のまわりの領域に相同な染色体DNAを対象の部位に導入してその対象の部位を修復するのに適切な条件下で、二本鎖破壊を誘発する工程を含む。

0132

2.ターゲティングDNAと組み合わせて使用するメガヌクレアーゼ:該メガヌクレアーゼの使用は、(a) 個体の体組織において、該メガヌクレアーゼの少なくとも一つの認識・切断部位を含む対象の部位に二本鎖切断を誘発し、そして(b)個体にターゲティングDNAを導入する工程を少なくとも含み、該ターゲティングDNAは、(1)切断部位のまわりの領域と相同性を共有するDNAおよび(2)ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に対象の部位を修復するDNAを含む。該ターゲティングDNAは、対象の部位にターゲティングDNAを導入するのに適切な条件下で個体中に導入される。メガヌクレアーゼをコードする配列とターゲティングDNAをコードする配列は同じベクターで運ぶことができる。

0133

本発明によれば、両方の場合で、上記の二本鎖切断は、上記のメガヌクレアーゼを個体に投与することによってイントトで誘発させるか、または該メガヌクレアーゼを個体から取り出して改変した後に個体に戻して体細胞中にエクスビボで導入することによって誘発させる。

0134

優性または複合の異型接合突然変異により引き起こされる遺伝子疾患としては、限定されないが、ハンチントン病、家族性高コレステロール血症、家族性高脂質血症、1型口指顔骨形成異常症候群、優性耳硬化症、バナヤン(Bannayan)症候群、ヘーリー-ヘーリー病軟骨形成不全症を含む。

0135

−抗ウイルス治療
本発明によると、メガヌクレアーゼは、DNA媒介物を示すウイルスまたはレトロウイルスが起こすウイルス疾患の治療における治療剤として使用される。実際に、真核細胞に感染する多くのウイルスが、そのライフサイクルの少なくとも一部分の間に、メガヌクレアーゼにより容易に切断され得る二本鎖DNAからなるゲノムを有する。このストラテジは、ウイルス特異的、すなわちヒトゲノム中には存在しないウイルスゲノム内のDNA配列の同定を含む。一旦同定されると、かような配列に高い親和性と特異性で特異的に結合して切断するメガヌクレアーゼを、本発明にて説明したようなカスタムメイドメガヌクレアーゼの製造法を使って設計できる。次に、設計されたメガヌクレアーゼをウイルス感染症の治療のために用いる。

0136

メガヌクレアーゼまたは該メガヌクレアーゼをコードする発現ベクターは、いずれの簡便な手段で個体内に導入される。カスタムメイドメガヌクレアーゼが、感染された細胞中に導入されるかまたは発現されると、ウイルスは不活性化されおよび/または除かれる。メガヌクレアーゼ治療は、健康な細胞の機能に対する影響がない。同様に、少なくとも一つのメガヌクレアーゼの使用に基づくかような抗ウイルス治療を用いて、異種移植された動物の器官処置できる。

0137

そのライフサイクルの間に二本鎖DNAの段階を含むいずれのウイルスも、ウイルスゲノムに特異的なDNA配列を認識するメガヌクレアーゼを創ることにより、除去または不活性化の標的となり得る。これらのウイルスは、複製型または潜伏型であり得る。これらは、エピソームとしてかまたは宿主のゲノムに組み込まれるかのいずれかでとどまることができる。

0138

二本鎖DNAゲノムウイルスは、本発明で規定されるメガヌクレアーゼを用いることにより処理されるのに非常に適する。これらのうち、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、パポバウイルスおよびポックスウイルスが見出されている。ヘルペスウイルスのうち、単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘ウイルス(VZV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス6、7および8が見出されている。ヘパドナウイルスのうち、ヒトB型肝炎ウイルス(HBV)が見出されている。パピローマウイルスのうち、パピローマウイルス(HPV) (例えばHPV16またはHPV18)およびポリオーマウイルスが見出されている。アデノウイルスのうち、アデノウイルス11および21が見出され、これらは急性出血性膀胱炎に関連する。

