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技術 生物学的試料からの核酸の抽出のための前処理方法、およびそのためのキット

出願人 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー
発明者 マシューコリスドナルドコパチーノカレンエッカートトーマスフォート
出願日 2004年2月6日 (17年9ヶ月経過) 出願番号 2006-502990
公開日 2006年7月20日 (15年4ヶ月経過) 公開番号 2006-517298
状態 未登録
技術分野 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 双極子力 加熱手順 総括表 繰越し 前処理プロセス 誘導双極子 模擬実験 永久双極子
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課題・解決手段

本発明は、核酸の抽出のために生物学的試料を前処理するための方法に関する。本発明は、以下の要素の1つまたは複数と、少なくとも1つのタンパク質変性剤組合せを採用して、核酸の抽出のための反応混合物を形成する:(1)少なくとも1つの非プロトン性溶剤、(2)段階的加熱、および(3)試料希釈

概要

背景

微生物の同定のための核酸に基づく遺伝学的な方法は、臨床診断関与する時間および労力を大いに削減してきている。そのような方法は、例えば、核酸ハイブリダイゼーション(例えば、Southerns/マイクロアレイおよびスロットブロット)、ヌクレオチド配列決定、核酸クローニング技術、核酸の制限消化、および核酸増幅を含む。特に、核酸増幅は、特異的遺伝子または遺伝子断片増幅および検出による微生物の迅速、高感度および特異的な同定のための手段を提供している。診断方法としての使用のためには、これらの核酸分析血漿および全血試料のような生物学的試料に適用することが特に興味深い。微生物の検出および同定のための核酸に基づく方法の有用性に先立ち血液培養することによって微生物の存在に関して血漿および血液試料を分析した。しかしながら、核酸分析のための臨床試料処理加工は、培養のための試料処理加工とは異なる基準を要する。例えば、核酸は、分析のために適当な形態で微生物から放出されなければならず;核酸は、分析の生化学的反応のために好適な成分、イオン強度、およびpHを有する組成物中に存在しなければならず;および、ヌクレアーゼのような反応の阻害剤が臨床試料中に存在するか、あるいは試料処理加工の間に導入される場合には、該阻害剤を取り除くかまたは非阻害性にしなければならない。

1つの潜在的な生化学検出方法は、核酸ハイブリダイゼーションの使用を含む。核酸中に具現化される配列特異性は、核酸ハイブリダイゼーションによって、事実上任意の2つの種を差別化することを可能にする。特定ヌクレオチド配列の検出のための標準的な技術は、一般的に、細胞タンパク質および他の細胞汚染物質から分離して精製された核酸を用いる。精製の最も一般的な方法は、細胞をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で溶解すること、プロテイナーゼK(ProK)で消化すること、および、フェノールクロロホルム、およびイソアミルアルコールのような有機溶剤で抽出することによって残留するタンパク質および他の分子を取り除くことを含む。

細胞可溶化の間に放出される内因性のヌクレアーゼは、無傷の核酸、特にリボ核酸(RNA)を回収するための努力を無効にする可能性がある。デオキシリボヌクレアーゼDNアーゼ)は、溶解溶液(lysis solution)に対するキレート剤の添加によって容易に不活性化される一方で、リボヌクレアーゼRNアーゼ)は、除去することがはるかに困難である。RNアーゼは遍在し、人間の手の上に見つけられる油の中にさえ存在する。従って、RNアーゼから保護することは、あらゆる標準的なRNA調製技術の一般的に広く認められた局面である。膵臓のRNアーゼ実験用ストックを調製するための標準的な手順は、酵素溶液を15分間煮沸することである。この処理の目的は、全ての痕跡量汚染酵素の活性破壊することである。なぜならば、他の酵素は煮沸すると生き残れないからである。

非特許文献1(一般的に模範とされる実験操作の概説)は、実験室におけるRNアーゼ汚染を避けるために、幅広予防策推奨する(非特許文献1参照)。そのような予防策は、RNアーゼを含まないガラス製品加圧滅菌された水、および、焼いたスパチュラ排他的に分配される、RNAを伴う作業用に確保された薬品を用いて、RNAと接触する全ての溶液を調製することを含む。実験用試薬からRNアーゼを除去することに加えて、典型的には、RNアーゼ阻害剤を溶解溶液中に含ませる。これらは、一般的に細胞溶解の間に活性化される、内因性のRNアーゼを破壊することを意図する。また、ピロ炭酸ジエチル(DEPC)処理された水にRNAを可溶化することは、一般的な操作である。さらに、RNA試料の取り扱いを改善するための試みにおいて、RNAの長期貯蔵のための可溶化剤として、ホルムアミドテストされてきている(非特許文献2参照)。

RNアーゼから保護することは、厄介でかつ費用がかかり、および典型的な抽出手順は、苛性溶剤の取り扱い、水浴へのアクセス換気フード、および遠心分離機、および有害廃棄物貯蔵および処分までもを必要とする。未分画(unfractionated)の可溶化された生物学的試料の直接分析は、これらの精製技術の費用および不都合を回避するであろう。

米国特許第5,973,138号明細書
Molecular Cloning、第3版(2001)、Sambrookら
Nucleic AcidsResearch 20、3791-3792 (1992)、P. Chomczynski

概要

本発明は、核酸の抽出のために生物学的試料を前処理するための方法に関する。本発明は、以下の要素の1つまたは複数と、少なくとも1つのタンパク質変性剤組合せを採用して、核酸の抽出のための反応混合物を形成する:(1)少なくとも1つの非プロトン性溶剤、(2)段階的加熱、および(3)試料希釈

目的

膵臓のRNアーゼ実験用ストックを調製するための標準的な手順は、酵素の溶液を15分間煮沸することである

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
4件

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請求項1

少なくとも1つのタンパク質変性剤および少なくとも1つの非プロトン性溶媒試料を処理することを含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理する方法。

請求項2

該タンパク質変性剤が、タンパク質分解酵素洗剤界面活性剤溶剤アミド類還元剤塩基タンパク質変性させる塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項3

該タンパク質変性剤が、プロテイナーゼK、プロナーゼペプシントリプシンキモトリプシンカルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項4

該タンパク質分解酵素がプロテイナーゼKであることを特徴とする請求項3に記載の方法。

請求項5

該タンパク質変性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムドデシル硫酸リチウムポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、NP−40、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム臭化セチルトリメチルアンモニウム、3[(3−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホナート、およびポリエチレングリコールt−オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される洗剤であることを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項6

該タンパク質変性剤が界面活性剤であることを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項7

該タンパク質変性剤が、フェノールクロロホルム、およびイソアミルアルコールからなる群から選択される溶剤であることを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項8

該タンパク質変性剤が、N−エチルアセトアミド、N−ブチルアセトアミドおよびN,N−ジメチルアセトアミドからなる群から選択されるアミドであることを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項9

該タンパク質変性剤が、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、およびジチオトレイトールからなる群から選択される還元剤であることを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項10

該タンパク質変性剤がKOH、NaOH、NH4OH、およびCa(OH)2からなる群から選択される塩基であることを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項11

