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技術 核酸の配列決定のための装置および方法

出願人 454・ライフ・サイエンシズ・コーポレーション
発明者 ロスバーグ,ジョナサンエム.ベイダー,ジョエルエス.デウェル,スコットビー.マックデイド,キースシンプソン,ジョンダブリュー.バーカ,ジェインコランジェロ,クリストファーエム.ワイナー,マイケルフィリップ
出願日 2002年3月21日 (18年7ヶ月経過) 出願番号 2002-575327
公開日 2005年2月24日 (15年8ヶ月経過) 公開番号 2005-505748
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 化学反応による材料の光学的調査・分析 自動分析、そのための試料等の取扱い 突然変異または遺伝子工学 微生物・酵素関連装置 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 線状流れ 流れチャンバ 高速流れ 流動チャンバ 平面状アレイ 底平面 カップリング材料 空間的制限
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2005年2月24日)のものです。
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図面 (12)

課題・解決手段

明細書中には、核酸配列決定するための方法および装置が開示される。これらの方法は、非常に多数の独立した配列決定反応が、並行してアレイされるのを可能にし、非常に多数(>10,000)の異なるオリゴヌクレオチドの同時配列決定を可能にする。複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を備えるアレイであって、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、アレイもまた提供される。

概要

背景

(発明の分野)
本発明は、核酸の配列を決定するための装置および方法に関する。

概要

明細書中には、核酸を配列決定するための方法および装置が開示される。これらの方法は、非常に多数の独立した配列決定反応が、並行してアレイされるのを可能にし、非常に多数(>10,000)の異なるオリゴヌクレオチドの同時配列決定を可能にする。複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を備えるアレイであって、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、アレイもまた提供される。

目的

しかし、このような放射性方法は、慣用的臨床的適用に十分適しておらず、従って、迅速なDNA配列分析のための簡単で、高感度非放射性方法の開発もまた、大きな目的である

効果

実績

技術文献被引用数
6件
牽制数
8件

この技術が所属する分野

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請求項1

複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を備えるアレイであって、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、アレイ。

請求項2

複数の空洞を有する平坦な表面を備えるアレイであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各空洞は、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、アレイ。

請求項3

複数の空洞を有する平坦な表面を備えるアレイであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各反応チャンバは、その中にたった1つの一本鎖環状核酸が配置されている、アレイ。

請求項4

各一本鎖環状核酸が、少なくとも100コピー核酸配列を含み、各コピーは、末端同士で共有結合されている、請求項3に記載のアレイ。

請求項5

前記一本鎖環状核酸が、前記反応チャンバ中に固定されている、請求項3に記載のアレイ。

請求項6

前記一本鎖環状核酸が、前記反応チャンバ中に配置された可動固体支持体に固定されている、請求項5に記載のアレイ。

請求項7

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、請求項3に記載のアレイ。

請求項8

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項3に記載のアレイ。

請求項9

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項3に記載のアレイ。

請求項10

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項3に記載のアレイ。

請求項11

前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項3に記載のアレイ。

請求項12

前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項3に記載のアレイ。

請求項13

前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項3に記載のアレイ。

請求項14

各空洞の形状が、実質的に六角形である、請求項3に記載のアレイ。

請求項15

前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項3に記載のアレイ。

請求項16

前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項3に記載のアレイ。

請求項17

各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項3に記載のアレイ。

請求項18

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項3に記載のアレイ。

請求項19

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項3に記載のアレイ。

請求項20

平坦な上面および平坦な底面を備えるアレイであって、該平坦な上面は、少なくとも1,000個の空洞を有し、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、該平坦な底面は、光学的に伝導性であって、その結果、該反応チャンバからの光学的シグナルが該平坦な底面を通して検出され得、該上面と該底面との間の距離は、10cm以下であり、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、アレイ。

請求項21

前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項20に記載のアレイ。

請求項22

前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項20に記載のアレイ。

請求項23

前記空洞が、400,000より多い数に達する、請求項20に記載のアレイ。

請求項24

前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項20に記載のアレイ。

請求項25

前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項20に記載のアレイ。

請求項26

各空洞の形状が、実質的に六角形である、請求項20に記載のアレイ。

請求項27

各空洞が、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項20に記載のアレイ。

請求項28

各空洞が、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項20に記載のアレイ。

請求項29

各空洞が、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項20に記載のアレイ。

請求項30

各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項20に記載のアレイ。

請求項31

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項20に記載のアレイ。

請求項32

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項20に記載のアレイ。

請求項33

各空洞が、少なくとも1つの不規則壁表面を有する、請求項20に記載のアレイ。

請求項34

各空洞が、平滑な壁表面を有する、請求項20に記載のアレイ。

請求項35

前記空洞が、光ファイバの束から形成されている、請求項20に記載のアレイ。

請求項36

前記空洞が、前記光ファイバの束の一方の末端をエッチングすることによって形成される、請求項35に記載のアレイ。

請求項37

各空洞が、核酸またはタンパク質分析するための試薬を含む、請求項20に記載のアレイ。

請求項38

前記平坦なアレイから間隔があけられており、かつ対向接触しており、その結果、フローチャンバが該アレイ上に形成されている第二表面をさらに備える、請求項20に記載のアレイ。

請求項39

水性環境中で別個並行共通反応を実施するためのアレイ手段であって、該アレイ手段は、試薬と反応し得る出発材料を含む少なくとも1,000個の別個の反応チャンバを備える基板を含み、該反応チャンバの各々は、少なくとも1つの試薬を含む1以上の流体が各反応チャンバに送達された場合に、該試薬がウェルの外に拡散する拡散時間が、該出発材料が該試薬と反応して生成物を形成するに必要な時間を超えるような寸法である、アレイ手段。

請求項40

前記反応チャンバが、前記基板に複数の空洞を生成することによって形成される、請求項39に記載のアレイ。

請求項41

前記反応チャンバが、平坦な表面に別個のパッチを生成することによって形成され、該パッチは、周囲の平坦な表面とは異なる表面化学を有する、請求項39に記載のアレイ。

請求項42

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項43

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項44

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項45

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項46

前記中心間間隔が、5〜200μmの間である、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項47

前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項48

前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項49

前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項50

前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項51

前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項52

各空洞の形状が、実質的に六角形である、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項53

各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項54

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項55

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項56

各空洞が、少なくとも1つの不規則な壁表面を有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項57

各空洞が、平滑な壁表面を有する、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項58

前記空洞が、光ファイバの束から形成されている、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項59

前記空洞が、前記光ファイバの束の一方の末端をエッチングすることによって形成される、請求項58に記載のアレイ。

請求項60

各空洞が、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項61

前記反応チャンバ中に配置された可動固体支持体の集団をさらに含み、各可動固体支持体には、1以上の生物活性因子が結合している、請求項39または41に記載のアレイ。

請求項62

前記空洞が、エッチング、成形または微細加工によって前記基板中に形成される、請求項40に記載のアレイ。

請求項63

前記基板が、光ファイバの束である、請求項40に記載のアレイ。

請求項64

前記空洞が、円筒状である、請求項40に記載のアレイ。

請求項65

前記空洞の各々の底部が、平坦である、請求項40に記載のアレイ。

請求項66

前記空洞の各々の底部が、凹面状である、請求項40に記載のアレイ。

請求項67

複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を備えるアレイであって、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有し、少なくとも1つの反応チャンバが、少なくとも1つの試薬が固定された可動固体支持体を有し、該試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切である、アレイ。

請求項68

各可動固体支持体の直径が、各空洞の幅の0.01倍〜0.1倍の間である、請求項67に記載のアレイ。

請求項69

前記反応チャンバの少なくとも5%〜20%が、少なくとも1つの試薬が固定されている可動固体支持体を有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項70

前記反応チャンバの少なくとも20%〜60%が、少なくとも1つの試薬が固定されている可動固体支持体を有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項71

前記反応チャンバの少なくとも50%〜100%が、少なくとも1つの試薬が固定されている可動固体支持体を有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項72

前記可動固体支持体には、少なくとも1つの試薬が固定されており、該試薬は、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項67に記載のアレイ。

請求項73

前記可動固体支持体には、少なくとも1つの試薬が固定されており、該試薬は、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項67に記載のアレイ。

請求項74

前記可動固体支持体には、少なくとも1つの試薬が固定されており、該試薬は、スルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方を有するキメラポリペプチドである、請求項67に記載のアレイ。

請求項75

前記可動固体支持体には、少なくとも第一試薬および第二試薬が固定されており、該第一試薬が、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドであり、そして該第二試薬が、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項67に記載のアレイ。

請求項76

前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項67に記載のアレイ。

請求項77

前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項67に記載のアレイ。

請求項78

前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項67に記載のアレイ。

請求項79

前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項67に記載のアレイ。

請求項80

前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項67に記載のアレイ。

請求項81

各空洞の形状が、実質的に六角形である、請求項67に記載のアレイ。

請求項82

各空洞が、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項83

各空洞が、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項84

各空洞が、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項85

各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項86

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項87

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項67に記載のアレイ。

請求項88

複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を備えるアレイであって、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有し、少なくとも1つの反応チャンバは、少なくとも1つの試薬が固定された可動固体支持体を有し、該試薬は、核酸であり、該核酸は、一本鎖コンカテマーを含む、アレイ。

請求項89

前記核酸が、ピロ配列決定反応における使用に適切である、請求項88に記載のアレイ。

請求項90

ATP活性を検出するために請求項67に記載の可動固体支持体を使用する方法。

請求項91

前記ATPが、核酸配列決定反応の一部として検出される、請求項90に記載の方法。

請求項92

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項88に記載のアレイ。

請求項93

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項88に記載のアレイ。

請求項94

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項88に記載のアレイ。

請求項95

前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項88に記載のアレイ。

請求項96

前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項88に記載のアレイ。

請求項97

前記空洞が、1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項88に記載のアレイ。

請求項98

前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項88に記載のアレイ。

請求項99

前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項88に記載のアレイ。

請求項100

各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項88に記載のアレイ。

請求項101

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.25倍と5倍との間である深さを有する、請求項88に記載のアレイ。

請求項102

各空洞が、該空洞の幅のサイズの0.3倍と1倍との間である深さを有する、請求項88に記載のアレイ。

請求項103

生物活性因子をアレイに送達するための方法であって、該アレイに複数の可動固体支持体を分配する工程を包含し、各可動固体支持体には、少なくとも1つの試薬が固定されており、該試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切であり、該アレイは、複数の反応チャンバが配置された平坦な表面を含み、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、そして各チャンバは、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、方法。

請求項104

反応チャンバのアレイを、反応が特定の部位で生じたことを示す光について同時にモニタリングするための装置であって、該装置は、以下:(a)複数の空洞のある表面を備える平坦な基板から形成された反応チャンバのアレイであって、各空洞のある表面は、分析物を含むように適合させた反応チャンバを形成し、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該アレイは、400,000を超える別個の反応チャンバを含む、アレイ;(b)感光性デバイスであって、使用時に、特定の反応チャンバからの光が、該感光性デバイスの特定の所定の領域に衝突するように配置された、デバイス;(c)該所定の領域の各々に衝突する光レベルを決定するための手段、および(d)該反応チャンバの各々について時間にともなった該光レベルの変動を記録するための手段を備える、装置。

請求項105

分析センサであって、以下:(a)一方の末端に複数の空洞のある表面を有する光ファイバの第一の束から形成されたアレイであって、各空洞のある表面は、分析物を含むように適合された反応チャンバを形成し、そして該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該アレイは、400,000を超える別個の反応チャンバを含む、アレイ;(b)該反応チャンバ中で光を生じるための、酵素的手段または蛍光的手段;(c)光検出手段であって、光捕獲手段および光を該光検出手段へと伝送するための第二光ファイバの束を備え、該第二光ファイバの束は、該アレイと光学的に接触しており、その結果、個々の反応チャンバにおいて生じた光は、該光捕獲手段への伝送のために該第二光ファイバの束の別々のファイバまたは別々のファイバの群によって捕獲される、手段を備える、センサ

請求項106

前記センサが、生化学的アッセイにおける使用のために適切である、請求項105に記載のセンサ。

請求項107

前記センサが、細胞ベースアッセイにおける使用のために適切である、請求項105に記載のセンサ。

請求項108

前記光捕獲手段が、CCDカメラである、請求項105に記載のセンサ。

請求項109

前記反応チャンバが、生物活性因子が固定された1以上の可動固体支持体を含む、請求項105に記載のセンサ。

請求項110

一方の末端に複数の空洞のある表面を有する融合した光ファイバアレイ中に複数の光ファイバを含む組成物であって、各空洞のある表面は、分析物を含むように適合させた反応チャンバを形成し、そして該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該アレイは、400,000を超える別個の反応チャンバを含み、各反応チャンバは、1以上の可動固体支持体を含み、該可動固体支持体の直径は、各反応チャンバの幅の0.01倍〜0.1倍の間である、組成物。

請求項111

水性環境中で別個の並行共通反応を実施するための方法であって、以下:(a)少なくとも1つの試薬を含む流体をアレイに送達する工程であって、該アレイは、該試薬と反応し得る出発材料を含む少なくとも400,000個の別個の反応チャンバを備える基板を含み、該反応チャンバの各々は、該流体が各反応チャンバに送達された場合に、該試薬がウェルの外に拡散する拡散時間が、該出発材料が該試薬と反応して生成物を形成するに必要な時間を超えるような寸法である、工程;および(b)(i)該出発材料が該試薬と反応して各反応チャンバ中で生成物を形成した後であるが、(ii)任意の1つの反応チャンバに送達された該試薬が、該反応チャンバの外で任意の他の反応チャンバへと拡散する前、の時期に該流体を該アレイから洗浄する工程を包含する、方法。

請求項112

任意の1つの反応チャンバにおいて形成された生成物が、任意の他の反応チャンバにおいて形成された生成物とは独立しているが、1以上の共通試薬を用いて作製される、請求項111に記載の方法。

請求項113

前記出発材料が、核酸配列であり、そして前記流体中の少なくとも1つの試薬が、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである、請求項111に記載の方法。

請求項114

前記流体が、前記核酸配列および前記ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを反応させ得るポリメラーゼをさらに含む、請求項113に記載の方法。

請求項115

工程(a)および工程(b)を順次反復する工程をさらに包含する、請求項111に記載の方法。

請求項116

核酸配列決定酵素をアレイに送達するための方法であって、該アレイは、複数の空洞を有する平坦な表面を備え、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し;該方法は、1つ以上の核酸配列決定酵素が固定された複数の可動固体支持体を該アレイに分配しを有し、その結果、少なくとも1つの可動固体支持体が、各反応チャンバ内に含まれる工程を包含する、方法。

請求項117

前記核酸配列決定酵素の1つが、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項116に記載の方法。

請求項118

前記核酸配列決定酵素の1つが、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項116に記載の方法。

請求項119

前記核酸配列決定酵素の1つが、スルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方を有するポリペプチドである、請求項116に記載の方法。

請求項120

前記複数の可動固体支持体が、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドが固定されているか、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドが固定されているか、または、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチドおよびルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドの両方が固定されている可動固体支持体を含む、請求項116に記載の方法。

請求項121

核酸配列をアレイに送達するための方法であって、該アレイは、複数の空洞を有する平坦な表面を備え、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し;該方法は、1つ以上の核酸配列が固定された複数の可動固体支持体を該アレイに分配する工程を包含する、方法。

請求項122

前記核酸配列が、一本鎖環状核酸である、請求項121に記載の方法。

請求項123

各一本鎖環状核酸が、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端同士で共有結合されている、請求項122に記載の方法。

請求項124

核酸配列をアレイに送達するための方法であって、該アレイは、複数の空洞を有する平坦な表面を備え、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し;該方法は、たった1つの核酸配列を各空洞内に固定する工程を包含する、方法。

請求項125

前記核酸配列が、一本鎖環状核酸である、請求項124に記載の方法。

請求項126

各一本鎖環状核酸が、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端同士で共有結合されている、請求項124に記載の方法。

請求項127

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項128

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項129

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項130

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項131

前記空洞が400,000よりも多い数に達する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項132

前記空洞が400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項133

前記空洞が1,000,000と16,000,000との間の数に達する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項134

前記中心間間隔が、10〜150μmの間である、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項135

前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項136

各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項137

各空洞が、該空洞の幅のサイズの、0.25倍と5倍との間の深さを有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項138

各空洞が、該空洞の幅のサイズの、0.3倍と1倍との間の深さを有する、請求項116〜126のいずれか1項に記載の方法。

請求項139

前記反応チャンバに配置された後にさらに増幅して、前記核酸配列を、多コピーの該核酸配列を生成する、請求項121または124に記載の方法。

請求項140

前記核酸配列が、ポリメラーゼ連鎖反応リガーゼ連鎖反応、および等温DNA増幅からなる群から選択される増幅技術を使用して増幅される、請求項139に記載の方法。

請求項141

核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下:(a)1つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程;(b)平坦な表面の複数の空洞内に配置された複数の一本鎖環状核酸鋳型を提供する工程であって、各空洞が分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、工程;(c)有効量の該核酸アンカープライマーを、少なくとも1つの該一本鎖環状鋳型アニーリングして、プライムされたアンカープライマー−環状鋳型複合体を生じる、工程;(d)該プライムされたアンカープライマー−環状鋳型複合体をポリメラーゼと合わせて、該環状核酸鋳型に相補的な多コピーの核酸に共有結合した伸長されたアンカープライマーを形成する、工程;(e)有効量の配列決定プライマーを、該共有結合した相補的な核酸の1つ以上のコピーにアニーリングする、工程;(f)該配列決定プライマーを、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて伸長して、配列決定産物、および、該所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物を生じる、工程;ならびに(g)該配列決定反応副産物を同定して、これによって、核酸の該配列を決定する、工程、を包含する、方法。

