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技術 精度管理用疑似組織及びそれを用いた精度管理方法

出願人 シスメックス株式会社
発明者 山崎正稔藤本敬二
出願日 2005年2月1日 (15年10ヶ月経過) 出願番号 2005-024918
公開日 2006年6月1日 (14年6ヶ月経過) 公開番号 2006-136310
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物・酵素関連装置 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード セット孔 水素移動重合 ゲル化剤溶液 被検査物質 磨耗状態 取り外しボタン 精度管理用 容器セット
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (10)

課題

遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織を提供する。

解決手段

核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織。

概要

背景

近年臨床診断の分野において遺伝子検査が急速に普及している。遺伝子検査とは、核酸染色体などを分析して疾患に関連する変異や核型などの有無を臨床目的で検査することである。遺伝子検査の一例として、生体から切除した組織内に癌細胞由来の核酸が存在するかどうかを判定する検査がある。その検査工程は、主に前処理、核酸増幅、及び検出の三工程からなる。

前処理には様々な方法がある。例として、先ず検査目的で生体から切除した組織に前処理用試薬を加える。次に試薬を添加された切除組織ホモジナイズし、得られたホモジネートから核酸を含む測定用試料を調製する。
核酸増幅では、前記測定用試料をサンプル容器に収容してそこに酵素プライマなどの試薬を加え、核酸増幅反応によって標的核酸増幅する。
検出では、蛍光染色された標的核酸の蛍光測定や増幅に比例して産生される副産物濁度測定などにより、切除組織中の標的核酸の有無の判定又は濃度の算出を行う。

上述のような遺伝子検査では、各工程(前処理、核酸増幅、及び検出)における様々な要素が測定結果に影響を与える。このため、遺伝子検査の分野において、各工程の精度及び信頼性の確保のための精度管理の充実が重要となる。

核酸増幅及び検出に関しては、ポジティブコントロールとして濃度既知の標的核酸を含むコントロール溶液、及びネガティブコントロールとして増幅されるべきではない核酸を含むコントロール溶液を用いて精度管理を行っている。

ポジティブコントロールは標的核酸の増幅及び増幅された標的核酸の検出が正常に行われているかどうかを確認するためのものであり、ネガティブコントロールは増幅されるべきではない核酸が増幅しないことを確認するためのものである。

概要

遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織を提供する。核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織。

目的

前処理に関しては、精度管理が行われていないことが現状である。ホモジナイズを手動で行う場合、前処理を行う者の技量によって切除組織のホモジナイズの程度に差がある。また、ホモジナイズを自動破砕装置などによって自動的に行う場合、ブレンダ回転数等のホモジナイズ条件の設定や継続使用によるブレンダの磨耗などにより切除組織のホモジナイズの程度に差が生じる。従って、ホモジナイズを手動で行う場合も、自動破砕装置などによって行う場合も、ホモジナイズ条件等の前処理の精度管理が必要である。従って、前処理の精度を管理するための精度管理用物質及びこの精度管理用物質を用いた精度管理方法の開発が望まれている。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

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請求項1

核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織

請求項2

前記核酸がリボ核酸(RNA)である請求項1記載の精度管理用疑似組織。

請求項3

前記核酸がメッセンジャーRNAmRNA)である請求項1記載の精度管理用疑似組織。

請求項4

前記細胞が癌細胞である請求項1記載の精度管理用疑似組織。

請求項5

前記保持体がゲル化剤を含む請求項1記載の精度管理用疑似組織。

請求項6

前記保持体が加温することによって流動化する請求項1記載の精度管理用疑似組織。

請求項7

前記保持体が天然高分子及び合成高分子からなる群より選択される少なくとも一種を含む請求項1記載の精度管理用疑似組織。

請求項8

前記保持体が寒天アガロースカラギーナンアルギン酸アルギン酸塩ペクチンコラーゲンゼラチングルテンポリビニルアルコールポリエチレングリコール、及びポリアクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種を含む請求項1記載の精度管理用疑似組織。

請求項9

核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定する精度管理方法

請求項10

標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、を有する精度管理方法。

請求項11

前記標的核酸が腫瘍マーカーの一部又は全部をコードする遺伝子又はその遺伝子の一部である請求項10記載の精度管理方法。

請求項12

前記腫瘍マーカーがサイトケラチンである請求項11記載の精度管理方法。

技術分野

0001

本発明は、精度管理用疑似組織(以下、単に疑似組織ともいう)及び該疑似組織を用いた精度管理方法に関する。

背景技術

0002

近年臨床診断の分野において遺伝子検査が急速に普及している。遺伝子検査とは、核酸染色体などを分析して疾患に関連する変異や核型などの有無を臨床目的で検査することである。遺伝子検査の一例として、生体から切除した組織内に癌細胞由来の核酸が存在するかどうかを判定する検査がある。その検査工程は、主に前処理、核酸増幅、及び検出の三工程からなる。

0003

前処理には様々な方法がある。例として、先ず検査目的で生体から切除した組織に前処理用試薬を加える。次に試薬を添加された切除組織ホモジナイズし、得られたホモジネートから核酸を含む測定用試料を調製する。
核酸増幅では、前記測定用試料をサンプル容器に収容してそこに酵素プライマなどの試薬を加え、核酸増幅反応によって標的核酸増幅する。
検出では、蛍光染色された標的核酸の蛍光測定や増幅に比例して産生される副産物濁度測定などにより、切除組織中の標的核酸の有無の判定又は濃度の算出を行う。

0004

上述のような遺伝子検査では、各工程(前処理、核酸増幅、及び検出)における様々な要素が測定結果に影響を与える。このため、遺伝子検査の分野において、各工程の精度及び信頼性の確保のための精度管理の充実が重要となる。

0005

核酸増幅及び検出に関しては、ポジティブコントロールとして濃度既知の標的核酸を含むコントロール溶液、及びネガティブコントロールとして増幅されるべきではない核酸を含むコントロール溶液を用いて精度管理を行っている。

0006

ポジティブコントロールは標的核酸の増幅及び増幅された標的核酸の検出が正常に行われているかどうかを確認するためのものであり、ネガティブコントロールは増幅されるべきではない核酸が増幅しないことを確認するためのものである。

