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課題

本発明は、液状安定性の向上した改変型コレステロールオキシダーゼ及び該改変型コレステロールオキシダーゼの製造法に関する。

解決手段

コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基置換欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、40分間または60℃、60分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。

概要

背景

従来から、コレステロールオキシダーゼ(EC 1.1.3.6)は、臨床的内分泌疾患や代謝異常診断指標となっている体液中のコレステロールの測定等に使用されている。

このようなコレステロールオキシダーゼはストレプトマイセス属(例えば、特許文献1参照。)、ブレビバクテリウム属(例えば、特許文献2参照。)、ロードコカス属(例えば、特許文献3参照。)等の細菌が生産することが知られている。近年の臨床検査発展及び液状試薬への移行により、より安定な、あるいはより信頼性の高いコレステロールオキシダーゼの開発が望まれている。それらを解決すべく、近年、野生型のコレステロールオキシダーゼを遺伝子工学的手法用い改変し、熱安定性を向上させた例(例えば、特許文献4参照。)が報告されている。
特許第2086609号
特開平4−218367号
特許第2510492号
特開平8−242860号

概要

本発明は、液状安定性の向上した改変型コレステロールオキシダーゼ及び該改変型コレステロールオキシダーゼの製造法に関する。コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基置換欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、40分間または60℃、60分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。

目的

臨床検査試薬として用いるコレステロールオキシダーゼは溶液状態における長期保存時の安定性に優れたものが望まれている。本発明はコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、変異を導入することにより得られた液状安定性の向上した改変型コレステロールオキシダーゼ及び該改変型コレステロールオキシダーゼの製造法に関する。

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基置換欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ

請求項2

加熱処理後残存活性率が、改変前に比べて50%以上増大している請求項1記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。

請求項3

液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後のコレステロールオキシダーゼ残存活性率が35%以上であるコレステロールオキシダーゼ。

請求項4

コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後の残存活性率が35%以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。

請求項5

請求項1〜4のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子

請求項6

コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる請求項1〜4記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。

請求項7

コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。

請求項8

加熱処理後の残存活性率が、改変前に比べて30%以上増大している請求項7記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。

請求項9

液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後のコレステロール残存活性率が45%以上であるコレステロールオキシダーゼ。

請求項10

コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後の残存活性率が45%以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。

請求項11

請求項7〜10のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子

請求項12

コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる請求項7〜10記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。

請求項13

配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる請求項6あるいは12記載のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。

請求項14

配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体たんぱく質の一次構造アミノ酸配列の109位のスレオニン残基、252位のスレオニン残基、404位のアラニン残基からなる群より選択される少なくとも1箇所もしくは2箇所以上が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。

請求項15

配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において252位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。

請求項16

配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、404位アラニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。

請求項17

配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、109位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。

請求項18

請求項5、6および請求項11,12に記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター

請求項19

請求項14〜17記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。

請求項20

請求項18および19に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞

請求項21

請求項20に記載の形質転換宿主細胞を培養することにより改変型コレステロールオキシダーゼを生成させ、該改変型コレステロールオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼの製造方法。

請求項22

請求項1〜4、請求項6〜10および請求項12のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを含有するコレステロール測定用試薬組成物

請求項23

請求項1〜4、請求項6〜10および請求項12のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロール測定方法

技術分野

0001

本発明は、液状安定性の向上した改変型コレステロールオキシダーゼ及び該改変型コレステロールオキシダーゼの製造法に関する。

背景技術

0002

従来から、コレステロールオキシダーゼ(EC 1.1.3.6)は、臨床的内分泌疾患や代謝異常診断指標となっている体液中のコレステロールの測定等に使用されている。

0003

このようなコレステロールオキシダーゼはストレプトマイセス属(例えば、特許文献1参照。)、ブレビバクテリウム属(例えば、特許文献2参照。)、ロードコカス属(例えば、特許文献3参照。)等の細菌が生産することが知られている。近年の臨床検査発展及び液状試薬への移行により、より安定な、あるいはより信頼性の高いコレステロールオキシダーゼの開発が望まれている。それらを解決すべく、近年、野生型のコレステロールオキシダーゼを遺伝子工学的手法用い改変し、熱安定性を向上させた例(例えば、特許文献4参照。)が報告されている。
特許第2086609号
特開平4−218367号
特許第2510492号
特開平8−242860号