0139

レトロウイルスも、本発明によるメガヌクレアーゼを用いることにより処理するのに非常に適する。これらはRNAウイルスであるが、宿主のゲノムに二本鎖DNAの形で組み込まれる。レトロウイルスのうち、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびヒトTリンパ腫ウイルス(HTLV) (例えばHTLV1)が見出されている。

0140

本発明の使用の有利な実施形態では、前記ウイルスは、HIV、HBV、HTLV、HPVおよびHSVから選択される。

0141

いくつかの上記のウイルスは、発癌性に関係することが周知である。バーキットリンパ腫、その他のリンパ組織増殖性の疾患および上咽頭癌におけるEBV;カポジ肉腫におけるヘルペスウイルス8;肝細胞癌におけるHBV;性器の癌におけるHPV;T細胞白血病におけるHTLV-1である。

0142

エピソームウイルスについて、そのゲノムに導入された二本鎖破壊は、ゲノムの直線化およびその分解に導く。エピソームウイルスの例は、HSV-1、EBVおよびHPVである。

0143

組込みウイルス(integrated viruses)について、組み込まれたウイルス配列の中またはその近くに導入された二本鎖破壊は、組み込まれたウイルス配列の部分的または完全な欠失に導く。組込みウイルスの例は、HPV、HTLV、HBVおよびHIVである。欠失にはいくつかの機構が関係し得る。染色体の二本鎖破壊は、相同な染色体との遺伝子変換を誘発し、よってウイルス配列の欠失を導く。二本鎖破壊の近くに直列反復配列(directed repeat sequence)が存在する場合、該破壊はSSA (一本鎖アニーリング)により修復することができ、部分的または完全なウイルスの欠失を導く。2つの二本鎖破壊を導入すると、二本鎖破壊の位置に応じて、染色体は末端結合(end joining)により修復されることができ、ウイルスの部分的または完全な欠失が導かれる。米国特許第5,948,678号(この開示は本明細書に参照として組み込まれる)の実施例5を参照。
標的ウイルスDNA配列が宿主のゲノムに存在しないことを確実にするために、このようなDNA標的配列は、少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも18ヌクレオチド長であるべきである。ホーミングエンドヌクレアーゼは12〜40 bpにわたる認識配列を示すので、この条件は本発明により規定されるカスタムメイドメガヌクレアーゼが充足する。より具体的には、I-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼは22 bpの認識配列を有する。

0144

ウイルスゲノムのいずれのDNA配列も、本発明により規定されるメガヌクレアーゼによる切断のために標的され得る。好ましい標的部位は、ウイルスの株の間で保存され、および/またはその遺伝子がウイルスの増殖および感染性に必須である配列を含む。これらの位置は、少なくとも2つの理由から好ましい。第一に、ウイルスの必須の部分は他より突然変異が少ない。第二に、ウイルスの不活性化を最大限にするためにウイルスの必須の領域を標的することが好ましい。

0145

カスタムメイドメガヌクレアーゼの良好な標的は、ウイルスの複製起点(ori)および/またはori結合タンパク質をエンコードするウイルス遺伝子であり得る。ori結合タンパク質の例は、HSV-1 UL9遺伝子産物、VZV遺伝子51産物、ヒトヘルペスウイルス6B CH6R遺伝子産物、EBVEBNA-1遺伝子産物ならびにHPVE1およびE2遺伝子産物である。HPVについての他の対象の標的は遺伝子E6およびE7であるが、これはこれらの産物が増殖および悪性の表現型の開始および維持に関係するからである。好ましい標的は、HPVのプレコアコア領域内の高度に保存された62ヌクレオチド配列である (E6、E7)。EBVについての対象の標的の例は、遺伝子EBNAおよびLMPである。ウイルスの発癌性効力仲介すると考えられるHTLV-1の遺伝子Taxを標的することは興味深いであろう。HBVについて、対象の標的はX遺伝子であろう。なぜなら、Xタンパク質はDNA修復システムの要素と相互作用しかつp53の変異率を増加させ得るからである。HIVについて、好ましい標的はTAT、REVまたはTAR遺伝子の中にある。ウイルスの標的は、上記の例に限定されない。任意に、標的DNAは、ウイルスの反復配列、例えばITR (逆方向末端反復)およびLTR(長末端反復)であり得る。

