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課題・解決手段

PrP遺伝子ターゲティングによる変化により、ウシ海綿状脳症耐性のウシを生成する方法を開示する。培養細胞のPrP遺伝子を、その翻訳を妨げ又は優性病気耐性型のタンパク質をコードするように変化させて、その変化させた細胞の核を用いて、創出動物クローン化する。一具体例において、変化を含む一本鎖DNA断片を、一本鎖の短い断片の相同性置換において利用してPrP遺伝子を変化させる。

概要

背景

発明の背景
細胞ゲノム改変は、原理的に、完全な遺伝子をそのゲノムに、ランダムな位置に導入するか又は既存の天然の遺伝子に特定の変化を起こすことにより達成することができる。哺乳動物細胞においては、10年より長期にわたって、相同組換えを達成する内因性酵素を利用して、特定の遺伝子に破壊が導入されてきた。この技術は、相同組換え依存性遺伝子破壊(hrdGT)と呼ばれる。Doetschman, T.等、1987, Nature 330, 576-78;Thomas K.R.及びCapecchi, M.R., 1987, Cell 51, 503-12。これらの努力は、二本鎖DNAの大きい切片(数キロ塩基(kb))を、相同組換えとランダムな挿入とを識別する遺伝的選択システムの存在下で細胞に導入することを含む。

別法の利用が、哺乳動物細胞において記載されている。この技術は、一本鎖の短い断片の相同組換え(ssSFHR)と呼ばれる。中位のサイズの(典型的には、400〜800bp)DNA断片を、プラスミドベクターからの切り出しにより生成し、或は、PCRによってテンプレートから合成する。この短い断片を、熱により変性させて、それら相補鎖を、適宜、互いから精製することができる。この技術は、D.C.Gruenertの米国特許第6,010,908号、及び科学文献に記載されている。Kapsa, R. 等、2001, Human Gene Therapy 12, 629-42 (repair of murine dystrophin, unseparated strands);Colosima, A.等、2001, Mol.Therapy Vol.3,No.3(episomal DNA in mammalian cells, unseparated strands);Goncz, K.K.等、1998, Hum.Mol.Genetics 7, 1913-19(human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), unseparated strands);Kunzelman, K.等、1996, Gene Therapy 3, 859-867 (murine CFTR, unseparated strands)。

このssSFHR技術は、hrdGTとは、幾つかの点で異なっている。この核酸は、hrdGTの数kbと比較して一層短く(400〜800nt);ssSFHRにおいては、外因性ポリヌクレオチドを変性させ、即ち、一本鎖化するが、少数突然変異誘発遺伝子ヌクレオチドを除いて標的遺伝子相同であり;hrdGTにおいては、外来遺伝子外因性核酸中に埋め;そしてhrdGTにおいては、相同組換えと変則的組換えを区別する選択システムを利用し、ssSFHRでは、変則的組換えが相同組換えに匹敵する割合では起きないのでかかる選択は必要とされない。

本発明は、ウシがウシ海綿状脳症(BSE)に耐性になるようにウシのゲノムを改変するための、ssSFHRの利用に関係する。BSEは、一種のいわゆる伝染性海綿状脳症(TSE)であり、ヒツジスクラピー及びヒトクロイツフェルト−ヤーコプ病(CJD)並びに他の疾患が含まれる。英国で発生した170,000症例にわたるBSEの最近の流行は、少なくとも130症例のヒトへの伝染を生じた。この流行は、ウシ用の加工動物食餌の製造にスクラピーに感染したヒツジを使用したことにより引き起こされたと考えられている(1988年に中止された結果、症例数の減少を生じた加工)。Pattison, J., 1998, Emerg Infect.Dis.4,390-4;Nathanson, N.等、Am.J Epidemiol.45,959-69。

TSEは、ユニークな感染症であり、核酸ベース病気有機体によっては伝染しない。むしろ、TSEは、異常なコンホメーションの脳タンパク質であるプリオンタンパク質(PrP)から生じる。Prusiner, S.B.,1991,Science 252,1515-22。病原性のコンホメーションは、主としてβプリーツシートコンホメーションを採用しているPrPの142アミノ酸断片よりなり、この形態は、病原性コンホメーションを採用するように他のPrPの変換を触媒する。Peretz, D.,2001, Protein Science 10,854-63;Wadsworth, J.D.等、1999, Curr Opin Genet Dev 9, 338-45。TSEがPrPの感染性コンホメーション変化から生じるという仮説は、英語以外では一般に受け入れられていない(例えば、Lasmezas, C.I.等、1997,Science 275,402-5参照)にもかかわらず、それは、酵母の遺伝するタンパク質コンホメーションの例により広く受け入れられ且つ確認されている。Lindquist,S.,1996,Mol.Psychiatry 1,376-9;Lindquist,S.,1997,Cell 89,495-8。

不明確なものが何かしら、TSEの病因論について残りうるが、宿主PrP遺伝子切除は、この病気に耐性の動物を生成する。Prusiner, S.B.等、1993,PNAS 90,10608-12;Weissmann, C.,及びAguzzi, A., 1999, Science 286,914-15。加えて、アミノ酸置換を有するPrPの優性の病気耐性のアレルは、ヘテロ接合体として、この病気に対する耐性を与えることができる。Perrier,V.等、2002,PNAS 99,13079-84。ある種の生化学的及び形態学的異常は、PrP除去された状態と関係しているが、これらの動物は、正常に発生して、健康に見える。Miele,G.等、2002,BBRC 291,372-77;White,A.R.等、1999,Am J.Path.155,1723-30。

