図面 (/)

技術 腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドレセプターに対して選択的な抗体と他の治療剤の組み合わせ

出願人 ザユーエービーリサーチファウンデーション
発明者 ジョウ,トン市川公久キンバーリー,ロバートピー.クープマン,ウィリアムジェイ.大隅潤ルブグリオ,アルバートエフ.ブッシュバーム,ドナルドジェイ.
出願日 2002年10月25日 (18年2ヶ月経過) 出願番号 2003-540308
公開日 2005年7月7日 (15年5ヶ月経過) 公開番号 2005-519871
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬
主要キーワード ひろげる 基準クラス マルイミド 長円柱 同一モデル 相乗作用効果 事件整理番号 小クラスター
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2005年7月7日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題・解決手段

本発明の抗体は、ヒトDR5またはヒトDR4と相互作用して、細胞の増殖およびアポトーシス阻害を含む、レセプター下流のアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用をもたらす。必要に応じて種々の治療剤と組み合わせられるこの抗体のための方法および使用(アポトーシス関連疾患処置および無調節な差異棒増殖の処置を含む)が詳述される。本発明によって、DR5を発現する標的細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、該方法は、以下:(a)標的細胞を、TRAILレセプターDR5に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、DR5を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロアポトーシス誘導活性を有する、工程;および(b)該標的細胞を、1種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、を包含する、方法が提供される。

概要

背景

(発明の背景
TRAILは、TNFファミリータンパク質メンバーであり、それはまた、TNF−αおよびFasリガンドも含む(1)。これらのタンパク質は、アポトーシスの強力な誘導因子である。現在まで、TRAILに対する5つのレセプターが同定されており、それらのうちの2つである、DR4(TRAIL−R1)およびDR5(TRAIL−R2)(2〜7)は、アポトーシスシグナルを伝達することが可能である。一方、他の3つ、DcR1(TRAIL−R3)、DcR2(TRAIL−R4)およびオステオプレテゲリン(OPG)は、アポトーシスシグナルを伝達しない(8〜12)。TRAILに対する5つすべてのレセプターは、それらの細胞外リガンド結合ドメイン内で有意な相同性共有する。FasおよびTNFレセプターI(本明細書中で以後「TNFRI」と呼ばれる)と同様に、DR4およびDR5の両方の細胞内セグメントは、デス(death)ドメインを含み、そしてFas関連デスドメインタンパク質(本明細書中で以後「FADD」と呼ばれる)およびカスパーゼ8に関連する経路を通ってアポトーシスシグナルを伝達する(6、7)。アポトーシスシグナルの伝達に加えて、DR4レセプターおよびDR5レセプターはまた、NFκbの関与する経路を活性化し得る(6、7)。

実証されているTRAILの生物学的機能は、形質転換腫瘍細胞のアポトーシスを選択的に誘導するTRAILの能力を含む(13〜15)。正常細胞は、TRAIL媒介性アポトーシスに比較的耐性である。この選択性は、Fasリガンドとは対照的に、TRAILの投与が、有意な毒性を誘導することなく動物モデルにおいてTRAILの全身投与によって実証されたように、毒性が非常に低いレベルであることに関連することが示される(13)。このように、TRAILは、ガンおよび異常な細胞増殖に関連する他の疾患の処置に対して適した治療薬であり得る強力なアポトーシス誘導薬剤として提案される。TRAILはまた、自己免疫疾患および炎症性疾患の処置に対して適し得る強力なアポトーシス誘導薬剤として提案される。TRAIL媒介性アポトーシスが、T細胞の活性化誘導細胞死に関連し、それによってFasリガンドに代替メカニズムとして働くことが実証されている(16、17)。TRAIL媒介性アポトーシスはまた、T細胞および他の炎症性細胞のアポトーシスの誘導において機能し得(18)、そしてNK細胞死滅活性(19〜21)および樹状細胞免疫調節機能(22、23)の役割を果たす。このように、TRAIL媒介性アポトーシスはまた、免疫沈降および免疫学的調査において機能し得る。

TRAILレセプターステムは、複雑であり、そして少なくとも2つのデスレセプター(DR4およびDR5)および少なくとも2つの非アポトーシスレセプター(DcR1およびDcR2)を含む。これらのレセプターすべては、高いアミノ酸配列の相同性を共有するだけでなく、TRAILに対する同様の結合親和性を示す(2〜12)。アポトーシスを誘導せずにTRAILの結合に対して競合するようなDcR1レセプターおよびDcR2レセプターの能力は、それらが、TRAILリガンドの活性をブロックまたは調節するデコイレセプターとして作用し得ることを示す。さらに、非形質転換細胞が、形質転換細胞発現するよりも高いレベルのデコイレセプターを発現することが報告されている。このように、デスレセプターおよびデコイレセプターの発現の差次的な調節が、レセプター特異的抗体欠如に起因するTRAIL媒介性アポトーシスに対する細胞の感受性を決定する主要な調節メカニズムを示し得ることが提案される(2)。DR4およびDR5の発現および機能が、広範に研究されていたにも拘らず、レセプター特異的モノクローナル抗体の欠如によって、その進展が妨害されていた。DR5の細胞表面発現は、実証されていない。インビトロでの黒色腫細胞のアポトーシスを誘導することが可能である一群の抗TRAILレセプター抗体が生成されたが、それは、抗体が固定された場合においてのみ架橋を促進し、いくつかの場合では、その細胞がアクチノマイシンDでの培養を必要とすることが報告されている(24)。いくつかの抗DR5抗体が、生成されている(24)。しかし、以前に生成されたこれらの抗DR5モノクローナル抗体は、インビトロにおいて、架橋状態下でさえ、低いアポトーシス誘導活性を有する。インビボでの活性は報告されていない。これらの抗体は、TRAILレセプターの細胞表面発現を試験するために使用される(24)。このように、細胞表面レセプターに結合することができるだけでなく、インビボおよびインビトロの両方において架橋または固定を必要とせずに、腫瘍細胞を含む種々の型の異常細胞のアポトーシスを強く誘導することができる、各特異的TRAILレセプターに対して選択的なモノクローナル抗体が必要である。そのような抗体は、潜在的な治療薬を提供するだけでなく、TRAILレセプターの機能的分析に対する診断的ツールを提供する。死誘導レセプターDR4およびDR5の各々に対する抗体特異的な薬剤が特に必要である。

多くの疾患の発症または進行において、細胞は欠失されないことがしばしばある。多くの自己免疫疾患および炎症性状態において、生存する活性化細胞は、正常組織または正常細胞を攻撃する。さらに、腫瘍形成の進行およびリウマチ様関節炎増殖性panus形成は、細胞の制御されない増殖によって特徴付けられる。このように、不十分なアポトーシスは、疾患の発症を導き、そしてアポトーシス誘導リガンドまたはアポトーシスを増強するアゴニスト性モノクローナル抗体の使用は、それら望まれない細胞を排除するための潜在的な治療ストラテジーとして考慮される。

例えば、リウマチ様関節炎(本明細書中で以後「RA」と呼ばれる)は、一般的なヒト自己免疫疾患である。RAの病理生理の現在の理解は、自己免疫T細胞およびB細胞が、関節において炎症性応答を開始し、それが滑膜細胞過剰増殖を駆動するというものである。滑膜細胞の過剰増殖の結果として、メタロプロテイナーゼ(本明細書中で以後「MMP」と呼ばれる)は、過剰産生され、それによって、さらにRAに特徴的である軟骨および骨のびらん破壊がさらに導かれる(25)。従って、炎症性滑膜細胞の過剰増殖の制御は、RAの処置において重要な工程である。滑膜細胞の過剰増殖を導く分子メカニズムは、なお未知である。過剰増殖した滑膜細胞が、悪性でなくかつ形質転換していないにも拘らず、多くの研究において、それらは、形質転換細胞と共通のいくつかの特徴を共有することが示唆されている(46)。これらの細胞は、いわゆる「形質転換しているように見える滑膜細胞」であり、密集した粗面小胞体無数の不揃いの核および通常は紡錘体形状の細胞骨格の変化によって特徴付けられる。オンコジーンおよびウイルス由来遺伝子の組み込みは、RA滑膜細胞の形質転換した外観に対する最初の誘発であり得ることが提唱されている(46)。

RAの少なくとも2つの局面において、調節されていないアポトーシスは、疾患の進行に寄与し得ること、そしてアポトーシスの治療的な誘発は、効果的な処置であり得ることが、示唆される:活性化T細胞の欠失の失敗は、これらT細胞の不完全活性化誘導性細胞死が存在することを示唆し、この細胞死は、Fas媒介性アポトーシスおよびTRAIL媒介性アポトーシスを含むプロセスである。そして、RA滑膜細胞の過剰増殖性質は、RA病理生理学の後の段階で寄与する因子である。実際、抗Fas抗体の炎症性関節への投与が、ヒトRAに対する動物モデルであるtaxトランスジェニックマウスにおいて慢性関節炎の発症を阻害することが示されている(26)。さらに、アデノウイルスベクターによるfasリガンド遺伝子での局所的な形質導入は、コラーゲン誘導関節炎の予防に効果的である(27)。Fas媒介性アポトーシスの増強による炎症性滑膜細胞の増殖の阻害は、両方の場合に観察される。Fasリガンドが、RA滑膜細胞における強力なアポトーシス誘発因子であるにも拘らず、ヒトに対する治療としてのFasリガンド媒介性アポトーシスの適用は、致死的肝臓毒性によって制限されている。したがって、TRAILレセプター誘導アポトーシスは、RAの処置に対して、Fasリガンド誘導アポトーシスより安全かつ効果的な治療を示す。TRAILレセプター誘導アポトーシスはまた、ガンの処置に対して、Fasリガンド誘導アポトーシスより安全かつ効果的な治療を示す。TRAIL媒介性アポトーシスは、正常細胞に影響を及ぼさずに形質転換腫瘍細胞のアポトーシスを特異的に誘導することが知られている。三量体形成した可溶性TRAILの全身投与は、実験動物にて毒性を引き起こさないがなお、移植した腫瘍退化を誘導することが可能であることが示されている(13、28)。従来の処置のための付属的な治療としてのその能力は、DR5の発現および乳ガン細胞のTRAIL誘導アポトーシスに対する感受性が、照射によって増大されるこという最近の研究結果によって理解された。このことは、照射と組み合わせると、TRAILの効力は、ガン治療において増大することが示唆する(29)。

さらに、TRAILレセプターDR5をコードする遺伝子は、いくつかのガン細胞において高頻度の変異を有する座である染色体8p21−22にマッッピングされている(30)。少なくとも2種類の腫瘍細胞、小ガン(31)、頭頚部ガン(32)が、DR5遺伝子のデスドメインにおいて変異を示すことが報告されている。したがって、ガンの発症および進行に対する、レセプターエピトープバリエーションの効果を決定するためのガン研究において抗DR5抗体が必要である。さらに、ガンの早期検出において他の生物マーカーとともに使用される場合、および腫瘍進行性の予知因子として使用される場合、TRAILレセプター変異の機能性は、有利な臨床的診断ツールを提供する。

概要

本発明の抗体は、ヒトDR5またはヒトDR4と相互作用して、細胞の増殖およびアポトーシスの阻害を含む、レセプター下流のアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用をもたらす。必要に応じて種々の治療剤と組み合わせられるこの抗体のための方法および使用(アポトーシス関連疾患の処置および無調節な差異棒増殖の処置を含む)が詳述される。本発明によって、DR5を発現する標的細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、該方法は、以下:(a)標的細胞を、TRAILレセプターDR5に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、DR5を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、工程;および(b)該標的細胞を、1種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、を包含する、方法が提供される。

目的

そのような抗体は、潜在的な治療薬を提供するだけでなく、TRAILレセプターの機能的分析に対する診断的ツールを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
5件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

DR5を発現する標的細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、該方法は、以下:(a)標的細胞を、TRAILレセプターDR5に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、DR5を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロアポトーシス誘導活性を有する、工程;および(b)該標的細胞を、1種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、を包含する、方法。

請求項2

少なくとも1つの接触させる工程が、インビボで実施される、請求項1に記載の方法。

請求項3

少なくとも1つの接触させる工程が、インビトロで実施される、請求項1に記載の方法。

請求項4

前記治療剤が、化学療法剤である、請求項1に記載の方法。

請求項5

請求項6

請求項4に記載の方法であって、前記化学治療剤または薬剤が、以下:レフルノミド(leflunomide)、ダクチノマイシンタモキシフェンインターフェロンα−2b、グルタミン酸プリカマイシン(plicamycin)、メルカプトプリン、6−チオアニニン(thioguaninine)、カルムスチン、BCNU、ロムスチン、CCNU、シトシンアラボシド(cytosinearaboside)、エストラムスチンヒドロキシ尿素プロカルバジンブスルファンメドロキシプロゲステロンエストラムスチンリン酸ナトリウムエチニルエストラジオールエストラジオール酢酸メゲストロールメチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸クロロトリアニセンテストラクトン、メファレン(mephalen)、コランシル(chorambucil)、メクロレタミン、チオテパベタメタゾン(bethamethasone)リン酸ナトリウム、ジカルバジン(dicarbazine)、アスパラギナーゼミトーテン硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、方法。

請求項7

請求項4に記載の方法であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン(predisone)またはこれらのサブセットである、方法。

請求項8

リタキシマブを投与する工程をさらに包含する、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記治療剤が、TNFファミリーメンバーである、請求項1に記載の方法。

請求項10

前記TNFファミリーのメンバーがCD40リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項9に記載の方法。

請求項11

前記TNFファミリーのメンバーがFasリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項9に記載の方法。

請求項12

前記治療剤が抗炎症剤である、請求項1に記載の方法。

請求項13

前記抗炎症剤が非ステロイド性の抗炎症剤である、請求項12に記載の方法。

請求項14

非ステロイド性の抗炎症剤がCOX−1インヒビターまたはCOX−2インヒビターである、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項12に記載の方法。

請求項16

前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項1に記載の方法。

請求項17

前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項1に記載の方法。

請求項18

前記治療剤が抗日和見剤である、請求項1に記載の方法。

請求項19

前記治療剤が抗生物質である、請求項1に記載の方法。

請求項20

前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項1に記載の方法。

請求項21

前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項1に記載の方法。

請求項22

前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項1に記載の方法。

請求項23

前記治療剤が疾患修飾抗リウマチ薬である、請求項1に記載の方法。

請求項24

前記治療剤がサイトカインである、請求項1に記載の方法。

請求項25

前記治療剤がケモカインである、請求項1に記載の方法。

請求項26

前記治療剤が増殖因子である、請求項1に記載の方法。

請求項27

前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項1に記載の方法。

請求項28

前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンイルマレイミド(bisindolylmaleimide)VIII(BisVIII)、SN−50またはLY294002である、請求項27に記載の方法。

請求項29

前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項1に記載の方法。

請求項30

前記二次抗体が、DR4抗体、TNF抗体、B7抗体、CD40リガンド抗体、CD40抗体、CD20抗体、およびFas抗体からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。

請求項31

請求項1に記載の方法であって、前記治療剤が、以下:化学療法剤、TNFファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、方法。

請求項32

前記標的細胞が異常に増殖する滑膜細胞である、請求項1に記載の方法。

請求項33

前記滑膜細胞が慢性関節リウマチ滑膜細胞である、請求項32に記載の方法。

請求項34

前記標的細胞が活性化免疫細胞である、請求項1に記載の方法。

請求項35

前記活性化免疫細胞が活性化リンパ球である、請求項34に記載の方法。

請求項36

前記標的細胞が好中球である、請求項1に記載の方法。

請求項37

前記標的細胞がウイルスに感染した細胞である、請求項1に記載の方法。

請求項38

前記標的細胞を照射する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。

請求項39

DR5を発現する標的細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は以下:(a)標的細胞を、TRAILレセプターDR5に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、DR5を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、工程;および(b)該標的細胞を、1種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、を包含する、方法。

請求項40

少なくとも1つの接触させる工程が、インビボで実施される、請求項39に記載の方法。

請求項41

少なくとも1つの接触させる工程が、インビトロで実施される、請求項39載の方法。

請求項42

前記治療剤が、化学療法剤である、請求項39に記載の方法。

請求項43

請求項42に記載の方法であって、前記化学療法剤が、以下:ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、6−メルカプトプリン、テニポシド(teniposide)、6−チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、方法。