請求項142

各一本鎖環状核酸が、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端同士で共有結合している、請求項141に記載の方法。

請求項143

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと100μmとの間の幅を有する、請求項141に記載の方法。

請求項144

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと20μmとの間の幅を有する、請求項141に記載の方法。

請求項145

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、0.3μmと10μmとの間の幅を有する、請求項141に記載の方法。

請求項146

各反応チャンバが、少なくとも1つの次元において、20μmと70μmとの間の幅を有する、請求項141に記載の方法。

請求項147

前記空洞が、400,000よりも多い数に達する、請求項141に記載の方法。

請求項148

前記空洞が、400,000と20,000,000との間の数に達する、請求項141に記載の方法。

請求項149

前記空洞が、1,000,000と16,000,000の間の数に達する、請求項141に記載の方法。

請求項150

前記中心間間隔が、10〜15μmの間である、請求項141に記載の方法。

請求項151

前記中心間間隔が、50〜100μmの間である、請求項141に記載の方法。

請求項152

各空洞が、10μmと100μmとの間の深さを有する、請求項141に記載の方法。

請求項153

各空洞が、該空洞の幅のサイズの、0.25倍と5倍との間の深さを有する、請求項141に記載の方法。

請求項154

各空洞が、該空洞の幅のサイズの、0.3倍と1倍との間の深さを有する、請求項141に記載の方法。

請求項155

前記反応チャンバに配置された後に、前記核酸配列をさらに増幅して、多コピーの該核酸配列を生成するために、請求項141に記載の方法。

請求項156

前記核酸配列が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、および等温DNA増幅からなる群から選択される増幅技術を使用して増幅される、請求項155に記載の方法。

請求項157

前記一本鎖環状核酸が、前記反応チャンバ中に固定される、請求項141に記載の方法。

請求項158

前記一本鎖環状核酸が、前記反応チャンバ中に配置される1以上の可動固体支持体上に固定される、請求項141に記載の方法。

請求項159

核酸を配列決定する方法であって、該方法は、以下:(a)少なくとも1つの核酸アンカープライマーを提供する工程;(b)少なくとも400,000の別個の反応部位を備えるアレイにおいて、複数の一本鎖環状核酸鋳型を提供する、工程;(c)第1の量の該核酸アンカープライマーを、少なくとも1つの該一本鎖環状鋳型にアニーリングして、プライムされたアンカープライマー−環状鋳型複合体を生じる、工程;(d)該プライムされたアンカープライマー−環状鋳型複合体をポリメラーゼと合わせて、該環状核酸鋳型に相補的な多コピーの核酸に共有結合した伸長したアンカープライマーを形成する、工程;(e)第2の量の配列決定プライマーを、該共有結合した相補的な核酸の1つ以上のコピーにアニーリングする、工程;(f)該配列決定プライマーを、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて伸長して、配列決定産物、および、該所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物を生じる、工程;ならびに(g)該配列決定反応副産物を同定して、これによって、核酸鋳型を含む核反応部位での該核酸の配列を決定する、工程、を包含する、方法。

請求項160

前記アンカープライマーが粒子に連結される、請求項159に記載の方法。

請求項161

前記アンカープライマーが、前記伸長されたアンカープライマーの形成の前に前記粒子に連結される、請求項159に記載の方法。

請求項162

前記アンカープライマーが、前記伸長されたアンカープライマーの形成後に、前記粒子に連結される、請求項159に記載の方法。

請求項163

前記配列決定反応副産物が、PPiであり、共役スルフリラーゼ/ルシフェラーゼ反応を用いて、検出するための光を生成する、請求項159に記載の方法。

請求項164

前記スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのいずれかまたは両方が、各反応部位に配置された1つ以上の可動固体支持体上に固定されている、請求項159に記載の方法。

請求項165

アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための方法であって、該方法は以下:(a)複数のサンプルDNAを提供する工程であって、各々は、平坦な表面の複数の空洞内に配置されており、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、工程;(b)ある既知含窒素塩基の活性化ヌクレオチド5’−三リン酸前駆体を、該活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の該含窒素塩基が、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型不対ヌクレオチド残基の該含窒素塩基に相補的である場合に、相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖の3’末端への該活性化ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、各反応チャンバ中の反応混合物に添加する工程であって、各反応混合物は、鋳型特異的ヌクレオチドポリメラーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチド鋳型を含み、該一本鎖ポリヌクレオチド鋳型は、該鋳型よりも少なくとも1つのヌクレオチド残基短い、相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズして、該プライマー鎖の3’末端にて、各鋳型中に少なくとも1つの不対ヌクレオチド残基を形成している、工程;(c)該ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体が、該プライマー鎖へ組み込まれたか否かを決定する工程であって、該ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の組み込みは、該鋳型の該不対ヌクレオチド残基が、該組み込まれたヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の不対ヌクレオチド残基に相補的である含窒素塩基構成物を有することを示す、工程;ならびに(d)工程(b)および工程(c)を順次に反復する工程であって、各順次の反復が、既知の含窒素塩基構成物の組み込み活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体を添加して、そして該活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の1つの型を検出する、工程;ならびに(e)各反応チャンバにおける該鋳型の該不対ヌクレオチド残基の該塩基配列を、該ヌクレオシド前駆体の組み込みの順序から決定する、工程、を包含する、方法。

請求項166

鋳型核酸ポリマーにおける核酸配列を決定するための方法であって、以下:(a)複数の鋳型核酸ポリマーを平坦な表面の複数の空洞に導入する工程であって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有し、各反応チャンバは、該核酸ポリマーが、ヌクレオチドが添加される場合に相補的核酸ポリマーの合成のための鋳型ポリマーとして作用する重合環境を備える、工程;(b)一連供給原料を該重合環境に順次提供する工程であって、各供給原料は、該相補的核酸ポリマーが形成される該ヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、該供給原料中の該ヌクレオチドが、配列決定されるべき該鋳型ポリマー中の隣のヌクレオチドに対して相補的である場合、該ヌクレオチドが該相補的ポリマーに組み込まれ、そして、無機ピロリン酸が放出される、工程;(c)無機ピロリン酸の形成を検出して、該相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体、従って、該鋳型ポリマーの配列を決定する、工程、を包含する、方法。

請求項167

サンプルDNAのDNA配列における標的位置塩基を同定する方法であって、ここで:(a)サンプルDNAは、平坦な表面の複数の空洞内に配置され、各空洞が分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該DNAは、該反応チャンバ中に配置される前または後のいずれかで一本鎖にされ、(b)該標的位置にすぐ隣接する位置にて、固定された一本鎖DNAにハイブリダイズする伸長プライマーが、提供され、(c)該固定された一本鎖DNAは、所定のヌクレオチド三リン酸の存在下でポリメラーゼ反応に供され、ここで、該所定のヌクレオチド三リン酸が、該配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物が形成され;そして(d)該配列決定反応副産物を同定して、それによって、該標的位置の該塩基に相補的なヌクレオチドを決定する、方法。

請求項168

サンプルDNA配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、以下:(a)平坦な表面の複数の空洞内に配置されたサンプルDNAを提供する工程であって、各空洞が分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバが5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該DNAは、該反応チャンバ中に配置される前または後のいずれかで一本鎖にされる、工程、(b)該標的位置にすぐ隣接した位置で該サンプルDNAにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する、工程、(c)該サンプルDNA配列および該伸長プライマーを、ヌクレオチド三リン酸の存在下でポリメラーゼ反応に供し、これによって、該ヌクレオチオ三リン酸は、該標的位置の該塩基に相補的である場合にのみ、組み込まれ、そして、ピロリン酸(PPi)を放出する工程であって、該ヌクレオチド三リン酸は、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または、同じサンプル−プライマー混合物に順次添加される、工程、(d)PPiの放出を検出して、どのヌクレオチドが組み込まれたかを示す、工程、を包含する、方法。

請求項169

一本鎖サンプルDNA配列における標的位置の塩基を同定する方法であって、該方法は、以下:(a)該標的位置にすぐ隣接した位置でサンプルDNAにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程であって、該サンプルDNAは、平坦表面の複数の空洞内に配置されており、各空洞は分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有し、該DNAは、該反応チャンバ中に配置される前または後のいずれかで一本鎖にされる、工程、(b)該サンプルDNAおよび伸長プライマーを、所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下で、ポリメラーゼ反応に供し、これによって、該デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが、該標的位置の該塩基に相補的である場合にのみ、組み込まれ、そして、ピロリン酸(PPi)を放出する工程であって、該所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または、同じサンプル−プライマー混合物に順次添加される、工程、(c)PPiの任意の放出を酵素的に検出して、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが組み込まれているかを示す、工程、を包含し、該PPi検出酵素が、該ポリメラーゼ反応工程に含まれるという点で、および、デオキシアデノシン三リン酸(ATP)またはジデオキシアデノシン三リン酸の代わりに、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、該PPi検出酵素の基質として作用し得ない、dATPまたはddATPアナログが使用されるという点で、特徴付けられる、方法。

請求項170

核酸配列を分析するための装置であって、該装置は、以下:(a)試薬送達キュベットであって、該キュベットは、複数の空洞を有する平坦な表面を備えるアレイを備え、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有し、ここで、該試薬送達キュベットは、配列決定反応における使用のための試薬を含む、キュベット;(b)該試薬送達キュベットと連絡している、試薬送達手段;(c)該試薬送達チャンバと連絡している、画像化システム;ならびに(d)該画像化システムと連絡している、データ収集システムを備える、装置。

請求項171

アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置であって、該装置が、以下:(a)平坦な表面に複数の空洞を備える試薬キュベットであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有する、キュベット;(b)1つの既知の含窒素塩基の活性化ヌクレオチド5’−三リン酸前駆体を、該活性化ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の該含窒素塩基が、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の不対ヌクレオチド残基の該含窒素塩基に相補的である場合に、相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖の3’末端への該活性化ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、各反応チャンバにおいて反応混合物に添加するための試薬送達手段であって、各反応混合物は、鋳型特異的ヌクレオチドポリメラーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチド鋳型を含み、該一本鎖ポリヌクレオチド鋳型は、該鋳型よりも少なくとも1つのヌクレオチド残基短い、相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズしており、該プライマー鎖の3’末端にて、各鋳型中に少なくとも1つの不対ヌクレオチド残基を形成している、試薬送達手段;(c)該ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体が、該プライマー鎖へ組み込まれたか否かを検出するための検出手段であって、該ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の組み込みは、該鋳型の該不対ヌクレオチド残基が、該組み込まれたヌクレオシド5’−三リン酸前駆体の不対ヌクレオチド残基に相補的である含窒素塩基構成物を有することを示す、検出手段、(d)工程(b)および工程(c)を順次反復するための手段であって、ここで、各順次反復が、既知の含窒素塩基構成物の1つの型の活性化ヌクレオシド5’−三リン酸前駆体を追加して、そして組み込みを検出する、手段;ならびに、(e)各反応チャンバにおける該鋳型の該不対ヌクレオチド残基の該塩基配列を、該ヌクレオシド前駆体の組み込みの順次から決定するためのデータ処理手段、を備える、装置。

請求項172

鋳型核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための装置であって、以下:(a)平坦な表面に複数の空洞を備えるアレイであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは5〜200μmの間の中心間間隔を有する、アレイ、(b)鋳型核酸ポリマーを該反応チャンバに導入するための、核酸送達手段;(c)該核酸ポリマーが、ヌクレオチドが添加される場合に相補的な核酸ポリマーの合成のための鋳型ポリマーとして作用する重合環境を作成するために、該反応チャンバに試薬を送達するための、核酸送達手段;(d)一連の供給原料を該重合環境に順次提供するための試薬送達手段であって、各供給原料は、該相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、該供給原料中の該ヌクレオチドが、配列決定されるべき該鋳型ポリマー中の隣のヌクレオチドに対して相補的である場合、該ヌクレオチドが該相補的ポリマーに組み込まれ、そして、無機ピロリン酸が放出される、試薬送達手段;(e)無機ピロリン酸の形成を酵素的に検出するための検出手段;ならびに、(f)該相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体、従って、鋳型ポリマーの該配列を決定するための、データ処理手段、を備える、装置。

請求項173

複数の分析物を処理するための手段であって、該装置は、以下:(a)複数の空洞のある表面基板が配置されたフローチャンバであって、各空洞のある表面が、分析物をふくむように適合された反応チャンバを形成し、ここで、該チャンバが、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、フローチャンバ;(b)1つ以上のレザバから該フローチャンバまで処理試薬を送達する流体手段であって、その結果、該フローチャンバ中に配置された該分析物が、該試薬に曝露される、流体手段;ならびに、(c)該反応チャンバの各々から光学的シグナルの配列を検出するための検出手段であって、該配列の各光学的シグナルが、処理試薬と該反応チャンバ中に配置された該分析物との間の相互作用を示し、ここで、該検出手段が、該空洞のある表面と連絡している、検出手段、を備える、装置。

請求項174

前記検出手段がCCDカメラである、請求項173に記載の装置。

請求項175

前記分析物が核酸である、請求項173に記載の装置。

請求項176

前記分析物が、前記反応チャンバ中に配置された1以上の可動固体支持体上に固定される、請求項173に記載の装置。

請求項177

前記処理試薬が、1以上の可動固体支持体上に固定される、請求項173に記載の装置。

請求項178

複数の空洞を有する平坦な表面を備えるアレイであって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの中心間間隔を有し、各空洞が、該反応チャンバに残るいずれの水溶液についての拡散係数が1.6667×10−9m2/sとなるように形成される、アレイ。

請求項179

アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法であって、該方法は、以下:(a)複数のサンプルDNAを提供する工程であって、各DNAは、平坦な表面上の複数の空洞内に配置されており、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、工程;(c)感光性デバイスの各々の部分上の複数の反応部位から放射される光レベルを検出する、工程;(d)該感光性デバイスの該部分の各々に衝突する光を、他の全ての領域からの信号から区別可能電気信号に変換する、工程;(e)対応する電気信号から、別々の領域の各々についての光強度を決定する、工程;(f)時間にともなった該電気信号の変動を記録する、工程、を包含する、方法。

請求項180

核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下:(a)1つ以上の核酸アンカープライマーを提供する、工程;(b)平坦な表面の複数の空洞内に配置された複数の一本鎖環状核酸鋳型を提供する工程であって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、5〜200μmの間の中心間間隔を有する、工程;(c)感光性デバイスの各々の部分の複数の反応部位から放射される光レベルを検出する工程;(d)該感光性デバイスの該部分の各々に衝突する光を、他の全ての領域からの信号から区別可能な電気信号に変換する、工程;(e)対応する電気信号から、別々の領域の各々についての光強度を決定する、工程;(f)時間にともなう該電気信号の変動を記録する工程、を包含する、方法。

請求項181

核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下:(a)少なくとも1つの核酸アンカープライマーを提供する工程;(b)少なくとも400,000の別個の反応部位を有するアレイ中に、複数の一本鎖環状核酸鋳型を提供する、工程;(c)感光性デバイスの各々の部分の複数の反応部位から放射される光レベルを検出する工程;(d)該感光性デバイスの該部分の各々に衝突する光を、他の全て領域のからの信号から区別可能な電気信号に変換する、工程;(e)対応する電気信号から、別々の領域の各々についての光強度を決定する、工程;(f)時間にともなう該電気信号の変動を記録する、工程、を包含する、方法。

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0001

(発明の分野)
本発明は、核酸の配列を決定するための装置および方法に関する。

0002

(発明の背景
多くの疾患は、特定のDNA配列に関連する。このDNA配列は、しばしば、DNA多型と呼ばれ、非罹患個体における対応するDNA配列と異なる疾患状態に関連するDNA配列を示す。DNA配列多型は、例えば、1つの配列における、第2の配列と比較してのヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。特定のDNA配列多型の例は、ヒトゲノムの特定の位置での、5’−ATGG−3’に対する5’−ATCG−3’である。後者の配列における第1ヌクレオチド「G」は、前者の配列においてヌクレオチド「C」で置換されている。前者の配列は、特定の疾患状態に関連し、後者の配列は、その疾患に罹患していない個体において見出される。従って、ヌクレオチド配列「5’−ATCG−3’」の存在は、個体が特定の疾患を有することを示す。この特定の型の配列多型は、配列の差が、1つのヌクレオチドにおける変化に起因することから、単一ヌクレオチド多型(SNP)として公知である。

0003

従って、単一DNA塩基変化の迅速な検出を可能にする技術は、遺伝子分析において使用するための重要な方法である。ヒトゲノムの大きさは大きい(30億塩基対オーダー)ので、多型を同定する技術は、核酸の潜在的に大きな集団において多型を含む配列を特異的に同定するのに十分高感度でなければならない。

0004

代表的に、DNA配列多型分析は、個体からDNAを単離し、単離したDNAを、例えば、制限酵素でそのDNAを消化することによって操作し、そして/または単離したDNAにおける配列のサブセット増幅することにより実施される。次いで、操作したDNAは、特定の配列が存在するか否かを決定するためにさらに試験される。

0005

DNAを分析するために一般的に使用される手順としては、電気泳動が挙げられる。電気泳動の一般的な適用としては、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動が挙げられる。DNA配列は、ゲルに挿入または充填され、そして電場に供される。DNAは、均一な負電荷を有するので、DNAは、電場の適用の際に、配列の長さ、三次元構造、およびゲルマトリクスとの相互作用を含む特性に基づきゲルを通って移動する。ほとんどの適用において、より小さいDNA分子は、より大きいフラグメントよりも迅速にゲルを通って移動する。電気泳動が十分な時間継続された後、DNA配列の最初の集団のDNAは、それらの相対的な大きさに従って分離される。