発明が解決しようとする課題

0007

前処理に関しては、精度管理が行われていないことが現状である。ホモジナイズを手動で行う場合、前処理を行う者の技量によって切除組織のホモジナイズの程度に差がある。また、ホモジナイズを自動破砕装置などによって自動的に行う場合、ブレンダ回転数等のホモジナイズ条件の設定や継続使用によるブレンダの磨耗などにより切除組織のホモジナイズの程度に差が生じる。従って、ホモジナイズを手動で行う場合も、自動破砕装置などによって行う場合も、ホモジナイズ条件等の前処理の精度管理が必要である。従って、前処理の精度を管理するための精度管理用物質及びこの精度管理用物質を用いた精度管理方法の開発が望まれている。

0008

本発明は、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0009

本発明は、核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織を提供する。

0010

また、本発明は、核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定する精度管理方法を提供する。

0011

また、本発明は、標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織に由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、を有する精度管理方法を提供する。

発明の効果

0012

本発明によると、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織が提供される。

発明を実施するための最良の形態

0013

以下、本発明の一実施形態を説明する。
本実施形態における疑似組織は疑似的な生体組織、具体的には生体から切除されたリンパ節と想定され、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いられる。
この疑似組織は、核酸又は細胞と、核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる。

0014

本発明の核酸は、DNAやRNAだけでなく、PNA、BNA、これらの類縁体などの人工核酸をも含む。また、本発明の核酸として、例えばArmored RNA(米国特許5677124号公報参照)などのように核酸をタンパク質等に封入したものを用いてもよい。
これら核酸の由来は特に限定されず、細胞から抽出したものでも、人工的に合成したものであってもよい。

0015

細胞としては、核酸を含有する細胞であれば特に限定されないが、遺伝子検査における被検査物質の一部又は全部をコードする遺伝子、この遺伝子に対応するmRNA、及び/又はこれらの一部配列を含有する細胞であることが好ましい。遺伝子検査における被検査物質としては、腫瘍マーカーが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、サイトケラチンCK)、癌胎児性抗原、α胎児タンパク組織ポリペプチド抗原免疫抑制酸性タンパク、αフェトプロテイン塩基性フェトプロテイン、PIVKA、DUPAN、エラスターゼ、SCC抗原、ProGRP、神経特異エノラーゼ、尿中NMP−22、前立腺酸性フォスファターゼ、γセミプロテインなどを例示することができる。

0016

保持体としては、室温では固形形態を呈し、一定温度迄加温する事によって固形形態が崩壊して流動化するものが好ましい。また、固形形態において生体組織と同程度の固さを有するものが好ましい。
保持体は、ゲル化剤を含むのが好ましい。ゲル化剤とは、溶媒に添加することによって溶液ゲル化させる性質を持つ物質である。ゲル化剤としては、例えば、寒天アガロースカラギーナンアルギン酸アルギン酸塩ペクチンコラーゲンゼラチングルテンなどの天然高分子や、ポリビニルアルコールPVA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)などの合成高分子などが挙げられる。本実施形態の疑似組織には、これら合成高分子及び天然高分子のうち、一種又は二種以上を用いることができる。また、ゲル化剤を添加する溶媒としては特に限定されないが、例えば水、TE(TrisEDTA)、TAE(Tris-Acetate EDTA)、TBE(Tris-Borate EDTA)などを用いることができる。

0017

寒天は、紅藻類細胞壁に含まれるガラクトース及びガラクトース誘導体から構成される多糖である。ゲル化剤として用いることができれば寒天の起源は特に限定されず、例えばテングサ属、オゴノリ属ムカデノリ属、イバラノリ属、スギノリ属、ヒラクサ、オニクサなどから精製されたものを用いることができる。

0018

アガロースは、交互に結合したD−ガラクトースと3,6−アンヒドロ−L−ガラクトースとを主構造とする多糖であり、D−ガラクトースの1位と3,6−アンヒドロ−L−ガラクトースの4位がβグリコシド結合で、また、3,6−アンヒドロ−L−ガラクトースの1位とD−ガラクトースの3位がαグリコシド結合で結合している。ゲル化剤として用いることができればアガロースの起源は特に限定されない。アガロースは寒天中に通常約70%の割合で含まれ、精製すると高純度のものを得ることができる。アガロースは精製度の低いものから高いものまで、様々なアガロース含量のものを使用できる。

0019

カラギーナンは紅藻類に含まれる多糖である。ゲル化剤として用いることができればカラギーナンの起源は特に限定されず、例えばスギノリ科、ミリン科、イバラノリ科に属する生物などから精製されたものを用いることができる。本実施形態には例えばκ−カラギーナン、λ−カラギーナンなどを用いることができる。
κ−カラギーナンは、D−ガラクトース−4−硫酸の1位と3,6−アンヒドロ−D−ガラクトースの4位がβグリコシド結合で、 また、3,6−アンヒドロ−D−ガラクトースの1位とD−ガラクトース−4−硫酸の3位がαグリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。
λ−カラギーナンは、D−ガラクトースの1位とD−ガラクトース−2,6−二硫酸の4位とがβグリコシド結合で、また、D−ガラクトース−2,6−二硫酸の1位とD−ガラクトースの3位とがαグリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。

0020

アルギン酸は褐藻類の細胞壁に含まれる多糖であり、β−1,4結合のD−マンヌロン酸とα−1,4結合のL−グルロン酸が連なった鎖状構造を有する。ゲル化剤として用いることができればアルギン酸の起源は特に限定されず、本実施形態には、例えばアルギン酸又はその塩(ナトリウム塩カルシウム塩マグネシウム塩アンモニウム塩など)などを用いることができる。

0021

ペクチンは、植物の細胞壁に含まれる多糖であり、その主成分はα−1,4結合したD−ガラクツロン酸の一部にα−1,2結合したL−ラムノースが混在する主鎖を有し、アラビノース、ガラクトースなどの中性糖に富んだ側鎖を有する酸性多糖、即ちラムノガラクツロナン−Iである。ゲル化剤として用いることができればペクチンの起源は特に限定されない。

