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技術 プラスミド、形質転換体およびその製造方法、フェノールの製造方法

出願人 加藤純一大竹久夫メルシャン株式会社
発明者 加藤純一大竹久夫
出願日 2003年8月8日 (17年3ヶ月経過) 出願番号 2003-290419
公開日 2005年3月10日 (15年8ヶ月経過) 公開番号 2005-058048
状態 拒絶査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理
主要キーワード 取得効率 ダーラム管 スクリュー管瓶 メイクアップガス 破壊用 カラム流量 機能破壊 複製開始配列
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この項目の情報は公開日時点(2005年3月10日)のものです。
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図面 (8)

課題

生物学的方法によって、ベンゼンからフェノール生産するための新たな手段を提供すること。

解決手段

ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊プラスミドベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体。前記形質転換体の製造方法。前記形質転換体をベンゼン存在下で培養する工程を含む、ベンゼンからフェノールを製造する方法。

概要

背景

ベンゼンフェノールへの化学変換プロセスは、石油化学工業で最も主要な化学プロセスのひとつである。ベンゼンにひとつだけ水酸基を導入する有機合成反応の反応制御は非常に困難であり、工業的には下記に示す3段階の化学プロセスから成るクメン法がフェノール生成の主流になっている。

一方、生物は、多種多様有機化合物に水酸基を導入する触媒機能を持っている。ベンゼンもその例外ではなく、ベンゼンに水酸基を導入してフェノールもしくはカテコールを生成する能力を持つ微生物報告されている。例えば、シュードモナスエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)JI104株は、ベンゼンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有し、ベンゼンからフェノールを生成することが知られている(非特許文献1)。しかし、ベンゼンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有する微生物はまれであり、例えば、GenBankなどのDNAデータベースには、前述のシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)JI104株しか登録されていない。

ベンゼンからフェノールへの変換のバイオプロセスでは、還元力の供給が必要になる。それゆえ、ベンゼン酸化のバイオプロセスでは、菌体そのものを生体触媒として用い、還元力の供給をも菌体細胞に行わせるのが有効であると考えられる。その場合、用いる菌体細胞は有害なベンゼンが高濃度に存在する条件でも、ベンゼン酸化能及び還元力供給能を維持できるよう、有機溶媒に高度に耐性であることが望まれる。

一方、ベンゼン資化性菌の中には、ベンゼン、トルエンキシレンなどの有害な有機溶媒に対して強い耐性を示す菌株(例えば、ロコドッカス・オパカスB−4株、ロドコッカス・オパカスB−9株およびB−10株)が存在する。しかし、これまで分離されたベンゼン資化性菌のほとんどは、ベンゼンに水酸基を二つ導入してカテコールを生成するベンゼンジオキシゲナーゼ経路でベンゼンを資化しているため、ベンゼンに水酸基を1つ導入してフェノールを生成するというバイオプロセスに用いることはできなかった。
キタヤマ(Kitayama),A.、スズキ(Suzuki),E.、カワカミ(Kawakami),Y.、およびナガムネ(Nagamune),T.1996、「シュードモナス・エルギノーサJI104のベンゼンモノオキシゲナーゼ芳香環への水酸基導入における遺伝子機構および低部位特異性(Gene organization and low regiospecificity in aromatic−ring hydroxylation of a benzene monooxygenase of Pseudomonas aeruginosa JI104.)」 J. Ferment. Bioeng. 82:pp.421−425.

概要

生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産するための新たな手段を提供すること。ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊プラスミドベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体。前記形質転換体の製造方法。前記形質転換体をベンゼン存在下で培養する工程を含む、ベンゼンからフェノールを製造する方法。なし

目的

そこで、本発明の目的は、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産するための新たな手段を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ベンゼン資化細菌由来ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊プラスミド

請求項2

前記外来遺伝子で分割された2つ領域は、いずれも、分割された領域を少なくとも含む配列が、ベンゼン資化細菌が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域において、それぞれ独立して相同組換えを起こし得る、請求項1に記載のプラスミド。

請求項3

前記分割された領域を少なくとも含む配列は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域のみからなるか、または、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域及びこの領域と連続して前記ベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分からなる請求項2に記載のプラスミド。

