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この項目の情報は公開日時点(2006年1月5日)のものです。
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図面 (7)

課題

魚類類結節症ワクチンを提供する。

解決手段

フォトバクテリウムダムセラサブスピースシシーダの対数増殖期不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチン。

概要

背景

類結節症は、ブリカンパチ、マダイヒラメ等にの比較的高水温期に発病する病気である。以前は、ブリ類にのみ発生が見られた疾病であったが、近年、養殖魚種拡大に伴い、感染魚種は広がりつつある。死亡率はほぼ100%である。

類結節症の治療手段としては、アミノベンジルペニシリンオキソリン酸ホスホマイシン、ビコザマイシンフロルフェニコール等の経口投与が行われているが、長期間の治療を必要とする為、経済的負担も大きく、一方で耐性菌出現も懸念される。

類結節症の原因菌フォトバクテリウムダムセラサブスピースシシ−ダ(Photobacterium damselae subsp.piscicida)であることが判明している。しかし日本では現在までこれに対するワクチン販売されていない。なお、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダはパスツレラピシシーダと呼ばれることもある。

概要

魚類類結節症ワクチンを提供する。フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシーダの対数増殖期不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチン。 なし

目的

本発明の目的は魚類類結節症ワクチンを提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

請求項2

フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を含有する魚類類結節症ワクチン組成物

請求項3

フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分の有効量を投与することを特徴とする魚類類結節症の予防法

技術分野

0001

本発明は魚類類結節症ワクチン及びこれを用いた魚類類結節症の予防法に関する。

背景技術

0002

類結節症は、ブリカンパチ、マダイヒラメ等にの比較的高水温期に発病する病気である。以前は、ブリ類にのみ発生が見られた疾病であったが、近年、養殖魚種拡大に伴い、感染魚種は広がりつつある。死亡率はほぼ100%である。

0003

類結節症の治療手段としては、アミノベンジルペニシリンオキソリン酸ホスホマイシン、ビコザマイシンフロルフェニコール等の経口投与が行われているが、長期間の治療を必要とする為、経済的負担も大きく、一方で耐性菌出現も懸念される。

0004

類結節症の原因菌フォトバクテリウムダムセラサブスピースシシ−ダ(Photobacterium damselae subsp.piscicida)であることが判明している。しかし日本では現在までこれに対するワクチンは販売されていない。なお、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダはパスツレラピシシーダと呼ばれることもある。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明の目的は魚類類結節症ワクチンを提供することにある。

課題を解決するための手段

0006

そこで発明者は類結節症の原因菌であるフォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシ−ダの各種培養条件による病原性及びワクチン活性について検討してきたところ、全く意外にも定常期菌体よりも対数増殖期の菌体を用いた場合に特にワクチン活性が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。

0007

すなわち本発明は、フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチンを提供するものである。

0008

また本発明は、フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を含有する魚類類結節症ワクチン組成物を提供するものである。

0009

さらに本発明は、フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分の有効量を投与することを特徴とする魚類類結節症の予防法を提供するものである。

発明の効果

0010

本発明のワクチンを用いれば、ブリ、カンパチ等のブリ属魚類、マダイ、ヒラメ等の類結節症が効率的に予防できる。

発明を実施するための最良の形態

0011

本発明のワクチンは、フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシ−ダ(以下本菌ということがある)の対数増殖期の不活化菌体又はその成分を用いる。通常、細菌を培養した場合、誘導期、対数増殖期、定常期、死滅期及び生残期に分けられる。

0012

本発明のワクチンに用いる菌体は、本菌を常法により培養し、対数増殖期に採取することにより得られる。本菌の培養は、本菌を適当な培地接種し常法に従って培養すればよい。培養中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有させておくのが好ましい。

0013

この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としてトリプトン、各種動物血清コーングルテンミール大豆粉コーンスチープリカーカザミノ酸酵母エキスファーマメディア、イワシミール肉エキスペプトンハイプロ、アジパワーコーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕綿実油粕、カルチベータアミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックスなどが挙げられる。また、炭素源としては資化し得る炭素源、例えば、アラビノースキシロースグルコースマンノース蔗糖麦芽糖可溶性デンプン乳糖廃糖蜜や資化し得る有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Na+、K+等の無機塩や、必要であれば、無機有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。
またNaCl濃度を2.0%に調製したBHI培地を用いることもできる。

0014

培養条件は、NaCl濃度2.0%、pH7.2〜7.6、25℃とするのが好ましい。

0015

本菌が対数増殖期にあるか否かの確認は、595nmでの光学密度を測定することにより行われる。すなわち595nmでの光学密度が急激に上昇する時期が対数増殖期である。例えばpH7.2、25℃で培養した場合、培養12〜24時間が対数増殖期である。