0022

コラーゲンは、動物細胞外マトリックスの主成分となるタンパク質で、3本のポリペプチド鎖からなる3重螺旋構造をとる。また、ゼラチンは、コラーゲンを熱湯で処理して得られる誘導タンパク質の一種である。ゲル化剤として用いることができればコラーゲン及びゼラチンの起源は特に限定されず、本実施形態には動物の組織から精製したもの、人工的に合成したものなどを用いることができる。

0023

グルテンは、穀類に含まれる粘着性タンパク質で、グルテリン系のタンパク質とプロラミン系のタンパク質との会合によって形成される。ゲル化剤として用いることができればグルテンの起源は特に限定されず、本実施形態には例えばコムギオオムギから抽出したもの、人工的に合成したものなどを用いることができる。

0024

PVAはポリ酢酸ビニル加水分解によって得られ、ビニルアルコール単位主体としてなる合成高分子である。

0025

PEGはエチレンオキシドアルカリによるアニオン重合又はプロトン開始によるカチオン重合によって得られ、エチレングリコール単位を主体としてなる合成高分子である。

0026

PAAはアクリルアミドビニル基重合又はアミド基水素移動重合によって得られ、アクリルアミド単位を主体としてなる合成高分子である。

0027

本実施形態に用いられるPVA、PEG及びPAAは、ゲル化剤として用いることができればその重合度などは特に限定されない。

0028

上述の疑似組織を用いて吸光度測定や、核酸増幅及び核酸検出などによって、遺伝子検査における前処理の精度管理が行われる。
以下、実施例を示し、吸光度測定による前処理の精度管理(実施例1)と、核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理(実施例2)とについて説明する。

0029

(実施例1)
吸光度測定による前処理の精度管理は、核酸及び前記核酸を内部に保持することのできる保持体からなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定することによって行う。

0030

<表示値αの算出>
先ず、表示値を算出する。
表示値とは、定められたプロトコルによって作製された疑似組織に所定の前処理を施し、吸光度測定を行って算出された核酸濃度測定値のことである。この表示値と測定対象の核酸濃度測定値とを比較することによって測定対象に対して行った前処理の精度管理が行われる。

0031

以下、表示値を算出するための疑似組織αの作製に関して説明する。
疑似組織αの吸光度測定に先立ち、核酸を含む核酸溶液又は細胞を含む細胞溶液緩衝剤を含む試薬(以下、ホモジナイズ試薬とする)とを混和して、この混合物基準試料αとする。核酸溶液を用いた場合、この基準試料αを吸光度測定して基準試料α中の核酸濃度を算出し、これを基準値αとする。細胞溶液を用いた場合、細胞溶液とホモジナイズ試薬との混合物を十分にホモジナイズしてこれを基準試料αとする。基準試料αの吸光度を測定して核酸濃度を算出し、これを基準値αとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め細胞計数盤(例えば、カウンティングチェンバー8100105;アズワン)や細胞計数装置(例えば、粒子計数分析装置CDA-500;シスメックス)などを用いて計数しておく。

0032

次に、基準試料α作製に用いられた核酸溶液又は細胞溶液と同じものを同量用いて疑似組織αを作製する。
疑似組織αの作製に際し、先ずマイクロチューブなどの容器に溶媒を収容する。
ゲル化剤を容器中の溶媒に添加し、ゲル化剤と溶媒の混合物及び該混合物を収容した容器を恒温槽電子レンジなどで加温し、ゲル化剤を溶媒中に完全に溶解させ、ゲル化剤溶液を作製する。
ゲル化剤溶液を収容した容器を常温下又は冷蔵庫内などの冷温下に放置し、ゲル化剤溶液を冷却する。
ゲル化剤溶液は一定温度以下になると固まってゲル状の固形形態をとるが、固形形態となる直前ピペットなどによりゲル化剤溶液に基準試料α作製の際に用いた核酸溶液又は細胞溶液と同じものを同量添加し、ゲル化剤溶液と核酸溶液又は細胞溶液との混合液中に核酸又は細胞の偏在が起こらないよう混和させる。
さらにゲル化剤溶液がゲル状の固形形態をとるまで液温を低下させると、核酸又は細胞を含むゲル化剤溶液はゲル化し、核酸又は細胞と核酸又は細胞を保持した保持体とからなる疑似組織αとなる。

0033

上述のようにして作製された疑似組織αに、遺伝子検査における前処理と同様の処理を施す。
先ず疑似組織αにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織αとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料αの体積と等しくなるよう調整する。
次に、疑似組織αとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織αから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。この上清の260nmにおける吸光度測定を行い、核酸濃度を測定する。

0034

疑似組織αから得られた上清中の核酸濃度が基準値αと等しいか、近似した場合(具体的には、該核酸濃度が基準値αの70%以上、好ましくは80%以上の値を示した場合)、疑似組織αホモジネートの上清に含まれる核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その核酸濃度測定値を表示値αとすることができる。

0035

<吸光度測定による前処理の精度管理>
次に、表示値αに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織βを用意する。疑似組織βは上述した疑似組織αと同ロットの疑似組織である。
疑似組織βに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織αに施した前処理と同様にして行われる。
前処理によって得られた上清の260nmにおける吸光度測定を行い、核酸濃度を測定する。

0036

疑似組織βを前処理して得られた上清の核酸濃度測定値が、上述した表示値αと比較したときに表示値αと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織βに対して施した前処理が適切であったことを確認できる。

0037

(実施例2)
核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理は、標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞とを内部に保持することのできる保持体からなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織に由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、からなる。

0038

<表示値γの算出>
以下、表示値を算出するための疑似組織γの作製に関して説明する。
疑似組織γの核酸増幅及び核酸検出に先立ち、先ず標的核酸又は標的核酸を含む細胞を含む細胞溶液とホモジナイズ試薬とを混和して基準試料γを作製する。溶液に細胞を含有させる場合は、細胞溶液とホモジナイズ試薬との混合物を十分にホモジナイズしたものを基準試料γとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め計数しておく。