発明の概要
この発明は、ウシのPrP遺伝子の除去により、ウシをBSE耐性にする方法を提供する。ウシのPrP遺伝子の断片を、細菌中にクローン化して、位置指定突然変異導入法の公知技術によって変異させる。この変異させたクローン化遺伝子をテンプレートとして利用して、200〜1000bpの、好ましくは400〜800bpの短い断片(以後「SF」と称す)を、慣用オリゴヌクレオチドプライムするポリメラーゼ連鎖反応による増幅を利用して生成させる。SF中には、コードされる1つより多くの遺伝的変化があってよいが、これらの変化は、大きさと程度が、SFの4つ以下の連続するヌクレオチドが標的遺伝子と相同にならないように制限されるべきである。生理的効果を伴わない第二の変化を導入して、その後のSFを相同組換えした変異体細胞の分離を容易にすることができる。このSFの配列と標的遺伝子の配列との間の差異(「ヘテロロジー」)は、ミスマッチ、挿入又は欠失であってよい。除去は、フレームシフト変異又は多数の停止コドンの挿入によって引き起こされる。

このSFは、一本鎖SF(「ssSF」)に変換されてから、鎖分離形態(「s4SF」)に変換される。このSFの配列を試験して、好ましくは、大規模自己相補的二次構造を生じる自己相補的配列を決定する。

一度形成されれば、このs4SFを、PrP遺伝子の除去を誘導するように、体細胞典型的には繊維芽細胞に導入することができる。変異したクローンの選択は、クローニング及びPCRスクリーニングによって行なわれる。PCRスクリーニングを促進するために、除去変異が、容易に認めうる制限部位造り、それで変異体クローンがスクリーニングなしで同定されうることは、好ましいことである。この変異したPrP遺伝子を組み込んだウシは、卵母細胞への核トランスファーによって、公知技術を利用して回収することができる。

発明の詳細な説明
s4SFの調製及び変異型PrP遺伝子の生成。一具体例において、この発明は、ウシPrP遺伝子の断片と相同な(同一の)200〜1000ntの一層好ましくは400〜800ntの一本鎖DNAの短い断片(SF)の利用よりなるが、但し、除去変異をPrP遺伝子に導入するためにデザインされた位置は、数が限られており、典型的には10未満であって、適宜、改変PrP遺伝子座のアレル特異的PCRと二次的検出の結合による同定を容易にするように更なる変化を生じる。このウシPrP遺伝子の配列は、GENBANK受入れ番号AJ298878で見出され、PrPcDNAの配列は、受入れ番号AB001468として見出されうる(これらを参考として本明細書中に援用する)。

所望の変異した配列の構築は、インビトロ位置指定突然変異導入法によって最も容易に達成することができる。これらの含まれる技術は、当分野で公知である。Perrin, S.及びGilliland, G.,1990, Nucleic AcidsResearch 18,7433;Landt,O.,1990, Gene 96,125-8;Nassal M.及びRieger,A, 1989, Nucleic Acids Research 18,3077-8;Hemsley,A.等、1989, Nucleic Acids Research 17,6545-51。これらの技術の実施は、標的遺伝子又は遺伝子の断片(改変されるべき配列を包含する)が組換え体クローンにおいて利用可能であることを必要とする。適当な所望の配列を構築したならば、SF自体を日常的なポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)によって合成することができる。s4SFを利用すべきである場合には、この合成には、1つの5’−ビオチン化プライマーと1つの非誘導体化プライマーを利用する。これらの鎖を、下記のように分離する。5’−ビチオン化プライマーの合成は、周知である。CooK,A.F.,等、1988,Nucleic Acids Research 16,4077-95;Connolly,B.A.,1988,Nucleic Acids Research 15,3131-9。

SFが二本鎖形態即ちこの断片がその相補鎖にワトソンクリック結合された形態で合成された後に、一本鎖SFを製造することができる。この製法は、熱変性(95℃まで加熱)後4℃まで急冷することによって最も簡単に達成することができる。この方法は、分子間ワトソン−クリック塩基対合を有しないか又は本質的に有しない両極性の鎖の混合物を生じる。しかしながら、この混合物の高温での連続的インキュベーションは、分子内のワトソン−クリック対合の形成を生じうる。

相補的鎖の分離は、SFのPCR合成で利用する2つのプライマーの一方をビオチン化した場合に、容易に達成されうる。この生成物の分離は、下記のように、ビオチン化した鎖を固定化したアビジンに結合させることにより達成することができる:
--二本鎖SF(ds−SF)産物を、2つのプライマーを利用するPCRにより生成することができ、その一方は、ビオチンを5’末端に含んだ。
--一本鎖を、ビオチン化したPCR生成物をアビジン−磁気ビーズ(Dyonex)に結合させることにより生成した。
--流浪(displaced)鎖(ビオチンを含まないD−ssSF)を、結合したdsPCR断片を高pH(0.5M NaOH)で、1〜2分間変性させることにより分離した。
--この「流浪鎖」(上清)を、磁気又は遠心分離を利用して、ビーズから除去し、酸(500:10.5M NaOH当たり27μl cHCL)で中和して、透析した(1000倍容0.1Mトリス pH7.0、その後、1000倍容の水で2回)。この流浪鎖を、次いで、エタノール沈殿又はスピンコンセントレーターにより濃縮した。
--このビーズに結合された固定化鎖(B−SF)を、2回のトリス 0.1M pH7.0での洗浄とその後の2回の水洗浄により中和した。この固定化された鎖を水中で磁気ビーズから除去してから、熱処理(95℃)した。
流浪及び固定化された両鎖は、個々に、活性を有する。
典型的には、流浪鎖は、一層活性であった。このコード鎖又は非コード鎖を利用して、修飾を標的遺伝子に導入することができる。

