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技術 血管障害を処置するためのEphレセプターのアンタゴニストおよびアゴニストについての使用

出願人 ジェネンテックインコーポレイテッド
発明者 ミシェルアギュー
出願日 2005年9月14日 (14年6ヶ月経過) 出願番号 2005-267683
公開日 2006年1月19日 (14年2ヶ月経過) 公開番号 2006-016404
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 冠状体 アクセス口 デスプレイ 放射結合 脳軟膜 二方向性 修復後 手当て
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (8)

課題

哺乳動物における新脈管形成阻害するか、または脈管奇形処置する方法の提供。

解決手段

哺乳動物における新脈管形成を阻害する方法であって、該哺乳動物における新脈管形成を阻害するために有効である量のEphレセプターアンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法であって、1実施形態において、上記哺乳動物がヒトであり、上記アンタゴニストがEphレセプターを結合し、上記アンタゴニストが抗体を含み、さらに、上記抗体がEphB4レセプターを結合する、方法。

概要

背景

(関連分野の説明)
胚発生の間に内皮細胞分化することに由来する新たな血管の形成(脈管形成)、または成人期の間の既存の血管に由来する新たな血管の形成(新脈管形成)のいずれも、高等生物における器官の発生、再生、および創傷治癒の必須の特徴である。FolkmanおよびShing,J.Biol.Chem.267:10931−10934(1992);Reynoldsら、FASEB J.6:886−892(1992);Risauら、Development,102:471−478(1988)。

新脈管形成は、種々の障害病因に関係している。これらの障害としては、固形腫瘍、眼内新生血管症候群(intraocular neovascular syndrome)(例えば、増殖性網膜症または加齢性黄斑変性(AMD))、慢性関節リウマチ、および乾癬が挙げられる[Folkmanら、J.Biol.Chem.267:10931−10934(1992);Klagsbrunら、Annu.Rev.Physiol.53:217−239(1991);およびGarner A,「Vascular diseases」、Pathobiology of ocular disease.A dynamic approach.Garner A、Klintworth GK,編、第2版、Marcel Dekker,NY,1625−1710頁(1994)]。固形腫瘍の場合において、血管新生は、正常細胞と比較した場合、腫瘍細胞が増殖に有利な立場、および増殖自律性を獲得することを可能にする。従って、乳癌およびいくつかの他の腫瘍において、腫瘍部分における微小血管密度患者生存と間には相関が観察された[Weidnerら、N Engl J Med 324:1−6(1991);Horakら、Lancet 340:1120−1124(1992);およびMacchiariniら、Lancet 340:145−146(1992)]。

新脈管形成の正のレギュレーターに対する検索は、多くの候補物をもたらした。これらの候補物としては、aFGF、bFGF、TGF−α、TGF−β、HGF、TNF−α、アンジオゲニンIL−8などが挙げられる(Folkmanら、およびKlagsbrunら)。これまでに同定された負のレギュレーターとしては、トロンボスポンジン[Goodら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6624−6628(1990)]、プロラクチンの16キロダルトンN末端フラグメント[Clappら、Endocrinology、133:1292−1299(1993)]、アンギオスタチン[O’Reillyら、Cell、79:315−328(1994)]およびエンドスタチン[O’Reillyら、Cell、88:277−285(1996)]が挙げられる。

多くのレセプターチロシンキナーゼが記載されており、これは、脈管発生別個の段階を支配する[Folkmanら、Cell 87:1153−1155(1996);Hanahan,D.,Science,277:48−50(1997);Risau,W.,Nature386:671−674(1997);Yancopoulosら,Cell,93:661−664(1998)]。

脈管内皮細胞増殖因子VEGF)についてのレセプターであるFlk−1(VEGF−R2)は、内皮細胞および造血前駆体細胞の分化を媒介する[Shalabyら、Nature,376:62−66(1995);Carmelietら、Nature、380:435−439(1996);Ferraraら、Nature 380:439−442(1996)]。VEGFはまた、Flt−1(VEGF−R2)の連結を通じて新脈管形成の後期を支配する[Fongら、Nature,376:66−70(1995)]。Flt−1を欠如するマウスは、脈管発生の最も初期の段階から内皮細胞の異所性の発生とともに脈管内皮細胞の組織破壊した。このことは、Flt−1シグナル伝達が、内皮細胞のシートの正確なアセンブリに必須であることを示唆する(Fongら、前出)。

別のチロシンキナーゼレセプターであるTie−2[Dumontら、Genes Dev.8:1897−1909(1994);Satoら、Nature、376:70−74(1995)]ならびにそのリガンドであるAng−1[Davisら、Cell 87:1161−1169(1996);Suriら、Cell 87:1171−1180(1996)]およびAng−2[Maisonpierreら、Science 277:55−60(1997)]は、内皮細胞ではない脈管壁成分のアセンブリに関与する。Tie−1は、内皮細胞完全性の維持に関与し、そしてその不活化は、浮腫および出血に起因する周産期死亡を生じる[Satoら、Nature 376:70−74(1995)]。Tie−2経路は、内皮細胞と周辺の脈管壁成分との間の相互作用を促進することを通じて成熟工程に関与しているようである[Suriら、前出;およびVikkulaら、Cell 87:1181−1190(1996)]。

Ephチロシンキナーゼサブファミリーは、膜貫通レセプターチロシンキナーゼの最も大きなサブファミリーであるようである[Pasquale,E.Curr.Opin.Cell Biol.9:608−615(1997);ならびにOrioliおよびKlein、Trendsin Genetics 13:354−359(1997)]。短期間の間に非常に多くのEphレセプター遺伝子が異なる種において同定されたので、各遺伝子は、複数の名前が与えられた。従って、統一した命名法が作り出され、ここでEphレセプターは、配列相同性に基づいて、2つの群に分けられる。EphA群のメンバーは、膜アンカリングのためにグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーとともに、Ephリガンドに対して優先的に結合する。このようなGPI連結リガンドは、Ephrin−Aサブクラス分類される。EphB群のメンバーは、膜アンカリングのためにポリペプチド膜貫通領域を保有するリガンドに優先的に結合する。このような膜貫通リガンドは、Ephrin−Bサブクラスに分類される。

Ephrinおよびそれらのレセプターは、おそらく、細胞内斥力を調節することを通じて、正確な細胞移動および神経発生の間の配置を支配する[Pasquale、前出;OrioliおよびKlein、前出]。二方向性シグナル伝達は、いくつかのephrin−B/EphBリガンド/レセプターの対について観察された[Hollandら、Nature 383:722−725(1996);およびBrucknerら、Science 275:1640−1643(1997)]。

Bennettら、J.Biol.Chem.269:14211−14218(1994)において開示されたHtkレセプターは、Ephファミリーのメンバーである。このレセプター(EphB4とよばれる)は、心臓内皮細胞および上皮細胞を含む種々の組織において発現される。Bennettら(前出);Ciossekら、Oncogene 11:2085−2095(1995);Inadaら、Blood 89:2757−2765(1997);Nikolovaら、J.Cell Sci.111:2741−2751(1998)。EphB4レセプター発現は、最近、エストロゲンに関連することが報告された[Nikolovaら、前出]。

Ephrin−A1およびEphrin−B1は、新脈管形成特性を有すると提唱された[Pandeyら、Science 268:567−569(1995);およびSteinら。Genes Dev.12:667−678(1998)]。Ephrin−B2(Ephrin−B4レセプターのリガンド)は、最近、早期の新脈管形成の間に動脈区画を示すこと、およびephrin−B2を欠如するマウスは、毛細管床形成において重篤奇形を示したことが報告された[Wangら、Cell 93:741−753(1998)]。

概要

哺乳動物における新脈管形成を阻害するか、または脈管奇形を処置する方法の提供。 哺乳動物における新脈管形成を阻害する方法であって、該哺乳動物における新脈管形成を阻害するために有効である量のEphレセプターアンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法であって、1実施形態において、上記哺乳動物がヒトであり、上記アンタゴニストがEphレセプターを結合し、上記アンタゴニストが抗体を含み、さらに、上記抗体がEphB4レセプターを結合する、方法。 なし

目的

本発明は、所望されないか、または過剰な新生血管形成により特徴付けられる疾患または障害、例えば、腫瘍(特に固形悪性腫瘍)、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム硬化症糖尿病および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生緑内障血管腫甲状腺過形成(thyroid hyperplasias)(グレーブス病を含む)、角膜および他の組織の移植、ならびに慢性炎症を、処置の必要がある患者に有効量のEphレセプターアンタゴニストを投与することにより処置する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

哺乳動物における新脈管形成阻害する方法であって、該哺乳動物における新脈管形成を阻害するために有効である量のEphレセプターアンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。

技術分野

0001

(発明の分野)
本発明は、一般に、Ephレセプターアンタゴニストまたはアゴニストについての使用に関する。特に、本発明は、哺乳動物における新脈管形成阻害または刺激する方法に関し、この方法は、有効量のEphレセプターアンタゴニストまたはアゴニストを、それぞれ、この哺乳動物に投与する工程を包含する。これらの方法に関して使用するための製品もまた記載される。

背景技術

0002

(関連分野の説明)
胚発生の間に内皮細胞分化することに由来する新たな血管の形成(脈管形成)、または成人期の間の既存の血管に由来する新たな血管の形成(新脈管形成)のいずれも、高等生物における器官の発生、再生、および創傷治癒の必須の特徴である。FolkmanおよびShing,J.Biol.Chem.267:10931−10934(1992);Reynoldsら、FASEB J.6:886−892(1992);Risauら、Development,102:471−478(1988)。

0003

新脈管形成は、種々の障害病因に関係している。これらの障害としては、固形腫瘍、眼内新生血管症候群(intraocular neovascular syndrome)(例えば、増殖性網膜症または加齢性黄斑変性(AMD))、慢性関節リウマチ、および乾癬が挙げられる[Folkmanら、J.Biol.Chem.267:10931−10934(1992);Klagsbrunら、Annu.Rev.Physiol.53:217−239(1991);およびGarner A,「Vascular diseases」、Pathobiology of ocular disease.A dynamic approach.Garner A、Klintworth GK,編、第2版、Marcel Dekker,NY,1625−1710頁(1994)]。固形腫瘍の場合において、血管新生は、正常細胞と比較した場合、腫瘍細胞が増殖に有利な立場、および増殖自律性を獲得することを可能にする。従って、乳癌およびいくつかの他の腫瘍において、腫瘍部分における微小血管密度患者生存と間には相関が観察された[Weidnerら、N Engl J Med 324:1−6(1991);Horakら、Lancet 340:1120−1124(1992);およびMacchiariniら、Lancet 340:145−146(1992)]。

0004

新脈管形成の正のレギュレーターに対する検索は、多くの候補物をもたらした。これらの候補物としては、aFGF、bFGF、TGF−α、TGF−β、HGF、TNF−α、アンジオゲニンIL−8などが挙げられる(Folkmanら、およびKlagsbrunら)。これまでに同定された負のレギュレーターとしては、トロンボスポンジン[Goodら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6624−6628(1990)]、プロラクチンの16キロダルトンN末端フラグメント[Clappら、Endocrinology、133:1292−1299(1993)]、アンギオスタチン[O’Reillyら、Cell、79:315−328(1994)]およびエンドスタチン[O’Reillyら、Cell、88:277−285(1996)]が挙げられる。

0005

多くのレセプターチロシンキナーゼが記載されており、これは、脈管発生別個の段階を支配する[Folkmanら、Cell 87:1153−1155(1996);Hanahan,D.,Science,277:48−50(1997);Risau,W.,Nature386:671−674(1997);Yancopoulosら,Cell,93:661−664(1998)]。

0006

脈管内皮細胞増殖因子VEGF)についてのレセプターであるFlk−1(VEGF−R2)は、内皮細胞および造血前駆体細胞の分化を媒介する[Shalabyら、Nature,376:62−66(1995);Carmelietら、Nature、380:435−439(1996);Ferraraら、Nature 380:439−442(1996)]。VEGFはまた、Flt−1(VEGF−R2)の連結を通じて新脈管形成の後期を支配する[Fongら、Nature,376:66−70(1995)]。Flt−1を欠如するマウスは、脈管発生の最も初期の段階から内皮細胞の異所性の発生とともに脈管内皮細胞の組織破壊した。このことは、Flt−1シグナル伝達が、内皮細胞のシートの正確なアセンブリに必須であることを示唆する(Fongら、前出)。

0007

別のチロシンキナーゼレセプターであるTie−2[Dumontら、Genes Dev.8:1897−1909(1994);Satoら、Nature、376:70−74(1995)]ならびにそのリガンドであるAng−1[Davisら、Cell 87:1161−1169(1996);Suriら、Cell 87:1171−1180(1996)]およびAng−2[Maisonpierreら、Science 277:55−60(1997)]は、内皮細胞ではない脈管壁成分のアセンブリに関与する。Tie−1は、内皮細胞完全性の維持に関与し、そしてその不活化は、浮腫および出血に起因する周産期死亡を生じる[Satoら、Nature 376:70−74(1995)]。Tie−2経路は、内皮細胞と周辺の脈管壁成分との間の相互作用を促進することを通じて成熟工程に関与しているようである[Suriら、前出;およびVikkulaら、Cell 87:1181−1190(1996)]。

