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課題・解決手段

本発明は、式(KLAKLAK)(式中、Kはリシンアミノ酸であり、Lはロイシンアミノ酸であり、かつAはアラニンアミノ酸である)の第1ペプチド配列、及び式βXXβ(式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつXはいかなるアミノ酸でも良い)の少なくとも1つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式(B)(式中、Bは中性pHの、正に帯電した、4から15個のアミノ酸のペプチドである)の第2ペプチド配列を含む、又はそれらから構成されるペプチドであって、前記第1ペプチド配列はn回反復され、かつ前記第2ペプチド配列はm回反復され、n及びmは、1〜5の整数であるペプチドを対象とする。

概要

背景

ヒト及び動物において病原性、かつ重度の感染の原因となる多数の微生物は、臨床で一般に使用される抗生物質耐性を有する。増大する微生物耐性発達は、公衆衛生の重大な問題である。それ故数年前から、新規分子の同定に関する、及び特に抗菌及び抗真菌活性を有し、かつ通常使用される抗生物質とは異なる作用様式を有する短いペプチド(15から30個のアミノ酸)の研究に関する著しい関心が増大した。多数のペプチドが、抗微生物性を有するとして知られているヒト、動物及び植物タンパクから生じ、他方で、他のものは、物理化学研究に基づき合成して生成される。

配列KLAKLAKKLAKLAKの14merの線状ペプチドが、抗菌活性を有する非溶血ペプチドとして文献に記載された(Javadpour MM、Juban MM、Lo WC、BishopSM、AlbertyJB、Cowell SM、Becker CL、McLaughlin ML。低い哺乳類細胞毒性を有する新規の抗微生物ペプチド(De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity)。J Med Chem.1996 Aug 2;39(16):3107−13)。このペプチドにより行われた限られた研究は、4時間の短いインキュベーション時間の間、3種の細菌株大腸菌緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌)に対する活性を示した。より長いインキュベーション時間による結果が、記載されたことはなかった。

出願人は、標準評価条件(18時間のインキュベーション)でこのペプチドの抗菌性インビトロでの研究を行ったが、文献に記載された濃度では、該条件は、いかなる生物学的活性も示さなかった。反対に、思いがけないことに、モチーフKLAKLAKが、抗菌及び/又は抗真菌性を有さないペプチド配列及びこのモチーフを含むペプチドに抗菌及び/又は抗真菌性を与えることが可能であることが今般明らかにされた。

概要

本発明は、式(KLAKLAK)(式中、Kはリシンアミノ酸であり、Lはロイシンアミノ酸であり、かつAはアラニンアミノ酸である)の第1ペプチド配列、及び式βXXβ(式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつXはいかなるアミノ酸でも良い)の少なくとも1つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式(B)(式中、Bは中性pHの、正に帯電した、4から15個のアミノ酸のペプチドである)の第2ペプチド配列を含む、又はそれらから構成されるペプチドであって、前記第1ペプチド配列はn回反復され、かつ前記第2ペプチド配列はm回反復され、n及びmは、1〜5の整数であるペプチドを対象とする。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

−式(KLAKLAK)(式中、Kはリシンアミノ酸であり、Lはロイシンアミノ酸であり、かつAはアラニンアミノ酸である)の第1ペプチド配列、及び−式βXXβ(式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつXはいかなるアミノ酸でも良い)の少なくとも1つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式(B)(式中、Bは中性pHの、正に帯電した、4から15個のアミノ酸のペプチドである)の第2ペプチド配列を含む、又はそれらから構成されるペプチドであって、前記第1ペプチド配列はn回反復され、かつ前記第2ペプチド配列はm回反復され、n及びmは、1〜5の整数であるペプチド。

請求項2

nは、1〜3の整数であることを特徴とする請求項1に記載のペプチド。

請求項3

mは、1より大きいこと、及び第2ペプチド配列(B)は、同一又は異なることを特徴とする請求項1又は2のいずれかに記載のペプチド。

請求項4

式βXXβのペプチドモチーフは、各第2ペプチド配列(B)中で同一又は異なることを特徴とする請求項3に記載のペプチド。

請求項5

第1及び第2ペプチド配列は:−交互である、又は−第1又は第2ペプチド配列の1つ、又は前記第1又は第2ペプチド配列の、N末端及びC末端の一方及び/又は他方に集められることを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載のペプチド。