請求項44

請求項42に記載の方法であって、前記化学治療剤または薬剤が、以下:ダクチノマイシン、タモキシフェン、インターフェロンα−2b、グルタミン酸、プリカマイシン(plicamycin)、メルカプトプリン、6−チオグアニニン(thioguaninine)、カルムスチン、BCNU、ロムスチン、CCNU、シトシンアラボシド(cytosinearaboside)、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ブスルファン、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸、クロロトリアニセン、テストラクトン、メファレン(mephalen)、コランブシル(chorambucil)、メクロレタミン、チオテパ、ベタメタゾン(bethamethasone)リン酸ナトリウム、ジカルバジン(dicarbazine)、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、方法。

請求項45

請求項42に記載の方法であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン(predisone)またはこれらのサブセットである、方法。

請求項46

リタキシマブを投与する工程をさらに包含する、請求項45に記載の方法。

請求項47

前記治療剤が、TNFファミリーのメンバーである、請求項39に記載の方法。

請求項48

前記TNFファミリーのメンバーがCD40リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項47に記載の方法。

請求項49

前記TNFファミリーのメンバーがFasリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項47に記載の方法。

請求項50

前記治療剤が抗炎症剤である、請求項39に記載の方法。

請求項51

前記抗炎症剤が非ステロイド性の抗炎症剤である、請求項50に記載の方法。

請求項52

非ステロイド性の抗炎症剤がCOX−1インヒビターまたはCOX−2インヒビターである、請求項51に記載の方法。

請求項53

前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項50に記載の方法。

請求項54

前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項39に記載の方法。

請求項55

前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項39に記載の方法。

請求項56

前記治療剤が抗日和見剤である、請求項39に記載の方法。

請求項57

前記治療剤が抗生物質である、請求項39に記載の方法。

請求項58

前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項39に記載の方法。

請求項59

前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項39に記載の方法。

請求項60

前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項39に記載の方法。

請求項61

前記治療剤が疾患修飾抗リウマチ薬である、請求項39に記載の方法。

請求項62

前記治療剤がサイトカインである、請求項39に記載の方法。

請求項63

前記治療剤がケモカインである、請求項39に記載の方法。

請求項64

前記治療剤が増殖因子である、請求項39に記載の方法。

請求項65

前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項39に記載の方法。

請求項66

前記二次抗体が、DR4抗体、TNF抗体、B7抗体、CD40リガンド抗体、CD40抗体、CD20抗体、およびFas抗体からなる群から選択される、請求項65に記載の方法。

請求項67

前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項1に記載の方法。

請求項68

前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンドイルマレイミド(bisindolylmaleimide)VIII(BisVIII)、SN−50またはLY294002である、請求項67に記載の方法。

請求項69

請求項39に記載の方法であって、前記治療剤が、以下:化学療法剤、TNFファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、方法。

請求項70

前記標的細胞が異常に増殖する滑膜細胞である、請求項39に記載の方法。

請求項71

前記滑膜細胞が慢性関節リウマチ滑膜細胞である、請求項70に記載の方法。

請求項72

前記標的細胞が活性化免疫細胞である、請求項39に記載の方法。

請求項73

前記活性化免疫細胞が活性化リンパ球である、請求項39に記載の方法。

請求項74

前記標的細胞が好中球である、請求項39に記載の方法。

請求項75

前記標的細胞がウイルスに感染した細胞である、請求項39に記載の方法。

請求項76

前記標的細胞を照射する工程をさらに包含する、請求項39に記載の方法。

請求項77

炎症疾患または自己免疫疾患を有する被験体処置する方法であって、以下:(a)標的細胞を、TRAILレセプターDR5に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、DR5を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、工程;および(b)該標的細胞を、1種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、を包含する、方法。

請求項78

前記治療剤が化学療法剤である、請求項77に記載の方法。

請求項79

前記化学療法剤が以下:ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、6−メルカプトプリン、テニポシド、6−チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、請求項78に記載の方法。

請求項80

前記化学療法剤が、以下:ダクチノマイシン、タモキシフェン、インターフェロンα−2b、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、6−チオグアニニン、カルムスチン、BCNU、ロムスチン、CCNU、シトシンアラボシド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ブスルファン、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸、クロロトリアニセン、テストラクトン、メファレン、コランブシル、メクロレタミン、チオテパ、ベタメタゾンリン酸ナトリウム、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、請求項78に記載の方法。

請求項81

請求項78に記載の方法であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン(predisone)またはこれらのサブセットである、方法。

請求項82

リタキシマブを投与する工程をさらに包含する、請求項81に記載の方法。

請求項83

前記治療剤が、TNFファミリーのメンバーである、請求項77に記載の方法。

請求項84

前記TNFファミリーのメンバーがCD40リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項83に記載の方法。

請求項85

前記TNFファミリーのメンバーがFasリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項83に記載の方法。

請求項86

前記治療剤が抗炎症剤である、請求項77に記載の方法。

請求項87

前記抗炎症剤が非ステロイド性の抗炎症剤である、請求項86に記載の方法。

請求項88

非ステロイド性の抗炎症剤がCOX−1インヒビターまたはCOX−2インヒビターである、請求項87に記載の方法。

請求項89

前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項86に記載の方法。

請求項90

前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項77に記載の方法。

請求項91

前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項77に記載の方法。

請求項92

前記治療剤が抗日和見剤である、請求項77に記載の方法。

請求項93

前記治療剤が抗生物質である、請求項77に記載の方法。

請求項94

前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項77に記載の方法。

請求項95

前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項77に記載の方法。

請求項96

前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項77に記載の方法。

請求項97

前記治療剤が疾患修飾抗リウマチ薬である、請求項77に記載の方法。

請求項98

前記治療剤がサイトカインである、請求項77に記載の方法。

請求項99

前記治療剤がケモカインである、請求項77に記載の方法。

請求項100

前記治療剤が増殖因子である、請求項77に記載の方法。

請求項101

前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項77に記載の方法。

請求項102

前記二次抗体が、DR4抗体、TNF抗体、B7抗体、CD40リガンド抗体、CD40抗体、CD20抗体、およびFas抗体からなる群から選択される、請求項101に記載の方法。

請求項103

前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項1に記載の方法。

請求項104

前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンドイルマレイミド(bisindolylmaleimide)VIII(BisVIII)、SN−50またはLY294002である、請求項103に記載の方法。

請求項105

前記治療剤が、化学療法剤、TNFファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、請求項77に記載の方法。

請求項106

前記炎症性疾患または自己免疫疾患は、以下:エリテマトーデス橋本病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、シェーグレン病、悪性貧血アディソン病強皮症グッドパスチャー症候群クローン病自己免疫性溶血性貧血生殖不能重症筋無力症多発性硬化症、バーゼドー病、血栓性血小板減少(thromboticthrobocytopenia)、血小板減少性紫斑病(thrombopeniapurpura)、インスリン依存性糖尿病アレルギーぜん息アトピー疾患;動脈硬化症心筋炎心筋症糸球体腎炎;低形成貧血からなる群から選択される、請求項77に記載の方法。

請求項107

放射線治療を被験体に受けさせる工程をさらに包含する、請求項77に記載の方法。

請求項108

組成物であって、該組成物は、以下:(a)TRAILレセプターDR5に特異的に結合する抗体であって、ここで該抗体は、その可溶形態で、DR5を発現する標的細胞中にインビボおよびインビトロでアポトーシスを誘導する活性を有する、抗体、および(b)1種以上の治療剤、を含有する、組成物。

請求項109

前記治療剤が以下:化学療法剤、TNFファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、疾患修飾抗リウマチ薬、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、請求項108に記載の組成物。

請求項110

薬学的に受容可能なキャリアをさらに含有する、請求項108に記載の組成物。

技術分野

0001

承認
本願は、米国仮出願番号60/391,478(2002年6月24日出願)および米国仮出願番号60/346,402(2001年11月1日出願)の利益を主張し、そして現在係属中である、PCT/US01/14151(2001年5月出願)に対する優先権を主張する。PCT/US01/14151は、米国仮出願番号60/201,344(2000年5月2日出願)の利益を主張する。本願が利益を主張する出願は、本明細書中で、それらの全体が参考として援用される。

0002

本発明は、国立ガン協会から授与された助成金NCI P50 CA89019−01および国立関節炎ならびに筋骨格疾患および皮膚疾患協会から授与されたNIH R03−AR44982下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

0003

(発明の分野)
本発明は、1つの型の腫瘍壊死因子(本明細書中で以後「TNF」と呼ばれる)関連アポトーシス誘導リガンド(本明細書中で以後「TRAIL」と呼ばれる)レセプターに特異的に結合することが可能な抗体、より詳細には、その1つの型のレセプターを発現する細胞においてインビボおよびインビトロアポトーシス誘導するモノクローナル抗体、ならびにそれに基づく治療法に関する。

背景技術

0004

(発明の背景
TRAILは、TNFファミリータンパク質メンバーであり、それはまた、TNF−αおよびFasリガンドも含む(1)。これらのタンパク質は、アポトーシスの強力な誘導因子である。現在まで、TRAILに対する5つのレセプターが同定されており、それらのうちの2つである、DR4(TRAIL−R1)およびDR5(TRAIL−R2)(2〜7)は、アポトーシスシグナルを伝達することが可能である。一方、他の3つ、DcR1(TRAIL−R3)、DcR2(TRAIL−R4)およびオステオプレテゲリン(OPG)は、アポトーシスシグナルを伝達しない(8〜12)。TRAILに対する5つすべてのレセプターは、それらの細胞外リガンド結合ドメイン内で有意な相同性共有する。FasおよびTNFレセプターI(本明細書中で以後「TNFRI」と呼ばれる)と同様に、DR4およびDR5の両方の細胞内セグメントは、デス(death)ドメインを含み、そしてFas関連デスドメインタンパク質(本明細書中で以後「FADD」と呼ばれる)およびカスパーゼ8に関連する経路を通ってアポトーシスシグナルを伝達する(6、7)。アポトーシスシグナルの伝達に加えて、DR4レセプターおよびDR5レセプターはまた、NFκbの関与する経路を活性化し得る(6、7)。

0005

実証されているTRAILの生物学的機能は、形質転換腫瘍細胞のアポトーシスを選択的に誘導するTRAILの能力を含む(13〜15)。正常細胞は、TRAIL媒介性アポトーシスに比較的耐性である。この選択性は、Fasリガンドとは対照的に、TRAILの投与が、有意な毒性を誘導することなく動物モデルにおいてTRAILの全身投与によって実証されたように、毒性が非常に低いレベルであることに関連することが示される(13)。このように、TRAILは、ガンおよび異常な細胞増殖に関連する他の疾患の処置に対して適した治療薬であり得る強力なアポトーシス誘導薬剤として提案される。TRAILはまた、自己免疫疾患および炎症性疾患の処置に対して適し得る強力なアポトーシス誘導薬剤として提案される。TRAIL媒介性アポトーシスが、T細胞の活性化誘導細胞死に関連し、それによってFasリガンドに代替メカニズムとして働くことが実証されている(16、17)。TRAIL媒介性アポトーシスはまた、T細胞および他の炎症性細胞のアポトーシスの誘導において機能し得(18)、そしてNK細胞死滅活性(19〜21)および樹状細胞免疫調節機能(22、23)の役割を果たす。このように、TRAIL媒介性アポトーシスはまた、免疫沈降および免疫学的調査において機能し得る。

0006

TRAILレセプターステムは、複雑であり、そして少なくとも2つのデスレセプター(DR4およびDR5)および少なくとも2つの非アポトーシスレセプター(DcR1およびDcR2)を含む。これらのレセプターすべては、高いアミノ酸配列の相同性を共有するだけでなく、TRAILに対する同様の結合親和性を示す(2〜12)。アポトーシスを誘導せずにTRAILの結合に対して競合するようなDcR1レセプターおよびDcR2レセプターの能力は、それらが、TRAILリガンドの活性をブロックまたは調節するデコイレセプターとして作用し得ることを示す。さらに、非形質転換細胞が、形質転換細胞が発現するよりも高いレベルのデコイレセプターを発現することが報告されている。このように、デスレセプターおよびデコイレセプターの発現の差次的な調節が、レセプター特異的抗体欠如に起因するTRAIL媒介性アポトーシスに対する細胞の感受性を決定する主要な調節メカニズムを示し得ることが提案される(2)。DR4およびDR5の発現および機能が、広範に研究されていたにも拘らず、レセプター特異的モノクローナル抗体の欠如によって、その進展が妨害されていた。DR5の細胞表面発現は、実証されていない。インビトロでの黒色腫細胞のアポトーシスを誘導することが可能である一群の抗TRAILレセプター抗体が生成されたが、それは、抗体が固定された場合においてのみ架橋を促進し、いくつかの場合では、その細胞がアクチノマイシンDでの培養を必要とすることが報告されている(24)。いくつかの抗DR5抗体が、生成されている(24)。しかし、以前に生成されたこれらの抗DR5モノクローナル抗体は、インビトロにおいて、架橋状態下でさえ、低いアポトーシス誘導活性を有する。インビボでの活性は報告されていない。これらの抗体は、TRAILレセプターの細胞表面発現を試験するために使用される(24)。このように、細胞表面レセプターに結合することができるだけでなく、インビボおよびインビトロの両方において架橋または固定を必要とせずに、腫瘍細胞を含む種々の型の異常細胞のアポトーシスを強く誘導することができる、各特異的TRAILレセプターに対して選択的なモノクローナル抗体が必要である。そのような抗体は、潜在的な治療薬を提供するだけでなく、TRAILレセプターの機能的分析に対する診断的ツールを提供する。死誘導レセプターDR4およびDR5の各々に対する抗体特異的な薬剤が特に必要である。

0007

多くの疾患の発症または進行において、細胞は欠失されないことがしばしばある。多くの自己免疫疾患および炎症性状態において、生存する活性化細胞は、正常組織または正常細胞を攻撃する。さらに、腫瘍形成の進行およびリウマチ様関節炎増殖性panus形成は、細胞の制御されない増殖によって特徴付けられる。このように、不十分なアポトーシスは、疾患の発症を導き、そしてアポトーシス誘導リガンドまたはアポトーシスを増強するアゴニスト性モノクローナル抗体の使用は、それら望まれない細胞を排除するための潜在的な治療ストラテジーとして考慮される。

0008

例えば、リウマチ様関節炎(本明細書中で以後「RA」と呼ばれる)は、一般的なヒト自己免疫疾患である。RAの病理生理の現在の理解は、自己免疫T細胞およびB細胞が、関節において炎症性応答を開始し、それが滑膜細胞過剰増殖を駆動するというものである。滑膜細胞の過剰増殖の結果として、メタロプロテイナーゼ(本明細書中で以後「MMP」と呼ばれる)は、過剰産生され、それによって、さらにRAに特徴的である軟骨および骨のびらん破壊がさらに導かれる(25)。従って、炎症性滑膜細胞の過剰増殖の制御は、RAの処置において重要な工程である。滑膜細胞の過剰増殖を導く分子メカニズムは、なお未知である。過剰増殖した滑膜細胞が、悪性でなくかつ形質転換していないにも拘らず、多くの研究において、それらは、形質転換細胞と共通のいくつかの特徴を共有することが示唆されている(46)。これらの細胞は、いわゆる「形質転換しているように見える滑膜細胞」であり、密集した粗面小胞体無数の不揃いの核および通常は紡錘体形状の細胞骨格の変化によって特徴付けられる。オンコジーンおよびウイルス由来遺伝子の組み込みは、RA滑膜細胞の形質転換した外観に対する最初の誘発であり得ることが提唱されている(46)。

0009

RAの少なくとも2つの局面において、調節されていないアポトーシスは、疾患の進行に寄与し得ること、そしてアポトーシスの治療的な誘発は、効果的な処置であり得ることが、示唆される:活性化T細胞の欠失の失敗は、これらT細胞の不完全活性化誘導性細胞死が存在することを示唆し、この細胞死は、Fas媒介性アポトーシスおよびTRAIL媒介性アポトーシスを含むプロセスである。そして、RA滑膜細胞の過剰増殖性質は、RA病理生理学の後の段階で寄与する因子である。実際、抗Fas抗体の炎症性関節への投与が、ヒトRAに対する動物モデルであるtaxトランスジェニックマウスにおいて慢性関節炎の発症を阻害することが示されている(26)。さらに、アデノウイルスベクターによるfasリガンド遺伝子での局所的な形質導入は、コラーゲン誘導関節炎の予防に効果的である(27)。Fas媒介性アポトーシスの増強による炎症性滑膜細胞の増殖の阻害は、両方の場合に観察される。Fasリガンドが、RA滑膜細胞における強力なアポトーシス誘発因子であるにも拘らず、ヒトに対する治療としてのFasリガンド媒介性アポトーシスの適用は、致死的肝臓毒性によって制限されている。したがって、TRAILレセプター誘導アポトーシスは、RAの処置に対して、Fasリガンド誘導アポトーシスより安全かつ効果的な治療を示す。TRAILレセプター誘導アポトーシスはまた、ガンの処置に対して、Fasリガンド誘導アポトーシスより安全かつ効果的な治療を示す。TRAIL媒介性アポトーシスは、正常細胞に影響を及ぼさずに形質転換腫瘍細胞のアポトーシスを特異的に誘導することが知られている。三量体形成した可溶性TRAILの全身投与は、実験動物にて毒性を引き起こさないがなお、移植した腫瘍退化を誘導することが可能であることが示されている(13、28)。従来の処置のための付属的な治療としてのその能力は、DR5の発現および乳ガン細胞のTRAIL誘導アポトーシスに対する感受性が、照射によって増大されるこという最近の研究結果によって理解された。このことは、照射と組み合わせると、TRAILの効力は、ガン治療において増大することが示唆する(29)。