請求項4

前記分割された領域を少なくとも含む配列が、0.5kb以上である、請求項2または3に記載のプラスミド。

請求項5

前記外来遺伝子が、選択マーカー遺伝子である請求項1〜4のいずれか1項に記載のプラスミド。

請求項6

前記ベンゼン資化細菌が、ベンゼンに対する耐性を有するものである請求項1〜5のいずれか1項に記載のプラスミド。

請求項7

前記ベンゼン資化細菌が、ロドコッカス属細菌である請求項1〜6のいずれか1項に記載のプラスミド。

請求項8

前記ロドコッカス属細菌がロドコッカス・オパカスB−4株(寄託番号FERMBP−8281)、ロドコッカス・オパカスB−9株(寄託番号FERMBP−8282)またはロドコッカス・オパカスB−10株(寄託番号FERMBP−8283)である請求項7記載のプラスミド。

請求項9

ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体

請求項10

ベンゼンに対する耐性を有する請求項9に記載の形質転換体。

請求項11

宿主がベンゼン資化細菌である請求項9または10に記載の形質転換体。

請求項12

前記ベンゼン資化細菌が、ロドコッカス属細菌である請求項11に記載の形質転換体。

請求項13

前記ロドコッカス属細菌がロドコッカス・オパカスB−4株(寄託番号FERMBP−8281)、ロドコッカス・オパカスB−9株(寄託番号FERMBP−8282)またはロドコッカス・オパカスB−10株(寄託番号FERMBP−8283)である請求項12記載の形質転換体。

請求項14

ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子及びベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主を、請求項1〜8のいずれか1項に記載のプラスミドを用いて相同組換えすることにより、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得る、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体の製造方法。

請求項15

ベンゼンからフェノールを製造する方法であって、請求項9〜13のいずれか1項に記載の形質転換体または請求項14に記載の製造方法によって製造された形質転換体を、ベンゼン存在下で培養する工程を含む方法。

請求項16

前記培養を、増殖基質をさらに存在させて行う、請求項15記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを製造する方法、前記方法に使用される形質転換体、および、前記形質転換体を得るためのプラスミドに関する。

背景技術

0002

ベンゼンのフェノールへの化学変換プロセスは、石油化学工業で最も主要な化学プロセスのひとつである。ベンゼンにひとつだけ水酸基を導入する有機合成反応の反応制御は非常に困難であり、工業的には下記に示す3段階の化学プロセスから成るクメン法がフェノール生成の主流になっている。

0003

0004

一方、生物は、多種多様有機化合物に水酸基を導入する触媒機能を持っている。ベンゼンもその例外ではなく、ベンゼンに水酸基を導入してフェノールもしくはカテコールを生成する能力を持つ微生物報告されている。例えば、シュードモナスエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)JI104株は、ベンゼンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有し、ベンゼンからフェノールを生成することが知られている(非特許文献1)。しかし、ベンゼンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有する微生物はまれであり、例えば、GenBankなどのDNAデータベースには、前述のシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)JI104株しか登録されていない。

0005

ベンゼンからフェノールへの変換のバイオプロセスでは、還元力の供給が必要になる。それゆえ、ベンゼン酸化のバイオプロセスでは、菌体そのものを生体触媒として用い、還元力の供給をも菌体細胞に行わせるのが有効であると考えられる。その場合、用いる菌体細胞は有害なベンゼンが高濃度に存在する条件でも、ベンゼン酸化能及び還元力供給能を維持できるよう、有機溶媒に高度に耐性であることが望まれる。

0006

一方、ベンゼン資化性菌の中には、ベンゼン、トルエンキシレンなどの有害な有機溶媒に対して強い耐性を示す菌株(例えば、ロコドッカス・オパカスB−4株、ロドコッカス・オパカスB−9株およびB−10株)が存在する。しかし、これまで分離されたベンゼン資化性菌のほとんどは、ベンゼンに水酸基を二つ導入してカテコールを生成するベンゼンジオキシゲナーゼ経路でベンゼンを資化しているため、ベンゼンに水酸基を1つ導入してフェノールを生成するというバイオプロセスに用いることはできなかった。
キタヤマ(Kitayama),A.、スズキ(Suzuki),E.、カワカミ(Kawakami),Y.、およびナガムネ(Nagamune),T.1996、「シュードモナス・エルギノーサJI104のベンゼンモノオキシゲナーゼ芳香環への水酸基導入における遺伝子機構および低部位特異性(Gene organization and low regiospecificity in aromatic−ring hydroxylation of a benzene monooxygenase of Pseudomonas aeruginosa JI104.)」 J. Ferment. Bioeng. 82:pp.421−425.

