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技術 TRAILレセプターに免疫特異的に結合する抗体

出願人 ヒューマンジノームサイエンシーズ,インコーポレイテッド
発明者 サルセド,セオドラルーベン,スティーブンエム.ローゼン,クレイグエイ.アルバート,ビビアンアール.ドブソン,クラリールイスヴォーン,トリスタンジョン.
出願日 2002年5月7日 (19年1ヶ月経過) 出願番号 2003-500202
公開日 2005年6月2日 (16年0ヶ月経過) 公開番号 2005-515963
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 冷却フィンガー 実験フロー 定常流速 こそげ 洞ブロック 再舗装 DOレベル 処理バッグ
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課題・解決手段

本発明は、TRAILレセプター、TR4に免疫特異的に結合する、抗体または関連分子に関する。このような抗体は、例えば、癌および他の増殖性障害の予防および処置についての用途を有する。本発明はまた、抗TR4抗体をコードする核酸ベクターおよびこれらの核酸を含む宿主細胞、ならびにこれらを産生するための方法に関する。本発明は、疾患または障害、特に、癌および他の過増殖性障害を予防、検出、診断、処置、または改善するための、方法および組成物に関し、上記方法は、TRAILレセプターTR4に免疫特異的に結合する、有効量の、1以上の抗体またはそのフラグメントもしくは改変体または関連分子を動物(好ましくは、ヒト)に投与する工程を包含する。

概要

背景

(発明の背景
多くの生物学的作用(例えば、特定の刺激および天然生物学的プロセスに対する応答)は、サイトカインのような因子により制御される。多くのサイトカインは、レセプター係合し、そして細胞内応答を生じることによりレセプターを介して作用する。

例えば、腫瘍壊死因子(TNF)αおよび腫瘍壊死因子βは、TNFレセプターを介して作用して、多数の生物学的プロセス(ショックおよび炎症性疾患の感染および誘発に対する防御を含む)を制御するサイトカインである。TNF分子は「TNFリガンドスーパーファミリーに属し、そしてこれらのレセプターまたはカウンターリガンド(「TNFレセプター」スーパーファミリー)と共に作用する。現在までに、TNFリガンドスーパーファミリーの少なくとも18種のメンバーが同定されており、そしてTNFレセプタースーパーファミリーの少なくとも19種のメンバーが特徴付けられている(例えば、Locksleyら、Cell(2001)104:487〜501を参照のこと)。

リガンドの中には、TNF−α、リンホトキシン−α(TNF−βとしてまた公知であるLT−α)、LT−β(複合ヘテロトリマーLT−α2−β中に見出される)、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4−lBBL、OX40L、および神経成長因子(NGF)が含まれる。TNFレセプターのスーパーファミリーは、p55TNFレセプター、p75TNFレセプター、TNFレセプター関連タンパク質FA抗原またはAPO−1、CD40、CD27、CD30、4−lBB、OX40、低親和性p75およびNGFレセプター(Meager,A.,Biologicals,22:291−295(1994))を含む。

TNFリガンドスーパーファミリーの多くのメンバーは、活性化T細胞により発現される。これは、これらのメンバーが細胞個体発生および機能の根底にある、他の細胞型とのT細胞の相互作用に必要であることを意味する(Meager,A.、前出)。

TNFレセプターファミリーのいくつかのメンバーの不可欠な機能についてのかなりの洞察が、これらのタンパク質の発現を無効にする変異体の同定および作製により得られている。例えば、FAS抗原およびそのリガンド中の天然に存在する変異は、リンパ球増殖疾患を生じ(Watanabe−Fukunaga,R.ら、Nature 356:314(1992))、これはおそらくプログラムされた細胞死不全を反映する。CD40リガンドの変異は、血漿中の高レベル免疫グロブリンMおよび低レベル免疫グロブリンGにより特徴付けられるX連鎖免疫不全状態を生じる。これは、不完全なT細胞依存性B細胞活性化を示す(Allen,R.C.ら、Science 259:990(1993))。低親和性神経成長因子レセプターの標的化された変異は、末梢構造の不完全な知覚神経支配(innovation)により特徴付けられる障害を生じる(Lee,K.F.ら、Cell 69:737(1992))。

TNFおよびLT−αは、2つのTNFレセプター(55kdおよび75kdのTNFレセプター)へ結合し得る。それらのレセプターを通して作用するTNFおよびLT−αにより誘発される多くの生物学的影響は、移植された腫瘍出血性壊死細胞傷害性エンドトキシンショックにおける役割、炎症、免疫調節、増殖および抗ウイルス応答、ならびに電離放射線有害な影響に対する防御を含む。TNFおよびLT−αは、エンドトキシンショック、大脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患AIDSおよび移植片宿主拒絶を含む広範囲な疾患の病因関与する(Beutler,B.およびVon Huffel,C.、Science 264:667−668(1994))。p55レセプター中の変異は、微生物感染に対する増大した感受性を生じる。

さらに、TNFR1(p55)およびFasのC末端付近の約80アミノ酸ドメインが、プログラムされた細胞死についてのシグナルを伝える原因である「デスドメイン(death domain)」として報告された(Tartagliaら、Cell 74:845(1993))。

アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発達およびホメオスタシスに不可欠である生理学的プロセスである(H.Steller、Science 267,1445−1449(1995))。アポトーシスの混乱は、ガン神経変性障害、および後天性免疫不全症候群を含むいくつかのヒト疾患の病因に寄与する(C.B.Thompson、Science 267,1456−1462(1995))。最近、多くの注目が、2つの細胞表面のデスレセプター(death receptor)(Fas/APO−1およびTNFR−1)のシグナル伝達および生物学的機能に集中している(J.L.Clevelandら、Cell 81,479−482(1995);A.Fraserら、Cell 85,781−784(1996);S.Nagataら、Science 267,1449−56(1995))。両方は、とりわけ、TNFR−2、低親和性NGFR、CD40、およびCD30もまた含むTNFレセプターファミリーのメンバーである(C.A.Smithら、Science 248,1019−23(1990);M.Tewariら、Modular Texts in Molecular and Cell Biology;M.Purton,Heldin,Carl編(Chapman and Hall,London,1995)。ファミリーのメンバーは、これらの細胞外ドメイン中のシステインリッチ反復の存在により定義されるが、Fas/APO−1およびTNFR−1はまた、Drosophila自殺遺伝子reaper(P.Golsteinら、Cell 81,185−6(1995);K.Whiteら、Science 264,677−83(1994))の遠縁にあたる、細胞内相同性の領域である、適切に指定された「デスドメイン」を共有する。この共有されたデスドメインは、両レセプターが最近まで未同定のままであった関連する対のシグナル伝達分子と相互作用することを示唆する。Fas/APO−1の活性化は、デスドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1(A.M.Chinnaiyanら、Cell 81,505−512(1995);M.P.Boldinら、J.Biol Chem 270,7795−8(1995);F.C.Kischkelら、EMBO 14:5579−5588(1995))を動員し、デスドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1は、次いで、プロアポトーシスプロテアーゼのICE/CED−3ファミリーのメンバーであるFLICE/MACH1へ結合し、そしておそらくこれを活性化する(M.Muzioら、Cell 85,817−827(1996);M.P.Boldinら、Cell 85,803−815(1996))。Fas/APO−1の中心的役割は、細胞死を誘発することであるが、TNFR−1は、整然とした多様な生物学的活性(その多くは、NF−kBを活性化する能力由来する)のシグナルを送り得る(L.A.Tartagliaら、Immunol Today 13,151−3(1992))。従って、TNFR−1は、多価アダプター分子TRADDを動員し、またFADDと同様にデスドメインを含む(H.Hsuら、Cell 81:495−504(1995);H.Hsuら、Cell 84:299−308(1996))。FADD、TRAF2、およびRIPを含む多くのシグナル伝達分子とのその会合を通して、TRADDは、アポトーシスおよびNF−kB活性化の両方へシグナルを送り得る(H.Hsuら、Cell 84:299−308(1996);H.Hsuら、Immunity 4,387−396(1996))。

リガンドを含む1つのTNF関連アポトーシスは、いくつかのグループによって報告され、そしてアポトーシス誘導性分子I(AIM−I)(国際出願番号WO97/33899)およびTNF関連アポトーシス誘導性リガンド(すなわちTRAIL)(Wiley,S.R.ら、Immunity 3:673〜682(1995))と命名された。Pitti,R.M.らは、この新規分子をApo−2(すなわち「Apo−2L」)と言及している。便宜上、本明細書中では、TRAILとして言及される。TRAILのアミノ酸配列は、配列番号66に示される。

FASリガンド(この転写物は、刺激されたT細胞に非常に制限されるようである)とは異なり、有意なレベルのTRAILが、多くの組織において見られ、そしていくつかの細胞株によって恒常的に転写される。TRAILは、FASリガンドから独立して作用することが示されている(Wiley,S.R.ら、(1995)前出)。Marsters,S.A.らによる研究は、TRAILが、FAS/Apo−1Lによるデスシナル伝達と同様の時間枠内で、迅速にアポトーシスを活性化するが、TNF誘導性アポトーシスより速いことを示した(Current Biology,6:750−752(1996))。

5つのTRAILレセプターが同定されており、以下が挙げられる:TR4(TRAILレセプター1(TRAIL−R1)としても知られる)およびデスレセプター4(DR4)(Panら、Science 276:111〜3(1997)、国際特許出願番号WO98/32856、WO00/67793、WO99/37684、WO2000/34355、WO99/02653、配列番号1);TR7(TRAILレセプター2(TRAIL−R2)としても言及される)、DR5、およびKILLER(Panら、Science 277:815〜8(1997)、Sheridanら、Science 277:818〜21(1997)、Chaudhuryら、Immunity 7:821〜30(1997)、国際特許出願番号WO98/46643、WO99/09165、WO99/11791、WO98/41629、WO00/66156、およびWO98/35986、配列番号3);TR1(オステオプロテグリン(OPG破骨細胞形成阻害因子(OCIF)、TNFRSF11B、およびFTHMA−090としても言及される)(国際特許出願番号WO98/12344、WO2000/54651、WO2001/04137、WO66/26217、WO98/07840、WO2000/21554、WO99/53942、およびWO2001/03719、配列番号5);TR5(TRAILレセプター3(TRAIL−R3)、デコイレセプター1(DcR1)およびTRIDとしても言及される)(Degli−Espostiら、J.Exp.Med.186:1165〜70(1997)、国際特許出願番号WO98/30693、WO00/71150、WO99/00423、EP867509、WO98/58062、配列番号2);ならびにTR10(TRAILレセプター4(TRAIL−R4)としても言及される)、DcR2、およびTRUNDD(Panら、FEBSLett.424:41〜5(1998)、Degli−Epostiら、Immunity 7:813〜20(1997)、国際特許出願番号WO98/54202、WO00/73321、WO2000/08155、WO99/03992、WO2000/34355およびWO9910484、配列番号4)。TR4およびTR7は、それらの細胞質テイルにおいてデスドメインを有し、そしてこれらのレセプターの誘発がアポトーシスを生じる。一方、TR1、TR5おおびTR10は、部分的に細胞性リガンドTRAILによって誘導されるアポトーシスを阻害し得る。なぜなら、それぞれ、細胞質性デスドメインが、存在しないかまたは短縮化されているからである。前掲刊行物および特許のそれぞれは、特に、それらに開示されるTRAILレセプターのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関して、それらの全体において本明細書によって参考として援用される。

TNFファミリーリガンドおよびTNFファミリーレセプターの効果は多様であり、そして哺乳動物系の生物学的プロセスにおいて正常および異常の両方の多数の機能に影響する。それゆえ、正常状態および疾患状態の両方において、TNFレセプターの生物学的活性に影響するような組成物(例えば、抗体)の同定および特徴付けのための明確な必要性が存在する。特に、TRAILレセプターの生物学的活性を調節する抗体を単離および特徴付ける必要性が存在する。

概要

本発明は、TRAILレセプター、TR4に免疫特異的に結合する、抗体または関連分子に関する。このような抗体は、例えば、癌および他の増殖性障害の予防および処置についての用途を有する。本発明はまた、抗TR4抗体をコードする核酸ベクターおよびこれらの核酸を含む宿主細胞、ならびにこれらを産生するための方法に関する。本発明は、疾患または障害、特に、癌および他の過増殖性障害を予防、検出、診断、処置、または改善するための、方法および組成物に関し、上記方法は、TRAILレセプターTR4に免疫特異的に結合する、有効量の、1以上の抗体またはそのフラグメントもしくは改変体または関連分子を動物(好ましくは、ヒト)に投与する工程を包含する。

目的

本発明はまた、TR4を発現する細胞のアポトーシスを阻害する抗体を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

単離された抗体またはそのフラグメントであって、以下:(a)配列番号42〜53のうちのいずれか1つのうちのVHCDR1、VHCDR2、またはVHCDR3のいずれかのアミノ酸配列;および(b)配列番号42〜53のうちのいずれか1つのうちのVLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3のいずれかのアミノ酸配列;からなる群より選択される、第2のアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一である、第1のアミノ酸配列を含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが免疫特異的にTR4に結合する、単離された抗体またはそのフラグメント。

請求項2

前記第2のアミノ酸配列が、配列番号42〜53のいずれか1つのうちのVHCDR3のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の単離された抗体またはそのフラグメント。

請求項3

TR1、TR5、TR7、およびTR10に結合するその能力に比べ、TR4に優先的に結合する、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項4

細胞の表面で発現するTR4に結合する、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項5

単離された抗体またはそのフラグメントであって、以下:(a)配列番号42〜53のうちのいずれか1つのVHドメインに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列;(b)配列番号42〜53のうちのいずれか1つのVLドメインに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列;または(c)(a)または(b)の両方;を含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが免疫特異的にTR4に結合する、抗体またはそのフラグメント。

請求項6

請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントであって、ここで、前記VHドメインは配列番号42に記載のVHドメインのアミノ酸配列を有し、そして、前記VLドメインは配列番号42に記載のVLドメインのアミノ酸配列を有する、抗体またはそのフラグメント。

請求項7

請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントであって、ここで、前記VHドメインは配列番号43に記載のVHドメインのアミノ酸配列を有し、そして、前記VLドメインは配列番号43に記載のVLドメインのアミノ酸配列を有する、抗体またはそのフラグメント。

請求項8

請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントであって、ここで、前記VHドメインは配列番号48に記載のVHドメインのアミノ酸配列を有し、そして、前記VLドメインは配列番号48に記載のVLドメインのアミノ酸配列を有する、抗体またはそのフラグメント。

請求項9

TR1、TR5、TR7、およびTR10に結合するその能力に比べ、TR4に優先的に結合する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項10

細胞の表面で発現するTR4に結合する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項11

請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントであって、以下:(a)配列番号42〜53のうちのいずれか1つのVHドメインのアミノ酸配列;(b)配列番号42〜53のうちのいずれか1つのVLドメインのアミノ酸配列;または(c)(a)および(b)の両方;を含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントが免疫特異的にTR4に結合する、抗体またはそのフラグメント。

請求項12

請求項11に記載の抗体またはそのフラグメントであって、ここで、前記VHドメインは配列番号42に記載のVHドメインのアミノ酸配列を有し、そして、前記VLドメインは配列番号42に記載のVLドメインのアミノ酸配列を有する、抗体またはそのフラグメント。

請求項13

請求項11に記載の抗体またはそのフラグメントであって、ここで、前記VHドメインは配列番号43に記載のVHドメインのアミノ酸配列を有し、そして、前記VLドメインは配列番号43に記載のVLドメインのアミノ酸配列を有する、抗体またはそのフラグメント。

請求項14

請求項11に記載の抗体またはそのフラグメントであって、ここで、前記VHドメインは配列番号48に記載のVHドメインのアミノ酸配列を有し、そして、前記VLドメインは配列番号48に記載のVLドメインのアミノ酸配列を有する、抗体またはそのフラグメント。

請求項15

TR1、TR5、TR7、およびTR10に結合するその能力に比べ、TR4に優先的に結合する、請求項11に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項16

細胞の表面で発現するTR4に結合する、請求項11に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項17