0146

好ましくは、少なくとも2つの異なる標的部位を用いる。実際に、ウイルスの主要な防御はそれらの変異する能力である。よって、2つの標的部位は、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを用いることによる処理からウイルスが逃れるのを回避する。さらに、異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼの継続使用により、有害な免疫応答を回避することができる。該異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、異なる当初のメガヌクレアーゼを示すことができ、よって異なる免疫原性を示す。

0147

ウイルスの増殖と感染を阻害するメガヌクレアーゼの効力は、好ましくはインビトロおよびインビボの感染検定法で評価される。かような検定は、第一に、異なるメガヌクレアーゼがウイルスの増殖に有害な作用をする方式でウイルスDNAを切断する可能性を立証するため、細胞培養で実施することができる。この種の予備試験に続いて適当な動物モデルの試験を行う。最後に、臨床試験を行う。

0148

異なるウイルスに適切な宿主および培養条件は大きく変動するので、異なるウイルスは異なるアッセイシステムを必要とする。しかしながら、このような適切な条件は多くのウイルスの培養について記載されており、これらの条件を用いてウイルスおよび/または宿主をメガヌクレアーゼに曝露する効果を試験して、エンドヌクレアーゼがウイルス感染を阻害する能力を決定することができる。特定のウイルスについての培養条件の議論についてはFieldsおよびKnipe編, FIELDS VIROLOGY, 第2版, Raven Press, N.Y. (1990)の第17章を参照。

0149

宿主および/またはウイルスは、感染の経過において、変更しうるいくつかの関係するパラメータに言及すると、種々の回数、種々の条件下で、いくつかの量で、そして種々の賦形剤で曝露して、潜在的な治療効果を達成するメガヌクレアーゼの潜在能力を評価することができる。

0150

さらに、培養細胞においてエクスビボで試験するために、潜在的な治療のメガヌクレアーゼを動物モデルにおいて試験して、単独または他の治療剤との組み合わせのいずれかでの予防、緩和、治療および/または治癒的な能力を評価することができる。ウイルスの培養が可能でなく、全ての生物学的アッセイを動物モデルにおいて行うことが必要な場合がある。異なる動物モデルが異なるウイルスに適切であることが容易に認識されるであろう。しかしながら、いずれの動物モデルも、メガヌクレアーゼの治療的能力を評価するのに用いることができる。

0151

アッセイされるメガヌクレアーゼの潜在的有効量は、動物の適切な個体群に投与することができ、ウイルス感染の経過におけるメガヌクレアーゼの効果は、適切なコントロールとの比較により評価できる。薬理学的効果を評価するためのこのような方法は、当該技術において周知であり、メガヌクレアーゼの治療的プロフィールを測定するのに容易に適応させることができる。

0152

−ゲノム工学(genome engineering)
ゲノム工学は、生細胞および/または生物の遺伝子プログラムにおける変化を誘導するのに用いられる一連の方法である。本発明により得られるメガヌクレアーゼは、細胞ゲノムの合理的な部位特異的改変を許容する。これらの技法の目的は、改変されるべき染色体を、ゲノムの残りの部分を無傷のままにして正確に上書きすることである。ゲノム工学の適用分野は多様である:動物モデルの作製(ノックインまたはノックアウト)、タンパク質産生(産生株エンジニアリングミルク中のタンパク質産生のための植物および動物でのタンパク質産生)、農学的生物工学(形質の付加または除去、マーカーの切り出し)、代謝経路の改変および研究。

0153

本発明による使用の第一の実施形態において、該使用は少なくとも次の工程を含む;
1)メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座で二本鎖破壊を導入する工程、および
2)標的遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入されるべき配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する工程。
実際に、共有されるDNA相同性は、ターゲティングDNA構築物における破壊の部位の上流および下流を挟む領域に位置し、導入されるべきDNAは、2つの腕の間に位置するべきである。該メガヌクレアーゼは、細胞に直接または該メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含みかつ用いられる細胞内のその発現に適する発現ベクターを介して提供され得る。このストラテジを用いて、DNA配列を標的部位に導入し、例えば薬剤の試験またはタンパク質の製造に用い得るノックイン動物モデルまたは細胞系が作製される。