請求項6

第1ペプチド配列は、第2ペプチド配列のN末端及びC末端の一方及び/又は他方に集められることを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載のペプチド。

請求項7

前記第1及び第2ペプチド配列は、好適にはペプチドの共有結合によって結合されることを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載のペプチド。

請求項8

式βXXβのペプチドモチーフにおいて、βは、好ましくはアルギニン(R)及びリシン(K)を含む群から選択される塩基性アミノ酸であり、かつXは、ロイシン(L)、グリシン(G)及びヒスチジン(H)を含む群から選択されることを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載のペプチド。

請求項9

請求項1から8のいずれかに記載の少なくとも1つのペプチドを活性作用物質として含む薬剤化粧農業食品又は農学組成物

請求項10

ヒト、動物又は植物における細菌及び/又は真菌感染を予防及び/又は治療するために有用であることを特徴とする請求項9に記載の組成物。

請求項11

請求項1から8のいずれかに記載のペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド

請求項12

請求項11に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むベクターのような核酸分子

請求項13

請求項12に記載の核酸分子を含む、動物若しくは植物細胞、又は原核生物のような宿主

請求項14

請求項13に記載の植物細胞から生成する植物。

技術分野

0001

本発明は、ヒト、動物又は植物における細菌及び真菌感染治療の分野に関する。本発明は、細菌及び真菌類のような病原体による感染を予防及び/又は治療するためのペプチド及びそれらを含む組成物を特には対象とする。

背景技術

0002

ヒト及び動物において病原性、かつ重度の感染の原因となる多数の微生物は、臨床で一般に使用される抗生物質耐性を有する。増大する微生物耐性発達は、公衆衛生の重大な問題である。それ故数年前から、新規分子の同定に関する、及び特に抗菌及び抗真菌活性を有し、かつ通常使用される抗生物質とは異なる作用様式を有する短いペプチド(15から30個のアミノ酸)の研究に関する著しい関心が増大した。多数のペプチドが、抗微生物性を有するとして知られているヒト、動物及び植物タンパクから生じ、他方で、他のものは、物理化学研究に基づき合成して生成される。

0003

配列KLAKLAKKLAKLAKの14merの線状ペプチドが、抗菌活性を有する非溶血ペプチドとして文献に記載された(Javadpour MM、Juban MM、Lo WC、BishopSM、AlbertyJB、Cowell SM、Becker CL、McLaughlin ML。低い哺乳類細胞毒性を有する新規の抗微生物ペプチド(De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity)。J Med Chem.1996 Aug 2;39(16):3107−13)。このペプチドにより行われた限られた研究は、4時間の短いインキュベーション時間の間、3種の細菌株大腸菌緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌)に対する活性を示した。より長いインキュベーション時間による結果が、記載されたことはなかった。

0004

出願人は、標準評価条件(18時間のインキュベーション)でこのペプチドの抗菌性インビトロでの研究を行ったが、文献に記載された濃度では、該条件は、いかなる生物学的活性も示さなかった。反対に、思いがけないことに、モチーフKLAKLAKが、抗菌及び/又は抗真菌性を有さないペプチド配列及びこのモチーフを含むペプチドに抗菌及び/又は抗真菌性を与えることが可能であることが今般明らかにされた。

課題を解決するための手段

0005

従って、本発明は:
−式(KLAKLAK)(式中、Kはリシンアミノ酸であり、Lはロイシンアミノ酸であり、かつAはアラニンアミノ酸である)の第1ペプチド配列、及び
−式βXXβ(式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつXはいかなるアミノ酸でも良い)の少なくとも1つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式(B)(式中、Bは中性pHの、正に帯電した、4から15個のアミノ酸のペプチドである)の第2ペプチド配列を含む、又はそれらから構成される好適には線状かつカチオン性ペプチドであって、前記第1ペプチド配列はn回反復され、かつ前記第2ペプチド配列はm回反復され、n及びmは、1〜5の整数であるペプチドを対象とする。nは、好ましくは1〜3の整数である。好適には、mは、1より大きく、かつ第2ペプチド配列(B)は、同一又は異なる。