0010

さらに、TRAILレセプターDR5をコードする遺伝子は、いくつかのガン細胞において高頻度の変異を有する座である染色体8p21−22にマッッピングされている(30)。少なくとも2種類の腫瘍細胞、小ガン(31)、頭頚部ガン(32)が、DR5遺伝子のデスドメインにおいて変異を示すことが報告されている。したがって、ガンの発症および進行に対する、レセプターエピトープバリエーションの効果を決定するためのガン研究において抗DR5抗体が必要である。さらに、ガンの早期検出において他の生物マーカーとともに使用される場合、および腫瘍進行性の予知因子として使用される場合、TRAILレセプター変異の機能性は、有利な臨床的診断ツールを提供する。

課題を解決するための手段

0011

(発明の要旨)
1つの実施形態において、本発明は、TRAILレセプターDR5を認識し、インビボまたはインビトロでDR5を発現する細胞においてアポトーシスを誘導する抗体に関する。さらに、DR5を認識するがDR4も、DcR1もDcR2も認識しない抗体が、開示される。ハイブリドーマによって生成されるDR5に対するモノクローナル抗体が、具体的に詳述される。

0012

別の実施形態において、本発明は、TRAILレセプターDR4を認識し、インビボまたはインビトロでDR4を発現する細胞にてアポトーシスを誘導する抗体に関する。さらに、DR4を認識するがDR5も、DcR1もDcR2も認識しない抗体が、開示される。ハイブリドーマによって生成されるDR4に対するモノクローナル抗体が、具体的に詳述される。

0013

提供される方法は、DR5またはDR4に結合することが可能な治療量の抗体と細胞とを接触することによる、標的細胞におけるアポトーシスの誘導および標的細胞増殖の阻害である。この方法の種々の実施形態において、標的細胞を、他のデスレセプターに対する抗体と接触させることによって、アポトーシスが誘導され得るか、または細胞増殖が阻害され得る。

0014

DR5に対して活性な治療量のモノクローナル抗体、薬剤的受容可能なキャリア、ならびに必要に応じてその抗体およびキャリアを収容する容器を含む、薬理学的組成物もまた、開示される。さらに、異常細胞または調節不全細胞の選択的アポトーシスに対する治療剤を調製するための、DR5を認識する抗体またはDR4を認識する抗体の使用が、本発明によって提供される。

0015

本発明の抗体は、DR4、DR5、DrR1、DrR2およびOPGのような腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドレセプターと相互作用し、そのようなレセプターを発現する細胞にてアポトーシスを誘導する。アゴニスト性またはアンタゴニスト性の腫瘍壊死因子リガンドレセプターエピトープを選択的に結合することが可能な本発明の抗体が、開示される。

0016

本発明は、単独でかまたは他のアポトーシス誘導抗体および/または他の治療薬もしくは処置と組み合わせて、疾患を有する標的組織を治療量の本発明の抗体に接触すること、を含む方法による、アポトーシス関連疾患、ガン、炎症性疾患または自己免疫疾患に対する処置を提供する。

0017

さらに、被験体内で免疫反応を誘発することが可能な免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントに連結された、少なくとも10塩基を有する抗原性TRAILレセプターアミノ酸配列を含む融合タンパク質が、開示される。

0018

本発明は、標的細胞を、TRAILレセプター核酸配列を含む発現ベクタートランスフェクトし、その結果、そのTRAILレセプターが標的細胞で発現される、遺伝子治療方法を提供する。次いで、この標的細胞は、そのTRAILレセプターを選択的に結合する抗体に曝される。

0019

DR5に対して選択的な抗体の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列およびアミノ酸配列が、提供される。配列もまた、DR4に選択的に結合する抗体について提供される。本発明の核酸配列を含むベクターおよび本発明のベクターで形質転換された宿主細胞もまた、詳述される。

0020

本発明は、ヒト化DR5抗体(例えば、TRA−8)およびヒト化DR4(例えば、2E12)、ならびにそのヒト化DR5抗体を生成するトランスフェクト細胞およびヒト化DR4抗体を生成するトランスフェクト細胞を提供する。

0021

ヒト化DR5抗体またはヒト化DR4抗体を生成するための方法が、記載され、この方法において、宿主が、ヒト化免疫グロブリン軽鎖およびヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列で形質転換され、その後、形質転換された宿主は、所定の期間、インキュベートされる。

0022

また、標的細胞においてアポトーシスを誘導するかまたは細胞増殖を阻害するためのプロセスが、記載され、そのプロセスは、他の治療薬および処置の存在下または非存在下で、薬学的に有効な量のヒト化DR5抗体、ヒト化DR4抗体、またはDR5抗体と別のデスレセプターに対する抗体(例えば、DR4に対する抗体)との組み合わせと、標的細胞を接触することを含む。

0023

アポトーシスを誘導するための市販のキットが、提供され、このキットは、適した容器内に包まれた、DR5に対して選択的なヒト化TRA−8抗体またはDR4に対するヒト化抗体(例えば、ヒト化2E12)、および必要に応じて使用のための指示書を備える。

0024

(発明の詳細な説明)
細胞除去の失敗は、アポトーシス誘導系の欠陥に起因し、それは例証的にリガンド、レセプター、または細胞内調節因子およびエフェクター分子の発現または機能を含む欠陥に関連する。本発明は、不完全なアポトーシス誘導系を補正する方法および所定の不完全なアポトーシス誘導系に備わる特定の欠陥を解明する方法を提供する。

0025

本発明は、DR5、DR4、DcR1およびDcR2を含む特異的TRAILレセプターに対する選択的なインビボおよびインビトロでのアポトーシス誘導活性を有するモノクローナル抗体の新しいクラスに関する。従って、本発明の抗体は、TRAILレセプターの1つに特異的に結合する。「選択的な結合」または「特異的な認識」とは、伝統的なウェスタンブロット解析の使用によって、抗体がただ1つのTRAILレセプターに結合し、そして他の型のTRAILレセプターにほとんど結合しないかまたは全く結合しないことを意味する。本発明のDR5抗体は、DR5に選択的に結合し、そしてDR4、DcR1またはDcR2に対して約1.5倍のバックグランドを上回る結合を示さない。同様に、本発明のDR4抗体は、選択的にDR4に結合し、DR5、DcR1またはDcR2の約1.5倍のバックグラウンドを上回る結合を示さない。本発明は、アポトーシスシグナル伝達の研究のための試薬としての有用性、およびTRAILレセプターを発現する細胞に対して有効な治療薬としての有用性を有する。TRAILレセプターを発現する細胞としては、例証的に、癌細胞の広範なクラス、アポトーシス系の脱調節を示す細胞、活性化リンパ球または他の活性化免疫細胞(例えば、リンパ球および骨髄性細胞)、ウイルス感染細胞、および自己免疫疾患の異常増殖する滑膜細胞(例えば、炎症性滑膜細胞、滑膜における活性化リンパおよび骨髄性細胞、マクロファージ様滑膜細胞、ならびに線維芽細胞様滑膜細胞を含む、慢性関節リウマチ滑膜細胞)が挙げられる。本発明による抗体は、TRAILレセプター間のホモロジーにもかかわらず、このレセプターの特定の型との結合において特異的である。この発明の抗体は、標的TRAILレセプターを発現する細胞、あるいは標的レセプターを発現する細胞のTRAILアポトーシスをブロックする細胞のみを標的とするアポトーシスを提供する。

0026

本発明のDR5モノクローナル抗体またはDR4モノクローナル抗体は、インビトロで、それぞれDR5またはDR4を発現する細胞におけるアポトーシスの強力な誘導因子として、およびインビボで、アポトーシスの強力な誘導因子として働く。ヒト化抗体骨格と本発明の融合タンパク質DR5抗体または融合タンパク質DR4抗体とにおいて合体された、ヒト化した断片的CDR配列は、類似のアポトーシス様特性を示す。

0027

今日まで、細胞表面DR5に結合するモノクローナル抗体、およびたとえ低濃度であっても、架橋剤なしで、インビトロおよびインビボの両方において、DR5を発現する細胞のアポトーシスを誘導するモノクローナル抗体は、入手可能ではない。本発明は、種々の疾患の処置における治療剤として作用するDR5抗体を含む。可溶性のTRAILが、インビボにおいて、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導に効果的であることが示されているが、殺傷活性は非常に低いようであり、多くの反復した投薬がしばしば必要とされる(13)。本発明は、TRAILレセプターDR5を結合する精製された抗体を提供し、ここで、この抗体は、低濃度におけるその可溶性形態で、DR5を発現する標的細胞において、インビボおよびインビトロでのアポトーシス誘導活性を有する。好ましい実施形態において、この精製された抗体は、抗体の架橋の非存在下で、TRAILレセプターDR5に結合する。好ましくは、この抗体は、正常な線維芽細胞の有意なアポトーシスを誘導しない。好ましくは、このアポトーシス誘導活性は、約0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/mlまたは20μg/ml未満あるいはそれらの間における任意の濃度の抗体濃度での、標的細胞の60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%未満あるいはそれらの間における任意の%の生存度によって特徴付けられる。この精製された抗体は、慣用的なウェスタンブロット解析下で、TRAILレセプターDR5と特異的に結合し、そしてTRAILレセプターDR4、DcR1またはDcR2とは結合しない。好ましい実施形態において、この抗体は、モノクローナル抗体であり、好ましくは、ATCC登録番号PTA−1428を有する、マウスマウスハイブリドーマTRA−8と同じエピト−プ特異性を有する。

0028

本発明に従って、DR5抗体の系列うちの1つであるTRA−8は、ヒトDR5トランスジーンを保有する動物において薬学的に有効であり、そしてまた、DR5およびTRAILの役割の研究のためのモデル確立する際に有用性を有する。

0029

本発明の種々の実施形態は、架橋の存在または非存在下で、アポトーシスを誘導する抗体を提供する。例えば、DR5抗体(例えば、TRA−8)の好ましい実施形態は、架橋の非存在下でアポトーシスを誘導する。「架橋」は、例えば、二次抗体による架橋を含む。他の実施形態は、架橋の存在下でアポトーシスを誘導する抗体を提供し、例えば、DR4抗体(2E12)の好ましい実施形態を含む。

0030

従って、本発明は、TRAILレセプターDR4に特異的に結合する精製された抗体を提供し、ここで、この抗体は、その可溶性形態で、DR4を発現する標的細胞において、インビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する。1実施形態として、この抗体は、TheUAB Research Foundationを代表して、呼称名「ヒトDR4に対する2E12ハイブリドーマクローン」を有し、2001年10月24日に寄託された、ATCC受託番号PTA−3978を有するハイブリドーマ2E12と、同じエピト−プ特異性を有するモノクローナル抗体である。本発明のDR4抗体の系列のうちの1つである2E12は、DR4を発現する癌を有する動物においてインビボで、未処置コントロール動物と比較されるか、または処置前の腫瘍のサイズと比較されるように、腫瘍のサイズを減少させることにおいて薬学的に活性である。

0031

DR5に対する抗体の両方は、低用量の可溶性形態で有効であり、低用量とは、インビトロで約0.01μg/ml〜約1μg/ml未満、そしてインビボで約1mg/kg〜10mg/kg未満の用量または濃度を意味する。本発明の抗体の好ましい特徴は、この抗体が、正常で活性化されておらず形質転換されていない肝細胞、線維芽細胞、滑膜細胞などにおいて、アポトーシスを誘導することなく、DR5レセプターを発現する細胞に対して選択的に、アポトーシスを誘導することである。TRAILレセプターに対して惹起された本発明に従う抗体は、本発明に従って実験動物から採集されるが、当該分野において公知の抗体産生または合成の任意の方法によって作製され得る。レセプター結合活性を維持するが、ヒト被験体内で減少する免疫応答および治療的に寛容な免疫応答を誘起させるように、本発明に従う抗体をヒト化することによって、本発明に従うヒト化抗TRAILレセプター抗体が、所定のTRAILレセプターに対する治療的なアゴニストまたはアンタゴニストとして使用される。本発明は、抗TRAILレセプター抗体の二次架橋以後、インビボ治療薬として作用するが、必要に応じて、必要とされない。

0032

本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストのアポトーシス効果を有する1つの抗TRAILレセプター抗体を越えて広がる。むしろ2つ以上の抗TRAILレセプター抗体が、強化した処置を生み出すために、インビトロで細胞培養物またはインビボで被験体身体組織と接触される。「強化した処置」とは、任意の相加的相乗的または増強的な効果を意味する。例えば、神経膠腫細胞株U87および造血細胞株U937およびMolt−4は、アゴニストの抗DR4抗体および抗DR5抗体への相乗的曝露のための曝露に反応性であり、一方、アゴニストのDR5抗体単独への曝露は、アポトーシスの誘導において制限された成功しか示さない。

0033

さらに、アンタゴニストの抗TRAILレセプター抗体は、この抗体がデコイレセプターDcR1、DcR2またはOPGの1つに特異的に結合する場合、本発明において特に有用である。本発明に従う抗体でのデコイレセプターの選択的なブロッキングは、デコイレセプターを発現する細胞型において、アポトーシスシグナルを伝達することが可能なTRAILレセプターに、TRAIL結合平衡シフトする効果を有する。従って、本発明に従う別の組み合わせ治療において、デコイレセプター結合抗体が、発現細胞を、アゴニストのアポトーシスシグナル伝達TRAILレセプター結合に対して感受性にする。

0034

別の実施形態においては、本発明は、所定のTRAILレセプターのアゴニストのエピトープおよびアンタゴニストのエピトープを解明する方法を提供する。さらに、本発明に従って、各々が異なる可変領域またはCDR領域を有するモノクローナル抗体のパネルの使用を介して、所定のTRAILレセプターと関連した個体間の多型現象が解明される。特徴付けされたモノクローナル抗体のパネルは、アゴニストのエピト−プおよびアンタゴニストのエピトープならびに多型現象を規定する能力を提供する。従って、本発明に従うモノクローナル抗体のパネルは、薬物発見および/または疾患傾向のための物質スクリーニングにおける有用性を有する。

0035

本発明のなお別の実施形態は、免疫グロブリンタンパク質、ポリペプチドまたはこれらのフラグメントと結合されたTRAILレセプターの抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を包含する。TRAILレセプターフラグメントは、被験体細胞表面で発現されるネイティブなTRAILレセプターに対する免疫原性応答を惹起するために十分な数の塩基を含むとして定義される。TRAILレセプター融合フラグメントは、少なくとも10アミノ酸を含む。免疫グロブリン融合タンパク質またはこのフラグメントは、ネイティブタンパク質または合成タンパク質、あるいは被験体内で免疫原性カスケード応答を活性化させるために十分な数のアミノ酸残基を有するポリペプチド区画を含むことが、本明細書中で定義される。免疫グロブリンフラグメントカップリングされたTRAILレセプターフラグメントの融合を含む、本発明の免疫原は、被験体内でインサイチュで抗TRAILレセプター抗体を惹起させるためのインビボでの治療薬として有用性を有する。

0036

またさらなる実施形態において、本発明は遺伝子治療剤として効力を有する。従って、本発明は、標的細胞内で選択的にアポトーシスを誘導する方法を提供し、この方法は、発現可能なTRAILレセプター核酸配列を含むベクターで標的細胞をトランスフェクトする工程;当該細胞上で、当該TRAILレセプター核酸配列によりコードされるTRAILレセプターを発現する工程;および当該TRAILレセプターと結合するのに選択的なアポトーシス誘導性の抗体と、当該細胞とを接触させる工程を包含する。本発明の遺伝子治療の局面においては、標的細胞は、TRAILレセプターに対応する発現可能な配列を有するベクターでトランスフェクトされ、このベクターは通常のものであり、そして標的される細胞のベクターへの感受性に基づいて選択される。遺伝子治療ベクターとしては、例証的にアデノウイルス、pAdCMV5が挙げられる。トランスフェクトしたTRAILレセプターを発現する標的される細胞または組織において、これら細胞または組織は、トランスフェクトされたTRAILレセプターへの結合に特異的な、本発明に従う抗体に曝露される。抗TRAILレセプター抗体は、所望される治療結果に一致して、アゴニスト的かまたはアンタゴニスト的のいずれかであることが理解される。