発明が解決しようとする課題

0004

臨床検査試薬として用いるコレステロールオキシダーゼは溶液状態における長期保存時の安定性に優れたものが望まれている。本発明はコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質一次構造において、変異を導入することにより得られた液状安定性の向上した改変型コレステロールオキシダーゼ及び該改変型コレステロールオキシダーゼの製造法に関する。

課題を解決するための手段

0005

本発明者らは、既にストレプトマイセスsp.SA−COOが産生するコレステロールオキシダーゼの前駆体たんぱく質の一次構造において少なくとも1つのアミノ酸残基の改変を遺伝子工学的に生じさせることにより、親酵素に比べて熱安定性が優れた新規酵素造成し、該遺伝子を含む組換えベクターによる形質転換体大量生産させることに成功している(例えば、特許文献4参照。)。本発明者らはさらに、上記コレステロールオキシダーゼ前駆体タンパク質の一次構造をもとに、液状での安定性に優れたコレステロールオキシダーゼを得るべく鋭意研究を重ねた結果、上記コレステロールオキシダーゼ前駆体タンパク質の一次構造に変異を導入することにより液状での安定性がさらに向上した改変型コレステロールを造成することに成功した。

0006

すなわち本発明は以下のような構成からなるものである。
項1.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。
項2.
加熱処理後残存活性率が、改変前に比べて50%以上増大している、項1記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項3.
液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後のコレステロールオキシダーゼ残存活性率が35%以上であるコレステロールオキシダーゼ。
項4.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後の残存活性率が35%以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。
項5.
項1〜4のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
項6.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる、項1〜4記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項7.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。
項8.
加熱処理後の残存活性率が、改変前に比べて30%以上増大している、項7記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項9.
液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後のコレステロール残存活性率が45%以上であるコレステロールオキシダーゼ。
項10.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後の残存活性率が45%以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。
項11.
項7〜10のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
項12.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる、項7〜10記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項13.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる、項6あるいは12記載のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項14.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体たんぱく質の一次構造アミノ酸配列の109位のスレオニン残基、252位のスレオニン残基、404位のアラニン残基からなる群より選択される少なくとも1箇所もしくは2箇所以上が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項15.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において252位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項16.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、404位アラニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項17.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、109位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項18.
項5、6および、項11,12に記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
項19.
項14〜17記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
項20.
項18および19に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞
項21.
項20に記載の形質転換宿主細胞を培養することにより改変型コレステロールオキシダーゼを生成させ、該改変型コレステロールオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼの製造方法。
項22.
項1〜4、項6〜10および項12のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを含有するコレステロール測定用試薬組成物
項23.
項1〜4、項6〜10および項12のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロール測定方法

発明の効果

0007

本発明のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変型タンパク質は、親酵素に対し熱安定が向上している。さらに、遺伝子工学技術により、該改変型コレステロールオキシダーゼを高純度にかつ大量に供給することができる。従って、本発明のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変型タンパク質を臨床検査用試薬等に用いることにより、より安定性の高い試薬にする事が可能である。

発明を実施するための最良の形態

0008

本発明の改変の基になるコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質は、特に限定されるものではない。その起源としては、好ましく微生物であって、具体的な例としては、ストレプトマイセス属、ブレビバクテリウム属、ロードコッカス属、ノカルディア属シュウドモナス属などの細菌が例示される。最も好ましい一例としては、特開平8−242860に開示されている、ストレプトマイセスsp.SA−COOが産生するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質を遺伝子工学的手法を用いて改変させて得られた酵素の1つであるS103T+V145Eを挙げることができる。このコレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造は配列表の配列番号1に示すとおりである。

0009

ここで、「S103T」などの「ローマ字数字・ローマ字」の表記は、特に断りがなければ、配列番号1の当該配列番号に位置するアミノ酸(1文字記号)を置換することを意味する。(この事例ではS:セリンをT:スレオニンに置換)

0010

本発明の改変型コレステロールオキシダーゼは、例えば上記のようなコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質の一次構造において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された一次構造を有するもので、本発明の改変型コレステロールオキシダーゼは液状安定性が改変前と比べて向上していることを特徴とする。

0011

本発明における液状安定性は、中性緩衝液中に存在するコレステロールオキシダーゼを加熱処理した後の残存活性の割合で示される。具体的には、酵素濃度約0.8U/ml、20mMリン酸緩衝液(pH7.0)中で60℃、40分または60分加熱処理した後の残存活性率を測定する。