0039

次に、基準試料γ作製に用いられた標的核酸又は細胞を含む溶液と同じものを同量用いて疑似組織γを作製する。
前述した疑似組織αの作製と同様にして疑似組織γを作製する。
疑似組織γにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織γとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料γの体積と等しくなるよう調整する。
疑似組織γとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織γから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。以下、この上清を測定用試料γとする。

0040

上述の基準試料γ及び測定用試料γに対して核酸増幅及び核酸検出を行う。
核酸増幅として、基準試料γ及び測定用試料γの上清に酵素試薬を加え、公知の核酸増幅法によって標的核酸を増幅させる(標的核酸がRNAである場合は、このRNAの塩基配列に対応するcDNAを増幅させる)。

0041

検出としては、公知の核酸検出法の何れも用いることができる。
核酸増幅に伴って同時にピロリン酸マグネシウムなどの不溶性物質が精製される場合、反応液の上清の濁り目視により確認する、或いは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度測定する、又は反応液を有色のフィルター濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより標的核酸を検出することができる(国際公開WO 01/83817号パンフレット参照)。
また、エチジウムブロマイド、SYBR GREEN I、或いはPico Greenのような二本鎖インターカレータである蛍光色素の存在下で核酸増幅を実施すれば、反応液の蛍光を測定することによって標的核酸検出を行うことができる。
濁度測定又は蛍光測定においては核酸増幅による生成物の増加に伴って濁度又は蛍光の増大が観察される。この増大をリアルタイムモニターすれば、閉鎖系で核酸の増幅と濁度又は蛍光の増加とが同時に追跡可能である。

0042

核酸検出を目視によって行う場合、基準試料γの濁りと測定用試料γの濁りを比較して、測定用試料γに対する前処理が正確に行われたかどうかを確認できる。
核酸検出を濁度測定によって行う場合は、測定用試料γの標的核酸濃度と基準試料γの標的核酸濃度(以下、基準値γとする)とを比較する。これらが等しいか、或いは近似した値を示した場合(具体的には、測定用試料γの標的核酸濃度が基準値γの70%以上、好ましくは80%以上の値を示した場合)、疑似組織γに由来する測定用試料γに含まれる標的核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その標的核酸濃度測定値を表示値γとすることができる。また、濁度又は蛍光の増大をリアルタイムでモニターする場合、測定用試料γに含まれる核酸が増幅し始めるまでの時間(以下、増幅立ち上がり時間とする)と基準試料γの増幅立ち上がり時間(以下、基準値γtとする)とを比較する。これらが等しいか近似した値を示した場合、測定用試料γに含まれる標的核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その立ち上がり時間を表示値γtとすることができる。

0043

<核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理>
次に、表示値γ又はγtに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織δを用意する。疑似組織δは上述した疑似組織γと同ロットの疑似組織である。
疑似組織δに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織γに施した前処理と同様にして行われ、測定用試料δが作製される。
測定用試料δに、上述の測定用試料γに対して行った核酸増幅及び核酸検出と同様の操作を施し、測定用試料δの標的核酸濃度及び/又は増幅立ち上がり時間を測定する。

0044

測定用試料δの標的核酸濃度測定値又は増幅立ち上がり時間が、上述の表示値γ又はγtと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織δに対して施した処理が適切であったことを確認できる。

0045

なお、上述した前処理、核酸増幅、及び核酸検出のうち少なくとも一つの工程を装置によって自動的に行ってもよい。
例えば、核酸増幅及び核酸検出を自動的に行うものとして核酸増幅検出装置が挙げられる。

0046

例えば癌手術での切除組織における癌転移診断支援する核酸増幅検出装置を用いることができる。この装置によると、切除組織内のmRNAを鋳型としてRT−LAMP(Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification、栄研化学)法によってmRNAからcDNAに逆転写し、このcDNAを増幅させ、増幅に伴い増大する溶液の濁度を測定することにより切除組織内のmRNAの増幅立ち上がり時間及びコピー数を算出する装置である。

0047

以下、図面に基づき核酸増幅検出装置について説明する。
この核酸検出装置は、生体から切除した組織中に癌マーカー(例えば、サイトケラチン19)に関する核酸がどのくらい含まれるかを定量する装置である。
図1は、核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成を示した斜視図である。
図2図1に示した核酸増幅検出装置の測定部の全体構成を示した図である。

0048

先ず、図1を参照して核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成について説明する。核酸増幅検出装置100は、図1に示すように測定部101と、測定部101に通信回線で接続されたデータ処理部102とによって構成されている。データ処理部102は、キーボード102a及びマウス102bを含むパーソナルコンピュータからなる。また、データ処理部102には、周辺機器としてのプリンタ200及びホストコンピュータ300が通信回線を介して接続されている。プリンタ200は、グラフィックデータやテキストデータなどを印刷するために設けられている。また、ホストコンピュータ300にはデータ処理部102から測定データが出力される。

0049

測定部101は、図2に示すように、分注機構部10と、サンプル容器セット部20と、試薬容器セット部30と、チップセット部40と、チップ廃棄部50と、5つの反応検出ブロック60aからなる反応検出部60とを含む。
測定部101には、図2に示すように、マイクロコンピュータにより装置を制御すると共に、装置外部との入出力を制御する制御部70と、制御部70を含む装置全体電源を供給する電源部80とが内蔵されている。また、測定部101の正面の所定箇所に緊急停止スイッチ90が配置されている。

0050

サンプル容器セット部20と、試薬容器セット部30と、チップセット部40とは、X軸方向に沿って配置されている。また、サンプル容器セット部20は、装置正面手前側に配置されており、試薬容器セット部30は、装置正面奥側に配置されている。また、5つの反応検出ブロック60aと、チップ廃棄部50とは、サンプル容器セット部20、試薬容器セット部30、及びチップセット部40に対して、Y軸方向に所定の間隔を隔てた位置に、X軸方向に沿って配置されている。即ち、サンプル容器セット部20、試薬容器セット部30、チップセット部40、チップ廃棄部50及び5つの反応検出ブロック60aが方形状(長方形状)に配置されている。