0037

本発明の抗体は、増感物質と併用してまた効力を有する。本明細書中で使用される増感物質は、アポトーシスを誘導する任意の刺激因子を含むと定義され、紫外線有機分子(特に、ビスイドールマレイミドのクラスを含む)、重金属、および遊離基種が挙げられる。

0038

癌治療の状況において、TRA−8は、二次的な架橋の非在下で、カスパーゼ依存様式でほとんどのTRAIL感受性の腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。TRA−8および2E12は、単独でも、他の抗体との組み合わせでも、インビボで強い殺腫瘍性活性を示す。大部分のTRAIL感受性細胞のアポトーシスを誘導するTRA−8または2E12の能力は、DR5かDR4のいずれかが単独でアポトーシスの誘発に十分であることを確認する。本明細書中で詳述されている大多数の腫瘍細胞は、細胞表面DR5を発現しており、そしてこれらのTRA−8誘導細胞死に対する感受性は、これらのTRAILに対する感受性に匹敵し、そのことはDR5が、大部分の腫瘍細胞において、TRAIL媒介アポトーシスについての主要なデスレセプターであることを示す。類似の結果が、DR4に対して特異的な抗体(例えば、2E12)で得られた。従って、正常細胞および癌細胞によるDR5またはDR4の差次的発現は、TRAIL媒介アポトーシスの選択性において機能的である。TRA−8は、TRAIL媒介アポトーシスを誘導するために、デコイレセプターを迂回する。しかし、ほんの少数のTRAIL抵抗性腫瘍細胞だけがTRA−8に感受性であり、このことは、デコイレセプターが、TRAIL媒介アポトーシスに対する腫瘍細胞の抵抗性において、主な役割を担っていないようであることを示す。

0039

以前の研究で、動物における可溶型のTRAILの全身投与が、毒性を引き起こすことなく腫瘍退縮を誘導し3、4、22、ヒトTRAILの膜結合型は、本明細書中で記載されるように、マウスにおいて肝臓損傷を誘導することが示された。ところが、TRAILの肝毒性は、Fasリガンドと比較して、TRAIL誘導性傷害に対する正常肝細胞の感受性がより低いこと、およびインビボではTRAILの致死性欠くことによって説明されるように、Fasリガンドほどずっと強力でない。従って、TRAILの力価決定(titration)は、癌の治療において有用性を有する。

0040

本明細書中で記載されるように、正常な肝細胞による有意なレベルのDR5タンパク質の発現の不在が示され、そしてこれは、TRA−8誘導性のアポトーシスに対する肝細胞の抵抗性と関連する。DR5のモノクローナル抗体との架橋は、アポトーシスを誘発することが可能な死レセプターのホモポリマー形態を統合するために十分ではない。マーモセットにおける実験は、TRA−8投与の肝性の毒性の証拠を示さない。従って、アゴニスト的なモノクローナルDR5抗体は、治療薬剤として、可溶型TRAILよりも、選択的かつ安全である可能性がある。同様に、DR4は、形質転換されたまたは活性化されたか、細胞によって発現され、そして正常細胞(例えば、線維芽細胞)では認知可能な量またはほんのずっと少量でも発現されない。それらの本発明のDR4は、線維芽細胞などのような非標的細胞において認知可能な細胞死を生じずに、特定の標的細胞のアポトーシスを誘導する。本明細書中で使用される場合、効果の不在または認知可能なまたは有意な効果の欠損とは、その効果の完全な不在、あるいはバックグラウンドまたはコントロールレベルより低いか、もしくは等しく、かつバックグラウンドおよびコントロールのレベルが、そのバックグラウンドまたはコントロールレベルの1.5倍より大きくは超過しない効果をいい、そして含む。

0041

スクリーニングアッセイまたは画像ツールとして、本発明は、正常な細胞形態学をなお示し得るDR4細胞またはDR5細胞の小クラスターを検出するためによく適合される。例えば、本発明に従う標識抗体ヒト癌細胞肺癌前立腺癌および肝臓癌を含む)のインサイチュ細胞切片染色は、容易に癌性細胞を同定する。本発明の抗体はまた、他の疾患の症状発現(例えば、慢性関節リウマチのような、様々な炎症性疾患および自己免疫疾患を含む)のスクリーニングにおいて有益である。このようなスクリーニングは、他の臨床的な兆候の発症前であっても有益であり得、そして疾患の危険性を有する被験体をスクリーニングするために用いられ得るから、予防的な処置が、他の兆候または症状の発現以前に開始され得る。特に、癌細胞は、同じ型の正常な細胞と比較して、非常に高いレベルのDR5を発現することが観察されている。従って、本発明は、少なくとも肺、前立腺結腸、血液、、および肝臓を含む組織内における、早期ステージ悪性疾患のための高感度スクリーニング方法として有用性を有する。治療プロセスは、疾患に関連した異常な細胞増殖(例証的に、とりわけ悪性癌およびリンパ性白血病)の阻害について本明細書中で詳述される。

0042

本発明は、TRA−8と命名された、ATCC受託番号PTA−1428を有する抗ヒトDR5モノクローナル抗体について特に本明細書中に詳述される。アゴニストの抗ヒトDR5モノクローナル抗体TRA−8に関して詳述された技術および結果は、アンタゴニストのDR5抗体、並びにアゴニスト様式とアンタゴニスト様式の両方で作用する、DR4、DcR1およびDcR2に対して惹起された抗体に対し全体的に拡張可能かつ適用可能であることが認められている。従って、本発明は、本明細書中で、ヒトDR4に特異的なアポトーシス誘導抗体に関して詳述されている。一つの実施形態において、抗体は、American Type Culture Collection、Rockville、MdでUAB Research Foundationのために受託番号を獲得するため、2001年10月24日に寄託されたハイブリドーマ2E12と同じエピトープ特異性を有する。寄託された材料の説明は、株名2E12および参考事件整理番号PCT/US01/14151を伴う、「2E12 Hybridoma Clone Against Human DR4」であった。Fasのようなアポトーシスレセプターの発現レベルは、アポトーシスに対する細胞の感受性と必ずしも相関しない。TRAIL媒介性アポトーシスに関して、TRAILのデコイレセプターの発現は、細胞の感受性に影響を与えることが示唆されている。さらに、FADDおよびカスパーゼ−8経路を介したアポトーシスシグナルの効果的な伝達のため、DR5はDR4と会合されなければならないことが示唆されている。アゴニストの抗DR5モノクローナル抗体の入手可能性は、DR5シグナル伝達の調節およびTRAIL媒介性アポトーシスにおけるその関連する役割の評価を可能にした。TRA−8媒介性アポトーシスに対する細胞の感受性とTRAIL媒介性アポトーシスに対する細胞の感受性との比較は、TRAIL媒介性アポトーシスにおけるDR5の役割および感受性に影響を与え得る機構に関する見識を提供する。同様の利点がDR4抗体により提供される。

0043

この利点は、一般的に、本発明のヒト化DR5抗体およびヒト化DR4抗体に拡張される。例えば、DR5に対する抗体の分子クローンは、以下の実施例について詳述されるような既知の技術により調製される。組換えDNA方法論(33)は、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築するため、本明細書において有効である。

0044

本発明は、ヒト抗マウス抗体(本明細書中以下に「HAMA」と称される)応答を誘導する見込みがなく(34)、一方で効果的な抗体エフェクター機能をまだ有しているヒト化TRAILレセプター抗体の構築を可能にする。完全なヒト抗体は、完全なヒト抗体を作成することができるマウス(例えば、ヒト抗体を産生するよう遺伝的に改変されたマウス)を免疫し、DR5またはDR4に結合しアポトーシスを誘導し、そしてTRA−8または2E12エピトープと競合するクローンをスクリーニングすることによっても作成され得る。例えば、完全なヒト抗体生成の方法についてその全体が本明細書に参考として援用される、Lonberg and Huszar(1995)Human antibodies from transgenic mice,Int.Rev.Immunol.13:65〜93を参照のこと。本明細書で使用される場合、抗体に関連した用語「ヒト」および「ヒト化」は、ヒト被験体において治療上許容可能な弱い免疫原性応答を誘発すると予想される任意の抗体に関する。

0045

本発明は、DR5抗体、ヒト化抗DR5抗体、TRA−8重鎖免疫グロブリンおよびTRA−8軽鎖免疫グロブリンならびにヒト化重鎖免疫グロブリンおよびヒト化軽鎖免疫グロブリンを提供する。本発明はまた、DR4抗体、ヒト化DR4抗体、DR4抗体の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンならびにヒト化重鎖免疫グロブリンおよびヒト化軽鎖免疫グロブリン、抗体ならびに重鎖および軽鎖をコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、ならびにこれらのベクターを含む細胞を提供する。これらのタンパク質または遺伝子の特定の短縮は、完全配列のタンパク質または完全配列の遺伝子の調節機能または酵素的機能を実行する。例えば、これらをコードする核酸配列は、置換、付加、欠失あるいは機能的に等価なタンパク質または遺伝子を提供する多量体発現により変えられ得る。核酸コード配列縮重のために、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の配列が、本発明の実施において使用され得る。これらは、上記のポリペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部を含む核酸配列を含むが、これに限定されない。この核酸配列は、配列内の機能的に等しいアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により変えられ、従ってサイレント変化を生じる。本発明に従う免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、標準方法(「Current Methodsin Sequence Comparison and Analysis」、Macromolecule Sequencing and Synthesis、Selected Methods and Applications、pp.127〜149、1998、Alan R. Liss,Inc.)により計算される場合、このような改変体がTRAILレセプターDR5を認識する作動的な抗体を形成する限り、25%までの配列相同性バリエーションを許容することが認められている。例えば、ポリペプチド配列内の一つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸配列により置換され得、サイレント変化を生じる。配列内のアミノ酸置換は、そのアミノ酸が所属するクラスの他のメンバーから選択され得る(すなわち保存的置換)。例えば、非極性疎水性)アミノ酸としては、アラニンロイシンイソロイシンバリンプロリンフェニルアラニントリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシンセリンスレオニンシステインチロシンアスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニンリジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本発明の範囲内にまた含まれるものは、翻訳の間または後に例えばグリコシル化タンパク質分解切断抗体分子または他の細胞リガンドとの結合などによって差動的に修飾された、タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体である。加えて、本発明の抗体の核酸配列をコードする組換えベクターは、ベクターのプロセシングまたは発現を改変するために操作され得る。他の改変は、抗体におけるアポトーシス活性の減少なしにまたは実質的な減少なしに、核酸配列またはアミノ酸配列のどちらかにおいて行われ得る。そのような改変は、当該分野において慣用的な技術を使用して、CDR領域または非CDR領域で起こり得る。例えば、CDRウォーキング変異誘発の方法に関して、その全体が本明細書により参考として援用される、Yangら(1995)、J.Mol.Biol.254:392〜403を参照のこと。

0046

加えて、インヒビターをコードする核酸配列は、インビトロまたはインビボにおいて、翻訳開始および/または終結配列を作製および/または破壊するために、あるいはコード領域においてバリエーションを作製するために、そして/あるいは新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するためもしくは既存の部位を破壊して、インビトロの改変をさらに促進するために、変異され得る。当該分野で公知の変異誘発の任意の技術(インビトロの部位特異的突然変異誘発(J.Biol.Chem.253:6551)、Tabリンカー(Pharmacia)の使用などを含むがこれに限定されない)が使用され得る。

0047

X線結晶学データは、抗体免疫グロブリンの折りたたみが、一般的にそれぞれが三つまたは四つのβ鎖から成る二層逆平行βシートを含む長円柱状構造を形成することを示している。可変領域において、H鎖およびL鎖の各Vドメイン由来の三つのループ一緒クラスターを形成して、抗原結合部位を形成する。これらの各ループは、相補性決定領域(CDR)と称される。CDRは、抗体のアミノ酸配列において最も高い可変性を有する。CDRの一部ではない可変領域の一部は、「フレームワーク領域」(「FR」領域)と呼ばれ、一般的にCDR構造の維持において役割を果たす。好ましくは、所定の抗体由来の全てのCDRが、TRAILレセプターエピトープ領域に対する結合領域を保存するために、アクセプター抗体に移植される。CDR総量の一部をドナーに移植することは、本明細書において有効であることが認識されている。移植は一般的に、一つのアミノ酸または領域の残基から残基への、別の残基での置換を伴うことが理解される。しかしながら、時々、特に領域の転移に関して、一つ以上の残基が所望される場合に付加または除外または置換され得、そしてそのような欠失および挿入、ならびに適切な置換および転位は、当業者の範囲内である。

0048

本発明の抗体は、例えば抗TRAILレセプターモノクローナル抗体のL鎖サブユニットおよびH鎖サブユニットの各CDRをヒト抗体の対応するCDR領域に移植し、それによってTRAILレセプターに対して有効なマウスモノクローナル抗体をヒト化することにより得られる。

0049

分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントもまた、公知の技術を用いて本明細書中において生成されるかつ有効である。例えば、そのようなフラグメントとしては、例示的に、抗体分子のペプシン消化により生成され得る抗TRAILレセプター(AB’)2フラグメント、TRAILレセプター(AB’)2フラグメントのジスルフィド結合還元により生成されたTRAILレセプター抗体AB’フラグメント、ならびにパパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することにより生成される抗体フラグメントが挙げられる。

0050

本発明の抗体は、当該分野で公知の多くの技術を使用して生成され得る。一例として、抗DR5モノクローナル抗体TRA−8は、ヒトDR5でマウスを免疫し、マウス由来脾臓細胞またはリンパ節細胞マウスミエローマ細胞とを引き続いて融合させることにより次々に得られ得る、ハイブリドーマを培養することで得られ得る。

0051

モノクローナル抗体の調製は、以下の工程を例示的に包含する:
a)抗原として用いる生体高分子の精製;
b)最初に抗原の注射を使用して動物を免疫し、動物から血を抜き、脾臓を取り出す時点を決定するため、抗体力価をアッセイした後の抗体生成細胞の調製;
c)ミエローマ細胞の調製;
d)抗体産生細胞およびミエローマ細胞を融合する工程;
e)望ましい抗体を生成するハイブリドーマを選択する工程;
f)単一細胞クローンを調製する工程(クローニング);
g)必要に応じて、ハイブリドーマ細胞を培養するか、またはモノクローナル抗体の大規模調製のため、ハイブリドーマ細胞を移植した動物を育てる工程;ならびに
h)このようにして調製したモノクローナル抗体の生物学的活性および特異性を試験するか、あるいはマーカー因子特性をのアッセイする工程。

0052

モノクローナル抗体の調製の手順は、上記の工程を参照して以下に詳述される。本発明の抗体を調製する方法は、調製の方法を例示することを意図しているだけであり、これに限定されることは意図されない。他の公知の手順が先行し得るか、あるいは下記の方法が、例えば、脾臓細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマの使用によって改変され得る。
((a)抗原の調製)
抗原として有効な組換えタンパク質(本明細書以下に「組換えヒトDR5」または「組換えヒトDR4」として言及される)は、ADENO−Quest kit(Quantum Biotechnologies Inc.,Canada)を使用し、QBI−293A細胞をヒトDR5またはヒトDR4の細胞外ドメインおよびヒトIgG1抗体(本明細書以下に「IgG」として言及される)のFc領域、(PTA−1428を参照のこと)を含む融合タンパク質の発現ベクターpAdDR5−IgGでトランスフェクトして、このタンパク質を発現させ、そして発現産物収集し、部分的に精製することによって、得られる。プラスミドpAdDR5−IgGは、ヒトDR5またはヒトDR4およびヒトIgG融合タンパク質をコードするDNAを、動物細胞の発現ベクターであるpAdCMV5に挿入することで構築される。他の材料、例えばDR5またはDR4をコードするDNA、ベクターおよび宿主は、本明細書中で有効である。

0053

ベクターpAdDR5−IgGでトランスフェクトされたQBI−293A細胞の培養物上清において生成されるヒトDR5またはヒトDR4およびIgG融合タンパク質は、プロテインAセファロースアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインG−セファロースアフィニティークロマトグラフィー、あるいはResource Qカラム商標名;Pharmacia)を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより部分的に精製され得る。