このs4SFを、ウシの細胞例えば繊維芽細胞に、二本鎖DNAを細胞に導入するために利用することのできる任意の方法によって導入することができる。好適方法は、マイクロインジェクションによるものであり、これは、予め選択した接着細胞への制御された様式での個別の接種を可能にする。

改変された標的遺伝子を含む細胞を、クローニング及びクローン化した細胞を、全動物の再生の前にPCR試験することによって分離することができる。幾つかの方法を採用して、SFがPrP遺伝子座を変化させた細胞のクローンを同定することができる。

変化した細胞の頻度が低い場合に適した特定の方法は、「結合した検出」(CD)と呼ばれ、出願人共通の、R.Metzの米国特許出願第10/298,859号(2002年11月18日出願)(参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する)に記載された。CDにおいては、2つの変化(典型的には、50〜100ヌクレオチド離れている)が、単一SFを利用して導入される。推定上改変された細胞を含む集団が得られた後に;その集団を複製サブグループに分割する。PCR反応を、標的配列を増幅させるがSFを増幅させないPCRプライマーを利用して、各サブグループの複製物由来するゲノムDNAについて行なう。この反応の生成物を希釈して、第2のPCR反応のためのテンプレートとして利用する。この第2のPCR反応を、野生型配列よりも変化物の一つの配列に優先的にアニールするPCRプライマー及び非選択的第2プライマーを利用して行なう。このPCR反応は、生成物が第2の変化の部位を含むようにデザインされる。適当なアニーリング温度の選択は、変化した断片の野生型と比較して優先的な増幅を生じる。この優先的な増幅は、PCR生成物中の第2の変化の検出による、数千のサブグループ中の変化した遺伝子型単一コピーの容易な検出を可能にする。制限酵素認識を造り又は削除し、それで変異型遺伝子座の存在が制限酵素消化によって検出できる第2の変化は、検出の容易さの故に、特に好ましい。

CDを利用すると、大きい細胞集団を容易にスクリーニングして、希少な細胞を検出することができる。このスクリーニングは、これらの集団をサブグループ又は約5,000に細分することにより行なう。希少な改変細胞の単一コピーを含むサブグループに由来するこれらの複製物を更に細分して培養する。細分、複製生成及び検出の連続サイクルを利用して、希少な改変細胞を集団から分離することができる。

一層少なく好適な方法においては、野生型と比較して変異型配列に優先的にアニールするPCRプライマーを利用して、細胞集団に由来するゲノム断片を、変異型配列(存在するならば)だけが生成物を生じるような温度条件下でPCR増幅する。

別の具体例においては、ウシのPrP遺伝子における変化を生じさせて、可溶性形態のPrPタンパク質の相対的安定性を増大させることができる。この安定性を増大させる変異は、ヒツジの種々の系統のスクラピーに対する罹病率をヒツジのPrP遺伝子の多型と比較することによって同定された。136、154及び171位の変異は、保護的であることが見出された。Drogenmuller, C.等、2001, Vet.Res.149,349-52。同じ変異をウシのPrP遺伝子に、この発明の別の具体例において導入することができる。

更に別の具体例において、ウシのPrP遺伝子の、優性の病気耐性の表現型を与える突然変異による変化を、ウシのPrP遺伝子に導入して、動物が、この病気に耐性であるために変化したPrp遺伝子についてホモ接合である必要がないようにすることができる。

BSE耐性ウシの生成。位置特異的変異を含む家畜の生成は、最近の体細胞からコンピテント生殖系列細胞即ち卵母細胞又は胚盤胞(卵割球)への核移植の進歩により可能となった。これらの技術は、実務家が遺伝的に同じ個体を移植された体細胞から作ることを可能にするので、一般に、「クローニング」又は「動物クローニング」と呼ばれる。これらの技術は、米国特許第6,147,276号及び6,252,133号に詳細に記載されている。

この技術を記載している科学刊行物は、幾つかの種特異的適応によって、これらの技術が、ヒツジ、ウシ及びブタにおいて成功したことを教示している。Schnieke,A.E.等、1997,Science 278,2130-33;Wilmut,I.等、1997,Nature 385,810-3;Polejaeva,I.A.等、2000,Nature 407,29-30。この分野の現在の総説は、Kuhholtzer,B.及びPrather,R.S.,2000,Proc.Soc.Exp.Med.224,240-45に見出すことができる。