0008

Ephチロシンキナーゼサブファミリーは、膜貫通レセプターチロシンキナーゼの最も大きなサブファミリーであるようである[Pasquale,E.Curr.Opin.Cell Biol.9:608−615(1997);ならびにOrioliおよびKlein、Trendsin Genetics 13:354−359(1997)]。短期間の間に非常に多くのEphレセプター遺伝子が異なる種において同定されたので、各遺伝子は、複数の名前が与えられた。従って、統一した命名法が作り出され、ここでEphレセプターは、配列相同性に基づいて、2つの群に分けられる。EphA群のメンバーは、膜アンカリングのためにグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーとともに、Ephリガンドに対して優先的に結合する。このようなGPI連結リガンドは、Ephrin−Aサブクラス分類される。EphB群のメンバーは、膜アンカリングのためにポリペプチド膜貫通領域を保有するリガンドに優先的に結合する。このような膜貫通リガンドは、Ephrin−Bサブクラスに分類される。

0009

Ephrinおよびそれらのレセプターは、おそらく、細胞内斥力を調節することを通じて、正確な細胞移動および神経発生の間の配置を支配する[Pasquale、前出;OrioliおよびKlein、前出]。二方向性シグナル伝達は、いくつかのephrin−B/EphBリガンド/レセプターの対について観察された[Hollandら、Nature 383:722−725(1996);およびBrucknerら、Science 275:1640−1643(1997)]。

0010

Bennettら、J.Biol.Chem.269:14211−14218(1994)において開示されたHtkレセプターは、Ephファミリーのメンバーである。このレセプター(EphB4とよばれる)は、心臓内皮細胞および上皮細胞を含む種々の組織において発現される。Bennettら(前出);Ciossekら、Oncogene 11:2085−2095(1995);Inadaら、Blood 89:2757−2765(1997);Nikolovaら、J.Cell Sci.111:2741−2751(1998)。EphB4レセプター発現は、最近、エストロゲンに関連することが報告された[Nikolovaら、前出]。

0011

Ephrin−A1およびEphrin−B1は、新脈管形成特性を有すると提唱された[Pandeyら、Science 268:567−569(1995);およびSteinら。Genes Dev.12:667−678(1998)]。Ephrin−B2(Ephrin−B4レセプターのリガンド)は、最近、早期の新脈管形成の間に動脈区画を示すこと、およびephrin−B2を欠如するマウスは、毛細管床形成において重篤奇形を示したことが報告された[Wangら、Cell 93:741−753(1998)]。

課題を解決するための手段

0012

本発明によって、以下が提供される:
項目1)哺乳動物における新脈管形成を阻害する方法であって、該哺乳動物における新脈管形成を阻害するために有効である量のEphレセプターアンタゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
(項目2) 前記哺乳動物がヒトである、項目1に記載の方法。
(項目3) 前記アンタゴニストがEphレセプターを結合する、項目1に記載の方法。
(項目4) 前記アンタゴニストが抗体を含む、項目1に記載の方法。
(項目5) 前記抗体がEphB4レセプターを結合する、項目4に記載の方法。
(項目6) 前記哺乳動物が、所望されないまたは過剰な血管新生または血管透過性によって特徴付けられる疾患または障害に罹患している、項目1に記載の方法。
(項目7)治療的有効量のEphレセプターアンタゴニストを、哺乳動物に投与する工程を包含する、該哺乳動物における癌を処置する方法。
(項目8) 前記アンタゴニストがEphレセプターを結合する、項目7に記載の方法。
(項目9) 前記哺乳動物が固形悪性腫瘍を有する、項目7に記載の方法。
(項目10) 前記アンタゴニストが抗体である、項目7に記載の方法。
(項目11) 前記EphレセプターがEphB4である、項目7に記載の方法。
(項目12) 前記哺乳動物がヒトである、項目7に記載の方法。
(項目13) 前記アンタゴニストがEphrin−B2を結合する、項目7に記載の方法。
(項目14) 哺乳動物における新脈管形成を刺激する方法であって、該哺乳動物において新脈管形成を刺激するために有効である量のEphレセプターアゴニストを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
(項目15) 前記哺乳動物がヒトである、項目14に記載の方法。
(項目16) 前記アンタゴニストがアゴニスト抗体を含む、項目14に記載の方法。
(項目17) 前記アゴニスト抗体がEphレセプターを結合する、項目16に記載の方法。
(項目18) 前記アゴニスト抗体がEphB4レセプターを結合する、項目17に記載の方法。
(項目19) 哺乳動物における血管ネットワークに対する外傷を処置する方法であって、治療的有効量のEphレセプターアゴニストを、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
(項目20)製品であって、以下:
容器
表示;および
該容器内に含まれる活性薬剤を含む組成物
を含み、ここで該表示は、該組成物が所望されないまたは過剰の血管新生または血管透過性によって特徴付けられる疾患または障害を処置するために使用され得、そして該組成物中の該活性薬剤がEphレセプターアンタゴニストであることを示す、製品。
(項目21) 哺乳動物における疾患または障害を処置するために、該哺乳動物にEphレセプターアンタゴニストを投与するための説明書をさらに備える、項目20に記載の製品。
(項目22) 製品であって、以下:
容器;
表示;および
該容器内に含まれる活性薬剤を含む組成物;
を含み、ここで該表示は、該組成物が新脈管形成を刺激するために使用され得、そして該組成物中の該活性薬剤がEphレセプターアゴニストであることを示す、製品。

0013

(発明の要旨)
本発明は、哺乳動物における新脈管形成を阻害するか、または脈管奇形を処置する方法に関し、この方法は、この哺乳動物における新脈管形成を阻害するため、または脈管奇形を処置するために有効な量のEphレセプターアゴニストを、この哺乳動物に投与する投与する工程を包含する。従って、本発明は、所望されないか、または過剰な新生血管形成により特徴付けられる疾患または障害、例えば、腫瘍(特に固形悪性腫瘍)、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム硬化症糖尿病および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生緑内障血管腫甲状腺過形成(thyroid hyperplasias)(グレーブス病を含む)、角膜および他の組織の移植、ならびに慢性炎症を、処置の必要がある患者に有効量のEphレセプターアンタゴニストを投与することにより処置する方法を提供する。本発明はさらに、所望されないか、または過剰な脈管透過性により特徴付けられる疾患または障害、例えば、脳腫瘍に関連する浮腫、悪性疾患に関連する腹水、メイグス症候群、の炎症、ネフローゼ症候群心内膜液浸出(例えば、心膜炎に関連するもの)、ならびに胸水を処置する方法を提供する。

0014

1つの実施形態において、Ephレセプターアンタゴニストを用いて、エストロゲン治療から生じる脈管奇形(例えば、小脈管異常)を処置する。Ephレセプターアンタゴニストの投与は、患者のエストロゲンの投与の前または後に行われ得る。付随した治療もまた企図され、例えば、ここで、Ephレセプターアンタゴニストおよびエストロゲンが、同じ組成物中に提供される。

0015

別の局面において、本発明は、哺乳動物において癌(例えば、固形悪性腫瘍)を処置する方法を提供し、この方法は、その哺乳動物に治療有効量のEphレセプターアンタゴニストを投与する工程を包含する。

0016

さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物において血管組織を処置するか、または新脈管形成を刺激する方法に関し、この方法は、その血管組織を処置するか、または新脈管形成を刺激するのに有効な量のEphレセプターアゴニストを、その哺乳動物に投与する工程を包含する。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物における血管ネットワークに対する外傷を処置する方法を提供し、この方法は、その外傷を患う哺乳動物に、治療有効量のEphレセプターアゴニストを投与する工程を包含する。この外傷は、例えば、糖尿病性潰瘍あるいは血管または心臓創傷である。

0017

なおさらなる局面において、本発明は、以下を備える製品を提供する:容器;ラベル;およびその容器に含まれる活性薬剤を含有する組成物。ここで、このラベルは、その組成物を使用して、新脈管形成を阻害し得るか、あるいは所望でないか、または過剰な脈管形成または血管透過性によって特徴付けられる疾患または障害を処置し得ることを表示し、そしてその組成物中の活性薬剤は、Ephレセプターアンタゴニストである。

0018

本発明はまた、以下を備える製品に関する:容器;ラベル;およびその容器に含まれる活性薬剤を含有する組成物。ここで、このラベルは、その組成物を使用して、新脈管形成を刺激し得るか、あるいは血管ネットワークに対する外傷を処置し得ることを表示し、そしてその組成物中の活性薬剤は、Ephレセプターアゴニストである。

発明を実施するための最良の形態

0019

(好ましい実施形態の詳細な説明)
(I.定義)
用語「Ephレセプター」とは、Ephファミリーのレセプターに属するチロシンキナーゼレセプターをいう。Ephファミリーのレセプターは、例えば、Pasquale,E.Curr.Opin.Cell Biol.9:608−615(1997);およびOrioliおよびKlein,Trendsin Genetics 13:354−359(1997)に総説される。Ephファミリーは、それほど保存されていない、14の構造的に関連する膜貫通レセプターチロシンキナーゼを含み、各々は、以下の一連モジュールを含む細胞外領域を有する;アミノ末端での推定免疫グロブリンIgドメイン、それに続く、一つの膜貫通セグメント近接するシステインリッチ領域および2つのフィブロネクチンIII型反復、膜近傍領域に隣接される高度に保存されたチロシンキナーゼドメイン含む細胞質領域、およびカルボキシ末端テール欠失、切断、置換または挿入を有する種々の改変体が、この定義に含まれる。さらに、キナーゼ活性欠くEphレセプター、Mep、および他の発見されるEphレセプター分子が、この定義に含まれる。Ephレセプターは、配列相同性に基づいて2つの群に分けられ得る。

0020

EphA群のEphレセプターは、本明細書中で「EphAレセプター」と称され、(現在5つのリガンドを含む、Ephrin−Aサブクラスの)グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合リガンドと優先的に相互作用する。特定のEphAレセプターとしては、以下が挙げられる:EphA1(EphおよびEskとも呼ばれる);EphA2(Eck、mEck、Myk2、Sek2とも呼ばれる);EphA3(Hek、Mek4、Tyro4およびCek4とも呼ばれる);EphA4(Hek8、Sek1、Tyro1およびCek8としても公知である);EphA5(Hek7、Bsk、Ehk1、Rek7およびCek7とも呼ばれる);EphA6(mEhk2およびEhk2とも呼ばれる);EphA7(他でHek11、Mdk1、Ebk、Ehk3と名付けられる);およびEph8(EekおよびmEekとも呼ばれる)、ならびに天然に存在するこれらの改変体。

0021

EphB群のEphレセプターは、本明細書中で「EphBレセプター」と称され、(現在3つのリガンドを含む、Ephrin−Bサブクラスの)膜貫通リガンドと優先的に相互作用する。特定のEphBレセプターとしては、以下が挙げられる:EphB1(他でNet、ElkおよびCek6と名付けられる);EphB2(別名として、Erk、Hek5、Drt、Nuk、Sek3、Tyro5、Cek5およびQek5が挙げられる);EphB3(Hek2、Sek4、Mdk5、Tyro6、Cek10およびQek10とも呼ばれる);EphB4(Htk、HpTK5、Myk1、Mdk2およびTyro11とも称される);EphB5(Cek9とも呼ばれる);およびEphB6(HepおよびMepがこのレセプターについての別名である)ならびに天然に存在するこれらの改変体。

0022

好ましいEphレセプターは、「ネイティブ配列」Ephレセプター(以下の定義を参照のこと)である。好ましくは、このEphレセプターは、「ヒトEphレセプター」(すなわち、ヒト供給源由来のEphレセプターのアミノ酸配列を有する)である。

0023

「ネイティブ配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチド(例えば、EphレセプターまたはEphリガンド)と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このようなネイティブ配列ポリペプチドは、内因性(すなわち、哺乳動物においてインビボで存在する)であり得るか、天然から単離され得るか、または組換え手段または合成手段によって産生され得る。従って、ネイティブ配列ポリペプチドは、天然に存在する、ヒトポペプチド、マウスポリペプチド、または他の任意の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。

0024

本明細書中の1つの好ましいEphレセプターは、Bennettら、J.Biol.Chem.269(19):14211−14218(1994)(本明細書中に参考として明確に援用される)におけるアミノ酸配列を含むヒトEphレセプターのような、「EphB4レセプター」(すなわち、Htkレセプター)である。