該タンパク質変性剤がNaCl、KCl、LiCl、NH4Cl、(NH4)2SO4、および過塩素酸塩からなる群から選択される、タンパク質を変性させる塩であることを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項12

該非プロトン性溶媒が、ホルムアミドジメチルホルムアミドジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリルベンゼントルエンアセトンシクロヘキサン、n−ヘプタン二酸化硫黄、およびヘキサメチルホスホルアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項13

該非プロトン性溶媒がホルムアミドであることを特徴とする請求項12に記載の方法。

請求項14

該方法が約4℃以上の温度で行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項15

該方法が約25℃から約95℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項16

該方法が約65℃から約85℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項17

該方法が約55℃から約85℃の温度範囲で段階的に加熱することによって行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項18

該プロテイナーゼKの濃度が生物学的試料のミリリットルあたり約1から約100単位であることを特徴とする請求項4に記載の方法。

請求項19

該生物学的試料が希釈または濃縮されることを特徴とする請求項18に記載の方法。

請求項20

該ホルムアミドの濃度が約10体積%から約80体積%であることを特徴とする請求項13に記載の方法。

請求項21

該核酸がRNAであることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項22

試薬はタンパク質変性剤および非プロトン性溶媒の両方であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項23

該方法が、処理された試料を希釈剤で希釈することをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項24

該希釈剤が、水、水性緩衝液、および非プロトン性溶媒からなる群から選択されることを特徴とする請求項23に記載の方法。

請求項25

該方法が約4℃以上の温度で行われることを特徴とする請求項24に記載の方法。

請求項26

該方法が約25℃から約95℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項25に記載の方法。

請求項27

該方法が固体担体の存在をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項28

該固体担体が、酸化鉄シリカ被覆された粒子、シリカで被覆された膜、ガラス繊維マットガラス膜ガラス類ゼオライト、およびセラミックスからなる群から選択されることを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項29

試料を少なくとも1つのタンパク質変性剤と混合すること、および混合物を段階的に加熱することを含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理する方法。

請求項30

該段階的加熱が約55℃から約85℃の温度範囲であることを特徴とする請求項29に記載の方法。

請求項31

試料を少なくとも1つのタンパク質変性剤で処理して反応混合物を形成すること、および該反応混合物を希釈剤で希釈することを含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理する方法。

請求項32

該希釈剤が、水、水性緩衝液、および非プロトン性溶媒からなる群から選択されることを特徴とする請求項31に記載の方法。

請求項33

該方法が約4℃以上の温度で行われることを特徴とする請求項31に記載の方法。

請求項34

該方法が約25℃から約95℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項33に記載の方法。

請求項35

少なくとも1つのタンパク質変性剤および少なくとも1つの非プロトン性溶媒を含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理するための反応混合物。

請求項36

該タンパク質変性剤が、タンパク質分解酵素、洗剤、界面活性剤、溶剤、アミド類、還元剤、塩基、タンパク質を変性させる塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とすることを特徴とする請求項35に記載の反応混合物。

請求項37

該タンパク質変性剤が、プロテイナーゼK、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であることを特徴とすることを特徴とする請求項36に記載の反応混合物。

請求項38

該タンパク質分解酵素がプロテイナーゼKであることを特徴とすることを特徴とする請求項37に記載の反応混合物。

請求項39

該タンパク質変性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、NP−40、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、3[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホナート、およびポリエチレングリコールt−オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される洗剤であることを特徴とする請求項36に記載の反応混合物。

請求項40

該タンパク質変性剤が界面活性剤であることを特徴とすることを特徴とする請求項36に記載の反応混合物。

請求項41

該タンパク質変性剤が、フェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコールからなる群から選択される溶剤であることを特徴とすることを特徴とする請求項36に記載の反応混合物。

請求項42

該タンパク質変性剤が、N−エチルアセトアミド、N−ブチルアセトアミドおよびN,N−ジメチルアセトアミドからなる群から選択されるアミドであることを特徴とする請求項36に記載の反応混合物。

請求項43

該タンパク質変性剤が、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、およびジチオトレイトールからなる群から選択される還元剤であることを特徴とする請求項36に記載の反応混合物。

請求項44

該タンパク質変性剤が、KOH、NaOH、NH4OH、および(CaOH)2からなる群から選択される塩基であることを特徴とする請求項36に記載の反応混合物。

請求項45

該タンパク質変性剤が、NaCl、KCl、LiCl、NH4Cl、(NH4)2SO4、および過塩素酸塩からなる群から選択される、タンパク質を変性させる塩であることを特徴とする請求項36に記載の反応混合物。

請求項46

該非プロトン性溶媒が、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、アセトン、シクロヘキサンおよびn−ヘプタン、二酸化硫黄、およびヘキサメチルホスホルアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項35に記載の反応混合物。

請求項47

該非プロトン性溶媒がホルムアミドであることを特徴とする請求項46に記載の反応混合物。

請求項48

該処理が約4℃以上の温度で行われることを特徴とする請求項35に記載の反応混合物。

請求項49

該処理が約25℃から約95℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項48に記載の反応混合物。

請求項50

該処理が約70℃から約85℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項35に記載の反応混合物。

請求項51

該処理が、約55℃から約85℃の温度範囲で段階的に加熱することによって行われることを特徴とする請求項35に記載の反応混合物。

請求項52

該プロテイナーゼKの濃度が、生物学的試料のミリリットルあたり約1から約100単位であることを特徴とする請求項38に記載の反応混合物。

請求項53

該ホルムアミドの濃度が、約10体積%から約80体積%であることを特徴とする請求項47に記載の反応混合物。

請求項54

固体担体をさらに含むことを特徴とする、請求項35に記載の反応混合物。

請求項55

該固体担体が、酸化鉄、シリカで被覆された粒子、シリカで被覆された膜、ガラス繊維マット、ガラス膜、ガラス類、ゼオライト、およびセラミックスからなる群から選択されることを特徴とする請求項54に記載の反応混合物。

請求項56

少なくとも1つのタンパク質変性剤および少なくとも1つの非プロトン性溶媒を含むことを特徴とする、核酸の抽出のために生物学的試料を処理するためのキット

請求項57

該タンパク質変性剤が、タンパク質分解酵素、洗剤、界面活性剤、溶剤、アミド類、還元剤、タンパク質を変性させる塩、塩基類、およびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項56に記載のキット。

請求項58

該タンパク質変性剤が、プロテイナーゼK、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項57に記載のキット。

請求項59

該タンパク質分解酵素がプロテイナーゼKであることを特徴とする請求項58に記載のキット。

請求項60

該非プロトン性溶媒が、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、アセトン、シクロヘキサンおよびn−ヘプタン、二酸化硫黄、およびヘキサメチルホスホルアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項56に記載のキット。

請求項61

該非プロトン性溶媒がホルムアミドであることを特徴とする請求項60に記載のキット。

請求項62

固体担体をさらに含むことを特徴とする請求項61に記載のキット。

請求項63

該固体担体が、酸化鉄、シリカで被覆された粒子、シリカで被覆された膜、ガラス繊維マット、ガラス膜、ガラス類、ゼオライト、およびセラミックスからなる群から選択されることを特徴とする請求項62に記載のキット。

