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技術 情報化核酸含有紙材及びその製造方法

出願人 日産自動車株式会社樋口恒彦
発明者 横山博志山中雅彦渡邉健太郎樋口恒彦平林茂樹
出願日 2004年12月15日 (16年2ヶ月経過) 出願番号 2004-362172
公開日 2006年6月29日 (14年7ヶ月経過) 公開番号 2006-166761
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 紙(4)
主要キーワード 情報素子 ブランク紙 美術作品 円形皿 製品認証 担持微粒子 検出指標 真偽確認
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2006年6月29日)のものです。
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図面 (3)

課題

取り除くことができない個別認証情報を備え、この情報を解読することによって、その出所経歴などを特定することができる情報化核酸含有紙材と、このような情報化核酸を含有する紙材の製造方法を提供する。

解決手段

DNAに代表される核酸の配列を個別認証情報として利用し、例えば任意且つ既知塩基配列を有する部位を備えた情報化核酸を含む溶液を原紙中に浸透させることによって、望ましくは紙100gに対して0.5〜500μgの情報化核酸を含有させる。

概要

背景

これまでの個別認証には、ナンバープレート紙幣などの透かし印刷ICチップクレジットカード写真などが利用されている。
しかし、これらの個別認証手段は、剥離、切断、消去などによって製品から除去することができるという欠点があった。このため、製品から取り除くことができず、消失しない認証情報の開発が期待されている。

一方、DNAは、元来全ての生物が保有し、それぞれの生物において全ての遺伝情報を含む情報生体分子であり、その多くは多数の蛋白質アミノ酸配列に対応するものである。即ち、DNAは、デオキシアデノシン(dA)、デオキシグアノシン(dG)、デオキシシトシン(dC)、及びデオキシチミン(dT)がリン酸エステル結合を介して一定の方向性をもって結合しており、その塩基数をn個とすると、その長さのDNAは4n種類存在することになる。従って、例えばわずか16種類の塩基数でもそれぞれ区別可能な約43億種類のDNAが存在し得ることになる。
現在では、数十の塩基配列を有するDNAであれば、どのような配列のものでも任意に合成することができ、しかも、ある程度以上の量があれば、自動配列読み取り装置シーケンサー)を用いて自動的にその配列を決定することができる。

このようなDNAの適用技術としては、水不溶性媒体にDNAを含ませた偽造防止ラベルを製品に用いることによって、該DNAの存在・不存在を手掛りにして、その製品の真偽を明らかにすることが提案されている(特許文献1参照)。
特開2004−159502号公報

概要

取り除くことができない個別認証情報を備え、この情報を解読することによって、その出所経歴などを特定することができる情報化核酸含有紙材と、このような情報化核酸を含有する紙材の製造方法を提供する。DNAに代表される核酸の配列を個別認証情報として利用し、例えば任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備えた情報化核酸を含む溶液を原紙中に浸透させることによって、望ましくは紙100gに対して0.5〜500μgの情報化核酸を含有させる。なし

目的

本発明は、従来技術におけるこのような課題に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、取り除くことができない個別認証情報を備え、この情報を解読することによって、その出所・経歴などを特定することができる情報化核酸含有紙材と、このような情報化核酸を含有する紙材の製造方法を提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

任意且つ既知塩基配列を有する部位を備えた情報化核酸を含んでいることを特徴とする情報化核酸含有紙材

請求項2

上記情報化核酸の含有量が紙100gに対して、0.5〜500μgであることを特徴とする請求項1に記載の情報化核酸含有紙材。

請求項3

上記情報化核酸が微粒子担持された状態で添加されていることを特徴とする請求項1又は2に記載の情報化核酸含有紙材。

請求項4

上記微粒子の平均粒径が0.01〜1μmであることを特徴とする請求項3に記載の情報化核酸含有紙材。

請求項5

上記微粒子の添加量が紙100gに対して、0.5〜20gであることを特徴とする請求項3又は4に記載の情報化核酸含有紙材。

請求項6

上記情報化核酸を含有する溶液を紙に浸透させることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つの項に記載の情報化核酸含有紙材の製造方法。

請求項7

上記情報化核酸を含有するパルプスラリーを抄紙することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つの項に記載の情報化核酸含有紙材の製造方法。