0154

本発明の使用の別の実施形態において、該使用は少なくとも以下の工程を含む;
1) 該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程;
2) 切断部位の周囲の領域と相同な染色体DNAとの相同的組換えに適切な条件下に維持する工程。
このストラテジを用いて、標的部位におけるDNA配列を除き、例えばゲノムの機能試験のためのノックアウト動物の作製または薬剤試験のための適当な動物モデルが作製される。さらにノックアウト動物は、代謝経路の改変を含む細胞株の改良もしくは最適かまたは薬剤試験のための細胞系の作製に用いることができる。

0155

本発明による、体組織に相同的組換えを誘発するメガヌクレアーゼの使用を例示する実施例を参照するさらなる記述と図面によって、本発明をさらに詳解する。しかしこれら実施例は、本発明を例示するためにのみ提供するものであり本発明を決して限定するものではないと解すべきである。

0156

−図1は、単鎖I-Cre Iメガヌクレアーゼのアミノ酸配列および該単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするあるポリヌクレオチドを開示する。タンパク質配列において、2つの最初のN-末端残基はメチオニンとアラニン(MA)であり、3つのC-末端残基はアラニンとアラニンとアスパラギン酸(AAD)である。これらの配列は、NcoI (CCATGG)およびEagI (CGGCCG)制限部位を含むDNAコーディング配列を有することを許容し、これらは種々のベクターにクローニングするのに用いられる。

0157

−図2はポリヌクレオチド配列を開示する。図2Aは、I-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「天然」とよばれるポリヌクレオチドを開示する。図2Bは、I-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「非相同」とよばれるポリヌクレオチド配列を開示する。図2Cは、変異D75NJを含むI-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「鋳型」とよばれるポリヌクレオチド配列を開示する。各I-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼは、N-末端の端に2つのさらなるアミノ酸(MA)およびC-末端の端に3つのさらなるアミノ酸(AAD)を有する。図2Dは、ライブラリUlibIおよびUlibIIを作製するのに用いられるUlibIfor、UlibIrev、UlibIIforおよびUlibIIrevとよばれるプライマーのポリヌクレオチド配列を開示する。

0158

−図3は、D75N変異を含むI-Cre Iホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする「鋳型」とよばれるポリヌクレオチド配列の模式図である。濃い矢印は、2つのライブラリUlibIおよびUlibIIを作製するのに用いられるプライマーUlibIfor、UlibIrev、UlibIIforおよびUlibIIrevの位置を示す。D-ヘリックスはLAGLIDADGヘリックスのことである。N75は変異D75Nのことである。

0159

−図4は、ライブラリ構築のストラテジの模式図である。工程1:pET24C-Tはポリヌクレオチド「鋳型」を含むプラスミドである。2つのPCR増幅、PCRulib1およびulib2は、UlibIforとUlibIIrevまたはUliblIforとUliblIIrevのいずれかを用いて行なわれる。PCR ulib1産物をファージミドpCes4 NHTにクローニングする。PCR ulib2産物をプラスミドpET24C-Tにクローニングする。工程2:Ulib2ベクター(pET45C-Ulib2)の断片のUlib1ファージミド(pCes4-Ulib1)へのサブクローニング。

0160

−図5:COS細胞単層を、I Sce-I (B)を発現するベクターまたはコントロールプラスミド(A)を用いてトランスフェクションする。トランスフェクションの48時間後、細胞をrHSV-1 (30PFU)を用いて感染させる。2日後、単層を固定して染色(X-Gal)する。感染した細胞は青色になった。

0161

−図6:図6A:細胞単層を30PFUで感染させる。HSV-1増殖を、細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼ活性により定量する。図6B:細胞単層を300 PFUで感染させる。細胞の生存率を細胞溶解物中のタンパク質測定により測定する。I-Sce IはI-Sce Iを発現するベクターのことである。I-Sce I(-)は、I Sce-IのORFが逆方向に挿入されたベクターのことである。ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。