0051

また、分注機構部10は、X軸及びY軸方向(平面方向)に移動可能なアーム部11と、アーム部11に対してそれぞれ独立してZ軸方向(垂直方向)に移動可能な2連(2本)のシリンジ部12とを含んでいる。2本のシリンジ部12は先端にピペットチップを装着することができるノズル部12aをそれぞれ備えている。

0052

また、図2に示すように、サンプル容器セット部20の凹部には、5つのサンプル容器セット孔21aと、把持部21bとを有するサンプル容器セット台21が取り外し可能にはめ込まれている。サンプル容器セット台21の5つのサンプル容器セット孔21aは、X軸方向に沿って1つの列状に所定の感覚を隔てて設けられている。このサンプル容器セット台21の5つのサンプル容器セット孔21aには、切除組織及び/又は疑似組織を前処理して作製された測定用試料が収容されたサンプル容器22がセットされる。

0053

試薬容器セット部30の凹部には、2つのプライマ試薬容器セット孔31a及び2つの酵素試薬容器セット孔31bと、把持部31cとを有する試薬容器セット台31が、取り外し可能にはめ込まれている。試薬容器セット台31のプライマ試薬容器セット孔31a及び酵素試薬セット孔31bは、それぞれ、Y軸方向に沿って所定の間隔を隔てて2つずつ設けられている。この試薬容器セット台31のプライマ試薬容器セット孔31a及び酵素試薬セット孔31bには、2種類のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器32a及びその2種類のプライマ試薬に対応する酵素試薬が収容された酵素試薬容器32bがそれぞれ各2本ずつセットされる。なお、正面左側のプライマ試薬容器セット孔31a及び酵素試薬容器セット孔31bに、サイトケラチン19(CK19)のmRNAに対応するプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器32a及びCK19mRNAの酵素試薬が収容された酵素試薬容器32bが配置される。また、正面右側のプライマ試薬容器セット孔31a及び酵素試薬容器セット孔31bに、内部標準物質としてβアクチンのmRNAのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器32a及びβアクチンmRNAの酵素試薬が収容された酵素試薬容器32bが配置される。
なお、内部標準物質としては、βアクチンに限らず、例えばハウスキーピング遺伝子のmRNAなどを用いることもできる(国際公開WO 03/070935号パンフレット参照)。

0054

チップセット部40の2つの凹部には、36本のピペットチップ41を収納可能な収納孔42aを有する2つのラック42がそれぞれ着脱可能にはめ込まれている。また、チップセット部40には、2つの取り外しボタン43が設けられている。この取り外しボタン43を押すことにより、ラック42が取り外し可能な状態になる。

0055

反応検出部60の各反応検出ブロック60aは、図2に示すように、反応部61と、2つの濁度検出部62と、蓋閉機構部63とから構成されている。各反応部61は検出セル65を備えている。蓋閉機構部63は、検出セル65にセル部67aを装着する機能を有している。

0056

(実施例3)
上述の核酸増幅検出装置による核酸検出を行う場合の操作手順及び装置の動作を具体的に説明する。ここでは、細胞と細胞を保持した保持体とからなる疑似組織を用いた場合について述べる。

0057

<表示値εtの算出>
疑似組織の核酸増幅及び核酸検出に先立ち、先ずCK19mRNAを含むと考えられる細胞を含有させた細胞溶液とホモジナイズ試薬とを混和して試料作製を行い、十分にホモジナイズして、これを基準試料εとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め計数しておく。

0058

次に、基準試料ε作製に用いられた細胞溶液と同じものを同量用い、前述した疑似組織αの作製と同様にして疑似組織εを作製する。
疑似組織εにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織εとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料εの体積と等しくなるよう調整する。
疑似組織εとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織εから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。以下、この上清を測定用試料εとする。

0059

基準試料ε及び測定用試料εを収容した容器を、サンプル容器セット台21のサンプル容器セット孔21aにそれぞれセットする。
また、正面左側のプライマ試薬容器セット孔31a及び酵素試薬容器セット孔31bに、CK19mRNAのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器32a及びCK19mRNAの酵素試薬が収容された酵素試薬容器32bをセットする。
また、正面右側のプライマ試薬容器セット孔31a及び酵素試薬容器セット孔31bに、βアクチンmRNAのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器32a及びβアクチンmRNAの酵素試薬が収容された酵素試薬容器32bをセットする。
また、チップセット部40の凹部に、それぞれ36本の使い捨て用ピペットチップ41が収納された二つのラック42を嵌め込む。さらに、各反応検出ブロック60aの反応部61の二つの検出セルセット孔61aに、検出セル65の二つのセル部67aをセットする。

0060

そして、図1に示したデータ処理部102のキーボード102a及びマウス102bを用いて、測定項目登録サンプルIDの登録などを行った後、キーボード102a又はマウス102bにより測定部101の動作をスタートさせる。

0061

測定部101の動作がスタートすると、分注機構部10のアーム部11がチップセット部40に移動し、2つのシリンジ部12が下方向に移動することによりノズル部12aの先端にピペットチップ41が自動的に装着される。そして、2つのシリンジ部12が上方に移動された後、分注機構部10のアーム部11は、試薬容器セット台31にセットされたCK19mRNA及びβアクチンmRNAのプライマ試薬が収容された2つのプライマ試薬容器32aの上方に向かってX軸方向に移動される。そして、2つのシリンジ部12が下方向に移動されることにより、それぞれのピペットチップ41の先端が、2つのプライマ試薬容器32a内のCK19mRNA及びβアクチンmRNAのプライマ試薬の液面に挿入され、ピペットチップ41内に各プライマ試薬が吸引される。

0062

プライマ試薬吸引後、2つのシリンジ部12が上方に移動された後、分注機構部10のアーム部11は、反応検出ブロック60aの上方に移動される。そして、2つのシリンジ部12が下方向に移動されることにより、2つのシリンジ部12のノズル部12aに装着された2つのピペットチップ41が、それぞれ、検出セル65のセル部67a内に挿入され、CK19mRNA及びβアクチンmRNAのプライマ試薬がそれぞれ2つのセル部67aに吐出される。

0063

プライマ試薬吐出後、2つのシリンジ部12が上方に移動され、分注機構部10のアーム部11は、チップ廃棄部50の上方に向かってX軸方向に移動される。チップ廃棄部50において、ピペットチップ41の廃棄が行われる。