請求項64

少なくとも1つのタンパク質変性剤および少なくとも1つの非プロトン性溶媒で試料を処理することによって抽出されることを特徴とする、生物学的試料から抽出される核酸。

請求項65

該タンパク質変性剤が、タンパク質分解酵素、洗剤、界面活性剤、溶剤、アミド類、還元剤、塩基、タンパク質を変性させる塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項64に記載の核酸。

請求項66

該タンパク質変性剤が、プロテイナーゼK、プロナーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項65に記載の核酸。

請求項67

該タンパク質分解酵素がプロテイナーゼKであることを特徴とする請求項66に記載の核酸。

請求項68

該非プロトン性溶媒が、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、アセトン、シクロヘキサンおよびn−ヘプタン、二酸化硫黄、およびヘキサメチルホスホルアミドからなる群から選択されることを特徴とする請求項64に記載の核酸。

請求項69

該非プロトン性溶媒がホルムアミドであることを特徴とする請求項68に記載の核酸。

請求項70

該核酸がRNAであることを特徴とする請求項64に記載の核酸。

技術分野

0001

本発明は、解析のための、血漿および血液試料のような生物学的試料を処理する方法に関する。より具体的には、本発明は、ハイブリダイゼーション増幅および検出のような、後続核酸解析と適合する生物学的試料の処理加工方法に関する。

背景技術

0002

微生物の同定のための核酸に基づく遺伝学的な方法は、臨床診断関与する時間および労力を大いに削減してきている。そのような方法は、例えば、核酸ハイブリダイゼーション(例えば、Southerns/マイクロアレイおよびスロットブロット)、ヌクレオチド配列決定、核酸クローニング技術、核酸の制限消化、および核酸増幅を含む。特に、核酸増幅は、特異的遺伝子または遺伝子断片の増幅および検出による微生物の迅速、高感度および特異的な同定のための手段を提供している。診断方法としての使用のためには、これらの核酸分析を血漿および全血試料のような生物学的試料に適用することが特に興味深い。微生物の検出および同定のための核酸に基づく方法の有用性に先立ち血液培養することによって微生物の存在に関して血漿および血液試料を分析した。しかしながら、核酸分析のための臨床試料処理加工は、培養のための試料処理加工とは異なる基準を要する。例えば、核酸は、分析のために適当な形態で微生物から放出されなければならず;核酸は、分析の生化学的反応のために好適な成分、イオン強度、およびpHを有する組成物中に存在しなければならず;および、ヌクレアーゼのような反応の阻害剤が臨床試料中に存在するか、あるいは試料処理加工の間に導入される場合には、該阻害剤を取り除くかまたは非阻害性にしなければならない。

0003

1つの潜在的な生化学検出方法は、核酸ハイブリダイゼーションの使用を含む。核酸中に具現化される配列特異性は、核酸ハイブリダイゼーションによって、事実上任意の2つの種を差別化することを可能にする。特定ヌクレオチド配列の検出のための標準的な技術は、一般的に、細胞タンパク質および他の細胞汚染物質から分離して精製された核酸を用いる。精製の最も一般的な方法は、細胞をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で溶解すること、プロテイナーゼK(ProK)で消化すること、および、フェノールクロロホルム、およびイソアミルアルコールのような有機溶剤で抽出することによって残留するタンパク質および他の分子を取り除くことを含む。

0004

細胞可溶化の間に放出される内因性のヌクレアーゼは、無傷の核酸、特にリボ核酸(RNA)を回収するための努力を無効にする可能性がある。デオキシリボヌクレアーゼDNアーゼ)は、溶解溶液(lysis solution)に対するキレート剤の添加によって容易に不活性化される一方で、リボヌクレアーゼRNアーゼ)は、除去することがはるかに困難である。RNアーゼは遍在し、人間の手の上に見つけられる油の中にさえ存在する。従って、RNアーゼから保護することは、あらゆる標準的なRNA調製技術の一般的に広く認められた局面である。膵臓のRNアーゼ実験用ストックを調製するための標準的な手順は、酵素溶液を15分間煮沸することである。この処理の目的は、全ての痕跡量汚染酵素の活性破壊することである。なぜならば、他の酵素は煮沸すると生き残れないからである。

0005

非特許文献1(一般的に模範とされる実験操作の概説)は、実験室におけるRNアーゼ汚染を避けるために、幅広予防策推奨する(非特許文献1参照)。そのような予防策は、RNアーゼを含まないガラス製品加圧滅菌された水、および、焼いたスパチュラ排他的に分配される、RNAを伴う作業用に確保された薬品を用いて、RNAと接触する全ての溶液を調製することを含む。実験用試薬からRNアーゼを除去することに加えて、典型的には、RNアーゼ阻害剤を溶解溶液中に含ませる。これらは、一般的に細胞溶解の間に活性化される、内因性のRNアーゼを破壊することを意図する。また、ピロ炭酸ジエチル(DEPC)処理された水にRNAを可溶化することは、一般的な操作である。さらに、RNA試料の取り扱いを改善するための試みにおいて、RNAの長期貯蔵のための可溶化剤として、ホルムアミドテストされてきている(非特許文献2参照)。

0006

RNアーゼから保護することは、厄介でかつ費用がかかり、および典型的な抽出手順は、苛性溶剤の取り扱い、水浴へのアクセス換気フード、および遠心分離機、および有害廃棄物貯蔵および処分までもを必要とする。未分画(unfractionated)の可溶化された生物学的試料の直接分析は、これらの精製技術の費用および不都合を回避するであろう。

0007

米国特許第5,973,138号明細書
Molecular Cloning、第3版(2001)、Sambrookら
Nucleic AcidsResearch 20、3791-3792 (1992)、P. Chomczynski

発明が解決しようとする課題

0008

前述を考慮すると、血漿および血液のような生物学的試料を分析用核酸の抽出のために処理することができる、簡単かつ迅速な方法の必要性が存在する。

課題を解決するための手段

0009

本発明は、血漿および血液のような生物学的試料を、核酸の抽出のために処理する簡単かつ迅速な方法の必要性に取り組む。1つの実施形態では、本発明の方法は、生物学的試料を少なくとも1つのタンパク質変性剤と混合すること、および混合物を約55℃から約85℃までの温度範囲で段階的に加熱して反応混合物を形成することによって、核酸の抽出のための生物学的試料を前処理する。別の実施形態では、本発明の方法は、生物学的試料を約55℃から約85℃までの温度範囲で少なくとも1つのタンパク質変性剤と混合して反応混合物を形成すること、および該反応混合物を水溶液または非プロトン性溶媒希釈することによって、生物学的試料を前処理する。さらに別の実施形態では、本発明の方法は、約4℃以上において、少なくとも1つのタンパク質変性剤および少なくとも1つの非プロトン性溶媒で試料を処理して核酸分析のための反応混合物を形成することによって、核酸の抽出のための生物学的試料を前処理する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、約25℃以上において、少なくとも1つのタンパク質変性剤および少なくとも1つの非プロトン性溶媒で試料を処理することによって、生物学的試料を前処理する。本発明の例示的な実施形態では、タンパク質変性剤としてProKを使用し、非プロトン性溶媒としてホルムアミドを使用し、および約55℃から約85℃の範囲の温度で約30分間にわたって処理を実施する。