0006

次いで、特定のDNA分子が、種々の検出方法を用いて検出され得る。いくつかの適用について、特定のDNA配列は、特定のDNA分子に結合された検出可能なタグ(例えば、放射性標識)の存在により同定される。

0007

電気泳動に基づく分離分析は、特定の配列多型について多くの核酸サンプルを迅速、経済的、および正確に分析することが望まれる適用には望ましくない。例えば、電気泳動に基づく分析は、多量の注入DNAを必要とする。さらに、電気泳動に基づく核酸に基づく分析に必要とされる多量のサンプルを処理することは、労働力を要し得る。さらに、これらの技術は、同一のDNA分子のサンプルを必要とし得、電気泳動の前に、多額であり得る費用を取り繕わなければならない。

0008

近年、自動電気泳動ステム入手可能となった。しかし、電気泳動は、高スループットを有する比較的コスト効果のある装置が必要とされる臨床的配列決定のような適用には不向きであり得る。従って、配列決定のための非電気泳動方法に対する必要性が大きい。多くの適用について、電気泳動は、DNA配列分析と組み合わせて使用される。

0009

電気泳動に基づく配列決定に対するいくつかの代替法が記載されている。これらの方法としては、走査型トンネル顕微鏡ハイブリダイゼーションによる配列決定、および単一ヌクレオチド検出法が挙げられる。

0010

電気泳動に基づく分離分析に対する別の代替法は、固体基質に基づく核酸分析である。これらの方法は、代表的に、固体支持体上の異なる位置に固定された多量の核酸プローブの使用に基づく。これらの固体支持体としては、例えば、ガラス表面、プラスチックマイクロタイタープレートプラスチックシート薄層ポリマー、または半導体が挙げられる。これらのプローブは、例えば、支持体吸着または共有結合され得るか、あるいは基質マトリクス、膜、またはフィルムマイクロカプセル化またはそうでなければ捕捉され得る。

0011

基質に基づく核酸分析は、特定の配列多型を含むことが既知であるかまたはその疑いのあるサンプル核酸を、固体支持体に結合したプローブのアレイに適用する工程を包含し得る。集団中の多型は、存在する場合、基質に取り付けられた相補配列ハイブリダイズする。次いで、核酸配列のハイブリダイズは、検出工程において検出される。

背景技術

0012

固体支持体マトリックスに基づくハイブリダイゼーションおよび配列決定法は、高いサンプルDNA濃度を必要とし得、そして核酸サンプルと、固定化されたオリゴヌクレオチドプローブとの比較的遅いハイブリダイゼーション速度により阻まれ得る。しばしば、少量のみの鋳型DNAが入手可能であり、そして標的核酸配列の高い濃度を有することが望ましくあり得る。従って、基質に基づく検出分析は、しばしば、標的核酸コピー、または標的核酸中の配列のサブセットが増幅される工程を包含する。ポリメラーゼ連鎖反応PCR)に基づく方法は、例えば、溶液中で、少量のプローブ標的を、数オーダー増加させ得る。しかし、PCRは、固相アプローチに組み込むのが困難であり得る。なぜならば、増幅したDNAが固体支持体マトリクスの表面上に固定されないからである。

0013

固相に基づく配列多型の検出は、記載されている。例としては、Hultmanら、1988、Nucl.Acid.Res.17:4937−4946;Syvanenら、1990、Genomics 8:684−692により記載される固相原理に基づく「ミニシーケンスプロトコルである。この研究において、放射標識ヌクレオチドの取り込みが測定され、そしてヒトアポリポタンパク質E遺伝子の三対立遺伝子多型の分析のために使用された。しかし、このような放射性方法は、慣用的な臨床的適用に十分適しておらず、従って、迅速なDNA配列分析のための簡単で、高感度の非放射性方法の開発もまた、大きな目的である。

0014

(発明の要旨)
本発明は、一部、核酸の配列を決定するためのアレイの使用に基づく。

0015

従って、1つの局面において、本発明は、平坦表面を備えるアレイに関し、この平坦表面に複数の反応チャンバが配置されている。反応チャンバは、5〜200μmの中心間距離を有し、そして各チャンバは、0.3μmと100μmとの間の少なくとも1つの寸法の幅を有する。いくつかの実施形態において、アレイは、複数の空洞を有する平坦表面であり、各空洞は、分析物反応チャンバを形成する。好ましい実施形態において、アレイは、スライスした光ファイバー束(すなわち、融着した光ファイバーケーブルの束)から形成され、そして反応チャンバは、光ファイバー反応器アレイ(「FORA」)の1つの表面をエッチングすることにより形成される。空洞がまた、エッチング、成形、またはミクロ機械加工を通じて基板上に形成され得る。

0016

詳細には、アレイの各反応チャンバは、代表的に、0.3μmと100μmとの間、好ましくは、0.3μmと20μmとの間、最も好ましくは、0.3μmと10μmとの間の少なくとも1つの寸法の幅を有する。別の実施形態において、本発明者らは、より大きい反応チャンバ(好ましくは、20μmと70μmとの間の少なくとも1つの寸法の幅を有する)を企図している。

0017

このアレイは、代表的に、1,000より多い反応チャンバ、好ましくは、400,000より多い反応チャンバ、より好ましくは、400,000と20,000,000との間、そして最も好ましくは、1,000,000と16,000,000との間の空洞または反応チャンバを含む。各空洞の形状は、しばしば、実質的に六角形であるが、空洞はまた円錐形であり得る。いくつかの実施形態において、各空洞は、平滑な壁表面を有する。しかし、本発明者らは、各空洞がまた、少なくとも1つの不規則な壁表面を有し得ることを企図している。各々の空洞の底は、平坦であってもくぼんでいてもよい。

0018

このアレイは、代表的に、中心間距離が10〜150μm、好ましくは、50〜100μmの空洞または反応チャンバを有するよう構築される。

0019

各空洞または反応チャンバは、代表的に、10μmと100μmとの間の深さを有する;あるいは、深さは、空洞の幅の0.25倍と5倍との間の大きさ、好ましくは、空洞の幅の0.3倍と1倍との間の大きさである。

0020

1つの実施形態において、本明細書中に記載されるアレイは、代表的に、平坦上表面および平坦底表面を備え、反応チャンバからの光学シグナルが底平坦表面を通じて検出され得るように光学的に伝導性である。これらのアレイにおいて、代表的に、上表面と底表面との間の距離は、10cm以下であり、好ましくは、3cm以下であり、最も好ましくは、2cm以下であり、そして通常は、0.5mmと5mmとの間である。

0021

1つの実施形態において、アレイの各空洞は、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。このアレイはまた、この平坦アレイから離れており、そしてそれらと対向して接触している第2表面を備え、その結果フローチャンバが、アレイ上に形成される。

0022

別の局面において、本発明は、水性環境における別々の平行共通反応を実施するためのアレイ手段に関する。このアレイ手段は、少なくとも1,000の異なる反応チャンバを有する基板を備える。これらのチャンバは、試薬と反応し得る出発材料を含む。各反応チャンバは、少なくとも1つの試薬を含む1以上の流体が各反応チャンバに送達される場合に、その試薬が壁の外側に拡散する拡散時間が、出発物質が試薬と反応して生成物を形成するのに必要とされる時間を超えるように寸法決めされている。この反応チャンバは、基板上に複数の空洞を作製することによるか、または複数の表面上に異なるパッチを作製することにより形成され得る。これらのパッチは、周囲の平坦表面と異なる表面化学を有する。

0023

1つの実施形態において、アレイの各空洞または反応チャンバは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。代表的に、核酸を含むこれらの反応チャンバ(アレイにおける全ての反応チャンバが必要とされるわけではない)が、1種のみの核酸(すなわち、目的の単一の配列)を含む。この種の核酸の単一のコピーが任意の特定の反応チャンバに存在し得るか、またはこれらは、複数のコピーであり得る。一般的に、反応チャンバは、少なくとも100コピーの核酸配列、好ましくは少なくとも100,000コピー、そして最も好ましくは、100,000〜1,000,000コピーの核酸を含むことが好ましい。1つの実施形態において、核酸種は、PCR、RCAリガーゼ鎖反応、他の等温増幅、または他の従来の核酸増幅手段を用いて、所望の数のコピーを提供するように増幅される。1つの実施形態において、核酸は、一本鎖である。他の実施形態において、一本鎖DNAは、各コピーが末端同士で共有結合したコンカテマーである。

0024

核酸は、チャンバ自体への結合によるかまたはチャンバに送達される移動性固体支持体への結合のよるかのいずれかによって、反応チャンバ中で固定され得る。生物活性剤は、アレイにわたって複数の移動性固体支持体を分散させることにより、アレイに送達され得、各移動性固体支持体は、それらに固定された少なくとも1つの試薬を有し、この試薬は、核酸配列決定反応における使用に適している。

0025

アレイはまた、反応チャンバに配置された移動性固体支持体の集団を含み得る。各移動性固体支持体は、それらに結合された1つ以上の生物活性剤(例えば、核酸または配列決定酵素)を有する。各移動性固体支持体の直径は変化し得、本発明者らは、移動性固体支持体の直径が、各空洞の幅の0.01〜0.1倍であることを好む。各々の反応チャンバが、1つ以上の移動性固体支持体を含む必要はない。3つの企図されている実施形態が存在する。1つ目は、反応チャンバの少なくとも5%〜20%が、少なくとも1つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合であり;2つ目の実施形態は、反応チャンバの少なくとも20%〜60%が、少なくとも1つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合であり;そして3つ目の実施形態は、反応チャンバの少なくとも50%〜100%が、少なくとも1つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合である。

0026

移動性固体支持体は、代表的に、それらに固定された少なくとも1つの試薬を有する。ピロシーケンス反応またはより一般的にはATP検出に関する実施形態について、この試薬は、スルフリラーゼまたはルシフェラーゼ活性、あるいはそれらの両方を有するポリペプチドであり得る。移動性固体支持体は、アレイにわたって、1つ以上の核酸配列またはタンパク質または酵素が固定された複数の移動性固体支持体を分散させる方法において使用され得る。

0027

別の局面において、本発明は、光生成のための反応チャンバのアレイを同時にモニタリングするための装置に関する。この光生成は、反応が、特定の部位で起こっていることを示す。この実施形態において、反応チャンバはセンサであり、分析物および反応チャンバ中で光を生成する酵素的手段または蛍光手段を含むよう適合されている。本発明のこの実施形態において、センサは、生化学的アッセイまたは細胞に基づくアッセイにおける使用に適している。この装置はまた、使用の際に特定の反応チャンバからの光が、光学的に感受性デバイスの特定の予め決定された領域に衝突するよう配置された光学的に感受性のデバイス、ならびに予め決定された領域の各々に衝突する光のレベルを決定するための手段および各々の反応チャンバについて、時間と共に光のレベルの変化を記録する手段を備える。

0028

1つの特定の実施形態において、この機器は、光捕捉手段を有する光検出手段および光を光検出手段に移送するための第2の光ファイバー束を備える。本発明者らは、光捕捉手段がCCDカメラであることを企図している。第2の光ファイバー束は、代表的に、アレイと光学的に接触しており、その結果、個々の反応チャンバにおいて発生した光は、光捕捉手段への移送のための第2の光ファイバー束の別のファイバーまたは別のファイバーの群により捕捉される。

0029

上記アレイは、水性環境における別の平行する共通の反応を実施するために使用され得る。この方法は、少なくとも1つの試薬を含む流体を記載されるアレイに送達する工程を包含する。ここで、アレイ上の特定の反応チャンバ(必ずしも全てではない)は、試薬と反応し得る出発材料を含む。各反応チャンバは、液体が各反応チャンバに送達される場合、試薬が壁の外側へ拡散するための拡散時間が、出発材料が、試薬と反応して生成物を形成するのに必要とされる時間を超えるような寸法である。この方法はまた、出発材料が各反応チャンバにおいて試薬と反応して生成物を形成した後であるが、任意の1つの反応チャンバに送達された試薬が反応チャンバから任意の他の反応チャンバへと拡散する前の期間に、アレイからの流体を洗浄する工程を包含する。1つの実施形態において、任意の1つの反応チャンバにおいて形成される生成物は、任意の他の反応チャンバにおいて形成さえる生成物から独立しているが、1つ以上の共通の試薬を用いて生成される。この出発材料は、核酸配列であり得、そして流体中の少なくとも1つの試薬は、核酸またはヌクレオチドアナログである。流体はさらに、核酸配列およびヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと反応し得るポリメラーゼを有し得る。この方法の工程は、連続的に反復され得る。

0030

この装置は、アレイに液体試薬を提供するための、本明細書中に記載されるアレイと共に使用するのに適合された新規の試薬送達キュベット、および試薬送達キュベットと連通した試薬送達手段を備える。

0031

本発明の1つ以上の実施形態の開示は、付属の以下の説明に示される。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を、ここに記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかである。明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の参照を含む。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する当業者に一般的に理解されているのと同一の意味を有する。他に明らかに記載されない限り、本明細書中で使用または企図される技術は、当業者に周知の標準的な方法である。実施形態の例は、例示の目的にすぎない。本明細書中で列挙される全ての特許および刊行物は、参照として援用される。

0032

(発明の詳細な説明)
本明細書中に記載される方法および装置は、最初に核酸をクローニングする必要性なしに、核酸配列情報の決定を可能にする。さらに、この方法は、高感度であり、そして核酸の出発集団においてほんの数コピー存在する鋳型核酸のヌクレオチド配列を決定するために使用され得る。さらに、この方法は、多量の核酸の配列を同時に決定するために使用され得る。

0033

記載される方法および装置は、一般的に、任意の特定の核酸配列の同定が所望される任意の適用に有用である。例えば、これらの方法は、単一染色体上での単一ヌクレオチド多型(SNP)、複数のSNPを含むハロタイプ、または他の多型の同定、および転写プロファイリングを可能にする。他の用途としては、一次配列を確認または顕在化するため、またはランダム変異誘発スクリーニングから特定の変異クローンを同定するため、およびその種からの遺伝子発現プロフィールを決定するための任意の発達段階または環境条件から単一細胞、全組織、または器官からcDNAの配列を獲得するための人工DNA構築物の配列決定が挙げられる。さらに、これらの方法は、任意の供給源から単離された任意の大きさのPCR産物および/またはクローン化されたDNAフラグメントの配列決定を可能にする。

0034

本明細書中で記載される方法は、サンプル調製プロセスを含み、このプロセスによって、標的核酸に相補的な1つ以上のコピーを含む核酸に共有結合した複数のアンカープライマーを含む固体アレイまたは移動性固体アレイが生成される。共有結合したアンカープライマーおよび標的核酸の1つ以上のコピーの形成は、好ましくは、環状核酸相補領域にアンカープライマーをアニーリングし、次いで、アニールしたアンカープライマーをポリメラーゼで伸長して、この環状核酸に相補的な配列の1つ以上のコピーを含む核酸を形成することにより生じる。

0035

固体支持体または移動性固体支持体へのアンカープライマーの結合は、アニールしたアンカープライマーの伸長の前、最中、および後に起こり得る。従って、1つの実施形態において、1つ以上のアンカープライマーが固体基板または移動性固体基板に連結され、その後、アンカープライマーは、標的核酸にアニールされ、そしてポリメラーゼの存在下で伸長される。あるいは、第2の実施形態において、アンカープライマーは、標的核酸に最初にアニールされ、そしてアニールしたアンカープライマーの3’OH末端がポリメラーゼにより伸長される。次いで、伸長したアンカープライマーは、固体基板または移動性固体基板に連結される。アンカープライマーの配列を変化させることにより、核酸の集団に存在する異なる標的核酸を特異的に増幅することが可能である。

0036

標的核酸における配列は、多数の方法で同定され得る。好ましい配列決定プライマーは、増幅された核酸にアニーリングされ、そしてそれを使用して、配列決定産物を生成する。次いで、この配列決定産物のヌクレオチド配列が決定され、それによって、核酸の決定が可能になる。同様に、1つの実施形態において、テンプレート核酸が増幅され、その後、ビーズまたは他の移動性固体支持体に結合される。他の実施形態において、このテンプレート核酸は、ビーズに結合され、その後、増幅される。

0037

本発明の方法はまた、分析技術によって作製されるDNAフラグメントの配列決定のために使用され得、この分析技術は、酵素処理放射線処理または化学処理(例えば、クロマチンの部分的なDNase処理)に対するDNA構築物の異なる感受性によってか、あるいは、化学物質(これは、ポリメラーゼによって認識される有効な塩基として、メチルシトシンチミジン(または他のヌクレオチド)に転換する)での前処理を行ったかまたは行っていない所定の組織から生じる配列を比較することによってDNAのメチル化状態を決定するために、より高いオーダーのDNA構築物を調査する。さらに、本発明の方法を使用して、一次配列のレベルにおける発達または老化の間に生じる細胞の生理学的変化をアッセイし得る。

0038

本発明はまた、引き続く分析(例えば、配列決定)のための核酸配列を調製する方法を提供する。

0039

(1.核酸の配列決定のための装置)
本発明は、核酸を配列決定するための装置を提供し、この装置は、一般に、配列決定反応を行うための1個以上の反応チャンバ、この反応チャンバにかまたはこの反応チャンバから反応物を送達するための手段、および配列決定反応事象を検出するための手段、を備える。別の実施形態において、この装置は、試薬送達キュベットを備え、このキュベットは、平面上に複数の空洞を備える。好ましい実施形態において、この装置は、この装置の個々の構成要素を制御するため、ならびに配列反応事象の検出から得られる情報を保存および/または分析するための、少なくとも1つコンピューターに接続されている。