請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントであって、ここで、該抗体またはそのフラグメントは、以下:(a)免疫グロブリン分子全体;(b)scFv;(c)モノクローナル抗体;(d)ヒト抗体;(e)キメラ抗体;(f)ヒト化抗体;(g)Fabフラグメント;(h)Fab’フラグメント;(i)F(ab’)2;(j)Fv;および(k)ジスルフィド結合されたFvからなる群より選択される、抗体またはそのフラグメント。

請求項18

請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントであって、以下:(a)ヒトIgM定常ドメイン;(b)ヒトIgG1定常ドメイン;(c)ヒトIgG2定常ドメイン;(d)ヒトIgG3定常ドメイン;(e)ヒトIgG4定常ドメイン;および(f)ヒトIgA定常ドメイン;からなる群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、抗体またはそのフラグメント。

請求項19

請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントであって、以下:(a)ヒトIgκ定常ドメイン;および(b)ヒトIgλ定常ドメイン;からなる群より選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、抗体またはそのフラグメント。

請求項20

請求項5に記載の抗体またそのフラグメントであって、ここで、該抗体またはそのフラグメントは、以下:(a)10−7M(この値を含む)と10−8Mとの間の解離定数(KD);および(b)10−8M(この値を含む)と10−9Mとの間の解離定数(KD);からなる群より選択される解離定数(KD)を有する、抗体またはそのフラグメント。

請求項21

10−9M以下である前記解離定数(KD)を有する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項22

10−9M(この値を含む)と10−10Mとの間のKDを有する、請求項21に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項23

10−10M(この値を含む)と10−11Mとの間のKDを有する、請求項21に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項24

10−11M(この値を含む)と10−12Mとの間のKDを有する、請求項21に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項25

前記抗体またはそのフラグメントが検出可能な標識に結合体化されている、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項26

前記検出可能な標識が放射性標識である、請求項25に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項27

前記放射性標識が、125I、131I、111In、90Y、99Tc、177Lu、166Ho、または153Smである、請求項26に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項28

前記検出可能な標識が、酵素蛍光標識発光標識、または生物発光標識である。請求項25に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項29

前記抗体またはそのフラグメントがビオチンかされた、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項30

治療剤または細胞傷害性剤に結合体化している、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項31

請求項30に記載の抗体またはそのフラグメントであって、前記治療剤または細胞傷害性剤が、以下:(a)抗代謝産物;(b)アルキル化剤;(c)抗生物質;(d)増殖因子;(e)サイトカイン;(f)抗脈管形成剤;(g)抗分裂剤;(h)アントラサイクリン;(i)トキシン;および(j)アポトーシス剤からなる群より選択される、抗体またはそのフラグメント。

請求項32

固相支持体に結合している、請求項5に記載のいずれか1つの抗体またはそのフラグメント。

請求項33

ウェスタンブロットにおいてTR4に免疫特異的に結合する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項34

ELISAにおいてTR4に免疫特異的に結合する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項35

請求項11に記載の抗体またはそのフラグメントを産生する、単離された細胞。

請求項36

TR4に結合するTRAILの能力を阻害しない、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項37

TR4のアゴニストである、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項38

TR4発現細胞アポトーシス刺激する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項39

前記抗体またはそのフラグメントが、それと同濃度のTRAILポリペプチドがTR4発現細胞のアポトーシスを刺激するよりも良好にTR発現細胞のアポトーシスを刺激する、請求項38に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項40

前記抗体またはそのフラグメントが、抗体架橋剤の存在下またはその非存在下において、等しく良好に、TR4発現細胞のアポトーシスを刺激する、請求項38に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項41

肝細胞毒素ではない、請求項38に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項42

TRAILレセプター発現をアップレギュレートする、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項43

TRAILがTR4に結合するのを阻害する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項44

TR4のアンタゴニストである、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項45

TR4発現細胞のアポトーシスを阻害する、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項46

TRAILレセプター発現をダウンレギュレートする、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項47

請求項11に記載の抗体またはそのフラグメントと同じ、TR4上のエピトープと結合する、抗体またはそのフラグメント。

請求項48

請求項12に記載の抗体またはそのフラグメントと同じ、TR4ポリペプチド上のエピトープと結合する、抗体またはそのフラグメント。

請求項49

請求項13に記載の抗体またはそのフラグメントと同じ、TR4ポリペプチド上のエピトープと結合する、抗体またはそのフラグメント。

請求項50

請求項14に記載の抗体またはそのフラグメントと同じ、TR4ポリペプチド上のエピトープと結合する、抗体またはそのフラグメント。

請求項51

薬学的に受容可能なキャリア中にある、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。

請求項52

癌を処置、予防、または改善するための方法であって、該方法は、請求項5に記載の抗体もしくはそのフラグメントまたは該抗体またはそのフラグメントを含む組成物を、動物投与する工程を包含する、方法。

請求項53

前記動物がヒトである、請求項52に記載の方法。

請求項54

前記癌が結腸癌である、請求項52に記載の方法。

請求項55

前記癌が乳癌である、請求項52に記載の方法。

請求項56

前記癌が子宮癌である、請求項52に記載の方法。

請求項57

前記癌が膵臓癌である、請求項52に記載の方法。

請求項58

前記癌が肺癌である、請求項52に記載の方法。

請求項59

前記癌が胃腸の癌である、請求項52に記載の方法。

請求項60

前記癌がカポージ肉腫である、請求項52に記載の方法。

請求項61

前記癌が中枢神経の癌である、請求項52に記載の方法。

請求項62

前記中枢神経の癌が髄芽腫である、請求項61に記載の方法。

請求項63

前記中枢神経の癌が神経芽腫である、請求項61に記載の方法。

請求項64

前記中枢神経の癌が膠芽腫である、請求項61に記載の方法。

請求項65

前記抗体またはそのフラグメントが化学療法剤とともに併用されて投与される、請求項52に記載の方法。

請求項66

請求項65に記載の方法であって、ここで化学療法剤が以下:(a)イリノテカン;(b)パクリタキセル(TAXOL(登録商標));および(c)ゲムシタビンからなる群より選択される、方法。

請求項67

疾患または障害を処置、予防、または改善するための方法であって、該疾患または障害は、以下:(a)移植片対宿主疾患(GVHD);(b)AIDS;および(c)神経変性障害からなる群より選択され、請求項5に記載の抗体もしくはそのフラグメントまたは該抗体もしくはその一部を含む組成物を動物に投与する工程を包含する、方法。

請求項68

前記動物がヒトである、請求項67に記載の方法。

請求項69

TR4発現細胞の増殖を阻害するかまたは該細胞を死滅させる方法であって、該方法は、TR4発現細胞の増殖を阻害するかまたは該細胞を死滅させる有効量で、請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントあるいは該抗体またはそのフラグメントを含む組成物を、このようなTR4レセプター発現細胞の増殖の阻害または該細胞の死滅が所望される動物に投与する工程を包含する、方法。

請求項70

TR4ポリペプチドの発現を検出する方法であって、該方法は、以下:(a)請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントを使用して固体からの生物学的サンプルにおけるTR4ポリペプチドの発現を発生する工程;および(b)TRAILレセプターポリペプチドの標準レベルとTR4ポリペプチドのレベルを比較する工程;を包含する、方法。

請求項71

癌および他の過増殖性障害を検出、診断予後診断、またはモニターする方法であって、該方法は、以下;(a)請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントを使用して個体からの生物学的サンプルにおけるTR4ポリペプチドの発現をアッセイする工程;および(b)TR4レセプターポリペプチドの標準レベルとTR4ポリペプチドのレベルを比較する工程;を包含する、方法。

請求項72

請求項5に記載の抗体またはそのフラグメントを備える、キット

請求項73

コントロール抗体を備える、請求項72に記載のキット。

請求項74

前記抗体またはそのフラグメントが、検出可能な標識に結合してるか、またはそれに結合体化している、請求項72に記載のキット。

請求項75

ATCC受託番号PTA−3570の細胞株によって発現される、抗体。

請求項76

ATCC受託番号PTA−3571の細胞株によって発現される、抗体。

請求項77

ATCC受託番号PTA−3675の細胞株によって発現される、抗体。

技術分野

0001

(発明の分野)
本発明は、TRAILレセプターTR4に免疫特異的に結合する抗体および関連分子に関する。このような抗体は、例えば、癌および他の増殖性障害の予防および処置における用途を有する。本発明はまた、抗TR4抗体をコードする核酸分子、これらの核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらを作製するための方法に関する。本発明は、疾患または障害、特に、癌および他の過剰増殖性障害を、予防、検出、診断、処置または改善するための方法および組成物に関連し、これは、動物、好ましくは、ヒトに、TR4に免疫特異的に結合する、有効量の1つ以上の抗体またはこれらのフラグメントもしくは改変体、あるいは関連分子を投与することを包含する。

背景技術

0002

(発明の背景
多くの生物学的作用(例えば、特定の刺激および天然生物学的プロセスに対する応答)は、サイトカインのような因子により制御される。多くのサイトカインは、レセプター係合し、そして細胞内応答を生じることによりレセプターを介して作用する。

0003

例えば、腫瘍壊死因子(TNF)αおよび腫瘍壊死因子βは、TNFレセプターを介して作用して、多数の生物学的プロセス(ショックおよび炎症性疾患の感染および誘発に対する防御を含む)を制御するサイトカインである。TNF分子は「TNFリガンドスーパーファミリーに属し、そしてこれらのレセプターまたはカウンターリガンド(「TNFレセプター」スーパーファミリー)と共に作用する。現在までに、TNFリガンドスーパーファミリーの少なくとも18種のメンバーが同定されており、そしてTNFレセプタースーパーファミリーの少なくとも19種のメンバーが特徴付けられている(例えば、Locksleyら、Cell(2001)104:487〜501を参照のこと)。

0004

リガンドの中には、TNF−α、リンホトキシン−α(TNF−βとしてまた公知であるLT−α)、LT−β(複合ヘテロトリマーLT−α2−β中に見出される)、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4−lBBL、OX40L、および神経成長因子(NGF)が含まれる。TNFレセプターのスーパーファミリーは、p55TNFレセプター、p75TNFレセプター、TNFレセプター関連タンパク質FA抗原またはAPO−1、CD40、CD27、CD30、4−lBB、OX40、低親和性p75およびNGFレセプター(Meager,A.,Biologicals,22:291−295(1994))を含む。

0005

TNFリガンドスーパーファミリーの多くのメンバーは、活性化T細胞により発現される。これは、これらのメンバーが細胞個体発生および機能の根底にある、他の細胞型とのT細胞の相互作用に必要であることを意味する(Meager,A.、前出)。

0006

TNFレセプターファミリーのいくつかのメンバーの不可欠な機能についてのかなりの洞察が、これらのタンパク質の発現を無効にする変異体の同定および作製により得られている。例えば、FAS抗原およびそのリガンド中の天然に存在する変異は、リンパ球増殖疾患を生じ(Watanabe−Fukunaga,R.ら、Nature 356:314(1992))、これはおそらくプログラムされた細胞死不全を反映する。CD40リガンドの変異は、血漿中の高レベル免疫グロブリンMおよび低レベル免疫グロブリンGにより特徴付けられるX連鎖免疫不全状態を生じる。これは、不完全なT細胞依存性B細胞活性化を示す(Allen,R.C.ら、Science 259:990(1993))。低親和性神経成長因子レセプターの標的化された変異は、末梢構造の不完全な知覚神経支配(innovation)により特徴付けられる障害を生じる(Lee,K.F.ら、Cell 69:737(1992))。

0007

TNFおよびLT−αは、2つのTNFレセプター(55kdおよび75kdのTNFレセプター)へ結合し得る。それらのレセプターを通して作用するTNFおよびLT−αにより誘発される多くの生物学的影響は、移植された腫瘍出血性壊死細胞傷害性エンドトキシンショックにおける役割、炎症、免疫調節、増殖および抗ウイルス応答、ならびに電離放射線有害な影響に対する防御を含む。TNFおよびLT−αは、エンドトキシンショック、大脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患AIDSおよび移植片宿主拒絶を含む広範囲な疾患の病因関与する(Beutler,B.およびVon Huffel,C.、Science 264:667−668(1994))。p55レセプター中の変異は、微生物感染に対する増大した感受性を生じる。

0008

さらに、TNFR1(p55)およびFasのC末端付近の約80アミノ酸ドメインが、プログラムされた細胞死についてのシグナルを伝える原因である「デスドメイン(death domain)」として報告された(Tartagliaら、Cell 74:845(1993))。

0009

アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発達およびホメオスタシスに不可欠である生理学的プロセスである(H.Steller、Science 267,1445−1449(1995))。アポトーシスの混乱は、ガン神経変性障害、および後天性免疫不全症候群を含むいくつかのヒト疾患の病因に寄与する(C.B.Thompson、Science 267,1456−1462(1995))。最近、多くの注目が、2つの細胞表面のデスレセプター(death receptor)(Fas/APO−1およびTNFR−1)のシグナル伝達および生物学的機能に集中している(J.L.Clevelandら、Cell 81,479−482(1995);A.Fraserら、Cell 85,781−784(1996);S.Nagataら、Science 267,1449−56(1995))。両方は、とりわけ、TNFR−2、低親和性NGFR、CD40、およびCD30もまた含むTNFレセプターファミリーのメンバーである(C.A.Smithら、Science 248,1019−23(1990);M.Tewariら、Modular Texts in Molecular and Cell Biology;M.Purton,Heldin,Carl編(Chapman and Hall,London,1995)。ファミリーのメンバーは、これらの細胞外ドメイン中のシステインリッチ反復の存在により定義されるが、Fas/APO−1およびTNFR−1はまた、Drosophila自殺遺伝子reaper(P.Golsteinら、Cell 81,185−6(1995);K.Whiteら、Science 264,677−83(1994))の遠縁にあたる、細胞内相同性の領域である、適切に指定された「デスドメイン」を共有する。この共有されたデスドメインは、両レセプターが最近まで未同定のままであった関連する対のシグナル伝達分子と相互作用することを示唆する。Fas/APO−1の活性化は、デスドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1(A.M.Chinnaiyanら、Cell 81,505−512(1995);M.P.Boldinら、J.Biol Chem 270,7795−8(1995);F.C.Kischkelら、EMBO 14:5579−5588(1995))を動員し、デスドメインを含むアダプター分子FADD/MORT1は、次いで、プロアポトーシスプロテアーゼのICE/CED−3ファミリーのメンバーであるFLICE/MACH1へ結合し、そしておそらくこれを活性化する(M.Muzioら、Cell 85,817−827(1996);M.P.Boldinら、Cell 85,803−815(1996))。Fas/APO−1の中心的役割は、細胞死を誘発することであるが、TNFR−1は、整然とした多様な生物学的活性(その多くは、NF−kBを活性化する能力由来する)のシグナルを送り得る(L.A.Tartagliaら、Immunol Today 13,151−3(1992))。従って、TNFR−1は、多価アダプター分子TRADDを動員し、またFADDと同様にデスドメインを含む(H.Hsuら、Cell 81:495−504(1995);H.Hsuら、Cell 84:299−308(1996))。FADD、TRAF2、およびRIPを含む多くのシグナル伝達分子とのその会合を通して、TRADDは、アポトーシスおよびNF−kB活性化の両方へシグナルを送り得る(H.Hsuら、Cell 84:299−308(1996);H.Hsuら、Immunity 4,387−396(1996))。

0010

リガンドを含む1つのTNF関連アポトーシスは、いくつかのグループによって報告され、そしてアポトーシス誘導性分子I(AIM−I)(国際出願番号WO97/33899)およびTNF関連アポトーシス誘導性リガンド(すなわちTRAIL)(Wiley,S.R.ら、Immunity 3:673〜682(1995))と命名された。Pitti,R.M.らは、この新規分子をApo−2(すなわち「Apo−2L」)と言及している。便宜上、本明細書中では、TRAILとして言及される。TRAILのアミノ酸配列は、配列番号66に示される。