0006

従って本発明のペプチドは、同一又は異なる幾つかの第2ペプチド配列(B)、及びそれ故に各第2ペプチド配列(B)中に、同一又は異なる式βXXβの幾つかのペプチドモチーフを含み得る。

0007

好適には、本発明のペプチドは、線状である。従ってそれらは、次の一般式(I):(KLAKLAK)n(B)m(式中、第1及び第2ペプチド配列は:
−交互である、又は
−第1又は第2ペプチド配列の1つ、又は前記第1又は第2ペプチド配列の、N末端及びC末端の一方及び/又は他方に集められる)に対応する。

0008

好ましくは、本発明のペプチドにおいて、第1ペプチド配列は、第2ペプチド配列のN末端及びC末端の一方及び/又は他方に集められる。

0009

好ましくは、前記第1及び第2ペプチド配列は、好適にはペプチドの共有結合によって結合される。

0010

式βXXβのペプチドモチーフにおいて、βは、好ましくはアルギニン(R)及びリシン(K)を含む群から選択される塩基性アミノ酸であり、かつXは、好ましくはロイシン(L)、グリシン(G)及びヒスチジン(H)を含む群から選択される。

0011

本発明によるペプチド組成物中に入る第2ペプチド配列の特異的な例として、次の配列:
−配列番号1:VKRGLKL
−配列番号2:KHLKKHLKKHLK
−配列番号3:GKRKKKGKLGKKRDPを挙げることができる。

0012

これらの第2ペプチド配列は、微生物による18時間のインキュベーション後に、抗菌及び/又は抗真菌活性を有するカチオン性線状ペプチドを生成するように、2回反復される第1ペプチド配列:KLAKLAKKLAKLAK(配列番号4)に結合され得る。

0013

本発明のペプチドは、化学合成、又は細菌のような原核細胞トランスジェニック動物、例えばトランスジェニックウサギヤギヒツジ等の乳、又は例えばタバコ等のようなトランスジェニック植物における酵母CHO細胞、NSO細胞のような真核細胞中の遺伝子工学によって調製され得る。

0014

本発明は、脂質、糖、ヌクレオチド配列とのカップリングのような化学修飾、又はグリコシル化のような翻訳後プロセスから生じた修飾を含むペプチドのような、上記に定義したペプチドの機能同等物にも、これらの修飾が下記の実験の部に示すテストによる前記ペプチドの抗菌及び/又は抗真菌活性を修飾しない限りにおいて、関する。機能同等物は、1個又は数個のアミノ酸が、コンフォメーションDのアミノ酸であるペプチドも含む。本発明は、レトロペプチド及びレトロインベルソペプチドも同様にカバーする。

0015

本発明は、細菌及び/又は真菌感染を予防及び/又は治療するための、ヒト、動物又は植物における前記ペプチドの使用も対象とする。従って、本発明は、薬剤化粧又は農業食品組成物であって、医薬上許容される1つ又は幾つかのビヒクル希釈剤又は賦形剤と前記組成物中で結合される、以上で定義したような少なくとも1つのペプチドを有効成分として含む薬剤、化粧又は農業食品組成物に関する。本発明のペプチドは、低い毒性を有し、かつ更にこれらのペプチドは、非溶血性である。

0016

ビヒクル、希釈剤及び賦形剤は、薬剤、化粧又は農学的な組成物の用途のタイプに応じて選択される。

0017

このように、本発明はまた、抗菌及び/又は抗真菌目的の、薬剤、化粧、皮膚科学又は農業食品組成物の調製のための、以上で定義したようなペプチドの使用を対象とする。

0018

本発明のペプチドは、グラム陰性グラム陽性細菌糸状菌及び酵母に対する活性を含む、多様な微生物に対する抗菌活性を有するが、しかるに分離して取った第2及び第1配列は、選択した評価条件において活性を有さない。

0019

本発明の組成物は、予防的にも、治療的にも有用である

0020

本発明による薬剤組成物投与は、治療薬許容される任意の投与方法によって行われ得る。これらの方法には、例えば頭蓋内外科方法、又は眼内投与による、全身局所又は中枢投与を含む。生分解性移植片皮下埋め込みも挙げることができる。