0040

本発明はまた、1個以上の反応チャンバを提供し、このチャンバは、不活性基材材料(これはまた、本明細書中で「固体支持体」とも呼ばれる)上にアレイの形態で配置され、規定空間内での配列決定反応において反応物を組み合わせ、そして配列決定反応事象を検出するのを可能にする。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「反応チャンバ」または「分析物反応チャンバ」とは、例えば、核酸の配列決定反応において、反応物の相互作用を容易にする基材材料上の局在化された領域をいう。以下でより完全に議論されるように、本発明によって企図される配列決定反応は、好ましくは、タンデムな多数の個々の核酸サンプルで生じる(特に、ゲノムDNAおよび染色体DNA由来の多数の核酸サンプルの同時配列決定)。従って、本発明の装置は、好ましくは、アレイを備え、このアレイは、このような多数の個々の配列決定反応を行うために、十分な数の反応チャンバを有する。1つの実施形態において、このアレイは、少なくとも1,000個の反応チャンバを備える。別の実施形態において、このアレイは、400,000個より多い反応チャンバを備え、好ましくは、400,000個と20,000,000個との間の反応チャンバを備える。より好ましい実施形態において、このアレイは、1,000,000個と16,000,000個との間の反応チャンバを備える。

0041

アレイ上の反応チャンバは、代表的には、基材材料において空洞の形態かまたはウェルの形態をとり、このチャンバは、反応物が沈着され得る幅および深さを有する。1種以上の反応物は、代表的には、反応チャンバ内の基材材料に結合され、そして反応の残余物は、この反応を促進しそして反応チャンバを通って流れる媒介物中に存在する。空洞またはウェルとして形成される場合、このチャンバは、好ましくは、以下を可能にするのに、十分な寸法およびオーダーである:(i)チャンバ内への、必要な反応物の導入、(ii)チャンバ内で生じる反応、ならびに、(iii)チャンバ間での反応物の混合の阻害。ウェルまたは空洞の形状は、好ましくは、環状または円筒状であるが、環状または円筒状の形状に近づくように多面化(multisided)され得る。別の実施形態において、ウェルまたは空洞の形状は、実質的に六角形である。この空洞は、滑らかな壁面を有し得る。さらなる実施形態において、この空洞は、少なくとも1つの不規則な壁面を有し得る。この空洞は、平面底部または凹面底部を有し得る。反応チャンバは、5μmと200μmとの間、離れて間隔を空けられ得る。2個の隣接した反応チャンバ間の中心間距離を測定することによって、空間が決定される。代表的には、この反応チャンバは、10μmと150μmとの間、好ましくは、50μmと100μmとの間、離れて間隔を空けられ得る。1つの実施形態において、この反応チャンバは、0.3μmと100μmとの間の寸法幅を有する。この反応チャンバは、0.3μmと20μmとの間、好ましくは、0.3μmと10μmとの間、そして最も好ましくは、約6μmの寸法幅を有し得る。別の実施形態において、この反応チャンバは、20μmと70μmとの間の幅を有する。最終的には、チャンバの幅は、核酸サンプルが増幅を必要とするか否かに依存し得る。増幅が必要ではない場合、より小さい幅(例えば、0.3μm)が好ましい。増幅が必要な場合、より大きい幅(例えば、6μm)が好ましい。この反応チャンバの深さは、好ましくは、10μmと100μmとの間である。あるいは、この反応チャンバは、反応チャンバの寸法幅の0.25倍と5倍との間の深さ、または別の実施形態において、この反応チャンバの寸法幅の0.3倍と1倍との間の深さを有し得る。

0042

別の局面において、本発明は、テンプレート核酸ポリマーにおいて核酸配列を決定するための装置を包含する。この装置は、アレイを備え、このアレイは、複数の空洞を平面上に有する。各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここでこの反応チャンバは、5μm〜200μmの間の中心間距離を有する。この装置はまた、テンプレート核酸ポリマーを反応チャンバ内に導入するための、核酸送達手段;および、試薬を反応チャンバ内に送達して重合環境を作るための、核酸送達手段を備える(ここで、この核酸ポリマーは、ヌクレオチドが添加される場合、相補的な核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する)。この装置はまた、一連供給原料を重合環境に連続的に提供するための、試薬送達手段を備え、この各供給原料は、相補的な核酸ポリマーが形成されるヌクレオチド間から選択されるヌクレオチドを含有し、その結果、この供給原料中のヌクレオチドが、配列決定されるテンプレートポリマー中の次のヌクレオチドに相補的である場合、このヌクレオチドは、その相補的なポリマー内に組み込まれ、そして無機ピロリン酸が放出される。この装置はまた、無機ピロリン酸の形成を酵素学的に検出するための、検出手段;および、相補的なポリマー内の各ヌクレオチドの同一性を決定し、それによってテンプレートポリマーを配列決定するための、データ処理手段を備える。

0043

別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置を包含する。この装置は、複数の空洞を平面上に備える、試薬キュベットを備える。各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、この反応チャンバは、5μm〜200μmの中心間距離を有する。この装置はまた、公知の窒素性塩基の1つである活性化ヌクレオチド5’−トリホスフェート前駆体を、各反応チャンバ内の反応混合物に加えるための、試薬送達手段を備える。各反応混合物は、テンプレート特異的ヌクレオチドポリメラーゼおよび1本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを有し、この1本鎖ポリペプチドテンプレートは、相補的なオリゴヌクレオチドプライマー鎖(このテンプレートよりも小さい少なくとも1つのヌクレオチド残基)にハイブリダイズされ、活性化ヌクレオシド5’−トリホスフェート前駆体をプロモーター鎖の3’末端上に組み込むのを可能にする反応条件下で、このプライマー鎖の3’末端にて、各テンプレート内で少なくとも1つの不対ヌクレオチド残基を形成するが、但し、この活性化ヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体の窒素性塩基は、テンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素性塩基に相補的である。この装置はまた、ヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かを検出するための検出手段を備え、このプライマー鎖において、このヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体の組み込みは、テンプレートの不対ヌクレオチド残基が、この組み込まれたヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体の組成と相補的な窒素性塩基組成物を有することを示す。この装置はまた、第二工程および第三工程を連続して繰り返すための手段を備え、ここで、各連続した繰返しは、公知の窒素性塩基組成物の活性化ヌクレオシド5’トリホスフェート前駆体の1つの型を加えて、その型の組み込みを検出する。この装置はまた、ヌクレオシド前駆体を組み込んだ配列から、各反応チャンバ内のテンプレートの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定するための、データ処理手段を備える。

0044

固体支持体材料
任意の材料の表面がプライマーの安定な結合および核酸配列の検出を可能にする限り、この任意の材料は、固体支持体材料として使用され得る。固体支持体材料は、平面であり得るか、または空洞形成され(cavitated)得る(例えば、光ファイバーの空洞形成された末端においてか、またはエッチングされたか、成形されたか、さもなければ、例えば、超小型電気機械系の構成において通常使用される技術を使用して平面内に微細加工された、ミクロウェルにおいて)。例えば、Rai−Choudhury,HANDBOOK OFMICROLITHOGRAPHY,MICROMACHINING,AND MICROFARICATION,VOLUME 1:MAICROLITHOGRAPHY,Volume PM39,SPIEPress(1997);Madou,CRCPress(1997),Aoki,Biotech,Histochem.67:98−9(1992);Kaneら、Biomaterials.20:2363−76(1999);Dengら、Anal.Chem.72:3176−80(2000);Zhuら、Nat.Genet.26:283−9(2000)を参照のこと。いくつかの実施形態において、固体支持体は、光学的に透過性(例えば、ガラス)である。

0045

光学的に透過な固体支持体上の結合部位のアレイは、例えば、米国特許第5,143,854号、同第5,445,934号、同第5,744,305号および同第5,800,992号:Cheeら、Science 274:610−614(1996);Fodorら、Nature 364:555−556(1993);Fodorら、Science 251:767−773(1991);Gushinら、Anal.Biochem.250:203−211(1997);Kinositaら、Cell 93:21−24(1998);Kato−Yamadaら、J.Biol.Chem.273:19375−19377(1998);およびYasudaら、Cell 93:1117−1124(1998)に記載される結合技術において記載される電気集積回路の構成において通常使用されるリソグラフィー技術を使用して、構成され得る。光リソグラフィーおよび電子ビームリソグラフィーは、改変された生体分子(例えば、タンパク質または核酸)の結合を可能にする連結基を用いて、固体支持体または基材感作する。例えば、Service,Science 283:27−28(1999);Rai−Choudhury,HANDBOOK OFMICROLITHOGRAPHY,MICROMACHINING,AND MICROFABRICATION,VOLUME 1:MICROLITHOGRAPHY,Volume PM39,SPIEPress(1997)を参照のこと。あるいは、感作部位のアレイは、Zasadzinskiら、Science 263:1726−1733(1994)に記載されるような薄膜技術を使用して作製され得る。

0046

(光ファイバー基材アレイ)
基材材料は、好ましくは、反応事象の検出を容易にする材料から作製される。例えば、代表的な配列決定反応において、dNTPの、配列決定されたサンプル核酸への結合は、配列決定反応において遊離されたホスフェートに対する酵素作用によって生じる光子を検出することによって、モニタリングされ得る。従って、透過性材料または光学的に(すなわち、光)導線性の材料から作製される基材材料を用いると、光子の検出が容易になる。

0047

いくつかの実施形態において、固体支持体は、光生成物を検出および透過するのに使用される光ファイバーのバンドルに連結され得る。このバンドル内の光ファイバーの総数は、配列決定反応において使用されるアレイ内の個々の反応チャンバ数に一致するように変更され得る。バンドル内に組み込まれた光ファイバーの数は、1:1の画像化を可能にするような検出デバイス解像度整合するように設計される。バンドルの全体のサイズは、反応チャンバ内の所望の試薬の特性(流れ)を維持しながら、検出デバイスの有効領域を最適化するように選択される。従って、15μm画素を有する4096×4096画素のCCD(電荷結合素子)アレイについて、ファイバーバンドルは、約60mm×60mmに選択され得るか、または約90mmの寸法を有するように選択される。所望の数の光ファイバーが、最初に、バンドルまたは光ファイバーアレイ内に溶接され(fused)、次いで、この末端が、必要な厚さ(例えば、1.5mm)の「ウエハ」を形成するように切断および研磨され得る。得られる光ファイバーウエハは、ガラス平面のハンドリング特性と類似のハンドリング特性を有する。個々のファイバーは、任意のサイズ寸法(例えば、3μm〜100μm)であり得る。

0048

2つの光ファイバーバンドルが使用されるいくつかの実施形態において、第一のバンドル(本明細書中において、ファイバーバンドルまたはコネクターとも呼ばれる)は、検出デバイスに直接取り付けられ、そして第二のバンドルは、反応チャンバ基材(ウエハまたは基材)として使用される。この場合において、2つのバンドルは、直接接触して配置され、検出デバイス上で反応中心を画像化するために、必要に応じて、光学カップリング流体が使用される。CCDが検出デバイスとして使用される場合、ウエハは、このCCD領域の使用を最大にするためにわずかに大きいか、または代表的な顕微鏡スライド形式(25mm×75mm)に一致するためにわずかに小さい。バンドル内の個々のファイバーの直径は、最新技術の制限内で、単一反応が検出デバイス内の単一画素で画像化される可能性を最大にするように選択される。例示的な直径は、ファイバーバンドルについては6〜8μmであり、そしてウエハについては6〜50μmであるが、3〜100μmの範囲内の任意の直径が使用され得る。ファイバーバンドルは、CCDカメラの製造業者から市販され得る。これらのアレイにおいて、代表的には、上面と底面との間の距離は、10cmより小さく、好ましくは、3cmよりも小さく、最も好ましくは、2cmよりも小さく、そして通常は、0.5mmと5mmとの間である。例えば、ウエハは、Incom,Inc.(Charlton,MA)から得られ、切断され、そして光ファイバーの巨大溶接物から研磨され得る(代表的には、2mm厚であるが、おそらく0.5〜5mm厚である)。ウエハは、窓ガラスまたはガラス顕微鏡スライドと類似のハンドリング特性を有する。

0049

反応チャンバは、光ファイバー材料から作製される基材に形成され得る。この光ファイバーの表面は、ファイバーのバンドルの末端を処理して(例えば、酸を用いて)、光ファイバー材料に窪みを形成することによって空洞形成される。従って、空洞が光ファイバーバンドルから形成される実施形態において、好ましくは、この空洞は、この光ファイバーバンドルの一端をエッチングすることによって形成され得る。空洞形成された各表面は、反応チャンバを形成し得る。このようなアレイは、光ファイバー反応アレイまたはFORAとして本明細書中で参照される。この深さにおける窪みは、個々の光ファイバーの約1/2の直径からこのファイバーの2/3倍の直径までの範囲である。空洞は、光ファイバーウエハの一端を酸性浴中に種々の時間量置くことによって、このファイバーの末端に導入され得る。時間量は、所望の反応空洞の全体の深さに依存して、変化し得る(例えば、Waltら、1996、Anal.Chem.70:1888を参照のこと)。広いチャネル空洞は、約14mm×43mmの均一な流速の大きさを有し得る。従って、この適切な寸法と適切な4.82×10−4空洞/μm2の密度において、この装置は、約290,000の流体的受容可能な空洞を有し得る。光ファイバーバンドルの端部においてエッチングされた空洞において、分子を結合する(および、この結合した分子を検出する)ためのいくつかの方法が、当該分野で公知である。例えば、Michaelら、Anal.Chem.70:1242−1248(1998);Fergusonら、Nature Biotechnology 14:1681−1684(1996);HealeyおよびWalt,Anal.Chem.69:2213−2216(1997)を参照のこと。反応性部位パターンはまた、平面支持体上に反応性パッドのパターンを作製する際に使用される光リソグラフィー技術と類似の光リソグラフィー技術を使用して、ミクロウェルに作製され得る。Healeyら、Science 269:1078−1080(1995);MunkholmおよびWalt.Anal.Chem.58:1427−1430(1986)、ならびにBronkら、Anal.Chem.67:2750−2757(1995)を参照のこと。

0050

光ファイバーウエハの反対面(すなわち、非エッチング面)は、代表的には、(例えば、浸漬油または他の光学カップリング流体によって)第二の光ファイバーバンドルへの光学カップリングを可能にするように、高度に研磨される。この第二の光ファイバーバンドルは、反応チャンバを備える光学ウエハの直径と正確に一致し、かつ取り付けられた検出デバイス(例えば、CCD画像化システムまたはカメラ)に光産物を伝達するためのコンジットとして作動するのに役立つ。

0051

1つの好ましい実施形態において、光ファイバーウエハは、例えば、15% H2O2/15% NH4OH(容量:水溶液中の容量)、次いで6回の脱イオン水でのリンス、次いで0.5MEDTA、次いで6回の脱イオン水、次いで15% H2O2/15% NH4OH、次いで6回の脱イオン水(各洗浄において、1/2時間のインキュベーション)の連続的な洗浄によって、全体にわたって洗浄される。

0052

光ファイバーウエハの表面は、好ましくは、配列決定反応におけるその使用を容易にするようにコーティングされる。このコーティングされた表面は、好ましくは、光学的に透過であり、タンパク質および核酸の結合を容易にし、そして固定化されたタンパク質の活性に負の影響を及ぼさない。さらに、この表面は、好ましくは、高分子の非特異的吸収を最小にし、そして連結された高分子(例えば、結合された核酸およびタンパク質)の安定性を増強する。

0053

アレイをコーティングするのに適切な材料としては、例えば、プラスチック(例えば、ポリスチレン)が挙げられる。プラスチックは、好ましくは、スピンコーティングされるかまたはスパッタリングされ得る(0.1μ厚)。アレイをコーティングための他の材料としては、金の層(例えば、24カラットの金0.1μm厚)が挙げられ、これは、長鎖チオールアルカン自己アセンブリングした単層に吸収される。次いで、ビオチンが、この表面に共有的カップリングされ、そしてビオチン結合タンパク質(例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン)で飽和される。

0054

コーティング材料としては、さらに、基材にプライマーを固着するために使用される系が挙げられる。オルガノシラン剤(これは、アミノ基、スルフヒドリル基またはカルボキシ基を介してタンパク質の直接的な共有カップリングを可能にする)もまた、アレイをコーティングするために使用され得る。さらなるコーティング物質としては、以下が挙げられる:光反応性リンカー(例えば、光ビオチン(photobiotin))(Amosら、「Biomaterial Surface Modification Using Photochemical Coupling Technology」Encyclopedic Handbook of Biomaterials and Bioengineering,Part A:Materials,Wiseら(編)、New York,Marcel Dekker,pp.895926,1995)。

0055

さらなるカップリング材料としては、以下が挙げられる:好ましくは、表面上かまたは重合後に共有結合されたポリマー鎖上で直接重合化され得る、親水性ポリマーゲルポリアクリルアミドポリサッカリド)(Hjerten,J.Chromatogr.347,191(1985);Novotny,Anal.Chem.62.2478(1990))、ならびに、特に、ポリスチレンまたはシラン処理されたガラス表面のいずれかに吸収される、プルロニック(pluronic)ポリマー(トリブロックコポリマー(例えば、PPO−PEO−PPO);F−108としてもまた公知)(Hoら、Langmuir 14:3889−94,1998)、ならびに、ビオチン結合タンパク質の受動的吸収層。この表面はまた、アミン結合を介して試薬のカップリングを可能にするエポキシドでコーティングされ得る。