0025

本明細書中で用語「Ephリガンド」とは、Ephレセプターに結合し、そして必要に応じてそのEphレセプターを活性化する(例えば、そのチロシンリン酸化を刺激する)ポリペプチドをいう。

0026

Ephリガンドは、「GPI結合型Ephリガンド」(すなわち、グリコシルホスファチジルイノシトールまたはGPIアンカーを含む)であり得る。例示的GPI結合型Ephリガンドとしては、Ephrin−A1(Lerk1およびB61とも呼ばれる);Ephrin−A2(他で、Elf1およびCek7−Lとして公知である);Ephrin−A3(Lerk3およびEhk1−Lとも呼ばれる);Ephrin−A4(Lerk4とも呼ばれる);およびEphrin−A5(別名、Lerk7、Al1およびRagsである)、ならびに天然に存在するそれらの改変体が挙げられる。

0027

あるいは、Ephリガンドは、「膜貫通Ephリガンド」(すなわち、膜貫通ポリペプチドドメインを含み、そして好ましくは細胞質ポリペプチドドメインをさらに含む)であり得る。膜貫通Ephリガンドの例としては、Ephrin−B1(Lerk2、Elk−LおよびCek5−Lとも呼ばれる);Ephrin−B2(他で、Lerk5、Htk−LおよびElf−2としても公知である);およびEphrin−B3(Nlerk3およびElk−L3とも称される)、ならびに天然に存在するそれらの改変体が挙げられる。

0028

好ましいEphリガンドは、膜貫通Ephリガンドであり、最も好ましくは、Ephrin−B2(すなわちHtkリガンド)であり、これらは、例えば、GenBank登録番号L38847(マウスHtkリガンド)またはL38734(ヒトHtkリガンド)[また、Bennettら、PNAS(USA)92:1866−1870(1995)(本明細書中で参考として明確に援用される)も参照のこと]におけるアミノ酸配列を含む。

0029

用語「アミノ酸配列改変体」とは、ネイティブ配列ポリペプチドとは幾分かの程度で異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。通常、アミノ酸配列改変体は、ネイティブ配列Ephリガンドの少なくとも1つのレセプター結合ドメインと、またはネイティブ配列Ephレセプターの少なくとも1つのリガンド結合ドメインと、少なくとも約70%の相同性を有し、そして好ましくは、このようなレセプターまたはリガンド結合ドメインと、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも90%相同である。アミノ酸配列改変体は、ネイティブアミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の部位に置換、欠失、および/または挿入を有する。

0030

「相同性」は、配列を整列し、そして必要に応じてギャップを導入して、最大の相同性パーセントを達成した後に同一である、アミノ酸配列改変体中の残基の割合として定義される。整列についての方法およびコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。1つのこのようなコンピュータープログラムは、「Align 2」である。これは、Genentech,Inc.によって作成され、1991年12月10日にUnited States Copyright Office、Washington DC 20559にユーザードキュメンテーションと共に提出された。

0031

用語「レセプター結合ドメイン」は、少なくとも対応するネイティブ配列Ephリガンドの定量的レセプター結合能力を保持するEphリガンドの任意の領域を示すために、本明細書中で使用される。ネイティブ配列レセプター結合ドメインのアミノ酸配列改変体および/または誘導体は、この定義の中に包含される。

0032

用語「リガンド結合ドメイン」は、少なくとも対応するネイティブ配列Ephレセプターの定量的リガンド結合能力を保持するEphレセプターの任意の領域を称するために、本明細書中で使用される。ネイティブ配列リガンド結合ドメインのアミノ酸配列改変体および/または誘導体は、この定義の中に包含される。

0033

本明細書中の用語「可溶性Ephレセプター」または「可溶性Ephリガンド」は、ネイティブ分子の膜結合領域(membrane anchoring region)を本質的に含まないEphレセプターもしくはEphリガンドの形態、または不活性化された膜結合領域を有する形態をいう。「膜結合領域」とは、EphレセプターもしくはEphリガンドの膜貫通ドメイン(および必要に応じて細胞質ドメイン)、またはEphリガンドのGPIアンカーを意味する。「本質的に含まない」とは、分子が、このような膜結合領域を1%未満で、好ましくは、このような領域を0.5%から0%で、最も好ましくは、このような領域を0.1%から0%で有することを意味する。

0034

用語「アンタゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、Ephレセプターのような標的分子生物学的活性の1つ以上を阻害し得る分子をいう。アンタゴニストは、リガンドへのレセプターの結合、およびその逆の結合を妨害することにより、リガンドにより活性化された細胞を活動不能化するかまたは殺傷することにより、ならびに/あるいはレセプターもしくはリガンドの活性化(例えば、チロシンキナーゼ活性化)または細胞レセプターへのリガンド結合後のシグナル伝達を妨害することにより作用し得る。アンタゴニストは、レセプター−リガンド相互作用を完全にブロックし得るか、またはこのような相互作用を実質的に減少させ得る。アンタゴニストによる介入のこのような点は全て、本発明の目的のために等価であるとみなされるべきである。従って、本発明の範囲内には、以下が含まれる:Ephレセプター、Ephリガンド、またはEphレセプターおよびEphリガンドの複合体に結合するアンタゴニスト(例えば、中和抗体);EphレセプターとEphリガンドとの間の相互作用を拮抗するEphレセプターまたはEphリガンドのアミノ酸配列改変体または誘導体;可溶性Ephレセプターまたは可溶性Ephリガンド(必要に応じて、免疫グロブリン領域(例えば、免疫接着因子(immunoadhesin))のような異種分子に融合される);Ephリガンドと会合したEphレセプターを含む複合体;EphレセプターまたはEphリガンドに結合する合成配列ペプチドまたはネイティブ配列ペプチド;小分子アンタゴニスト;および核酸アンタゴニスト(例えば、アンチセンス)。

0035

本明細書中の「アゴニスト」は、Ephレセプターのような標的分子の生物学的活性の1つ以上を活性化し得る分子である。アゴニストは、例えば、標的分子を活性化すること、および/またシグナル伝達を媒介することにより作用し得る。本発明の範囲内には、以下が含まれる:EphレセプターまたはEphリガンドそれ自体;Ephレセプター、Ephリガンド、またはEphレセプターおよびEphリガンドの複合体に結合するアゴニスト(例えば、アゴニスト抗体);EphレセプターまたはEphリガンドを活性化するEphレセプターまたはEphリガンドのアミノ酸配列改変体または誘導体(例えば、Ephレセプターまたはリガンドを活性化する免疫接着因子のような二価分子);EphレセプターまたはEphリガンドに結合し、そして活性化する合成配列ペプチドまたはネイティブ配列ペプチド;小分子アゴニスト;およびEphレセプターまたはEphリガンドをコードする遺伝子(すなわち、遺伝子治療のために)。

0036

「処置」とは、治療的処置と、予防的もしくは防止的手段との両方をいう。処置を必要とするものは、その障害を既に有するもの、ならびにその障害が予防されるべきものを含む。

0037

処置の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物(ヒト、家畜動物、および動物園スポーツ、またはペット動物(例えば、イヌウマネコウシなど)を含む)をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本明細書中で処置されるヒトは、または胎児(すなわち、ここでは、哺乳動物は子宮中で処置される)、乳児小児思春期成人、または成人を含む。

0038

アゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」または「治療有効量」は、処置される状態を防ぐ、その悪化を軽減する、緩和する、または治癒するのに有効な量である。

0039

癌の処置を参照した「治療有効量」は、以下の効果の1つ以上を惹起し得る量をいう:(1)ある程度の腫瘍増殖の阻害(鈍化および完全な増殖阻止を包含する);(2)腫瘍細胞の数の減少;(3)腫瘍サイズの減少;(4)末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害(すなわち、減少、鈍化、または完全停止);(5)転移の阻害(すなわち、減少、鈍化、または完全停止);(6)抗腫瘍免疫応答の増強(腫瘍の抑制または拒絶を生じ得るが、必ずしも生じるわけではない);および/または(7)障害と関連した1つ以上の症状のある程度の緩和。

0040

用語「新脈管形成を阻害する」とは、処置される哺乳動物における血管の発達を実質的に防止するまたは減少させる作用をいう。

0041

「新脈管形成を刺激する」または「新脈管形成を促進する」との表現は、処置される哺乳動物における血管の発達を実質的に増大させる作用をいう。

0042

「所望されないまたは過剰な血管新生により特徴付けられる疾患または障害」は、例として、腫瘍、および特に、固形悪性腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、動脈硬化症糖尿病網膜症および他の網膜症、水晶体後線維増殖年齢関連黄斑変性、血管新生緑内障、血管腫、甲状腺肥大グレーヴズ病を含む)、角膜移植および他の組織移植、ならびに慢性炎症を包含する。

0043

「所望されないまたは過剰な血管透過性により特徴付けられる疾患または障害」の例は、脳腫瘍に付随した浮腫、悪性腫瘍に付随した腹水、メグズ症候群肺炎、ネフローゼ症候群、心内膜液浸出(例えば、心膜炎に付随したもの)、および胸水を包含する。

0044

「血管ネットワークへの外傷」との表現は、哺乳動物が供される血管または心臓(器官の血管ネットワークを含む)に対する外傷(例えば、傷害)をいう。このような外傷の例は、創傷、切開、および潰瘍(例えば、糖尿病潰瘍、および血管または心臓の創傷または裂傷)を包含する。外傷は、内部事象によって引き起こされる状態、ならびに病原のような外因性因子によって課される状態を包含する。これらは、新脈管形成の促進によって改善され得る。それはまた、血管形成または再内皮形成が治癒のために必要とされる創傷の処置をいう。

0045

本明細書中の用語「抗体」は、最も広範な意味において使用され、そして特にモノクローナル抗体全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体多重特異性(multispecific)抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体フラグメントカバーする。

0046

「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部を含み、これは、一般には、抗原結合領域またはそれらの可変ドメインを含む。抗体フラグメントの例は、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFvフラグメント;ダイアボディー(diabodies);直鎖状抗体;単鎖抗体分子;および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む。

0047

本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体を言い、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量において存在し得る天然に存在し得る変異以外は、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向付けられる。さらに、異なる決定基エピトープ)に対して方向付けられる異なる抗体を代表的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製とは対照的に、各ポリクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して方向付けられる。修飾語句モノクローナル」は、実質的に同質の抗体の集団から得られたものと同様な抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature 256:495(1975)により初めに記載されたハイブリドーマ方法により作製され得るか、または組換えDNA方法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)によって作製され得る。この「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clacksonら、Nature
352:624−628(1991)およびMarksら、J.Mol.Biol.222:581−597(1991)に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。

0048

本明細書中のモノクローナル抗体は、特に、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一か、または相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含むが、その鎖の残部は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列ならびにそのような抗体のフラグメントと同一か、または相同である[米国特許第4,816,567号およびMorrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851−6855(1984)]。

0049

非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエント超可変領域残基が、非ヒト種(ドナー抗体)(例えば、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットウサギまたは非ヒト霊長類)に由来する超可変領域残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFramework Region(FR)残基は、対応する非ヒト残基によて置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見い出だされない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに洗練するためになされ得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、および代表的には2つの可変ドメインの実質的なすべてを含み、ここで、全て、または実質的に全ての超可変領域は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域と対応し、そしてすべての、または実質的にすべてのFRは、ヒト免疫グロブリン配列のFRである。必要に応じて、ヒト化抗体はまた、少なくとも一部の免疫グログリ定常領域(Fc)、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。さらなる詳細について、Jonesら、Nature 321:522−525(1986);Reichmannら、Nature 332:323−329(1988);およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593−596(1992)を参照のこと。

0050

本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」とは、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を言う。超可変領域は、「Complementarity
Determining Region」または「CDR」[すなわち、軽鎖可変ドメイン内の24〜34残基(L1)、50〜56残基(L2)および89〜97残基(L3)ならびに重鎖可変ドメイン内の31〜35残基(H1)、50〜65残基(H2)および95〜102残基(H3);Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版.Public Health Service、National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)]に由来するアミノ酸残基および/または「超可変ループ」[すなわち、軽鎖可変ドメイン内の26〜32残基(L1)、50〜52残基(L2)および91〜96残基(L3)ならびに重鎖可変領域内の26〜32残基(H1)、53〜55残基(H2)および96〜101残基(H3);ChothiaおよびLesk J.Mol.Biol.196:901−917(1987)]に由来するアミノ酸残基を含む。「Framework Region」または「FR」残基は、本明細書中で定義されるような超可変領域残基とは異なるそれらの可変ドメイン残基である。

0051

単鎖Fv」または「sFv」抗体フラグメントは、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。一般的に、Fvポリペプチドは、sFvが、抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。sFvの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、vol.113、RosenburgおよびMoore編Springer−Verlag、New York、269−315頁(1994)を参照のこと。