元々変異していた体細胞の核は、PrP変異についてヘテロ接合であろうということが予想される。従って、BSE耐性系統の生成は、PrP遺伝子の変化をデザインしてその翻訳を防止する場合に、ホモ接合形態の変異を分離するために、創出系統の交配を必要とするであろう。PrP病耐性アレルを有する両親子孫における改変されたPrPの存在を、当分野で一般に公知の技術例えばRFLマッピング、SNP検出、サザーンブロット、PCR増幅及び直接配列決定が含まれうるDNAベースアッセイによって測定することができる。PrP遺伝子の変化についてホモ接合の動物を生成する別法として、核トランスファークローニングの第1ラウンドにおいて誘導されたから調製された細胞株をSFHRにより再ターゲティングして第2のPrPアレルを変えることができる。この第2のアレルの変化は、第1のアレルの変化と同じであってよいし或は、改変された両PrPアレルを有する細胞の同定において助成するように異なってもよい。ヘテロ接合の変化したPrPアレルについてホモ接合であるこれらの変異型細胞株は、所望のPrP遺伝子変異についてホモ接合の動物を再クローン化するのに利用することができる。

SFHRのためのDNA断片を、2段階の過程において、ウシPrPのエキソン3が挿入された市販のベクターを利用するPCRによって合成する。2種類のプライマーを利用する。変異用プライマーを利用して、ベクター中のPrP配列を変化させる。

この変異を導入した後に、生成用プライマーを利用して、SFHR二本鎖DNAを、変異したベクターをテンプレートとして利用するPCRにより作成する。

生成用フォワード及びリバースプライマー(FP及びRP)並びにアミノ酸配列中の突然変異の位置によって標識された変異用プライマーを、以下に列記する。

概要

PrP遺伝子のターゲティングによる変化により、ウシ海綿状脳症に耐性のウシを生成する方法を開示する。培養細胞のPrP遺伝子を、その翻訳を妨げ又は優性の病気耐性型のタンパク質をコードするように変化させて、その変化させた細胞の核を用いて、創出動物をクローン化する。一具体例において、変化を含む一本鎖DNA断片を、一本鎖の短い断片の相同性置換において利用してPrP遺伝子を変化させる。

目的

この発明は、ウシのPrP遺伝子の除去により、ウシをBSE耐性にする方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

ウシをウシ海綿状脳症耐性にする方法であって、下記を含む当該方法:a)100〜1000bpの長さを有し且つ本質的にPrPタンパク質翻訳を妨げるように改変されたウシPrP遺伝子の配列を有するDNA断片を含む改変用組成物を用意し;b)この改変用組成物を、雌ウシ又は雄ウシ由来する体細胞に導入し、その細胞を培養して、改変PrP遺伝子を有する細胞を生成し;c)該改変された細胞を未改変PrP遺伝子を有する細胞から分離し;そしてd)該分離した細胞からコンピテントなウシの生殖系列細胞に核をトランスファーしてこの生殖系列細胞に由来する創出雌ウシ又は雄ウシを生成する。

請求項2

DNA断片が、一本鎖であって且つ改変用組成物が、実質的に、その断片に相補的なDNAを含まない、請求項1に記載の方法。

請求項3

一本鎖断片の長さが、200〜800ntである、請求項2に記載の方法。

請求項4

請求項2に記載の方法を含み、更に、創出雌ウシと創出雄ウシとを交雑させるステップを含む、ウシをウシ海綿状脳症に耐性にする方法。

請求項5

一本鎖断片の長さが、200〜800ntである、請求項4に記載の方法。

請求項6

改変細胞を、結合した検出を利用して分離する、請求項2に記載の方法。

請求項7

100〜1000ntの長さを有し且つ本質的にPrPタンパク質の翻訳を妨げるように改変されたウシPrP遺伝子の配列を有する一本鎖DNA断片を含む組成物であって、実質的に、その断片に相補的なDNAを含まない当該組成物。

請求項8

一本鎖断片の長さが、400〜800ntである、請求項7に記載の方法。

請求項9

ウシをウシ海綿状脳症に耐性にする方法であって、下記を含む当該方法:a)100〜1000bpの長さを有し且つ本質的に優性病気耐性のPrPタンパク質をコードするように改変されたウシPrP遺伝子の配列を有するDNA断片を含む改変用組成物を用意し;b)この改変用組成物を、雌ウシ又は雄ウシに由来する体細胞に導入し、その細胞を培養して、改変PrP遺伝子を有する細胞を生成し;c)該改変された細胞を未改変PrP遺伝子を有する細胞から分離し;そしてd)該分離した細胞からコンピテントなウシの生殖系列細胞に核をトランスファーしてこの生殖系列細胞に由来する創出雌ウシ又は雄ウシを生成する。

請求項10

優性の病気耐性のPrPタンパク質が、アミノ酸178において、グルタミンからアルギニンへの置換を含む、請求項9に記載の方法。

請求項11

DNA断片が一本鎖であって且つ改変用組成物が実質的に、この断片に相補的なDNAを含まない、請求項9に記載の方法。

請求項12

一本鎖断片の長さが、200〜800ntである、請求項11に記載の方法。

請求項13

請求項11に記載の方法を含み、更に、創出雌ウシと創出雄ウシとを交雑させるステップを含む、ウシをウシ海綿状脳症に耐性にする方法。

請求項14

一本鎖断片の長さが、200〜800ntである、請求項13に記載の方法。

請求項15

改変細胞を、結合した検出を利用して分離する、請求項11に記載の方法。

請求項16

100〜1000ntの長さを有し且つ本質的に優性の病気耐性のPrPタンパク質をコードするように改変されたウシPrP遺伝子の配列を有する一本鎖DNA断片を含む組成物であって、実質的に、その断片に相補的なDNAを含まない当該組成物。