0012

本発明の具体的な実施態様としては、例えば、配列表の配列番号1に記載される一次構造の109位のスレオニン残基、252位のスレオニン残基、404位のアラニン残基、402位のメチオニン残基からなる群より選択される少なくとも1箇所もしくは2箇所以上が他のアミノ酸に置換された改変型コレステロールオキシダーゼである。

0013

更に具体的には配列表の配列番号1に記載される一次構造の、252位のスレオニンがアラニングリシンフェニルアラニントリプトファンチロシンへ、404番目のアラニン残基がバリンへ、109位のスレオニンがイソロイシンへ、402位のメチオニンロイシン、バリンへの置換のうち、少なくとも1つまたは2つ以上を含む、改変型コレステロールオキシダーゼである。

0014

また、N371、N390、M369、E536、N443の部位に関する単独、及びそれらの少なくとも一つを含む改変型コレステロールオキシダーゼの安定性が改変前と比べて向上するかもしれないであろうと類推することは容易に考えつく範囲である。

0015

また、本発明の改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子は、配列表の配列番号1に記載される一次構造の252位のスレオニン残基、404番目のアラニン残基、109位のスレオニン残基、402位のメチオニン残基のうちの少なくとも1つまたは2つ以上が他のアミノ酸に置換された、改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子である。

0016

更に具体的には配列表の配列番号1に記載される一次構造の252位のスレオニンがアラニン、グリシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンへ、404位のバリンがアラニンへ、109位のスレオニンがイソロイシンへ402位のメチオニンがロイシン、バリンへの置換のうち、少なくとも1つまたは2つ以上を含む、改変型コレステロールオキシダーゼコードする遺伝子が挙げられる。

0017

本発明の改変型コレステロールオキシダーゼを作製するために、コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法をも用いることができる。すなわち、コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子と変異原となる薬剤を接触させる方法、紫外線照射による方法、また遺伝子修復機構欠損しているために高頻度に遺伝子に変異が生じる大腸菌を用いる方法がある。また部位特異的変異を導入する方法として合成オリゴヌクレオチドを用いた方法PCR法や市販のキットを用いる方法が挙げられる。

0018

作製された改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子は、ベクターに連結した状態で複製可能な宿主微生物移入後、得られた形質転換体を培養し、その培養物から該変異型コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含むベクターを分離、精製し、該ベクターから改変型コレステロールオキシダーゼ遺伝子を採取することができる。

0019

すなわち供与微生物を例えば1から3日間攪拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることにより改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームやβ—グルカナ—ゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム(SDS)等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解フレンチプレス処理のような物理破砕方法と組み合わせてもよい。

0020

このようにして得られた溶菌物からDNAを分離・精製するには常法にしたがって、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除タンパク処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。

0021

ベクターには、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては例えばエシェリヒアコリー(Escherichia coli)を宿主微生物とする場合にはLambda−gt10、Lambda−gt11などが使用できる。また、プラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合にはpBR322、pUC19、pBluescriptなどが使用できる。

0022

宿主微生物は、組換えベクターが安定かつ自律増殖可能で外来性遺伝子形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーHB110、エシェリヒア・コリーJM109などを用いることができる。

0023

宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合にはカルシウム処理法によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用いることができる。

0024

上記のように得られた形質転換体である微生物は栄養培地で培養されることにより、改変型コレステロールオキシダーゼを安定に生産し得ることが可能である。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするDNAを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとコレステロールオキシダーゼを同時に発現する微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつコレステロールオキシダーゼを生成する微生物を選択すればよい。

0025

上記のようにして得られた改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列はScience 第214巻、第1205〜1210頁(1981年)に報告されているジデオキシ法により解読し、また該改変型コレステロールオキシダーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定できる。このようにして一度選択された改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素PCRにより改変型コレステロール遺伝子であるDNAを回収し他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。

0026

形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地栄養源としては微生物の培養に通常用いられるのもが広く利用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコースシュークロースラクトースマルトースフラクトース糖蜜ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン肉エキス酵母エキスカゼイン加水分解物大豆アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩硫酸塩、マグネシウムカルシウムカリウム、鉄、マンガン亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

0027

培養温度は菌が生育し、コレステロールオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るがエシェリヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、コレステロールオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は6〜48時間程度である。培値pHは菌が発育しコレステロールオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが特に好ましくはpH6.0〜9.0程度である。