0011

FASリガンド(この転写物は、刺激されたT細胞に非常に制限されるようである)とは異なり、有意なレベルのTRAILが、多くの組織において見られ、そしていくつかの細胞株によって恒常的に転写される。TRAILは、FASリガンドから独立して作用することが示されている(Wiley,S.R.ら、(1995)前出)。Marsters,S.A.らによる研究は、TRAILが、FAS/Apo−1Lによるデスシナル伝達と同様の時間枠内で、迅速にアポトーシスを活性化するが、TNF誘導性アポトーシスより速いことを示した(Current Biology,6:750−752(1996))。

0012

5つのTRAILレセプターが同定されており、以下が挙げられる:TR4(TRAILレセプター1(TRAIL−R1)としても知られる)およびデスレセプター4(DR4)(Panら、Science 276:111〜3(1997)、国際特許出願番号WO98/32856、WO00/67793、WO99/37684、WO2000/34355、WO99/02653、配列番号1);TR7(TRAILレセプター2(TRAIL−R2)としても言及される)、DR5、およびKILLER(Panら、Science 277:815〜8(1997)、Sheridanら、Science 277:818〜21(1997)、Chaudhuryら、Immunity 7:821〜30(1997)、国際特許出願番号WO98/46643、WO99/09165、WO99/11791、WO98/41629、WO00/66156、およびWO98/35986、配列番号3);TR1(オステオプロテグリン(OPG破骨細胞形成阻害因子(OCIF)、TNFRSF11B、およびFTHMA−090としても言及される)(国際特許出願番号WO98/12344、WO2000/54651、WO2001/04137、WO66/26217、WO98/07840、WO2000/21554、WO99/53942、およびWO2001/03719、配列番号5);TR5(TRAILレセプター3(TRAIL−R3)、デコイレセプター1(DcR1)およびTRIDとしても言及される)(Degli−Espostiら、J.Exp.Med.186:1165〜70(1997)、国際特許出願番号WO98/30693、WO00/71150、WO99/00423、EP867509、WO98/58062、配列番号2);ならびにTR10(TRAILレセプター4(TRAIL−R4)としても言及される)、DcR2、およびTRUNDD(Panら、FEBSLett.424:41〜5(1998)、Degli−Epostiら、Immunity 7:813〜20(1997)、国際特許出願番号WO98/54202、WO00/73321、WO2000/08155、WO99/03992、WO2000/34355およびWO9910484、配列番号4)。TR4およびTR7は、それらの細胞質テイルにおいてデスドメインを有し、そしてこれらのレセプターの誘発がアポトーシスを生じる。一方、TR1、TR5おおびTR10は、部分的に細胞性リガンドTRAILによって誘導されるアポトーシスを阻害し得る。なぜなら、それぞれ、細胞質性デスドメインが、存在しないかまたは短縮化されているからである。前掲刊行物および特許のそれぞれは、特に、それらに開示されるTRAILレセプターのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関して、それらの全体において本明細書によって参考として援用される。

0013

TNFファミリーリガンドおよびTNFファミリーレセプターの効果は多様であり、そして哺乳動物系の生物学的プロセスにおいて正常および異常の両方の多数の機能に影響する。それゆえ、正常状態および疾患状態の両方において、TNFレセプターの生物学的活性に影響するような組成物(例えば、抗体)の同定および特徴付けのための明確な必要性が存在する。特に、TRAILレセプターの生物学的活性を調節する抗体を単離および特徴付ける必要性が存在する。

課題を解決するための手段

0014

(発明の要旨)
本発明は、TR4ポリペプチドまたはTR4のポリペプチドフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する抗体(その抗体フラグメントもしくは改変体を含む分子か、あるいはこれらからなる分子を含む)を包含する。特に、本発明は、ヒトTR4(例えば、配列番号1のもの)のポリペプチドまたはこのポリペプチドフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する抗体(その抗体フラグメントもしくは改変体を含む分子か、あるいはこれらからなる分子を含む)を包含する。いくつかの実施形態において、TR4ポリペプチドに免疫特異的に結合する本発明の抗体は、TR7(例えば、配列番号3)にも結合するが、他のタンパク質(TR1、TR5およびTR10(配列番号5、配列番号2および配列番号4が挙げられる))に結合しない。

0015

本発明は、疾患または障害を予防、処置または回復させるための方法および組成物に関し、TR4またはそのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、有効量の1つ以上の抗体またはそのフラグメントもしくは改変体、あるいは関連分子を、動物、好ましくは、ヒトに投与することを含む。特定の実施形態において、本発明は、TR4機能もしくはTR4リガンド機能または異常なTR4もしくはTR4リガンドの発現に関連した疾患または障害を予防、処置または回復させるための方法および組成物に関し、TR4またはそのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、有効量の1つ以上の抗体またはそのフラグメントもしくは改変体、あるいは関連分子を、動物、好ましくは、ヒトに投与することを含む。非常に好ましい実施形態において、本発明は、癌および他の過剰増殖性障害(例えば、白血病癌腫、およびリンパ腫)を予防、処置または回復させるための抗体ベースの方法および組成物に関する。本発明の抗体で処置、予防または回復され得る他の疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:神経変性障害(例えば、パーキンソン病アルツハイマー病、およびハンティングトン病)、免疫障害(例えば、狼瘡慢性関節リウマチ多発性硬化症重症筋無力症橋本病、および免疫不全症候群)、炎症性障害(例えば、喘息アレルギー性障害、および慢性関節リウマチ)、感染性疾患(例えば、AIDS、ヘルペスウイルス感染、および他のウイルス感染)および増殖性障害。

0016

非常に好ましい実施形態において、本発明の抗体は、以下の型の癌を、予防、診断、予知、処置または回復するための方法および組成物において使用される:乳癌肺癌非小細胞肺癌を含む)、結腸癌尿路の癌、膀胱癌腎臓癌膵臓癌肝臓癌胃癌前立腺癌、白血病、非ホジキンリンパ腫食道癌、脳癌、白血病、卵巣癌精巣癌、黒色腫子宮癌子宮頸癌喉頭の癌、直腸癌、および口腔の癌。特定の実施形態において、本発明の抗体は、化学療法剤パクリタキセル(Taxol)、イリノテカン(Camptosar、CPT−11)、イリノテカンアナログ、およびゲムシタビン(GEMZARTM))と組み合わせて投与される。

0017

本発明はまた、疾患または障害を、検出、診断、または予知するための方法および組成物を包含し、TR4またはそのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、有効量の1つ以上の抗体またはそのフラグメントもしくは改変体、あるいは関連分子を、動物、好ましくは、ヒトに投与することを含む。特定の実施形態において、本発明はまた、TR4機能もしくはTR4リガンド機能または異常なTR4もしくはTR4リガンドの発現に関連した疾患または障害を、検出、診断、または予知するための方法および組成物を包含し、TR4またはそのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、有効量の1つ以上の抗体またはそのフラグメントもしくは改変体、あるいは関連分子を、動物、好ましくは、ヒトに投与することを含む。非常に好ましい実施形態において、本発明は、癌および他の過剰増殖性障害(例えば、白血病、癌腫、およびリンパ腫)を検出、診断、または予知するための抗体ベースの方法および組成物に関する。本発明の抗体で検出、診断または予知され得る、他の疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:神経変性障害(例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンティングトン病)、免疫障害(例えば、狼瘡、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、橋本病、および免疫不全症候群)、炎症性障害(例えば、喘息、アレルギー性障害、および慢性関節リウマチ)、感染性疾患(例えば、AIDS、ヘルペスウイルス感染、および他のウイルス感染)および増殖性障害。

0018

本発明の別の実施形態は、細胞上でのTR4発現の発現をモニターするための診断ツールとしての本発明の抗体の使用を含む。

0019

本発明者らは、TR4ポリペプチド(例えば、配列番号1)に免疫特異的に結合する単鎖Fv’s(scFv)を作製した。従って、本発明は、表1に列挙される、これらのscFvを包含する。さらに、本発明は、American Type Culture Collection(「ATCC」)に表1に列挙される日付で寄託され、そして表1に確認されるATCC受託番号を与えられた、これらのscFvに対応する抗体を発現させるために操作される細胞株を含む。ATCCは、10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−2209,USAに位置する。ATCCへの受託は、特許手続上の目的のための微生物の受託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項準拠させた。

0020

さらに、本発明は、scFvをコードするポリヌクレオチド、ならびにscFvをコードするアミノ酸配列を含む。TR4またはそのフラグメントもしくは改変体に免疫特異的に結合する、これらのscFvのフラグメントまたは改変体(例えば、表1に参照されるscFvのいずれか1つのアミノ酸配列を有する、VHドメイン、VHCDR、VLドメイン、またはVL CDR)を含む分子、あるいはこれらからなる分子もまた、これらの抗体および/または分子をコードする核酸分子と同様に、本発明によって包含される。非常に好ましい実施形態において、本発明は、TR4またはそのフラグメントもしくは改変体の細胞外領域/ドメインに結合する、抗体またはそのフラグメントもしくは改変体を包含する。

0021

本発明はまた、TR4ポリペプチドに結合する抗体を提供し、この抗体は、検出可能な標識(例えば、酵素蛍光標識発光標識、または生物発光標識)に連結されている。本発明はまた、TR4ポリペプチドに結合する抗体を提供し、この抗体は、治療剤または細胞傷害性剤に連結されている。本発明はまた、TR4ポリペプチドに結合する抗体を提供し、この抗体は、放射活性物質に連結されている。

0022

本発明はまた、TR4ポリペプチドに結合する抗体を提供し、この抗体は、TR4アゴニストまたはTR4アンタゴニストのいずれかとして作用する。特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4を発現する細胞のアポトーシスを刺激する。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4に対するTRAILの結合を阻害する。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4の発現をアップレギュレートする。

0023

本発明はまた、TR4を発現する細胞のアポトーシスを阻害する抗体を提供する。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4の発現をダウンレギュレートする。

0024

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、10−7M以下の解離定数(KD)を有する。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、10−9M以下の解離定数(KD)を有する。

0025

本発明は、さらに、等濃度のTRAILポリペプチドが、TR4を発現する細胞のアポトーシスを刺激するよりも多く、TR4を発現する細胞のアポトーシスを刺激する抗体を提供する。

0026

本発明は、さらに、抗体架橋試薬の存在下または非存在下で同様に十分にTR4発現細胞のアポトーシスを刺激する抗体;および/または架橋抗体または他の架橋剤の非存在下で、等濃度のTRAILと、同じかまたはより高い効力でアポトーシスを刺激する抗体を提供する。

0027

さらなる実施形態において、本発明の抗体は、10−3/秒以下のオフ速度(koff)を有する。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、10−4/秒以下のオフ速度(koff)を有する。他の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、10−5/秒以下のオフ速度(koff)を有する。

0028

本発明はまた、他のタンパク質(TR1、TR5およびTR10を含む)に結合するそれらの能力に対して、TR4および/またはTR7に優先的に結合する抗体を提供する。

0029

特定の実施形態において、本発明の抗体の特性は、以下の実施例において詳述されるように、この抗体を既に記載されるTR4結合抗体よりも優れた治療剤にする。

0030

本発明はまた、抗体(抗体フラグメントもしくは改変体を含む分子、あるいはこれらからなる分子を含む)のパネルを提供し、ここで、このパネルのメンバーは、1、2、3、4、5、10、15、20またはそれよりも多く異なる本発明の抗体(例えば、抗体全体Fab、F(ab’)2フラグメント、Fdフラグメント、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、およびscFv)に対応する。本発明は、さらに、抗体の混合物を提供し、ここで、この混合物は、1、2、3、4、5、10、15、20またはそれよりも多く異なる本発明の抗体(例えば、抗体全体、Fab、F(ab’)2フラグメント、Fdフラグメント、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、およびscFv)に対応する。本発明はまた、1、2、3、4、5、10、15、20またはそれよりも多くの本発明の抗体(抗体フラグメントもしくはその改変体を含む分子、あるいはこれらからなる分子を含む)を含む組成物、または代替的にこれらからなる組成物について提供する。本発明の組成物は、1、2、3、4、5、10、15、20またはそれよりも多くの1つ以上の抗体またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を含み得るか、あるいはこれらからなり得る。あるいは、本発明の組成物は、本発明の1つ以上の抗体をコードする核酸分子を含み得るか、あるいはこれらからなり得る。

0031

本発明はまた、本発明の抗体(抗体フラグメントもしくはその改変体を含む分子、あるいはこれらからなる分子を含む)、および異種ペプチド(すなわち、抗体または抗体ドメインに無関係なポリペプチド)を含む、融合タンパク質を提供する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明によって包含される。本発明の組成物は、1、2、3、4、5、10、15、20またはそれよりも多くの本発明の融合タンパク質を含み得るか、あるいはこれらからなり得る。あるいは、本発明の組成物は、1、2、3、4、5、10、15、20またはそれよりも多くの本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含み得るか、あるいはこれらからなり得る。

0032

本発明はまた、核酸分子を提供し、一般的に、単離され、本発明の抗体(例えば、抗体フラグメントもしくはその改変体を含む分子か、あるいはこれらからなる分子(例えば、scFv、VHドメイン、またはVLドメイン)を含む)をコードする。本発明はまた、本発明の核酸分子で形質転換された宿主細胞およびその子孫を提供する。本発明はまた、本発明の抗体(抗体フラグメントもしくはその改変体を含む分子、あるいはこれらからなる分子を含む)の作製のための方法を提供する。本発明は、さらに、核酸分子から本発明の抗体(抗体フラグメントもしくはその改変体を含む分子、あるいはこれらからなる分子を含む)を発現させる方法を提供する。本発明のこれらの局面および他の局面は、以下にさらに詳細に記載される。

0033

(発明の詳細な説明)
(定義)
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分(すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子)をいう。そのような場合、用語抗体は、抗体分子全体だけでなく、抗体フラグメントならびに抗体および抗体フラグメントの改変体(誘導体を含む)もまた包含する。本明細書中で用語「抗体」によって記載される分子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:単鎖Fv(scFv)、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、Fv、およびVLドメインもしくはVHドメインのいずれかを含むフラグメント、あるいはこれらからなるフラグメント。用語「単鎖Fv」または「scFv」は、本明細書中で使用される場合、抗体のVHドメインに連結された抗体のVLドメインを含むポリペプチドをいう。TR4に免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原との交差反応性を有し得る。好ましくは、TR4に免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原(例えば、他のTRAILレセプターまたは腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーの他のメンバー)と交差反応しない。TR4に免疫特異的に結合する抗体は、例えば、当業者に公知の免疫アッセイまたは他の技術によって同定され得、例えば、免疫アッセイは、以下の実施例において記載される。

0034

本発明の抗体としては、モノクローナル抗体多重特異的抗体ヒト抗体またはキメラ抗体単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)フラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体が挙げられる)、細胞内で生成される抗体(すなわち、イントラボディ(intrabody))、および任意の上記の抗体のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型(例えば、IgGIgEIgMIgDIgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスの分子であり得る。好ましくは、本発明の抗体は、表1に参照されるいずれか1つの抗体、またはそのフラグメントもしくは改変体のアミノ酸配列を有する、VHドメイン、VHCDR、VLドメイン、もしくはVL CDRを含むか、あるいはこれらからなる。好ましい実施形態において、免疫グロブリンは、IgG1イソタイプである。別の好ましい実施形態において、この免疫グロブリンはIgG4イソタイプである。免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖の両方を有し得る。IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY重鎖のアレイは、κまたはλの形態の軽鎖と対になり得る。