0021

経口投与は、錠剤ゼラチン質カプセル剤、遅延又は持続性放出製剤を含む軟カプセル剤丸薬粉末細粒エリキシル剤チンキ剤、懸濁液、シロップ及びエマルジョンによって行うことができる。この提示形状は、腸関門通過、及び抗菌及び/又は抗真菌化合物の最も一般的な使用に特に適している。

0022

抗菌及び/又は抗真菌化合物の非経口投与は、潅流による静脈内又は筋肉内注射によって一般的に行われる。注射可能な組成物は、懸濁又は溶液か、脂質製剤若しくはデキストラン製剤、又はPLGA若しくは同等物生分解性微小粒子又はナノ粒子中にペプチドを封入するような、遅延又は持続性放出製剤を含む適切な液体中での即時溶解に適した固形で、従来の形状で調製することができる。この提示形状は、血液脳関門通過、及び抗菌及び/又は抗真菌化合物の病院での使用に特に適している。

0023

非経口投与の可能性は、一定レベルの分量の維持を確実にする、緩速放出又は持続性放出ステム移植を使用する。

0024

もう一つの可能性は、カテーテル人工補綴又は生体のような担体上に本発明のペプチドを吸着その他により固定することからなる。

0025

鼻腔内投与のために、適当な鼻腔内ビヒクルを使用することができる。

0026

その他の慣習的な局所調剤には、クリーム軟膏ローションゲル及びエアゾールスプレーを含む。これらは、細菌及び/又は真菌気管支肺感染の治療に特に適している。

0027

化粧組成物中での本発明のペプチドの使用は、重要な予防として有用であり、クリーム、マニキュア液生殖器衛生製品練り歯磨き口腔衛生溶液中に、前記ペプチドを封入する、又はそれらを、例えばおむつ、綿棒包帯化粧落とし綿、生理用ナプキン又は動物用敷藁中に含まれる、水相で緩速拡散する微小粒子中に封入することからなる。

0028

投与方法に応じて、化合物固体半固体又は液体形状であっても良い。

0029

錠剤、丸薬、遊離状態又はゼラチン質カプセル剤中に封入される粉末又は細粒のような固体組成物に関して、有効成分は:
−希釈剤、例えば乳糖デキストロースショ糖マンニトールソルビトールセルロース及び/又はグリシン;
潤滑剤、例えばシリカタルクステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び/又はポリエチレングリコール
結合剤、例えばケイ酸マグネシウム及びアルミニウムデンプン糊ゼラチントラガカントゴムメチルセルロースナトリウムカルボキシメチルセルロース及び/又はポリビニルピロリドン;必要な場合、
崩壊剤、例えばデンプン寒天アルギン酸、又はそのナトリウム塩、又は発泡性混合物;及び/又は
吸収剤着色剤芳香剤及び甘味料と組み合され得る。賦形剤は、例えばマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウムナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム及び薬剤品質類似体であっても良い。

0030

座薬のような半固体組成物に関して、賦形剤は、例えば脂肪性エマルジョン又は懸濁液であっても良く、又はポリプロピレングリコールのような、ポリアルキレングリコールを主成分としても良い。

0031

特に注射可能な、又は軟カプセル剤中に封入する、液体組成物は、例えば水、生理血清水性デキストロース、グリセロールエタノール、油及び類似体のような、薬剤的に純粋な溶剤中の有効成分の溶解、分散等によって例えば調製され得る。

0032

本発明によるペプチドは、小型単層小嚢、大型単層小嚢、及び多層小嚢の形状のような、リポゾームタイプの放出システムの形状で同様に投与され得る。リポゾームは、コレステロールステアリルアミン、又はホスファチジルコリンを含む多様なリン脂質から形成され得る。実施形において、液状成分フィルムが、薬剤をカプセルに入れる脂質層を形成するために、薬剤の水溶液によって水和され得る。

0033

本発明による組成物は、滅菌され、かつ/又はアジュバント、及び保存剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤溶解促進剤浸透圧を調整する塩及び/又は緩衝液のような無毒性補助剤を含み得る。更に、本発明による組成物は、治療的有用性を有する他の物質を同様に含み得る。組成物は、従来の混合、細粒化又はコーティング方法によってそれぞれ調製され、かつ約0.1〜75%、好ましくは約1〜50%の有効成分を含む。