0056

さらに、上記材料のいずれかは、酵素およびヌクレオチドの固定化のために当該分野で一般的に公知の、1種以上の官能基(例えば、金属キレート基(例えば、ニトリロ三酢酸イミノ二酢酸、五座キレート剤)(これらは、6×Hisタグ化タンパク質および核酸に結合する))で誘導体化され得る。

0057

次元表面理論的結合能力を越えた、引き続く処理(例えば、酵素の結合(後で議論される))のために利用可能な結合部位の数を増加させる表面コーティングが、使用され得る。

0058

好ましい実施形態において、溶接された光ファイバーバンドル/ウエハを作製するために利用される個々の光ファイバーは、光学画像化システムにおいて利用され得る直径(すなわち、3μm)よりも大きい直径(すなわち、6μm〜12μm)である。従って、単一の反応性部位を画像化するために、いくつかの光学画像化ファイバーが使用され得る。

0059

(本発明のアレイの概要
1つの局面において、本発明はアレイを包含し、このアレイは、その上に配置された複数の反応チャンバを有する平面を備え、ここで、この反応チャンバは、5〜200μmの中心間距離を有し、そして各チャンバは、0.3μmと100μmとの間の、少なくとも1つの寸法幅を有する。いくつかの実施形態において、このアレイは、その上に複数の空洞を備える平面であり、ここで、各空洞は、分析物反応チャンバを形成する。好ましい実施形態において、このアレイは、スライスされた光ファイバーバンドル(すなわち、溶接された光ファイバーケーブルのバンドル)から作製され、そしてこの反応チャンバは、その光ファイバー反応アレイ(「FORA」)の1つの表面をエッチングすることによって形成される。この空洞はまた、エッチング、成形または微細加工によって、基材に形成され得る。

0060

詳細には、このアレイにおける各反応チャンバは、代表的には、0.3μmと100μmとの間、好ましくは、0.3μmと20μmとの間、最も好ましくは、0.3μmと10μmとの間の、少なくとも1つの寸法幅を有する。別々の実施形態において、本発明者らは、好ましくは、20μmと70μmとの間の少なくとも1つの寸法幅を有する、巨大な反応チャンバを企図する。

0061

このアレイは、代表的には、1,000個より反応チャンバ、好ましくは、400,000個より多い、より好ましくは、400,000個と20,000,000個との間、そして最も好ましくは、1,000,000個と16,000,000個との間の、空洞または反応チャンバを備える。各空洞の形状は、しばしば実質的に六角形であるが、この空洞はまた、円筒状でもあり得る。いくつかの実施形態において、各空洞は、滑らかな壁面を有するが、本発明者らは、各空洞がまた、少なくとも1つの不規則壁面を有し得ることも企図する。空洞の各々の底面は、平面または凹面であり得る。

0062

このアレイは、代表的には、10μm〜150μmの間、好ましくは、50μm〜100μmの間の中心間距離を有する、空洞または反応チャンバを有するように構成される。

0063

各空洞または反応チャンバは、代表的には、10μm〜100μmの間の深さを有し、この深さは、空洞の幅の0.25倍と5倍との間のサイズであり、好ましくは、空洞の幅の0.3倍と1倍との間のサイズである。

0064

1つの実施形態において、本明細書中で記載されるアレイは、代表的には、平らな上面および平らな底面を備え、これは、光学的に導電性であり、その結果、反応チャンバからの光学シグナルは、この底平面を介して検出され得る。これらのアレイにおいて、代表的には、その上面と底面との間の距離は、10cmよりの小さく、好ましくは、3cmよりも小さく、最も好ましくは、2cmよりも小さい。

0065

1つの実施形態において、アレイの各空洞は、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を備える。このアレイはまた、平面アレイから離れて間隔を空け、それと対向して接触した第二の表面を備え、その結果、流動チャンバが、このアレイにわたって形成される。

0066

別の局面において、本発明は、水性環境において、別々の並列一般反応を行うための、アレイ手段を包含し、ここでこのアレイ手段は、少なくとも1,000個の別個の反応チャンバを有する基材を備える。これらのチャンバは、試薬と反応し得る出発材料を含む。反応チャンバの各々は、特定の寸法を有し、その結果、少なくとも1種の試薬を含有する1種以上の流体が各反応チャンバに送達される場合、試薬がウェルから拡散するための拡散時間は、出発材料が試薬と反応して生成物を形成するために必要とする時間を上回る。この反応チャンバは、基材上に複数の空洞を作製することによってか、または平面上に別個のパッチ(これは、周囲平面と異なる表面化学を有する)を作製することによって形成され得る。

0067

1つの実施形態では、アレイの各空洞または反応チャンバーは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。代表的には、核酸を含むこれらの反応チャンバーは、(アレイ中のすべての反応チャンバーがそうである必要はないが)単一種のみの核酸の(すなわち、目的である単一の配列)を含む。任意の特定の反応チャンバー内にこの種の核酸の単一コピーが存在し得るか、またはそれらは複数コピーであり得る。一般に、反応チャンバーが、少なくとも100コピーの核酸配列、好ましくは少なくとも100,000コピーの核酸配列、そして最も好ましくは100,000〜1,000,000コピーの核酸を含むことが好ましい。当業者は、任意の1つの反応チャンバー中の核酸種のコピー数における変化が、高温配列決定反応で発生する光子の数に影響し、そして必要に応じて慣用的に調節され、多かれ少なかれ光子シグナルを提供し得ることを認識する。

0068

1つの実施形態では、この核酸種は、PCR、RCA、リガーゼ連鎖反応、その他の等温増幅、または核酸増幅のその他の従来手段を用い、増幅されて所望のコピー数を提供する。1つの実施形態では、この核酸は一本鎖である。その他の実施形態では、この一本鎖DNAは、各コピーの端と端とが共有結合で連結されたコンカテマーである。

0069

(送達手段)
上記反応チャンバーに反応物を送達するための手段の例は、本発明の灌流チャンバーであり、図3に示される。この灌流チャンバーは、透明の上部スライドおよび下部スライドをもつシールされた区画を備える。これは、基板表面の表面上の溶液の流れを可能にし、そして試薬の迅速な交換を可能にするように設計されている。従って、これは、例えば、ピロリン酸配列決定反応を実施するために適切である。このチャンバーの形状および寸法は、バルク流れ交換、拡散的交換、または層流または乱流措置いずれかの両方を含む試薬交換を最適化するために調節され得る。

0070

この反応チャンバーへの反応物の正確な交換は、本発明における正確な測定のために重要である。バルク流体対流不在下では、反応に関与する物質輸送(および隣接反応部位間またはミクロベッセル間の交差汚染または「クロストーク」)は拡散によってのみ生じ得る。反応部位が2−D表面上の点源であると考えられるとき、目的の化学種(例えば、反応生成物)は、その生成の部位から半径方向に拡散し、上記表面上に実質的に半球形の濃度フィールドを生成する。

0071

化学物質(entity)が所定の時間tに拡散し得る距離は、拡散の数学(Crank、The Mathematics of Diffusion、第2版、1975)を考慮することにより概算様式で推定され得る。任意の所定の方向x(cm)の拡散輸送の速度は、Fickの法則により以下の式で与えられる。

0072

【数1】
ここで、jは、拡散係数D(cm2/s)をもつ種の単位面積あたりのフラックス(g−mol/cm2−s)であり、そして∂C/∂xは、その種の濃度勾配である。拡散の数学は、拡散単独により物質が移動し得る特徴または「平均」距離が、拡散係数および拡散が生じることを可能にする時間の両方の1/2べき乗で測定される。実際、オーダーの大きさまで、この特徴的拡散距離は、拡散係数と時間との積の平方根として(これは、システムの幾何学的構造および拡散プロセスに課せられる初期および/または境界条件事項を考慮するオーダー一致(order unity)の数的因子により調節される)推定され得る。

0073

この特徴的拡散距離を、拡散物質が時間tにたどり得る、以下の2乗平均距離drmsとして推定することが便利である:

0074

【数2】
上記のように、拡散化学物質が代表的にたどる距離は、それが拡散するために利用可能な時間の平方根とともに変化し−−そして、反対に、拡散する化学物質が所定の距離をたどるために必要な時間は、拡散により横切られる距離の2乗で測定される。従って、オーダー1−10−5cm2/秒の拡散係数Dにより特徴付けられる単純な低分子量生体分子について、0.1秒、1.0秒、2.0秒、および10秒の時間間隔で横切られ得る2乗平均距離drmsは、式2により、それぞれ14μm、45μm、63μm、および141μmと推定される。

0075

対流および拡散の両方の機構が同時に起こることを含む輸送プロセスにおける対流と拡散の相対的重要性は、無次元数−すなわちPeclet数Peの助けにより測定され得る。このPeclet数は、2つの速度(rateまたはvelocity)の比−すなわち、対流流れの速度を拡散「流れ」またはフラックスで除する、として概算され得る。より詳細には、このPeclet数は、特徴的な流れ速度V(cm/秒)が特徴的な拡散速度D/L(これもまたcm/秒の単位で表される)で除された比である−両者を同じ方向にとると:

0076

【数3】
式3において、Vは、対流流れの平均または特徴的スピードであり、ほぼ、容量流れ速度Q(cm3/秒)を、流れが利用可能な断面積A(cm2)で除することにより決定される。特徴的な長さLは、流れの方向および拡散の方向に平行な方向(すなわち、最も急な濃度勾配の方向)に測定される代表的距離またはシステム寸法であり、そしてプロセス中で拡散が起こる代表的または「平均」距離を代表するように選択される。そして最終に、D(cm2/秒)は、問題の拡散種に対する拡散係数である。(代替であるが等価なPeclet数Peの公式は、それを、2つの特徴的な時間の比−すなわち、拡散および対流の代表的時間の比としてみる。Peclet数についての式3は、特徴的拡散時間L2/Dを、特徴的な対流時間L/Vで除することにより等しく良好に得られ得る。)
輸送の対流成分は、一であること(unity)と比較してPeclet数Peが大きい状況において、拡散成分より優勢であることが予期され得る。逆に、輸送の拡散成分は、一であることと比較してPeclet数Peが小さい状況において、対流成分より優勢であることが予期され得る。Peclet数が1よりかなり大きいか、またはかなり小さいかのいずれかの極端な状況では、輸送は、対流単独によるか、または拡散単独によるかのいずれかで生じると、それぞれ、正確に推測され得る。最後に、推定されたPeclet数が一であることのオーダーである状況では、そのときは、対流および拡散の両方が、輸送プロセスの全体に顕著な役割を演じていることが予期され得る。

0077

代表的な低分子量生体分子の拡散係数は、ほぼ、10−5cm2/秒のオーダーである(例えば、スクロースについて0.52・10−5cm/秒、そしてグリシンについて1.06・10−5cm/秒)。従って、100μm(すなわち、0.01cm)の距離だけ離れた反応中心、空洞、またはウェルについて、これらのような低分子量溶質に対するPeclet数Peは、約10μm/秒(0.001cm/秒)より大きい流れ速度について、一であることを超える。わずか10μm(すなわち、0.001cm)だけ離れた空洞については、低分子量溶質に対するPeclet数Peは、約100μm/秒(0.01cm/秒)より大きい流れ速度について、一であることを超える。従って、対流輸送は、非常に遅い流れ速度を除くすべて、および/または非常に短い拡散距離について拡散輸送に対して優勢であるように見える。

0078

拡散種の分子量が実質的により大きい場合−−例えば、DNA/RNA、DNAフラグメント、オリゴヌクレオチド、タンパク質、および前者の構築物のような大きな生体分子であるとき−−種の拡散度は、対応してより小さく、そして対流が、両方の機構を含む輸送プロセスにおいて、拡散に対してより重要な役割を演じる。例えば、タンパク質の水相拡散係数は、約10倍の範囲に入る(Tanford、Physical Chemistry of Macromolecules、1961)。タンパク質拡散度は、リボヌクレアーゼ(13,683ダルトンの分子量をもつ小タンパク質)について1.19×10−6cm2/秒の値で階層付けられ、そしてミオシン(493,000ダルトンの分子量をもつ大タンパク質)について1.16×10−7cm2/秒の値で階層付けられている。なおより大きな物質(例えば、4060万ダルトンのタバコモザイクウイルスまたはTMV)は、より低い拡散度(特に、TMVについて4.6×10−8cm2/秒)(Lehninger、Biochemistry、第2版、1975)により特徴付けられる。対流と拡散とがほぼ等しく輸送に寄与する流体速度(すなわち、一であることのオーダーのPe)は、種拡散度に直接比例して測定される。

0079

Peclet数の形式の助けにより、反応チャンバー、空洞またはウェルに供給される反応物−−およびそれから除去される生成物に対する対流のインパクトを測定することが可能である。その一方、最も穏やかな対流でさえ、アレイまたはFORA中の空洞の内部に反応物が送達される速度を認識し得るほど増大することは明らかである。特に、単純化のために、ほぼ等しい対流および拡散流れに対する規準がPe=1であると考えられると仮定する。そのときは、ほんの0.004cm/秒のオーダーの対流流れ速度は、反応物拡散度が1×10−5cm2/秒の推定値を仮定すると、拡散単独によりウェルの底に反応物が供給され得るのとほぼ同じ速度で、反応物を25μm深さのウェル中に運ぶために十分であることが推定され得る。2.5μm深さのマイクロウェルの底から頂部までのこのような種の拡散の速度に一致するために必要な対応する流れ速度は、0.04cm/秒のオーダーであると推定される。これよりかなり高いFORAを通る流れ速度が可能であり、それによって、最も穏やかな対流流れが、FORA反応中心、空洞またはウェルへの反応物の拡散的供給を増強し得る程度を例示する。

0080

好ましくは、灌流チャンバーは、イメージングシステムが準備される間それから離脱されており、そして配列決定分析が実施されるときのみイメージングシステム上に配置される。1つの実施形態では、固体支持体(すなわち、DNAチップまたはスライドグラス)が、金属またはプラスチックハウジングにより適所に保持され、これは、前記固体支持体の再配置を可能にするようにアセンブルまたは脱アセンブルされ得る。灌流チャンバーの固体支持体の下側は、反応チャンバーアレイを保持し、そして伝統的な光学を基礎にした焦点システム、高開口数対物レンズを用いて反応中心アレイのイメージCCDイメージングシステム上に集める。

0081

分析のための代替システムは、サンプルが、表面、例えば、微細製作されたチップ上に分配され、そしてそれによって、配列されたサンプルのセットが2次元フォーマットで固定化され得るアレイフォーマットを用いることである。多くのサンプルがそれによって並行して分析され得る。本発明の方法を用い、多くの固定化されたテンプレートがこの中で分析され得、これは、酵素および1つのヌクレオチドを含む溶液を、上記表面上で流すことを可能すること、次いで各サンプルについて生成されるシグナルを検出することによった。次いでこの手順は繰り返され得る。あるいは、テンプレートに相補的ないくつかの異なるオリゴヌクレオチドを、上記表面上に分配し、次いでテンプレートとハイブリダイズする。デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの取り込みは、プライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを用いて生成されたシグナルにより各オリゴヌクレオチドについてモニターされ得る。上記表面の異なる領域からのシグナルを組み合わせることにより、配列を基礎にした分析が、種々のジデオキシヌクレオチドを用いるポリメラーゼ反応の4つのサイクルにより実施され得る。

0082

上記支持体が空洞化されたアレイの形態、例えば、FORAの末端、またはマイクロウェルのその他のアレイであるとき、試薬のための適切な送達手段は、流すことおよび洗浄すること、そしてまた、例えば、流すこと、スプレーすること、エレクトロスプレーすること、インクジェット送達、スタンプすること、超音波微粒化(Sonotek Corp.、Milton、NY)およびローリングを含む。好ましくは、すべての試薬溶液は、10−20%エチレングリコールを含み、蒸発を最小にする。スプレーすることが用いられる場合、試薬は、工業タイプのスプレーノズル(Spraying Systems、Co.、Wheaton、IL)またはCAMATLCSprayer(Camag Scientific Inc.、Wilmington、NC)のような薄層クロマトグラフィー(TLC)で用いられるアトマイザーにより生成される均一な薄層中のFORA表面に送達される。これらの噴霧器は、0.3〜10μmのサイズ範囲エアロゾルスプレー粒子に試薬を微粒化する。

0083

タンパク質溶液およびDNA溶液のエレクトロスプレー沈着(ESD)は、現在、これら分子の質量スペクトル分析のためのイオンを生成するために用いられている。静電力の制御下でFORA基板の特定領域上への荷電したエレクトロスプレー生成物の沈着が示唆されている。ES沈着されたタンパク質およびDNAは、それぞれ、抗体に特異的に結合し、そしてDNAプローブマッチするそれらの能力を保持し、ドットイムノ結合(DIB)中およびDNAハイブリダイゼーションアッセイ中で、ESD製造されたマトリックスの使用を可能にする(MorozovおよびMorozova Anal.Chem.71(15):3110−7(1999))。

0084

インクジェット送達は、文献中に記載されているように(例えば、Rodaら、Biotechniques 28(3):492−6(2000))、タンパク質溶液およびその他の生体高分子に適用可能である。これはまた、例えば、MicroFabTechnologies,Inc.(Plano、TX)から市販されている。

0085

あるいは、試薬溶液は、リソグラフィーに類似の方法によりFORA表面に送達され得る。ローラー(スタンプ;親水性材料が用いられるべきである)は、最初、リザーバー中で湿潤スポンジを用いて試薬層で覆われ、そして次にFORA表面上にロールされる(それに対して押し付けられる)。