請求項17

一本鎖断片の長さが、400〜800ntである、請求項16に記載の組成物。

請求項18

雌ウシ及び雄ウシの子孫のウシ海綿状脳症耐性について試験する方法であって、下記を含む当該方法:a)雌ウシ及び雄ウシの子孫から核酸試料を得(少なくとも一親が、ウシ海綿状脳症に対する耐性を与える改変PrP遺伝子を運ぶ);そしてb)改変PrP遺伝子が試料中に存在するかどうかを測定する。

請求項19

野生型PrP遺伝子が、試料中に存在するかどうかを測定することを更に含む、請求項18に記載の方法。

背景技術

0001

発明の背景
細胞ゲノム改変は、原理的に、完全な遺伝子をそのゲノムに、ランダムな位置に導入するか又は既存の天然の遺伝子に特定の変化を起こすことにより達成することができる。哺乳動物細胞においては、10年より長期にわたって、相同組換えを達成する内因性酵素を利用して、特定の遺伝子に破壊が導入されてきた。この技術は、相同組換え依存性遺伝子破壊(hrdGT)と呼ばれる。Doetschman, T.等、1987, Nature 330, 576-78;Thomas K.R.及びCapecchi, M.R., 1987, Cell 51, 503-12。これらの努力は、二本鎖DNAの大きい切片(数キロ塩基(kb))を、相同組換えとランダムな挿入とを識別する遺伝的選択システムの存在下で細胞に導入することを含む。

0002

別法の利用が、哺乳動物細胞において記載されている。この技術は、一本鎖の短い断片の相同組換え(ssSFHR)と呼ばれる。中位のサイズの(典型的には、400〜800bp)DNA断片を、プラスミドベクターからの切り出しにより生成し、或は、PCRによってテンプレートから合成する。この短い断片を、熱により変性させて、それら相補鎖を、適宜、互いから精製することができる。この技術は、D.C.Gruenertの米国特許第6,010,908号、及び科学文献に記載されている。Kapsa, R. 等、2001, Human Gene Therapy 12, 629-42 (repair of murine dystrophin, unseparated strands);Colosima, A.等、2001, Mol.Therapy Vol.3,No.3(episomal DNA in mammalian cells, unseparated strands);Goncz, K.K.等、1998, Hum.Mol.Genetics 7, 1913-19(human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), unseparated strands);Kunzelman, K.等、1996, Gene Therapy 3, 859-867 (murine CFTR, unseparated strands)。

0003

このssSFHR技術は、hrdGTとは、幾つかの点で異なっている。この核酸は、hrdGTの数kbと比較して一層短く(400〜800nt);ssSFHRにおいては、外因性ポリヌクレオチドを変性させ、即ち、一本鎖化するが、少数突然変異誘発遺伝子ヌクレオチドを除いて標的遺伝子相同であり;hrdGTにおいては、外来遺伝子外因性核酸中に埋め;そしてhrdGTにおいては、相同組換えと変則的組換えを区別する選択システムを利用し、ssSFHRでは、変則的組換えが相同組換えに匹敵する割合では起きないのでかかる選択は必要とされない。

0004

本発明は、ウシがウシ海綿状脳症(BSE)に耐性になるようにウシのゲノムを改変するための、ssSFHRの利用に関係する。BSEは、一種のいわゆる伝染性海綿状脳症(TSE)であり、ヒツジスクラピー及びヒトクロイツフェルト−ヤーコプ病(CJD)並びに他の疾患が含まれる。英国で発生した170,000症例にわたるBSEの最近の流行は、少なくとも130症例のヒトへの伝染を生じた。この流行は、ウシ用の加工動物食餌の製造にスクラピーに感染したヒツジを使用したことにより引き起こされたと考えられている(1988年に中止された結果、症例数の減少を生じた加工)。Pattison, J., 1998, Emerg Infect.Dis.4,390-4;Nathanson, N.等、Am.J Epidemiol.45,959-69。

0005

TSEは、ユニークな感染症であり、核酸ベース病気有機体によっては伝染しない。むしろ、TSEは、異常なコンホメーションの脳タンパク質であるプリオンタンパク質(PrP)から生じる。Prusiner, S.B.,1991,Science 252,1515-22。病原性のコンホメーションは、主としてβプリーツシートコンホメーションを採用しているPrPの142アミノ酸断片よりなり、この形態は、病原性コンホメーションを採用するように他のPrPの変換を触媒する。Peretz, D.,2001, Protein Science 10,854-63;Wadsworth, J.D.等、1999, Curr Opin Genet Dev 9, 338-45。TSEがPrPの感染性コンホメーション変化から生じるという仮説は、英語以外では一般に受け入れられていない(例えば、Lasmezas, C.I.等、1997,Science 275,402-5参照)にもかかわらず、それは、酵母の遺伝するタンパク質コンホメーションの例により広く受け入れられ且つ確認されている。Lindquist,S.,1996,Mol.Psychiatry 1,376-9;Lindquist,S.,1997,Cell 89,495-8。