技術分野

0001

本発明は、紙材及び紙製品に係わり、さらに詳しくは、出所経歴情報などの個別認証に利用できる情報化核酸を含有する情報化核酸含有紙材と、このような情報化核酸を含有する紙材の製造方法に関するものである。

背景技術

0002

これまでの個別認証には、ナンバープレート紙幣などの透かし印刷ICチップクレジットカード写真などが利用されている。
しかし、これらの個別認証手段は、剥離、切断、消去などによって製品から除去することができるという欠点があった。このため、製品から取り除くことができず、消失しない認証情報の開発が期待されている。

0003

一方、DNAは、元来全ての生物が保有し、それぞれの生物において全ての遺伝情報を含む情報生体分子であり、その多くは多数の蛋白質アミノ酸配列に対応するものである。即ち、DNAは、デオキシアデノシン(dA)、デオキシグアノシン(dG)、デオキシシトシン(dC)、及びデオキシチミン(dT)がリン酸エステル結合を介して一定の方向性をもって結合しており、その塩基数をn個とすると、その長さのDNAは4n種類存在することになる。従って、例えばわずか16種類の塩基数でもそれぞれ区別可能な約43億種類のDNAが存在し得ることになる。
現在では、数十の塩基配列を有するDNAであれば、どのような配列のものでも任意に合成することができ、しかも、ある程度以上の量があれば、自動配列読み取り装置シーケンサー)を用いて自動的にその配列を決定することができる。

0004

このようなDNAの適用技術としては、水不溶性媒体にDNAを含ませた偽造防止ラベルを製品に用いることによって、該DNAの存在・不存在を手掛りにして、その製品の真偽を明らかにすることが提案されている(特許文献1参照)。
特開2004−159502号公報

発明が解決しようとする課題

0005

しかし、上記特許文献1に記載の技術は、基本的にはDNAと水不溶性媒体の混合方法に係るものであり、当該特許文献1には、製品の真偽確認方法として、PCR法によるリボ核酸増幅の有無を確認することによってリボ核酸入り対象製品を同定することが示唆されているに過ぎない。
また、DNAの存在・不存在を検定指標とする真偽確認データはもとより、DNAの配列を検定指標とし、同種製品における個々の製品ごとの認証を可能にする個別認証に関するデータについては全く開示されていない。

0006

一方、画用紙印刷物などの紙製品に、その出所・履歴などに係わる情報をその全体に広範囲盛り込んでおき、必要に応じてそれを認証できるようにする技術の確立要請があり、これが実現できれば、これらの出所・履歴を個別認証することができるようになり、例えば盗難品の所有者特定、紙幣や、小切手手形株券などの有価証券類証明書類美術作品などの真贋判定などに広く利用することができる。

0007

本発明は、従来技術におけるこのような課題に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、取り除くことができない個別認証情報を備え、この情報を解読することによって、その出所・経歴などを特定することができる情報化核酸含有紙材と、このような情報化核酸を含有する紙材の製造方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、DNAに代表される核酸の配列を個別認証情報として利用するという着想に基づき、当該核酸を紙材を構成する繊維間やその表面に付着させておき、必要に応じてその塩基配列を読み取るようにすることによって、上記課題の解決が可能であることを見出し、本発明を完成するに到った。

0009

すなわち、本発明は上記知見に基づくものであって、本発明の情報化核酸含有紙材は、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備えた情報化核酸を当該紙材中に含んでいることを特徴とし、本発明の情報化核酸含有紙材の製造方法においては、情報化核酸を含有する水溶液溶媒溶液を原紙に浸透させたり、パルプスラリーに情報化核酸を添加した上で、抄紙したりするようにしたことを特徴としている。

発明の効果

0010

本発明によれば、紙材中に情報化核酸を含ませたことから、調査対象の紙や紙製品から情報化核酸を取り出し、その塩基配列を決定することによって、塩基配列を検出指標とする製品情報、例えば出所・経歴データの個別認証が可能になり、調査対象の出所・経歴などの情報を得ることができるという極めて優れた効果がもたらされる。また、このような情報化核酸は、視認することができず、しかも紙材全体に亘って広範囲に分布させることができることから、除去することは実質的に不可能であって、優れた個別認証手段となる。

発明を実施するための最良の形態

0011

以下、本発明の情報化核酸含有紙材及びその製造方法についてさらに詳細に説明する。なお、本明細書において「%」は、特別な記載がない限り質量百分率を示すものとする。

0012

本発明の情報化核酸含有紙材は、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備えた情報化核酸を含有するものである。
なお、本発明において「紙材」とは、特に種類や用途を問わず、板紙(ボール紙)や段ボールなどをも含むものとする。