0034

本発明によるペプチドは、標的とし得る薬剤担体のような可溶性重合体と同様に結合され得る。かかる重合体には、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミド(aspanamide)−フェノール又はポリ酸化エチレン)−ポリリシンで、パルミトイル残基によって置換されたもの、デキストランを含み得る。更に、本発明による化合物は、薬剤、例えばポリ(乳酸)、ポリ(イプシロンカプロラクトン)、ポリ(ヒドロキシ酪酸)、ポリオルトエステルポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及び網状の配列決定された、又は両親媒性ヒドロゲル共重合体の制御された放出を行うために有用な生分解性重合体類と結合され得る。

0035

本発明によるペプチド投与のための薬量は、患者のタイプ、種族年齢、体重、性別及び医療状態;治療する状態の深刻さ;投与方法;患者の腎臓及び肝臓機能状態、及び使用する特殊な化合物又は塩の性質を含む多数の要因に応じて選択される。普通に経験を積んだ医師又は獣医ならば、治療する医療状態の進行を予防し、妨げ又は停止させるための有効量を容易に決定し、かつ処方するであろう。

0036

本発明による組成物は、0.1〜99%、好ましくは1〜70%の有効成分を含み得る。

0037

例として、本発明によるペプチドの経口薬量は、経口で約0.5〜1mg/日であり、かつ好ましくは0.5、1、2.5、5、10、15、25、50、100、250、500及び1000mgの有効成分を含む錠剤の形状で与えられる。ペプチドの有効な血漿濃度は、体重1kg当たり、かつ1日当たり0.002mg〜50mgに及ぶ薬量から得られる。

0038

本発明のペプチドは、単一の1日量、又は1日当たり2、3又は4分量の形状で投与され得る。

0039

本発明は、上記ペプチドの投与だけでなく、宿主、及び特に動物、植物又は原核生物形質転換するために、これらのペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の使用も同様に検討する。これらの配列は、文献中に記載された遺伝子工学技術に従って使用される。

0040

従って、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクターのような核酸分子、DNA又はRNA、及び例えば前記核酸分子を含む動物若しくは植物細胞、又は原核生物のような宿主、並びにそれらを含む特に薬剤組成物を同様に対象とする。

0041

植物若しくは動物細胞、又は原核生物を形質転換するために使用され得るかかるポリヌクレオチドの例として:
−ペプチドVKRGLKLKLAKLAKKLAKLAK(配列番号6)をコードする配列5’GTTAAACGT GGTTTG AAA TTG AAA TTGGCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA 3’(配列番号5)、
− ペプチドKLAKLAKKLAKLAKKHLKKHLKKHLK(配列番号8)をコードする配列5’AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAACATTTG AAA AAA CAT TTG AAA AAA CAT TTG AAA 3’(配列番号7)、
− ペプチドKLAKLAKKLAKLAKGKRKKKGKLGKKRDP(配列番号10)をコードする配列5’AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA AAA TTG GCT AAA TTG GCT AAA GGT AAA CGT AAA AAA AAA GGT AAA TTG GGT AAA AAA CGT GATCCT3’(配列番号9)を挙げることができる。

0042

従って、本発明は、植物を植物病原性細菌及び真菌に耐性を有するようにし、かつ環境に有害な化学殺虫剤の予防又は治療的な使用をこのようにして減少させるための、以上に記載したペプチドの農学的応用にも係る。有効量の抗菌及び/又は抗真菌ペプチド、又はそれを含む組成物を植物に直接適用することは、農学的応用の第1の実施形となる。この応用の第2の実施形は、上記の1つ又は幾つかの抗菌及び/又は抗真菌ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、植物細胞のDNAに安定して組み込むことからなる形質転換生成技術に基づく。このように形質転換した植物細胞により、細菌及び/又は真菌感染に耐性を有する性質を子孫に伝達する植物を再生させることが可能になる。植物の例として、稲、トウモロコシ菜種甜菜小麦、タバコ、トマトジャガイモ等を挙げることができる。