発明を実施するための最良の形態

0010

また、本明細書中で使用される際に、用語「精製する」および「精製」は、抽出する/抽出および単離する/単離を含む。

0011

本発明は、核酸の抽出のために生物学的試料(例えば、血漿および全血試料のようなもの、しかしそれらに限定されるものではない)を処理する組成物および方法である。本発明は、以下の要素のうち1つまたは複数と、少なくとも1つのタンパク質変性剤の組合せを採用して、核酸の抽出のための反応混合物を形成する:(1)少なくとも1つの非プロトン性溶媒、(2)段階的加熱、および(3)試料希釈。

0012

本発明に従って使用される生物学的試料は、核酸を含有する任意の生物学的材料であってもよく、該材料は、例えば、臨床試料、法医学的試料、または環境試料のようなものであるが、それらに限定されるものではない。これらの試料は、原核細胞および真核細胞ウィルスバクテリオファージマイコプラズマプロトプラスト、および細胞小器官を含む任意のウィルス性材料または細胞性材料を含有してもよい。そのような生物学的材料は、哺乳類および非哺乳類動物細胞植物細胞ラン藻を含む藻類菌類バクテリア酵母菌および原生動物の全タイプを含んでもよい。代表的な例は、血液、ならびに全血、血漿および血清のような血液由来製剤;精液、尿、糞便組織細胞培養物および細胞浮遊液鼻咽頭吸引物、および頸管内、、眼、咽喉および口腔綿棒採集標本を含む綿棒採集標本のような臨床標本;および指爪、皮膚、毛および脳脊髄液または他の体液のような他の生物学的試料を含む。

0013

少なくとも1つのタンパク質変性剤は、単独で、または他のタンパク質変性剤および/または非プロトン性溶媒と組み合わされた時に、タンパク質の膜または細胞の壁、ビリオン、DNアーゼまたはRNアーゼを破壊し、タンパク質変性有機体溶解とをもたらし、および生物学的試料の中の核酸を放出させる能力がある試薬である。タンパク質変性剤は、当技術分野においてよく知られており、および既知業者から購入しても、あるいはよく知られた標準的な技術を用いて調製してもよい。本発明において有用であるタンパク質変性剤は、ProK、プロナーゼペプシントリプシンキモトリプシンカルボキシペプチダーゼおよびエラスターゼのようなタンパク質分解酵素;SDS、ドデシル硫酸リチウム(LDS)、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(すなわち、Tween(登録商標)20)、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート(すなわち、Tween(登録商標)80)、NP−40、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム(DTAB)、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、3[(3−コールアミドプロピルジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホナートCHAPS)、ポリエチレングリコールt−オクチルフェニルエーテル(すなわち、Triton X−20およびTriton X−100のようなTriton Xの洗剤)のような、アニオン性非イオン性、および両性の洗剤;サーファクチンのような界面活性剤;フェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコールのような溶剤;N−エチルアセトアミド、N−ブチルアセトアミド、およびN,N−ジメチルアセトアミドのようなアミド類グルタチオン、β−メルカプトエタノール、およびジチオトレイトール(DTT)のような還元剤;NaCl、KCl、LiCl、NH4Cl、(NH4)2SO4および過塩素酸塩のような、タンパク質を変性させる塩;およびKOH、NaOH、NH4OHおよびCa(OH)2のようなpHの上昇をもたらす薬剤を含む。一般的に、タンパク質分解酵素はタンパク質変性剤として好ましく、およびProKはそのようなタンパク質分解酵素の好例である。本発明の方法における任意のタンパク質変性剤の有用性を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認するだろう。

0014

本発明の方法において使用される場合、タンパク質変性剤の濃度は、他の薬剤および条件に依存して変動しうるが、しかし、他のタンパク質変性剤および/または非プロトン性溶媒の存在下で、タンパク質の膜または細胞の壁、ビリオン、DNアーゼまたはRNアーゼを破壊して、タンパク質変性および有機体溶解をもたらし、および生物学的試料の中の核酸を放出するために十分である。タンパク質変性剤のこの濃度を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に決定することができる。タンパク質変性剤としてProKを少なくとも1つの非プロトン性溶媒とともに使用する場合、ProKの望ましい濃度は、生物学的試料のタンパク質含有量に依存する。たいていの生物学的試料に関して、それは、生物学的試料のミリリットルあたり約1から約100単位の範囲である。しかしながら、いくつかの生物学的試料は、その最適濃度範囲、すなわち生物学的試料のミリリットルあたり約1から約100単位でProKを使用するために、前処理の前に希釈または濃縮を必要とする可能性がある。タンパク質変性剤として塩基または塩を使用する場合、たいていの生物学的試料に関して、塩基または塩の濃度は、約10から約400mMの範囲、より好ましくは約80から約220mM、および最も好ましくは約100mMである。タンパク質変性剤として洗剤を使用する場合、たいていの生物学的試料に関して、洗剤の濃度は、約0.05%から約8.0%の範囲、より好ましくは約0.05%から約4%、および最も好ましくは約1%である。

0015

本発明に従って、前処理のために2つ以上のタンパク質変性剤を利用することができる。同タイプまたは異なるタイプのタンパク質変性剤の組合せは、核酸の抽出のための生物学的試料の前処理にさらなる利点を提供する。当業者は、本発明の方法において混合されるタンパク質変性剤の濃度を、同様に、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認できる。

0016

1つの実施形態では、タンパク質変性剤とともに、1つまたは複数の非プロトン性溶媒を利用する。使用される非プロトン性溶媒は、イオン双極子力の形成を可能にする永久双極子または誘導双極子のために、イオン性物質を溶解することができる。非プロトン性溶媒は、アニオンと不安定な水素結合を形成するのに適当な水素原子供与しない。荷電した求核試薬でのSN2機構による求核置換は、多くの場合、非プロトン性溶媒中で、より速い。

0017

双極性非プロトン性溶媒は、例えば約15を超える比較的高い比誘電率(または誘電率)、および双極子モーメントを持つ溶剤である。しかしながら、より一般的な極性溶剤である水とは異なり、非プロトン性溶媒は、イオン化して水素イオンを形成することが無く、そのことが利点を与える。

0018

本発明において有用な非プロトン性溶媒は、ホルムアミド、ジメチルホルムアミドDMF)、ジメチルスルホキシドDMSO)、ジメチルアセトアミド(DMAC)、アセトニトリルベンゼントルエンアセトンシクロヘキサン、n−ヘプタン二酸化硫黄ヘキサメチルホスホルアミドHMPA)、および、標的核酸を変性および可溶化するために使用することができる他の非水媒体を含む。ホルムアミドは、好ましい非プロトン性溶媒である。そのような非プロトン性溶媒は、当技術分野においてよく知られており、および既知の業者から購入してもよく、またはよく知られた標準的な技術を用いて合成してもよい。本発明の方法における任意の非プロトン性溶媒の有用性を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認するだろう。