0006

不明確なものが何かしら、TSEの病因論について残りうるが、宿主PrP遺伝子切除は、この病気に耐性の動物を生成する。Prusiner, S.B.等、1993,PNAS 90,10608-12;Weissmann, C.,及びAguzzi, A., 1999, Science 286,914-15。加えて、アミノ酸置換を有するPrPの優性の病気耐性のアレルは、ヘテロ接合体として、この病気に対する耐性を与えることができる。Perrier,V.等、2002,PNAS 99,13079-84。ある種の生化学的及び形態学的異常は、PrP除去された状態と関係しているが、これらの動物は、正常に発生して、健康に見える。Miele,G.等、2002,BBRC 291,372-77;White,A.R.等、1999,Am J.Path.155,1723-30。

0007

発明の概要
この発明は、ウシのPrP遺伝子の除去により、ウシをBSE耐性にする方法を提供する。ウシのPrP遺伝子の断片を、細菌中にクローン化して、位置指定突然変異導入法の公知技術によって変異させる。この変異させたクローン化遺伝子をテンプレートとして利用して、200〜1000bpの、好ましくは400〜800bpの短い断片(以後「SF」と称す)を、慣用オリゴヌクレオチドプライムするポリメラーゼ連鎖反応による増幅を利用して生成させる。SF中には、コードされる1つより多くの遺伝的変化があってよいが、これらの変化は、大きさと程度が、SFの4つ以下の連続するヌクレオチドが標的遺伝子と相同にならないように制限されるべきである。生理的効果を伴わない第二の変化を導入して、その後のSFを相同組換えした変異体細胞の分離を容易にすることができる。このSFの配列と標的遺伝子の配列との間の差異(「ヘテロロジー」)は、ミスマッチ、挿入又は欠失であってよい。除去は、フレームシフト変異又は多数の停止コドンの挿入によって引き起こされる。

0008

このSFは、一本鎖SF(「ssSF」)に変換されてから、鎖分離形態(「s4SF」)に変換される。このSFの配列を試験して、好ましくは、大規模自己相補的二次構造を生じる自己相補的配列を決定する。

0009

一度形成されれば、このs4SFを、PrP遺伝子の除去を誘導するように、体細胞典型的には繊維芽細胞に導入することができる。変異したクローンの選択は、クローニング及びPCRスクリーニングによって行なわれる。PCRスクリーニングを促進するために、除去変異が、容易に認めうる制限部位造り、それで変異体クローンがスクリーニングなしで同定されうることは、好ましいことである。この変異したPrP遺伝子を組み込んだウシは、卵母細胞への核トランスファーによって、公知技術を利用して回収することができる。

0010

発明の詳細な説明
s4SFの調製及び変異型PrP遺伝子の生成。一具体例において、この発明は、ウシPrP遺伝子の断片と相同な(同一の)200〜1000ntの一層好ましくは400〜800ntの一本鎖DNAの短い断片(SF)の利用よりなるが、但し、除去変異をPrP遺伝子に導入するためにデザインされた位置は、数が限られており、典型的には10未満であって、適宜、改変PrP遺伝子座のアレル特異的PCRと二次的検出の結合による同定を容易にするように更なる変化を生じる。このウシPrP遺伝子の配列は、GENBANK受入れ番号AJ298878で見出され、PrPcDNAの配列は、受入れ番号AB001468として見出されうる(これらを参考として本明細書中に援用する)。

0011

所望の変異した配列の構築は、インビトロ位置指定突然変異導入法によって最も容易に達成することができる。これらの含まれる技術は、当分野で公知である。Perrin, S.及びGilliland, G.,1990, Nucleic AcidsResearch 18,7433;Landt,O.,1990, Gene 96,125-8;Nassal M.及びRieger,A, 1989, Nucleic Acids Research 18,3077-8;Hemsley,A.等、1989, Nucleic Acids Research 17,6545-51。これらの技術の実施は、標的遺伝子又は遺伝子の断片(改変されるべき配列を包含する)が組換え体クローンにおいて利用可能であることを必要とする。適当な所望の配列を構築したならば、SF自体を日常的なポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)によって合成することができる。s4SFを利用すべきである場合には、この合成には、1つの5’−ビオチン化プライマーと1つの非誘導体化プライマーを利用する。これらの鎖を、下記のように分離する。5’−ビチオン化プライマーの合成は、周知である。CooK,A.F.,等、1988,Nucleic Acids Research 16,4077-95;Connolly,B.A.,1988,Nucleic Acids Research 15,3131-9。

0012

SFが二本鎖形態即ちこの断片がその相補鎖にワトソンクリック結合された形態で合成された後に、一本鎖SFを製造することができる。この製法は、熱変性(95℃まで加熱)後4℃まで急冷することによって最も簡単に達成することができる。この方法は、分子間ワトソン−クリック塩基対合を有しないか又は本質的に有しない両極性の鎖の混合物を生じる。しかしながら、この混合物の高温での連続的インキュベーションは、分子内のワトソン−クリック対合の形成を生じうる。