0043

ペプチド配列のアミノ酸は、一般的に1文字表記によって表すが、下記の命名法による3文字表記によっても表すことができる:
A Alaアラニン
C Cysシステイン
D Aspアスパラギン酸
E Gluグルタミン酸
F Pheフェニルアラニン
G Glyグリシン
H Hisヒスチジン
I Ileイソロイシン
K Lysリシン
L Leuロイシン
M Metメチオニン
N Asnアスパラギン
P Proプロリン
Q Glnグルタミン
R Argアルギニン
S Serセリン
T Thrトレオニン
V Valバリン
W Trpトリプトファン
Y Tyr チロシン

0044

本発明のその他の利点及び特徴は、例証として示し、かつ添付図面を参照する、これに続く実施例から現れるであろう。

発明を実施するための最良の形態

0045

材料。

0046

1)線状ペプチド。

0047

1号:VKRGLKLKLAKLAKKLAKLAK(配列番号6)
2号:KLAKLAKKLAKLAKKHLKKHLKKHLK(配列番号8)
3号:KLAKLAKKLAKLAKGKRKKKGKLGKKRDP(配列番号10)

0048

2)細菌、糸状菌及び酵母。

0049

種々の結果において使用し、かつ参照する株は、ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション)のコレクションバンク及びパストゥール研究所に由来する。

0050

3)細胞。

0051

Etablissement Francais du Sang(EFS)に由来し、かつ+4℃で保存される、全血液に由来する赤血球

0052

4)ペプチドの調製。

0053

ペプチド合成が、当業者に公知の技術により行われた。ペプチドは、水溶性である。

0054

結果。

0055

I −ペプチドの抗微生物活性

0056

A −液状媒体での最小抑制濃度CMI)及び最小殺細菌濃度(CMB)の決定。

0057

CMIは、96ウェルポリスチレンプレート細菌種全体に対して、液状媒体(NCCLS M7A5)で微量希釈法によって決定される。

0058

培地は、研究する細菌種に応じて補足物を加えた、ミュラーヒントブイヨンMHB)(pH=7.2〜7.4)である。すなわち:
−手のかからない株に、MHBのみ、
連鎖球菌リステリア及びナイセリアに、MHB+3%の溶解したウマ血液、
ヘモフィルスに、MHB+ヘミン15mg/l+NAD15mg/l+酵母抽出物5g/l。

0059

細菌接種は:
−CLED寒天:手のかからない株、
−血液+5%のウマ血液の入った寒天:連鎖球菌、リステリア、桿菌
チョコレート寒天:ヘモフィルス、ナイセリア、に対して行われた再分離から行われた。

0060

最終接種は、〜5×105CFU/ml(コロニー形成単位)である。50μlの細菌接種が、細菌種に応じて適切な培地(0.5〜512μg/ml)中で半分ずつに希釈されるペプチド溶液と等しい容量を含むウェル毎に分配される。培養物は、16〜20時間(連鎖球菌には20〜24時間)、周囲空気で35℃でインキュベートされた。

0061

μg/mlで表現したCMIは、細菌生育を示さない第1の濃度である。

0062

CMBの決定は、CMIプレートのインキュベーション及び読み取り後に行われる。

0063

体積3μlの各抗生物質濃度を、寒天:
−手のかからない株に:MH、
−連鎖球菌、リステリア、桿菌、ナイセリアに:MH+5%のヒツジ血液、
−ヘモフィルスに:HTM上に堆積させる。

0064

寒天を、雰囲気
−手のかからない株に:周囲空気で、
−連鎖球菌、リステリア、ヘモフィルス、ナイセリアに:5〜6%のCO2中で、35℃で18時間インキュベートする。

0065

CMBは、移植寒天上であらゆる細菌生育を抑制する(<0.1%の生存>、最も低い抗生物質濃度である。

0066

下記の表1で、細菌に対するペプチドの活性を報告する。

0067

結果は、ペプチド2号が、ペプチド1号よりも活性であることを明瞭に示している。ペプチド3号は、活性でない。

0068

CMBは、CMIに非常に近い:CMB/CMI比は、しばしば2に等しく、まれに4より大きく、このことは、ペプチド1号及び2号の殺細菌活性を表す。

0069

0070

下記の表2で、抗体物質への公知の耐性メカニズムを有する又は有さない臨床病原株全体に対して決定したペプチド1及び2の抗菌活性を報告する。
Pase:ペニシリナーゼ
Case:セファロスポリナーゼ
Case HN:抑制解除セファロスポリナーゼ
BLSE:拡大スペクトルベータラクタマーゼ
IPM:耐イミペネム
Meti R:耐メチリシン