0013

ここで、情報化核酸とは、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備えたものであって、上記したように、塩基配列の異なる情報化核酸を製品にあらかじめ仕込んでおくことによって、塩基配列を検出指標とする種々の製品情報、例えば出所・経歴データなどの個別認証が可能となり、しかも製品から除去することが実質的に不可能な個別認証手段となるものである。
そして、この情報化核酸とは、DNA(デオキシリボ核酸)、RNA(リボ核酸)及びこれらの誘導体を言い、天然型でも人工型でもよいが、使用環境が厳しい製品中に添加することを考慮すると、構造的に安定な人工型を使用することが好ましい。人工型においては天然型には存在しない結合様式の(例えば、ヌクレオシド同士の結合がリン酸エステル結合だけでなく、チオリン酸エステル結合のような非天然型を含むなどの)配列を形成することができる。

0014

なお、当該情報化核酸において、塩基配列部位が任意であるとは、検出可能な塩基配列である限り無作為に選択され得るものであることを意味し、塩基配列部位が既知であるとは、個別認証に用いられる塩基配列が予め把握されているものであることを意味する。

0015

上記情報化核酸の大きさとしては、当該核酸全体における塩基数が200以下であることが好ましい。すなわち、塩基数が200を超えると合成の段階でごく僅かずつ未反応部位が生成し、塩基がかけたものの含有量が増大し易い。なお、100塩基程度であることがより好ましい。
また、チミンがダイマー化するのを抑制する観点から、上記塩基配列においてチミン同士が隣接しないことが好ましい。

0016

さらに、上記情報化核酸としては、OH基と反応する化合物と併用する場合や、厳しい環境下で使用される場合の安定性を向上させる観点から、保護基により誘導化されていることが好ましく、具体的には、5´位、3´位のいずれか一方又は双方にある水酸基リン酸エステル基アシル基アルコキシカルボニル基ベンジル基置換ベンジル基アリル基などを用いて誘導化することができる。
図1(A)に天然型DNA、図1(B)に5´位を誘導化したDNAを示す。

0017

また、単離や精製の利便性を高める観点から、5´位の水酸基をビオチン又は蛍光分子により誘導化することが好ましい。具体的には、ビチオンを用いるとアビジンという蛋白質を結合したカラムに選択的に吸着され易くなる。一方、フルオレセインなどの蛍光分子を用いると核酸自体が蛍光をもつようになるため、感度よく検出でき、精製等が容易になる。このように、単離や精製の利便性を高めることにより、個別認証が極めて容易なものとなる。

0018

さらに、例えば5´位を硫黄置換した場合には、水で抽出したものをさらに金(Au)をコーティングした担体のカラムに通すことによって容易に分離することができる。
なお、情報化核酸としてRNAを用いるときは、安定性を向上させる観点から2´位の水酸基を上記保護基により誘導化することもできる。

0019

また、情報化核酸を抽出して個別認証をする場合において、少ない含有量でも効率良く検出されるようにする観点から、上記塩基配列部位が該情報化核酸の増幅に用いられる部位であることが好ましい。このような情報化核酸の増幅方法としては、相乗的に増幅させることのできるポリメラーゼ連鎖反応PCR)を適宜採用することができる。

0020

上記PCR法では、情報化核酸が極微量であっても極度に増幅することができ、例えば、DNAの末端数十塩基と相補的な塩基(プライマー)の存在下に温度制御を行いつつ、耐熱性DNAポリメラーゼを作用させると、元のDNAを倍増させることができる。例えば、これを30回繰り返せば、数億倍に増幅させることができる。
このような増幅によって微量のサンプルからでもその配列を決定するのに十分な量のDNAを得ることができるようになり、延いては配列に対応する情報からそれが含まれていた製品の「身元」が判明することになる。