0035

用語「改変体」は、本明細書中で使用される場合、TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、抗TR4抗体もしくはこの抗体フラグメントと類似または同一の機能を有するポリペプチドをいうが、それぞれ、TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、抗TR4抗体もしくはこの抗体フラグメントと類似または同一のアミノ酸配列を含むか、または、TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、抗TR4抗体もしくはこの抗体フラグメントと類似または同一な構造を有する必要はない。類似のアミノ酸配列を有する改変体とは、以下の少なくとも1つを満たすポリペプチドをいう:(a)本明細書中に記載されるTR4ポリペプチド(配列番号1)、TR4ポリペプチドのフラグメント、抗TR4抗体もしくはこの抗体フラグメント(表1に参照されるいずれか1つ以上のscFvのアミノ酸配列を有する、VHドメイン、VHCDR、VLドメイン、またはVLCDRを含む)のアミノ酸と、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいは、このようなアミノ酸配列からなる、ポリペプチド;(b)少なくとも5アミノ酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも30アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少なくとも50アミノ酸残基、少なくとも60アミノ酸残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なくとも80アミノ酸残基、少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なくとも125アミノ酸残基、または少なくとも150アミノ酸残基の、本明細書中に記載されるTR4(配列番号1)、TR4ポリペプチドのフラグメント、抗TR4抗体もしくはこの抗体フラグメント(表1に参照されるいずれか1つ以上のもののアミノ酸配列を有する、VHドメイン、VHCDR、VLドメイン、またはVLCDRを含む)をコードするヌクレオチド配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズする相補性配列であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド;ならびに(c)本明細書中に記載されるTR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、抗TR4抗体もしくはこの抗体フラグメント(表1に参照されるいずれか1つ以上のscFvのアミノ酸配列を有する、VHドメイン、VHCDR、VLドメイン、またはVLCDRを含む)をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。本明細書中に記載されるTR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、抗TR4抗体またはこの抗体フラグメントに類似な構造を有するポリペプチドは、本明細書中に記載されるTR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、抗TR4抗体、またはこの抗体フラグメントと類似な二次構造三次構造または四次構造を有するポリペプチドをいう。ポリペプチドの構造は、当業者に公知の方法(X線結晶学核磁気共鳴、および結晶学電子顕微鏡検査法が挙げられるが、これらに限定されない)によって決定され得る。

0036

2つのアミノ酸配列の同一性%または2つの核酸配列の同一性%を決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列される(例えば、ギャップが、第2のアミノ酸または核酸の配列と最適な配列に対して、第1のアミノ酸または核酸の配列の配列中に導入され得る)。次いで、アミノ酸位置またはヌクレオチド位置に対応するアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第1配列における位置が、第2配列における位置と対応する同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、この分子は、その位置で同一である。2つの配列間の同一性%は、この配列によって共有される同一な位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一な重複する位置の数/位置の総数× 100%)。1つの実施形態において、2つの配列は、同じ長さである。

0037

2つの配列間の同一性%の決定は、当業者に公知の数学アルゴリズムを使用して達成され得る。2つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの例は、KarlinおよびAltschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873〜5877(1993)で修正された、KarlinおよびAltschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264〜2268(1990)のアルゴリズムである。Altschulら、J.Mol.Biol.215:403〜410(1990)のBLASTnプログラムおよびBLASTxプログラムは、このようなアルゴリズムに組込まれている。BLASTヌクレオチドサーチは、BLASTnプログラム(スコア=100、ワード長=12)で実施されて、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を入手し得る。BLASTタンパク質サーチは、BLASTxプログラム(スコア=50、ワード長=3)で実施されて、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を入手し得る。比較の目的についてギャップ化整列を得るために、Gapped BLASTは、Altschulら、Nucleic AcidsRes.25:3589〜3402(1997)に記載されるように使用され得る。あるいは、PSI−BLASTは、分子(Id.)間の距離的関係を検出する反復サーチを実施するために使用され得る。BLASTプログラム、Gapped BLASTプログラム、およびPSI−BLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTxおよびBLASTn)のデフォルトパラメータが、使用され得る。(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照のこと)。

0038

配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの別の例は、MyersおよびMiller、CABIOS(1989)のアルゴリズムである。GCG配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)は、このようなアルゴリズムに組込まれている。当該分野に公知の配列分析のための他のアルゴリズムとしては、TorellisおよびRobotti Comput.Appl.Biosci.,10:3〜5(1994)に記載されるようなADVANCEおよびADAM;ならびにPearsonおよびLipman Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444〜8(1988)に記載されるFASTAが挙げられる。FASTAにおいて、ktupは、サーチの感度および速度を設定する制御オプションである。

0039

用語「誘導体」は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸残基の置換欠失または付加の導入によって変更された、TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、もしくはTR4ポリペプチドに免疫特異的に結合する本発明の抗体のアミノ酸配列を含むか、あるいは、これらからなる本発明の改変ポリペプチドをいう。用語「誘導体」はまた、本明細書中で使用される場合、例えば、ポリペプチドへの任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された、TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、もしくはTR4ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体をいう。例えば、限定する目的でなく、TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、または抗TR4抗体は、例えば、グリコシル化アセチル化ポリエチレングリコール化リン酸化アミド化、公知の保護基ブロック基による誘導体化タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾され得る。TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、または抗TR4抗体の誘導体は、当業者に公知の技術を用いる化学修飾(特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない)によって修飾され得る。さらに、TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、または抗TR4抗体の誘導体は、1つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。ペプチド誘導体は、本明細書中において記載される、TR4ポリペプチド、TR4ポリペプチドのフラグメント、もしくは抗TR4抗体と類似または同一な機能を有する。

0040

用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物、好ましくは、哺乳動物において抗原性活性または免疫原性活性を有するTR4の部分をいう。免疫原性活性を有するエピトープは、動物に応答する抗体を誘発するTR4の一部である。抗原性活性を有するエピトープは、当該分野に公知の任意の方法(例えば、本明細書中に記載される免疫アッセイによって)によって決定されるような抗体に免疫特異的に結合するTR4の一部である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要性はない。

0041

用語「フラグメント」は、本明細書中で使用される場合、TR4のアミノ酸配列、または抗TR4抗体(抗体フラグメントもしくはこれらの改変体を含むか、あるいは、これらからなる分子(例えば、scFv)を含む)の、少なくとも5アミノ酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも30アミノ酸残基、少なくとも35アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少なくとも45アミノ酸残基、少なくとも50アミノ酸残基、少なくとも60アミノ酸残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なくとも80アミノ酸残基、少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なくとも125アミノ酸残基、少なくとも150アミノ酸残基、少なくとも175アミノ酸残基、少なくとも200アミノ酸残基、または少なくとも250アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。

0042

用語「融合タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、本発明の抗TR4抗体のアミノ酸配列および異種ポリペプチドのアミノ酸配列(すなわち、抗体または抗体ドメインに無関係なポリペプチド)を含むか、あるいは、これらからなるポリペプチドをいう。

0043

用語「宿主細胞」は、本明細書中で使用される場合、核酸分子をトランスフェクトされた特定の対象の細胞、およびこのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいう。子孫は、世代の継代または宿主細胞ゲノム中への核酸分子の組込みの際に生じ得る変異または環境的影響に起因して、核酸分子をトランスフェクトされた親細胞と同一でないかもしれない。

0044

本発明の抗体は、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは、実質的に精製されている。「単離された」とは、そのネイティブな環境から取り出された抗体を意図する。従って、例えば、組換え宿主細胞中に生成および/または含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されると考えられる。

0045

(抗体の構造)
基本的な抗体の構造単位は、四量体を構成することが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対からなり、各対は、1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部は、主に抗原の認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。この鎖のカルボキシ末端部は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEとして抗体のイソタイプを規定する。一般的に、Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.ら、第2版 Raven Press,N.Y.(1989))(その全体が全ての目的のために参考として援用される)を参照のこと。各軽鎖/重鎖の対の可変領域は、抗体の結合部位を形成する。

0046

従って、完全なIgG抗体は、2つの結合部位を有する。二重機能性または二重特異性の抗体を除いて、これら2つの結合部位は、同じである。

0047

これらの鎖は全て、相補性決定領域またはCDRとも称される3つの高可変領域によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の、同じ一般的構造を示す。各対の重鎖および軽鎖由来のCDRは、特定のエピトープに結合し得るフレームワーク領域によって並べられる。軽鎖および重鎖の両方が、N末端からC末端に向かって、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の指定は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health、Bethesda,Md.(1987および1991))、またはChothia&Lesk J.Mol.Biol.196:901−917(1987);Chothiaら、Nature 342:878〜883(1989)の定義に従う。

0048

二重特異性または二重機能性の抗体は、2つの異なる重鎖/軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの連結を含む種々の方法によって産生され得る。例えば、Songsivilai&Lachmann Clin.Exp.Immunol.79:315−321(1990)、Kostelnyら、J Immunol.148:1547 1553(1992)を参照のこと。さらに、二重特異性抗体は、「ダイアボディ(diabody)」(Holligerら、「Diabodies’:small bivalent and bispecific antibody fragments」PNAS USA 90:6444−6448(1993))または「ヤヌシン(Janusin)」(Trauneckerら、「Bispecific single chain molecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes onHIVinfected cells」EMBO J 10:3655−3659(1991)およびTrauneckerら、「Janusin:new molecular design for bispecific reagents」Int J Cancer Suppl 7:51〜52(1992))として形成され得る。

0049

二重特異性抗体の作製は、従来の抗体の作製および収率と比較して、比較的労力のいる集中的なプロセスであり得、そして純度の程度は、二重特異性抗体に対して一般的により低い。二重特異性抗体は、単一の結合部位(例えば、Fab、Fab’、およびFv)を有するフラグメントの形態で存在しない。

0050

(抗TR4抗体)
ファージディスプレイ技術を用いて、本発明者らは、TR4(またはそのフラグメントもしくは改変体)に免疫特異的に結合する単鎖抗体分子(「scFv」)を同定した。TR4(またはそのフラグメントもしくは改変体)に免疫特異的に結合する、これらのscFv(例えば、表1に参照されるもののいずれか1つのアミノ酸配列を有するVHドメイン、VHCDR、VLドメイン、またはVL CDRを含む)のフラグメントもしくは改変体を含む分子、あるいはこれらからなる分子はまた、これらのscFvおよび/または分子をコードする核酸分子と同様に、本発明によって包含される。

0051

特に、本発明は、以下の表1に参照されるように、配列番号42〜53、好ましくは、配列番号42および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むscFv、あるいは、これらからなるscFvに関する。TR4に免疫特異的に結合するこれらのscFv(例えば、表1に参照されるもののいずれか1つのアミノ酸配列を有するVHドメイン、VHCDR、VLドメイン、またはVL CDRを含む)フラグメントもしくは改変体を含む分子、あるいはこれらからなる分子もまた、これらのscFvおよび/または分子をコードする核酸分子(例えば、配列番号54〜65)と同様に、本発明によって包含される。

0052

配列番号42〜53に対応するscFvは、TR4ポリペプチドに結合するそれらの活性について選択された。

0053

本発明は、TR4のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントに免疫特異的に結合する抗体(抗体フラグメントもしくはその改変体を含む分子、あるいはこれらからなる分子を含む)を提供する。特に、本発明は、表1に参照されるscFvに対応する抗体を提供する。このようなscFvは、慣用的に、挿入によって免疫グロブリン分子に「変換」され得、例えば、以下の実施例5により詳細に記載されるように、scFvのVHドメインおよび/またはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を、定常ドメイン配列を含む発現ベクター中に挿入し、そして免疫グロブリン分子の発現を指示するように操作される。

0054

本発明のscFvのVHドメインおよびVLドメインを含むIgG1抗体を発現するNS0細胞株は、表1に列挙される日時でAmerican Type Culture Collection(「ATCC」)に寄託され、そして表1で確認されるATCC受託番号を与えられた。ATCCは、10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−2209,USAに位置する。ATCCへの受託は、特許手続上の目的のための微生物の受託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に準拠させた。

0055

従って、1つの実施形態において、本発明は、本発明のscFvのVHドメインおよびVLドメインを含む抗体を提供する。

0056

好ましい実施形態において、本発明の抗体は、細胞株NSO αTRAIL 1985 BU #81 P:15 6/21/01によって発現される抗体である(表1を参照のこと)。

0057

好ましい実施形態において、本発明の抗体は、細胞株TRAIL(NSO)14G03 #39 P:14 7/2/01によって発現される抗体である(表1を参照のこと)。

0058

好ましい実施形態において、本発明の抗体は、細胞株NSO抗−TRAIL 14F08 #28 P:11によって発現される抗体である(表1を参照のこと)。

0059

(表1TRAILレセプターに免疫特異的に結合するscFv)

0060

0061

本発明は、TR4ポリペプチドまたはそのフラグメント、改変体、もしくは融合タンパク質に免疫特異的に結合する抗体(抗体フラグメントまたはその改変体を含むか、あるいは、それらからなる分子が挙げられる)を包含する。TR4ポリペプチドとしては、TR4(配列番号1)または1997年1月21日に寄託されたACTT寄託97853に含まれるクローンHCUDS60におけるcDNAによりコードされるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、上記のTR4およびTR7(配列番号3)または1997年3月7日に寄託されたATCC寄託97920に含まれるクローンHLYBX88におけるcDNAによりコードされるポリペプチドの両方に免疫特異的に結合し得る。TRAILレセプターは、配列番号1〜5のポリペプチド(TR4、TR5、TR7、TR10、およびTR1;例えば、ATCC寄託番号97853、(TR4)97798(1996年11月20に寄託されたTR5)、97920(TR7)、または209040(1997年5月15日に寄託された、TR10)におけるcDNA)をコードする核酸の組換え発現を通して産生され得る。

0062

1つの実施形態において、本発明の抗体は、TR1、TR5、TR7、またはTR10(配列番号5、2、3、および4)またはそのフラグメント、改変体、もしくは融合タンパク質を含む他のタンパク質に結合するそれらの能力と比較して、TR4(配列番号1)またはそのフラグメント、改変体、もしくは融合タンパク質(例えば、Fcドメインに融合されたTR4の細胞外領域)に優先的に結合する。他の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、TR1、TR5またはTR10(配列番号5、2および4)またはそのフラグメント、改変体、もしくは融合タンパク質を含む他のタンパク質に結合するそれらの能力と比較して、TR4およびTR7(配列番号1および3)、またはそのフラグメントもしくは改変体に優先的に結合する。他の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、TR1 TR4、TR5、TR7およびTR10(配列番号5、1、2、3、および4)に結合する。1つの抗原を、別の抗原より優先的に結合する抗体の能力は、当該分野において公知の任意の方法を用いて決定され得る。

0063

(TR4ポリペプチド)
本発明の特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に結合する。以下の節は、本発明の抗体により結合され得るTR4ポリペプチド、TR4フラグメント、およびTR4改変体をより詳細に記載する。本発明の抗体により結合され得るTR4ポリペプチド、TR4フラグメント、およびTR4改変体はまた、例えば、国際公開番号WO98/32856および同WO00/67793(これらの全体が、本明細書中に参考として援用される)にも記載される。

0064

特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4ポリペプチドに免疫特異的に結合する。TR4に免疫特異的に結合する抗体は、いくつかの実施形態において、TR4のフラグメント、改変体(TR4のオルソログ種を含む)、マルチマーまたは改変された形態を結合し得る。例えば、TR4に免疫特異的な抗体は、TR4の全てまたは一部を含む融合タンパク質のTR4部分を結合し得る。

0065

TR4タンパク質は、モノマーまたはマルチマー(すなわち、二量体三量体、四量体およびより高次のモノマー)として見出され得る。従って、本発明は、モノマーまたはマルチマーの一部として見出されるTR4タンパク質を結合する抗体に関する。特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4のモノマー、二量体、三量体、または四量体を結合する。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、1つ以上のTR4ポリペプチドを含む、少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なくとも四量体を結合する。

0066

本発明の抗体は、TR4ホモマーまたはTR4へテロマーを結合し得る。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のTR4(本明細書中に記載されるTR4の、フラグメント、改変体、および融合タンパク質を含む)のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるポリぺプチド配列を有するTR4タンパク質を含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のポリぺプチド配列を有するTR4タンパク質のみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明の抗体は、異なるポリぺプチド配列を有するTR4タンパク質を含むTR4ホモマーに結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、TR4ホモダイマー(例えば、同一または異なるポリぺプチド配列を有するTR4タンパク質を含む)あるいはホモトリマー(例えば、同一または異なるポリぺプチド配列を有するTR4タンパク質を含む)に結合する。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、TR4の少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーに結合する。

0067

特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4ホモトリマー(例えば、同一または異なるポリペプチド配列を有するTR4タンパク質を含む)を結合する。

0068

本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のTR4タンパク質に加えて異種タンパク質(すなわち、TR4遺伝子によりコードされるペプチド配列に対応しないポリぺプチド配列を含むタンパク質)を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーを結合する。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、1つ以上のTR4ポリペプチドを含む少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーを結合する。