0071

これらの結果は、ペプチド2が、より活性であることを確認している。更に、これらの結果は、ペプチド2及び臨床で一般に使用される抗生物質の間に交差耐性メカニズムがないことを明瞭に示している。

0072

0073

B −抗菌活性の反応速度研究。

0074

細菌大腸菌ATCC25922又は緑膿菌ATCC27853の分離したコロニーが、3〜5mlのミュラー−ヒントン(MH)培地中で懸濁状態に置かれ、かつ攪拌して一晩中、37℃でインキュベートされた。この夜の培養から、株の指数増殖期の培養が行われる;MH媒体は、一晩の培養により1/50eで植え付けられ、かつ攪拌して37℃で2時間インキュベートされた。細菌濃度は、MH媒体中で1〜2×106cfu/ml(コロニー形成単位)に調節される。

0075

1×105〜1×106cfuが、10mlのMHの最終体積において、漸増時間(30分、1時間、3時間及び6時間)でペプチド(xμg/ml)の存在下、又は不存在下で37℃でインキュベートされる。これらの異なるインキュベーション時間でのcfu数は、500μlの細菌懸濁液を、18時間37℃でインキュベートされたMH寒天の箱に広げて、評価される。

0076

図1で、大腸菌に対するペプチド1号の殺細菌活性の研究を報告し、図2で、大腸菌に対するペプチド2号の殺細菌活性の研究を報告し、かつ図3で、緑膿菌に対するペプチド2号の殺細菌活性の研究を報告する。

0077

結果は、ペプチド1号が、殺細菌性であることを示している。表1に記載されたCMIの4倍に相当する濃度64μg/mlによる6時間のインキュベーション後に3 Logより大きい生存細菌数の減少が観察される。

0078

図2及び3の結果は、ペプチド2号が大腸菌(図2)及び緑膿菌(図3)に対する高い殺細菌活性を有することを示している。

0079

大腸菌細菌の30分のインキュベーションから、懸濁液中で高い生存細菌数の減少が観察される。5 Logの減少が、表1に記載されたCMIに相当する濃度2μg/mlで観察される。より高い濃度に関して、30分のインキュベーション後に、いかなる生存細菌も検出できなかった。

0080

緑膿菌に対するペプチド2号の殺細菌活性は、表1に記載されたCMIに対応する濃度8μg/mlによる30分のインキュベーション後に、生存細菌の全体的欠如によって図3に表される。

0081

C −ペプチドの抗菌活性に対するヒト血清タンパクの影響の研究。

0082

細菌大腸菌ATCC25922又は緑膿菌ATCC27853の分離したコロニーが、3〜5mlのミュラー−ヒントン(MH)培地中で懸濁状態に置かれ、かつ攪拌して一晩中、37℃でインキュベートされた。この夜の培養から、株の指数増殖期の培養が行われた;MH媒体は、一晩の培養により1/50eで植え付けられ、かつ攪拌して37℃で2時間インキュベートされた。細菌濃度は、0、10、25又は50%のヒト血清を含むMH媒体中で〜5×105cfu/ml(コロニー形成単位)に調節される。50μlの細菌接種が、0、10、25又は50%のヒト血清が添加されたMH媒体中で半分ずつに希釈されるペプチド溶液と等しい容量を含むウェル毎に(96ウェルのポリスチレンプレート)分配される(0.5〜512μg/mlのペプチド濃度)。CMIは、37℃で保温器中で18時間培養した後に細菌生育の欠如(混濁度の欠如)を引き起こす最も低い濃度として決定される。CMIは、μg/ml(mg/l)で表す。