0021

また、このとき、上記増幅に用いられる部位として、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に必要なプライマー対応部位を両端に有することが好ましい。すなわち、情報化核酸としては、プライマーを備えていないものを使用することもできるが、プライマーを備えることによってより短時間で識別できるようになることによる。
このようなプライマー対応部位について、塩基数の下限値は5であることが好ましい。より好ましくは10以上であることが良い。塩基数が5未満では、区別できる核酸の数が減少し、多くの製品の識別に時間がかかるようになる。一方、塩基数の上限値としては、100であることが好ましい。これは、塩基数が100を超えると、いずれかの位置の塩基を欠いた副生成物比率が高くなり、精製に手間が掛かり、場合によっては困難となる傾向があることによる。
なお、情報化核酸としてRNAを用いるときは、逆転写酵素を用いて配列の相補的なDNAを得、このDNAを用いてPCR法を行うことができる。

0022

また、上記情報化核酸としては、上記塩基配列部位の他に更に認証情報部位を有することが好ましく、これによって、より詳細な情報設定により個別認証を実行することができる。
例えば、図2に示すように、両端にプライマー対応部位を備えた情報化DNAであれば、中央にm個の塩基数の配列を置き(B1〜Bm)、この部分の配列情報を認証情報に対応させる。その両端には、それぞれl(エル)個、n個のプライマーに相補的な配列(X1〜Xl,P1〜Pn)を連結する。この部分が存在することにより初めてPCR法の採用が可能となる。

0023

情報化DNAはこの1本鎖のもの又はそれと相補的な配列のDNAと複合体を形成した2本鎖のものを情報素子として用いることができる。このプライマー対応部位の配列は、できるだけ相補的配列の結合が安定になり且つPCR法による増幅が円滑に進行するように工夫することができる。
なお、図2において、X1〜Xl、B1〜Bm、P1〜Pn のそれぞれは、デオキシアデノシン(dA)、デオキシグアノシン(dG)、デオキシシトシン(dC)及びデオキシチミン(dT)のいずれかより構成される。

0024

そして、情報化核酸の塩基配列を検出指標とする製品の個別認証において、PCR法によって情報化核酸を増幅させるに際しては、抽出された情報化核酸の溶液、PCR緩衝液滅菌蒸留水、少なくとも1種のプライマー、2,3−ジデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)及びポリメラーザを混合し、
(1)92〜95℃で2〜5分間加熱し、次いで
(2)a:92〜95℃で30〜60秒間、
b:20〜50℃で30〜60秒間、
c:70〜80℃で30〜120秒間
加熱サイクルを20〜50回繰返し、しかる後
(3)70〜80℃で1〜10分間加熱処理することが好ましい。
なお、このとき、情報化核酸の塩基性配列の任意性を高めるという観点からは、2種のプライマーを用いることが望ましい。

0025

ここで、(1)の条件範囲については、92℃×2分よりも低温度短時間ではDNAの2本鎖への分離が困難になり、95℃×5分よりも高温度長時間では酵素失活することによるが、94℃で5分間加熱することが特に好ましい。なお、紙材材料に含まれる情報化核酸が1本鎖である場合には、この(1)工程は不要である。
また、(2)−aにおける条件範囲は、92℃×30秒よりも低温度短時間では増幅率が低下し、95℃×60秒よりも高温度長時間では酵素が失活することによるが、94℃で30秒間加熱することが特に好ましい。
さらに、(2)−bの条件範囲については、20℃×30秒よりも低温度短時間ではプライマーとDNAの結合が困難になり、50℃×60秒よりも高温度長時間では酵素が失活することによるが、40℃で30秒間加熱することが特に好ましい。
また、(2)−cの条件範囲は、70℃×30秒よりも低温度短時間では伸長が不十分となり、80℃×120秒よりも高温度長時間では酵素が失活することによるが、72℃で30秒間加熱することが特に好ましい。。

0026

そして、(3)においては、72℃で7分間加熱することが特に好ましい。すなわち、70℃×1分よりも低温度短時間では伸長が不十分となり、80℃×10分よりも高温度長時間では時間の無駄となることによる。
さらに、上記(2)におけるa〜cの加熱サイクルの繰返し数については、20回よりも少ないと増幅率が低下し、50回より多いと時間の無駄となるからであるが、30回が特に好ましい。

0027

図3は、上記した情報化核酸による製品の個別認証手順の一実施形態を示す工程図であって、図に示すように、先ずS1において、製品、すなわち紙材や紙製品から情報化DNAを抽出する。
次いで、S2において、凍結乾燥によって抽出溶液濃縮したのち、S3において、2種類のプライマーとポリメラーゼを加える。