0086

好ましくは、連続的な試薬送達ステップは、当該分野で従来公知の技法を用いて洗浄ステップと分離されている。これらの洗浄は、例えば、高速流れ噴霧器またはFORAもしくはマイクロウェルアレイ表面上の液体流れによることを含む、上記に記載の方法を用いて実施され得る。これらの洗浄は、出発物質が試薬と反応し、各反応チャンバーで生成物を形成した後であるが、任意の1つの反応チャンバーに送達された試薬がその反応チャンバーから他の任意の反応チャンバー中に拡散する前の任意の時間に生じ得る。1つの実施形態では、任意の1つの反応チャンバーは、他の任意の反応チャンバー中で形成されるが、1つ以上の共通試薬を用いて生成される生成物とは独立している。

0087

完全な装置の実施形態は図2に示されている。この装置は、離脱可能な灌流チャンバー226と連通する入口導管200を備える。この入口導管200は、複数のチューブ202−212を経由して配列決定試薬の侵入を可能にし、この複数のチューブは、それぞれ、複数の配列決定調合試薬ベッセル214−224と連通している。

0088

試薬は、能動流れを駆動するために加圧システムまたはポンプのいずれかを用い、導管200を通じて灌流チャンバー226中に導入される。代表的には、この試薬の流速は、0.05〜50ml/分(例えば、1〜50ml/分)であり、0.100ml〜連続流れ(洗浄のため)の容量である。バルブは、ヌクレオチドおよび洗浄試薬サイクリングを可能にするコンピューター制御下にある。配列決定試薬、例えば、ポリメラーゼは、ヌクレオチドと予備混合され得るか、または流れに添加され得る。多岐管は、6つのチューブ202−212のすべてを、灌流チャンバー供給のために1つにする。従って、いくつかの試薬送達ポートが灌流チャンバーへのアクセスを可能にする。例えば、ポートの1つを利用して水性配列決定試薬のインプットを可能にし得、その一方、別のポートが、これら試薬(および任意の反応生成物)を灌流チャンバーから引き抜かれることを可能にする。

0089

灌流チャンバー226は、複数の反応チャンバーを備える基板を備える。この灌流チャンバーは、増幅された核酸上に、要求される水溶液中の配列決定試薬の均一な直線状流れを可能にし、そしてこれら試薬の迅速かつ完全な交換を可能にする。従って、これは、ピロリン酸を基礎にした配列決定反応を実施するために好適である。灌流チャンバーはまた、アンカープライマーを調製し、増幅反応、例えば、本明細書に記載のRCA反応を実施するために用いられ得る。

0090

本発明はまた、アレイに、核酸配列決定酵素を送達するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸配列決定酵素の1つは、スルフリラーゼ(sulfurylase)活性をもつポリペプチドであり得るか、またはこの核酸配列決定酵素は、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドであり得る。別の実施形態では、この核酸配列決定酵素の1つは、スルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方をもつポリペプチドであり得る。より好適な実施形態では、この試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切であり得る。

0091

好適な実施形態では、1つ以上の試薬が移動可能な固体支持体の集団、例えば、ビーズまたはマイクロスフェアに固定化または付着されたアレイに送達される。このビーズまたはマイクロスフェアは、球状である必要はなく、不規則形状のビーズが用いられ得る。代表的には、これらは多くの物質、例えば、プラスチック、ガラスまたはセラミックから構築され、そしてビーズのサイズは、ナノメーターからミリメーターの範囲にあり、これは反応チャンバーの幅に依存する。好ましくは、各移動固体支持体の直径は、各空洞の幅の0.01〜0.1倍の間であり得る。種々のビーズ化学物質、例えば、メチルスチレン、ポリスチレン、アクリルポリマーラテックス常磁性体トリアゾル炭素グラファイトおよび二酸化チタンを用い得る。ビーズの構築または化学は、所望の試薬の付着を容易にするように選択され得る。

0092

別の実施形態では、最初に生体活性試薬が合成され、そして次にビーズに共有結合で付着される。当業者に認識されるように、これは、生体活性試薬およびビーズの組成に依存してなされ得る。チオール、アミン、カルボキシルなどのような化学的に反応性の基を用いる特定のポリマーのような固体支持体表面官能化は当該分野で一般に公知である。従って、ユーザーにより所望の官能性の付着を容易にする表面化学を有する「ブランク」ビーズが用いられ得る。ブランクビーズのこれらの表面化学のさらなる例は、制限されずに、脂肪族アミンおよび芳香族アミンを含むアミノ基、カルボン酸アルデヒドアミドクロロメチル基ヒドラジドヒドロキシル基スルホネートおよびスルフェートを含む。

0093

これらの官能基は、一般に、公知の化学物質を用い、ビーズに任意の数の異なる候補薬剤を付加するために用いられ得る。例えば、炭化水素を含む候補薬剤は、アミノ官能化支持体に付着され得る;炭化水素のアルデヒドを、標準的な技法を用いて作成し、そして次にこのアルデヒドを表面上のアミノ基と反応させる。代替の実施形態では、スルフヒドリルリンカーが用いられ得る。SPDPマレイミド、α−ハロアセチル、およびピリジルジスルフィドのような、当該分野で公知の多くのスルフヒドリル反応性リンカーがあり(例えば、本明細書に参考として援用される、1994年のPierce Chemical Companyカタログ架橋リンカーの技術セクション、155−200頁を参照のこと。)、これを用い、システインを含有するタンパク質の試薬を支持体に付着し得る。あるいは、候補試薬上のアミノ基を、表面上のアミノ基への付着のために用い得る。例えば、多数の安定な二官能性基が当該分野で周知であり、これにはホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーが含まれる(Pierce Catalog and Handbook、155−200頁を参照のこと)。さらなる実施形態では、カルボキシル基(表面由来であるか、または候補薬剤由来のいずれか)を、周知のリンカー(Pierceカタログを参照のこと)を用いて誘導体化し得る。例えば、カルボジイミドは、アミンなどの良好な求核試薬による攻撃のためにカルボキシル基を活性化する(Torchilinら、Critical Rev.Thereapeutic Drug Carrier Systems、7(4):275−308(1991)を参照のこと)。タンンパク質の候補試薬はまた、当該分野で公知である、例えば、ポリマーへの抗体の付着のための他の技法を用いて付着され得る;Slinkinら、Bioconj.Chem.2:342−348(1991);Torchilinら、前述;Trubetskoyら、Bioconj.Chem.3:323−327(1992);Kingら、Cancer Res.54:6176−6185(1994);およびWilburら、Bioconjugate Chem.5:220−235(1994)を参照のこと。候補薬剤は、上記に列挙したようなものを含む種々の方法で付着され得ることが理解されるべきである。好ましくは、付着の様式は、候補試薬の官能性を有意に改変しない;すなわち、候補試薬は、標的とのその相互作用を可能にするような柔軟な様式で付着されるべきである。

0094

ビーズ上に酵素を固定化する特別の技法は先行技術で公知である。1つの事例では、NH2表面化学ビーズが用いられる。表面活性化は、pH6.9を提供する(138mM NaCl、2.7mM KCl)リン酸緩衝化生食塩水(10mM)中の2.5%グルタルアルデヒドで達成される。この混合物は、攪拌ベッド上で、約2時間、室温で攪拌される。次いで、ビーズを超純水+0.01%−0.02%Tween20(界面活性剤)ですすぎ、そしてpH7.7PBS+0.01%Tween20で再びすすぐ。最後に、酵素を、好ましくは、0.45μmのアミコンマクロポアフィルターを用いて予備濾過した後、溶液に添加する。

0095

移動固体支持体の集団は、反応チャンバー中に配置される。いくつかの実施形態では、5%〜20%の反応チャンバーが、移動固体支持体を、その上に少なくとも1つの試薬を固定化して有し得るか、20%〜60%の反応チャンバーが、試薬移動固体支持体を、その上に少なくとも1つの試薬を固定化して有し得るか、または50%〜100%の反応チャンバーが、試薬移動固体支持体を、その上に少なくとも1つの試薬を固定化して有し得る。好ましくは、少なくとも1つの反応チャンバーが、その上に固定化された少なくとも1つの試薬を有する移動固体支持体を有し、そしてこの試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切である。

0096

いくつかの実施形態では、移動固体支持体に固定化された試薬は、スルフリラーゼ活性をもつポリペプチド、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドまたはスルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方をもつキメラポリペプチドであり得る。1つの実施形態では、それは、ATPスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ融合タンパク質であり得る。スルフリラーゼ反応の生成物はルシフェラーゼにより消費されるので、これら2つの酵素間の近接は、2つの酵素を融合タンパク質の形態に共有結合することにより達成され得る。本発明は、基板チャネリングにおけるのみならず、生産コストを低減すること、およびストレプトアビジンでコートされたビーズ上の結合部位の数を潜在的に倍にすることにおいて有用である。

0097

別の実施形態では、スルフリラーゼは、熱安定性ATPスルフリラーゼである。好適な実施形態では、この熱安定性スルフリラーゼは、室温を超える温度で活性である(少なくとも50℃まで)。1つの実施形態では、このATPスルフリラーゼは好熱菌由来である。さらなる実施形態では、移動固体支持体は、その上に固定化された第1の試薬および第2の試薬を有し得、この第1の試薬はスルフリラーゼ活性をもつポリペプチドであり、そしてこの第2の試薬は、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドである。

0098

別の実施形態では、移動固体支持体に固定化された試薬は核酸であり得;好ましくは、この核酸は一本鎖のコンカタマーである。好適な実施形態では、この核酸は、核酸の配列決定、例えば、熱配列決定反応のために用いられ得る。

0099

本発明はまた、移動固体支持体を用いてATP活性を検出または定量する方法を提供する;好ましくは、ATPは、核酸配列決定反応の一部として検出または定量され得る。

0100

核酸または試薬酵素のいずれかが付着した移動固体支持体で「じゅうたんをひかれた(carpeted)」FORAを図7に示す。

0101

固体支持体は、従来の光学的バンドルまたは光ファイバーバンドルと合わせたCCDシステムを備える画像化システム230に必要に応じて連結される。1つの実施形態において、灌流チャンバー基板としては、水性インターフェース付近で発生した光が、直接光ファイバーを通って基板またはチャンバーに伝達されるような光ファイバーアレイウェファーが挙げられる。CCDシステムが、光ファイバーコネクターを備える場合、画像化は、灌流チャンバー基板を、コネクターと直接接触して配置することによって達成され得る。あるいは、従来の光学が、例えば、I−I拡大複数孔レンズシステム(magnification high numerical aperture lens system)を用いることによって、光ファイバー基板の外側からの直接CCDセンサーへの光を画像化するために用いられ得る。この基板が光ファイバーとの組み合わせを提供しない場合、レンズシステムはまた、上記のように使用され得、この場合、基板または灌流チャンバーカバーのいずれかは、光学的に透明である。例示的なCCD画像化システムは、上記の通りである。

0102

画像化システム230は、基板表面上のリアクタからの光を収集するために使用される。光は、例えば、当該分野において公知の高感度、低ノイズの装置を用いてCCD上で画像化され得る。光ファイバーに基づく画像化のためには、光ファイバーを直接カバースリップに組み込むことが好ましく、また、マイクロウェルを形成する光ファイバーを有するFORAのためには、検出器に光を伝達する光ファイバーもまた好ましい。

0103

画像化システムは、コンピュータ制御およびデータ収集システム240に連結される。一般的に、任意の一般的に入手可能なハードウェアおよびソフトウェアパッケージが用いられ得る。コンピュータ制御およびデータ収集システムはまた、試薬の送達を制御するためのコンジット200に連結されている。

0104

ピロリン酸配列反応により発生した光子は、それらが収束デバイス(例えば、光学的レンズまたは光ファイバー)を通過し、そしてCCD素子に収束される場合のみ、CCDによって捕捉される。しかし、出力された光子は、全ての方向に均等に飛び出す。二次元アレイ(例えば、DNAチップ)を利用した場合の、これらの続く「捕捉」をおよび量を最大限にするために、光子が発生する点に可能な限り近くで(例えば、二次元の固体支持体に直接)それを収集することが好ましい。これは、(i)カバースリップと従来の光学レンズもしくは光ファイバーバンドルとの間に光学的浸漬オイルを利用すること、または、好ましくは、(ii)光ファイバーを直接カバースリップ自体に組み込むこと、のいずれかにより達成される。同様に、薄く、光学的に透明な二次元の表面が用いられる場合、光ファイバーバンドルはまた、その背面表面に対して配置され、反応/灌流チャンバー全体の深さを通して「画像化」する必要性を除外する。

0105

(検出手段)
この反応事象(例えば、ルシフェラーゼにより発生された光子)は、種々の検出装置(例えば、光電子増倍管、CCD、CMOS、吸収光計(absorbance photometer)、ルミノメーター、電荷注入デバイス(charge injection device)(CID)、または他の固体状態検出器および本明細書中に記載される装置)を用いて検出および定量され得る。好ましい実施形態において、出力された光子の定量は、融合された光ファイバーバンドルに適合したCCDカメラの使用によって達成される。別の好ましい実施形態において、出力された光子の定量は、マイクロチャネルプレート増強装置に適合したCCDカメラの使用によって達成される。背部を薄くした(back−thinned)CCDが、感度を増加させるために用いられ得る。CCD検出器は、例えば、Bronksら、1995.Anal.Chem.65:2750−2757に記載される。

0106

例示的なCCDシステムは、Lockheed−Martin LM485CCDチップおよび6〜8μmの個々の光ファイバーの直径を有する1−1光ファイバーコネクター(バンドル)を有するSpectral Instruments,Inc.(Tucson,AZ)Series 600 4ポートカメラである。このシステムは、4096×4096(すなわち1600万ピクセルより多い)を有し、10%〜40%を超える範囲までの量子効率を有する。従って、波長に依存して、CCDセンサ上に画像化される光子の40%程度の多さのものが、検出可能な電子に変換される。

0107

他の実施形態において、蛍光部分が、標識として用いられ得、そして反応事象の検出は、アレイの表面を走査する共焦走査顕微鏡を用いて実施され得るか、またはより小さい光学分割が可能であり、それにより「より稠密な」アレイの使用を可能とする近視野光顕微鏡(near−field optical microscopy)(SNOM)が利用可能である。例えば、SNOMを用いて、個々のポリヌクレオチドが、100nm未満(例えば、10nm×10nm)の距離、離れた場合に、区別され得る。さらに、走査性トンネル顕微鏡(Binningら、Helvetica Physica Acta、55:726−735、1982)および原子力顕微鏡(Hanswaら、Annu Rev BioPhys Biomol Struct、23:115−139、1994)が使用され得る。

0108

本発明は、反応チャンバーのアレイを、反応が特定の部位で起こっていることを示す光について、同時にモニターするための装置を提供する。これらの装置は、複数の空洞化された表面を有する平面基板から形成される反応チャンバーのアレイを備え得、各々の空洞化された表面は、分析物を含むように適合された反応チャンバーを形成する。これらの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し得、そしてこのアレイは、400,000より多い個々のチャンバーを有し得る。これらの装置はまた、使用の際に特定の反応チャンバーからの光が、この光学的に高感度なデバイスの特定の予め決定された領域に衝突するように構成された光学的に高感度なデバイスを備え得る。これらの装置は、各々の予め決定された領域上で衝突した光のレベルを決定するための手段およびこの反応チャンバーの各々について、経時的に、種々の光を記録するための手段をさらに備え得る。

0109

本発明はまた、光ファイバーのバンドルの一端に複数の空洞化した表面を有する、第一のバンドルの光ファイバーから形成されるアレイを備え得る分析センサを提供し、各々の空洞化表面は、分析物を含有するように適合された反応チャンバーを形成する。反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し得、そしてこのアレイは、400,000より多い個々のチャンバーを有し得る。この分析センサはまた、反応チャンバー内で光を発生させるための酵素的手段または蛍光手段を有し得る。この分析センサは、光捕捉手段を備える光検出手段およびこの光検出手段に光を伝達するための第二の光ファイバーバンドルをさらに備え得る。この第二の光ファイバーバンドルは、個々の反応チャンバーで発生した光が光捕捉手段への光の伝達のために第二の光ファイバーバンドルの別々のファイバーまたは別々の光ファイバーの群により捕捉されるように、このアレイと光学的に接触され得る。光捕捉手段は、本明細書中で記載されるCCDカメラであり得る。反応チャンバーは、その上に生物活性薬剤と有する1つ以上の移動式固体支持体を備え得る。いくつかの実施形態において、分析センサは、生化学的アッセイにおける使用に適するか、または細胞ベースのアッセイにおける使用に適する。

0110

(核酸の配列決定法)
本発明はまた、核酸の配列決定をするための方法を提供し、この方法は、一般的に、以下:(a)複数の反応チャンバーまたは空洞内に配置された、1つ以上の核酸アンカープライマーおよび複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程;(b)少なくとも1つの一本鎖環状テンプレートに有効量の核酸アンカープライマーをアニーリングして、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を産生する工程;(c)プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体と、ポリメラーゼを組み合わせて、環状核酸テンプレートに相補的な複数コピーの核酸を共有結合された伸長アンカープライマーを形成する工程;(d)1コピー以上の共有結合された相補的核酸に有効量の配列決定プライマーをアニーリングする工程;(e)ポリメラーゼおよび予め決定されたヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長し、配列決定産物、および予め決定されたヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物、を生成する工程;および(f)配列決定反応副産物を同定する工程であって、これにより核酸の配列を決定する工程、を包含する。1つの実施形態において、配列決定副産物は、PPiである。別の実施形態において、dATPアナログまたはddATPアナログがデオキシアデノシン三リン酸またはジデオキシアデノシン三リン酸の代わりに用いられ得る。このアナログは、ポリメラーゼの基質としての役割を果たし得るが、PPi検出酵素の基質としての役割を果たし得ない。この方法は、水性環境における、別々の並行する一般的な反応において実施され得る。