0069

特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4へテロトリマー(例えば、1つまた2つのTR4タンパク質および各々2つまたは1つのTR7タンパク質を含む)。

0070

1つ以上の本発明の抗体により結合されるマルチマーは、疎水性親水性イオン性および/もしくは共有結合的な結合の結果であり得、そして/または例えば、リポソーム形成によって間接的に連結され得る。従って、1つの実施形態では、1つ以上の本発明の抗体により結合されるマルチマー(例えば、ホモダイマーまたはホモトリマーなど)は、TR4タンパク質が溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、1つ以上の本発明の抗体により結合されるへテロマルチマー(例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど)は、本発明のタンパク質が、溶液中でTR4ポリペプチドに対する抗体(融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む)と接触した場合に形成される。他の実施形態では、1つ以上の本発明の抗体により結合されるマルチマーは、本発明のTR4タンパク質との、および/または本発明のTR4タンパク質間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、タンパク質のポリぺプチド配列(例えば、配列番号1において列挙されるポリペプチドまたは、ATCC寄託番号97853中の寄託されたcDNAクローンによってコードされるポリペプチド)に含まれる1以上のアミノ酸残基を含み得る。1例では、この共有結合は、ネイティブ(すなわち、天然に存在する)ポリペプチドにおいて相互作用するタンパク質のポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、TR4融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる1以上のアミノ酸残基を含み得る。1例では、共有結合は、融合タンパク質に含まれる異種配列間にある(例えば、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。特定の例では、この共有結合は、(本明細書中に記載されるような)TR4−Fc融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のTNFファミリーリガンド/レセプターメンバー(例えば、オステオプロテゲリン(oseteoprotegerin)など)由来の異種ポリペプチド配列間にある(例えば、国際公開番号WO 98/49305号(この内容はその全体が本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。

0071

本発明の1つ以上の抗体によって結合され得るマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質は、当該分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して、化学的に架橋され得る(例えば、米国特許第5,478,925号(これは本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)さらに、1つ以上の本発明の抗体により結合され得るマルチマーは、当該分野で公知の技術を使用して生成されて、マルチマー中に含まれることが所望されるタンパク質のポリぺプチド配列内に位置するシステイン残基間に、1つ以上の分子間架橋を形成し得る(例えば、米国特許第5,478,925号(これは、本明細書中にその全体が参考として援用される)を参照のこと)。さらに、1つ以上の本発明の抗体により結合され得るタンパク質は、このタンパク質のポリぺプチド配列のC末端またはN末端へのシステインまたはビオチンの付加により慣用的に改変され得、当該分野で公知の技術が、1つ以上のこれらの改変されたタンパク質を含むマルチマーを生成するために適用され得る(例えば、米国特許第5,478,925号(これはその全体が本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。さらに、当該分野で公知の技術は、1つ以上の本発明の抗体により結合され得るマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質成分を含むリポソームを生成するために適用され得る(例えば、米国特許第5,478,925号(これはその全体が本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。

0072

あるいは、1つ以上の本発明の抗体により結合され得るマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて生成され得る。1つの実施形態では、1つ以上の本発明の抗体により結合され得るマルチマーに含まれるタンパク質は、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術を用いて組換え生成される(例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。特定の実施形態では、1つ以上の本発明の抗体により結合され得るホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、TR4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に連結し、次いでさらに元々のC末端からN末端の方向とは逆方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチドリーダー配列欠く)に連結することによって生成される(例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。別の実施形態では、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、組換えTR4ポリペプチドを生成する(例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。別の実施形態において、2つ以上のTR4ポリペプチドが合成リンカー(例えば、ペプチド糖鎖または可溶性ポリマーリンカー)を介して結合される。例としては、米国特許第5,073,627号(本明細書中に参考として援用される)に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーにより分けられた複合TR4ポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えDNA技術を用いて産生され得る。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ペプチドリンカーにより分けられる複合TR4ポリペプチドを含むタンパク質を結合する。

0073

マルチマーTR4ポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合されたTR4ポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのDNA結合タンパク質において同定され(Landschulzら,Science 240:1759、(1988))、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成またはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。TR4可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパードメインの例は、PCT出願WO 94/10308(本明細書中に参考として援用される)に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成またはトリマー形成をするペプチドに融合された可溶性TR4ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性マルチマーTR4は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4−ロイシンジッパー融合タンパク質モノマーおよび/またはTR4−ロイシンジッパー融合タンパク質マルチマーを結合する。

0074

タンパク質のTNFファミリーの特定のメンバーは、トリマー形態で存在すると考えられる(BeutlerおよびHuffel、Science 264:667,1994;Bannerら、Cell 73:431,1993)。従って、トリマーTR4は、増強された生物学的活性という利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分は、トリマーを優先的に形成する部分である。1例は、Hoppeら(FEBSLetters 344:191,(1994))および米国特許出願第08/446,922号(本明細書中に参考として援用される)に記載される通りの肺サーファクタントプロテインD(SPD)に由来するロイシンジッパーである。特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4−ロイシンジッパー融合タンパク質トリマーを結合する。

0075

天然に存在する三量体タンパク質由来の他のペプチドが、三量体TR4の調製に使用され得る。特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR4−融合タンパク質モノマーおよび/またはTR4融合タンパク質三量体を結合する。

0076

TR4レセプターポリペプチドを結合する抗体は、単離されたポリペプチドとしてかまたはそれらが天然に存在する状態でそれらを結合し得る。「単離されたポリペプチド」とは、そのネイティブの環境から除去されたポリペプチドを意図する。従って、産生され、そして/または組換え宿主細胞内に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。また、「単離されたポリペプチド」とは、組換え宿主細胞から部分的もしくは実質的に精製されているポリペプチドを意図する。例えば、TR4ポリペプチドの組換え的に産生されたバージョンは、SmithおよびJohnson,Gene 67:31−40(1988)に記載される一工程の方法により実質的に精製され得る。従って、本発明の抗体は、組換え産生されたTR4レセプターポリペプチドを結合し得る。特定の実施形態において、本発明の抗体は、遺伝子発現を制御する調節配列作動可能に結合された配列番号1のアミノ酸1〜468をコードするポリヌクレオチドを含む細胞の表面上で発現されるTR4レセプターを結合する。

0077

本発明の抗体は、ATCC寄託番号97853に含まれるcDNAによりコードされるか、またはATCC寄託番号97853に含まれるヌクレオチド配列、もしくはその相補鎖に(例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で)ハイブリダイズする核酸によりコードされる配列番号1に含まれるアミノ酸配列を含むか、あるいはその配列からなるTR4ポリペプチドを結合し得る。タンパク質フラグメントは、「染色されていない」か、そのフラグメントが一部または一領域、最も好ましくは単一の連続する領域を形成する、より大きなポリペプチドに含まれ得る。本発明の抗体は、例えば、以下:配列番号1のおおよそアミノ酸残基1〜おおよそアミノ酸残基23、おおよそアミノ酸残基24〜おおよそアミノ酸残基43、おおよそアミノ酸残基44〜おおよそアミノ酸残基63、おおよそアミノ酸残基64〜83、おおよそアミノ酸残基84〜103、おおよそアミノ酸残基104〜123、おおよそアミノ酸残基124〜143、おおよそアミノ酸残基144〜おおよそアミノ酸残基163、おおよそアミノ酸残基164〜おおよそアミノ酸残基183、おおよそアミノ酸残基184〜おおよそアミノ酸残基203、おおよそアミノ酸残基204〜おおよそアミノ酸残基223、おおよそアミノ酸残基224〜おおよそアミノ酸残基238、おおよそアミノ酸残基239〜おおよそアミノ酸残基264、おおよそアミノ酸残基265〜おおよそアミノ酸残基284、おおよそアミノ酸残基285〜おおよそアミノ酸残基304、おおよそアミノ酸残基305〜おおよそアミノ酸残基324、おおよそアミノ酸残基325〜おおよそアミノ酸残基345、おおよそアミノ酸残基346〜おおよそアミノ酸残基366、おおよそアミノ酸残基367〜おおよそアミノ酸残基387、おおよそアミノ酸残基388〜おおよそアミノ酸残基418、おおよそアミノ酸残基419〜おおよそアミノ酸残基439、および/またはおおよそアミノ酸残基440〜おおよそアミノ酸残基468を含むか、あるいはそれらからなるフラグメントを含む、ペプチドフラグメントを結合し得る。この文脈において、「おおよそ」とは、詳細には、いずれかの端または両方の端で、いくつかの(5、4、3、2、または1)アミノ酸だけ多いかまたは少ない、再び引用された値を含む。さらに、本発明の抗体により結合されるポリペプチドフラグメントは、少なくともおおよそ10アミノ酸長、少なくともおおよそ20アミノ酸長、少なくともおおよそ30アミノ酸長、少なくともおおよそ40アミノ酸長、少なくともおおよそ50アミノ酸長、少なくともおおよそ60アミノ酸長、少なくともおおよそ70アミノ酸長、少なくともおおよそ80アミノ酸長、少なくともおおよそ90アミノ酸長、少なくともおおよそ100アミノ酸長、少なくともおおよそ110アミノ酸長、少なくともおおよそ120アミノ酸長、少なくともおおよそ130アミノ酸長、少なくともおおよそ140アミノ酸長、少なくともおおよそ150アミノ酸長、少なくともおおよそ175アミノ酸長、または少なくともおおよそ200アミノ酸長であり得る。この文脈において、「おおよそ」とは、詳細には、いずれかの端または両方の端で、いくつかの(5、4、3、2、または1)アミノ酸だけ多いかまたは少ない、再び引用された値を含む。

0078

好ましくは、本発明の抗体は、以下:TR4レセプター細胞外ドメイン(配列番号1におけるおおよそ24〜238アミノ酸残基を構成すると予測される)を含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチド;TR4システインリッチドメインを含むかあるいは、それらからなるポリペプチド(それらの両方が配列番号1におけるおおよそ131〜229アミノ酸残基からなるタンパク質フラグメントにおいて見出され得る);配列番号1におけるおおよそ131〜183アミノ酸残基からなるTR4システインリッチドメインを含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチド;配列番号1におけるおおよそ184〜229アミノ酸残基からなるTR4システインリッチドメインを含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチド;TR4レセプター膜貫通ドメイン(配列番号1におけるおおよそ239〜264アミノ酸残基を構成すると予測される)を含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチド;予測される成熟TR4ポリペプチドのフラグメントを含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチドであって、ここでこのフラグメントが、TR4の機能的活性(例えば、抗原活性または生物学的活性)を有する、ポリペプチド;TR4レセプター細胞内ドメイン(配列番号1におけるおおよそアミノ酸残基265〜おおよそアミノ酸残基468を構成すると予測される)を含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチド;膜貫通ドメインの全てかまたは一部が欠失しているTR4レセプターの細胞外および細胞内ドメインを含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチド;TR4レセプター死ドメイン(配列番号1におけるおおよそアミノ酸残基379〜おおよそアミノ酸残基422を構成すると予測される)を含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチド;ならびにTRレセプタータンパク質のエピトープ保有部分のうち1、2、3、4以上を含むかあるいは、それらからなる、ポリペプチド、より選択されるポリペプチドフラグメントに結合する。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメントは、上記のメンバーのうち1、2、3、4、5、6、7、または8つ全ての任意の組み合わせを含むかあるいは、それらからなる。TR4レセプターの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを構成するアミノ酸残基がコンピュータ解析により予測されている。従って、当業者は、各々のドメインを規定するために用いられる基準に依存してこれらのドメインを構成するアミノ酸残基がわずかに(例えば、おおよそ1アミノ酸残基〜おおよそ15アミノ酸残基)変化し得ることを理解する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲に含まれる。

0079

TR4の細胞外システインリッチモチーフのうち一方または両方がTR4とそのリガンド(例えば、TRAIL)との相互作用のために重要であると考えられている。従って、非常に好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号1のアミノ酸残基131〜183、および/または184〜229を含むか、あるいはそれらからなるTR4ポリペプチドフラグメントを結合する。別の非常に好ましい実施形態において、本発明の抗体は、細胞外システインリッチモチーフ(配列番号1のアミノ酸残基131〜229)の両方を含むか、あるいはそれらからなるTR4ポリペプチドを結合する。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、TR4の細胞外可溶性ドメイン(配列番号1のアミノ酸残基24〜238)を含むか、あるいはそれからなるTR4ポリペプチドを結合する。非常に好ましい実施形態において、TR4の細胞外可溶性ドメインの全てまたは一部(例えば、システインリッチドメインの1つまたは両方)を結合する本発明の抗体は、TRAILリガンドがTR4に結合することを防ぐ。他の非常に好ましい実施形態において、TR4の細胞外可溶性ドメインの全てまたは一部(例えば、システインリッチドメインの1つまたは両方)を結合する本発明の抗体は、TR4レセプターと拮抗する。他の非常に好ましい実施形態において、TR4の細胞外可溶性ドメインの全てまたは一部(例えば、システインリッチドメインの1つまたは両方)を結合する本発明の抗体は、TR4レセプターを発現する細胞の細胞死を誘導する。

0080

本発明の抗体はまた、TR4の構造的または機能的な特性を含むか、またはそれらからなるフラグメントを結合し得る。そのようなフラグメントは、完全な(すなわち、全長)TR4のαヘリックスおよびαヘリックス形成領域(「α領域」)、βシートおよびβシート形成領域(「β領域」)、ターンおよびターン形成領域(「ターン領域」)、コイルおよびコイル形成領域(「コイル領域」)、親水性領域疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、および高い抗原性指標の領域(high antigenic index region)(すなわち、Jameson−Wolfプログラムのデフォルトパラメーターを用いて識別される場合、1.5以上の抗原性指標を有する4つ以上の連続するアミノ酸を含む)を含むアミノ酸残基を含む。特定の好ましい領域は、表2に示される領域であり、そして(配列番号1)に示されるアミノ酸配列の分析により識別される前記の型の領域が挙げられるが、それらに限定されず、そのような好ましい領域としては、Garnier−Robson α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域;Chou−Fasman α領域、β領域、およびターン領域;Kyte−Doolittle親水性領域;Eisenberg α両親媒性領域およびβ両親媒性領域;Emini表面形成領域;ならびにJameson−Wolfの高い抗原性指標領域が挙げられる(これらは、これらのコンピュータプログラムのデフォルトパラメーターを用いて予測されるとおりである)。

0081

上記のような、表2に示されるTR4の構造的特性または機能的特性を示すデータは、デフォルトパラメータでセットされるDNA*STARの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用いて作製された。列Iは、αヘリックス領域のGarnier−Robson分析の結果を表す;列IIは、αヘリックス領域のChou−Fasman分析の結果を表す;列IIIは、βシート領域のGarnier Robson分析の結果を表す;列IVは、βシート領域のChou−Fasman分析の結果を表す;列Vは、ターン領域のGarnier Robson分析の結果を表す;列VIは、ターン領域のChou−Fasman分析の結果を表す;列VIIは、コイル領域のGarnier Robson分析の結果を表す;列VIIIは、Kyte−Doolittle親水性プロットを表す;列IXは、α両親媒性領域のEisenberg分析の結果を表す;列Xは、β両親媒性領域のEisenberg分析の結果を表す;列XIは、可撓性領域のKarplus−Schultz分析の結果を表す;列XIIは、Jameson−Wolfの抗原性指標のスコアを表す;そして列XIIIは、Emini表面の可能性のプロットを表す。

0082

好ましい実施形態において、表2の列VIII、XII、およびXIIIに示されるデータは、抗原性の潜在能力を高い程度で阻害するTR4の領域を決定するために用いられ得る。高い抗原性の領域は、免疫応答の開始のプロセスにおいて抗原認識が起こり得る環境で、ポリペプチドの表面に曝されているようであるポリペプチドの領域を表す値を選択することによって、列VIII、XII、および/またはXIIIに示されるデータから決定される。