0052

用語「ダイアボディ(diabodies)」とは、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖(VH−VL)内で、軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。短かすぎて同じ鎖上で2つのドメイン間で対形成ができないリンカーを使用することにより、そのドメインに強制的に別の鎖の相補的ドメインと対形成させて、2つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097;WO93/11161;およびHollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448(1993)においてより十分に記載される。

0053

本出願全体に渡って使用される場合、表現「直線状抗体」とは、1997年6月24日に発行された米国特許第5,641,870号に記載されるL−F(ab’)2抗体を言う。簡潔には、これらの抗体は、直列のFdセグメント(VH−CH1−VH−CH1)の対を含み、2つの軽鎖と結合される場合、これは一対の抗原結合領域を形成する。直線状抗体は、二重特異的(bispecific)または単一特異的であり得る。

0054

本明細書で使用される場合、用語「免疫接着因子(immunoadhesin)」は、異種「付着因子タンパク質(例えば、EphレセプターまたはEphリガンド)の「結合ドメイン」を免疫グロブリン定常ドメインアミノ酸配列と結合させる抗体様分子を示す。構造的に、免疫接着因子は、抗体(すなわち、「異種」である)の抗原認識部位および抗原結合部位(抗原結合部位)および免疫グロブリン定常ドメイン配列とは異なる所望の結合特異性を有する接着アミノ酸配列の融合を含む。

0055

「抗体−免疫接着因子キメラ」は、少なくとも1つの免疫接着因子(本出願において記載されるような)を抗体(本明細書中で定義される)の少なくとも1つの結合ドメインと結合させる分子を含む。例示的な抗体−免疫接着因子キメラは、Bergら、PNAS(USA)88:4723−4727(1991)およびChamowら、J.Immunol.153:4268(1994)において記載される二重特異的CD4−IgGキメラである。

0056

「単離された」分子とは、同定され、そしてその天然の環境の成分から分離および/または回収された分子である。その天然環境の混入成分は、その分子に対する治療的用途を妨害する無機物であり、そして酵素ホルモン、および他のタンパク質溶質または非タンパク質溶質を含み得る。

0057

本明細書で使用される場合、用語「細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤」とは、細胞の機能または増殖を減少させるか、もしくは妨げ、そして/または細胞の崩壊を引き起こす物質を言う。この用語は、放射性同位元素(例えば、I131、I125、Y90、およびRe186)、化学療法剤および毒素(例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源酵素学的に活性な毒素またはそのフラグメント)を含むことを意図する。

0058

「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、アドリアマイシンドキソルビシンエピルビシン5−フルオロウラシルシトシンアラビノシド(「Ara−C」)、シクロホスファミドチオテパブスルファンシトキン(cytoxin)、タキソイド(taxoid)(例えば、パクリタキセル(paclitaxl)(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb Oncology、Princeton、NJ)およびドクサタキセル(doxetaxel)(TAXOTERE(登録商標)、Rhone−Poulenc Rorer、Antony、France))、タキソテールメトトレキセートシスプラチンメルファランビンラスチン、ブレオマイシンエトポシドイホスファミドマイトマイシンCミトキサントロンビンクリスチンビノレルビン(vinorelbine)、カルボプラチン、テニポシド(teniposide)、ダウノマイシンカルミノマイシン(carminomycin)、アミノプテリンダクチノマイシンマイトマイシンエスペラミシン(esperamicin)(米国特許第4,675,187号)、メルファラン、および他の関連するナイトロジェンマスタードが挙げられる。この定義において、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤タモキシフェンおよびオナプリストン(onapristone)もまた、含まれる。

0059

用語「エストロゲン」とは、エストロゲン性ホルモン(例えば、エストラジオール)に特有な生物学的な影響を及ぼす任意の物質(天然または合成)を言う。

0060

本出願で使用される場合、用語「プロドラッグ」とは、親ドラッグと比較して腫瘍細胞に対して小さな毒性であり、そして酵素学的に活性化されるか、またはより活性な親形態に変換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体形態または誘導体形態を言う。例えば、Wilman、「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」Biochemical Society Transactons、14、375−382頁、615th、Meeting
Belfast(1986)およびStellaら、「Prodrugs:A
Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery」、Directed Drug Delivery、Borchardtら、(編)247−267頁、Humana Press(1985)を参照のこと。本発明のプロドラッグとしては、以下が挙げられが、それらに限定されない:ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて、置換型フェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または必要に応じて、置換型フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5−フルオロシトシンおよびより活性な細胞傷害性または細胞増殖抑制性のない薬物に変換され得る他の5−フルオロウリジンプロドラッグ。本発明における使用のためのプロドラッグ形態に誘導され得る細胞傷害性薬物または細胞増殖抑制性薬物の例としては、上記のそれらの化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。

0061

リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質および/または界面活性剤からなる小さな小胞であり、これは、哺乳動物に対して薬物(例えば、本明細書に開示されるアンタゴニスト、および必要に応じて、化学療法剤)送達のために有用である。このリポソームの成分は、一般に、二重層形成において配列され、生物学的膜の脂質配列と類似する。

0062

用語「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド」および「アンチセンスオリゴ」とは、EphレセプターもしくはEphリガンドのmRNAまたはDNAの領域とハイブリダイズするポリヌクレオチドを言い、それにより、インビトロまたはインビボでEphレセプターポリペプチドまたはEphリガンドポリペプチドの産生を妨害するか、または減少させる。この用語は「改変された」ポリヌクレオチドを含み、その例は、本明細書に記載される。

0063

(II.本発明を実行するための様式)
本発明は、Ephレセプターアゴニストおよび/またはアンタゴニストを利用する方法に関する。そのような分子を作製するための方法は、以下に詳しく述べられる。以下の実施例に示されるように、Ephリガンド経路における潜在的なオーバーラップおよび重複性に起因する新脈管形成に対して、Ephレセプターはより明白な効果を有することが予期されるので、好ましくは、このアゴニストまたはアンタゴニストは、Ephレセプター(Ephリガンドよりはむしろ)と結合するか、または相互作用する。最も好ましくは、このアゴニストまたはアンタゴニストは、EphB4レセプターおよび最も好ましくはヒトEphB4レセプターを含み、それに結合するか、またはそれと相互作用する。

0064

その分子が、アゴニストである場合、天然のレセプターまたはリガンドの1つ以上のアゴニスト特性を保持する天然配列EphレセプターまたはEphリガンド(または改変体もしくはその誘導体)を使用し得る。適切なEphB4レセプター分子(HpTK5レセプター分子)が、1997年6月3日に発行された米国特許第5,635,177号において開示され(はっきりと、参考として本明細書に援用される)、有用なEphrin−B2分子(Htkリガンド)は、米国特許第5,624,899号において開示され、はっきりと、参考として本明細書に援用される。一つの実施形態において、可溶性分子が、天然分子の一つ以上のアゴニスト特性を保持する場合、可溶性のEphレセプターまたはリガンド(例えば、領域を固着する機能性膜を欠失しているレセプターまたはリガンドの短縮型形態)を使用し得る。あるいは、遺伝子治療によって、Ephレセプター、Ephリガンドをコードする遺伝子またはそのアゴニスト改変体をコードする核酸を投与し得る。他のアゴニスト分子は、本明細書中で以下に開示される。

0065

アゴニスト分子をスクリーニングするために、チロシンリン酸化を決定するための種々の利用可能な任意のアッセイを利用して、Ephレセプターおよび/またはリガンドのチロシンリン酸化を刺激する候補分子の能力を評価し得る。例えば、そのレセプターまたはリガンド(内在性または組換え的に導入された)を含む細胞を候補アゴニストに曝露し得、そして抗ホスホチロシン抗体を使用して、レセプターまたはリガンドのチロシンリン酸化を決定し得る(1997年6月3日に発行された米国特許5,635,177号および1998年6月16日に発行された米国特許5,766,863号を参照のこと;後者の特許は、アゴニストを同定するために都合良く使用され得る「Kinase Receptor Activation Assay」を記載している。

0066

あるいは、またはさらに、候補アゴニストの他のアゴニスト特性(例えば、下流のシグナル伝達事象を活性化する能力、例えば、EphレセプターまたはEphリガンドと細胞内分子との相互作用)についてスクリーニングし得る。

0067

さらに、インビボまたはインビトロで新脈管形成を刺激する候補アゴニストの能力についてスクリーニングし得る。例えば、F344雌ラット眼球無血管性角膜における脈管形成活性が、評価され得る[例えば、Streiterら、Am.J.Pathol.141:1279(1992)を参照のこと]。

0068

代替的な実施形態において、目的の分子は、Ephレセプターアンタゴニストである。種々のアンタゴニスト分子が以下に記載される。好ましいアンタゴニストは、Ephレセプターに結合し、そしてそれに対するEphリガンドの結合をブロックする中和抗体である。EphリガンドとEphレセプターとの間の相互作用をブロックする分子についてスクリーニングするために、リガンドまたはレセプター(またはその結合ドメイン)は、固相上に固定され得、そしてレセプターまたはリガンドの結合の競合阻害は、それぞれ、候補アゴニストによって、標準的技術(例えば、競合ELISA)により分析され得る。あるいは、またはさらに、チロシンリン酸化アッセイ(例えば、1997年6月3日に発行された米国特許第5,635,177号または1998年6月16日に発行された米国特許第5,766,863号に記載されるような)を使用して、レセプターまたはリガンドのチロシンリン酸化を妨害または減少させるアンタゴニストについてスクリーニングし得る。他のアッセイとしては、下流のシグナル伝達事象を妨害または減少させる候補アンタゴニストの能力を評価するアッセイまたは新脈管形成アッセイにおける新脈管形成を妨害または減少させるアッセイ(上記参照のこと)が挙げられる。あるいは、またはさらに、腫瘍細胞を注入されたヌードマウスにおいて腫瘍サイズを根絶または減少するアンタゴニストの能力が、評価され得る[例えば、Prestaら、Cancer Research、57:4593−4599(1997)を参照のこと]。

0069

(A.抗体)
本発明は、アンタゴニスト(「中和」抗体または「ブロック」抗体)またはアゴニスト(「アゴニスト抗体」)としての抗体の使用を意図する。抗体を生成するための技術は、本明細書中に記載される。アンタゴニスト特性またはアゴニスト特性は、前節にて記載されるようにスクリーニングされ得る。

0070

((i)抗原調製)
抗体の産生のために使用されるべき抗体は、例えば、単離されたインタクトなEphレセプターもしくは単離されたEphリガンドまたはその一つ以上のフラグメントであり得る。あるいは、天然または組換えEphレセプターまたはEphリガンドを発現する細胞は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。その抗原は、必要に応じて、さらに異種分子(例えば、免疫原性ペプチド)を含み得る。抗体を生成するために有用な他の形態のEphレセプターまたはEphリガンドは、当業者に対して明らかである。

0071

((ii)ポリクローナル抗体)
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原またはアジュバンドの多数の皮下(sc)注射または腹腔内(ip)注射によって動物内で惹起される。免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター)に二官能価剤または誘導体化剤(例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルシステイン残基を介する結合)、N−ヒドロキシスクシンイミドリジン残基を介する)、グルタルアルデヒド無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(ここで、RおよびR1は異なるアルキル基である)を使用して、関連抗原を結合することは有用であり得る。

0072

動物は、例えば、100μgまたは5μgのタンパク質または結合体(それぞれ、ウサギまたはマウスに対して)を3容量のフロイント完全アジュバンドと合わせ、そして皮内の複数の部位にその溶液を注入することにより、抗原、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫化される。1ヶ月後、その動物をフロイントの完全アジュバンド中の最初の量のペプチドまたは結合体の、1/5〜1/10を用いて、複数の部位における皮下注射によってブーストされる。7〜14日後、その動物は採血され、その血清が、抗体力価についてアッセイされる。動物は、その力価プラトーになるまでブーストされる。好ましくは、その動物は、同じ抗原の結合体を用いてブーストされるが、それは異なるタンパク質と、そして/または異なる架橋剤を介して結合体化される。結合体はまた、融合タンパク質として、組換え細胞培養において作製され得る。また、凝集剤(例えば、ミョウバン)が、免疫応答を増強するために適切に使用される。

0073

((iii)モノクローナル抗体)
モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、256:495(1975)より初めに記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えDNA方法(米国特許第4,816,567号)により作製され得る。

0074

ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物(例えば、ハムスターまたはマカクザル)が、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、もしくは産生し得るリンパ球を誘発するために本明細書の上記のように免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、適切な融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用して、ミエローマ細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding、Monoclonal Antibodies Principles and Practice、59−103頁(Academic Press、1986)]。

0075

このように調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない、親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する、一つ以上の物質を含む適切な培養培地において播種されて、増殖される。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠損している場合には、ハイブリドーマに対する培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンHAT培地)を含み、この物質が、HGPRT欠損細胞の増殖を妨害する。