0162

−図7:図7Aは、組換えHSV-1のゲノムDNAの模式図である。Lac遺伝子を駆動するCMVプロモーターを含むカセットを、主要LAT転写産物に挿入した。I-Sce I制限部位をプロモーターとレポーター遺伝子との間にクローニングした。aおよびbは、半定量的PCRに用いたプライマーを示す。COS-7単層をI-Sce Iを発現するベクターまたはコントロールプラスミドを用いて感染させた。トランスフェクションの48時間後、細胞をrHSV-1 (30PFU)を用いて感染させた。DNAを感染の1、2または3日後に抽出した。PCRを「実験方法」に記載のようにして行った。Stdは内部標準のことであり;LacはrHSV-1 Lac遺伝子のアンプリコンのことである。I-Sce IはI-Sce Iを発現するベクターのことであり;I-Sce I(-)はI Sce-IのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。図7B;ウイルスのチミジンキナーゼ(TK)遺伝子のPCR定量。PCRを2つのDNA濃度で行なった。I-Sce IはI-Sce Iを発現するベクターのことであり;I-Sce I(-)はI Sce-IのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。

0163

−図8は、トランスフェクションした細胞の感染の後に培地に放出されたウイルスの力価を示す。培地を毎日回収して新鮮な培地を加えた。ウイルスを、標準的なプラークアッセイにより測定した。I-Sce IはI-Sce Iを発現するベクターのことであり;I-Sce I(-)はI Sce-IのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。

0164

−図9は、I-CreIDNA標的および5つの関係する標的を示す。保存された位置は灰色の箱である。
−図10は、6つの標的を用いてLib2ライブラリをスクリーニングした後に得られる4つの結合パターンを示す。陽性のものは最初のスクリーニングで同定され、第二のスクリーニングにおいて確認されたが、その間にそれらは標的のそれぞれ(C1234、C1221、C4334、H1234、H1221およびH4334)について8回アッセイされた(8つの立方のバーに対応する)。ヒストグラムは各クラスからの1つのクローンについて示される。標的は図9に示す。

0165

−図11は、標的ベクターの模式図を示す。CpG欠失LacZ遺伝子(LagoZ)は、ヒト伸長因子1アルファプロモーターにより駆動される。LagoZ遺伝子は、I-SceI切断部位の挿入により不活性化される。挟む反復を白抜きの矢印で示す。相同配列の長さをボールドで示す。

0166

−図12は、一本鎖アニーリング(SSA)効率に対する相同性の長さの影響を示す。細胞単層を、等モル量の異なる長さの相同反復配列を有する標的プラスミドおよびISce-Iを発現するベクターを用いるかまたはコントロールプラスミドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞を回収して細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼ活性を定量した。(+)I-SceI、I-SceIを発現するベクターを用いた共トランスフェクション;(-)I-SceI、I-SceIのORFが逆方向に挿入された発現ベクターを用いた共トランスフェクション。

0167

−図13:細胞単層を(+)I-SceIを発現するベクターまたはコントロールプラスミド(-)I-SceIを用いて共トランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞を固定して染色した(X-Gal)。図13A:遺伝子修復が起こった細胞が暗く現れた。図13B:70および220 bp重複標的ベクター上のI-SceI誘導組換えの頻度。頻度は、青色の細胞/トランスフェクションされた細胞の比により計算される。

0168

−図14A:標的LagoZ遺伝子(30μg)およびI-SceI発現ベクター(10μg)の混合物を注射されたマウスからの肝臓のX-Gal染色。図14B:標的LagoZ遺伝子(30μg)およびI-SceIのORFが逆方向に挿入された発現ベクター(10μg)の混合物を注射されたマウスからの肝臓のX-Gal染色。