0013

相補的鎖の分離は、SFのPCR合成で利用する2つのプライマーの一方をビオチン化した場合に、容易に達成されうる。この生成物の分離は、下記のように、ビオチン化した鎖を固定化したアビジンに結合させることにより達成することができる:
--二本鎖SF(ds−SF)産物を、2つのプライマーを利用するPCRにより生成することができ、その一方は、ビオチンを5’末端に含んだ。
--一本鎖を、ビオチン化したPCR生成物をアビジン−磁気ビーズ(Dyonex)に結合させることにより生成した。
--流浪(displaced)鎖(ビオチンを含まないD−ssSF)を、結合したdsPCR断片を高pH(0.5M NaOH)で、1〜2分間変性させることにより分離した。
--この「流浪鎖」(上清)を、磁気又は遠心分離を利用して、ビーズから除去し、酸(500:10.5M NaOH当たり27μl cHCL)で中和して、透析した(1000倍容0.1Mトリス pH7.0、その後、1000倍容の水で2回)。この流浪鎖を、次いで、エタノール沈殿又はスピンコンセントレーターにより濃縮した。
--このビーズに結合された固定化鎖(B−SF)を、2回のトリス 0.1M pH7.0での洗浄とその後の2回の水洗浄により中和した。この固定化された鎖を水中で磁気ビーズから除去してから、熱処理(95℃)した。
流浪及び固定化された両鎖は、個々に、活性を有する。
典型的には、流浪鎖は、一層活性であった。このコード鎖又は非コード鎖を利用して、修飾を標的遺伝子に導入することができる。

0014

このs4SFを、ウシの細胞例えば繊維芽細胞に、二本鎖DNAを細胞に導入するために利用することのできる任意の方法によって導入することができる。好適方法は、マイクロインジェクションによるものであり、これは、予め選択した接着細胞への制御された様式での個別の接種を可能にする。

0015

改変された標的遺伝子を含む細胞を、クローニング及びクローン化した細胞を、全動物の再生の前にPCR試験することによって分離することができる。幾つかの方法を採用して、SFがPrP遺伝子座を変化させた細胞のクローンを同定することができる。

0016

変化した細胞の頻度が低い場合に適した特定の方法は、「結合した検出」(CD)と呼ばれ、出願人共通の、R.Metzの米国特許出願第10/298,859号(2002年11月18日出願)(参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する)に記載された。CDにおいては、2つの変化(典型的には、50〜100ヌクレオチド離れている)が、単一SFを利用して導入される。推定上改変された細胞を含む集団が得られた後に;その集団を複製サブグループに分割する。PCR反応を、標的配列を増幅させるがSFを増幅させないPCRプライマーを利用して、各サブグループの複製物由来するゲノムDNAについて行なう。この反応の生成物を希釈して、第2のPCR反応のためのテンプレートとして利用する。この第2のPCR反応を、野生型配列よりも変化物の一つの配列に優先的にアニールするPCRプライマー及び非選択的第2プライマーを利用して行なう。このPCR反応は、生成物が第2の変化の部位を含むようにデザインされる。適当なアニーリング温度の選択は、変化した断片の野生型と比較して優先的な増幅を生じる。この優先的な増幅は、PCR生成物中の第2の変化の検出による、数千のサブグループ中の変化した遺伝子型単一コピーの容易な検出を可能にする。制限酵素認識を造り又は削除し、それで変異型遺伝子座の存在が制限酵素消化によって検出できる第2の変化は、検出の容易さの故に、特に好ましい。

0017

CDを利用すると、大きい細胞集団を容易にスクリーニングして、希少な細胞を検出することができる。このスクリーニングは、これらの集団をサブグループ又は約5,000に細分することにより行なう。希少な改変細胞の単一コピーを含むサブグループに由来するこれらの複製物を更に細分して培養する。細分、複製生成及び検出の連続サイクルを利用して、希少な改変細胞を集団から分離することができる。

0018

一層少なく好適な方法においては、野生型と比較して変異型配列に優先的にアニールするPCRプライマーを利用して、細胞集団に由来するゲノム断片を、変異型配列(存在するならば)だけが生成物を生じるような温度条件下でPCR増幅する。

0019

別の具体例においては、ウシのPrP遺伝子における変化を生じさせて、可溶性形態のPrPタンパク質の相対的安定性を増大させることができる。この安定性を増大させる変異は、ヒツジの種々の系統のスクラピーに対する罹病率をヒツジのPrP遺伝子の多型と比較することによって同定された。136、154及び171位の変異は、保護的であることが見出された。Drogenmuller, C.等、2001, Vet.Res.149,349-52。同じ変異をウシのPrP遺伝子に、この発明の別の具体例において導入することができる。

0020

更に別の具体例において、ウシのPrP遺伝子の、優性の病気耐性の表現型を与える突然変異による変化を、ウシのPrP遺伝子に導入して、動物が、この病気に耐性であるために変化したPrp遺伝子についてホモ接合である必要がないようにすることができる。

0021

BSE耐性ウシの生成。位置特異的変異を含む家畜の生成は、最近の体細胞からコンピテント生殖系列細胞即ち卵母細胞又は胚盤胞(卵割球)への核移植の進歩により可能となった。これらの技術は、実務家が遺伝的に同じ個体を移植された体細胞から作ることを可能にするので、一般に、「クローニング」又は「動物クローニング」と呼ばれる。これらの技術は、米国特許第6,147,276号及び6,252,133号に詳細に記載されている。

0022

この技術を記載している科学刊行物は、幾つかの種特異的適応によって、これらの技術が、ヒツジ、ウシ及びブタにおいて成功したことを教示している。Schnieke,A.E.等、1997,Science 278,2130-33;Wilmut,I.等、1997,Nature 385,810-3;Polejaeva,I.A.等、2000,Nature 407,29-30。この分野の現在の総説は、Kuhholtzer,B.及びPrather,R.S.,2000,Proc.Soc.Exp.Med.224,240-45に見出すことができる。