0019

本発明の方法において使用される場合、非プロトン性溶媒の濃度は、他の薬剤および条件に依存して変動しうるが、しかし、必要とされる温度および少なくとも1つのタンパク質変性剤の存在下で、核酸を溶液中に維持することによって核酸を保護するために十分である。当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して、この濃度を容易に決定することができる。ホルムアミドが本発明の方法において使用される非プロトン性溶媒である場合、たいていの生物学的試料に関して、ホルムアミドの濃度は、好ましくは反応混合物の約10体積%から約80体積%の範囲、より好ましくは約20体積%から約40体積%、および最も好ましくは、約30体積%である。

0020

本発明に従って、前処理のために2つ以上の非プロトン性溶媒を利用することができる。異なる非プロトン性溶媒の組合せは、核酸の抽出のための生物学的試料の前処理にさらなる利点を提供する。本発明の方法において混合される非プロトン性溶媒の濃度を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認できる。

0021

本発明の方法を実施する温度は、一般的には約4℃以上、好ましくは約25℃以上とされる。より好ましい範囲は、約55℃から約95℃である。さらにより好ましい温度の範囲は、約65℃から約85℃である。最も好ましい温度は、約70℃である。本発明の方法において、高温はタンパク質の変性に寄与すると考えられる。

0022

本発明の別の実施形態では、生物学的試料からの核酸の抽出のために、単独の、または少なくとも1つの非プロトン性溶媒と組合せられる少なくとも1つのタンパク質変性剤とともに、段階的加熱を利用する。段階的加熱は、生物学的試料からの核酸の抽出のために、処理温度を2以上の段階によって体系的に増加または減少させる加熱手順である。例えば、タンパク質分解酵素ProKを用いるタンパク質変性および核酸抽出に関して、55℃および85℃の各々の処理温度における20分間の処理を利用する。段階的加熱は、改善された核酸抽出の回収を示している。本発明の方法における加熱工程の温度範囲および継続時間を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に確認できる。

0023

本発明のさらに別の実施形態では、単独の、または少なくとも1つの非プロトン性溶媒を伴う少なくとも1つのタンパク質変性剤とともに、水溶液または非プロトン性溶媒による試料希釈を利用する。水溶液は、水または約3.0から約10.0の間のpH値を持つ任意の緩衝液であることができる。試料希釈は改善された核酸抽出の回収を示している。希釈工程は、溶液中に核酸を維持すると同時に、さらなるタンパク質の変性および/または沈降を引き起こす。通常、希釈ファクター(反応混合物/希釈剤)は、試料、希釈剤、および処理条件に依存して、4:1と1:10との間である。本発明の方法における使用のための希釈剤および希釈ファクターの選択を、当業者は、過度の実験作業を必要としない日常的なスクリーニング方法を使用して容易に決定することができる。

0024

本発明のさらに別の態様は、核酸の抽出のために生物学的試料を処理するためのキットを提供することであり、該キットは、本明細書に記載されるように、1つまたは複数の非プロトン性溶媒とともに、または伴わずに、少なくとも1つのタンパク質変性剤を含む。キットは、本明細書に記載されるような水および緩衝液に加えて、核酸精製のための酸化鉄または他の固体担体を含有してもよく、これらは他の場所に、より詳細に記載される。また、キットは、生物学的試料を処理加工および分析するために、以下の品目の1つまたは複数を含有してもよい:綿棒、管、およびピペットのような採集道具対照標準pH指示薬;および体温計。キットは、本発明に従って方法を実施するために適当な比率で混合される試薬の容器を含んでもよい。試薬容器は、好ましくは、対象の方法を実施するときに計量工程を不要にする単位量で試薬を含有する。

0025

また、本発明は、反応混合物ばかりでなく、反応混合物から核酸を抽出する方法も含む。反応混合物は、1つまたは複数の非プロトン性溶媒とともに、または伴わずに、少なくとも1つのタンパク質変性剤を含む。反応混合物は、いくつかの実施形態において、核酸を精製および検出するために対象の反応混合物とともに使用される様々な試薬(緩衝液および核酸精製のための酸化鉄または他の固体担体のようなもの)を含んでもよい。

0026

ここで、特定の実施例を介して、本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は、例示の目的で提供され、およびいかなる意味においても本発明を限定することを意図しない。これらの実施例において、参照によって本明細書中に組み込まれる特許文献1に開示されるように、本発明に従って無傷の核酸の抽出のための試料を処理することから生じる反応混合物からの核酸単離のために、酸性環境における常磁性粒子上の核酸分子可逆的結合を使用する(特許文献1参照)。結合pHは、好ましくは約1から約6.5、より好ましくは約1から約4、および最も好ましくは約2である。溶離pHは、好ましくは約6.5から約12、より好ましくは約7.5から約11、および最も好ましくは約8である。常磁性酸化鉄テクノロジーは、非特異的、すなわち配列とは無関係に、核酸を捕捉する。特異的および非特異的捕捉の両方を代表する、現在市場に出回っているいくつかの他の自動化された核酸抽出テクノロジーがある。最も注目すべき非特異的捕捉システムは、Roche MagNA Pure LCおよびOrganon Teknika Nuclisensを含み、その両方が磁性シリカ粒子を利用する。Qiagen BioRobot 9604は、シリカ膜包含する。Roche AmpliPrepは、ストレプトアビジン被覆された磁性粒子およびビオチン化捕捉プローブで、標的を特異的に捕捉する。GenProbe’s Tigrisシステムは、オリゴヌクレオチドで被覆された磁性粒子を利用すると思われる。また、さらに、酸化鉄、シリカで被覆された粒子、シリカで被覆された膜、ガラス繊維マットガラス膜、および他のガラス類ゼオライト、およびセラミックスのような材料を、核酸抽出のための固相結合表面として使用することができる。要約すれば、液体および固体相分離を含む、当技術分野において知られている核酸単離および精製のための任意の慣用の有効な技術を、本発明の前処理プロセスに続いて核酸の単離および精製のために利用することができる。あるいはまた、当技術分野において知られている核酸単離および精製のための慣用の有効な技術の存在下または非存在下で前処理プロセスを実施してもよい。

0027

また、これらの実施例において、標的核酸配列の増幅および検出のために、本発明の抽出プロセスおよび任意の好適な単離または精製工程に続いて、鎖置換増幅(SDA)を利用する。SDA法は、最初に、一本鎖標的配列を、核酸ポリメラーゼ制限エンドヌクレアーゼデオキシヌクレオシドトリホスフェート、および標的断片の3’末端における領域に対して相補的である少なくとも1つのプライマー(各プライマーは5’末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列である配列を有する)と混合し、および、次いで、混合物を、反応生成物を生成するために十分な時間にわたって反応させることを含む。核酸がRNAを含む場合、逆転写酵素を使用して、RNAをcDNA転換させることが好ましい。しかしながら、本発明はSDA検出に限定されず、および、検出のために、本発明の前処理プロセスに続いてハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応PCR)のような多くの慣用および有効な検出技術を使用してもよい。