0064

次に、分注機構部10のアーム部11が再びチップセット部40に移動し、チップセット部40において上記と同様の動作により2つのシリンジ部12のノズル部12aの先端に新しい2つのピペットチップ41が自動的に装着される。そして、分注機構部10のアーム部11は、試薬容器セット台31にセットされたCK19mRNA及びβアクチンmRNAの2つの酵素試薬がそれぞれ収容された2つの酵素試薬容器32bの上方に向かってX軸方向に移動される。その後、2つのシリンジ部12がした方向に移動されることにより、2つの酵素試薬容器32b内のCK19mRNA及びβアクチンmRNAの2つの酵素試薬が吸引され、2つのシリンジ部12が上方向に移動される。そして、分注機構部10のアーム部11は、反応検出ブロック60aの上方に移動された後、CK19mRNA及びβアクチンmRNAの2つの酵素試薬が、それぞれ検出セル65の2つのセル部67aに吐出される。酵素試薬の吐出後、分注機構部10のアーム部11は、チップ廃棄部50の上方に移動された後、ピペットチップ41の廃棄が行われる。

0065

次に、分注機構部10のアーム部11が再びチップセット部40に移動された後、2つのシリンジ部12のノズル部12aの先端に新しい2つのピペットチップ41が自動的に装着される。そして、分注機構部10のアーム部11は、サンプル容器セット台21にセットされた基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ収容された2つのサンプル容器22の上方に向かってX軸方向に移動された後、基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれピペットチップ41内に吸引される。

0066

検出セル65の2つのセル部67aに基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ吐出される際、2つのシリンジ部12が自動的にピペッティングを行うことにより、2つのセル部67a内の混合液が混和される。この後、分注機構部10のアーム部11が、チップ廃棄部50の上方に移動された後、ピペットチップ41の廃棄が行われる。

0067

上記のセル部67aへ各試薬、基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ収容され、蓋閉機構部63によって検出セル65のセル部67aの蓋が閉められた後、検出セル65内の液温を約65℃に加温することにより、前述したRT−LAMPにより、CK19のmRNAを鋳型としてcDNAを増幅させる。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムの白濁を濁度測定によりリアルタイムでモニターする。具体的には、LED光源(図示せず)から光を増幅反応時の検出セル65のセル部67aに照射する。照射した光を受光素子受光することにより、増幅反応時の検出セル65のセル部67a内の液濁度をリアルタイムでモニターし、基準試料ε及び測定用試料εに含まれているCK19mRNAの増幅立ち上がり時間をそれぞれ算出する。ここでは、濁度が0.1に達した時間を増幅立ち上がり時間として算出する。

0068

濁度測定によって算出された基準試料εの増幅立ち上がり時間を基準値εtとする。測定用試料εのCK19mRNAの増幅立ち上がり時間が、基準値εtと等しいか、近似した値を示した場合、測定用試料εに含まれるCK19mRNAがホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、そのCK19mRNA増幅立ち上がり時間を表示値εtとすることができる。

0069

<核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理>
次に、表示値εtに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織ηを用意する。疑似組織ηは上述した疑似組織εと同ロットの疑似組織である。
疑似組織ηに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織εに施した前処理と同様にして行われる。
この疑似組織ηの上清に、上述の測定用試料εに対して行った核酸増幅及び核酸検出を施し、疑似組織ηの上清のCK19mRNAの増幅立ち上がり時間を測定する。

0070

疑似組織ηの上清のCK19mRNA増幅立ち上がり時間が、上述の表示値εtと比較したときに表示値εtと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織ηに対して施した処理が適切であったことを確認できる。

0071

なお、実施例1〜3において、基準試料や疑似組織に対するホモジナイズはペッスルなどによって手動で行ってもよい。また、特公平6−36732記載の細胞破砕装置や特開2004−209322記載の自動破砕装置を用いてもよい。ホモジナイズを手動で行う場合、実施例の疑似組織はペッスルなどによる細胞の破砕動作の精度が管理される。ホモジナイズを装置によって行う場合、装置のホモジナイズ条件の設定やブレンダの磨耗状態が管理される。

0072

なお、実施例1〜3において、遠心分離の前に公知の核酸抽出法によってホモジネートから核酸を抽出精製してもよい。核酸抽出法の具体例としては、酵素、界面活性剤カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノール法アルカリ法、あるいはフェノールクロロホルム法等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来使用される。最近では、核酸抽出過程に置いて、イオン交換樹脂ガラスフィルタガラスビーズ或いは蛋白凝集作用を有する試薬等が使用されている。また核酸の抽出に核酸結合担体を用いる系としては、ガラス粒子ヨウ化ナトリウムを用いる方法、ヒドロキシアパタイトを用いる方法などが知られている。

0073

以下、実験例を示す。
(実験例1)
実験例1では、核酸と核酸を保持する保持体とからなる疑似組織を作製し、ホモジナイズなどの所定の処理を施して260nmの波長における吸光度測定によって疑似組織から核酸を抽出できるか否かを確認した。この疑似組織は生体から切除したリンパ節を想定して作製されたものである。

0074

下記の組成を含むホモジナイズ試薬を調製した。
200mM(pH3.0) Glycin-HCl (Glycin、HCl共に和光純薬工業)
5% Brij35 (Sigma)
0.05% KS-538 (信越化学工業)
上記濃度は試薬中の濃度を示す。

0075

以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び/又はアガロース溶液を用いて、測定用試料i及びiiを作製した。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図3に示される。

0076

<測定用試料iの作製>
先ずマイクロチューブに、ピペットチップを装着したピペットを用いてマウス細胞から抽出したRNAを4.6μg含む溶液(以下、RNA溶液とする)を10μL収容し、これをコントロールAとした。さらにコントロールAにホモジナイズ試薬650μLを添加し、ピペッティングによってこの混合液を混和した。この混合液のうち100μLを回収してこれを測定用試料iとし、キュベットaに収容した。