0054

あるいは、ヒト細胞株細胞膜から得た精製DR5または精製DR4は、抗原として使用される。さらに、DR4およびDR5の一次構造が既知なので(PTA−1428を参照のこと)、配列番号(SEQID No.)1のアミノ酸配列を含むペプチドは、公知の方法(例えばサンガー法)により化学的に合成され得、抗原として使用され得る。
((b)抗体産生細胞の調製)
マウスを、以下の工程において生成された免疫原で免疫する;
(a)アジュバント(例えば、フロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントあるいはミョウバン)と混合する。他の適した実験動物としては、例示的に、ラットモルモットウサギイヌニワトリウマブタウシおよびヒツジが挙げられる。

0055

実験動物を免疫するために適した投与経路としては、皮下注射経路、腹腔内注射経路、静脈内注射経路、皮内注射経路、および筋肉注射経路が挙げられ、皮下注射および腹腔内注射が好まれる。

0056

免疫は、単回用量により、または適切な間隔(好ましくは1〜5週間)で数回の反復用量により必要に応じて行われる。免疫された動物は、血清内の抗体力価についてモニターされ、十分に高い抗体力価を有する動物は、抗体産生細胞供給源として選択される。高い力価を有する動物の選択は、続きの工程をより効果的にする。後の融合のための細胞は、最後の免疫の3〜5日後の動物から一般的に収集される。

0057

抗体力価をアッセイする方法は、様々な周知の技術(例えば、放射免疫アッセイ(本明細書以下に、「RIA」として言及される)、固相酵素免疫アッセイ(本明細書以下に、「ELISA」として言及される)、蛍光抗体アッセイおよび受動的血球凝集反応アッセイが含まれ、検出感度、速度、精度および自動化の可能性の理由でRIAおよびELISAが好まれる。

0058

抗体力価の決定は、例えばELISAにより、以下のとおりに行われ得る。最初に、精製または一部精製したDR5またはDR4が、例えば96ウェルELISAプレートのような固相の表面上に吸着され、その後にDR5またはDR4が結合していない任意の残存表面を、抗原に関係ないタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミンBSA))でブロッキングすることが続く。洗浄後、ウェル表面に、サンプル内のDR5抗体またはDR4抗体の抗原に対する結合を可能にするため、マウス血清の連続希釈サンプルを接触させる。二次抗体として標識された抗マウス抗体が、マウス抗体に結合させるため添加される。その標識としては、酵素標識蛍光標識または当該分野で公知の他の標識が挙げられ得る。洗浄後、酵素基質が添加され、基質などの変化により生じた発色に起因する吸光度変化の測定により、抗体力価が推定される。

0059

((c)ミエローマ細胞の調製)
確立されたマウス細胞株(例えば、8−アザグアニン耐性マウスを含む)由来の細胞は、BALB/cミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3−U1)(35)、P3/NSI/1−Ag4−1(NS−1)(36)、Sp2/0−Ag14(SP−2)(37)、P3X63Ag8.653(653)(38)およびP3X63Ag8(X63)(39)由来のミエローマ細胞の供給源として働く。選択された細胞株は、例えば8−アザグアニン培地のような適切な培地に連続的に移される。8−アザグアニン培地は、Iscove改変Dulbecco培地(本明細書以下に、「IMDM」として言及される)またはDulbecco改変Eagle培地(本明細書以下に、「DMEM」として言及される)を含む。RPMI−1640培地は、グルタミン、2−メルカプトエタノールゲンタマイシンウシ胎仔血清(本明細書以下に、「FCS」として言及される)、および8−アザグアニンで補充されている。次に、細胞は、少なくとも2×107細胞が融合の日に有効となることを確実にするため、融合3〜4日前に、例えば10%FCSを含むASF104培地(Ajinomoto,K.K.)のような通常培地に移される。

0060

((d)細胞融合
動物の任意の適した部分から得られるリンパ球および形質細胞は、抗体を産生するための前駆細胞である。リンパ球または形質細胞の供給源としては、例えば脾臓、リンパ節末梢血またはそれらの任意の適切な組みが挙げられ、脾臓細胞が最も一般的な供給源である。

0061

最後の追加免疫注射の後、抗体産生細胞が存在する組織は、あらかじめ決定された抗体力価を有するマウスから取り出される。工程c)において調製される骨髄腫細胞と脾臓細胞との融合についての現在好ましい技術は、ポリエチレングリコールを用いる。

0062

融合技術は、脾臓細胞と骨髄腫細胞との数の割合が、約5:1と10:1との間になるよう、無血清培地(例えば、RPMI1640)またはリン酸緩衝化生食塩水(本明細書以後、「PBS」としていう)で脾臓細胞および骨髄腫細胞を洗浄し、次に遠心分離することを含む。上清廃棄され、そしてペレット化細胞が、十分にほぐされた後、50%(w/v)のポリエチレングリコール(分子量1,000〜4,000)を含む無血清培地1mlは、混合しながら懸濁液に滴下される。次に、10mlの無血清培地が、ゆっくり添加され、そして次に遠心分離される。上清は、再び廃棄され、そしてペレット化細胞は、ヒポキサンチンアミノプテリンおよびチミジン(本明細書以後、「HAT」という)ならびにマウスインターロイキン−2(本明細書以後、「IL−2」という)の溶液を含む適切量のHAT培地中に懸濁される。懸濁液は次に、培養プレート(本明細書以後、単に「プレート」という)のウェルに分配され、そして37℃で、5% v/v CO2の存在下で、約2週間インキュベートされる(適切なように、補足的にHAT培地を追加しながら)。

0063

((e)ハイブリドーマの選択)
使用される骨髄腫株が、8−アザグアニンに抵抗性である(すなわち、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)酵素が欠損している)場合、あらゆる非融合骨髄腫細胞およびあらゆる骨髄腫−骨髄腫融合体は、HAT培地中では生存不可能である。一方、お互いが抗体産生細胞である融合体、ならびに抗体産生細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマは、生き残り得、前者のみが限定された寿命を有する。従って、HAT培地中でインキュベートを継続すると、所望のハイブリドーマのみが選択される。

0064

生じたハイブリドーマは増殖してコロニーとなり、これは次にアミノプテリンを欠いたHAT培地(HT培地)に移される。その後、培養上清アリコートは、例えば、ELISAにより抗Fas抗体力価を決定するために取り出される。上述の融合タンパク質が、ELISA抗原として使用される場合、ヒトIgG1のFc領域に特異的に結合する抗体を産生するクローンを取り除くこともまた必要である。このようなクローンの存在または非存在は、例えば、Fas−IgG1またはIgG1を抗原として用いるELISAによって確認され得る。

0065

((f)クローニング)
次に、抗体力価を決定するための工程b)に述べられた方法と同様の方法を用いて、特異的抗体を産生することが示されたハイブリドーマは、クローニングのために別のプレートに移される。適したクローニング方法は、以下を含む:プレートの1ウェルあたり1細胞を含むようにハイブリドーマが希釈され、次いで培養される限界希釈法軟寒天培地における培養の後にコロニーが回収される軟寒天法;培養のために単一細胞に分けるためにマイクロマニピュレーターを使用する方法;およびセルソータにより単一細胞が、分けられる「クローン選別(sort−a−clone)」。

0066

例えば、限界希釈法によるクローニング手順は、抗体力価を表す各ウェルについて2〜4回繰り返され、そして安定な抗体力価を有するクローンが、抗DR5モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択される。抗マウスDR5抗体を生産するハイブリドーマは、抗DR5モノクローナル抗体産生細胞株を得るために同様の方法によって選択される。

0067

本発明の抗体について基本であるマウス—マウスハイブリドーマTRA−8は、American TypeCilture Collectionに2000年3月1日に寄託され、そして受託番号PTA−1428を有する。2E12ハイブリドーマは、上記のように、American Type Cilture Collectionに2001年10月24日に寄託され、そして受託番号ATCC番号PTA−3798を有する。従って、マウス—マウスハイブリドーマTRA−8または任意の他の確立されたハイブリドーマを使用して抗体を準備する場合、調製は、工程(a)〜工程(f)を除外した以下の工程(g)から始まる以下の手順により行われ得る。

0068

((g)モノクローナル抗体の調製のためのハイブリドーマの培養)
クローニングによって得られたハイブリドーマは、次にHT培地でない通常培地において培養される。大規模培養は、大きな培養ボトルを使用したローラーボトル培養またはスピナー培養によって行わる。次に、大規模培養からの上清は、本発明の抗体についての基本であるDR5またはDR4モノクローナル抗体を得るために、当業者に周知のゲル濾過のような適切な方法によって収集され、そして精製される。ハイブリドーマはまた、大容量のDR5またはDR4モノクローナル抗体を含む腹水を得るために、BALB/cマウスまたはnu/nuマウスのような同系マウスにおいて、腹腔内で増殖され得る。市販のモノクローナル抗体精製キット(例えば、MAbTrapGII Kit;Pharmacia)は、収集され抗体の精製に簡便に用いられている。

0069

上で調製されたモノクローナル抗体は、それぞれヒトDR5またはDR4について高い特異性を有する。

0070

((h)モノクローナル抗体のアッセイ)
モノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの適切な同定方法としては、オークターロニー方法、ELISAおよびRIAが挙げられる。好ましくは、同定には、Mouse Typer Kit(商標;BioRad)のような市販のキットを使用する。

0071

タンパク質の定量は、Folin−Lowry法または280nm(1.4(OD280)=免疫グロブリン1 mg/ml)の吸光度を基にした計算によって、行われ得る。

0072

モノクローナル抗体が認識するエピトープの同定は、以下のように行われる。第1に、モノクローナル抗体が認識する分子の種々の部分構造が、調製される。この部分構造は、この方法によって調製され、ここで、分子の種々の部分ペプチドは、既知のオリゴペプチド合成技術によって合成的に調製される方法、または所望の部分ポリペプチドをコードするDNAが、適切な発現プラスミド中に組み込まれ、そしてE.coliのような適切な宿主中で発現されて、このペプチドが産生される方法によって調製される。一般に、両方法は、上記の目的のために頻繁に組み合わせて使用される。例えば、抗原タンパク質C末端またはN末端からはじめて、適切に減少した長さを有する一連のポリペプチドは、確立された遺伝子工学技術によって調製され得る。抗体と反応するフラグメントを確立することによって、エピトープ部位のおおよその見当が得られる。

0073

エピトープは、抗DR5モノクローナル抗体に対するこのペプチドの結合特性を決定するために確立されたオリゴペプチド合成技術を用いて、このペプチドかまた、その変異体に対応する種々のより小さなオリゴペプチドを合成することによってより綿密に同定される。例えば、エピトープは、本発明の抗体の調製およびモノクローナル抗体を用いた抗原に対するペプチドの競合的結合阻害について基礎となる。SPOTs Kit(Genosys Biotechnologies,Inc.)およびマルチピン(multipin)合成法を基礎とする一連のマルチピンペプチド合成キット(Chiron Corp.)のような市販のペプチド合成キットは、多種類のオリゴペプチドを得るために簡便に使用され得る。

0074

本発明の抗体は、以下に示されるa)〜f)の種々の機能的特性を有し、例えば、これらは各々は、本明細書の以下に記載される方法によって確認される。

0075

(a)ヒトDR5発現細胞に対するTRA−8の特異的結合
本発明の特有の特性は、細胞表面のDR5に結合する能力である。これは、DR5発現細胞のフローサイトメトリー解析によって示される。第1に、DR5の特異的細胞表面結合は、ヒトDR5をコードする全長cDNAがトランスフェクトされたCOS−7細胞によって確認される。詳細には、TRA−8は、DR5がトランスフェクトされたCOS−7のみを認識し、空のコントロールベクターまたはDR4をコードするベクターでトランスフェクトされたCOS−7は認識しない。第2に、3つの異なる起源(ヒト悪性腫瘍細胞造血癌、グリオーマおよび前立腺癌)が試験される。発現レベルは大きく変化するが、これらのトランスフォームした腫瘍細胞の大部分は、有意なレベルの細胞表面DR5を発現した。第3に、RA患者およびOA患者から得たヒト初代滑膜線維芽細胞の2つのパネルが、調査される。全てのRA滑膜細胞は、OA細胞と比較して有意に高いレベルのDR5を発現した。

0076

(b)架橋のないインビトロにおいてのヒト悪性腫瘍細胞のアポトーシスの誘導)
本発明に従って惹起された抗体が、TRAILレセプターを認識する能力、および悪性ヒト腫瘍細胞のアポトーシスを直接的に誘導する能力は、インビトロで種々の濃度の抗体(特に、TRA−8)とともに細胞を培養する間、細胞生存率アッセイ(ATPLite)により決定される。大部分の腫瘍細胞は、TRA−8の誘導するアポトーシスに対して感受性である。いくらかの細胞にとって、TRA−8は、強力なアポトーシス誘導活性を示した(例えば、TRA−8は、pg/mlレベル内でヒトJurkat細胞のアポトーシスを誘導し得る)。重要なことには、TRA−8の誘導するアポトーシスは、架橋を必要とせず、そしてほとんどの細胞において、TRA−8は、エンハンサーの存在下で、組み換え可溶性TRAILよりも強力なアポトーシス誘導活性を示した。

0077

(c)インビボにおけるTRA−8の腫瘍殺傷活性)
TRA−8の腫瘍殺傷活性は、2つのSCID/ヒト腫瘍細胞モデルにおいて評価される。第1に、SCIDマウスは、ヒト白血病Jurkat細胞を静脈内に接種され、TRA−8の1用量(100μg)で処置される。この結果は、大部分の移植Jurkat細胞が、TRA−8で処置することにより末梢血および脾臓から取り除かれることを示す(Jurkat細胞のフローサイトメトリー分析およびインサイチュ免疫組織化学染色によって決定された)。第2に、ヒト星状細胞腫細胞1321N1はSCIDマウスに皮下接種され、そして腫瘍保有マウスは、TRA−8の1用量で処置される。移植された1321N1細胞の増殖は、TRA−8処置マウスにおいて有意に阻害される(腫瘍の大きさ、および組織学的解析によって決定された)。

0078

(d)TRA−8によるRA滑膜細胞の同定)
8人のRA患者および4人のOA患者から単離された初代滑膜細胞は、DR5の細胞表面発現について試験される。TRA−8は、全てのRA細胞をポジティブに染色し得ないが、全てのOA細胞はネガティブに染色し得る。従って、RAは、TRA−8によって検出されるようなDR5の表面発現によってOAから識別される。

0079

(e)RA滑膜線維芽細胞におけるTRA−8によるアポトーシスの誘導)
TRA−8がRA滑膜細胞のアポトーシスを誘導する能力は、種々の濃度のTRA−8の存在するインビトロ培養の間、細胞生存率アッセイによって決定される。全てのRA細胞は、100ng/mlのTRA−8に対しての高レベル中間レベルまでの感受性を示した。対照的に、全てのOA細胞は、TRA−8の誘導するアポトーシスに対して本質的に耐性がある。重要なことに、TRA−8は、エンハンサーを用いた可溶性TRAILよりもRA滑膜細胞に対して、より良好なアポトーシス誘導活性を示した。さらに、抗Fas抗体(CH−11)と比較して、TRA−8は、RA滑膜細胞に対してより良好な選択性を示した。

0080

(f)TRA−8は、RA滑膜細胞においてMMPの産生を誘導しない)
TRA−8は、TNF−aとしてRA滑膜細胞において、NF−kb活性化を誘導し得るので、滑膜細胞のMMP1およびMMP3の産生に対するTRA−8の影響が、決定される。TNF−aは、MMPの用量依存性増加を誘導した一方、TRA−8は、MMPの任意の産生を誘導することができず、そしてある濃度において、TRA−8は、RA滑膜細胞において、MMPの産生をわずかに減少させた。

0081

(g)TRA−8は、多様なカスパーゼ活性化を誘導する)
カスパーゼは、アポトーシスの誘導に重要な役割を果たすので、TRA−8がカスパーゼの活性化を誘導する能力は、ヒトJurkat細胞において決定される。Jurkat細胞が、低用量(50ng/ml)のTRA−8とともにインキュベートされた場合、カスパーゼ8、カスパーゼ9およびカスパーゼ3の活性化は、ウエスタンブロット分析およびカスパーゼ切断分析によって示されるようにインキュベーション後15分という早さで観察される。カスパーゼの活性化の時期、数および強さの観点から、例示の抗体TRA−8を含め、本発明の抗体は、抗ヒトFas抗体(CH−11)のようなあらゆる他の既知のアポトーシス誘導抗体よりもさらに良い活性を示した。