0169

−図15:IVにより「Ad.I-SceI」アデノウイルスを用いて感染させた2つの独立した系統半接合体トランスジェニックマウスの肝臓のX-Gal染色。A. 感染の5日後、β-ガラクトシダーゼ活性が、1010感染性単位で感染された「58A」半接合体の肝臓全体の多数の細胞で検出される。これに比べて、「Ad.control」で感染された半接合体または感染していない「58A」同腹子の肝臓のX-Gal染色により、β-ガラクトシダーゼ活性は検出できない(データ示さず)。B.およびC. 感染の14日後、β-ガラクトシダーゼ活性が、109感染性単位で感染されたマウス(B)および1010感染性単位で感染されたマウス(C)の肝臓全体の多数の細胞で検出される。より強いシグナルはBに比べてCで検出され、これはおそらくより多数の細胞が「Ad.I-SceI」を用いて感染されたからであろう。これに比べて、感染していない「361」同腹子の肝臓のX-Gal染色により、β-ガラクトシダーゼ活性は検出できない(データ示さず)。

0170

−図16:肝臓抽出物の蛍光β-ガラクトシダーゼアッセイ。トランスジェニックマウスの2つの独立した系統(58 Aおよび361)に109または1010PFUのI-SceIを発現するアデノウイルス(Ad.I-SceI)またはコントロールウイルス(Ad.control)を注入した。マウスを注射の5または14日後に犠牲にし、肝臓を切開し、タンパク質を抽出した。肝臓タンパク質抽出物30μlを37℃でフルオレセインガラクトシド(FDG)の存在下にインキュベートした。バーは、アッセイの標準偏差を示す(同じ抽出物のサンプルを用いて2回の測定実験)。NI:注射されていないマウス;Ad.I-SceI:I-SceIを発現するアデノウイルスを注射したマウス;Ad.control:コントロールアデノウイルスを注射したマウス。

0171

−図17は、実施例7で用いた導入遺伝子、DNA修復マトリックスおよびプライマーの配列を示す。
−図18は、マウスにおけるI-SceI誘導遺伝子変換によるI-SceI-hApo A-I導入遺伝子修復のRT-PCR分析を説明する。3〜4週齢のトランスジェニックマウス(ライン14Aおよび21)へのの(naked) DNA (I-SceI発現ベクターおよびDNA修復マトリックス)の流体力学尾部静脈注射(hydrodynamic tail vein injection)。A:2kbpのDNA修復マトリックス(RM)およびB:1.5 kbpのRM。CHO細胞におけるI-SceI-hApo A-I導入遺伝子についてのI-SceI誘導遺伝子変換を、PCRのポジティブコントロールとして用いた。

0172

実施例1:ダイマーホーミングエンドヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
いくつかのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、ホモダイマーとして活性である。各モノマーはそれらのドデカペプチドモチーフを介して主にダイマー化する。単鎖メガヌクレアーゼは、この酵素の2つのサブユニットの間に共有結合を導入するようにして改変された2つのモノマーを共有結合させることによりつくることができる。好ましくは、共有結合は2つのモノマーの間にペプチド結合を創ることにより導入される。しかしながら、他の簡便な共有結合も意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、単鎖I-Cre Iおよび単鎖I-Ceu Iのような同じホーミングエンドヌクレアーゼからの2つのサブユニットを含むのが好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは多数の利点を有する。例えば、単鎖メガヌクレアーゼはより操作(manipulate)しやすい。単鎖メガヌクレアーゼは、ダイマー構造に比べて例えば標的配列の認識のために熱力学的に好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは、オリゴマー化の制御を許容する。

0173

I-CreIの単鎖バージョン(scI-CreI)を手本とし作製した。scI-CreIは、その同種の(cognate) DNA基質をインビトロで切断し、酵母および哺乳動物細胞の両方において相同的組換えを誘発する。

0174

−単鎖I-CreIメガヌクレアーゼの設計
Chlamydomonas reinhardtiiからのI-CreIは、小さいLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼであり、これはより大きいモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのものに類似の構造にダイマー化する。I-CreIの単鎖バージョン(scI-CreI)をつくるために、2つのI-CreIコピーを融合させた。このことは2つのドメインの間にリンカー領域を配置することを必要とし、I-CreIタンパク質のかなりの部分がリンカーに先行するドメインの末端で除去されなければならなかった。