0076

好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によって安定な高レベルの抗体の産生を支持し、そしてHAT培地のような培地に対して感受性のある細胞である。これらの中で、好ましいミエローマ細胞株は、マウスミエローマ株(例えば、Salk Institute Cell Distribution Center、San Diego、California
USAより入手可能なMOP−21およびM.C.−11マウス腫瘍に由来する細胞株、およびAmerican Type Culture Collection、Rockville、Maryland USAより入手可能なであるSP−2またはX63−Ag8−653細胞株)である。ヒトミエローマ細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている[Kozbor,J.Immunol.、133:3001(1984);Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51−63頁(Marcel Dekker,Inc.、New York、1987)]。

0077

ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗体に対して方向付けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ(例えば、放射免疫アッセイRIA)または酵素結合免疫測定法(ELISA))によって決定される。

0078

例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munsonら、Anal.Biochem.、107:220(1980)のスキャッチャード分析によって決定される。

0079

所望の特異性、親和性および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され得、そして標準的な方法によって増殖され得る[Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、59−103頁(Academic Press、1986)]。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、D−MEMまたはRPMI−1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物内の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。

0080

サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グログリン精製手順(例えば、プロテインAセファロースヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーゲル電気泳動透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような)によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。

0081

モノクローナル抗体をコードするDNAは、容易に単離され、そして従来の手順を使用して配列決定される(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)。このハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として役に立つ。一旦単離されると、そのDNAは、発現ベクターに配置され得、次いでそのベクターは、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を得るために、例えば、E.coli細胞、サルOS細胞チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞トランスフェクトされる。

0082

((iv)ヒト化抗体)
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその抗体に導入された一つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と言われ、これは代表的に、「移入」可変ドメインから選び出される。ヒト化は、基本的に、げっ歯類CDRすなわちヒト抗体の対応配列に対するCDR配列を置換することにより、Winterおよびその協力者らの方法[Jonesら、Nature、321:522−525(1986);Riechmannら、Nature、332:323−327(1988);Verhoeyenら、Science、239:1534−1536(1998)]に従って実行され得る。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、ここで、実質的に、インタクトなヒト可変ドメインが、決して非ヒト種に由来する対応配列によって置換されているわけではない。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかの超可変領域残基およびおそらくいくつかのFR残基が、げっ歯類抗体内の類似部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体である。

0083

ヒト化抗体を作製する際に使用されるべきヒト可変ドメイン(軽鎖および重鎖の両方)の選択は、抗原性を減少するために非常に重要である。いわゆる「最良適合(best−fit)」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、そのげっ歯類の配列と最も近親であるヒト配列は、ヒト化抗体に対するヒトFRとして受容される[Simsら、J.Immunol.、151:2296(1993)]。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定FRを使用する。同じFRは、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用され得る[Carterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:4285(1992);Prestaら、J.Immnol.、151:2623(1993)]。

0084

抗原に対する高度な親和性および他の有利な生物学的特性を保持するようにヒト化される抗体が、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、親配列およびヒト化配列の3次元モデルを使用して、親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析の過程により、ヒト化抗体が調製される。3次元免グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、かつ当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な3次元コンホメーション構造を例示し、そして表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示の視察は、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の有望な役割の分析を可能にする(すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析)。このように、FR残基は選択され得、レシピエントから結合され得、そして配列を移入し得、その結果、所望される抗体の特徴(例えば、標的抗原に対する増加した親和性)が達成される。一般的に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼす際に直接かつ最も実質的に関与する。

0085

((v)ヒト抗体)
ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体が産生され得る。例えば、現在、免疫化に際して、内在性の免疫グロブリン産生の非存在下におけるヒト抗体の十分なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することが可能である。例えば、キメラ変異マウスおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失は、内在性抗体産生の完全阻害を生じることが、記載されている。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる。例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:2551(1993);Jakobovitsら、Nature、362:255−258(1993);Bruggermannら、Year in Immuno.、7:33(1993);および米国特許第5,591,669号、同第5,589,369号および同第5,545,807号を参照のこと。ヒト抗体はまた、ファージデスプレイライブラリーから誘導され得る[Hoogenboomら、J.Mol.Biol.、227:381(1991);Marksら、J.Mol.Biol.、222:581−597(1991);および米国特許第5,565,332号および同第5,573,905号]。ヒト抗体はまた、活性化B細胞によってインビトロで産生され得る(例えば、米国特許第5,567,610号および同第5,229,275号を参照のこと)。

0086

((iv)抗体フラグメント)
種々の技術が、抗体フラグメントの産生のために発展してきた。従来は、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって得られた[例えば、Morimotoら、Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107−117(1992)およびBrennanら、Science 229:81(1985)を参照のこと]。しかし、現在、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって、直接産生され得る。例えば、Fab’−SHフラグメントは、直接E.coliから回収され得、そして化学的に結合されてF(ab’)2フラグメントを形成し得る[Carterら、Bio/Technology 10:163−167(1992)]。別の実施形態において、このF(ab’)2は、ロイシンジッパーGCN4を使用して形成され、F(ab’)2分子のアセンブリを促進する。別のアプローチに従って、Fvフラグメント、Fabフラグメント、またはF(ab’)2フラグメントが、組換え宿主細胞培養から直接単離され得る。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に対して明らかである。

0087

((vii)多重特異的(multispecific)抗体)
いくつかの実施形態において、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する多重特異的(例えば、二重特異的(bispecific))抗体を産生することが所望され得る。例示的な二重特異的抗体は、標的抗原上の2つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗−Ephリガンドまたは抗−Ephレセプターアームは、EphレセプターまたはEphリガンド発現細胞に対する細胞防御機構に集中するために、白血球上のトリガー分子(例えば、T細胞レセプター分子(例えば、CD2またはCD3)、またはIgGに対するFcレセプター(FcγR)(例えば、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)))に結合するアームと結合され得る。二重特異的抗体はまた、EphレセプターまたはEphリガンドを発現する細胞に対して細胞傷害剤を局在化するために使用され得る。これらの抗体は、EphレセプターまたはEphリガンド結合アームおよび細胞傷害剤(例えば、サポリン(saporin)、ビンカアルカロイドリシンA鎖、メトトレキセートまたは放射性同位元素ハプテン)を結合するアームを所有する。

0088

別の実施形態において、二重特異的抗体は、Ephリガンドと結合する一方のアームおよびEphレセプター(例えば、内在性リガンドが結合する同種レセプター)に結合する別のアームを有する。異なるEphリガンドまたは異なるEphレセプターと架橋し得る二重特異的抗体がまた、意図される。そのような二重特異的抗体は、それらの生物学的活性に依存してアゴニストまたはアンタゴニストととして使用され得る。

0089

二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2二重特異的抗体)として調製され得る。

0090

好ましい全長の二重特異的抗体を作製するための一つのアプローチに従って、一対の抗体分子間のインターフェースは、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大するように操作され得る。好ましいインターフェースは、少なくとも、抗体定常ドメインのCH3ドメインの一部を含む。この方法において、第1の抗体分子のインターフェースに由来する一つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖と置換される(例えば、チロシンまたはトリプトファン)。その大きな側鎖と同一か、または類似するサイズの代償的「空洞」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニンまたはスレオニン)で置換することにより第2抗体分子のインターフェース上に生成される。これは、他の不要な最終産物(例えば、ホモダイマー)を超えるヘテロダイマーの収率を増加するための機構を提供する。1998年3月24日に発行された米国特許第5,731,168号を参照のこと。

0091

二重特異的抗体は、架橋された抗体または「ヘテロ結合体(heteroconjugate)」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体における一方の抗体は、アビジンと結合され得、他方の抗体は、ビオチンと結合され得る。ヘテロ結合体抗体は、任意の都合の良い架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は、当該分野において周知であり、そして多くの架橋技術とともに、米国特許第4,676,980号において開示される。

0092

抗体フラグメントから二重特異的抗体を生成するための技術はまた、文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。例えば、Brennanら、Science 229:81(1985)およびShalabyら、J.Exp.Med.175:217−225(1992)を参照のこと。

0093

組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、かつ単離するための種々の技術もまた、記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生された。Kostelnyら、J.Immunol.148(5):1547−1553(1992)。FosおよびJunタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、2つの異なる抗体のFab’部分と結合された。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されて、モノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために利用され得る。Hollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448(1993)により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的機構を提供してきた。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成が不可能であるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン(VL)と結合された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。従って、一つのフラグメントのVHドメインおよびVLドメインは、強制的に、別のフラグメントの相補的なVLドメインおよびVHドメインと対形成し、それにより、2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv(sFv)ダイマーを使用することによる二重特異的抗体フラグメントを作製するため別のストラテジーもまた、報告されている。Gruberら、J.Immunol.152:5368(1994)を参照のこと。あるいは、この二重特異的抗体は、例えば、1997年6月24日に発行された米国特許第5,641,870号において記載されるように産生される「直線状抗体」であり得る。

0094

2価を超える抗体が意図される。例えば、三二重特異的抗体が、調製され得る。Tuttら、J.Immunol.147:60(1991)。

0095

((viii)他の改変)
抗体の他の改変が意図される。例えば、本発明の抗体を、エフェクター機能に関して改変することが所望され得る(例えば、癌を処置する際に、抗体の有効性を増強するように)。例えば、システイン残基が、Fc領域に導入され得、それにより、この領域における内部鎖ジスルフィド結合形成を可能にする。従って、生成されるホモダイマー抗体は、インターナリゼーション能力を改善し得、そして/または補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞傷害ADCC)を増加し得る。Caronら、J.Exp Med.176:1191−1195(1992)およびShopes,B.J.Immunol.148:2918−2922(1992)を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体もまた、Wolffら、Cancer Research 53:2560−2565(1993)において記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は、2重のFc領域を有するように操作され得、そしてそれによって補体溶解およびADCC能力を増強し得た。Stevensonら、Anti−Cancer Drug Design 3:219−230(1989)を参照のこと。

0096

本発明の特定の実施形態において、例えば、腫瘍侵入を増加するために、インタクトな抗体よりはむしろ抗体フラグメントを使用することが所望され得る。この場合、抗体フラグメントの血清半減期を増加するように、抗体フラグメントを改変することが所望され得る。これは、例えば、サルベージレセプター結合エピトープをその抗体フラグメントに組み込むことによって達成され得る(例えば、その抗体フラグメント内の適切な領域の変異によって、または、エピトープをペプチドタグに組み込み、次いでそれが末端または中間のいずれかの位置で抗体フラグメントに融合されることによって、例えば、DNAまたはペプチド合成によって)。米国特許第5,739,277号を参照のこと。

0097

(B.ポリペプチドの誘導体または改変体)
他の有用なアンタゴニストまたはアゴニストとして、天然のEphレセプターまたは天然のEphリガンドの、アミノ酸配列改変体および/または誘導体が挙げられる。これらは、内因性のレセプターまたはリガンドに結合し、そして天然のリガンドとレセプターとの間での相互作用を競合的に阻害する(アンタゴニスト)か、またはレセプターもしくはリガンドを活性化する(アゴニスト)。

0098

例えば、このようなアンタゴニストとして、フラグメントおよびアミノ酸配列の改変体が挙げられる。これらは、Ephリガンドのレセプター結合ドメインまたはEphレセプターのリガンド結合ドメインを含むが、生物学的活性を与えるドメインを欠いているか、またはそうでなければ、細胞性のEphレセプターまたはリガンドを活性化することができない。

0099

Ephリガンド中のレセプター結合ドメインおよびEphレセプター中のリガンド結合ドメインは、X線研究、変異分析、および抗体結合研究を含む、当該分野で公知の方法によって決定される。変異によるアプローチとして、回避変異の選択および挿入による変異誘発と組み合わせた、ランダム飽和変異誘発の技術が挙げられる。結合ドメインの同定に適切な別のストラテジーは、アラニン(Ala)−スキャン変異誘発として公知である。Cunninghamら、Science 244:1081−1985(1989)。この方法は、荷電したアミノ酸側鎖を含む領域の同定を包含する。同定されたそれぞれの領域内の荷電した残基(すなわち、Arg、Asp、His、Lys、およびGlu)は、Alaで置換され(1つの変異分子について1つの領域)、そして結合の特定の領域の重要性を評価するために、得られた改変体の結合が試験される。結合ドメインの位置決定のためのさらなる強力な方法は、中和抗体の使用による。通常は、これらのおよび類似の方法の組み合わせが、レセプターまたはリガンドの結合に関連するドメインを位置決定するために使用される。

0100

置換改変体は、天然の配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、そしてその同じ位置に異なるアミノ酸が挿入された改変体である。この置換は、分子内の1つのアミノ酸だけが置換されている場合には、単一であり得、または、同じ分子内で2つ以上のアミノ酸が置換されている場合には、複数であり得る。

0101

挿入改変体は、1つ以上のアミノ酸が、天然の配列中の特定の位置で1つのアミノ酸にすぐ隣接して導入されている改変体である。1つのアミノ酸にすぐに隣接するは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに対して連結されていることを意味する。