0028

次に、S4において、PCRを繰り返すことによってDNAを増幅し、S5において、残った余分なプライマーを一本鎖DNA開裂酵素による分解する。
そして、S6において、二本鎖である情報化DNAをゲル濾過によって精製し、さらにS7において、シーケンサーによって情報化DNAの配列を決定する。

0029

上記S1においては、紙材を粉末にして、少量の水と混ぜればよいが、情報化DNAを微粒子担持させる際に、化学的結合させた場合には、例えば加水分解することによって効率良く抽出することができるようになる。また、S2においては、例えば遠心エバポレーターを用いて濃縮しても良い。さらに、S5においては、一本鎖DNA切断酵素として、例えばTaqDNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tf1 DNAポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼ、Bca BESTポリメラーゼ、KODDNAポリメラーゼなどを使用することができる。また、S6とS7との間に、さらにS3及び4と同様の操作を繰り返して、目的のDNAを増幅させることもできる。また、S7においては、質量分析装置によって配列決定を行なってもよく、シーケンサーによる配裂決定と組み合わせても良い。

0030

また、塩基配列の決定にあたり、製品から抽出される情報化核酸のデータと、少なくとも上記情報化核酸のデータを含む情報化核酸データベースとを比較することが望ましい。あらかじめ把握された情報化核酸のデータベースと比較することによって、製品認証にかかる時間を大幅に減らすことが可能になる。
このようなデータベースに蓄えられるデータとしては、例えば電気泳動時間やゲル濾過した際の移動距離(これは、情報化核酸自体をコントロールレーンに流すだけでも良い)などを挙げることができる。

0031

本発明の情報化核酸含有紙材における上記情報化核酸の含有量としては、紙100gに対して0.5〜500μgであることが好ましく、さらには50〜100μgの範囲とすることがより好ましい。
情報化核酸含有量が紙100gに対して0.5μgより少ない場合には、当該紙材や紙製品など、対象となる製品から情報化核酸を検出して塩基配列を識別することができない可能性があり、500μgを超えた場合には、コストが高くなり無駄が生じる。

0032

また、上記情報化核酸は、紙材中に、そのまま単体の状態で含有されているよりも、シリカ酸化亜鉛酸化チタン酸化モリブデン酸化タングステンチタン酸バリウムなどの微粒子に担持された状態で添加されていることが好ましく、これによって当該情報化核酸を紙材中に確実、安定に添加し、分散させることができるようになると共に、当該紙材中に長期間安定に保持することができ、このような情報化核酸の塩基配列を検出指標とする製品の出所・経歴の個別認証が長期にわたって可能なものとなる。
ここで、「担持」とは、情報化核酸が上記微粒子の表面に乗せられた状態で微粒子と共に移動できる程度に密着していることを意味し、情報化核酸が上記微粒子の表面に強固に固着していても、微粒子表面やその凹部内に使用に耐える程度の強度で付着していてもよい。

0033

上記のような微粒子に、情報化核酸を担持するに際しては、上記微粒子を滅菌蒸留水中に分散させて懸濁液となし、この懸濁液に上記情報化核酸をそのまま、あるいは当該情報化核酸を滅菌蒸留水に溶解させた情報化核酸水溶液を加え、乾燥することによって製造することができる。このとき、情報化核酸については、一部を水溶液とすることなくそのままの状態で加え、残部を水溶液の状態で加えるようにしても何ら差し支えない。

0034

また、このとき、上記懸濁液には、アルコール(例えば、メタノールエタノールプロパノールブタノールペンタノールヘキサノールヘプタノールオクタノールノナノールなど)、エステル(例えば、酢酸エチル酢酸ブチル酢酸プロピルなど)、ケトン(例えば、アセトンジメチルケトンメチルエチルケトンジエチルケトンなど)及び芳香族溶剤トルエンヘキサンシクロヘキサンキシレンなど)の溶媒をさらに添加することも望ましく、これによって上記微粒子の懸濁液中における分散性が向上すると共に、情報化核酸が添加された後の水分及び溶剤分の揮発が促進されることになる。
なお、これら溶媒は1種のみに限定されず、2種以上の溶媒を併用することも可能である。また、これら溶媒は、情報化核酸と同時、あるいは情報化核酸を加えた後に添加しても、特に差し支えはない。