0175

I-DmoIの三次元構造は、I-DmoIはある明確なドメインから他のドメインへ導くリンカー領域を含むことを除いてI-CreIのものに匹敵する。このリンカーの境界は、I-CreIダイマーの関係する主鎖原子に精巧に調和する。第一のドメインにおいて、I-CreIとI-DmoIの第三のα-ヘリックスからの残基93〜95 (リンカーに先行する)は、構造的に等しい。第二のLAGLIDADGα-ヘリックスの最初(第二のドメイン)では、I-DmoIの残基104〜106はI-CreIの残基7〜9に対応する。さらに、I-DmoIからのLeu95およびGlu105は、I-CreIにおいて同一性を保存しており、I-DmoIの残基Arg104はI-CreI中の別の塩基性残基(Lys7)と整列する。つまり、単鎖I-CreI (scI-CreI)は、残基94〜104 (配列MLERIRLFNMR)のI-DmoIリンカー領域を第一のI-CreIドメイン(Pro93で終結)と第二のI-CreIドメイン(Glu8から開始)との間に挿入することにより設計された。

0176

どのようにして新しいリンカーがscI-CreIタンパク質ドメイン(手本とした構造において)を連結するかの詳細な構造解析により、矛盾の可能性(potential incompatibility)は見られなかった。例えば、I-DmoIからの非極性アミノ酸の側鎖であるMet94、Ile98およびPhe109は、内部に向いてI-CreIのキャビティフィットする。しかしながら、単一の突然変異(P93A)を作製してリンカー領域に先行するα-ヘリックスにおける主軸(backbone)の規則性を促進した(アミノ酸およびポリヌクレオチド配列について図1を参照)。

0177

−材料および方法
タンパク質の発現および精製
Hisタグをつけたタンパク質を、pET-24d (+)ベクター(Novagen)を用いてE. coliBL21 (DE3)細胞で過剰発現させた。IPTG (1mM)を用いて25℃で誘導した。細胞をプロテアーゼ阻害剤(CompleteEDTA-フリータブレット、Roche)および5% (v/v)グリセロールを含有する25mMHEPES(pH 8)溶液中で超音波破砕した。細胞溶解物を2回遠心分離した(15 000 g、30分間)。次いでHisタグをつけたタンパク質を、コバルトをのせた5mlのHi-Trapキレティングカラム(Amersham)を用いて親和性精製した。イミダゾールの直線勾配(0.25Mイミダゾールまで、続いて0.5Mイミダゾールおよび0.5M NaClのプラトー)を用いる溶出の間にいくつかのフラクションを回収した。タンパク質に富むフラクション(SDS-PAGEにより測定)を、10kDaカットオフセントリプレップAmiconシステムを用いて濃縮した。最後に得られたサンプルをSuperdex75PGHi-Load 26-60カラム(Amersham)での排除クロマトグラフィーにより精製した。回収したフラクションをSDS-PAGEに付した。選択したタンパク質フラクションを濃縮して25mM HEPES (pH 7.5)および20% (v/v)グリセロールの溶液に対して透析した。

0178

インビトロ切断アッセイ
単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMプラスミドを、まずXmnIを用いて直線化した。切断アッセイを37℃または65℃で12.5mMHEPES(pH 8)、2.5% (v/v)グリセロールおよび10mM MgCl2の中で行なった。反応を0.1容量の0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、0.25 MEDTA、5% (w/v) SDSおよび0.5 mg/mlのプロテイナーゼKの添加および37℃で20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を、1%アガロースゲルでの電気泳動による分離の後に調べた。

0179

酵母比色アッセイ
酵母の形質転換法を、以前のプロトコルから適合させた。染色には、伝統的な定性のX-Galアガロースオーバーレイアッセイ(Agarose Overlay Assay)を用いた。各プレートを、60℃で0.1 M燐酸ナトリウムバッファー、pH 7.0、0.2% SDS、12%ジメチルホルムアミド(DMF)、14 mM β-メルカプトエタノール、0.4% X-Gal中の1%アガロース2.5 mlで被覆した。プレートを37℃でインキュベーションした。