0028

培養物中の改変型コレステロールオキシダーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法にしたがってコレステロールオキシダーゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、コレステロールオキシダーゼ含有溶液微生物菌体とを分離した後に利用される。コレステロールオキシダーゼが菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過、遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等のキレート剤及びまたは界面活性剤を用いてコレステロールオキシダーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。

0029

このようにして得られた改変型コレステロールオキシダーゼ含有液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮,更に硫酸アンモニウム硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは、メタノールエタノールアセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製された変異型コレステロールオキシダーゼを得ることができる。

0030

例えば、Sephadex G−25(ファルマシアバイオテク製)などによるゲル濾過、DEAEセファロースCL−6B(ファルマシアバイオテク製)、フェニルセファロースCL−6B(ファルマシアバイオテク製)カラムクロマトグラフィーにより、分離、精製することにより、精製酵素標品を得ることができる。

0031

本願明細書に開示されている本願発明のコレステロールオキシダーゼは、さらにまた、触媒としての本質が失なわれない範囲で、少なくとも1つのアミノ酸を付加、欠失、挿入される等の改変が行なわれたものであっても良い。

0032

また本願発明の一態様は、特許請求の範囲または本願明細書のいずれかに開示されている本願発明のコレステロールオキシダーゼを含有するコレステロール測定用試薬組成物である。本発明のコレステロール測定用試薬組成物は、エステル型コレステロール遊離型コレステロール、あるいはまた、高密度リポ蛋白中のコレステロール、低密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール及びカイロミクロン中のコレステロールなど、種々の態様のコレステロールの測定に利用できる。

0033

また本願発明の一態様は、特許請求の範囲または本願明細書のいずれかに開示されている本願発明のコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロール測定方法である。本発明のコレステロール測定方法は、エステル型コレステロールや遊離型コレステロール、あるいはまた、高密度リポ蛋白中のコレステロール、低密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール及びカイロミクロン中のコレステロールなど、種々の態様のコレステロールの測定に適用できる。

0034

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって何ら限定されるものではない。
コレステロールオキシダーゼの酵素活性は、コレステロールを基質とし、その消失量を500nmの吸光度の変化で測定することにより測定した。具体的方法を以下に示す。
5mg/mlコレステロール溶液(5%(V/V)Triton X−100、4%(W/V)コール酸ナトリウム塩を含む)、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、1.76%4−アミノアンチピリン(4−AA)水溶液、6.0%フェノール水溶液、ぺルオキシダーゼ(POD)15,000U/ml−0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を調製し、下記反応混液を調製した。
51.0ml 0.1M 0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
4.0ml コレステロール溶液
1.0ml 4AA水溶液
2.0ml フェノール水溶液
2.0ml POD溶液
上記反応混合液を3.0ml取り、37℃で約5分間予備加温した後、測定試料酵素液)を0.05mlを添加し、混和後、37℃に制御された分光光度計で500nmの吸光度を3〜4分間記録し、その初期直線部分から1分間当たりの吸光度変化を求めた(ΔODtest)。盲検は酵素液の代わりに20mM、リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.05ml加え上記同様に操作を行って1分間当り吸光度変化量を求めた(ΔODblank)。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきコレステロールオキシダーゼの酵素活性を算出した。なお上記条件下で1分間に1マイクロモルのH2O2を酸化する酵素量を1単位(1U)とする。
計算式
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×3.05(ml)×希釈倍率}/{13.78×1/2×1.0×0.05(ml)}
13.78 : Quinoneimine色素の上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数
1/2 :酵素反応で生成したH2O2の2分子から形成するQuinoneimine色素は1分子であることによる係数
1.0 :セルの光路長(cm)

0035

実施例1コレステロールオキシダーゼ遺伝子への変異の導入
遺伝子工学的手法を用いた改変により熱安定性が向上したコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドpCO110−S103T+V145E(特開平8−242860)で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli JM109;TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン(50μg/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl;pH7.3)を摂取し、30℃で一晩神振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調製した。該プラスミドを鋳型として用いDiversifyTMPCRRandom Mutagenesis Kit(Clontech 社製)を用いた変異処理をそのプロトコールに従って施し、コレステロールオキシダーゼの生産能力を有する、改変型コレステロールオキシダーゼ変異プラスドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。

0036

実施例2熱安定性の向上した変異体スクリーニング
実施例1で調製したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli JM109;TOYOBO社製)を形質転換し、該形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl、1.5%寒天;pH7.3)に塗布した後、30℃で一晩培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって菌体を回収し、20mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。