0028

以下の実施例は、核酸抽出のための全血および血漿試料を前処理するための本発明の前処理プロセスの有効性を説明する。全血および血漿は、その高度なタンパク質含有量のために、核酸抽出のための最も手腕を問われる試料のうちの一つである;従って、本発明の方法は、他の生物学的試料のためにも同様に有効であると予想される。代表的な例を、本明細書中に論じる。

0029

多様な温度における血漿前処理の評価
本発明のProK血漿前処理方法の間の温度がRNAの抽出に与える効果を評価するために、本実験を設計した。酸化鉄を用いて試料からRNAを抽出した。

0030

最初に、40mgの酸化鉄と1200μlの30mMのリン酸カリウム緩衝液(KPB)とを、8本の2mlポリプロピレン管の中へ分配した。6本の管にEDTA抗凝固された血漿(600μl)を加え、および残りの2本の管に600μlの30mMのKPBを加えた。次いで、各管に3単位のProKを加え、および管を混合した。KPBを含有する2本の管および血漿を含有する管のうちの2本を、室温で20分間にわたりインキュベートした。血漿を含有する2本の管を37℃で20分間にわたりインキュベートし、および血漿を含有する2本の管を52℃で20分間にわたりインキュベートした。インキュベーションに続いて、各管に、180μlの6Mのグリシン/HCl、1μgのキャリアRNA、および5000のHIV生体外転写物を加えた。次いで、管の反対側に配置された電磁石を交互に電源オンオフすることによって、15分間にわたって管を混合した。これは、溶液の端から端まで前後に酸化鉄粒子を引き寄せることによって試料を混合した。次いで、電磁石を電源オンすることによって、酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定した。次いで、各管からの非結合試料を吸引によって除去した。次いで、2mlの90mMのグリシン/HClで粒子を2回洗浄した。次いで、上述のように、各管を混合し、粒子を側面に固定し、および流体を吸引によって除去した。各管において、45mMのKOH、90mMのビシンおよび20mMのKPO4から成る0.4mlの溶離緩衝液を加え、および管を混合することによって、酸化鉄から試料を溶離した。溶離に続いて、酸化鉄粒子を側面に磁気的に固定し、および試料を新しい管の中へ吸引することによって、溶離剤を新しい管に移動させた。次に、各管に1μgの酵母菌キャリアRNAを加えた。次いで、HIV逆転写酵素(RT)−SDA分析システムを用いるSDAによって、溶離された試料を分析した。結果は以下のとおりであった:

0031

0032

様々な温度におけるシグナル応答は、52℃もの温度においてProKで血漿を前処理したときのRNA標的の回収を示唆する。

0033

高いProK濃度および温度における血漿前処理の評価
以下の実験は、多様なProK濃度および高温の血漿前処理がRNAの抽出に与える効果を試験した。酸化鉄を用いて試料を抽出した。

0034

Becton Dickinson(BD)製のPPT(商標)管に採集されたEDTAで抗凝固された血漿(600μl)を、40〜45mgの酸化鉄を各々含有する新しい管に移動させた。移動に続いて、各々の管に220μlの30mMのKPBを加えた。次に、それらの管に3、6または9単位のProKを加え、および、次いで、55℃、65℃、または75℃の水浴中で20分間にわたり管をインキュベートした。インキュベーションに続いて、各管に180μlの6Mのグリシン/HClを加え、およびピペットで上下に吸引することによって管を混合した。各管に酵母菌キャリアRNA(濃度10μg/mlの10μl)を加えた。次いで、6μlの107コピー/mlのHIV−RNA生体外転写物で試料をスパイクした。1回につき800μlを吸引および分配し、24回繰り返すことによって、試料を混合した。次いで、混合に続いて、実施例1に記載されるように、すなわち、酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を新しい管の中へ吸引することによって、試料を抽出した。1mlの86mMのグリシン/HClで、800μlを計12回吸引および分配し、管の側面に酸化鉄粒子を固定し、および流体を管から吸引することによって、粒子を2回洗浄した。次いで、各管に、90mMのビシン、50mMのKOH、および20mMのKPO4から成る0.4mlの溶離緩衝液を加え、300μlを12回、吸引および分配することによって混合することにより、試料を酸化鉄から溶離した。溶離に続いて、各管に10マイクロリットルの酵母菌キャリアRNA(10mg/ml)を加えた。次いで、管を60℃に加熱し、その間、管の反対側に配置された電磁石を交互にオンオフすることによって20分間にわたって磁気的混合にさらした。これは、溶液の端から端まで前後に酸化鉄粒子を引き寄せることによって試料を混合した。実施例1に記載されるように、すなわち、酸化鉄粒子を側面に磁気的に固定し、および試料を新しい管の中へ吸引することによって試料を混合することにより、溶離された試料を新しい管に移動させ、およびHIV逆転写酵素(RT)−SDA分析システムを用いるSDAによって分析した。結果は以下のとおりである:

0035

0036

結果は、テストした温度範囲(55℃から75℃)全体にわたって、6〜9単位のProKでの血漿の前処理が標的回収をもたらすことを実証する。さらに、温度とProKの量との間の相関は、テストしたProKの範囲(3〜9単位のProK)全体にわたって、より高温で標的回収を達成できることを示す。

0037

ホルムアミドおよび多様な熱プロファイルによる血漿前処理の評価
以下の実験は、ProKおよびホルムアミドと血漿前処理の間の多様な熱プロファイルとがRNAの抽出に与える効果を試験した。酸化鉄を用いて試料からRNAを抽出した。

0038

最初に、40〜45mgの酸化鉄を各々含有する64本の管に、EDTAで抗凝固された血漿500μlを加えた。これらの管のうち8本を対照標準として取っておいた(すなわち、前処理しなかった)。管のうち8本にリン酸緩衝生理食塩水PBS)(300μl)を加えた。残りの48本の管に300μlのホルムアミドを入れた。PBSまたはホルムアミドのいずれかを含有する46本の管の各々に、20単位のProKを加えた。以下の総括表中に明記される温度および時間において、管をインキュベートした。次いで、全ての管を、2,500コピーのHIV生体外転写物でスパイクして、5,000コピー/mlのHIV RNAを含有する血漿試料の模擬実験をした。次に、各管に180μlの6Mのグリシン/HClを加え、および800μlをピペットで上下に計24回吸引することによって試料を混合した。次いで、酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および吸引によって非結合試料を除去した。1mlの90mMのグリシン/HClで、800μlを計12回吸引および分配することによって、粒子を2回洗浄した。各洗浄後、粒子を管の側面に固定し、および吸引によって各管から流体を除去した。75mMのビシンおよび85mMのKOHから成る120μlの溶離緩衝液を添加して、1回につき100μlを計15回、吸引および分配することによって混合することにより、粒子から試料を溶離した。次いで、各管に400mMのビシンから成る60μlの中和緩衝液を加え、および1回につき100μlを計15回、吸引および分配して混合することによって、試料を中和した。実施例1に記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。HIVRT-SDA分析システムを用いるSDAによって、溶離された試料を分析した。結果は以下のとおりである:

0039

0040

結果は、記載された時間および温度にわたってProKおよびホルムアミドで血漿を前処理することは、前処理しない場合、または75℃で20分間にわたってProKおよびPBSで前処理する場合と比べて、かなり高い平均シグナルを与えることを明確に実証した。

0041

血漿前処理の間に存在する酸化鉄の有無による、血漿からのDNA抽出の評価
血漿前処理の間に酸化鉄が存在する場合に対する、前処理の後に酸化鉄を加える場合の、血漿からのDNA抽出効率を比較するために、以下の実験を実施した。

0042

12本の2ml管(6本は40mgの酸化鉄を含有し、および6本は空の管)の各々に、ヒト血漿(500μl)を加えた。各管にProK(5単位)を加え、および管を65℃で20分間にわたりインキュベートした。ホルムアミド(400μl)を加え、および管を70℃で10分間にわたりインキュベートした。40mgの酸化鉄を含有する6本の新しい2ml管に、酸化鉄無しで前処理された試料を移動させた。次に、結核菌(TB)特定配列を含有するK10DNAプラスミド2,500コピーを、存在する酸化鉄無しで前処理された6本の管のうち5本、および存在する酸化鉄有りで前処理された6本の管のうち5本にスパイクした。各管に180μlの6Mのグリシン/HClを加え、続いて上下に吸引することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を吸引した。5mMのグリシン/HClで管を2回洗浄し、各洗浄後は、粒子を管の側面に固定し、および流体を管から吸引した。105mMのKOHおよび14%のDMSOから成る溶離緩衝液(120μl)を加えて、および上下にピペット移動させることによって混合した。次いで、実施例1に記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。350mMのビシンおよび38.5%のグリセロールから成る中和緩衝液(60μl)を加え、および上下にピペット移動させることにより混合した。直接TB SDA分析(DTB)(Direct TB SDA assay)において、溶離された試料を増幅して、DTB特異的応答および内部増幅制御(IC)応答を得た。

0043

0044

TB増幅分析におけるシグナル改善によって示唆されるように、結果は、血漿前処理の前よりもむしろ後に血漿と酸化鉄とを結合させることが血漿からのDNA抽出効率を改善することを実証する。

0045

血漿前処理の間に存在する酸化鉄の有無、および混合の間に加えるAC電界の有無による、血漿からのDNA抽出の評価
血漿前処理の間に酸化鉄が存在する場合対前処理後に酸化鉄を加えた場合の、血漿からのDNA抽出効率を比較し、および混合の間の交流(AC)電界の有無の2つの条件を試験するために、以下の実験を実施した。

0046

40mgの酸化鉄を含有する24本の2ml管および24本の空の2ml管の各々に、ヒト血漿(500μl)を加えた。各管にProK(5単位)および300μlのホルムアミドを加えた。全ての管を、65℃で20分間、および85℃で10分間にわたってインキュベートした。酸化鉄無しで前処理された試料を、40mgの酸化鉄を含有する新しい2ml管に移動させた。次に、存在する酸化鉄無しで前処理された24本の管のうち20本、および存在する酸化鉄有りで前処理された24本の管のうち20本の中へ、結核菌(TB)特定配列を含有するK10DNAプラスミド4,000コピーをスパイクした。次いで、150μlの6Mのグリシン/HClを加えて、および上下に吸引することによって混合した。存在する酸化鉄有りで前処理された管のうち12本、および存在する酸化鉄無しで前処理された管のうち12本を、各混合工程においてAC電界無しで混合した。存在する酸化鉄有りで前処理された残りの12本の管を、存在する酸化鉄無しで前処理された残りの12本の管と同様に、各混合工程において30mVのAC電界下で混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を管から吸引した。5mMのグリシン/HClで管を2回洗浄し、各洗浄後は、粒子を管の側面に固定し、および流体を管から吸引した。次に、105mMのKOHおよび14%のDMSOから成る120μlの溶離緩衝液を加えて、および上下にピペット移動させることにより混合した。実施例1におけるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。350mMのビシンおよび38.5%のグリセロールから成る中和緩衝液(60μl)を加えて、および上下にピペットで移すことにより混合した。直接TB SDA分析において、溶離された試料を増幅して、DTB特異的応答およびIC応答を得た。結果は以下のとおりである:

0047

0048

TB増幅分析におけるシグナル改善によって示唆されるように、結果は、血漿前処理の前よりもむしろ後に血漿と酸化鉄とを結合することが、血漿からのDNA抽出効率改善することを実証する。AC電界の存在下で混合することは、前処理の間に酸化鉄を含有しない試料に関するシグナルを改善した。

0049

酸化鉄での血漿からのDNA抽出に与える、ProK消化前に対するProK消化後の血漿試料の希釈の効果の評価
血漿をProK消化前にリン酸カリウム緩衝液で希釈する場合に対する、ProK消化後に水で希釈する場合の、酸化鉄での血漿からのDNA抽出効率を比較するために、以下の実験を実施した。

0050

24本の2ml管の各々に、ヒト血漿(500μl)を加えた。血漿の管のうち8本に、ProK(5単位)および400μlの30mMのリン酸カリウム緩衝液を加え、および65℃で20分間にわたってインキュベートし、続けて70℃で10分間にわたってインキュベートした。血漿の管のうち8本に、ProK(9単位)および400μlの30mMのリン酸カリウム緩衝液を加え、および65℃で20分間にわたってインキュベートし、続けて70℃で10分間にわたってインキュベートした。血漿の管のうち8本に、ProK(5単位)を加え、および65℃で20分間にわたってインキュベートした。65℃のインキュベーションに続いて、これらの管を400μlの水で希釈し、および70℃で10分間にわたってインキュベートした。追加の8本の2ml管に、リン酸カリウム緩衝液(900μl)を加えた。各溶液を、各々40mgの酸化鉄を含有する新しい2ml管に移動させた。次に、4つの条件の各々8本の管のうち6本の中へ、結核菌特定配列を含有するK10DNAプラスミド3,000コピーをスパイクした。各条件の残りの2本の管を、陰性の対照標準として残した。次に、管の各々に180μlの6Mのグリシン/HClを加え、および上下に吸引することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を吸引した。5mMのグリシン/HClで管を2回洗浄し、各洗浄後、粒子を管の側面に固定し、および管から流体を吸引した。105mMのKOHおよび14%のDMSOから成る溶離緩衝液(120μl)を加えて、および上下にピペット移動させることにより混合した。実施例1において記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。350mMのビシンおよび38.5%のグリセロールから成る中和緩衝液(60μl)を加えて、および上下にピペット移動させることにより混合した。直接TB SDA分析において、溶離された試料を増幅して、DTB特異的応答およびIC応答を得た。結果は以下のとおりである:

0051

0052

TB増幅分析における増大されたシグナルによって示唆されるように、結果は、ProK消化の後に血漿を希釈することが、血漿からのDNA抽出効率を改善することを実証する。ProK後希釈条件の結果は、緩衝液試料の対照標準の結果にほぼ等しい。