0082

2E12抗体は、その可溶性形態において、特異的にDR4を結合し、DR4を発現する標的細胞(例えば、癌細胞、慢性関節リウマチ滑膜細胞、活性化リンパ球のような活性化免疫細胞およびウイルス感染細胞などが挙げられる)において、インビボおよびインビトロのアポトーシス誘導活性を有し、インビボで腫瘍殺傷活性を有する(好ましくは、非腫瘍細胞に対して毒性の無い)。好ましくは、本発明のDR4抗体は、30μg/ml、3μg/ml、0.3μg/mlまたは0.03μg/ml未満の抗体濃度で、約60%、50%、40%、30%、20%または10%未満の標的細胞生存率で特徴付けられるアポトーシス誘導活性を有し、また腫瘍の大きさにおいて、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%の縮小により特徴付けられる腫瘍殺傷活性を有する。従って、本発明の抗体は、効果(a)および(g)に示すような病原性細胞において、選択的にアポトーシスを誘導する特性を有する物質である。従って、それは、細胞の不適切な生存または細胞の不適切な増殖に関連する疾患(Fas/Fasリガンド系を含むアポトーシス系の調節不全に起因し得る疾患)について、予防剤および治療剤として有用である。

0083

本発明の抗体がアポトーシスを誘導する能力は、ヒト白血病細胞株Jurkat細胞(American Type Culture番号TIB−152)および星状細胞株1321N1のような細胞を試験サンプルが加えた培地中で培養すること、そして例えば、ATPLiteアッセイによって生存率を決定により確かめられる。

0084

本発明の抗体(特にヒト抗体のものとほとんど同じヒトへの免疫原性を有するDR5およびDR4抗体)は、不適切な細胞の生存または増殖に関連する、疾患の予防剤または処置剤として用いられ、この疾患としては、炎症および自己免疫の疾患におけるアポトーシス系の調節不全に起因し得るものが挙げられ、この炎症および自己免疫の疾患としては、例として、全身性エリテマトーデス橋本病、慢性関節リウマチ、宿主移植片病、シェーグレン症候群悪性貧血アジソン病硬皮症グッドパスチャー症候群クローン病、自己免疫溶血性貧血生殖不能症、重症筋無力症多発性硬化症、バセドー病、血栓不足紫斑病インスリン依存糖尿病アレルギー喘息アトピー疾患;動脈硬化症心筋炎心筋症糸球腎炎再生不良性貧血臓器移植後拒絶反応ならびに肺、前立腺、肝臓、卵巣、結腸、リンパ組織および胸組織の多数の悪性腫瘍が挙げられる。本発明の抗体を用いて、活性化された免疫細胞を標的化し、アポトーシスを選択的に誘導し得、これらの標的化された細胞が、特異的なTRAILレセプター(すなわち、DR4またはDR5)を発現させ、または発現させ得る限り、この細胞としては、活性化されたリンパ球、リンパ性細胞、脊髄細胞、およびリウマチ様滑液細胞(炎症性滑液細胞、マクロファージ様滑液細胞、繊維芽細胞様滑液細胞を含む)、およびウイルス性感染細胞(例えば、HIVに感染したものを含む)が挙げられる。

0085

このような予防剤または治療剤は、種々の形態で投与され得る。適切な投与の様式は、錠剤カプセル剤粒剤粉末剤およびシロップ剤の様な経口投与または注射もしくは坐剤のような非経口投与を含む。

0086

この抗体または治療剤が、経口で、直腸で、槽内で、心室内(脳室内)で、頭蓋内で、骨髄腔内で、関節内に、内に、非経口的に(静脈内に、筋肉内に、または皮下に)、局部的に(粉末剤、軟膏、または滴剤)、腹膜内注射により、経皮的に、吸入により、または口内もしくは鼻腔スプレ−として、投与され得る。必要とされる抗体の正確な量または治療剤の正確な量は、被験体により変わり、これは、被験体の年齢、体重および一般的条件、処置される疾患の重篤度、腫瘍の位置および大きさ、使用される特定の化合物、投与の様式などに依存する。適切な量は、本明細書中の教示と慣用的な実験のみを用いて、当該者によって決定され得る。代表的な抗体の1回分投薬量は、0.1μg〜10,000μgの範囲にわたり、好ましくは、1μgと100μgとの間の範囲にわたる。代表的なキャリア内の抗体濃度は、送達される1ml当たり、0.2ng〜2000ngの範囲にわたる。関節への注射について、抗体およびキャリアの体積は、その関節に依存するが、しかしおよそ0.5ml〜10ml、好ましくは1ml〜5mlが、ヒトの膝関節に注射され、およそ0.1ml〜5mlそして好ましくは1ml〜2mlがヒトの足関節に注射される。

0087

投与の意図された様式に依存して、抗体または治療剤は、固体半固体、または液体調剤の形態において、薬学的組成物であり得、その形態は例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、液剤、または懸濁液剤、好ましくは、正確な投薬量の一回の投与に適切な投薬形態である。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせで有効量の選択された基質を含み、さらに、他の医薬薬学的薬剤、キャリア、または希釈液を含み得る。「薬学的に受容可能」とは、生物学的またはそれ以外で所望されないことはない物質を意味し、この物質は、重大な所望されない生物学的効果を引き起こすことも、この物質が含まれる薬学的組成物の他の成分のいずれかと有害な様式において相互作用することもなしに、選択された基質と一緒に個体へ投与され得る。

0088

非経口的注射に適切な組成物は、生理学的に受容可能な減菌した水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、および減菌された注射可能溶液または分散液への再構成のための減菌された粉末を含み得る。適切な水性、および非水性キャリア、希釈液、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノ−ル、ポリオ−ル(プロピレングリコ−ル、ポリエチレングリコ−ル、グリセロ−ルなど)、これらの適切な混合物植物油オリ−ブオイルのような)およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機物エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコ−ティングの使用により、分散剤の場合必要とされる粒子の大きさの保持により、および界面活性剤の使用により、保持され得る。

0089

これらの組成物はまた、保護剤湿潤剤乳化剤、分配剤のようなアジュバントを含み得る。微生物の活動を妨げることは、例えば、パラベンクロロブタノ−ル、フェノ−ル、ソルビン酸などの、種々の抗菌剤および抗真菌剤により、確実にされ得る。例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等浸透圧剤を含むこともまた、所望され得る。注射可能な薬学的形態延長された吸収が、吸収を遅らせる薬、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することで、もたらされ得る。

0090

経口投与のための固体投薬形態としては、カプセル剤、錠剤、丸薬、粉末剤、および粒剤が挙げられる。このような固体投薬形態において、活性な化合物は、少なくとも一つの不活性な慣習的な賦形剤(またはキャリア)と混ぜられ、ここで賦形剤としては、クエン酸ナトリウムもしくはジカルシウムホスフェ−トまたは(a)フィラ−もしくは増量剤、例えば、スタ−チ、ラクト−ス、スクロ−ス、グルコ−ス、マンニト−ル、および珪酸、(b)結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロ−スアルギネ−ト(alignate)、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロ−ス、およびアカシア、(c)湿潤剤(humectant)、例えば、グリセロ−ル、(d)崩壊剤、例えば、寒天、カルシウムカ−ボネ−ト、ジャガイモまたはタピオカデンプンアルギン酸、特定の珪酸塩複合体、およびナトリウムカ−ボネ−ト、(e)溶液抑制剤、例えば、パラフィン、(f)吸収促進剤、例えば、4級アンモニウム化合物、(g)湿潤剤(wetting agent)、例えば、セチルアルコ−ル、およびモノステアリン酸グリセロ−ル、(h)吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに(i)潤滑剤、例えば、タルクステアリン酸カルシウムステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコ−ル、ラウリル硫酸ナトリウム、またはその混合物である。カプセル剤、錠剤、および丸薬の場合、投薬形態はまた、緩衝剤を含み得る。

0091

同様な型の固体組成物はまた、ラクト−スまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコ−ルなどの様な賦形剤を用いる、ソフト充填カプセル剤およびハ−ド充填カプセル剤においてフィラ−として利用され得る。

0092

錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸薬、および粒剤のような固体投薬形態が、当該分野で周知の腸溶性コ−ティングおよび他のものといった、コ−ティングおよび殻を用いて調製され得る。これらは不透明化剤を含み得、また、これらが、遅延された様式で腸管のある部分で活性な化合物を放出するような組成物であり得る。使用され得る組成物を埋め込む実施例は、ポリマ性物質およびワックスである。活性な化合物はまた、適切な場合、1つ以上の上記の賦形剤を有する、マイクロカプセル化形態であり得る。

0093

経口投与のための液体投薬形態には、薬学的に受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。活性な化合物に加えて、液体投薬形態は、当該分野で一般的に使用される、不活性な希釈液、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコ−ル、イソプロピルアルコ−ル、エチルカ−ボネ−ト、エチルアセテ−ト、ベンジルアルコ−ル、ベンジルベンゾエ−ト、プロピレングリコ−ル、1,3−ブチレングリコ−ル、ジメチルホルムアミド、油、詳細には、綿実油、アメリカホドイモ油、トウモロコシ油、オリ−ブ油、ひまし油およびゴマ油、グリセロ−ル、テトラヒドロフルフリルアルコ−ル、ポリエチレングリコ−ルならびにソルビタン脂肪酸エステルまたはこれらの物質の混合物などを含み得る。

0094

このような不活性な希釈液に加えて、組成物もまたアジュバント(湿潤剤、乳化剤および懸濁剤甘味料調味料、ならびに香料)を含み得る。

0095

懸濁液は、活性な化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化されたイソステアリルアルコ−ル、ポリオキシエチレンルビト−ルおよびソルビタンエステル微小結晶セルロ−ス、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天ならびにトラガカント、またはこれらの物質の混合物、など、を含み得る。

0096

直腸投与についての組成物は、好ましくは坐剤であり、これは本発明の化合物と適切な非刺激賦形剤またはキャリア(例えば、ココアバタ−、ポリエチレングリコ−ルまたは坐剤ワックス(これらは常温で固体だが体温で液体であり、従って、直腸または膣腔において溶融し、活性成分を放出する))と本発明の化合物を混合することによって調製され得る。

0097

本発明の化合物の局所的投与のための投薬形態としては、軟膏、粉末薬、スプレ−、および吸入薬が挙げられる。活性成分は、減菌された条件下で生理学的に受容可能なキャリアおよび予防剤、緩衝液、または推進体と必要な場合に混合される。眼用処方物、軟膏、粉末薬、および溶液もまた本発明の範囲内にあるものとして、企図される。

0098

本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能な塩、エステル、アミド、およびプロドラッグ」は、本発明の化合物のカルボキシレ−ト塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミドおよびプロドラッグをいい、これらは、正常な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激アレルギ−反応などを有さないで患者の組織に接触して使用することに適切で、合理的な利益/危険率にふさわしく、意図された使用に有効であり、そして、可能な場合、本発明の化合物の多価イオン形能である。用語「塩」は、本発明の化合物の比較的無毒で、無機および有機酸付加塩をいう。これらの塩は、この化合物の最後の単離および精製の間にインサイチュで調製され得るか、または遊離塩基形態において精製された化合物を適切な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、このように形成された塩を単離することにより調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩塩酸塩ヒドロクロリド硫酸塩、重硫酸塩硝酸塩酢酸塩シュウ酸塩吉草酸塩オレイン酸塩パルミチン酸塩ステアリン酸塩ラウリン酸塩ホウ酸塩安息香酸塩乳酸塩リン酸塩トルエンスルホン酸塩クエン酸塩マレイン酸塩フマル酸塩コハク酸塩酒石酸塩ナフチル酸塩、メシレ−ト、グルコヘプト酸塩、ラクトビオネ−ト、メタンスルホン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。これらは、アルカリ金属およびアルカリ土類金属(ナトリウム、リチウムカリウム、カルシウム、マグネシウム、など)ならびに無毒のアンモニウム、第4級アンモニウムおよびアミンカチオン(アンモニウム、テトラメチルアンモニウムテトラエチルアンモニウムメチルアミンジメチルアミントリメチルアミントリエチルアミンエチルアミンなどを含むが、これらに限定されない)に基づくカチオンを含む。(例えば、本明細書中に参考として援用されるS.M.Bargeら、「Pharmaceutical Salts,」J.Pharm.Sci.,1977,66:1−19を参照のこと)。

0099

用語「プロドラッグ」は、インビボで急速に変化し、例えば、血液中での加水分解により、上記式の親化合物を生じる化合物をいう。A.C.S.Symposium SeriesのT.HiguchiおよびV.Stella,“Pro−drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14、ならびにBioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche編,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987において詳細な考察が提供されている。

0100

標的細胞は、動物の細胞であり、例示的には、ヒト、非ヒト霊長類ネコ、イヌ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ブタ、キヌザルケナガイタチが挙げられる。

0101

加えて、本発明の抗体または治療剤は、非溶媒和形態、ならびに水、エタノ−ルなどの様な薬学的に受容可能な溶媒を用いる溶媒和形態において存在し得る。一般的には、溶媒和形態は、本発明の目的のために非溶媒和形態と同等と考えられる。

0102

抗体分子は、公知の技術により精製され、この技術には、例示的には、アミノ吸収クロマトグラフィ−もしくはアミノ親和クロマトグラフィ−、高圧液体クロマトグラフィ−の様なクロマトグラフィ−技術、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

0103

本発明の別の局面は、生物学的に活性な抗TRAILレセプタ−抗体またはヒト化抗TRAILレセプタ−抗体の脊椎動物への送達における使用のための薬学的産物を含む。薬学的産物は、薬学的有効量の抗TRAILレセプタ−抗体またはそのフラグメント、薬学的に受容可能なキャリア、ならびに減菌様式でキャリアおよび抗体を封入する容器を含む。

0104

本発明の好ましい実施形態において、薬学的有効量の本発明の抗体は、標的細胞との接触により細胞の増殖を妨げるか、またはアポト−シスを誘導する。薬学的有効量またはある量の抗体(DR5もしくはDR4のいずれかを認識する)またはヒト化抗体(DR5もしくはDR4のいずれかを認識する)は、所望される効果を引き起こすのに十分な、個体に投与される量である。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的有効量」および「治療の量」は、同義である。DR5またはDR4を認識する抗体の薬学的有効量の投与の所望される効果としては、1つ以上の標的細胞の死、1つ以上の標的細胞の増殖抑制、DR5またはDR4各々への刺激、DR5またはDR4各々への結合、および標的細胞における増大したNFkBレベルまたはNFkB活性が挙げられる。標的細胞は、DR5またはDR4を発現する細胞であり、例示的に、異常に増殖した細胞および腫瘍細胞(乳頭腫およびいぼ乳癌結腸癌肝癌白血病、肺癌、メラノ−マ、骨髄腫、骨肉腫卵巣癌膵臓癌、前立腺癌、頭または首の癌、甲状腺癌子宮癌、星状細胞腫のような脳の腫瘍)、活性化免疫細胞(例えば、活性化リンパ球、リンパ系細胞および骨髄細胞)、炎症性の細胞、慢性関節リウマチ滑液細胞、およびウイルス感染細胞が挙げられる。インビボにおいて、標的細胞は病理学的状態を有する個体の細胞であり、この状態としては、細胞の増殖が、異常または調節不全(例えば、悪性の癌または良性の癌および慢性関節リウマチ)である状態である。

0105

別の好ましい実施形態において、標的細胞をまた、治療剤と接触させる。従って、本発明の抗体および組成物は、単独かまたは1以上の治療剤と組み合わせて投与され得る。治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:TNFファミリ−の他のメンバ−、化学療法剤、抗体、抗ウイルス剤ステロイド抗炎症剤および非ステロイド抗炎症剤、従来の免疫治療剤サイトカインケモカイン、ならびに/または増殖因子併用剤(combination)は、付随して(例えば、混合物として)か、別々であるが同時に(例えば、別々の静脈内ラインを介して同じ被験体に)か、または連続的に(例えば、化合物または薬剤のうちの一方を最初に与えて、次いで第2の化合物または薬剤を与える)かのいずれでも投与され得る。従って、用語「併用(combination)」または「組み合わせた(combined)」は、2つ以上の薬剤の不随投与、同時投与、または連続的投与のいずれかをいうために使用される。

0106

一実施形態において、併用治療は、TNFファミリ−のメンバ−の投与を包含する。本発明の抗体と共に投与され得るTNF、TNF関連分子またはTNF様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:可溶性形態のTNF−α、リンホトキシン−α(LT−α、TNF−βとしても公知)、LT−β(複合体ヘテロトリマ−LT−α2−βで見出される)OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4−1BBL、DcR3、OX40L、TNF−γ(WO96/14328)、TRAIL、AIM−II(WO 97/34911)、APRIL(J.Exp.Med.188:1185−90)、エンドカイン−α(W098/07880)、TR6(WO 98/30694)、OPGおよび神経成長因子(NGF)、ならびにFas、CD30、CD27、CD40および4−IBBの可溶性形態、TR2(WO96/34095)、DR3(W097/33904)、DR4(WO 98/32856)、TR5(WO 98/30693)、TRANK、TR9(WO98/56892)、TRIO(WO 98/54202)、312C2(WO 98/06842)、およびTR12、ならびにCD154、CD70、およびCD153の可溶性形態。