発明が解決しようとする課題

0007

そこで、本発明の目的は、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産するための新たな手段を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0008

本発明の上記目的を達成する手段は、以下の通りである。
[請求項1]ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミド。
[請求項2]前記外来遺伝子で分割された2つの領域は、いずれも、分割された領域を少なくとも含む配列が、ベンゼン資化細菌が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域において、それぞれ独立して相同組換えを起こし得る、請求項1に記載のプラスミド。
[請求項3]前記分割された領域を少なくとも含む配列は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域のみからなるか、または、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域及びこの領域と連続して前記ベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分からなる請求項2に記載のプラスミド。
[請求項4]前記分割された領域を少なくとも含む配列が、0.5kb以上である、請求項2または3に記載のプラスミド。
[請求項5]前記外来遺伝子が、選択マーカー遺伝子である請求項1〜4のいずれか1項に記載のプラスミド。
[請求項6]前記ベンゼン資化細菌が、ベンゼンに対する耐性を有するものである請求項1〜5のいずれか1項に記載のプラスミド。
[請求項7]前記ベンゼン資化細菌が、ロドコッカス属細菌である請求項1〜6のいずれか1項に記載のプラスミド。
[請求項8]前記ロドコッカス属細菌がロドコッカス・オパカスB−4株(寄託番号 FERM BP−8281)、ロドコッカス・オパカスB−9株(寄託番号 FERM BP−8282)またはロドコッカス・オパカスB−10株(寄託番号 FERM BP−8283)である請求項7記載のプラスミド。
[請求項9]ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体。
[請求項10]ベンゼンに対する耐性を有する請求項9に記載の形質転換体。
[請求項11]宿主がベンゼン資化細菌である請求項9または10に記載の形質転換体。
[請求項12]前記ベンゼン資化細菌が、ロドコッカス属細菌である請求項11に記載の形質転換体。
[請求項13]前記ロドコッカス属細菌がロドコッカス・オパカスB−4株(寄託番号 FERM BP−8281)、ロドコッカス・オパカスB−9株(寄託番号 FERM BP−8282)またはロドコッカス・オパカスB−10株(寄託番号 FERM BP−8283)である請求項12記載の形質転換体。
[請求項14]ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子及びベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主を、請求項1〜8のいずれか1項に記載のプラスミドを用いて相同組換えすることにより、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得る、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体の製造方法。
[請求項15]ベンゼンからフェノールを製造する方法であって、請求項9〜13のいずれか1項に記載の形質転換体または請求項14に記載の製造方法によって製造された形質転換体を、ベンゼン存在下で培養する工程を含む方法。
[請求項16]前記培養を、増殖基質をさらに存在させて行う、請求項15記載の方法。

発明の効果

0009

本発明によれば、ベンゼンジオキシゲナーゼ経由でベンゼンを代謝する細菌から得られた形質転換体を用いて、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産するための手段を提供することができる。

発明を実施するための最良の形態

0010

以下に、本発明について、更に詳細に説明する。
ベンゼンは、ベンゼン資化細菌により、ベンゼンジオキシゲナーゼ経由で下記のとおり代謝される。

0011

0012

ベンゼンジオキシゲナーゼの触媒作用によって生じるベンゼン−cis−グリコール化学的に不安定な物質で、容易に脱水してフェノールを生じる。そこで、本発明者らは、以下に示すように、ベンゼンジオキシゲナーゼ経由のベンゼン代謝経路において、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ活性を抑えることができれば、ベンゼン→ベンゼン−cis−グリコール→フェノールの経路によるフェノールの生産が可能になると考え検討を重ねた。

0013

0014

そこで、本発明者らは、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベンゼン資化細菌を形質転換することにより、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得ることができれば、この形質転換体によってベンゼンからフェノールを効率的に製造することができると考えた。本発明者らは、そのような形質転換体を得るために鋭意検討を重ね、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベンゼン資化細菌のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊し得るプラスミドを得ることに成功し、さらにこのプラスミドを用いてベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得ることにも成功して、本発明を完成するに至った。

0015

即ち、本発明のプラスミドは、ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有し、前記領域内にこの領域を分割するように外来遺伝子が挿入されており、かつ、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないことを特徴とするベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドである。
前述のように、ベンゼン−cis−グリコールは、化学的に不安定な物質で、容易に脱水してフェノールを生じる。そこで、ベンゼンジオキシゲナーゼは発現するが、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼは発現しない細菌を、上記本発明のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを用いて形質転換し、得られた形質転換体をベンゼン存在下で培養すれば、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼの触媒作用によってベンゼン−cis−グリコールからカテコールが生成されるという代謝経路を取ることなく、ベンゼン−cis−グリコールが脱水されてフェノールが生成される。これにより、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを製造することができる。