0083

表2に示される上述の好ましい領域としては、配列番号1に示されるアミノ酸配列の分析により識別される前出の型の領域が挙げられるが、これらに限定されない。表2に示されるように、そのような好ましい領域としては、Garnier−Robson α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域;Chou−Fasman α領域、β領域、およびターン領域;Kyte−Doolittle親水性領域;Eisenberg α両親媒性領域およびβ両親媒性領域;Karplus−Schulz可撓性領域、高い抗原性指標のJameson−Wolf領域ならびにEmini表面形成領域が挙げられる。複数の構造的特徴(例えば、上記および表2に示されるいくつか(例えば、1、2、3、または4)の同じかまたは異なる領域の特性)に結びつくTR4の領域を含むポリペプチドフラグメントは、1つ以上の本発明の抗体により結合される好ましいポリペプチドフラグメントの範囲にある。

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別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを結合する抗体を提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の部分として規定される。一方、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として規定される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般的に、抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998−4002(1983)を参照のこと。

0095

抗原性エピトープを保有する(すなわち、抗原が結合し得るタンパク質分子の領域を含む)ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドは、通常、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を誘発し得ることが、当該分野において周知である。例えば、Sutcliffe,J.G.、Shinnick,T.M.、Green,N.およびLearner,R.A.(1983)Antibodies that react with predetermined sites on proteins.Science 219:660−666を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の1次配列中に頻繁に現れ、一組の単純な化学法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫的優性な領域(すなわち、免疫原性エピトープ)にも、アミノ末端にもカルボキシル末端にも制限されない。

0096

従って、抗原性エピトープを保有するペプチドおよびポリペプチドは、本発明のTR4ポリペプチドに結合する抗体(モノクローナル抗体を含む)を惹起するのに有用である。例えば、Wilsonら、Cell 37:767−778(1984)の777を参照のこと。抗原性エピトープを保有するペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列に含まれる、好ましくは少なくとも7、より好ましくは少なくとも9、そして最も好ましくは少なくとも約15〜約30のアミノ酸を含む。

0097

本発明の抗体は、配列番号1のおおよそアミノ酸残基35〜おおよそアミノ酸残基92を含むポリペプチド;配列番号1のおおよそアミノ酸残基114〜おおよそアミノ酸残基160のアミノ酸残基を含むポリペプチド;配列番号1のおおよそアミノ酸残基169〜おおよそアミノ酸残基240のアミノ酸残基を含むポリペプチド;配列番号1のおおよそアミノ酸残基267〜おおよそアミノ酸残基298のアミノ酸残基を含むポリペプチド;配列番号1のおおよそアミノ酸残基330〜おおよそアミノ酸残基364のアミノ酸残基を含むポリペプチド;配列番号1のおおよそアミノ酸残基391〜おおよそアミノ酸残基404を含むポリペプチド;および/または配列番号1のおおよそアミノ酸残基418〜おおよそアミノ酸残基465を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない1以上の抗原性TR4ポリペプチドまたは抗原性TR4ペプチドを結合し得る。この文脈において、「おおよそ」とは、詳細には、いずれかの端または両方の端で、いくつかの(5、4、3、2、または1)アミノ酸だけ多いかまたは少ない、再び引用される範囲を含む。上記のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントが、TR4タンパク質の抗原性領域であることを決定した。エピトープを保有するTR4ペプチドおよびTR4ポリペプチドは、任意の従来の手段で作製され得る。Houghten,R.A.,「General method for the rapid solid−phase synthesis of large numbers of peptides:specificity of antigen−antibody interaction at the level of individual amino acids」 Proc.Natl.Acad Sci.USA 82:5131−5135(1985)。この「同時多重ペプチド合成(Simultaneous Multiple Peptide Synthesis)(SMPS)」工程は、Houghtenらに対する米国特許第4,631,211号(1986)にさらに記載される。

0098

当業者は、本明細書中に記載されるTR4ポリペプチドおよびそのエピトープを保有するフラグメント(例えば、配列番号1のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基240のような細胞外ドメインの一部に対応する)は、免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの一部と結合されて、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの増大された半減期を示す。このことは、例えば、第一のヒトCD4ポリペプチドの2つのドメインおよび哺乳動物イムノグロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域からなるキメラタンパク質について示されている(EPA 394,827;Trauneckerら、Nature 331:84−86(1988))。IgG部分に起因して、ジスルフィド結合した二量体構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子の結合および中和において単量体TR4タンパク質またはTR4タンパク質フラグメント単独より効率的であり得る(Fountoulakisら、J Biochem 270:3958−3964(1995))。従って、本発明の抗体は、TR4ポリペプチドの全てまたは一部(例えば、TR4)を含む融合タンパク質を結合し得る。

0099

当業者に公知の組み換えDNA技術は、単数または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む新規の変異体タンパク質または「変異体」を作製するために使用され得る。そのような改変されたポリペプチドは、例えば、増大した活性または増大した安定性を示し得る。さらに、これらは、より高い収率で精製され得、かつ少なくとも特定の精製条件および貯蔵条件で天然のポリペプチドより良好な溶解性を示す。本発明の抗体はまた、そのような改変されたTR4ポリペプチドまたはTR4ポリペプチドフラグメントもしくはTR4ポリペプチド改変体を結合し得る。

0100

例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質成熟形態を含む多くのタンパク質について、1つ以上のアミノ酸が、生物学的機能を実質的に損失することも、特定の抗体により結合される能力を損失することもなくN末端またはC末端から欠失され得る。例えば、Ronら、J.Biol.Chem.268:2984−2988(1993)は、3、8、または27のアミノ末端アミノ酸残基を欠失している場合でさえもヘパリン結合活性を有する改変されたKGFタンパク質を報告した。本発明の場合、TR4は、死ドメイン含有レセプター(DDCR)ポリペプチドファミリーのメンバーであるので、配列番号1における109位のシステインまでのN末端アミノ酸の欠失は、いくつかの生物学的活性(例えば、アポトーシスを誘導する能力)を維持し得る。配列番号1における109位のシステイン残基(C109)は、ファミリーメンバー内で一定でありかつリガンド結合に必要とされる構造的安定性を提供するためのジスルフィド結合を形成するために必要とされ得るので、この残基を含むN末端の欠失をさらに有するポリペプチドが、そのような生物学的活性を維持するとは予想されない。

0101

しかし、タンパク質のN末端からの1つ以上のアミノ酸の欠失がこのタンパク質の1つ以上の生物学的機能の改変または欠損を生じる場合でさえも、他の機能的活性(例えば、生物学的活性、多量体化する能力、TR4リガンド(例えば、TRAIL)に結合する能力)は、なお維持され得る。例えば、短縮されたTR4ポリペプチドがTR4ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導しかつ/またはその抗体に結合する能力は、この完全な形態または成熟形態のポリペプチドの残基のうち多数よりは少ないものがN末端から除去される場合、一般的に、維持される。完全なポリペプチドのN末端残基を欠失する特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性を維持するか否かは、本明細書中に記載される従来の方法および当該分野における他の公知の方法により容易に決定され得る。多数のN末端アミノ酸残基の欠失を有するTR4ポリペプチドは、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性を維持し得ないようである。実際、6程度に少ないTRアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を誘発し得る。

0102

従って、本発明は、配列番号1のTR4アミノ酸配列のアミノ末端から463位のセリン残基まで1以上の残基を欠失するポリペプチドに結合する抗体およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は、配列番号1の残基n1−468のアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合する抗体を提供する(ここで、n1は、配列番号1におけるアミノ酸残基の位置に対応する2〜463の整数である)。

0103

より詳細には、本発明は、配列番号1のTR4配列の

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の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドを結合する抗体を提供する。

0108

別の実施形態において、このTR4ポリペプチドのN末端欠失は、一般式n2〜238により示され得る(ここでn2は、配列番号1の同定されたアミノ酸配列に対応する2〜238の数である)。特定の実施形態において、本発明の抗体は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるTR4のN末端の欠失を結合する:配列番号1のTR4細胞外ドメイン配列の

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。上記されるように、たとえ、タンパク質のC末端からの1つ以上アミノ酸の欠失が、このタンパク質の1つ以上の生物学的機能の損失という改変を生じるとしても、他の機能的活性(例えば、生物学的活性、マルチマーを形成する能力、DR4リガンド(例えば、TRAIL)を結合する能力)は、なお保持され得る。完全ポリペプチド、または成熟ポリペプチド大多数に満たない残基が、C末端から除去される場合、例えば、短縮されたTR4ポリぺプチドが、このTR4ポリぺプチドの完全形態、または成熟形態を認識する抗体を誘導し、そして/またはその抗体に結合する能力は、一般に保持される。完全ポリぺプチドのC末端残基を欠く特定のポリぺプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的方法、およびそうでなければ当該分野で公知の方法によって容易に決定され得る。多数の欠失C末端アミノ酸残基を有するTR4ポリペプチドは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得るようでない。実際、わずか6つのTR4アミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を引き起こし得る。

0113

従って、本発明は、配列番号1に示されるTR4ポリペプチド配列のアミノ酸配列のカルボキシ末端から、位置番号30のアラニン残基までの1つ以上の残基が欠失されたポリぺプチドを結合する抗体、およびこのようなポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は、配列番号1の残基24−m1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合する抗体を提供し、ここでm1は、配列番号1のアミノ酸残基の位置に対応する30〜467の整数である。

0114

より詳細には、本発明は、配列番号1のTR4配列の以下の残基のアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれらのアミノ酸配列からなるポリペプチドを結合する抗体を提供する:

0115

0116

0117

0118

0119

別の実施形態においては、本発明の抗体は、一般式24−m2によって記載され得るC末端欠失TR4ポリペプチドを結合し、ここでm2は、配列番号1の同定されたアミノ酸配列に対応する30〜238の数である。特定の実施形態においては、本発明は、配列番号1のTR4細胞外ドメイン配列の以下の残基のアミノ酸配列を含むか、またはこれらのアミノ酸配列からなるTR4ポリペプチドを結合する抗体を提供する:

0120

0121

0122

本発明は、配列番号1のTR4ポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から、配列番号1のC−221までの1つ以上の残基を有するポリぺプチドを結合する抗体をさらに提供する。詳細には、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列の残基1−m9のアミノ酸配列を有するポリペプチドを結合する抗体を提供し、ここでm9は、221〜468の範囲内の任意の整数であり、そして残基C−221は、TR4タンパク質のレセプター結合活性に必要であると考えられる、完全TR4ポリペプチド(配列番号1に示される)のC末端から最初の残基の位置である。

0123

本発明はまた、配列番号1の残基n1−m1、および/またはn2−m2を有すると一般に記載され得る、TR4ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から1つ以上のアミノ酸が欠失されているポリペプチドを結合する抗体を提供し、ここでn1、n2、m1、およびm2は、上記のような整数である。

0124

ATCC寄託番号97853に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全なTR4アミノ酸配列の一部からなるポリペプチドを結合する抗体(ここでこの部分は、ATCC寄託番号97853に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端から1〜約108アミノ酸を除外するか、もしくはATCC寄託番号97853に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列のカルボキシ末端から1〜約247のアミノ酸を除外する)、またはATCC寄託番号97853に含まれるcDNAクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列の上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組合せもまた含まれる。

0125

好ましくは、本発明の抗体は、細胞外ドメイン部分(すなわち、配列番号1の残基24〜238内)を含むTR4フラグメントを結合する。なぜならば、この中の任意の部分は、溶解することが期待されるからである。

0126

TR4のいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能への有意な影響なしに、変化され得ることが当該分野で認識される。配列中のこのような差異が考慮される場合、タンパク質上に活性を決定する重要な領域が存在することが覚えておかなければならない。このような領域は、通常、リガンド結合部位もしくはデスドメインを作製する残基、またはこれらのドメインに影響する三次構造を形成する残基を含む。

0127

従って、本発明は、実質的なTR4タンパク質活性を示すか、または以下に考察するタンパク質フラグメントのようなTR4領域を含むTR4タンパク質のバリエーションを結合する抗体をさらに含む。このような変異体は、欠失、挿入、反転、反復およびタイプ置換を含む。どのアミノ酸変化表現型的サイレントありそうかに関するガイダンスは、Bowie,J.U.ら、Science 247:1306〜1310(1990)に見出され得る。

0128

従って、本発明の抗体は、配列番号1のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログ、またはATCC寄託番号97853のcDNAによりコードされる配列番号1のポリペプチドを結合し得る。このようなフラグメント、変異体または誘導体は、(i)アミノ酸残基の少なくとも1つ以上が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基、そしてより好ましくは、少なくとも1つ、しかし10未満の保存されたアミノ酸残基)で置換されているものであってもよいし、そしてこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされたものであっても、もしくはそうでなくてもよく、または(ii)アミノ酸残基の1つ以上が置換基を含むものであってももしくはそうでなくてもよく、または(iii)成熟ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物と融合されたものであってもそうでなくてもよく、または(iv)さらなるアミノ酸(例えば、IgGFc融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列)が成熟ポリペプチドと融合されたものであっても、そうでなくてもよい。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書における教示から当業者の範囲内であるとみなされる。

0129

特に興味深いことは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸、および中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、正電荷が低下したタンパク質を生じ、TR4タンパク質の特性を改善する。凝集の阻止は、非常に望ましい。タンパク質の凝集は、薬学的処方物を調製する場合、活性を失うのみでならず、問題でもあり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得るからである(Pinckardら、Clin.Exp.Immunol.2:331〜340(1967);Robbinsら、Diabetes 36:838〜845(1987);Clelandら、Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307〜377(1993))。

0130

アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変え得る。Ostadeら、Nature 361:266〜268(1993)は、TNF−αの、TNFレセプターの2つの公知の型の1つのみへの選択的結合を生じる特定の変異を記載している。従って、本発明の抗体は、天然の変異または人工的操作のいずれかに由来する1つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むTR4レセプターを結合し得る。

0131

示されるように、変化は好ましくは、タンパク質の折り畳み、または活性に有意に影響しない軽微性質(例えば、保存アミノ酸の置換)である(表3を参照のこと)。

0132

0133

特定の実施形態においては、配列番号1のアミノ酸配列および/または本明細書中で記載されるポリペプチドフラグメントのいずれか(例えば、細胞外ドメインまたは細胞内ドメイン)における置換、付加、または欠失の数は、75、70、60、50、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1または30〜20、20〜15、20〜10、15〜10、10〜1、5〜10、1〜5、1〜3または1〜2である。

0134

特定の実施形態においては、本発明の抗体は、TR4ポリペプチド、またはこれらのフラグメントもしくは変異体(特に、TR4の細胞外可溶性ドメインを含むか、またはこれらからなるフラグメント)を結合し、TR4中の任意の1つ以上の以下の保存的変異体を含む:
配列番号1の

0135

0136

0137

0138

0139

0140

0141

特定の実施形態においては、本発明の抗体は、TR4ポリペプチドまたはこれらのフラグメントもしくは変異体(特に、TR4の細胞外可溶性ドメインを含むか、またはこれらからなるフラグメント)を結合し、TR4中の任意の1つ以上の以下の非保存的変異体を含む:
配列番号1の

0142

0143

0144

0145

0146

0147

0148

0149

0150

0151

0152

0153

0154

本発明のTR4タンパク質中の、機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異体誘発のような、当該分野で公知の方法によって同定され得る(CunninghamおよびWells、Science 244:1081−1085(1989))。後者の手順は、分子中の全ての残基で単一のアラニン変異体を導入する。次いで、得られた変異体分子は、生物学的活性(例えば、レセプター結合活性もしくはインビトロ増殖活性、またはインビトロ増殖活性)について試験される。リガンド−レセプター結合について決定的である部位はまた、構造解析(例えば、結晶化、核磁気共鳴法または光親和性標識)により決定され得る(Smithら、J.Mol.Biol.224:899−904(1992)およびde Vosら、Science 255:306−312(1992))。好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、TR4機能に必須であるTR4領域を結合する。他の好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、TR4機能に必須であるTR4領域を結合し、そしてTR4機能を阻害または無効にする。他の好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、TR4に必須であり、そしてTR4機能を増強するTR4領域を結合する。