0077

<測定用試料iiの作製>
先ずマイクロチューブに精製水を収容した。さらにマイクロチューブ内にゲル化剤としてアガロース(商品名:NuSieveGTC Agarose;CAMBREX社)を6μg添加し、さらに精製水を加えて合計体積が150μLとなるようメスアップした。このマイクロチューブを、約70℃に温度設定した恒温槽内で、精製水中のアガロースが完全に溶解するまで加温した。精製水にアガロースが完全に溶解すると、恒温槽から取り出して、常温下でアガロース溶液の液温を低下させた。該アガロース溶液のアガロース濃度は4w/v%である。アガロース溶液がゲル化する直前(アガロース溶液の液温が約40℃となったとき)、アガロース溶液にRNA溶液を10μL添加した。アガロース溶液中にRNAが偏在しないよう、ピペッティングによってRNA溶液を添加したアガロース溶液を混和させた。RNA溶液添加後、さらにアガロース溶液を常温下に置き、アガロース溶液をゲル化させて内部にRNAを保持する保持体(アガロースゲル)とした。マイクロチューブ内に収容されたアガロースゲルをコントロールBとした。コントロールBは本発明の精度管理用疑似組織に相当する。
図4は上述のようにして作製した疑似組織と、該疑似組織を収容したマイクロチューブとを模式的に示した図である。マイクロチューブ2は疑似組織を収容する収容部5及び収容部を封じる蓋6を備えており、収容部5には保持体としてアガロースゲル3と、該アガロースゲル3に保持されたRNA4が収容されている。
コントロールB160μLにホモジナイズ試薬500μL添加して、ペッスルで10往復破砕動作を行い、さらに約一分間、約2000gで遠心して上清100μLを回収してこれを測定用試料iiとし、キュベットbに収容した。
測定用試料iiは、前処理で疑似組織を充分にホモジナイズでき、均一なホモジネートを得られた場合を想定して作製されたものである。

0078

ここで用いられるホモジナイズ試薬、マイクロチューブ、ピペットチップ、精製水、アガロース、キュベットa及びbはRNaseフリーであることが望ましい。

0079

<吸光度の測定>
測定に際しては、分光光度計(UV−2500PC:島津製作所)を用いて、キュベットa及びbに収容された各測定用試料の吸光度(O. D. 260nm)を測定し、各測定用試料に含まれるRNA濃度を算出した。
測定結果を以下の表1に示す。また、表1のRNA濃度をグラフにしたものを図5に示す。
表1中の「吸光度測定値」の欄には、上述の実験と同様の実験を計3回行い、その測定値の平均を示す。
「RNA濃度(μg/mL)」の欄には、吸光度測定値から算出した各測定用試料に含まれるRNAの濃度を示す。
「測定用試料iに対する回収率」の欄には、測定用試料iのRNA濃度(又は吸光度測定値)を100%としたときの測定用試料iiの相対値百分率で示す。

0080

0081

表1及び図5より、測定用試料iのRNA濃度測定値は7.1μg/mLであった。これは、コントロールA作製時にマイクロチューブ内に収容したRNA溶液中のRNA濃度に対応している。
測定用試料iiのRNA濃度測定値は5.8μg/mLとなり、測定用試料iに対する回収率は81.8%となった。

0082

測定結果より、核酸を保持した保持体に前処理を施すことによって、本実験例における測定用試料iに比べて80%以上の核酸を検出することができた。これは、ホモジナイズを10往復行うことによって保持体から核酸を効果的に回収できたことを示す。
従って測定用試料iiのRNA濃度測定値を後述する実験例2における表示値とすることができる。

0083

(実験例2)
実験例2では、核酸と核酸を保持する保持体とからなる疑似組織を作製し、ホモジナイズなどの所定の処理を施して核酸濃度測定した場合と、ホモジナイズを行わずに核酸濃度測定した場合とのそれぞれの核酸濃度を算出し、実験例1で算出した表示値と比較した。

0084

以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び/又はアガロース溶液を用いて、測定用試料iii及びivを作製した。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図6に示される。

0085

<測定用試料iii及びivの作製>
測定用試料iiiの作製に際して、先ず実験例1におけるコントロールBと同ロットのコントロールCに、ホモジナイズ試薬500μL添加した。さらに、測定用試料iiを作製するのと同様の処理を施し、上清100μLをキュベットcに回収した。
測定用試料ivの作製に際して、先ず実験例1におけるコントロールBと同ロットのコントロールDに、ホモジナイズ試薬500μL添加した。このコントロールDとホモジナイズ試薬との混合物から上清を100μL回収し、キュベットdに回収した。測定用試料ivは、ホモジナイズを行わずに作製したものである。

0086

<吸光度の測定>
測定に際しては、分光光度計(UV-2500PC:島津製作所製)を用いて、キュベットc及びdに収容された各測定用試料の吸光度(O. D. 260nm)を測定し、各測定用試料に含まれるRNA濃度を算出した。
測定結果を以下の表2に示す。また、表2のRNA濃度をグラフにしたものを図7に示す。
表2中の「吸光度測定値」の欄には、上述の実験例と同様の実験を計3回行い、その測定値の平均を示す。
「RNA濃度(μg/mL)」の欄には、吸光度測定値から算出した各測定用試料に含まれるRNAの濃度を示す。
「表示値に対する回収率」の欄には、実験例1で算出した表示値を100%としたときの測定用試料iii及びivの相対値を百分率で示す。

0087

0088

表2及び図7より、測定用試料iiiのRNA濃度測定値は5.8μg/mLとなった。この値は表示値に比べて100%の回収率である。
また、ホモジナイズをせずに測定を行った測定用試料iiiのRNA濃度測定値は1.2μg/mLとなった。この値は表示値に比べて20.4%の回収率である。

0089

以上の測定結果より、ホモジナイズを行わないと疑似組織から効果的に核酸を抽出できないということが分かった。
従って、表示値と疑似組織の核酸濃度測定値とを比較することにより、ホモジナイズが正確に行われているかどうかを確認できる。