0102

欠失改変体は、天然の配列中の1つ以上のアミノ酸残基が除去されている改変体である。通常は、欠失改変体は、分子内の特定の領域において1つまたは2つのアミノ酸残基が欠失している。好ましい欠失改変体は、必要に応じてイムノグロブリン領域のような異種分子または他の分子(例えば、ポリエチレングリコール)に対して融合させられた、可溶性のEphレセプターまたはEphリガンドである。

0103

フラグメントおよびアミノ酸配列改変体は、天然の因子をコードするDNAの部位特異的変異誘発のような、当該分野で公知の方法によって容易に調製される。変異したDNAは、適切な発現ベクター中に挿入され、次いで、宿主細胞が、組換えベクターでトランスフェクトされる。組換え宿主細胞は適切な培養培地中で増殖させられ、次いで、宿主細胞中で発現された所望のフラグメントまたはアミノ酸配列改変体が、クロマトグラフィーまたは他の精製方法によって組換え細胞培養物から回収される。

0104

あるいは、フラグメントおよびアミノ酸改変体は、例えば、天然のEphレセプターもしくはEphリガンドのタンパク質溶解によって、またはMerrifield J.Am.Chem.Soc.85:2149(1963)によって記載されているような標準的な固相ペプチド合成手順を使用する合成によってインビトロで調製されるが、当該分野で公知の他の同等の化学合成が使用され得る。固相合成が、適切な樹脂に対して保護されたα−アミノ酸カップリングさせることによって、ペプチドのC−末端から開始される。アミノ酸は、ペプチド結合の形成のための当該分野で周知の技術を使用して、ペプチド鎖に対してカップリングさせられる。

0105

(C.免疫接着因子(immunoadhesin))
EphレセプターまたはEphリガンドの1つの好ましい誘導体は、免疫接着因子である。免疫接着因子は、Ephリガンドに結合するEphレセプター(またはその逆)の一部を含み得、従って、内因性のレセプターとリガンドとの間での相互作用を競合的に阻害するように作用する。オリゴマー化またはリン酸基移転反応がレセプターまたはリガンドの活性化に関与している場合は、例えば、適切な立体構造中に2つ以上のリガンドまたはレセプター結合ドメインを含む免疫接着因子が、レセプターまたはリガンドのアゴニストとして作用し得る。

0106

最も単純なおよび最も率直な免疫接着因子の設計は、ヒンジを有する接着因子(例えば、EphレセプターまたはEphリガンドの細胞外ドメイン(ECD))とイムノグロブリンの重鎖のFc領域とを組み合わせる。通常は、本発明の免疫接着因子を調製する場合には、接着因子の結合ドメインをコードする核酸はイムノグロブリンの定常ドメイン配列のN−末端をコードする核酸に対してC−末端で融合されるが、N−末端での融合もまた可能である。

0107

典型的には、このような融合体においては、コードされるキメラポリペプチドは、少なくとも、イムノグロブリンの重鎖の定常領域の、機能的に活性なヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを保持している。融合体はまた、定常ドメインのFc部分のC−末端に対して、または重鎖のCH1もしくは軽鎖の対応する領域に対してすぐN−末端で作成される。融合が行われる正確な部位は重要ではない;特定の部位は周知であり、そして免疫接着因子の生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択され得る。

0108

好ましい実施形態においては、接着因子配列は、イムノグロブリンG1(IgG1)のFcドメインのN−末端に対して融合される。接着因子配列に対して重鎖の定常領域全体を融合することが可能である。しかし、より好ましくは、IgG Fcを化学的に定義するパパイン切断部位(すなわち、残基216、114である重鎖の定常領域の最初の残基をとる)のすぐ上流のヒンジ領域で開始する配列、または他のイムノグロブリンの同様の部位が融合において使用される。特に好ましい実施形態においては、接着因子アミノ酸配列は、IgG重鎖の(a)ヒンジ領域、およびCH2、およびCH3、または(b)CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインに対して融合させられる。

0109

二重特異的免疫接着因子については、免疫接着因子は、多量体として、そして特に、ヘテロ二量体またはヘテロ四量体として組み立てられる。一般的には、これらの組み立てられたイムノグロブリンは、既知ユニット構造を有する。基本的な4つの鎖の構造のユニットは、IgG、IgD、およびIgEが存在する特定の形態である。4つの鎖のユニットは、より大きな分子量のイムノグロブリン中で反復される;IgMは、一般的には、ジスルフィド結合によって互いに結ばれた4つの基本的なユニットの五量体として存在する。IgAグロブリンおよび時折、IgGグロブリンもまた、血清中で多量体の形態で存在し得る。多量体の場合には、それぞれの4つのユニットは同じであるかまたは異なり得る。

0110

本明細書中の範囲内の種々の例示的な組み立てられた免疫接着因子を以下に模式的に示す:
(a)ACL−ACL;
(b)ACL−(ACH,ACL−ACH,ACL−VHCH,またはVL,CL−ACH)
(c)ACL−ACH−(ACL−ACH,ACL−VHCH,VLCL−ACH,またはVLCL−VHCH)
(d)ACL—VHCH(ACHまたはACL−VHCHまたはVLCL−ACH);
(e)VLCL−ACH−(ACL−VHCHまたはVLCL−ACH);および
(f)(A−Y)n−(VLCL−VHCH)2
ここで、それぞれのAは、同一であるかまたは異なる接着因子アミノ酸配列を示す。

0111

VLは、イムノグロブリンの軽鎖の可変ドメインである;
VHは、イムノグロブリンの重鎖の可変ドメインである;
CLは、イムノグロブリンの軽鎖の定常ドメインである;
CHは、イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインである;
nは、1を超える整数である;
Yは、共有結合架橋剤の残基を示す。

0112

簡潔さの目的において、上記の構造は鍵となる特徴のみを示す;これらは、連結(J)、またはイムノグロブリンの他のドメインを示さないだけれはなく、ジスルフィド結合をも示さない。しかし、このようなドメインが結合活性のために必要とされる場合には、これらは、これらがイムノグロブリン分子中で占有する通常の位置に存在するようき構築されるはずである。

0113

あるいは、接着因子配列は、イムノグロブリンの重鎖と軽鎖の配列の間に挿入され得る。その結果、キメラである重鎖を含有しているイムノグロブリンが得られる。この実施形態においては、接着配列は、ヒンジとCH2ドメインとの間、またはCH2とCH3ドメインとの間のいずれかで、イムノグロブリンのそれぞれのアーム中のイムノグロブリンの重鎖の3’末端に融合される。同様の構築物が、Hoogenboomら、Mol.Immunol.28:1027−1037(1991)によって報告されている。

0114

イムノグロブリンの軽鎖の存在は本発明の免疫接着因子においては必要ではないが、イムノグロブリンの軽鎖は、接着イムノグロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合されるか,または接着因子に直接融合されるかのいずれかで存在し得る。前者の場合には、イムノグロブリンの軽鎖をコードするDNAは、代表的には、接着因子イムノグロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時に発現される。分泌の際には、ハイブリッドの重鎖および軽鎖が、2つのジスルフィド結合されたイムノグロブリン重鎖−軽鎖の対を含有しているイムノグロブリン様構造を提供するように、共有的に会合させられる。このような構造の調製に適切な方法は、例えば、1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。

0115

免疫接着因子は、イムノグログリンのcDNA配列に対してインフレームで接着因子部分をコードするcDNA配列を融合することによって最も簡単に構築される。しかし、ゲノムのイムノグロブリンへの融合もまた、使用され得る(例えば、Aruffoら、Cell 61:1303−1313(1990);およびStamenkovicら、Cell 66:1133−1144(1991)を参照のこと)。後者の型の融合体は、発現のためにIg調節配列の存在を必要とする。TgG重鎖の定常領域をコードするcDNAは、脾臓、または末梢血リンパ球に由来するcDNAライブラリーに由来する公の配列に基づいて、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応PCR)技術によって単離され得る。「接着因子」および免疫接着因子のイムノグロブリン部分をコードするcDNAは、選択された縮細胞中での効率的な発現を指向するプラスミドベクター中ににタンデムに挿入される。

0116

(D.他のアゴニストまたはアンタゴニスト分子)
本発明はさらなるアンタゴニストまたはアゴニストに関する。

0117

例えば、アンタゴニストまたはアゴニストは、合成の低分子であり得る。例えば、低分子は、EphレセプターまたはEphリガンドの結合部位模倣し得、それによってアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。あるいは、低分子は、レセプターまたはリガンドのチロシンキナーゼドメイント相互作用し得、それによってチロシンキナーゼドメインを活性化するか、またはその活性化を妨げる。例えば、米国特許第5,795,910号を参照のこと。

0118

アンタゴニストまたはアゴニストはまた、例えば、合理的な設計によって、またはファージディスプレイによって生成されたペプチドであり得る(1998年8月13日に公開された、WO98/35036号)。従って、選択された分子は、例えば、「CDR模倣物」または抗体のCDRに基づいて設計された抗体アナログであり得る。

0119

あるいは、アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、1995年10月26日に公開されたWO95/28485のアプローチに本質的には従って、Eph遺伝子のプロモーターまたは他の調節領域と相互作用し得る。

0120

目的の別のアゴニストは、EphレセプターまたはEphリガンドの2つ以上の結合部位を含む二量体のような分子である。このような分子は、このような分子は、結合ドメインを、二量体中のドメインの安定な相互作用を促進するために、二量体化領域に融合することによって形成され得る。このような分子は、EphレセプターまたはEphリガンドの「レセプター相干渉」またはリン酸基移転反応を容易にするために有用なアゴニストであり得る。

0121

別の型のアンタゴニストは、アンチセンス核酸である。遺伝子発現のアンチセンス阻害は、複数のレベルで生じ得る。しかし、好ましいアプローチは、mRNAのタンパク質への翻訳を妨害することを含むアプローチである。このことを達成するために、当業者は、EphレセプターまたはEphリガンドのmRNAに相補的なオリゴデオキシヌクレオチドオリゴ)を使用し得る。このアンチセンスオリゴは、天然のセンスmRNAに対してワトソンクリック塩基対を形成することによって相補的に結合する。しかし、プラスミドに由来するアンチセンスRNA(すなわち、アンチセンスDNAは、プラスミド中で提供される)もまた、意図される。MercolaおよびCohen、Cancer Gene Therapy 2(1):47−59(1995)。別の実施形態である、いわゆる「アンチ遺伝子アプローチ」に従うと、アンチセンス分子は、すでに形成された対との、アンチセンス分子中の第3の塩基のHoogsteen(またはアンチ−Hoogsteen)水素結合を介して、EphレセプターまたはEphリガンドDNAと三重リックスまたは三本鎖を形成するように結合する分子である。MercolaおよびCohen、前出。アンチセンスオリゴは、どこでもmRNA転写物に対して指向され得るが、好ましい標的配列は、その開始コドンにまたがる5’末端である。目的のオリゴは少なくとも、通常は、15個から17個の塩基を含む。最も活性なアンチセンス配列を同定するためには、欠失分析が行われ得る。

0122

アンチセンスオリゴは、自動化された方法によって容易に合成され得る。1996年2月6日に発行された米国特許第5,489,677号を参照のこと。通常は、インビボでの使用のために意図されるアンチセンスオリゴは、それをヌクレアーゼでの分解に対してあまり敏感ではないようにするように、および/または細胞によってそれが取りこまれる効率を改善するように、改変される。1つの例示的な改変は、「メチルホスホネート」(MO)オリゴを生じる。このアプローチに従うと、ヌクレオチド間結合中の架橋していない酸素原子の1つが、メチル基で置換される。このことは、オリゴの負の電荷を排除する正味の効果を有する。Tonkinsonら、Cancer Investigation 14(1):54−65(1996)。ヌクレアーゼでの分解を減少させるためのTonkinsonらに記載されている別の改変は、イオウで、リンでの架橋していない酸素の1つを置換することを含む、ホスホロチオエート(PS)改変である。塩基性のオリゴを改変する1つの方法は、Cohen,J.Adv.Pharmacol.25:319−339(1993)に概説されている。例えば、新規アナログが報告されている。ここでは、デオキシリボース−ホスフェート骨格全体が、ペプチド様の骨格で置換された、新規のアナログが報告されている。MercolaおよびCohen、前出を参照のこと。細胞性の取りこみを改善するために、アンチセンスオリゴが、リポソーム中カプセル化され得、カチオン性脂質(例えば、DOTMA)と複合体化され、ポリリジンまたはリポフェクチンにカップリングさせられ、そして/またはコレステリル部分に共有結合させられる。Tonkinsonら、前出を参照のこと。

0123

上記のようなアンチセンス核酸以外に、本発明はまた、本明細書中に記載されているような任意のアゴニストまたはアンタゴニストをコードする核酸の投与を意図する。例えば、本発明は、遺伝子治療によって細胞中に導入された「内細胞性の抗体」を意図する。