0016

本発明では、まず、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊するためのプラスミド(以下、「ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミド」ともいう)を調製する。次いで、このプラスミドを用いて、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主を相同組み換えすることにより、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得る。ここで、「ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊する」とは、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼを発現し得ないように、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域に改変を加えることをいう。

0017

本発明のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドは、ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有するプラスミドであって、前記領域内に、この領域を分割するように外来遺伝子が挿入されたものである。

0018

本発明のプラスミドが、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊するには、本発明のプラスミドが有する外来遺伝子が、上記宿主が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入され、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を阻害する必要がある。本発明のプラスミドが有する外来遺伝子の、宿主が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子への挿入は、相同組み換えによって行われる。そのため、本発明のプラスミドにおいては、外来遺伝子で分割された2つの領域は、いずれも、分割された領域を少なくとも含む配列が、ベンゼン資化細菌が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域において、それぞれ独立して相同組換えを起こし得るものであることが適当である。

0019

「分割された領域を少なくとも含む配列」が、ベンゼン資化細菌が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域において、相同組換えを起こし得るには、「分割された領域を少なくとも含む配列」は、例えば、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域のみからなるか、または、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の領域及びこの領域と連続してベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分からなることができる。この点を、図8を用いてさらに説明する。

0020

図8上段に、ベンゼン資化細菌のゲノムのベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む部分を示し、上段のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子と対応するように、その下の(a)、(b−1)及び(b−2)に、本発明のプラスミドの相同組換えを起こし得る配列を示す。(a)、(b−1)及び(b−2)において各配列は、外来遺伝子によって分割されるベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域と、この領域と連続してベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分とからなる。
図8(a)に示す本発明のプラスミドは、ベンゼン資化細菌のゲノムに含まれるベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をすべて含むものであり、かつ、相同組換えを起こし得る2つの配列(A1及びA2)は、いずれも、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ分割された遺伝子領域とこの領域と上流または下流に連続してベンゼン資化細菌のゲノム上に存在する配列部分とからなる。
本発明のプラスミドは、ベンゼン資化細菌のゲノムに含まれるベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をすべて含むものでなくてもよく、その例を(b−1)及び(b−2)に示す。(b−1)に示す本発明のプラスミドでは、相同組換えを起こし得る一方の配列B1は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部のみからなり、もう一方の相同組換えを起こし得る配列B2は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部とその上流配列の一部を含む。また、(b−2)に示す本発明のプラスミドでは、相同組換えを起こし得る一方の配列C1は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部とその下流配列の一部を含み、もう一方の相同組換えを起こし得る配列C2は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部のみからなる。

0021

本発明のプラスミドは、図8に示すように、挿入された外来遺伝子の上流と下流に、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部を含む、ベンゼン資化細菌由来の配列を有する。このようなプラスミドを、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベンゼン資化細菌へ導入すると、外来遺伝子の上流および下流のベンゼン資化細菌由来の配列は、ベンゼン資化細菌(宿主)が有するベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部を含む領域で相同組換えを起こし得る。ここで、相同組換えを効果的に起こすためには、前記プラスミドにおいて、外来遺伝子で分割され、外来遺伝子の上流側および下流側に位置する配列は、それぞれ、ベンゼン資化細菌由来の0.5kb以上の配列であることが好ましい。
このように相同組換えが起こることにより、宿主内のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域に、外来遺伝子が挿入され、宿主のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を破壊することができる。

0022

本発明のプラスミドによる相同組み換えの概略を、図5および図6に示す。図5(a)に示すように、宿主のゲノム上のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域と本発明のプラスミドとの相同組換えが起これば、図5(b)に示すように、宿主のゲノム上のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域が外来遺伝子によって分割される。こうして、ゲノム上のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域に外来遺伝子が挿入され、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を得ることができる。
なお、図6(a)に示すように、外来遺伝子の上流配列または下流配列のいずれか一方のみで相同組換えが生じた(相同組換えが一箇所で起きた)形質転換体では、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域が破壊されず残る。そのためこの形質転換体は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼを発現し得る。それに対し、図6(b)に示すように、外来遺伝子の上流配列および下流配列の両方で相同組換えが生じた(相同組換えが二箇所で起きた)形質転換体は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に外来遺伝子が挿入され、その機能が破壊されるため、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼを発現し得ない。このようなベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体が本発明の形質転換体であり、後述するように、ベンゼンからフェノールを生成するために用いることができる。