0053

酸化鉄でのDNA抽出における血漿希釈剤としてのホルムアミドおよび水の評価
ProK消化後にホルムアミドまたは水のいずれか一方で血漿を希釈する場合の、酸化鉄での血漿からのDNA抽出効率を比較するために、以下の実験を実施した。

0054

12本の2ml管の各々に、500μlのヒト血漿および5単位のProKを加えた。65℃で20分間にわたって管をインキュベートした。管のうち6本にホルムアミド(400μl)を加え、および70℃で10分間にわたって管をインキュベートした。残りの6本の管に水(400μl)を加え、および70℃で10分間にわたって管をインキュベートした。各溶液を、各々40mgの酸化鉄を含有する新しい2ml管に移動させた。次に、2つの条件の各々6本の管のうち5本の中へ、結核菌特定配列を含有するK10DNAプラスミド2,500コピーをスパイクした。各条件の残りの管を、陰性の対照標準として残した。次に、管の各々に180μlの6Mのグリシン/HClを加え、および上下に吸引することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を管から吸引した。5mMのグリシン/HClで管を2回洗浄し、各洗浄後に、粒子を管の側面に固定し、および管から流体を吸引した。105mMのKOHおよび14%のDMSOから成る溶離緩衝液(120μl)を加え、および上下にピペット移動させることによって混合した。実施例1に記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。350mMのビシンおよび38.5%のグリセロールから成る中和緩衝液(60μl)を加え、および上下にピペット移動させることにより混合した。直接TB SDA分析において、溶離された試料を増幅して、DTB特異的応答およびIC応答を得た。結果は以下のとおりである:

0055

0056

TB増幅分析における同等のシグナルによって示唆されるように、結果は、ProK消化後に水またはホルムアミドのいずれで血漿を希釈することも、同等の血漿からのDNA抽出効率をもたらすことを実証する。

0057

酸化鉄での血漿からのRNAの回収に関する多様なキャリアRNA濃度の評価
酸化鉄での血漿からのRNA抽出に与える、増大する酵母菌キャリアRNA濃度の効果を評価するために、以下の実験を実施した。

0058

mlあたり10,000個のHIV粒子でヒト血漿をスパイクし、およびHIVでスパイクされた血漿500μlを、40本の2ml管に加えた。各管に、ProK(40単位)を加えた。次に、0、2.5、5、10、または20μgのキャリアRNAを含有する300μlの30mMのKPを、管(キャリアRNAのレベル毎に管8本)に加えた。0.5mlの血漿試料を考えれば、これは、ml血漿あたり0、5、10、20、および40μgのキャリアRNA濃度となる。RNA対照標準としての働きをさせるために、500μlのスパイクされていない血漿、40単位のProK、300μlのホルムアミドおよび10,000コピーのHIV生体外転写物を、8本の2ml管に加えた。全ての管を、70℃の水浴中で30分間にわたってインキュベートした。次に、180μlの6Mのグリシン/HClを加え、および800μlを24回吸引および分配することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定し、および非結合試料を吸引した。1mlの6mMのグリシン/HClで、800μlを15回吸引および分配することによって、管を2回洗浄した。粒子を管の側面に固定し、および管から流体を吸引した。各管に、75mMのビシン、85mMのKOH、および30mMのKPO4から成る溶離緩衝液(120μl)を加え、および100μlを15回吸引および分配することによって混合した。実施例1に記載されるように、溶離された試料を新しい管に移動させた。各管に、400mMのビシンから成る中和緩衝液(60μl)を加え、および100μlを15回吸引および分配することによって混合した。酸化鉄粒子を管の側面に磁気的に固定して、溶離された試料の除去を可能にした。HIVRT−SDA分析において離された試料を増幅した。結果は以下のとおりである:

0059

0060

結果は、キャリアRNAの存在が血漿からの特異的RNA標的の回収を改善することを実証する。キャリアRNAをあらかじめHIV増幅分析において20μgに至るまで滴定し、およびキャリアRNAは増幅に与える効果を有さないことを示した。

0061

核酸抽出のための段階的加熱での血漿のProK前処理
酸化鉄システム中でRNAを結合させる前に、ProKを55℃または65℃で活性化させ、続いて75℃で20分間にわたるインキュベーションを行う効果を試験するために、以下の実験を実施した。

0062

BD PPT(商標)管からの600μlの容積の血漿を、40〜45mgの酸化鉄を含有する管に加え、そして次に、管の各々に220μlの30mMのKPO4を加えた。また、各管にProK(6単位)を加え、および管を55℃水浴または65℃の水浴のいずれかにおいて20分間にわたってインキュベートすることによって、ProKを活性化した。管を75℃の水浴に移動させ、および20分間にわたってインキュベートした。試料を、室温で5分間にわたって冷却した。次に、各管に180μlの6Mのグリシン/HClを加え、および試料をピペット混合した。次に、10μlの酵母菌キャリアRNA(10μg/ml)を、続いて6μlのHIVストックRNA(107コピー/ml)を各管に加え、およびピペット混合した。酸化鉄粒子を管の側面に固定し、および無駄になる溶液を吸引することによって、管から非結合試料を除去した。1000μlの洗浄溶液(86mMのグリシン/HCl)で、ピペット混合し、酸化鉄粒子を各管の側面に固定し、および非結合溶液を吸引することによって、粒子を3回洗浄した。次いで、各管に試料を400μlの溶離緩衝液(90mMのビシン、50mMのKOH、および20mMのKPO4)を加え、および、12サイクルの吸引混合、続いて60℃で20分間の磁気的混合、続いて2回目の12サイクルの吸引混合を実施することによって試料を溶離した。各管に酵母菌キャリアRNA(10μg)を加えた。分析前にスパイクをされたコントロール試料に標的を加えた。実施例1に記載されるように、試料を新しい管に移動させ、およびHIVRT−SDA分析によって分析した。結果は以下のとおりである:

0063

0064

高められた温度(55℃から65℃の活性化温度に続いて75℃のインキュベーション温度)でProKで血漿を前処理することは、陽性の分析シグナルによって示唆されるような抽出効率を実証する。

0065

全血からのRNA抽出
本実験を実施して、全血からRNAを抽出し、および溶離工程中への阻害性成分の繰越し汚染を減少させるための付加的な洗浄工程の使用を試験した。

0066

全血試料(500μl)を、65℃で20分間、および85℃で10分間にわたって、20単位のProKおよび300μlのホルムアミドでそれぞれ前処理した。ひと組の試料を2回洗浄6サイクルの洗浄で、および他の組を3回洗浄9サイクルの洗浄で前処理した。試料を85mMのKOH/75mMのビシンで溶離し、400mMのビシンで中和し、およびHIVgag遺伝子RT−SDA増幅システムにおいて検出した。結果は以下のとおりである:

0067

0068

結果は、洗浄の増加に伴う阻害物質の繰越し汚染の減少を示して、付加的な洗浄が分析シグナルを改善することを実証する。

0069

本発明はなんらかの具体性とともに記載されているものの、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとって明らかな変形を施してもよい。本発明の様々な特徴は、特許請求の範囲に記載される。

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