0035

上記溶媒の添加量としては、アルコールの場合には、滅菌蒸留水/アルコールの容量比を1〜99の範囲とすることが好ましく、アルコール以外の溶媒の場合、即ちエステル、ケトン、芳香族溶剤の場合には、滅菌蒸留水/溶媒の容量比を1〜75の範囲とすることが好ましい。
これは、溶媒の添加量が少な過ぎると、溶媒添加による上記効果が十分に得られず、逆に多過ぎても、水との相溶性低下によって水が揮発せずに残り易くなり、上記効果が十分に得られないようになる傾向があることによる。

0036

また、上記微粒子のサイズとしては、平均粒径が0.01〜1μmの範囲、好ましくは0.02〜0.1μmの範囲のものとすることが望ましい。これは、微粒子の平均粒径が0.01μmに満たないと情報化核酸の識別精度が低下し、1μmより大きくなると紙への浸透量が少なくなって、検出が困難になる傾向があることによる。

0037

上記微粒子における情報化核酸の担持量としては、微粒子100gに対して、0.5〜10,000μg、より好ましくは1.0〜1000μgの範囲とすることが望ましい。上記情報化核酸の担持量が微粒子100g当たり0.5μgに満たない場合は、情報化核酸を製品中に安定に添加することができなくなって検出精度が低下する一方、10,000μgを超えた場合には、情報化核酸を微粒子に安定に担持することができなくなって、フリーの情報化核酸が生じ、分散しにくくなる傾向があることによる。

0038

本発明の情報化核酸含有紙材において、上記微粒子の添加量としては、紙100gに対して、0.5〜20g、さらには1〜10gの範囲とすることが望ましい。微粒子添加量が紙材100g当たり0.5gに満たないと、サンプリングされた紙材中の微粒子の量が少なくなって、情報化核酸の識別精度が低下し、20gを超えると、紙の強度が低下する可能性がある。

0039

紙材に情報化核酸を含有させるには、情報化核酸を、望ましくは微粒子に担持させた状態で含有する溶液、例えば水溶液やアルコールなどの溶媒溶液を紙材にスプレーしたり、塗布したり、あるいは当該溶液中に紙材を浸漬したりすることによって、浸透させたのち乾燥することによって行なうことができる。
また、抄紙工程において、パルプスラリー(パルプ懸濁液)に情報化核酸を混合した状態で抄紙することによっても、情報化核酸を紙材中に含有させることができる。

0040

以下に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

0041

〔1〕情報化核酸担持微粒子の作製
〔1−1〕情報化DNAの合成
ホスホアミダイト法にてヌクレオシドを逐次結合させることによって、GGGATTAATTGGAGGの配列を有する認証情報部位の両端に、TGCACGACCGTGTACTC及びAGTGGACACGTTGGTCGGの配列を有するプライマー対応部位をそれぞれ結合し、情報化核酸としての情報化DNA(5´‐TGCACGCACCGTGTACTC‐GGGATTAATTGGAGG‐AGTGGACACGTTGGTCGG‐3´)を合成した。

0042

〔1−2〕懸濁液の調整
担体用の微粒子として、シリカコートを施した平均粒径0.02μmの酸化亜鉛(昭和電工(株)製ZS−032)、平均粒径1μmのシリカ(鈴木油脂工業(株)製E−2C)及び平均粒径4μmのシリカ(鈴木油脂工業(株)製E−16C)の3種を使用し、これら微粒子8gに、それぞれ容量比で30%のエタノールを含有する滅菌蒸留水30mLを加えて撹拌し、各微粒子の懸濁液を得た。

0043

〔1−3〕情報化DNAの添加
上記〔1−1〕により得られた情報化DNA10nmol(200μg)を滅菌蒸留水0.5mLに溶解し、得られた情報化DNA水溶液を上記各懸濁液に加えて良く撹拌し、さらに4mLのエタノールを加えて撹拌した。

0044

〔1−4〕自然乾燥
情報化DNAを加えた上記懸濁液をそれぞれプラスチック製の円形皿に注ぎ、その上部を通気性の良い紙あるいは布で覆った状態で、2日間自然乾燥した。

0045

〔1−5〕減圧乾燥
上記〔1−4〕によってほぼ乾燥したものをデシケータに入れ、40℃の加熱下で減圧乾燥し、十分に乾燥させた。

0046

〔1−6〕粉砕
上記〔1−5〕により、十分に乾燥され、塊状の微粉末をそれぞれ乳鉢に入れて砕き、もとの微粉末状として、情報化DNA担持微粒子を得た。

0047

〔2〕情報化DNA含有紙材の調整
〔2−1〕情報化DNA水溶液の調整
上記〔1−6〕により得られた各情報化DNA担持微粒子4gをそれぞれ滅菌蒸留水96gに加えて情報化DNA水溶液とした。