0155

さらに、タンパク質工学がTR4ポリペプチドの特徴を改良または改変するために、使用され得る。当業者に公知の組換えDNA技術は、単一もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは融合タンパク質を含む、新規の変異体タンパク質またはムテインを作成するために使用され得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、増強された活性または高い安定性を示し得る。さらに、これらは、少なくとも特定の精製条件および保存条件の下では、より高い収率で精製され得、そして対応する天然ポリペプチドよりも良好な溶解性を示し得る。本発明の抗体は、このような改変されたTR4ポリペプチドを結合し得る。

0156

天然に存在しないTR4の改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して生成され得、これらの技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキャニング、PCR変異誘発、部位特異的変異誘発(例えば、Carterら、Nucl.AcidsRes.13:4331(1986);およびZollerら、Nucl.Acids Res.10:6487(1982)を参照のこと)、カセット変異誘発(例えば、Wellsら、Gene 34:315(1985)を参照のこと)、制限選択変異誘発(restriction selection mutagenesis)(例えば、Wellsら、Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317:415(1986)を参照のこと)。

0157

従って、本発明はまた、選択された宿主細胞における発現、スケールアップなどについてより適したTR4ポリペプチドを生成するために、1つ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されたTR4の誘導体およびアナログを結合する抗体を含む。例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を除去するために、欠失され得るか、または別のアミノ酸残基で置換され得る;N連結型グリコシル化部位は、例えば、N連結部位高グリコシル化する(hyperglycosylate)ことが公知である酵母宿主からより容易に回収および精製される、均質な産物の発現を達成するために、改変され得または除去され得る。この目的のために、TR4ポリペプチドの任意の1以上のグリコシル化認識配列上の第1または第3のアミノ酸位置の一方あるいは両方での種々のアミノ酸置換、および/または任意の1以上のこのような認識配列の第2位でのアミノ酸欠失は、その改変トリペプチド配列でのTR4のグリコシル化を妨げる(例えば、Miyajimoら、EMBO J 5(6):1193−1197を参照のこと)。さらに、TR4ポリペプチドの1以上のアミノ酸残基(例えば、アルギニン残基およびリジン残基)が、プロテアーゼ(例えば、フリン(furin)またはケキシン(kexin))による望まれないプロセシングを排除するために、欠失され得るかまたは別の残基で置換され得る。

0158

本発明の抗体はまた、以下を結合する抗体を含む:リーダーを含む、寄託されたcDNA(ATCC受託番号97853を有する寄託)によってコードされるポリペプチドを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;リーダー(すなわち、成熟タンパク質)を差し引いた寄託されたcDNAをによって、コードされる成熟ポリペプチドを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;リーダーを含む配列番号1のポリペプチドを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;アミノ末端のメチオニンを差し引いた配列番号1のポリペプチドを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;リーダーを差し引いた配列番号1のポリペプチドを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;TR4細胞外ドメインを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;TR4システインリッチドメインを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;TR4膜貫通ドメインを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;TR4細胞内ドメインを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;TR4デスドメインを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;細胞外ドメインおよび細胞内ドメインの全てまたは部分を含むが、膜貫通ドメインを欠失している、可溶性ポリペプチドを含むか、またはこれらからなるポリペプチド;ならびに上記のポリペプチド(例えば、寄託されたcDNAクローン(ATCC受託番号97853を有する寄託物)によってコードされるポリペプチド)に対して少なくとも80%同一、より好ましくは、少なくとも90%もしくは95%同一、なおさらに好ましくは、少なくとも96%、97%、98%もしくは99%同一であるポリペプチド、配列番号1のポリペプチド、ならびに少なくとも30のアミノ酸およびさらに好ましくは、少なくとも50のアミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分。

0159

TR4ポリペプチドの参照アミノ酸配列と例えば、少なくとも95%「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリヌクレオチオド配列がTR4ポリペプチドの参照アミノ酸の各100アミノ酸あたり5つまでの変異を含み得ることを除いて、この参照配列と同一であるポリペプチドのアミノ酸配列が意図される。言いかえると、参照アミノ酸配列に少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、この参照配列におけるアミノ酸残基の5%までが、欠失され得るかまたは別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは参照配列における全アミノ酸残基の5%までの多くのアミノ酸が、この参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置、またはこの参照配列中の残基間の個々にか、もしくは参照配列内の1以上の隣接した群においてのいずれかで分散された、これらの末端位置の間のどこでも起こり得る。

0160

実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号1に示されるアミノ酸配列、または寄託されたcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム(例えば、Bestfit program(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix(登録商標),Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)を使用して従来どおり決定され得る。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、95%同一であるか否かを決定する場合は、当然のことながら、同一性のパーセントがこの参照アミノ酸配列の全長にわたり算定され、そしてこの参照配列におけるアミノ酸残基数全体の5%までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。

0161

特定の実施形態においては、参照(問い合わせ)配列(本発明の配列)と対象配列との間の同一性(全体的な配列整列ともいわれる)は、Brutlagら、(Comp.App.Biosci.6:237−245(1990))のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムを使用して決定される。FASTDBアミノ酸整列において使用される好ましいパラメーターは、Matrix=PAM 0、k−tuple=2、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty=20、Randomization Group Length=0、Cutoff Score=1、Window Size=sequence length、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty=0.05、Window Size=500または対象アミノ酸配列の長さ(いずれかより短い方)である。この実施形態に従って、全体的な同一性パーセントを算定する場合は、FASTDBプログラムが、対象配列のN末端およびC末端の短縮を説明しないという事実を考慮に入れるように、対象配列がN末端またはC末端の欠失のために(内部欠失が理由ではなく)、問い合わせ配列よりも短い場合、手動補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対して、N末端またはC末端で短縮化された対象配列について、同一性パーセントは、この問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致/整列されない対象配列のN末端およびC末端である問い合わせ配列残基の数を算定することによって補正される。残基が一致/整列されるか否かの決定は、FASTDB配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、特定のパラメーターを使用して上記のFASTDBプログラムによって算定された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアが、本実施形態の目的に使用されるものである。問い合わせ配列と一致/整列されいていない、対象配列のN末端およびC末端の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、この対象配列の最も遠くのN末端残基およびC末端残基の外側に位置する。例えば、90アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために100残基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列のN末端で生じ、従って、FASTDB整列は、N末端の最初の10残基で一致/整列を示さない。この10の不対残基は、配列の10%(一致していないN末端およびC末端での残基の数/問い合わせ配列中の残基の総数)を表し、そのため10%は、FASTDBプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの90残基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは90%である。別の例では、90残基の対象配列が、100残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致/整列しない対象配列のN末端またはC末端での残基は存在しない。この場合、FASTDBによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わせ配列と一致/整列しない対象配列のN末端およびC末端の残基の外側に位置する残基のみが、FASTDB整列で示される場合、手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。

0162

本願はまた、n1−m1、および/またはn2−m2として本明細書中で示されるTR4ポリペプチド配列に、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%同一なポリペプチドを含むタンパク質を結合する抗体に関する。好ましい実施形態においては、本願は、本明細書中に列挙される特定のTR4のN末端欠失型および/またはC末端欠失型のアミノ酸配列を有するポリペプチドに、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%または99%同一なポリペプチドを含むタンパク質を結合する抗体に関する。

0163

特定の好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、上記されるTR4融合タンパク質を結合し、ここで、融合タンパク質のTR4部分は、本明細書中でn1−m1および/またはn2−m2として記載されるものである。

0164

(TR7)
本発明の特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR7ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体を結合する。以下の節は、さらに詳しく、本発明の抗体によって結合され得るTR7のポリペプチド、フラグメントおよび変異体を記載する。本発明の抗体によって結合され得るこのTR7のポリペプチド、フラグメントおよび変異体は例えば、その全体が本明細書中で参考として援用される、国際公開WO98/41629、WO00/66156およびWO98/35986にもまた、記載される。

0165

特定の実施形態においては、本発明の抗体は、TR7ポリペプチドを免疫特異的に結合する。いくつかの実施形態において、TR7を免疫特異的に結合する抗体は、TR7のフラグメント形態、改変体(TR7のオルソログ(ortholog)種を含む)、マルチマー形態または改変形態を結合し得る。例えば、TR7に対して免疫特異的な抗体は、TR7の全てまたは部分を含む融合タンパク質のTR7部分を結合し得る。

0166

TR7タンパク質は、モノマーまたはマルチマー(すなわち、ダイマー、トリマー、およびより高度なマルチマー)として見出され得る。従って、本発明は、モノマーとして、またはマルチマーの部分として見出されるTR7タンパク質を結合する抗体に関する。特定の実施形態においては、このTR7ポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマー、またはテトラマーである。さらなる実施形態においては、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーである。

0167

本発明の抗体は、TR7ホモマー、またはTR7ヘテロマーを結合し得る。本明細書中で使用される、用語「ホモマー」とは、本発明のTR7タンパク質のみ(本明細書中で記載される場合、TR7のフラグメント、変異体、および融合タンパク質を含む)含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるポリペプチド配列を有するTR7タンパク質を含み得る。特定の実施形態においては、本発明のホモマーは、同一のポリペプチド配列を有するTR7タンパク質のみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態においては、本発明の抗体は、異なるポリペプチド配列を有するTR7タンパク質を含むTR7ホモマーを結合する。特定の実施形態においては、本発明の抗体は、TR7ホモダイマー(例えば、同一または異なるポリペプチド配列を有する、TR7タンパク質を含む)またはホモトリマー(例えば、同一または異なるポリペプチド配列を有する、TR7タンパク質を含む)を結合する。さらなる実施形態においては、本発明の抗体は、TR7の少なくともホモダイマ−、少なくともホモトリマー、または少なくともホモテトラマーを結合する
本明細書で使用される場合、用語ヘテロマーとは、本発明のTR7タンパク質に加えて、異種タンパク質(すなわち、TR7遺伝子によってコードされるポリペプチド配列に対応しないポリペプチド配列を含むタンパク質)を含むマルチマーをいう。特定の実施形態においては、本発明の抗体は、ヘテロダイマー、ヘテロトリマー、またはヘテロテトラマーを結合する。さらなる実施形態においては、本発明の抗体は、1以上のTR7ポリペプチドを含む、少なくともホモダイマ−、少なくともホモトリマー、または少なくともホモテトラマーを結合する。

0168

本発明の1以上の抗体によって結合されるマルチマーは、疎水性結合、親水性結合、イオン結合および/または共有結合の結果であり得、そして/あるいは例えば、リポソーム形成によって間接的に連結され得る。従って、1つの実施形態においては、本発明の1以上の抗体によって結合されるマルチマー(例えば、ホモダイマーまたはホモトリマー)は、TR7タンパク質が溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態においては、本発明の1以上の抗体によって結合されるヘテロマルチマー(例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマー)は、TR7タンパク質がTR7ポリペプチドに対する抗体(融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む)と溶液中で接触する場合に形成される。他の実施形態において、本発明の1以上の抗体によって結合されるマルチマーは、本発明のTR7タンパク質との共有結合および/または本発明のTR7タンパク質の間での共有結合によって形成され得る。このような共有結合は、タンパク質(例えば、配列番号3中に列挙されるポリペプチド配列、またはATTCC寄託番号97920の寄託されたcDNAクローンによってコードされるポリペプチド)のポリペプチド配列中に含まれる1以上のアミノ酸残基を含み得る。一例において、この共有結合は、ネイティブな(すなわち、天然に存在する)ポリペプチドにおいて相互作用するタンパク質のポリペプチド配列中に位置するシステイン残基の間での架橋である。別の例において、この共有結合は、化学的操作または組換え的操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、TR7融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列中に含まれる1以上のアミノ残基を含み得る。一例において、共有結合は、融合タンパク質中に含まれる異種配列の間にある(例えば、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。特定の例において、この共有結合は、(本明細書中で記載されるように)TR7−Fc融合タンパク質中に含まれる異種配列の間にある。別の特定の例において、融合タンパク質の共有結合は、例えば、オステオプロテゲリン(oseteoprotegerin)のような共有結合したマルチマーを形成し得る別のTNFファミリーリガンド/レセプターメンバー由来の異種ポリペプチド配列の間にある(例えば、国際公開WO98/49305を参照のこと、この内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される)。

0169

本発明の1以上の抗体によって結合され得るマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質は、当該分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して化学的に架橋され得る(例えば、本明細書中でその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。さらに、本発明の1以上の抗体によって結合され得るマルチマーは、当該分野で公知の技術を使用して、生成され得て、そのマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質のポリペプチド配列内に位置されるシステイン残基の間の1以上の分子間架橋を形成する(例えば、本明細書中でその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。さらに、本発明の1以上の抗体によって結合され得るタンパク質は、このタンパク質のポリペプチド配列のC末端またはN末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、1以上のこれらの改変されたタンパク質を含むマルチマーを作製するために適用され得る(例えば、本明細書中でその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。さらに、当該分野で公知の技術が、本発明の1以上の抗体によって結合され得るマルチマーに含まれることが所望されるタンパク質成分を含むリポソームを生成するために適用され得る(例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。

0170

あるいは、本発明の1以上の抗体によって結合され得るマルチマーは、当該分野で、公知の遺伝子操作技術を使用して作成され得る。1つの実施形態においては、本発明の1以上の抗体によって結合され得るマルチマーに含まれるタンパク質は、本明細書中で記載されるかそうでなければ当該分野で公知の、融合タンパク質技術を使用して組換え的に産生される(例えば、本明細書中でその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。特定の実施形態においては、本発明の1以上の抗体によって結合され得るホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、TR7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に連結し、次いでさらに本来のC末端からN末端へとは、逆方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリペプチド(リーダー配列を欠く)に連結することによって作成される(例えば、本明細書中でその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。別の実施形態においては、本明細書中で記載されるかそうでなければ当該分野で公知の組換え技術は、膜貫通ドメインを含む組換えTR7ポリペプチド作成するために適用され得、そして組換え技術は、リポソーム内への膜の再構築技術によって取り込まれ得る(例えば、本明細書中でその全体が参考として援用される、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。別の実施形態においては、2以上のTR7ポリペプチドは、合成リンカー(例えば、ペプチド、糖質または可溶性ポリマーリンカー)を介して、結合される。例としては、米国特許第5,073,627号(本明細書で参考として援用される)に記載されるペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーによって分離された複数のTR7ポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えDNA技術を使用して生成され得る。特定の実施形態においては、本発明の抗体は、ペプチドリンカーによって分離された複数のTR7ポリペプチドを含むタンパクを結合する。

0171

マルチマーTR7ポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーまたはイソロイシンポリペプチド配列に融合したTR7ポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質の多量体化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは、元々いくつかのDNA結合タンパク質中で同定され(Landschulzら、Science 240:1759(1988))、そして種々の異なるタンパク質中に以前から見出されている。公知のロイシンジッパーは、天然に存在する二量体化または三量体化するペプチドおよびその誘導体である。可溶性マルチマーTR7タンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例は、PCT出願WO94/10308に記載され、これは、本明細書中で参考として援用される。溶液中で二量体化または三量体化するペプチドに融合した可溶性TR7ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして生じた可溶性マルチマーTR7は、当該分野において公知の技術を用いて培養上清から回収される。特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR7ロイシンジッパー融合タンパク質モノマーおよび/またはTR7ロイシンジッパー融合タンパク質マルチマーに結合する。

0172

タンパク質のTNFファミリーの特定のメンバーは、トリマー形態で存在すると考えられる(BeutlerおよびHuffel,Science 264:667,1994;Bannerら、Cell 74:431,1993)。従って、トリマーTR7は、増強された生物学的活性の利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分は、優先的にトリマー形態である。1つの実施例は、肺表面活性タンパク質D(lung surfactant protein D(SPD)由来のロイシンジッパーであり、本明細書中で参考として援用される、Hoppeら(FEBSLetters 344:191,(1994))および米国特許出願番号08/446,922に記載されるとおりである。特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR7ロイシンジッパー融合タンパク質トリマーに結合する。

0173

天然に存在するトリマータンパク質由来の他のペプチドは、トリマーTR7の調製において用いられ得る。特定の実施形態において、本発明の抗体は、TR7融合タンパク質モノマーおよび/またはTR7融合タンパク質トリマーに結合する。