0037

上記の租酵素液を用いて、上述した活性測定法によりコレステロールオキシダーゼ活性を測定した。また、同租酵素液を60℃で40分間加熱処理した後、コレステロールオキシダーゼ活性を測定し、14種の熱安定性の向上した変異体を取得した。こらら9種の改変体をコードするプラスミドをpCO110−S103T+V145E−M1、pCO110−S103T+V145E−M2、pCO110−S103T+V145E−M3、pCO110−S103T+V145E−M4、pCO110−S103T+V145E−M5、pCO110−S103T+V145E−M6、pCO110−S103T+V145E−M7、pCO110−S103T+V145E−M8、pCO110−S103T+V145E−M9、pCO110−S103T+V145E−M10、pCO110−S103T+V145E−M11、pCO110−S103T+V145E−M12、pCO110−S103T+V145E−M13、pCO110−S103T+V145E−M14と命名した。

0038

pCO110−S103T+V145E−M1、pCO110−S103T+V145E−M2、pCO110−S103T+V145E−M3、pCO110−S103T+V145E−M4、pCO110−S103T+V145E−M5、pCO110−S103T+V145E−M6、pCO110−S103T+V145E−M7、pCO110−S103T+V145E−M8、pCO110−S103T+V145E−M9、pCO110−S103T+V145E−M10、pCO110−S103T+V145E−M11、pCO110−S103T+V145E−M12、pCO110−S103T+V145E−M13、pCO110−S103T+V145E−M14の変異箇所を同定するためにDNAシーケンサー(ABIRISMTM 3700 DNA Analyzer ; Perkin−Elmer製)でコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pCO110−S103T+V145E−M1では配列表配列番号1記載の121番目のバリンがアラニン、pCO110−S103T+V145E−M2では252番目のスレオニンがアラニン、pCO110−S103T+V145E−M3では103番目のスレオニンがイソロイシン、pCO110−S103T+V145E−M4では109番目のスレオニンがイソロイシン、pCO110−S103T+V145E−M5では109番目のスレオニンがプロリン、pCO110−S103T+V145E−M6では252番目のスレオニンがチロシン、pCO110−S103T+V145E−M7では252番目のスレオニンがトリプトファン、pCO110−S103T+V145E−M8では252番目のスレオニンがフェニルアラニン、pCO110−S103T+V145E−M9では252番目のスレオニンがグリシン、pCO110−S103T+V145E−M10では404番目のアラニンがバリン、pCO110−S103T+V145E−M11では402番目のメチオニンがロイシン、pCO110−S103T+V145E−M12では402番目のメチオニンがバリン、371番目のアスパラギンヒスチジン、390番目のアスパラギンがセリン、pCO110−S103T+V145E−M13では402番目のメチオニンがバリン、369番目のメチオニンがイソロイシン、536番目のグルタミン酸がバリン、pCO110−S103T+V145E−M14では402番目のメチオニンがバリン、443番目のアスパラギンがセリンに置換されていることが確認された。またT252A変異とV121A、T109I、T103I変異部位を組み合わせた改変型コレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含むプラスミド(pCO110−S103T+V145E+T252A+V121A、pCO110−S103T+V145E+T252A+T109I、pCO110−S103T+V145E+T252A+T103I)を制限酵素サイトを利用して作製し、同様にDNAシーケンサー(ABI PRISMTM 3700 DNA Analyzer ; Perkin−Elmer製)で塩基配列を確認した。