0111

別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を含み、この方法は、一般的に、以下:(a)平面表面上の複数の空洞内に配置された複数のサンプルDNAを提供する工程;(b)各々の反応チャンバー中の反応混合物に、既知の窒素を含む既知の塩基の活性化ヌクレオチド5’三リン酸前駆体を添加する工程であって、各々の反応混合物は、テンプレートに指向されるヌクレオチドポリメラーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含み、このテンプレートは、プライマー鎖の3’末端への活性化ヌクレオチド5’三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、このテンプレートより少なくとも1ヌクレオチド残基短い相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズされて、各々のテンプレートにおいてプライマー鎖の3’末端で少なくとも1つの対形成しないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の窒素を含む塩基が、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の窒素を含む塩基である、工程;(c)ヌクレオシド5’三リン酸前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かを決定する工程であって、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の組み込みは、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基が、組み込まれたヌクレオシド5’三リン酸前駆体の塩基に相補的な、窒素を含む塩基の組成を有すること示す、工程;ならびに(d)工程(b)および(c)を連続的に繰り返す工程であって、ここで各々の連続的な反復は、既知の窒素を含む塩基組成の活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の1つの型を付加し、そしてその組み込みを検出する工程;ならびに(e)ヌクレオシド前駆体の組み込みの配列から、各々の反応チャンバーにおけるテンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程、を包含する。

0112

本発明の1つの実施形態において、アンカープライマーは、粒子に連結している。このアンカープライマーは、伸長アンカープライマーの形成の前または後に、粒子に連結され得る。配列決定副産物は、PPiであり得、そしてスルフリラーゼ/ルシフェラーゼ反応の組み合わせは、検出のための光を発生させるために用いられる。スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのいずれかまたはそれらの両方が、各々の反応部位に配置された1つ以上の移動性固体支持体上に固定化され得る。

0113

別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法に関連する。この方法は、複数のサンプルDNAを提供する工程を包含し、これらの各々のサンプルDNAは、平面表面上の複数の空洞内に配置され、これらの空洞の各々は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有する。次いで、既知の窒素を含む塩基の活性化ヌクレオチド5’三リン酸前駆体が、各々の反応チャンバーに反応混合物に添加される。各々の反応混合物は、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼおよびテンプレートより少なくとも1ヌクレオチド残基一本鎖ポリヌクレオチド残基を含み、このテンプレートは、プライマー鎖の3’末端への活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、このテンプレートより少なくとも1ヌクレオチド残基短い相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズされて、各々のテンプレートにおいてプライマー鎖の3’末端で少なくとも1つの対形成しないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の窒素を含む塩基が、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の窒素を含む塩基である。次いで、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かが決定され、ここで、ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の組み込みは、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基が、組み込まれたヌクレオシド5’三リン酸前駆体の塩基に相補的な、窒素を含む塩基の組成を有すること示す。次いで、これらの工程が連続的に繰り返され、ここで各々の連続的な反復は、既知の窒素を含む塩基組成の活性化ヌクレオシド5’三リン酸前駆体の1つの型を付加し、そしてその組み込みを検出する。次いで、各々の反応チャンバーにおけるテンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の塩基配列が、ヌクレオシド前駆体の組み込みの配列から、決定される。

0114

別の局面において、本発明は、テンプレート核酸重合体中の核酸配列を決定するための方法に関連する。この方法は、1つの平面表面上の複数の空洞に複数のテンプレート核酸重合体を導入する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこれらの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有する。各々の反応チャンバーはまた、核酸重合体が、ヌクレオチドが添加されたときに相補的核酸重合体の合成のためのテンプレート重合体としての役割を果たす重合環境を有する。一連の供給原料が、重合環境に連続的に提供され、各々の供給原料は、相補的核酸重合体が形成されるヌクレオチドの中から選択されるヌクレオチドを有し、その結果、供給原料中のヌクレオチドが配列決定されるテンプレート重合体中の次のヌクレオチドに相補的である場合、そのヌクレオチドが、相補的重合体中に組み込まれ、そして無機ピロリン酸が放出される。次いで、無機ピロリン酸の形成が、相補的重合体中の各々のヌクレオチド(従ってテンプレート重合体の配列)の正体を決定するために検出される。

0115

別の局面において、本発明は、サンプルDNAのDNA配列における標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、1つの平面表面上の複数の空洞内に配置されたDNAのサンプルを提供する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し、DNAは、反応チャンバー中に配置される前または後のいずれかに一本鎖にされる。次いで、標的位置に直ぐに隣接する位置で固定化一本鎖DNAにハイブリダイズされる、伸長プライマーが、提供される。固定化された一本鎖DNAは、予め決定されたヌクレオチド三リン酸の存在下でポリメラーゼ反応に供され、ここでこの予め決定されたヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの3’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物が形成される。次いで、この配列決定反応副産物が、同定され、これにより、標的位置の塩基に相補的なヌクレオチドを決定する。

0116

別の局面において、本発明は、サンプルDNA配列中の標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、1つの平面表面上の複数の空洞内に配置されたサンプルDNAを提供する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し、DNAは、反応チャンバー中に配置される前または後のいずれかに一本鎖にされ、そして標的位置に直ぐに隣接してサンプルDNAにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する。次いで、サンプルDNA配列および伸長プライマーは、ヌクレオチド三リン酸の存在下で、ポリメラーゼ反応に供され、これにより、ヌクレオチド三リン酸は、標的位置における塩基に相補的である場合にのみ、組み込まれ、そしてピロリン酸(PPi)を放出し、このヌクレオチド三リン酸は、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または同じサンプル−プライマー混合物に連続的にかのいずれかで添加される。次いで、ヌクレオチドが組み込まれたことを示すPPiの放出が、検出される。

0117

別の局面において、本発明は、一本鎖サンプルDNA配列中の標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、標的位置に直ぐに隣接してサンプルDNAにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程を包含し、このサンプルDNAは、1つの平面表面上の複数の空洞内に配置され、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここで、反応チャンバーは、5〜200μmの間の中心間距離を有し、DNAは、反応チャンバーに配置される前または後のいずれかに一本鎖にされる。このサンプルDNAおよび伸長プライマーは、予め決定されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供され、これによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、標的位置における塩基に相補的である場合にのみ組み込まれ、そしてピロリン酸(PPi)を放出し、予め決定されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または同じサンプル−プライマー混合物に連続的にかのいずれかに添加される。PPiの任意の放出は、酵素的に検出されて、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが組み込まれているかを示す。これは、PPi検出酵素は、ポリメラーゼ反応工程に含まれ、そしてデオキシアデノシン三リン酸(ATP)またはジデオキシアデノシン三リン酸(ATP)の代わりに、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、PPi検出酵素の基質としての役割を果たさないdATPアナログまたはddATPアナログが用いられるという点で特徴付けられる。

0118

別の局面において、本発明は、核酸の配列決定をするための方法に関連する。この方法は、1つ以上の核酸アンカープライマー;および上記のアレイ上の複数の空洞内に配置された複数の核酸テンプレートを提供する工程を包含する。有効量の核酸アンカープライマーが、少なくとも1つの一本鎖環状テンプレートにアニーリングされて、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を産生する。次いで、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体は、ポリメラーゼと合わされて、環状核酸テンプレートに相補的な複数コピーの核酸に共有結合した伸長したアンカープライマーを形成する;次いで、1コピー数以上の共有結合された相補的核酸に有効量の配列決定プライマーをアニーリングさせる。次いで、この配列決定プライマーは、プライマーおよび予め決定されたヌクレオチド三リン酸を用いて伸長されて、配列決定産物および、予め決定された三リン酸が、配列決定プライマーの3’末端上に組みこまれる場合、配列決定副産物を産生する。次いで、配列決定反応副産物が、同定され、これにより核酸の配列を決定する。

0119

(アンカープライマーの構造)
本発明のアンカープライマーは、一般的に、軸領域および少なくとも1つのアダプター領域を含む。好ましい実施形態において、このアンカープライマーは、少なくとも2つの連続するアダプター領域を含む。軸領域は、アンカープライマーの5’末端に存在し、そして固体基材にアンカープライマーを付着させるためのヌクレオチドの領域を含む。

0120

アダプター領域は、複数の核酸配列の1つ以上のメンバー中に存在する相補的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、2つの隣接するアダプター領域を含み、これらの領域は、標的核酸配列の別々の末端に連結される相補的領域にハイブリダイズする。この実施形態は、図1に例示され、これは、以下でより詳細に議論される。さらなる実施形態において、アンカープライマー中のアダプター領域は、第二の核酸配列中に存在する配列の非連続的領域に相補的である。例えば、各々のアダプター領域は、1つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により産生されるフラグメントの各々の末端に相同であり得る。このフラグメントは、例えば、配列多型を含むことが既知または予想される配列を含み得る。さらに、アンカープライマーは、標的核酸配列のギャップの開いた(gapped)領域(すなわち、1つ以上のヌクレオチドの欠失に起因して非連続的である領域)に相同である2つのアダプター領域を含み得る。これらの配列を有するアダプター領域が用いられる場合、ギャップの開いた配列に対応する整列するオリゴヌクレオチドが、テンプレート核酸分子集団に沿ってアンカープライマーにアニーリングされ得る。

0121

アンカープライマーは、必要に応じて、更なるエレメント(例えば、1つ以上の制限酵素認識部位RNAポリメラーゼ結合部位(例えば、T7プロモーター部位)、同定されたDNA配列中に存在する配列(例えば、既知の遺伝子中に存在する配列))を含み得る。アダプター領域はまた、配列多型に隣接することが知られている配列を含み得る。配列多型は、ヌクレオチドの置換、挿入、欠損、または2つの別の同一の核酸配列の間の配列の差異を生じる他の再構成を含む。配列多型の例は、単一ヌクレオチド多型(SNP)である。

0122

一般的に、塩基対形成し得る任意の核酸は、アンカープライマーとして用いられ得る。いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、オリゴヌクレオチドである。本明細書中に使用される場合、用語オリゴヌクレオチドは、モノマー対モノマーの相互作用の通常のパターンにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然または改変されたモノマーまたは連結(例えば、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド、それらのアノマー形態、ペプチド核酸(PNA)など)の直鎖状オリゴマーを含む。これらの型の相互作用としては、例えば、Watson−Crick型の塩基対形成、塩基スタッキング、Hoogsteenまたは逆Hoogsteen型の塩基対形成などが挙げられ得る。一般的に、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結して、例えば、3〜200、8〜150、10〜100、20〜80、または25〜50のモノマー単位の大きさの範囲をとるオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが文字列により表現される場合はいつも、そのヌクレオチドは、左から右へ5’→3’方向に方向付けられており、そして本明細書中で他に示されない限り、文字「A」が、デオキシアデノシンを示し、文字「T」が、チミジンを示し、文字「C」が、デオキシシトシンを示し、そして文字「G」が、デオキシグアノシンを示すことが理解される。本発明のオリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドアナログを含み得る。しかし、例えば、酵素によるプロセシングが必要とされる場合などは、天然に存在するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが、一般的に生物学的機能の保持に必要とされる。

0123

(固体基材へのプライマーの連結)
アンカープライマーは、増感部位で固体基材に連結される。連結されたプライマーを含む固体基材の領域は、本明細書中で、アンカーパッドと呼ばれる。従って、固体支持体上での増感状態を特定することによって、アンカーパッドのアレイまたはマトリクスを形成することが可能である。これらのアンカーパッドは、例えば、固体支持体上に等間隔でエッチングされた小さい直径のスポットであり得る。アンカーパッドは、この基材が空洞作成されているか、エッチングされているか、または上で議論されるような他のミクロ機械加工されている場合、空洞またはウェルの底部に配置され得る。

0124

1つの実施形態において、アンカープライマーは、粒子に連結される。アンカープライマーは、伸長したアンカープライマーの形成の前または伸長アンカープライマーの形成の後にその粒子に連結され得る。

0125

このアンカープライマーは、共有結合相互作用または非共有結合相互作用を介して固体支持体に付着され得る。一般的に、当該分野において認識されている任意の連結が、使用され得る。当該分野において一般的なそのような連結の例としては、任意の適切な金属(例えば、Co2+、Ni2+)−ヘキサヒスチジン複合体、ビオチン結合タンパク質(例えば、NEUTAVIDINTM改変アビジン(Pierce Chemicals、Rockford、IL))、ストレプトアビジン/ビオチン、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)/グルタチオン、モノクローナル抗体抗原、およびマルトース結合タンパク質マルトース、およびプルロニック(pluronic)カップリング技術が挙げられる。適切なタグを含むサンプルが、増感された基板と共にインキュベートされて、その結果、0、1つ、または複数の分子が、各々の増感部位に付着する。

0126

あるビオチン−(ストレプト−)アビジン−ベースアンカー方法は、固体表面上で乾燥された光活性ビオチン可能なアナログの薄層を使用する(HengsakulおよびCass,1996.Bioconjugate Chem.7:249〜254)。次いで、ビオチンアナログは、活性化ビオチンの規定された領域を作成するように、マスクを介して白色光曝露される。次いで、アビジン(またはストレプトアビジン)が、添加され、そして活性化ビオチンに結合される。アビジンは、遊離ビオチン結合部位を保有し、これは、ビオチン−(ストレプト−)アビジン結合を介してビオチン化オリゴヌクレオチドを「アンカー」するために利用され得る。

0127

あるいは、アンカープライマーは、光除去可能な保護基を有するビオチン誘導体を用いて固体支持体に付着され得る。この部分は、固体支持体(例えば、ガラス表面)に付着されるウシ血清アルブミンBSA)に共有結合される。PirrungおよびHuang,1996.Bioconjugate Chem.7:317〜321を参照のこと。ついで、マスクが、規定された照射領域内で活性化ビオチンを作製するために使用される。次いで、アビジンが、BSA−ビオチン−アビジン−ビオチン結合を介して実質的に付着されたビオチン化DNAと共に照射範囲に配置され得る。所望される場合、シランの中間層は、規定された領域におけるBSA結合を位置づけるためにパターン化され得るシリコンジオキシドシラン表面上の自己アセンブリした単層に沈着される。例えば、Mooneyら、1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:12287〜12291を参照のこと。

0128

プルロニック(pluronic)ベースの付着において、アンカープライマーは、プルロニック化合物としても公知であるまずポリエチレンオキシドポリプロピレンオキシドポリエチレンオキシオトリブロックコポリマーの末端に付着される。プルロニック部分は、アンカープライマーを固体基材に付着するために使用され得る。プルロニックは、疎水性表面とポリプロピレンオキシドとの間の反応によって疎水性表面に付着する。残りのポリエチレンオキシド基は、表面から伸長し、これによって疎水性の環境を作る。ニトリロトリ酢酸(NTA)は、ポリエチレンオキシド鎖の末端に結合体化して、ヘキサヒスチジンタグ化アンカープライマーの付着を可能にし得る。別の実施形態において、ピリジルジスルフィド(PDS)は、ポリエチレン鎖の末端に結合体化して、ジスルフィド結合を介したチオール化アンカープライマーの付着を可能にし得る。1つの好ましい実施形態において、プルロニックF108(BASFCorp.)が、付着のために使用される。

0129

固体支持体上の各感光性部位は、潜在的に複数のアンカープライマーを付着し得る。従って、各アンカーパッドは、1つ以上のアンカープライマーを含み得る。単一の生産性反応中心のみを有するパッドの数(例えば、アンカープライマーから伸長された単一配列のみを有する、伸長反応後のパッドの数)を最大化することが好ましい。これは、以下を含むがそれらに限定されない技術によって達成され得る:(i)表面上で洗浄されるビオチン化アンカープライマーの希釈を変化させること;(ii)ビオチン化プライマーがアビジン表面と接触するインキュベーション時間を変化させること;(iii)平均で、各パッド上の1つのプライマーのみが伸長して配列決定テンプレートを作成するような、開環または閉環テンプレートの濃度を変化させること;あるいは(iv)単一分子の直径(<1μm)に接近するためにアンカーパッドのサイズを減少させ、その結果、1つのアンカーの結合が、別のアンカーの結合を阻害するか、または遮断すること(例えば、小さいスポットでの光活性化によって);あるいは(v)アンカーパッドのサイズを減少させて、その結果、1つの環状テンプレートの結合が、第2の環状テンプレートの結合を阻害または遮断すること。

0130

いくつかの実施形態において、それぞれ個々のパッドは、1個の連結したアンカープライマーのみを含む。1つのアンカープライマーのみを有するパッドは、固体支持体上で、選択されたアンカープライマーの限界希釈を実行することによって作成され得、その結果、平均で、1つのアンカープライマーのみが、各パッド上に沈着される。パッドに適用されるアンカープライマーの濃度は、例えば、ポアソン分布モデルを用いて計算され得る。

0131

単一のアンカープライマーを含む反応パッドの数を最大化するために、1連の希釈実験が実行され、ここで、アンカープライマー濃度または環状テンプレート濃度の範囲が変更される。高度に希釈されたプライマーの濃度について、同じパッドに結合しているプライマーおよび環状テンプレートは、互いに独立しており、そしてポアソン分布は、任意の1つのパッド上て伸長したアンカープライマーの数を特徴づける。実際に伸長されるプライマーの数は変化し得るが、最大37%のパッドが、単一の伸長したアンカープライマーを有する(単一のアンカーオリゴヌクレオチドを有するパッドの数)。この数は、以下のように得られ得る。