0107

別の実施形態において、本発明の抗体は、天然に存在する、合成または操作したCD40リガンド(CD40L)と組み合わせて投与され、これらとしては、例えば、以下が挙げられるCD40Lの可溶性形態(例えば、AVREND)、CD40Lの生物学的に活性なフラグメント、改変体または誘導体、CD40L抗体(例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体)、および/あるいはCD40抗体(例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体)。

0108

さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、以下の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上と組み合わせて投与される:タクロリムス(Fujisawa)、サリドマイド(例えば、Celgene)、抗Tac(Fv)−PE40(例えば、Protein Design Labs)、inolimomab(Biotest)、MAK−195F(Knoll)、ASM−981(Novartis)、インタロイキン−1レセプタ−(例えば、Immunex)、インタ−ロイキン−4レセプタ−(例えば、Immunex)、ICM3(ICOS)、BMS−188667(Bristol Myers Squibb)、抗−TNF Ab(例えば、Therapeutic Antibodies)、CG−1088(Celgene)、抗B7モノクロナル抗体(例えば、Innogetics)、MEDI−507(BioTransplant)、およびABX−CBL(Abgenix)。

0109

本発明によれば、本発明の抗体を、Fasリガンド(Fas−L)、またはFasに結合してアポト−シスを引き起こす生物学的シグナルを伝達するFas抗体と共に投与し得る。好ましくは、本方法に従って使用するFas抗体は、モノクローナル抗体である。

0110

特定の実施形態において、本発明の抗体は、抗レトロウイルス剤ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−、および/またはプロテアゼインヒビタ−を組み合わせて投与される。本発明の抗体と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:RETROVIR(登録商標)(ジドブジン/AZT)(Gaxo−Wellcome、Research Triangle Park、NC)、VIDEX(登録商標)(ジダノシン/ddI)(Bristol−Myers Squibb、New York)、HIVID(登録商標)(ザルシタビン/ddC)(Roche、Nutley、New Jersey)、ZERIT(登録商標)(スタブジン)(Bristol−Myers Squibb)。本発明の抗体と組み合わせて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:VIRAMUNE(登録商標)(ネビラピン)(Boehringer Ingelheim/Roxanne、Columbus、Ohio)、RESCRIPTOR(登録商標)(デラビルジン)(Phannacia &Upjohn Company、Kalamazoo、Michigan)、およびSUSTIVA(登録商標)(エファビレンツ)(Bristol−Myers Squibb)。

0111

本発明の抗体と組み合わせて投与され得るプロテア−ゼインヒビタ−としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:CRIXIVAN(登録商標)(硫酸インジナビル)(Merck & Company、Whitehouse Station、NJ)、NORVIR(登録商標)(リトナビル)(Abbott Laboratories、Chicago、IL)、INVIRASE(登録商標)(サキナビル)(Roche Pharmaceuticals、Nutley、NJ)、およびVIRACEPT(登録商標)(ネルフィナビル)(Agouron Pharmaceuticals、SanDiego、CA)。特定の実施形態において、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−、および/またはプロテア−ゼインヒビタ−は、AIDSを処置するためおよび/またはHIV感染を予防もしくは処置するために、本発明の組成物との任意の組み合わせにおいて使用され得る。

0112

他の実施形態において、本発明の抗体は、抗日和見感染剤と組み合わせて投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トリメトプリムペンタミジンスルファメトキサゾ−ル、DAPSONE(登録商標)(Jacobus Pharmaceuticals、Princeton、NJ)、ATOVAQUONE(登録商標)(GlaxoSmithKline、Research Triangle Park、NC)、ISONIAZID(登録商標)(CIBA Pharmaceuticals、Summit、NJ)、RIFADIN(登録商標)(リファンピン)(Hoechst−Marrion−Roussel、KansasCity、MO)、PYRAZINAMIDE(登録商標)(Ledelrle、Pearl River、NY)、BIAXIN(登録商標)(クラリスロマイシン)(Abbott Laboratories、Chicago、IL)、ETHAMBUTOL(登録商標)(Ledelrle、Pearl River,NY)、RIFABUTIN(登録商標)(Pharmacia&Upjohn Company,Kalamazoo,MI)、AZITHROMYCIN(登録商標)(Pfizer Inc,NewYork,NY)、GANCICLOVIR(Roche Pharmaceuticals、Nutley、NJ)、FOSCARNET(登録商標)(Astra,Westborough,MA)、CIDOFOVIR(登録商標)(Gilead Sciences,Foster City,CA)、KETOCONAZOLE(登録商標)(Janssen,Titusville,NJ)、FLUCONAZOLE(登録商標)(Pfizer Inc,NewYork,NY)、ITRACONAZOLE(登録商標)(Janssen,Titusville,NJ)、ACYCLOVIR(登録商標)(Glaxo−Wellcome,Research Triangle Park,NC)、FAMICICOLCIR(登録商標)(SmithKline Beecham Pharmaceuticals,Pittsburgh,PA)、ピリメタミンロイコボリン、NEUPOGEN(登録商標)(フィルグラスチムGMCSF)(Amgen,Thousand Oaks,CA)、およびLEUKINE(登録商標)(サルグラモスチム(sargramostim)/GM−CSF)(Immunex,Seattle,WA)。

0113

特定の実施形態において、本発明の抗体を、トリメトプリム−スルファメトキサゾ−ル
および/またはAtovaquone、Dapsone、Pentamidineとの任意の組み合わせで使用して、日和見Pneumocystis carinii肺炎感染を予防的に処置するか、および/または予防する。

0114

別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、イソニアジド、RIFADIN(登録商標)(Merrell Dow Pharmaceuticals,Cincinnati,Ohio)、ピラジンアミド、および/またはエタンブトールとの任意の組み合わせで、日和見性のMycobacterium avium複合感染を予防的に処置し、そして/または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、リファブチン、クラリスロマイシン、および/またはアジスロマイシンとの任意の組み合わせで、日和見性のヒト型結核菌感染を予防的に処置し、そして/または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ガンシクロビルホスカネット、および/またはシドフォビル(Cidofovir)との任意の組み合わせで、日和見性のサイトメガロウイルス感染を予防的に処置し、そして/または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、フルコナゾールトラコナゾール(Traconazole)、および/またはケトコナゾールとの任意の組み合わせで、日和見性の真菌感染を予防的に処置し、そして/または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、アシクロビルおよび/またはファムシクロビルとの任意の組み合わせで、日和見性の単純ヘルペスウイルスI型および/またはII型の感染を予防的に処置し、そして/または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ピリメタミンおよび/またはロイコボリンとの任意の組み合わせで、日和見性のToxoplasma gondii感染を予防的に処置し、そして/または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ロイコボリンおよび/またはNEUPOGEN(登録商標)(Amgen,Thousand Oaks,CA)との任意の組み合わせで、日和見性の細菌感染を予防的に処置し、そして/または予防するために使用される。

0115

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、抗ウイルス剤と組み合わせて投与される。投与され得る抗ウイルス剤としては、アシクロビル、リバビリンアマンタジン、およびレマンジン(remantidine)が挙げられるが、これらに限定されない。

0116

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、抗菌剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗菌剤としては、アモキシリンアミノ配糖体、β−ラクタム糖ペプチド)、ベータラクタマーゼクリンダマイシンクロラムフェニコールセファロスポリンシプロフロキサシンエリスロマイシン、フルロキノロン(fluroquinolone)、マクロライドメトロニダゾルペニシリン、キノロン、リファンピン(ritampin)、ストレプトマイシンスルホンアミドテトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール(sulfamthoxazole)、およびバンコマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。

0117

本発明の抗体と組み合わせて投与され得る、従来の非特異的な免疫抑制薬剤としては、ステロイド、シクロスポリンシクロスポリンアナログシクロホスファミドメチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、FK−506(Fujisawa Pharmaceuticals,Deerfield,IL)、15デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)、および応答性免疫細胞(例えば、T細胞が挙げられる)の機能を直接的(例えば、免疫細胞に作用することによって)または間接的に(他の媒介細胞に作用することによって)抑制することによって働く他の免疫抑制剤が挙げられるが、これらに限定されない。

0118

特定の実施形態において、本発明の抗体は、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の抗体とともに投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ORTHOCLONE(登録商標)(OKT3)(Ortho Biotech,Raritan,NJ)、SANDIMMUNE(登録商標)ORAL(シクロスポリン)(Sandoz Pharmaceuticals,Hanover,NJ)、PROGRAF(登録商標)(タクロリムス(tacrolimus))(Fujisawa Pharmaceuticals,Deerfield,IL)、CELLCEPT(登録商標)(ミコフェノレート(mycophenolate))(Roche Pharmaceuticals,Nutley,NJ)、アザチオプリン、グルココルチコステロイド(glucorticosteroids)、およびRAPAMUNE(登録商標)(シロリムス(sirolimus))(Wyeth,Collegeville,PA)が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗体と組み合わせた免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために使用され得る。

0119

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、単独でか、または1種以上の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の抗体とともに投与され得る、静脈内免疫グロブリン調製物としては、GAMMARE(登録商標)(Centeon,Kankakee,IL)、IVEEGAM(登録商標)(Immuno−US Inc.,Rochester,MI)、SANDOGLOBULFN(登録商標)(Sandoz Pharmaceuticals,Hanover,NJ)、GAMMAGARD(登録商標)(Baxter Healthcare,Glendale,CA)、およびGAMIMUNE(登録商標)(Bayer Biological,West Haven,CT)が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、移植治療(例えば、骨髄移植)において、静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。

0120

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、単独でか、または抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗炎症剤としては、グルココルチコイドおよび非ステロイド系抗炎症剤アミノアリールカルボン酸誘導体アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体アリールカルボン酸アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾールピラゾロンサリチル酸誘導体チアジンカルボキサミド、e−アセトアミドカプロン酸S−アデノシルメチオニン、3−アミノ4−ヒドロキシ酪酸アミキセトリン、ベンダザックベンジダミンブコロームジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾングアイアズレンナブメトン、ニネスリド(ninesulide)、オルゴテインオキサセプロールパラニリン(paranyline)、ペリソキサール、ピフォキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、これらに限定されない。

0121

1つの実施形態において、本発明の抗体は、ステロイド治療と組み合わせて投与される。組み合わせて投与され得るステロイドとしては、メチルプレドニゾロン(例えば、IVメチルプレドニゾロン)が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、プレドニゾンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形態において、本発明の抗体は、プレドニゾンおよび免疫抑制剤と組み合わせて投与される。投与され得る免疫抑制剤およびプレドニゾンは、本明細書中に記載されるものであり、そしてアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドIVが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形態において、本発明の抗体は、メチルプレドニゾロンおよび免疫抑制剤と組み合わせて投与される。メチルプレドニゾロンと共に投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載されるものであり、そしてアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドIVが挙げられるが、これらに限定されない。

0122

別の実施形態において、本発明の抗体は、抗マラリア薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗マラリア薬としては、ヒドロキシクロロキンクロロキン、および/またはキナクリンが挙げられるが、これらに限定されない。

0123

なお別の実施形態において、本発明の抗体は、NSAIDと組み合わせて投与される。必要に応じて、本発明の抗体は、以下の薬物のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、10、またはそれより多くと組み合わせて投与される:NRD−101(Hoechst Marion Roussel,KansasCity,MO)、ジクロフェナク(Dimethaid,Ontario,CN)、オキサプロジンカリウム(Monsanto)、メカセルミン(mecasermin)(Chiron,Emeryville,CA)、T−614(Toyama)、ペメトレキセド(pemetrexed)二ナトリウム(Eli Lilly,Indianapolis,IN)、アトレロイトン(atreleuton)(Abbott,Chicago,IL)、バルデコキシブ(valdecoxib)(Monsanto)、エルテナク(Byk Gulden,Melville,NY)、カムパス(campath)、AGM−1470(Takeda,Lincolnshire,IL)、CDP−571(Celltech,Rochester,NY)、CM−101(CarboMed,Nashville,TN)、ML−3000(Merck)、CB−2431(KS Biomedix,Surrey,UK)、CBF、BS2(KS Biomedix,Surrey,UK)、IL−Ira遺伝子療法(Valentis,Burlingame,CA)、JTE−522(Japan Tobacco,Tokyo,Japan)、パクリタキセル(Angiotech,Vancouver,BC)、DW−166HC(Dong Wha,Seoul,Korea)、ダルフェロン(darbufelone)メシレート(Pfizer Inc.,NewYork,NY)、可溶性TNFレセプター1(シナージェン(synergen);Amgen,Thousand Oaks,CA)、IPR 6001(Institute for Pharmaceutical Research)、トロケード(trocade)(Hoffman−La Roche,Nutley,NJ)、EF5(Scotia Pharmaceuticals)、BIIL−284(Boehringer Ingelheim,Ridgefield,CT)、BIIF−1149(Boehringer Ingelheim,Ridgefield,CT)、LEUKOVAX(登録商標)(Inflammatics,Malvern,PA)、MK−663(Merck,Whitehouse Station,NJ)、ST−1482(Sigma−Tau,Gaithersburg,MD)、およびブチキソコート(butixocort)プロピオネート(Pfizer Inc.,NewYork,NY)。

0124

なお別の実施形態において、本発明の抗体は、1種以上のDMARDと組み合わせて投与される。従って、以下の薬物のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれより多くが使用され得る:メトトレキサートレフルノミドエダトレキサート、エピロプリム、イオメトレソール(iometrexol)、ピリトレキシム(pyritrexim)、トリメトレキサート、ブロジモプリム、MX−68、N−[4−[3−(2,4−ジアミノ−6,7−ジヒドロ−5H−シクロペンタ[d]−ピリミジン−5−イルプロピルベンゾイル]−L−グルタミン酸、N−[[5−[2−(2−アミノ−1,4,5,6,7,8−ヘキサヒドロ−4−オキシピリリド[2.3−d]ピリミジン−6−イル)エチル]−2−チエニルカルボニル]−L−グルタミン酸、(R)N−[[5−[2−(2−アミノ−1,4,5,6,7,8−ヘキサヒドロ−4−オキソピリド[2,3−d]ピリミジン−6−イル)エチル]−2−チエニル]−カルボニル]L−グルタミン酸、N−((2,4−ジアミノ−3,4,5,6,7,8−ヘキサヒドロピリド[2,3−d]ピリミジン−6−イル)エチル)−2−チエニルカルボニル−L−グルタミン酸、(S)−2−[[[4−カルボキシ−4−[[4−[[(2,4−ジアミノ−6−プテリジニル)メチル]アミノ]ベンゾイル]アミノ]ブチル]アミノ]カルボニル]安息香酸、N−[4−[3−(2,4−ジアミノ−1−H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)プロピル]ベンゾイル]−L−グルタミン酸、2,4−ジアミノ−6−(N−(4−(フェニルスルホニル)ベンジル)メチルアミノキナゾリン、2,4−ジアミノ−5−[4−[3−(4−アミノフェニル−4−スルホニルフェニルアミノプロポキシ]−3,5−ジメトキシベンジル]ピリミジン、N−[4−4−(2,4−ジアミノ−5−ピリミジニル)ブチル]ベンゾイル]−L−グルタミン酸、N−[4−[3−(2,4−ジアミノ−5−ピリミジニル)プロピル]ベンゾイル]−L−グルタミン酸、N−[4−[2−(2,4−ジアミノ−6−プテリジニル)エチル]−ベンゾイル]−4−メチレン−DL−グルタミン酸およびN−(1−メチルエチル)−N’[3−(2,4,5−トリクロロフェノキシ)プロポキシ]イミドカルボンイミジックジアミド塩酸塩(PS15)、スルファサラジンアウロチオマレイン酸ナトリウムオーラノフィン、シクロスポリン、ペニシルアミン、アザチオプリン、抗マラリア薬物(例えば、本明細書中に記載されるような)、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、Enbrel(エタネルセプト(etanercept))(Wyeth−Ayerst Laboratories,Philadelphia,PA)、抗TNF抗体、およびプレドニゾロン。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、抗マラリア薬、メトトレキサート、抗TNF、Enbrelおよび/またはスルファサラジンと組み合わせて投与される。

0125

1つの実施形態において、本発明の抗体は、メトトレキサートと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗TNF抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、メトトレキサートおよび抗TNF抗体または抗Fas抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、スルファサラジンと組み合わせて投与される。