0016

対数増殖期にある本菌を遠心分離濾過等により分離するか、培養物をそのまま不活化する。不活化処理としては加熱処理ホルマリン処理等が挙げられる。

0017

本菌の成分には、菌体の膜成分及び分泌物が含まれる。これらの成分を採取するには、不活化菌体の超音波破砕等により行うのが好ましい。

0018

得られた不活化菌体又はその成分は、濾過、エバポレーション濃縮凍結乾燥等により濃縮して用いるのが好ましい。

0019

本菌の不活化菌体又はその成分は、そのままワクチンとして使用してもよいが、薬学的に許容される液状又は固体状担体とともにワクチン組成物として使用してもよい。当該ワクチン組成物の形態としては注射用組成物経口投与組成物、魚類浸漬用組成物飼料組成物等が挙げられる。液状の担体としては、リン酸緩衝液が挙げられる。固体状の担体としては、タルクシュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。また、これらのワクチン組成物にはアジュバントを添加して抗原性を高めてもよい。

0020

本発明のワクチン又はワクチン組成物の投与は、成魚でもよいが類結節症に罹患する前、例えば稚魚の段階が好ましい。その投与量は、1尾あたり不活化菌又はその成分として約108〜1010CFUが好ましい。投与回数は1回でもよいが、2回が好ましく、また、2回目の投与までの間隔は3週間以上あけてから接種したほうが良い。

0021

本発明のワクチン又はワクチン組成物の対象魚種としては、本菌による類結節症になる魚類であれば制限されず、例えばブリ、カンパチ等のブリ属魚類の他、マダイ、ヒラメ等が挙げられる。

0022

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

0023

実施例1
(1)フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシ−ダP3529(以下でもこの株を使用した。)の凍結保存した菌0.2mLを200mLの2%NaCl加BHI液体培地に接種し25℃で静置培養した。培養時間と菌体数及び595nmにおける光学密度(OD)との関係を図1に示す。図1から明らかなように、本菌は0〜12時間までが誘導期であり、12〜20時間までが対数増殖期であり、20時間以降が定常期であることがわかる。

0024

(2) 本菌の各種培養条件によるブリに対する病原性の差異について検討した。すなわち、対数増殖中期、対数増殖後期、定常期及び死滅期の本菌をブリ1尾あたり103〜105CFUとなるように腹腔内注射し、病原性を検討した。なお、対照としたブリは20〜24gであり、水槽の温度は25℃とした。その結果、図2、3、4及び5に示すように、生残率が、対数増殖中期の本菌感染群では25.0〜6.6%、対数増殖後期では13.3〜1.6%、定常期では53.3〜26.7%、死滅期では80.0〜43.3%であり、対数増殖後期の菌の病原性が高いことが判明した。

0025

実施例2
フォトバクテリウムダムセラサブスピースピシシ−ダP3529の0.2mLを三角フラスコ中で200mLの2%NaCl加BHI培地に接種し、25℃で培養した。OD595nmが0.85から0.95のものを対数増殖菌体として用いた。すなわち、培養19〜21時間の間の培養物を0.3%ホルマリン中で25℃、1日間インキュベーションして不活化菌体とし、次いで4℃で8,000〜10,000×gで遠心分離して菌体を採取した。得られた菌体をさらに0.3%ホルマリン生理食塩水再懸濁し、本菌の不活化菌体を含むワクチン組成物を得た。また、対照として培養32時間後(OD595nm=0.95)の培養物を同様に不活化して定常期不活化菌体を含むワクチン組成物を得た。

0026

平均体重23.6gのブリに、上記で得たワクチン組成物を用いてワクチン効果を検討した。すなわち、ワクチンを1尾あたり0.1mL腹腔内注射し、2週間免疫活性を上昇させる為に飼育した。
2週間後、これらの免疫したブリに対して腹腔内注射攻撃試験を行った。対照として等量のPBSを腹腔内注射したブリを同様に試験に供試した。なお、攻撃菌には、対数増殖期及び定常期の菌体を用いた。その結果を表1、図6及び7に示す。

0027

0028

その結果、対数増殖期群が定常期群及び対照群に対して生存率有意差があり、ワクチンとして有用であることが判明した。

0029

本試験期間中に死亡について、2%NaCl加BHI平板培地を用いて腎臓および脾臓より菌分離を行った。本菌による死亡か否かを分離菌抗血清による凝集にて確認した結果、全ての死亡魚からの分離菌が抗血清と凝集した。このことから、本試験期間中に死亡した試験魚は、本菌感染を原因とするものであることが明らかになった。

図面の簡単な説明

0030

菌培養時間と595nmにおける光学密度(OD)及び菌数(CFU/mL)との関係を示す図である。
本菌の対数増殖中期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
本菌の対数増殖後期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
本菌の定常期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
本菌の死滅期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
攻撃1(攻撃量2.0×104CFU/mL)における生残率を示す図である。
攻撃2(攻撃量4.0×104CFU/mL)における生残率を示す図である。

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