0083

下記の表3で、ヒト血清の不存在下及び存在下で評価したペプチド1号及び2号のCMIを報告する。

0084

0085

ペプチド1号の緑膿菌に対する抗菌活性は、血清の存在下で修飾されない。大腸菌に対するペプチド1号の活性は、培地中で25%及び50%のヒト血清の存在下で増加する。

0086

ヒト血清の漸増濃度は、大腸菌に対するペプチド2の抗菌活性に効果を有さない。緑膿菌に対するペプチド2号の活性は、25%及び50%のヒト血清の存在下で減少する。

0087

D −糸状菌及び酵母に関する液状媒体での最小抑制濃度(CMI)の決定。

0088

テストしたペプチド濃度:0.2μg/ml〜100μg/ml。

0089

下記の表4で、真菌類に対するペプチドの活性を報告する。

0090

0091

結果は、テストした3つのペプチドが、クリプトコックスネオフォルマンスに対して活性であることを示す。

0092

II −ペプチドの溶血活性の評価。

0093

1×106のヒト赤血球が、150μlの最終体積において、ペプチドの漸増濃度(0〜500μg/ml)により30分間インキュベートされる。溶血活性は、細胞上清波長414nmでの吸光度(Abs)(ヘモグロビン吸光度)の測定によって評価される。水中での赤血球インキュベーション後の上清の吸光度は、100%の溶血(Abs100)に相当し、かつPBS中での赤血球インキュベーション後の上清の吸光度は、0%の溶血(Abs0)に相当する。パーセンテージで表わされるペプチドの溶血活性は、(Abspeptide−Abs0)/Abs100×100に相当する。

0094

図4で、ヒト赤血球に対するペプチド1号、2号及び3号の溶血活性の研究を報告する。ペプチドは、溶血活性を示さない。

0095

III −ペプチドの安定性の評価。

0096

ヒト血漿の3.9mlの体積が、100μlのペプチド2号、2mMに添加される。安定性は、37℃で作られた。0、0.5、1、2、4及び6時間後、3×200μlが、採取され、かつ水中の800μlのトリフルオロ酢酸(TFA)0.1%が添加される水中の10μlの内標準(ペプチド1号)、500μMに添加される。体積1mlのこの混合物が、水中の1mlのTFA0.1%、アセトニトリル中の1mlのTFA0.1%、及び水中の1mlのTFA0.1%と予め平衡を取った樹脂C2(EC)上に堆積される。水中の1mlのTFA0.1%による2回の洗浄後、ペプチド及びこれら代謝物溶出が、メタノール中の1mlのTFA0.1%によって行われる。これは、次に空気流で乾燥され、かつ、水中の200μlのTFA0.1%中に戻される。100μlの体積は、溶剤Aとして、水中のTFA0.1%により、かつ溶剤Bとして、アセトニトリル中のTFA0.1%により、カラムLuna C18(2)、3μ、4.6×100mm(Phenomenex)上でのHPLCによって分析される。12分でのBの15〜45%の勾配が、1.2ml/分の流量での溶出のために使用され、かつ検出は、214nmで行われた。

0097

図5で、異なる血液型に由来する3組のヒト血漿:A+(A);B+(B)及びO+(C)におけるペプチド2の安定性の研究を報告する。(◆:ペプチド2号、□及び△:代謝物

0098

2つの主要な代謝物が、ペプチド2号の開裂によって生成される。ペプチド2号は、ヒト血漿中の6時間のインキュベーションの後に最大で41%分解する。血漿が由来する血液型が、何であれ、ペプチド分解に著しい差異はない。

0099

IV −ペプチドのインビボでの毒性の評価。

0100

各ペプチドの最大耐量MDT)は、注射後の28日に、雌マウスOF1に対して決定される。MDTは、注射可能な最大非致死量として定義される。ペプチドは、約15分の潅流で静脈内に投与される。注射量は、10μl/gであり、潅流時間は、1.2ml/時であり、かつ賦形剤は、0.8%のNaCl溶液である。

0101

下記の表5で、ペプチド1号及び2号のMDTを報告する。

0102

図面の簡単な説明

0103

大腸菌に対する配列番号6の配列のペプチド1号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
大腸菌に対する配列番号8の配列のペプチド2号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
緑膿菌に対する配列番号8の配列のペプチド2号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
ヒト赤血球に対する配列番号6、配列番号8、配列番号10の配列のそれぞれペプチド1号、2号及び3号の溶血活性の研究を報告する。
ヒト血漿中の配列のペプチド2号(配列番号8)の安定性を報告する。

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