0126

別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、メトトレキサート、抗TNF抗体、抗Fas抗体およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、Enbrelと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、Enbrelおよびメトトレキサートと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、Enbrel、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、エトリコキシブ(etroricoxib)、ミソプロストールジクロフェナクナトリウム、バルデコキシブ、チラコキシブ(tiracoxib)、ロフェコキシブ(rofecoxib)、セレコキシブ(celecoxib)、ガランタミン、ダルブフェロンメシレート、アセクロフェナク、ML−3000、アナキンラ(anakinra)、ヒアルロン酸ナトリウム(hvaluronate sodium)、ニメスリド、ミコフェノレートモフェチル(mvcophenolate mofetil)、ジアセレイン、シベレストスト(sivelestst)ナトリウム、デフラザコート(deflazacort)、ナルメフェン塩酸塩サマリウム−153レキシドロナム(lexidronam)五ナトリウム、ペントスタチン、T−614、アミプリロース塩酸塩、ロセパファント(rocepafant)、アンピロキシカムファルネシル酸プレドニゾロン、メロキシカム、ジクロフェナクナトリウム、ロモキシカム(lomoxicam)、サラゾスルファピリジンエトドラクフルピルチンマレエートエブセレン、タクロリムス(tacrolimus)水和物、ナブメトン、クロプレドノール、ピロキシカムシンナメート、プロカゾン、リメキソロンフェンレチニドイミダゾールヒドロキシベンゾエート、ドロキシカムフェンチアザクアルファカルシドールハロプレドンジアセテート、グスペリムス(gusperimus)塩酸塩、イノシンプラノベクスアクタリト、インドメタシンファルネシル、ミゾリビントルフェナム酸ジフルニサル、ピロキシカム、オキサプロジン、ヒアルロン酸ナトリウム、ブシラミン、シクロスポリン、フロクタフェニンテノキシカムデキサメタゾンパルミテート、アムフェナクナトリウム、アセメタシン、オーラノフィン、ロベンザリット二ナトリウム、またはこれらの任意の組み合わせと組み合わせて投与される。

0127

別の実施形態において、本発明の抗体は、Enbrel、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施形態において、1つ以上の抗マラリア薬が、上記組み合わせの1つと組み合わせられる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、抗マラリア薬(例えば、ヒドロキシクロロキン)、Enbrel、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、抗マラリア薬(例えば、ヒドロキシクロロキン)、スルファサラジン、抗TNF抗体、およびメトトレキサートと組み合わせて投与される。

0128

別の実施形態において、本発明の抗体は、化学療法剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導体(例えば、ドキソルビシンブレオマイシンダウノルビシン、およびダクチノマイシン);抗エストロゲン(例えば、タモキシフェン);代謝拮抗物質(例えば、フルオロウラシル、5−FU、メトトレキサート、フロクスウリジンインターフェロンα−2B、グルタミン酸、プリカマイシンメルカプトプリン、および6−チオグアニン);細胞傷害性因子(例えば、カルムスチン、BCNU、ロムスチン、CCNU、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチンヒドロキシウレアプロカルバジンマイトマイシンブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン);ホルモン(例えば、メドロキシプロゲステロンエストラムスチンリン酸ナトリウムエチニルエストラジオールエストラジオール酢酸メゲストロールメチルテストステロンジエチルスチルベストロールジホスフェートクロロトリアニセン、およびテストラクトン);ナイトロジェンマスタード誘導体(例えば、メファレン(mephalen)、コラムシル(chorambucil)、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)およびチオテパ);ステロイドおよび組み合わせ(例えば、ベタメタゾンナトリウムホスフェート);および他のもの(例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼミトタント(mitotant)、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド)が挙げられるが、これらに限定されない。他の化学療法剤としては、例えば、CPT−11、デフルノミド(deflunomide)、シクロヘキシミド、およびマイトマイシンが挙げられる。

0129

特定の実施形態において、本発明の抗体は、CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)またはCHOPの成分の任意の組み合わせと組み合わせて、投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、Rituximabと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、RituxmabおよびCHOP、またはRituxmabおよびCHOPの成分の任意の組み合わせと共に、投与される。

0130

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得るサイトカインとしては、GM−CSF、G−CSF、IL−1α、IL−Iβ、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、抗CD40、CD40L、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、TNF−α、およびTNFβが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、造血増殖因子と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る造血増殖因子としては、LEUKINE(登録商標)(サルグラモスチム(sargamostim))およびNEUPOGEN(登録商標)(フィルグラスト(filgrast))が挙げられるが、これらに限定されない。

0131

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、1種以上の他の治療レジメンまたは予防レジメン(例えば、放射線療法など)と組み合わせて投与される。

0132

全体にわたって使用される場合、「治療剤」とは、病理学的状態を軽減する際に有効な、化合物または組成物である。治療剤の代表的な例としては、抗癌化合物、TNFファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見性剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、疾患改変抗リウマチ薬(DMARD)サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および標的細胞のアポトーシスを促進する二次抗体が挙げられる。

0133

抗癌化合物または抗癌化学療法剤は、異常に増殖する細胞の増殖を、抑制するまたは止めるのに有効な化合物または組成物である。従って、このような薬剤は、癌および異常な細胞増殖によって特徴付けられる他の疾患を処置するために、治療的に使用され得る。薬学的に有効な量の抗癌化合物は、個体に投与されて、異常に増殖する細胞の増殖を抑制または止めるのに十分な量である。抗癌化合物の例示的な例としては、以下が挙げられる:ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチンコルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、6−メルカプトプリン、テニポサイド、6−チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチン。抗癌化合物および治療剤のさらなる例は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第15版、Berkowら編、1987,Rahway,N.J.およびSladekらMetabolism and Action of Anti−Cancer Drugs,1987,Powisら編、TaylorおよびFrancis,New York,N.Y.に見出される。

0134

本発明の抗体は、悪性腫瘍の処置において他の治療(例えば、化学治療および/または放射性治療)とさらに組み合わされ得、そして治療効力は、アポトーシス誘導化合物(例えば、ビスインドリルマルイミドVIII(Bis VIII)またはSN−50もしくはLY294002のような他の感作剤)によって高められ得る。従って、1つの実施形態において、本発明の抗体は、Bis VIIIまたは他の感作剤および化学療法剤(例えば、アドリアマイシン、エトポシド、トポテカンタキソテレ(taxotere)、またはパクリタキセル)と組み合わされ得る。別の実施形態においては、本発明の抗体は、非ステロイド抗炎症性薬物(例えば、スリンダクスルフィドまたは他のCOX−1インヒビターもしくは他のCOX−2インヒビター)、化学療法剤(例えば、アドリアマイシン、エトポシド、トポテカン、タキソテレ、またはパクリタキセル)と組み合わされ得る。他の疾患(例えば、自己免疫疾患および炎症性疾患)の処置において、処置の組み合せもまた、使用され得る。例えば、抗体は、抗炎症剤、DMARD、化学治療剤、メトトレキサート、ビスインドリルマルイミドVIIIまたは他の感作剤などのような、他の治療剤と組み合わせて投与され得る。放射性治療もまた、炎症性疾患および自己免疫疾患の処置において他の治療剤と組み合わされ得る。当業者は、特定の炎症性疾患または自己免疫疾患に対して放射性治療の形態を適合する(例えば、関節炎の処置における放射線骨膜切除)。

0135

本発明の抗体を使用する治療はまた、本発明の別の抗体を使用する治療とも組み合され得る。例えば、DR5に対する抗体は、DR4、TNF、B7、CD40リガンド、CD40、CD20 (例えば、リツキシマブ(rituximab))、Fas、またはこれらの組み合わせに対する抗体の投与とともに、投与より先に、または投与の後に、それを必要とする被験体に投与され得る。このような併用抗体治療は、1つ以上の治療剤(例えば、化学療法剤、ドキソルビシン、および/またはメトトレキサート)、放射性治療、または両方の投与とさらに組み合され得る。

0136

従って、本発明は、DR5を発現する標的細胞のアポトーシスを選択的に誘導するか、またはこの細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:(a)標的細胞を、TRAILレセプターDR5を特異的に結合する治療的量の抗体と接触させる工程であって、この抗体は、その可溶性形態において、DR5を発現する標的細胞において、インビボおよびインビトロのアポトーシス誘導活性を有する、工程;ならびに(b)標的細胞を、治療的な量の1つ以上の治療剤と接触させる工程。1つの実施形態において、接触させる工程の一方または両方が、必要に応じてインビボで実施される。別の実施形態において、一方または両方の接触させる工程が、インビトロで実施される。標的細胞は、アポトーシス系の非調節を示す細胞、好中球、活性化リンパ球または他の活性化免疫細胞(例えば、リンパ系細胞および骨髄性細胞)、ウイルス感染した細胞、および自己免疫疾患の異常に増殖する滑膜細胞(例えば、慢性関節リウマチ滑膜細胞(炎症生活膜細胞、滑膜における活性化リンパ系細胞および活性化骨髄性細胞、マクロファージ様滑膜細胞、ならびに線維芽細胞様滑膜細胞が挙げられる))から選択され得る。以前公開された抗DR5抗体(24)と比較すると、本発明の指示的なTRA−8抗体のアポトーシス誘導活性は、非常に強力であり、そしてインビトロでpg/mlレベルにてJurkat細胞のアポトーシスを誘導し得、そして以前報告された可溶性TRAILと比較して優れた殺腫瘍性の活性をインビボで示す。TRA−8の単一用量静脈内投与は、固形腫瘍細胞および造血性腫瘍細胞の両方の増殖を阻害するのに十分であるが、可溶性のTRAILを用いてインビボで腫瘍後退を誘導するには、かなり高用量(1日毎に500μgを10日間)を必要とする。本発明の抗TRAILレセプター抗体は、例示的な抗体TRA−8が、非形質転換線維芽細胞のアポトーシスを誘導しないので、可溶性のTRAILと同様に安全であるように見える。類似する結果が、DR4抗体について観察された。

0137

本発明のベクターは、調節エレメント(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)に作動可能に連結された、DR5抗体またはDR4抗体の重鎖免疫グロブリンもしくは軽鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列を含む。「作動可能に連結される」とは、その通常の機能を実施するように構成されたヌクレオチド配列の配置を言う。従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節エレメントは、ポリペプチドの転写、複製および/または翻訳を指示可能である。単一ベクターが、DR5抗体またはDR4抗体の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンについてのコード配列を必要に応じて含むことは、当業者によって認識される。1つの実施形態において、ベクターは、ヒト化軽鎖免疫グロブリンまたはヒト化重鎖免疫グロブリンをコードする。

0138

本発明による方法および結果を示すため、次の実施例を以下に示す。これらの実施例は、本発明の全ての局面を包括するものであることを意図しないが、むしろ代表的な方法および結果を示すことを意図する。これらの実施例は、当業者にとって明らかである本発明の等価物および変化形を除外することを意図しない。

0139

(実施例1.DR5抗原の調製)
(1.1 DR5cDNAのクローニング)
ヒトDR5タンパク質をコードするDNAを、以下を使用する次のRT−PCR法によってクローン化する。

0140

(a)テンプレート
HeLa細胞の全RNAを、TRIzol Reagent(GIBCOBRL)を使用することによって抽出する。First−StrandcDNA合成キット(Amersham Pharmacia Biotech)を、このキットに備え付けられた指示マニュアルに従って使用することによって得られるcDNAを、PCR反応についてのテンプレートとして使用する。

0141

(b)PCRプライマー
次のオリゴヌクレオチドプライマーPCRのために合成する:
5’−gacgatgcccgatctactttaaggg−3’(DR5p1:配列番号1);
5’−ccactgggtgatgttggatggg−3’(DR5p2:配列番号2)。

0142

別のように特定されなければ、これらの実施例中の全てのオリゴヌクレオチドを、Lifetechnologiesによって合成する。全てのオリゴヌクレオチドを、蒸留水に溶かした後、−20℃で保存する。

0143

(c)PCR反応)
PCR反応溶液組成
テンプレートcDNA、全33μl反応物中の5μl
プライマーDR5p1、10pmol;
プライマーDR5p2、10pmol;
10×濃縮PCR緩衝液(キットに備え付けられている)、10μl;
NTP(各2.5mM)、4μl;および
Taqポリメラ−ゼ(Promega)、5単位。

0144

滅菌した蒸留水を、全容積100μlになるまでこの溶液に加える。別のように特定されなければ、dNTPは、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP(各2.5mM)の等モル混合物である。

0145

PCR反応を、次のように行う。溶液を最初に94℃で2分間加熱し、その後、94℃で30秒間、52℃で1分間そして72℃で3分間加熱するサイクルを、40回繰り返す。この手順の完了後、反応溶液を72℃で10分間加熱する。

0146

このようにして得られた、増幅されたDNAフラグメントを、0.25μg/mlエチジウムブロミドを含む1%アガロースゲル上で分離する。所望のDNAフラグメントを含むように決定されたバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、次いで、そのDNAをGene Cleanキット(BIO101)を使用して回収する。そのDNAフラグメントを、TA Cloning Kit(Invitrogen、CA)を使用してクローン化する。これを、次のように実施する。

0147

TA Cloningキットに備え付けられているpCR2.1ベクター50ngとともに、このPCR反応溶液から回収されたDNAフラグメントを、1μlの10×リガーゼ反応緩衝液(6mM Tris−HCl(pH7.5)、6mM塩化マグネシウム、5mM塩化ナトリウム、7mMβーメルカプトエタノール、0.1mMATP、2mM DTT、1mMスペルミジン、および0.1mg/mlウシ血清アルブミン)と混ぜ合わせ、これに4単位のT4DNAリガーゼ(1μl)を加えた。混合物の全容積を、滅菌脱イオン水を用いて10μlに調整し、そして得られたリガーゼ溶液を、14℃で15時間インキュベートする。その後、2μlのリガーゼ反応溶液を、50μlのコンピテントE.coli TOP10F’株(これは、TAクローニングキットに備え付けられており、指示マニュアルに従ってコンピテントにする)に加え、そして2μlの0.5Mβ−メルカプトエタノールを、これに加える。そして得られた混合物を、30分間上で保ち、次いで42℃で30秒間、そして再び氷上で5分間保つ。次に、2%v/vトリプトンを含む500μlの培地、0.5%w/v酵母抽出物、0.05%w/v塩化ナトリウム、2.5mM塩化カリウム、1mM塩化マグネシウム、および20mMグルコース(本明細書中以後「SOC」培地と呼ぶ)を、培養物に加え、そして混合物を、振り混ぜながら37℃で1時間インキュベートする。その後、培養物を、100μg/mlを含むL−ブロス寒天プレート(1%v/vトリプトン、0.5%w/v酵母抽出物、0.5%w/v塩化ナトリウム、0.1%w/vグルコース、および0.6%w/vバクト寒天(Difco))上にスプレッディングする。プレート上で現れるアンピシリン耐性コロニーを選択し、そして白金製移動ループを用いて削り取り、そして200r.p.m.で振り混ぜながら、一晩中37℃で、100μg/mlのアンピシリンを含むL−ブロス培地中で培養する。インキュベーションの後、細胞を、遠心分離法によって収集し、それからプラスミドDNAをアルカリ法によって調製する。このようにして得られたプラスミド由来のEcoRI−EcoRI DR5cDNAフラグメントを、pcDNA3プラスミド(Invetrogen、CA)にサブクローン化する。pcDNA3におけるDR5遺伝子の全長を、配列決定し、そして公開された配列と適合させる。このようにして得られたプラスミドを、プラスミドpcDNA3−DR5と名付ける

0148

(1.2 DR5−IgG発現ベクターの構築)
膜貫通ドメインを欠くヒトDR5の可溶性形態を得るため、発現プラスミドベクターを構築する。このベクターを、ヒトIgG1 Fc DNA(41)に融合されたヒトDR5の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードするように設計する。膜貫通ドメインを欠くヒトDR5をコードするDNAを、次のPCR反応によって得る。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

  • 株式会社堀場製作所の「 エクソソーム表面分子を特定する方法」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】本発明はエクソソーム表面分子に対する結合性分子が固相化された担体をカゼイン溶液またはカゼイン分解物溶液でブロックおよび洗浄すること、ならびに該担体とエクソソームを含む被験試料の接触前... 詳細

  • 株式会社資生堂の「 レチノイドの副作用に対する感受性の決定方法」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】SNP解析により遺伝要素に基づいて対象のレチノイドの副作用に対する感受性を決定する方法、レチノイドの副作用に対する感受性を決定するコンピュータ、及び当該コンピュータを制御するプログラ... 詳細

  • 公立大学法人福島県立医科大学の「 大腸がんの予後バイオマーカー」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】大腸がん患者の予後を予測するための、及び/又は大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーを提供する。GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGAL... 詳細

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