0090

実験例1及び2により、各実験例で作製した疑似組織(コントロールB〜D)は遺伝子検査におけるホモジナイズの精度管理に適しているということが確認された。

0091

(実験例3)
実験例3では、標的核酸を含む細胞と標的核酸を含む細胞を保持する保持体とからなる疑似組織を用いて、細胞に含まれるCK19mRNAの増幅立ち上がり時間を測定することによって、疑似組織から核酸を抽出し、増幅できるか否かを確認した。この疑似組織は生体から切除したリンパ節を想定して作製されたものである。ここでは、濁度が0.1に達した時間を増幅立ち上がり時間として算出する。

0092

以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び/又はアガロース溶液を用いて、測定用試料v、vi及びviiを作製した。測定用試料vの増幅立ち上がり時間は本実験のポジティブコントロールとして用いられ、測定用試料viiはネガティブコントロールとして用いられる。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図8に示される。

0093

<測定用試料vの作製>
先ず,ヒト乳癌由来の細胞(MDA−MB−231;大日本製薬)をカウンティングチェンバー(アズワン)を用いて顕微鏡で計数し、溶液中に2×106個の細胞が含まれるよう、細胞溶液を調製した。マイクロチューブにこの細胞溶液を収容し、これをコントロールEとした。コントロールEに実験例1で用いたホモジナイズ試薬で1mlまでメスアップした。コントロールEとホモジナイズ試薬との混合物に対してペッスルで10往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間約2000gで遠心し上清20μlを回収してこれを測定用試料vとし、マイクロチューブeに収容した。

0094

<測定用試料viの作製>
先ず、マイクロチューブに精製水を収容した。ここにゲル化剤としてアガロース(CAMBREX社)を8μg添加した。このマイクロチューブを、約70℃に温度設定した恒温槽内で、精製水中のアガロースが完全に溶解するまで加温した。精製水にアガロースが完全に溶解すると、恒温槽から取り出し、アガロース溶液に測定用試料v作製の際に用いた細胞溶液と同じものを添加した。アガロース溶液中に細胞が偏在しないよう、ピペッティングによってアガロース溶液と細胞溶液の混合液を混和させた。−20℃の冷凍庫内でこの混合液の液温を低下させて混合液をゲル化させ、これをコントロールFとした。なお、アガロース溶液と細胞溶液との合計体積は、200μlとなるように調整された。アガロース溶液のアガロース濃度は4w/v%である。コントロールFは本発明の精度管理用疑似組織に相当する。
コントロールFを解凍した後、ホモジナイズ試薬800μlを添加して、ペッスルで10往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間、約2000gで遠心して上清20μlを回収してこれを測定用試料viとし、マイクロチューブfに回収した。

0095

<測定用試料viiの作製>
先ず、コントロールGが作製された。コントロールGは、細胞溶液を用いないこと以外はコントロールFと同様にして作製された。
コントロールGにホモジナイズ試薬800μlを添加して、ペッスルで10往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間、約2000gで遠心して上清20μlを回収してこれを測定用試料viiとし、マイクロチューブgに回収した。

0096

<増幅立ち上がり時間の測定>
マイクロチューブe、f、及びgにそれぞれ180μlのホモジナイズ試薬を添加し、測定用試料v、vi、及びviiを10倍に希釈した。
遺伝子増幅検出装置GD−100(シスメックス)を用いて、希釈された各測定用試料のCK19mRNAに対応するcDNAを増幅し、増幅に伴って増大する濁度の変化をリアルタイムでモニターした。
測定結果を図9に示す。
図9(1)、(2)及び(3)はそれぞれ測定用試料v、vi及びviiの増幅立ち上がり時間を示すグラフである。

0097

ポジティブコントロールである測定用試料vの増幅立ち上がり時間は12.7分であり、測定用試料viの増幅立ち上がり時間は12.9分であった。また、ネガティブコントロールである測定用試料viiは増幅の立ち上がりが見られなかった。
以上の測定結果より、疑似組織のホモジナイズが正確に行われれば、疑似組織から得られた測定用試料の増幅立ち上がり時間は、ポジティブコントロールである測定用試料vの増幅立ち上がり時間と非常に近似した値を示すことが確認され、この疑似組織を精度管理物質として用いることが可能であると判断できた。

0098

本明細書では、生体から切除した組織に前処理を施し、切除組織に含まれる核酸を検出して疾患の有無を推定する場合について述べたが、切除組織に含まれる特定のタンパク質の発現量や活性を検出して疾患の有無を推定することも可能である。タンパク質を検出する場合も切除組織の前処理が必要であるため、細胞と細胞を保持する保持体とからなる疑似組織を用いてタンパク質を検出することにより前処理の精度管理を行うことができる。前処理された疑似組織に含まれるタンパク質は吸光度測定や、タンパク質発現活性解析により検出され得る。

図面の簡単な説明

0099

核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成を示した斜視図である。
核酸増幅検出装置の測定部の全体構成を示した図である。
実験例1で行われた測定用試料i及びii作製の概略である。
疑似組織と、該疑似組織を収容したマイクロチューブとを模式的に示した図である。
測定用試料i及びiiのRNA濃度を示したグラフである。
実験例2で行われた測定用試料iii及びiv作製の概略である。
測定用試料iii及びivのRNA濃度を示したグラフである。
実験例3で行われた測定用試料v,vi及びvii作製の概略である。
測定用試料v、vi、及びviiの増幅立ち上がり時間を示したグラフである。

符号の説明

0100

2マイクロチューブ
3アガロースゲル
4 RNA
5 収容部
6 蓋
10分注機構部
11アーム部
12シリンジ部
12aノズル部
20サンプル容器セット部
21a サンプル容器セット孔
21b把持部
30試薬容器セット部
31aプライマ試薬容器セット孔
31b酵素試薬容器セット孔
31c 把持部
32a プライマ試薬容器
32b 酵素試薬容器
40チップセット部
41ピペットチップ
42 ラック
42a収納孔
43取り外しボタン
50チップ廃棄部
60反応検出部
60a 反応検出ブロック
61 反応部
62濁度検出部
63 蓋閉機構部
65検出セル
67aセル部
70 制御部
80電源部
90 緊急停止スイッチ
100核酸増幅検出装置
101測定部
102データ処理部
102aキーボード
102bマウス
200プリンタ
300 ホストコンピュータ

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