0023

元々変異していた体細胞の核は、PrP変異についてヘテロ接合であろうということが予想される。従って、BSE耐性系統の生成は、PrP遺伝子の変化をデザインしてその翻訳を防止する場合に、ホモ接合形態の変異を分離するために、創出系統の交配を必要とするであろう。PrP病耐性アレルを有する両親子孫における改変されたPrPの存在を、当分野で一般に公知の技術例えばRFLマッピング、SNP検出、サザーンブロット、PCR増幅及び直接配列決定が含まれうるDNAベースアッセイによって測定することができる。PrP遺伝子の変化についてホモ接合の動物を生成する別法として、核トランスファークローニングの第1ラウンドにおいて誘導されたから調製された細胞株をSFHRにより再ターゲティングして第2のPrPアレルを変えることができる。この第2のアレルの変化は、第1のアレルの変化と同じであってよいし或は、改変された両PrPアレルを有する細胞の同定において助成するように異なってもよい。ヘテロ接合の変化したPrPアレルについてホモ接合であるこれらの変異型細胞株は、所望のPrP遺伝子変異についてホモ接合の動物を再クローン化するのに利用することができる。

0024

SFHRのためのDNA断片を、2段階の過程において、ウシPrPのエキソン3が挿入された市販のベクターを利用するPCRによって合成する。2種類のプライマーを利用する。変異用プライマーを利用して、ベクター中のPrP配列を変化させる。

0025

この変異を導入した後に、生成用プライマーを利用して、SFHR二本鎖DNAを、変異したベクターをテンプレートとして利用するPCRにより作成する。

0026

生成用フォワード及びリバースプライマー(FP及びRP)並びにアミノ酸配列中の突然変異の位置によって標識された変異用プライマーを、以下に列記する。

0027

0028

実施例:伝染性海綿状脳症(TSE)又はウシ海綿状脳症(BSE)に耐性の動物の生成へのアプローチは、2つの並行する道において進行する。非機能的PrPアレルが、ウシの一次細胞株において、SFHR(GenEdit)分子を利用して生成される(PrP0−1及び/又はPrP0−2、オープンリーディングフレームを破壊する他の分子例えばPrP−0−3、−4、−5、−6なども又、企図されうる)。加えて、突然変異誘発用PCRプライマーを利用して、点突然変異を、上記の変異の何れかの100ヌクレオチド以内の制限酵素認識配列内に挿入する。変異型配列が相同組換えにより組み込まれた変異型細胞が生成され、これらの細胞のクローンが、変異型配列の存在についてスクリーニングされる。複製サブ培養を生成して、PCR増幅用にDNAを調製する。我々の感度を及び選択性を増すために、2ラウンドのPCR増幅を行なう。最初の反応は、PrP標的領域に隣接するプライマーセットを利用する。第一ラウンドの反応の生成物を、10,000倍に希釈して、アレル富化PCR反応のためのテンプレートとして利用する(一方のプライマーを、変異型配列に優先的に結合して、PrP変異を含む配列が選択的に富化されるようにデザインする)。次いで、アレル富化PCR生成物を、認識部位が変異した制限酵素で消化する。未切断PCR生成物は、変異型配列を含むものであり、他方、2つの断片の存在は、野生型PrPの存在を表す。PrPの変異型を含むサブ培養を、更に、細分して、変異型PrPをスクリーニングする過程を、改変された変異型細胞を含む純粋なサブ培養が分離されるまで反復する。

0029

この改変細胞株から、核トランスファー技術を利用して、動物を生成する。機能的PrPアレルの減少は、遺伝子産物の減少に基づく保護性を有しうる。ホモ接合PrP−0動物(PrP−0/PrP−0)は、PrP−0ヘテロ接合体の戻し交配により生成することができる。同様にして、BSE耐性アレルは、TSE(BSE)に対する多型バリヤーを導入するためのSFHR分子(耐性表現型に影響するbPrP AAR及び/又は他の分子)を利用して、種畜に導入される。TSE(スクラピー)に対する多型バリヤーの現在の証拠は、アラニン(A)、アルギニン(R)及びアルギニン(R)を、それぞれコドン136、154及び171に含むヒツジのスクラピー耐性群について記載されている。ウシの配列は、耐性関連アミノ酸を、136及び154に相同な位置に含み、そして該アミノ酸を171にだけ含む(改変されている必要がある)。ホモ接合体PrPARR/PrPAAR又はPrPARR/PrP−0動物は、標準的戻し交配及び適当なホモ接合/ヘテロ接合動物との交雑育種ストラテジーを利用して生成することができる。

0030

幾つかのヌルアレルを含んで生成することのできる幾つかの変異。下記は、3つのナンセンス及び2つのフレームシフトヌル変異の例である。ウシPrP−ARRを生成する塩基置換も又、与える。SFHR分子は、一本鎖のコード鎖若しくは非コード鎖であり、又は変性された二本鎖である。すべてのヌル生成SFHR分子は、イントロン2に至り、エキソン3(PRPのコード領域)で終結する。このPrP−ARRアレルは、エキソン3に配列が含まれるSFHR分子を必要とする。

0031

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