0124

これらは、インビボおよびエキソビボで患者の細胞内に核酸(必要に応じて、ベクター中に含まれる)を入れるための2つの主要なアプローチである。インビボでの送達については、核酸は、通常は、アゴニストまたはアンタゴニストが必要とされる部位に、患者に直接注射される。エキソビボでの処置については、患者の細胞が採取され、核酸がこれらの単離された細胞中に導入され、そして改変された細胞が患者に直接、または例えば、患者に移植される有孔性膜内にカプセル化されてのいずれかで、投与される(例えば、米国特許第4,892,538号、および同第5,283,187号を参照のこと)。生存可能な細胞中に核酸を導入するために利用可能な種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸がインビトロで培養された細胞中に導入されるか、または意図される宿主の細胞中にインビボで導入されるかどうかに依存して変化する。インビトロで哺乳動物細胞中に核酸を導入するために適切な技術として、リポソーム、エレクトロポレーションマイクロインジェクション細胞融合DEAEデキストランリン酸カルシウム沈降法などの使用が挙げられる。一般的に使用される遺伝子のエキソビボでの送達のためのベクターは、レトロウイルスである。

0125

現在好ましいインビボでの核酸の導入技術として、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルスI型単純ヘルペスウイルス、またはアデノ随伴ウイルス)を用いるトランスフェクション、および脂質に基づく系(例えば、遺伝子の脂質によって媒介される導入に有用な脂質は、DOTMA、DOPE、およびDC−Cholである)が挙げられる。いくつかの状況においては、標的細胞を標的化する試薬(例えば、表面の膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなど)とともに核酸の供給源を提供することが所望される。リポソームが使用される場合は、エンドサイトーシスに関連する細胞の表面の膜タンパク質に結合するタンパク質が、例えば、キャプシドタンパク質または特定の細胞型について向性であるそのフラグメント、循環においてインターナライズされたタンパク質についての抗体、および細胞内での位置を標的化しそして細胞内での寿命を増大させるタンパク質を、標的化し、そして/またはその取りこみを促進するために使用され得る。レセプターによって媒介されるエンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら、J.Biol.Chem.262:4429−4432(1987);およびWagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3410−3414(1990)によって記載されている。現在公知の遺伝子マーカーおよび遺伝子治療プロトコール概要については、Andersonら、Science 256:808−813(1992)を参照のこと。WO93/25673号およびその中で引用されている参考文献をもまた参照のこと。

0126

(E.結合体化した分子)
上記のアンタゴニストまたはアゴニストの「結合体」、および異種の分子を利用する方法もまた、意図される。アンタゴニストまたはアゴニスト、および異種分子(単数または複数)は、化学的な架橋、融合タンパク質の産生などを含む種々の異なる様式で連結される。

0127

本明細書中の好ましい結合体は、その血清半減期を増大させる分子に結合されたアゴニストまたはアンタゴニストを含む。例えば、当業者は、米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192号;または同第4,179,337号に示されている様式で、種々の非タンパク質性のポリマー(例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン)の任意の1つに対してアゴニストまたはアンタゴニストを連結し得る。

0128

別の好ましい結合体は、細胞毒性または細胞増殖抑制性の試薬に結合されたアンタゴニストを含む。このような構築物を生成するために有用な例示的な細胞毒性または細胞増殖抑制性の試薬として、限定的ではないが、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射活性同意元素(すなわち、放射結合体)が挙げられる。

0129

このような結合体の生成に有用な化学療法剤は、上記に記載されている。使用され得る酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとして、以下が挙げられる:ジフテリアのA鎖、ジフテリア毒素の非毒性の活性なフラグメント、外毒素A鎖(Pseudomonas aeruginosaに由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、Phytolaca
americanaタンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP−S)、momordica charantiaインヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、sapaonaria officinalisインヒビター、ゲロニンミトゲリン、レストクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびtricothecenes。種々の放射性核種が、放射を結合させられたアンタゴニストの産生のために利用可能である。例として、212Bi、131I、131In、90Y、および186Reが挙げられる。

0130

アンタゴニストと、細胞毒性または細胞増殖抑制性の試薬との結合体は、以下のような種々の二官能性のタンパク質カップリング試薬を使用して作製される:N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオールプロピオネート(SPDP)、イミノチオレート(IT)、イミドエステルの二官能性の誘導体(例えば、ジメチルアジピミデートHCL)、活性なエステル(例えば、ジスクシンイミジルスベレート)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン(tolyene)2,6−ジイソシアネート)、およびビス−活性フロリン化合物(例えば、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)。例えば、リシンの免疫毒素は、Vitettaら、Science 238:1098(1987)に記載されているように調製され得る。炭素−14−で標識された1−イソチオシアネートベンジル−3−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸(MX−DTPA)が、抗体への放射性核種の結合のための例示的なキレート化剤である。WO94/11026を参照のこと。あるいは、ポリペプチドアンタゴニスト、および細胞毒性または細胞増殖抑制性のポリペプチドを含有している融合タンパク質が、調製され得る。このような分子はまた、例えば、ペプチド合成によって生成され得る。

0131

別の実施形態においては、アンタゴニストは、腫瘍の予備標的化における利用のために、「レセプター」(例えば、ストレプトアビジン)に結合させられ得る。ここでは、アンタゴニスト−レセプター結合体が患者に投与され、その後、キレート化剤を使用して循環から結合した結合体が除去され、次いで細胞毒性または細胞増殖抑制性の試薬に結語させられた「リガンド」(例えば、アビジン)が投与される。

0132

本発明のアンタゴニストはまた、プロドラッグ(例えば、ペプチジル化学療法剤、WO81/01145を参照のこと)を活性な抗ガン剤転換するプロドラッグ活性化酵素にアンタゴニストを結合させることによって、ADEPTにおいて使用され得る。例えば、WO88/07378号および米国特許第4,975,278号を参照のこと。

0133

ADEPTに有用なアンタゴニスト結合体の酵素成分として、それをより活性な、細胞毒性の形態に転換するような様式で、プロドラッグに対して作用し得る任意の酵素が挙げられる。

0134

本発明の方法において有用な酵素として、限定的ではないが、以下のものが挙げられる:リン酸塩を含有しているプロドラッグを遊離の薬物に転換するために有用なアルカリホスファターゼ;硫酸塩を含有しているプロドラッグを遊離の薬物に転換するために有用なアリールスルフェート;非毒性の5−フルオロシトシンを抗ガン剤である5−フルオロウラシルに転換するために有用なシトシンデアミナーゼセラチアプロテアーゼサーモリシンサブチリシンカルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン(例えば、カテプシンBおよびL)のような、ペプチドを含有しているプロドラッグを遊離の薬物に転換するために有用なプロテアーゼ;D−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを転換するために有用なD−アラニルカルボキシペプチダーゼ;グリコシル化されているプロドラッグを遊離の薬物に転換するために有用なβ−ガラクトシダーゼ、およびノイラミニダーゼのような、炭水化物を切断する酵素;β−ラクタムを用いて誘導された薬物を遊離の薬物に転換するために有用なβ−ラクタマーゼ;ならびにそれらのアミン窒素フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基をそれぞれ用いて誘導体化された薬物を遊離の薬物に転換するために有用な、ペニシリンVアミダーゼまたはペニシリンGアミダーゼのような、ペニシリン。あるいは、「アブザイム(abzyme)」としてもまた当業者に公知である、酵素活性を有する抗体が、本発明のプロドラッグを遊離の薬物に転換するために使用され得る(Massey、Nature 328:457−458(1987)を参照のこと)。抗体−アブザイム結合体は、腫瘍細胞の集団へのアブザイムの送達のために、本明細書中で記載されているように調製され得る。

0135

本発明の酵素は、上記で議論されているの異種二官能性架橋剤の使用のような、当該分野で周知の技術によってアンタゴニストに共有結合させられ得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に対して連結された、本発明のアンタゴニストの少なくともEphレセプター結合ドメインまたはEphリガンド結合ドメインを含有している融合タンパク質は、当該分野で周知の組換えDNA技術を使用して構築され得る(例えば、Neubergerら、Nature 312:604−608(1984)を参照のこと)。

0136

(F.薬学的組成物
アゴニストまたはアンタゴニストの治療用処方物は、最適な生理学的に受容可能なキャリア賦形剤、または安定剤とともに、所望の程度の純度を有するアゴニストまたはアンタゴニストを混合することによって、凍結乾燥させられた処方物または水性の溶液の形態で、貯蔵のために調製される。(Remington’s Pharmaceutical Science 第16版、Osol,A.編(1980))。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、そして以下が挙げられる:リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤保存料(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドヘキサメトニウムクロライドベンズアルコニウムクロライド;ベンズエトニウムクライドフェノールブチル、またはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベンカテコールレゾルシノールシクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(およそ10残基未満)のポリペプチド;タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン);親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えば、グリシングルタミンアスパラギンヒスチジンアルギニン、またはリジン);モノサッカライドジサッカライド、および他の炭水化物(グルコースマンノース、またはデキストリンを含む);キレート化剤(例えば、EDTA);糖(例えば、スクロールマンニトールトレハロース、またはソルビトール);塩を形成するカウンターイオン(例えば、ナトリウム);金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);および/あるいは非イオン性の界面活性剤(例えば、TWEEN(登録商標)、PLURONICS(TM)、またはポリエチレングリコール(PEG))。

0137

アゴニストまたはアンタゴニストはまた、リポソーム中に処方され得る。目的の分子を含有しているリポソームは、例えば、Epsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985);Hwangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);および米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号に記載されているような、当該分野で公知の方法によって調製される。延長された循環時間を有するリポソームが、米国特許第5,013,556号に開示されている。

0138

特に有用な免疫リポソームは、ホスファチジルコリンコレステロール、およびPEGによって誘導されるホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含有している脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、規定された孔の大きさのフィルターを通じて押し出されて、所望の直径のリポソームを生じる。本発明の抗体のFab’フラグメントは、Martinら、J.Biol.Chem.257:286−288(1982)に記載されているようなリポソームに対して、ジスルフィド相互交換反応を介して結合させられ得る。化学療法剤(ドキソルビシン(Doxorubicin)のような)は、必要に応じて、リポソーム中に含まれる。Gabizonら、J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)を参照のこと。

0139

本明細書中の処方物はまた、1を超える活性な化合物を、処置される特定の適用に必要とされている場合に、含み得る。好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含み得る。このような分子は、適切には、意図される目的のために有効な量での組合せで、存在する。例えば、Ephレセプターアンタゴニストは、化学療法剤またはエストロゲンと組み合わせられ得る。

0140

有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面の重合(例えば、それぞれ、コロイド状の薬物の送達系(例えば,リポソーム、アルブミンミクロスフェアマイクロエマルジョンナノ粒子、およびナノカプセル)またはマイクロエマルジョンにおいて、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)によって、調製されたマイクロカプセル中に捕捉され得る。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol,A.編(1980)に開示されている。

0141

インビボでの投与のために使用される処方物は、滅菌されなければならない。これは、滅菌の濾過膜を通過させる濾過によって容易に達成される。

0142

徐放調製物が調製され得る。徐放調製物の適切な例として、アンタゴニストを含有している固体疎水性ポリマー半透過性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは、成形されたものの形態(例えば、フィルムまたはマイクロカプセル)である。徐放マトリックスの例として、以下が挙げられる:ポリエステルヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸エチル−L−グルタミン酸とのコポリマー非分解性エチレンビニルアセテート分解性乳酸グリコール酸のコポリマー(例えば、Lupron Depot(登録商標)(乳酸−グリコール酸のコポリマーおよびロイプロリドアセテートから構成される注射可能なミクロスフェア)、およびポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、100日間以上にわたって分子を放出することが可能であるが、特定のヒドロゲル放出タンパク質はより短い時間の期間である。カプセル化された抗体が長時間体内に留まる場合には、これらは、37℃の水分への暴露の結果として、変成するかまたは凝集し得る。その結果、生物学的活性の欠失および免疫原性における可能な変化を生じる。合理的なストラテジーが、関連する機構に依存して安定化のために案出され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド相互交換を介する分子間S−S結合であることが発見されると、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性の溶液から凍結乾燥させること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。

0143

(G.EPHレセプターアンタゴニストを用いる治療)
治療的な適用のためには、本発明のアンタゴニストは、哺乳動物(好ましくは、ヒト)に対して、上記に議論されているような薬学的に受容可能な投与量形態で投与される。これには、追加投与としてヒトの静脈内に投与され得るか、または一定の期間にわたる持続的な注入によって、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、こう内、経口、局所、または吸入による経路によって投与され得るものが含まれる。アンタゴニストはまた、局所的および全身的な治療効果を発揮するように、腫瘍内、腫瘍の周囲、病変内、病変の周囲の経路によって適切に投与される。腹膜内経路は、例えば、卵巣の腫瘍の処置において特に有用であると予想される。