0132

Npを、パッド上のアンカープライマーの平均数とし、そしてfを、アンカープライマーが環状テンプレートで伸長される確率とする。次いで、1パッドあたりの伸長アンカープライマーの平均数は、Npfであり、これらは、量aとして規定される。実際に伸長されるプライマーの数は変化可能である。低濃度限界において、同じパッドに結合しているプライマーおよび環状テンプレートは、互いに独立しており、そしてポアソン分布P(n)は、任意のパッド上で伸長したアンカープライマーの数nを特徴づける。この分布は、以下によって数学的に規定され得る:P(n)=(an/n!)exp(−a)、P(1)=a exp(−a)。確率P(1)は、a=1についてのその最大値exp(−1)のをパッドの37%が、仮定し、単一の伸長されたアンカープライマーを有する。

0133

アンカープライマー濃度および環状テンプレート濃度の範囲は、1に最も近いNpfの値を見出すために引き続いてスキャンされ得る。この分布を最適化する好ましい方法は、各反応パッド上の複数のアンカープライマーを可能にするが、環状テンプレートの限界希釈を使用し、その結果、平均で、各パッド上の1つのプライマーのみが伸長して配列決定テンプレートを生成する。

0134

あるいは、低濃度のアンカープライマーで、最大で1つのアンカープライマーは、各反応パッドにおそらく結合する。高濃度の環状テンプレートが使用され得、その結果、各プライマーがおそらく伸長される。

0135

反応パッドが平らな表面または光ファイバーアレイ上に整列される場合、個々のパッドは、1面が約10μmであり、隣接するパッド間で100μmの間隔を有する。故に、1cm2の表面上に、合計約10,000個のマイクロリアクターが沈着され得、そしてポアソン分布に従って、これらのうち約3700は、単一のアンカープライマーを含む。特定の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドが、固体支持体に付着された後、改変(例えば、ビオチン化)酵素が沈着されて、この表面上の残りの使用されていないアビジン結合部位に結合する。

0136

他の実施形態において、複数のアンカープライマーが、アレイ中の任意の1つの個々のパッドに付着される。複数の環状核酸テンプレート(以下により詳細に記載される)の限界希釈は、このように固定化されたアンカープライマーにハイブリダイズされ得、その結果、平均で、各パッド上の1つのプライマーのみが核酸テンプレートにハイブリダイズされる。使用されるライブラリー濃度は、例えば、限界希釈およびPoisson分布モデルを利用して計算され得る。

0137

(核酸テンプレート)
本発明に従って配列決定され得る核酸テンプレート(例えば、核酸ライブラリー)は、一般に開環核酸分子または閉環核酸分子を含み得る。「閉環」は、共有結合的に閉じられた環状核酸分子(例えば、環状DNA分子または環状RNA分子)である。「開環」は、5’リン酸基および3’ヒドロキシル基を有する線状一本鎖核酸分子である。1つの実施形態において、一本鎖核酸は、少なくとも100コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端と末端で共有結合している。いくつかの実施形態において、開環は、線状の2本鎖核酸分子からインサイチュで形成される。所定の開環核酸分子の末端は、DNAリガーゼによって連結され得る。開環分子の5’末端および3’末端での配列は、第2の核酸分子中の隣接するヌクレオチドの2つの領域(例えば、アンカープライマーのアダプター領域、または第2のDNA分子に密接に隣接している2つの領域)に相補的である。従って、開環分子の末端は、DNAリガーゼを用いて連結され得るか、またはギャップ充填反応においてDNAポリメラーゼによって伸長され得る。開環は、Lizardi,米国特許第5,854,033号に詳細に記載される。開環は、DNAリガーゼ(DNA用)またはRNAリガーゼの存在下で、例えば、アンカープライマーへの開環のアニーリング後に閉環に転換され得る。

0138

所望の場合、核酸テンプレートは、南京錠(padlock)プローブとして提供され得る。南京錠プローブは、線状オリゴヌクレオチドであり、各末端に配置される標的−相補的配列を含み、そしてこれらはリンカー配列によって分離されている。このリンカーは、核酸配列のライブラリーのメンバーの末端に連結され得、この核酸配列は、例えば、物理学的に剪断されるか、制限エンドヌクレアーゼで消化されている。標的配列へのハイブリダイゼーションの際、これらの線状オリゴヌクレオチドの5’末端領域および3’末端領域は、近位に運ばれる。この近位は、2つのプローブセグメントが(適切にハイブリダイズする場合)酵素的ライゲーション(例えば、T4DNAリガーゼを用いる)によって共有結合されることを可能にし、従って、プローブを、特異的標的配列に連結させた閉環分子に転換する(例えば、Nilssonら、1994,Science 265:2085〜2088を参照のこと)。得られたプローブは、遺伝子配列改変体に対するその特異性および選択性(例えば、Lizardiら、1998.Nat.Genet.19:225〜232;Nilssonら、1997,Nat.Genet.16:252〜255を参照のこと)、ならびに得られた反応産物が、特定の標的配列に局在したままであるという事実の両方に起因して、多くの遺伝子配列の同時分析に適切である。さらに、多くの異なるプローブの分子内連結は、多重PCRベースの方法論よりも非特異的交差反応性に対する感受性が低いと予測され、ここでプライマーの非同族対は、不適切増幅産物を生じ得る(例えば、LandegrenおよびNilsson,1997.Ann.Med.299:585〜590を参照のこと)。

0139

出発ライブラリーは、一本鎖核酸分子、または二本鎖核酸分子のいずれかを含むように構築され得、但し、この核酸配列は、ライブラリー中に存在する場合、アニーリングのために利用可能な領域を含むか、またはアンカープライマー配列へのアニーリングのために利用可能にされ得る。例えば、ローリングサークル増幅のためのテンプレートとして使用する場合、二本鎖テンプレートの領域は、アンカープライマーの伸長のためのテンプレートとして作用するために、少なくとも過渡的に一本鎖である必要がある。

0140

ライブラリーのテンプレートは、複数のエレメントを含み得、このエレメントとしては、アンカープライマーに相補的な1つ以上の領域が挙げられるが、これに限定されない。例えば、テンプレートライブラリーは、配列決定プライマーに相補的な領域、コントロールヌクレオチド領域、および引き続いて特徴づけられる配列決定テンプレートから構成される挿入配列を含み得る。以下により詳細に説明されるように、コントロールヌクレオチド領域は、副産物の量と組み込まれたヌクレオチドの数との間の関連を較正するために使用される。本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズして、一致した二重鎖を形成し得るヌクレオチド配列をいう。

0141

1つの実施形態において、ライブラリーのテンプレートとしては、以下が挙げられる:(i)アンカープライマーに相補的な2つの別個の領域、(ii)配列決定プライマーに相同な1つの領域、(iii)1つの任意のコントロールヌクレオチド領域、(iv)配列決定される、例えば、30〜500、50〜200、または60〜100ヌクレオチドの挿入配列。当然、このテンプレートは、2つ、3つ、または4つ全てのこれらの特徴を備え得る。

0142

テンプレート核酸は、核酸の任意の供給源(例えば、任意の細胞、組織、または生物)から構築され得、そして当該分野で認識されている任意の方法によって生成され得る。適切な方法としては、例えば、ゲノムDNAの超音波処理、および核酸分子の最初の集団から所望の範囲の長さのフラグメントを生成するための1種以上の制限エンドヌクレアーゼ(RE)での消化が挙げられる。好ましくは、1種以上の制限酵素は、別個の4塩基の認識配列を有する。このような酵素の例としては、例えば、Sau3A1、Msp1、およびTaq1が挙げられる。好ましくは、この酵素は、対応する制限酵素についての認識配列を含む領域を有するアンカープライマーとの結合体化において使用される。いくつかの実施形態において、アンカープライマーの1つのアダプター領域または両方のアダプター領域は、既知の制限酵素認識配列に隣接しているさらなる配列を含み、これによって、アンカープライマーへの目的の特定の制限フラグメントのアンカープライマーへの捕捉またはアニーリングを可能にする。他の実施形態において、制限酵素が、IIS型制限酵素と共に使用される。

0143

あるいは、テンプレートライブラリーは、RNA(例えば、メッセンジャーRNAmRNA))から相補的DNA(cDNA)ライブラリーを生成することによって作製され得る。所望される場合、cDNAライブラリーは、特定のRNA、内部フラグメント、または単離されたRNAの3’末端を含むフラグメントの3’末端特徴を得るために、制限エンドヌクレアーゼを用いてさらに処理される。アンカープライマー中のアダプター領域は、テンプレートライブラリー中に存在すると考えられる目的の配列(例えば、エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるフラグメント内の既知または疑われる配列多型)に相補的であり得る。

0144

1つの実施形態において、索引オリゴヌクレオチドは、テンプレートライブラリーのメンバーに付着して、テンプレート核酸とこのテンプレート核酸が由来する核酸集団との実質的な相関を可能にし得る。例えば、出発DNA集団の1つ以上のサンプルは、任意の以前に開示された方法(例えば、制限消化、超音波処理)を用いて別々にフラグメント化され得る。各サンプルに特異的な指示オリゴヌクレオチド配列は、フラグメント化集団のメンバーの末端に付着、例えば、連結される。指示オリゴヌクレオチドは、環状化、増幅、および必要に応じて配列決定のための領域として作用し得、これは核酸を指示またはコード化するために使用され得るのを可能にし、これが由来する出発サンプルを同定する。

0145

複数の識別可能な指示プライマーを用いて作製される別個のテンプレートライブラリーは、実質的な反応のために一緒に混合され得る。ライブラリーのメンバーの配列決定は、指示オリゴヌクレオチドに対応する配列の同定を可能にする。この情報に基づいて、任意の所定のフラグメントの起源が、推測され得る。

0146

(プライマー−テンプレート核酸複合体のアニーリングおよび増幅)
核酸のライブラリーは、認識された技術を用いてアンカープライマー配列にアニーリングされる(例えば、Hatchら、1999,Genet.Anal.Biomol.Engineer.15:35〜40;Kool,米国特許第5,714,320号およびLizardi,米国特許第5,854,033号を参照のこと)。一般に、アンカープライマーをテンプレート核酸配列にアニーリングさせるための任意の手順は、アダプター領域、またはアンカープライマー配列中の領域とテンプレートライブラリーに特異的(すなわち、完全、またはほぼ完全)な相補性の形成を生じる限り、適切である。

0147

多数のインビトロでの核酸増幅技術を利用して、アンカープライマー配列を伸長し得る。増幅されたDNAのサイズは、好ましくは、アンカーパッドのサイズよりも小さく、そしてまたアンカーパッド間の距離よりも小さい。

0148

増幅は、代表的に、ポリメラーゼ(例えば、DNA指向型DNAポリメラーゼ、またはRNA指向型DNAポリメラーゼ、そして1つ、2つ、3つまたは4つの型のヌクレオチド三リン酸、そして必要に応じて補助的な結合タンパク質)の存在下で実行される。一般に、プライムされた3’−OH基を伸長し得る任意のポリメラーゼは、これが3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損する限り使用され得る。適切なポリメラーゼとしては、例えば、Bacillus stearothermophilus、Thermus acquaticus、Pyrococcus furiosis、Thermococcus litoralis、およびThermus thermophilus由来のDNAポリメラーゼ、バクテリオファージT4およびT7、ならびにE.coli DNAポリメラーゼIクレノウフラグメントが挙げられる。適切なRNA指向型DNAポリメラーゼとしては、例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス−I由来の逆転写酵素が挙げられる。

0149

多数のインビトロでの核酸増幅技術が、記載されている。これらの増幅方法論は、以下の方法に区別され得る:(i)熱循環ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、Saikiら、1995.Science 230:1350〜1354を参照のこと)、リガーゼ連鎖反応(例えば、Barany,1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88:189〜193;Barringerら、1990.Gene 89:117〜122を参照のこと)、および転写ベースの増幅(例えば、Kwohら、1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173〜1177を参照のこと)を必要とする方法、ならびに(ii)等温増幅系−自己維持、配列複製(例えば、Guatelliら、1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874〜1878を参照のこと);QBレプリカーゼ系(例えば、Lizardiら、1988.BioTechnology 6:1197〜1202を参照のこと);鎖置換増幅(Nucleic AcidsRes.1992 Apr 11;20(7):1691〜6);ならびにPNAS 1992 Jan 1;89(1):392〜6;およびNASBA J Virol Methods.1991 Dec;35(3):273〜86に記載される方法。

0150

等温増幅はまた、ローリングサークルベースの増幅(RCA)を含む。RCAは、例えば、Kool,米国特許第5,714,320号、およびLizardi,米国特許第5,854,033号;Hatchら、1999.Genet.Anal.Biomol.Engineer.15:35〜40で考察される。RCAの結果は、アンカープライマーの3’末端から伸長された単独のDNA鎖であり(従って、固体支持体マトリクスに連結され)、そしてプライマー配列にアニーリングされた複数コピーの環状テンプレートを含むコンカテマーを含む。代表的に、それぞれ、例えば、約30〜500、50〜200、または60〜100のヌクレオチドサイズ範囲のサイズを有する1,000〜10,000以上のコピー数の環状テンプレートが、RCAで得られ得る。

0151

アンカープライマーへの環状核酸分子のアニーリングに続くRCA増幅の産物は、図1A図式で示される。環状テンプレート核酸102は、アンカープライマー104にアニーリングされ、これはその5’末端で表面106に連結され、そして伸長のために利用可能な遊離3’OHを有する。環状テンプレート核酸102は、2つのアダプター領域108および110を含み、これらは、アンカープライマー104中の配列の領域に相補的である。配列決定プライマーに相同な挿入物112および領域114がまた、環状テンプレート核酸102に含まれ、これは、以下に記載される配列決定反応で使用される。

0152

アニーリングの際、アンカープライマー104上の遊離3’−OHは、テンプレート核酸102内の配列を用いて伸長され得る。アンカープライマー102は、複数回、テンプレートに沿って伸長され得、各々の反復は、アンカープライマーから伸長した配列に、環状テンプレート核酸に相補的な配列を添加する。4回の反復または4回のローリングサークル複製は、伸長されたアンカープライマー増幅産物114として図1Aに示される。アンカープライマーの伸長は、基材106に共有結合しているか、または別々の方法で物理学的に付着している増幅産物を生じる。

0153

環状テンプレートおよびアンカープライマーのさらなる実施形態は、図1B〜1D中に、より詳細に示される。図1Bは、ライゲーションの際にアンカープライマーの伸長のためのテンプレートとして働き得るアニーリングした開環線状基質へのアニーリングを例示する。配列5’−TCg TgT gAg gTC TCA gCA TCTTATgTA TAT TTA CTT CTATTCTCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A−3’(配列番号1)を有するテンプレート分子は、その5’末端にビオチンリンカーおよび配列5’−gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT−3’(配列番号2)を有するアンカープライマーにアニーリングする。テンプレートのアニーリングは、テンプレート分子の5’末端および3’末端を隣接させる。アンカープライマーの3’OHは、環状テンプレートを用いて伸長され得る。

0154

1ヌクレオチド多型の同定のための環状テンプレートおよびアンカープライマーの使用は、図1Cに示される。配列5’−gAC CTC ACA CgA Tgg CTg CAg CTT−3’(配列番号3)を有する一般的アンカープライマーが示される。このアンカープライマーは、配列5’−TTTATA TgT ATT CTA CgA CTC Tgg AgT gTg CTA CCg ACg TCg AAT CCg TTg ACT CTTATCTTCA−3’(配列番号4)を有するSNPプローブにアニーリングする。次に、このSNPプローブは、配列5’−CTA gCT CgT CgT ACATATAAA TgA AgA TAA gATCCTg−3’(配列番号5)を有する遺伝子のSNP含有領域のある領域にハイブリダイズする。SNPプローブ複合体への多型含有核酸配列のハイブリダイゼーションは、SNPプローブの引き続くライゲーションおよび環状化を可能にする。図1Cに示されるように、SNPプローブは、多型部位の領域に接触するように、その5’末端および3’末端がゲノム領域にアニーリングするように設計される。環状化SNPプローブは、本明細書中に記載される方法を用いて引き続いて伸長および配列決定され得る。多型を欠く核酸は、SNPプローブの5’末端および3’末端を隣接させるようにハイブリダイズしない。この場合、SNPプローブは、引き続く伸長のために必要な環状基質を形成するようにはライゲーションされ得ない。

0155

図1Dは、環状テンプレート分子に沿ったギャップオリゴヌクレオチドの使用を例示する。配列5’−gAC CTC ACA CgA gTA gCA Tgg CTg CAg CTT−3’(配列番号6)を有するアンカープライマーは、ビオチンリンカーを介して表面に付着される。配列5’−TCg TgT gAg gTC TCA gCA TCTTATgTA TAT TTA CTT CTATTCTCA gTT gCC TAA gCT gCA gCC A−3’(配列番号7)を有するテンプレート分子は、アンカープライマーにアニーリングして、二本鎖領域が隣接したアンカープライマー中の部分的一本鎖領域、またはギャップ領域を生じる。次いで、配列5’−TgC TAC−3’を有するギャップ分子は、アンカープライマーにアニーリングする。テンプレート分子へのギャップオリゴヌクレオチドの両方の末端のライゲーションは、ローリングサークル増幅のためのテンプレートとして作用し得る環状核酸分子の形成を生じる。

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