0039

実施例3改変体コレステロールオキシダーゼの製造
市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli JM109;TOYOBO社製)を計17種類の改変型コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターでそれぞれ形質転換することにより改変コレステロールオキシダーゼ生産菌株12種類を造成した。これらの菌株ををアンピシリン(50μg/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl;pH7.3)でそれぞれ30℃、24時間培養し、約100−500mU/mlのコレステロールオキシダーゼ活性を得た。pCO110−S103T+V145E−M1、pCO−110−S103T+V145E−M2、pCO110−S103T+V145E−M3、pCO110−S103T+V145E−M4、pCO110−S103T+V145E−M5、pCO110−S103T+V145E−M6、pCO110−S103T+V145E−M7、pCO−110−S103T+V145EM8、pCO110−S103T+V145E−M9、pCO110−S103T+V145E−M10、pCO110−S103T+V145E−M11、pCO110−S103T+V145E−M12、pCO110−S103T+V145E−M13、pCO110−S103T+V145E−M14の各プラスミドに由来するコレステロールオキシダーゼをV121A, T252A, T103I, T109I,T109P, T252Y, T252W, T252F, T252G, A404V、M402L、M402V+N371H+N390S、M402V+M369I+E536V、M402V+N443S、また、pCO110−S103T+V145E+T252A+V121A、pCO110−S103T+V145E+T252A+T109I、pCO110−S103T+V145E+T252A+T103Iの各プラスミドに由来するオキシダーゼをV121A+T252A, T109I+T252A, T103I+T252Aと命名した。
なお、確認のために述べるが、本実施例においては、改変の基になるコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質として、ストレプトマイセスsp.SA−COOが産生するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質を遺伝子工学的手法を用いて改変させて得られた酵素の1つであるS103T+V145Eを用いているため、本実施例におけるコレステロールオキシダーゼは、すべてS103TとV145Eの2箇所の変異を持っている。
したがって、上記において例えばV121Aとは、S103TおよびV145Eの2箇所が変異した変異体にさらにV121Aの変異が加わったものを示す。また、上記において例えばV121A+T252Aとは、S103TとV145Eの2箇所が変異した変異体にさらにV121AとT252Aの2箇所の変異が加わったものを示す。

0040

しかしながら、改変の基になるコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質は特に上記に限定されるものではない。

0041

上記方法にて培養した菌体を集め、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0) に再懸濁後、超音波処理にて破砕し、遠心分離により上清液(粗酵素液)を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンを用いた除核酸、硫酸アンモニウムを用いた塩析により、コレステロールオキシダーゼを分画した。さらにDEAE−セファロースイオン交換クロマトグラフィーによりコレステロールオキシダーゼを精製した。

0042

実施例4改変型コレステロールオキシダーゼV121A,T252A,T103I,T109I粗酵素液サンプルと親酵素の熱安定性の比較
V121A,T252A,T103I,T109I,T109P粗酵素液サンプルを60℃、40分加熱処理した時の残存活性を比較した時の残存活性を比較した結果を図1に示す。図1から分かるようにコレステロールオキシダーゼに対して遺伝子レベルでの改変を行うことにより熱安定性が有意に向上するものが取得できることが確認された。

0043

実施例5改変型コレステロールオキシダーゼV121A+T252A,T109I+T252A,T103I+T252A,T252A粗酵素液サンプルと親酵素の熱安定性の比較
各種改変型組み合わせコレステロールオキシダーゼ粗酵素液サンプルを60℃、60分加熱処理した時の残存活性を比較した時の残存活性を比較した結果を図2に示す。図2から分かるように熱安定性の向上コレステロールオキシダーゼに対して遺伝子レベルでの変異部位を組み合わせた改変体を作製することによりT109I+T252Aにおいて大きな相乗効果が認められることが確認され、60℃、60分加熱処理後も90%以上の活性を保持していた。

0044

実施例6改変型コレステロールオキシダーゼT252Y,T252W,T252F,T252G,A404V,V121A,T252A,M402L,M402V+N371H+N390S,M402V+M369I+E536V,M402V+N443S粗精製サンプルと親酵素の熱安定性の比較
各種改変体コレステロールオキシダーゼと親酵素を20mMリン酸緩衝液(pH7.0)中で60℃、60分加熱処理を施した時の残存活性を比較した結果を図3に示す、図3から分かるようにこれら改変型コレステロールオキシダーゼの熱安定性は親酵素の熱安定性よりも有意に向上していることが確認された。

0045

本発明のコレステロールオキシダーゼは、液状にて高い安定性を示す等の優れた特性を持つため、臨床検査分野で用いられる診断薬等に用いる酵素として優れており、産業界に寄与することが大である。

図面の簡単な説明

0046

改変型コレステロールオキシダーゼV121A,T252A,T103I,T109I,T109P粗酵素液サンプルと親酵素の熱安定性の比較
改変型コレステロールオキシダーゼV121A+T252A,T109I+T252A,T103I+T252A,T252A粗酵素液サンプルと親酵素の熱安定性の比較
改変型コレステロールオキシダーゼT252Y,T252W,T252F,T252G,T252A,V121A,A404V,M402L,M402V+N371H+N390S,M402V+M369I+E536V,M402V+N443S精製サンプルと親酵素の熱安定性の比較

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