0144

疾患の予防または処置のためには、アンタゴニストの適切な投与量は、上記に定義されているような処置される疾患の型、疾患の重篤度および経過、アンタゴニストが予防目的または治療目的のために投与されるかどうか、過去の治療、患者の臨床的病歴およびアンタゴニストに対する応答、ならびに手当てする医師の裁量に依存する。アンタゴニストは、一度に、または一連の処置にわたって患者に対して適切に投与される。

0145

アンタゴニストは、種々の新生物性および新生物性ではない疾患および障害の処置において有用である。処置に敏感に反応するガンおよび関連する状態として、以下が挙げられる:乳ガン腫、肺ガン腫、胃ガン腫、食道ガン腫、結腸直腸ガン腫、肝臓ガン腫、卵巣ガン腫、卵胞膜細胞腫男性胚細胞腫ガン腫、子宮内膜のガン腫、子宮内膜の過形成内分裂繊維肉腫絨毛膜癌、頭部および頚部のガン、鼻咽頭のガン腫、咽頭部のガン腫、肝芽腫カポジ肉腫黒色腫、皮膚のガン腫、血管腫、海綿状血管腫血管芽細胞腫すい臓ガン腫、網膜芽細胞腫神経膠星状細胞腫神経グリア芽細胞腫神経鞘腫乏突起神経膠腫髄芽細胞腫神経芽細胞腫横紋筋肉腫骨形成性肉腫平滑筋肉腫尿管のガン腫、甲状腺ガン腫、ウィルムス腫瘍腎細胞のガン腫、前立腺ガン腫、母斑症に関連する異常な血管の増殖、浮腫(例えば、脳の腫瘍に関連するもの)、およびメーグス症候群。

0146

処置に敏感に反応する新生物性ではない状態として、以下が挙げられる:慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病、および他の増殖性の網膜症(早熟の網膜症を含む)、水晶体後方線維増殖症、血管新生緑内障、年齢に関連する黄斑変性、甲状腺の過形成(グレーヴス病を含む)、角膜および他の組織の移植、慢性の炎症、肺の炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症腹水症心外膜滲出液(例えば、心外膜に関連するもの)、および胸膜滲出液。

0147

疾患の型および重篤度に依存して、約1μg/kgから約50mg/kg(例えば、0.1〜20mg/kg)のアンタゴニストが、例えば、1回以上の別々の投与によるか、または連続的な注入によるかにはかかわらず、患者への投与のための最初の候補の投与量である。典型的な毎日のまたは毎週の投与量は、上記の要素に依存して、約1μg/kgから約20mg/kgまでまたはそれを超える範囲であり得る。状態に依存して数日またはより長い期間にわたって繰り返される投与については、処置は、所望される疾患の症状の抑制が生じるまで繰り返される。しかし、他の投与量レジメが有用であり得る。この治療の進行は、例えば、放射線撮影法による腫瘍の画像化を含む、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。

0148

本発明の別の実施形態に従うと、疾患を予防するかまたは処置することにおけるアンタゴニストの有効性は、アンタゴニストを連続的に投与することによるか、または別の因子と組合せて投与することによって改善され得る。以下のような別の因子が、これらの目的のために有効である:腫瘍壊死因子(TNF)、酸性または塩基性の繊維芽細胞増殖因子(FGF)または肝細胞増殖因子(HGF)の脈管形成性の活性を阻害し得るかまたは中和し得るアンタゴニスト、組織因子プロテインC、またはプロテインSの凝固活性を阻害し得るかまたは中和し得るアンタゴニスト(1991年2月21日に公開された、EsmonらのPCT特許公開番号第91/01753号を参照のこと)、HER2レセプターに結合し得る抗体のようなアンタゴニスト(米国特許第5,772,997号を参照のこと)、または以下のような1つ以上の従来の治療薬(例えば、アルカリ化剤葉酸アンタゴニスト、抗−核酸の代謝の代謝物抗生物質ピリミジンアナログ、5−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、チアゾールヌクレオシド、またはコルチコステロイド)。このような他の因子は、投与される組成物中に存在し得るか、または別々に投与され得る。また、アンタゴニストは、放射活性物質の照射または投与を含むかどうかにはかかわらず、放射線医学的な処置と連続して、またはそれと組み合わせて適切に投与される。

0149

1つの実施形態においては、腫瘍の脈管形成は、組み合わせ治療において攻撃される。アンタゴニストおよび1つ以上の他のアンタゴニストが、例えば、必要である場合には、腫瘍またはその代謝性の主患部壊死を観察することによって決定されるような、治療的に有効な用量で腫瘍を保有している患者に投与される。この治療は、それ以上の有用な効果を有さないようなこのような時間が観察されるまで、または臨床試験が腫瘍もしくは任意の代謝性の主患部の痕跡を示さなくなるまで継続される。次いで、TNFが、単独で、または以下のような補助剤ものと組み合わせて投与される:例えば、α−、β−、もしくはγ−インターフェロン、抗−HER2抗体、ヘレグリン、抗−ヘレグリン抗体、D−因子、インターロイキン−1(I−1)、インターロイキン−2(IL−2)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF)、または抗−プロテインC抗体もしくは抗−プロテインS抗体、またはC4b結合タンパク質(1991年2月21日に公開された、Esmonら、PCT特許公開番号第WO91/01753号を参照のこと)のような、腫瘍中の微小血管の凝固を促進する試薬、または加熱もしくは照射。

0150

補助剤はそれらの有効性において変化するので、従来の様式でのマトリックスのスクリーニングによる、腫瘍に対するそれらの影響を比較することが所望される。アンタゴニストおよびTNFの投与は、所望の臨床的な効果が達成されるまで繰り返される。あるいは、アンタゴニストは、TNF、および必要に応じて補助剤(単数または複数)とともに投与される。固形の腫瘍が四肢または他の一般的な循環からの単離に敏感な位置に見出される場合には、本明細書中に記載されている治療薬は、単離された腫瘍または器官に投与される。他の実施形態においては、FGFまたは血小板由来増殖因子(PDGF)アンタゴニスト(例えば、抗−FGFまたは抗−PDGF中和抗体)が、アンタゴニストと組み合わせて患者に投与される。アンタゴニストでの処置は、必要に応じて、創傷の治癒または所望される血管新生の期間の間は中断され得る。

0151

1つの実施形態においては、Ephレセプターアンタゴニストは、エストロゲン治療によって生じる脈管の奇形(例えば、小さい血管の奇形)を処置するために使用される。Ephレセプターアンタゴニストの投与は、患者へのエストロゲンの投与の前または後であり得る。例えば、Ephレセプターアンタゴニストおよびエストロゲンが同じ組成物中で提供される場合には、付随する治療もまた、意図される。エストロゲンの投与量は、以前から既知の量に対応する。

0152

(H.EPHレセプターアゴニストでの治療)
本発明は、哺乳動物にEphレセプターアゴニストを投与することを含む、脈管形成を刺激する方法を提供する。例えば、アゴニストは、脈管のネットワークに対する外傷の処置のような、血管内皮に関連する状態を処置するために使用され得る。このように処置され得るこのような外傷の例として、限定的ではないが、以下が挙げられる;外科的な切開(特に、心臓に関するもの)、創傷(血管の裂傷、切開、および穿通を含む)、ならびに表面の潰瘍(糖尿病、血友病、および静脈瘤の潰瘍のような血管内皮を含む)。

0153

上記に言及されている外傷の適用については、Ephレセプターアゴニストが処方され、そして処置される特異的な障害、個々の患者の状態、Ephレセプターアゴニストの送達部位投与方法、および医師に公知の他の因子を考慮して、良好な医学的な慣例と一致する様式で投与される。

0154

Ephレセプターアゴニストのさらなる適用は、表皮の潰瘍のような厚み全体の創傷(床ずれ静脈性の潰瘍、および糖尿病の潰瘍のカテゴリーを含む)、ならびに厚み全体の火傷および傷害(脈管形成が皮膚移植片または皮膚弁について火傷または損傷した部位を調製するために必要とされる場合)の処置である。この症例においては、Ephレセプターアゴニストは、その部位に直接適用されるか、または移植の前に移植される皮膚または皮膚弁を浸すために使用される。同様の様式において、Ephレセプターアゴニストが、火傷または他の外傷後再構成が必要とされる形成外科手術において、または美容目的に使用され得る。

0155

脈管形成はまた、創傷を清潔に、そして感染していない状態を維持することにおいて重要である。従って、Ephレセプターアゴニストは、一般的な外科手術と組み合わせて、そして切開および裂傷の修復後に使用され得る。これは、高い感染の危険性を有する異常な創傷の処置において特に有用である。血管新生は、骨折修復の鍵となる。なぜなら、血管は、骨の損傷部位で発達するからである。Ephレセプターアゴニストの骨折部位への投与が、従って別の有用性である。

0156

Ephレセプターアゴニストが局所的な創傷の治癒のために使用される場合には、上記のように、これは、血管組織の再内皮細胞化の前に、任意の記載されている経路によって、またはより好ましくは、局所的な手段によって投与され得る。これらの場合においては、これは、溶液、スプレーゲルクリーム軟膏、または乾燥粉末のいずれかとして、傷害の部位に直接投与される。傷害部位に対してEphレセプターアゴニストを指向させてゆっくりと放出するデバイスもまた、使用される。局所的な適用においては、Ephレセプターアゴニストは、約50から1,000μg/mLまでの範囲の濃度で、1回の適用で、または1週間から数週間の期間についての毎日もしくは数日おきの投与レジメのいずれかで適用される。一般的には、投与される局所的な処方物の量は、創傷の表面積に基づいて、約0.1から100μg/cm2までのEphレセプターアゴニストが適用されるに十分な量である。

0157

Ephレセプターアゴニストは、バルーン血管形成術血管内皮細胞が、アテローム性動脈硬化症プラーク圧縮とともに除去されているかまたは損傷している場合の手順)において外科手術後に創傷を治癒させる試薬として使用され得る。Ephレセプターアゴニストは、静脈内の追加の注射または注入としてのいずれかとして、全身的または局所的な適用によって、内部の血管の尿面に適用され得る。所望される場合には、Ephレセプターアゴニストは、マイクロメーターポンプ(micrometering pump)を使用して経時的に投与され得る。静脈内投与に適切な組成物は、内皮細胞の増殖を促進するために十分な量のEphレセプターアゴニストおよび非経口的なキャリア物質を含む。Ephレセプターアゴニストは、例えば、約50μg/mLから約1,000μg/mLまでの広範な濃度の範囲にわたる組成物中に存在し得る。これは、患者あたり3から10mL注射を使用して、1回で投与されるか、または複数回の適用が可能である投与レジメにおいて投与される。任意の公知の非経口のキャリアビヒクル(例えば、通常の生理食塩水または5〜10%のデキストロース)が、使用され得る。

0158

Ephレセプターアゴニストはまた、血管の移植の外科手術において内皮細胞の形成を促進するために使用され得る。移植された血管または全身的な材料のいずれかを使用する血管の移植の場合においては、例えば、Ephレセプターアゴニストは、血管内皮細胞の増殖を促進するために、移植片の表面に適用され得、そして/または移植片と既存の血管構造との接合部に適用される。このような適用については、Ephレセプターアゴニストは、バルーン血管形成術について上記のように、静脈内に適用され得るか、またはこれは、外科手術の前または後のいずれかで、移植変の表面および/または既存の血管構造に対して直接適用され得る。このような場合においては、厚くなったキャリア材料中のEphレセプターアゴニストを適用することが所望され得る。その結果、これは、罹患した表面に接着する。適切なキャリア材料として、例えば、1〜5%のカルボポールが挙げられる。Ephレセプターアゴニストは、例えば、約50μg/mgから約1,000μg/mg間での広範なの濃度の範囲にわたってキャリア中に存在し得る。あるいは、Ephレセプターアゴニストは、非経口の溶液として、マイクロメーターポンプによってその部位に送達され得る。

0159

Ephレセプターアゴニストはまた、心筋梗塞後の血管の損傷を修復するために、および側副の循環の増殖を刺激することによって、冠状動脈バイパス手術の必要性を回避するために、使用され得る。Ephレセプターアゴニストは、個々の注射において、または上記のような一定の期間にわたってマイクロメーターポンプによって、または損傷した心筋の部位への直接的な注入もしくは注射によってのいずれかで、この目的のために静脈内投与される。

0160

Ephレセプターアゴニストの投与経路は、例えば、特異的な適用については上記のような投与経路、ならびに静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼球内、動脈内、または病変内の手段による注射または注入の一般的な経路、あるいは以下に示されているような徐放系のような、既知の方法に従う。Ephレセプターアゴニストは、注入によって持続的に、または追加の注射によって投与される。一般的には、傷害が許容する場合には、部位特異的送達のためのEphレセプターアゴニストを処方および投与すべきである。このことは、創傷および潰瘍の場合に便利である。

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