0180

哺乳動物細胞アッセイ
COS細胞を、Superfectトランスフェクション試薬を用いて、供給業者(Qiagen)のプロトコルに従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞をPBS1Xで2回リンスし、溶解バッファー(Tris-HCl 10mM pH7.5、NaCl 150mM、トリトンX100 0.1 %、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)中でインキュベーションした。溶解物を遠心分離し、上清タンパク質濃度測定およびβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイに用いた。典型的に、抽出物30μlを3μlのMg 100Xバッファー(MgCl2 100mM、β-メルカプトエタノール35%)、33μlのONPG8 mg/mlおよび234μlのリン酸ナトリウム0.1M pH7.5と合わせた。37℃でのインキュベーション後、反応を500μlの1M Na2CO3で停止してODを415nmで測定した。相対的なβ-ガラクトシダーゼ活性を、このODの関数として測定し、反応時間およびタンパク質の全量で標準化する。

0181

−結果:単鎖I-CreIはそのDNA基質をインビトロおよび生細胞内で切断する
新規な酵素に対応する合成遺伝子をつくり、scI-CreIタンパク質をE. coliで過剰発現させた。精製scI-CreIのインビトロでDNA基質を切断する能力を、I-CreIホーミング部位のコピーを有する直線化したプラスミドを用いて試験した。親のI-CreIと同様に、新規な酵素はI-CreI標的部位を37℃で切断する。

0182

インビボでのscI-CreIの機能性を試験するために、酵母および哺乳動物細胞でのメガヌクレアーゼにより誘導された相同的組換えをモニターするためのアッセイを設計した。酵母、ツメガエル(Xenopus)の卵母細胞および哺乳動物細胞においては、2つの直列反復の間のDNA切断が、これらの反復の間の相同的組換えを非常に高レベルで誘導することが知られている。単鎖アニーリング(SSA)としばしばよばれる組換え経路は、1つの反復ユニットおよび全ての介在配列を除去する。つまり、細菌のLacZ遺伝子の2つの短縮された非機能的コピーおよび介在配列内のI-CreI切断部位を有するSSAレポーターベクターを、酵母複製プラスミド内で構築した。切断部位の切断は、X-gal染色により簡単に検出され得る機能的なユニークLacZコピーをもたらすはずである。

0183

レポーターベクターを酵母細胞を形質転換するのに用いた。細胞のわずかのフラクションが機能性LacZを発現したようであり、これはおそらく形質転換の間の組換え事象による。これに比べて、I-CreIまたはscI-CreIのいずれかを発現するプラスミドとの共形転換(co-transformation)は、プレートに播種した全ての細胞に青色の染色をもたらした。非誘導条件(グルコース)の下でさえも、タンパク質の残存レベルはSSAを誘導するのに充分であり、このことは、scI-CreIが、I-CreIと同程度に、酵母細胞内で非常に有効であることを示唆する。さらに、SSA誘導はI-CreIタンパク質による標的切断部位の切断に完全に依存した。なぜなら、この部位を欠くベクターはバックグラウンドのレベルに比べてβ-ガラクトシダーゼ活性の増加がないからである。

0184

SSAアッセイを、哺乳動物細胞での試験のために改変した。レポーターおよびメガヌクレアーゼ発現プラスミドプロモーター配列終結配列を変更して、プラスミド組換えを一過性トランスフェクションアッセイにおいて評価した。scI-CreIまたはI-CreIのいずれかを用いて、同様のレベルの組換え(2〜3倍の増加)の誘導が観察された。酵母での実験のように、I-CreI切断部位がないとβ-ガラクトシダーゼの増加がないので、組換えは反復の間のI-CreI切断部位に依存する。

0185

逆方向反復の間の組換えに基づく別の組換えアッセイも、COS細胞でのメガヌクレアーゼに誘導される組換えをモニターするために用いた。直列反復がSSAにより組換え可能であるので、間接反復(indirect repeat)の間の相同的組換えは遺伝子変換事象を必要とする。遺伝子変換の同様の刺激(3〜4倍)が、scI-CreIまたはI-CreIのいずれかを用いて観察された。真の相同的組換え事象に予想されるように、相同の供与体鋳型の不在下では増強が観察されなかった。

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