0174

TR7レセプターポリペプチドに結合する抗体は、単離されたポリペプチドとしてか、またはその天然に存在する状態でそれに結合し得る。「単離されたポリペプチド」は、その自然環境から取り出されたポリペプチドを意図する。従って、組換え宿主細胞内で生成され、そして/またはその内に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。組換え宿主細胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドもまた、「単離されたポリペプチド」として意図される。例えば、TR7ポリペプチドの組換え生成された型は、SmithおよびJohnson,Gene 67:31〜40(1988)に記載される1工程の方法によって、実質的に精製される。従って、本発明の抗体は、組換え生成されたTR7レセプターポリペプチドに結合し得る。特定の実施形態において、本発明の抗体は、遺伝子発現を制御する調節配列と作動可能に結合した、配列番号3のアミノ酸1〜411をコードするポリヌクレオチドを含む細胞の表面で発現されるTR7レセプターに結合する。

0175

本発明の抗体は、ATCC受託番号97920に含まれるcDNAによってコードされるか、もしくはATCC受託番号97920に含まれるヌクレオチド配列にハイブリダイズ(例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で)する核酸によってコードされる、配列番号3に含まれるアミノ酸配列、またはその相補鎖を含むか、あるいはそれからなるポリペプチドを含む、TR7ポリペプチドまたはTR7ポリペプチドフラグメントに結合し得る。タンパク質フラグメントは、「自由鎖」であり得るか、またはフラグメントが部分または領域を、最も好ましくは単一の連続した領域として形成する、より大きなポリペプチドを構成し得る。本発明の抗体は、ポリペプチドフラグメントに結合し得、このポリペプチドフラグメントとしては、例えば、以下のアミノ酸残基を含むか、あるいはこれらからなるフラグメントが挙げられる:配列番号3の1〜51、52〜78、79〜91、92〜111、112〜134、135〜151、152〜178、179〜180、181〜208、209〜218、219〜231、232〜251、252〜271、272〜291、292〜311、312〜323、324〜361、362〜391、392〜411。この文脈において「約」は、いずれかの末端または両方の末端でのいくつか(5個、4個、3個、2個または1個)のアミノ酸だけより大きいかまたは小さい、特定の列挙された範囲を含む。さらに、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140または150のアミノ酸長であり得る。この文脈において、「約」は、いずれかの末端または両方の末端でのいくつかの(5個、4個、3個、2個または1個)のアミノ酸だけより大きいかまたはより小さい、特定の列挙された値を含む。

0176

本発明の好ましいポリペプチドフラグメントとしては、以下の群から選択されるメンバーが挙げられる:TR7レセプター細胞外ドメインを含むか、あるいはそれからなるポリペプチド(配列番号3中の約52〜約184のアミノ酸残基を構築すると予測される);TR7システインリッチドメインの両方(これら両方は、配列番号3中の約84〜約179のアミノ酸残基からなるタンパク質フラグメント中で見出され得る)を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド;配列番号3の約84〜約131のアミノ酸残基からなるTR7システインリッチドメインを含むか、あるいはそれらからなるポリペプチド;配列番号3の約132〜約179のアミノ酸残記からなるTR7システインリッチドメインを含むか、あるいはそれらからなるポリペプチド;TR7レセプター膜貫通ドメイン(配列番号3中の約185〜約208のアミノ酸残基を構築すると予測される)を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド;予測される成熟TR7ポリペプチドのフラグメントを含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドであって、ここでこのフラグメントは、TR7の機能的活性(例えば、抗原性活性または生物学的活性)を有する;TR7レセプター細胞内ドメイン(配列番号3中の約209〜約411のアミノ酸残基を構築すると予測される)を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド;全てまたは一部の膜貫通ドメインが欠失した、TR7レセプターの細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むか、あるいはそれらからなるポリペプチド;TR7レセプター死(death)ドメイン(配列番号3中の約324〜約391のアミノ酸残基を構成すると予測される)を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド;ならびにTR7レセプタータンパク質の1部を保有する1、2、3、4以上のエピトープを含むか、あるいはそれらからなるポリペプチド。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメントは、上記メンバーの1、2、3、4、5、6、7、または8つ全ての任意の組み合わせを含むか、あるいはそれらからなる。上記のように、リーダー配列とともにTR7レセプター細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを構成するアミノ酸残基は、コンピュータ分析によって予測される。従って、当業者は、これらのドメインからなるアミノ酸残基は、各ドメインを規定するために使用される規準に依存してわずかに変化し得る(例えば、約1〜約15のアミノ酸残基だけ)。これらの核酸および分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明に包含される。

0177

上記のように、TR7の1つまたは両方の細胞外システインリッチモチーフは、TR7とそのリガンド(例えば、TRAIL)との間の相互作用のために重要であると考えられる。従って、非常に好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号3の84〜131および/または132〜179のアミノ酸残基を含むか、あるいはそれらからなるTR7ポリペプチドフラグメントに結合する。別の非常に好ましい実施形態において、本発明の抗体は、細胞外システインリッチモチーフ(配列番号3の84〜179のアミノ酸残基)の両方を含むか、あるいはそれらからなるTR7ポリペプチドに結合する。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、TR7の細胞外可溶性ドメイン(配列番号2の52〜184のアミノ酸残基)を含むか、あるいはそれらからなるTR7ポリペプチドに結合する。他の非常に好ましい実施形態において、TR7の細胞外可溶性ドメイン(例えば、1つまたは両方のシステインリッチドメイン)の全てまたは一部に結合する本発明の抗体は、TR7レセプターをアゴナイズする。

0178

他の非常に好ましい実施形態において、TR7の細胞外可溶性ドメイン(例えば、1つまたは両方のシステインリッチドメイン)の全てまたは一部に結合する本発明の抗体は、TR7レセプターを発現する細胞の細胞死を誘導する。

0179

本発明の抗体はまた、TR7の構造的性質または機能的性質を含むか、あるいはそれらからなるフラグメントに結合し得る。このようなフラグメントとしては、以下を含むアミノ酸残基が挙げられる:TR7のα−ヘリックスおよびα−ヘリックス形成領域(「α−領域」)、β−シートおよびβ−シート形成領域(「β−シート領域」)、ターンおよびターン形成領域(「ターン領域」)、コイル領域およびコイル形成領域(「コイル領域」)、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、ならびに高度に抗原性の指標領域(すなわち、Jameson−Wolfプログラムの初期設定パラメータを用いて同定される場合、1.5の抗原性指標、または1.5よりも大きい抗原性指標を有するアミノ酸残基からなるポリペプチドの領域)。特定の好ましい領域は、表4に開示される領域であり、そしてこれらとしては以下が挙げられるが、それらに限定されない:配列番号3のアミノ酸配列の分析によって同定された上述の型の領域、このような好ましい領域としては以下が挙げられる;Garnier Robsonの予測したα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域;Chou−Fasmanの予測したα領域、β領域、およびターン領域;Kyte−Doolittleの予測した親水性領域およびHopp−Woodsの予測した疎水性領域、Eisenbergのαおよびβ両親媒性領域;Emini表面形成領域;ならびにこれらのコンピュータプログラムの初期設定パラメータを用いて予測されるようなJameson−Wolfの高い抗原性指標の領域。

0180

上記のような表4に記載されるTR7の構造的性質または機能的性質を表すデータは、初期設定パラメータに設定されたDNA*STARの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用いて生成された。列Iは、αヘリックス領域のGarnier−Robson分析の結果を示す;列IIは、αヘリックス領域のChou−Fasman分析の結果を示す;列IIIは、βシート領域のGarnier−Robson分析の結果を示す;列IVは、βシート領域のChou−Fasman分析の結果を示す;列Vは、ターン領域のGarnier−Robson分析の結果を示す;列VIは、ターン領域のChou−Fasman分析の結果を示す;列VIIは、コイル領域のGarnier−Robson分析の結果を示す;列VIIIは、Kyte−Doolittle親水性プロットを示す;列IXは、Hopp−Woods疎水性プロットを示す;列Xは、α両親媒性領域のEisenberg分析の結果を示す;列XIは、β両親媒性領域のEisenberg分析の結果を示す;列XIIは、可変性領域のKarplus−Schultz分析の結果を示す;列XIIIは、Jameson−Wolf抗原性指標スコアを示す;そして列XIVは、Emini表面可能性プロットを示す。

0181

好ましい実施形態において、表4の列VIII、IX、XIIIおよびXIV中に示されるデータは、抗原性に対する高程度の可能性を示すTR7の領域を決定するために使用され得る。高度に抗原性の領域は、抗原認識が、免疫応答の開始プロセスで生じ得る環境中のポリペプチドの表面上に露出される可能性があるポリペプチドの領域を示す値を選択することによって、列VIII、IX、XIIIおよび/またはXIV中に示されるデータから決定される。表4における列は、TR7タンパク質配列の異なる分析結果を示す。

0182

表4に記載される上記の好ましい領域としては、配列番号3に記載されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域が挙げられるが、これに限定されない。表4に示されるように、このような好ましい領域としては、Garnier−Robsonのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Chou−Fasmanのα領域、β領域、およびターン領域、Kyte−Doolittleの親水性領域、Eisenbergのα両親媒性領域およびβ両親媒性領域、Karplus−Schulz可変性領域、高い抗原性指標のJameson−Wolf領域、ならびにEmini表面形成領域が挙げられる。好ましくは、本発明の抗体は、TR7ポリペプチドまたはTR7ポリペプチドフラグメント、およびいくつかの構造的特徴を組み合わせるTR7の領域を含む改変体(例えば、上述、および表4に示されるいくつか(例えば、1個、2個、3個、または4個)の同じか、または異なる領域の特徴)に結合する。

0183

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0190

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0192

別の局面において、本発明は、TR7の一部を保有する1個、2個、3個、4個、5個以上のエピトープを含むか、あるいはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドに結合する抗体を提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本明細書中に記載されるポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合に、抗体応答を誘因するタンパク質の一部として規定される。その一方で、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として規定される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般に、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998〜4002(1983)を参照のこと。

0193

抗原性エピトープ(すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む)を保有するペプチドまたはポリペプチドの選択について、タンパク質配列の部分を模倣する比較的短い合成ペプチドは、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣用的に誘因し得ることが当該分野で周知である。例えば、J.G.Sutcliffeら、「Antibodies That React With Predetermined Sites on Proteins」、Science 219:660〜666(1983)を参照のこと。タンパク質反応性の血清を誘因し得るペプチドは、タンパク質の1次配列で頻繁に示され、1組の単純な化学的規則によって特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域(すなわち、免疫原性エピトープ)にも、アミノ末端にもカルボキシ末端のいずれにも制限されない。

0194

故に、抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、抗体(TR7ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を含む)を惹起するのに有用である。例えば、Wilsonら、Cell 37:767〜778(1984)の777頁を参照のこと。抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、配列番号3のアミノ酸配列内に含まれる少なくとも7個、より好ましくは少なくとも9個、そして最も好ましくは少なくとも15個〜30個のアミノ酸の配列を含む。

0195

本発明の抗体は、1つ以上の抗原性TR7ポリペプチドまたはペプチドに結合し得、これらとしては以下が挙げられるが、それらに限定されない:配列番号3の約62〜約110、配列番号3の約119〜約164、配列番号3の約224〜約271、配列番号3の約275〜約370、配列番号3の約69〜約80、配列番号3の約88〜約95、配列番号3の約99〜約103、配列番号3の約119〜約123、配列番号3の約130〜約135、配列番号3の約152〜約163、配列番号3の約226〜約238、配列番号3の約275〜約279、配列番号3の約301〜約305、および/または配列番号3の約362〜約367のアミノ酸残基を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチド。この文脈において「約」は、いずれかの末端または両方の末端でのいくつか(5個、4個、3個、2個または1個)のヌクレオチドだけより大きいかまたは小さい、特に列挙された範囲を含む。上述のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントが、TR7レセプタータンパク質の抗原性領域であることを決定した。

0196

エピトープ保有TR7ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段によって生成され得る。R.A.Houghten,「General Method for the Rapid Solid−Phase Synthesis of Large Numbers of Peptides:Specificity of Antigen−Antibody Interaction at the Level of Individual Amino Acids」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131〜5135(1985)。この「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)」プロセスは、Houghtenら(1986)に対する米国特許第4,631,211号にさらに記載される。

0197

当業者が理解するように、本明細書中に記載されるTR7レセプターポリペプチド、およびそのエピトープ保有フラグメント(例えば、細胞外ドメイン対応する部分(例えば、配列番号3の52〜184のアミノ酸残基)は、キメラポリペプチドを生じる免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの一部と組み合わされ得る。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメイン、および哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなる、キメラタンパク質について、示されている(EPA 394,837;Trauneckerら、Nature 331:84〜86(1988))。IgG部分に起因するジスルフィド結合した二量体構造を有する融合タンパク質はまた、モノマーのTR7タンパク質またはタンパク質フラグメント単独以外の分子を結合および中和するのにより効果的であり得る(Fountoulakisら、J.Biochem.270:3958〜3964(1995))。TR7融合タンパク質は、抗TR7抗体を誘因する免疫原として使用され得る。従って、本発明の抗体は、TR7のようなTR4ポリペプチドの全てまたは一部を含む融合タンパク質と結合し得る。

0198

当業者に公知の組換えDNA技術は、一個または複数のアミノ酸の置換、欠損、付加または融合タンパク質を含む新規変異タンパク質「ムテイン」を生成するために使用され得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、増強された活性または増加された安定性を示し得る。さらに、これらは、より高い収率で精製され得、そして少なくとも特定の精製条件および保存条件で対応する天然のポリペプチドによりもより良好な可溶性を示し得る。本発明の抗体はまた、このような改変されたTR7ポリペプチドまたはTR7ポリペプチドフラグメントもしくは改変体に結合し得る。

0199

例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟形態を含む、多くのタンパク質について、1つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な損失も特異的抗体によって結合される能力を実質的な損失も伴なわずに、N末端またはC末端から欠失され得ることが、当該分野において公知である。しかし、たとえ、タンパク質のN末端またはC末端からの1つの以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の1つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じるとしても、他のTR7機能的活性は、なお保持され得る。例えば、多くの例において、TR7を認識する抗体(好ましくは、TR7に特異的に結合する抗体)を誘導し、そして/またはこれに結合する短縮されたタンパク質の能力は、欠失のサイズまたは位置に関係なく保持される。実際、6個程度のTR7アミノ酸残基から構成されるポリペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。このような免疫学的活性を保持する完全なタンパク質のN末端および/またはC末端残基を欠く特定のポリペプチドは、本明細書中に記載される慣用的な方法、さもなくば当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。

0200

上述のように、たとえ、タンパク質のN末端からの1つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の1つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じたとしても、他の機能的活性(例えば、生物学的活性、多量体化の能力、TR7リガンドへ結合する能力)はなお、保持され得る。例えば、ポリペプチド完全形態またはポリペプチドの成熟形態を認識する抗体を誘導および/またはこれに結合する短縮されたTR7ポリペプチドの能力は、一般に、完全なポリペプチドまたは成熟したポリペプチドの残基の少ない部分がN末端から除かれる場合に、保持される。このような免疫学的活性を保持する完全なポリペプチドN末端の残基を欠く特定のポリペプチドは、本明細書中に記載されるか、さもなくば当該分野において公知の慣用的方法によって容易に決定され得る。多数の欠損したN末端アミノ酸残基を伴うTR7ポリペプチドは、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性をおそらく保持し得ない。

0201

従って、本発明は、配列番号3に示されるTR7アミノ酸配列のアミノ末端から、406位のアラニン残基から欠失される1つ以上の残基を有するポリペプチドに結合する抗体、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。特に、本発明は、配列番号3の残基n5−411のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体を提供し、ここでn5は、配列番号3のアミノ酸残基の位置に対応する2〜406の整数である。

0202

より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドに結合する抗体を提供する:配列番号3に示されるTR7配列の

0203

0204

0205

0206

0207

別の実施形態において、TR7ポリペプチドのN末端欠失は、一般式n6−184によって記載され得、ここでn6は、配列番号3において同定されるアミノ酸配列に対応する1〜179の数である。特定の実施形態において、本発明の抗体は、以下の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるTR7のN末端欠損に結合する:配列番号3において示されるTR7細胞外ドメイン配列の

0208

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