0048

〔2−2〕情報化DNA水溶液の含浸
厚さ0.5mm、100mm×100mmの大きさの紙片に、上記情報化DNA水溶液をそれぞれ所定量だけスプレーした後、乾燥することによって、表1に示すように、情報化DNA含有量、微粒子添加量、添加微粒子径がそれぞれ異なる20種類の紙片を得た。

0049

〔3〕DNAの検出
〔3−1〕紙片の裁断
上記各実施例の紙片をカッターによってそれぞれ細かく裁断した。

0050

〔3−2〕DNA抽出
得られた各紙細片に滅菌蒸留水5mLをそれぞれ加え、マグネチックスターラーによって撹拌し、これらに含まれる情報化DNAを水層にそれぞれ抽出した。

0051

〔3−3〕水溶液濃縮
遠心分離機を用いて、各紙細片と水層を分離し、水層を遠心エバポレータを用いてそれぞれ濃縮した。

0052

〔3−4〕処理液調整
溶出回収した各DNA溶液(5μL)に、それぞれPCRbuffer(5μL)、Taq polymerase(0.25μL)、滅菌蒸留水(24.75μL)、5μMの第1プライマー(5´−TGCACGCACCGTGTACTC−3´:5μL)、5μMの第2プライマー(5´−CCGACCAACGTGTCCACT−3´:5μL)、及び2mMの2,3−ジデオキシヌクレオシド三リン酸(5μL)を混合した。

0053

〔3−5〕熱サイクル
上記各混合液を94℃で5分間加熱後、94℃で30秒加熱→40℃で30秒加熱→72℃で30秒加熱のサイクルをそれぞれ30回繰り返した。

0054

〔3−6〕保存
上記加熱サイクルを加えた各混合液に、それぞれ72℃で7分間の加熱処理を施した後、4℃で保存した。

0055

〔3−7〕精製
1本鎖DNA開裂酵素S1ヌクレアーゼ(一本鎖DNAに特異的に反応)を用いて、余分なプライマーを分解し、目的の2本鎖情報化DNAをゲル濾過によって精製した。

0056

〔3−8〕プライマー及びdNTP添加
精製した情報化DNAに一種類のプライマー5´−TGCACGCACCGTGTACTC−3´及び蛍光標識した2,3−ジデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)を混合した。

0057

〔3−9〕熱サイクル
上記工程〔3−5〕と同様に、加熱サイクルを繰り返した。

0058

〔3−10〕配列決定
ゲル濾過精製後、自動シーケンサーに供し、配列決定を行った。

0059

〔3−11〕検出結果
上記工程による情報化DNAの識別結果を表1に併せて示す。なお、表中「○」は上記した方法によって紙材に含まれる情報化DNAの配列が容易に識別できたもの、「△」は上記PCRによる増幅回数を増やすことが必要であるものの、情報化DNAの配列の識別が可能であったものを示す。

0060

〔4〕紙片強度の評価
上記各実施例で得られた各紙片について、5人のパネラーに手で破断してもらい、情報化DNA担持微粒子を含まないブランク紙よりも強度が低下していると判断した人数が0〜1人の場合を「○」、2〜3人の場合を「△」、4〜5人の場合を「×」として、各実施例紙片の強度を評価した。

0061

0062

表1に示した結果から明らかなように、本発明の情報化核酸含有紙材においては、情報化核酸の識別が可能であることがわかる。また、実施例1〜12及び実施例18〜20の情報化核酸含有紙材料は、実施例13〜17の情報化核酸含有紙材と比較して、より少ないPCR増幅回数で情報化核酸の識別が可能となることがわかる。さらに、実施例1〜17の情報化核酸含有紙材は、実施例18〜20の情報化核酸含有紙材と比較して、紙片の強度に優れることがわかる。

図面の簡単な説明

0063

DNAの一例として、天然型DNA(A)及び5´位を誘導化したDNA(B)を示す構造式である。
本発明に用いる情報化核酸の一例として、認証情報部位の両端にプライマー対応部位を備えたDNAの構造を示す概略図である。
本発明の紙材に含まれる情報化核酸の検出手順の一例を示す流れ概略図である。

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