0023

前記プラスミドにおいて、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を分割する外来遺伝子の塩基長は、その外来遺伝子が形質転換によってベンゼン資化細菌のゲノム上に挿入されることにより、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失させることができる塩基長であればよく、原理的には、1b以上で欠失させることは可能だが、挿入の容易性を考慮すると、例えば、30b以上であることができる。外来遺伝子が選択マーカー遺伝子の場合は、その長さは、通常100b以上である。

0024

前記外来遺伝子は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失させ、かつ、この機能を欠失した形質転換体の選択が容易であるという観点から、選択マーカー遺伝子であることができる。選択マーカー遺伝子としては、具体的には、薬剤耐性を有する遺伝子であることができ、例えば、カナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性を有する遺伝子であることができる。例えば、前記外来遺伝子がカナマイシン耐性を有する遺伝子であれば、その外来遺伝子を含むプラスミドによる相同組換えにより遺伝子破壊を受けて形質転換された細菌(形質転換体)は、カナマイシンを含む培地中で増殖することができるが、その遺伝子を含むプラスミドによる相同組換えを受けていない細菌は増殖しない。これにより、形質転換体(ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼを発現しない細菌)を選択的に得ることが可能になる。

0025

前記ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドは、例えば、以下の方法によって得ることができる。
まず、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域を有するプラスミドを用意する。ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域を有するプラスミドは、例えば、以下のように用意できる。
ベンゼン資化細菌のゲノムDNAおよび大腸菌クローニングベクター(例えばpUC118等)を、制限酵素(例えばPstI等)で切断し、それぞれの断片を得る。その後、ライゲーション反応を用いて、クローニングベクター中にゲノムDNA断片を挿入し、閉環させる。このプラスミドを大腸菌に導入し、寒天培地上で生育させコロニーを形成させた後、1%カテコールアセトン溶液噴霧黄変するコロニーを選別する。このコロニーから標準的なアルカリSDS法により、プラスミドを回収・精製し、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子及びベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部の配列をクローニングする。クローニングした断片の制限酵素切断断片、例えばEcoRIおよびPstI消化断片プローブとして、ジーンウォーキング法によりベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製することができる。
上記のようにして用意されたベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域を有するプラスミドを、制限酵素、例えば、EcoRV、によって切断し、切断された断片間に外来遺伝子を挿入して、例えばT4DNAリガーゼ等で連結する。これにより、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域に外来遺伝子が挿入された、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドが得られる。

0026

このプラスミドを増幅するために、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを複製し得る性質を有する宿主へ導入し、形質転換を行う。このような宿主は、ベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを複製し得る性質を有するものであれば特に制限はなく、ベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを構築する上で用いた元のプラスミドの性質にあわせて適宜選択することができる。例えば、pUC118由来の遺伝子機能破壊用プラスミドの場合、宿主としては、大腸菌、サルモネラ、チフィムリウム、エンテロバクター等の腸内細菌を挙げることができる。
このような宿主にベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドを導入して得られた形質転換体を培養して、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドを増幅させる。その際に、制限酵素によって切断された、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域の断片間に挿入される外来遺伝子が、選択マーカー遺伝子であれば、前述と同様に、増幅したベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドを有する形質転換体を、選択的に採取することができる。この形質転換体から、多数のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドを常法により回収することができる。培養条件は、宿主に応じて適宜決定することができ、例えば、宿主として大腸菌を用いる場合、ペプトン10g/l、酵母エキス5g/lおよびNaCl5g/lを含むLB培地に、選択マーカー遺伝子を選択できる抗生物質、例えばカナマイシン(例えば50mg/l)、テトラサイクリン(例えば10mg/l)、クロラムフェニコール(例えば50mg/l)を添加したものに、形質転換株接種し、例えば、37℃、150往復/分の振とう培養にて16時間培養することにより、形質転換体の培養を行うことができる。

0027

前記ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドを、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主へ導入して相同組み換えを伴って形質転換を行う方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法を用いることができる。このように形質転換を行うことにより、前述のように、相同組換えが一箇所で起こった形質転換体と、相同組換えが二箇所で起こった形質転換体が生成される。相同組換えが二箇所で起こった形質転換体を選択的に採取するには、遺伝子機能破壊用プラスミドを構築する上で用いた元のプラスミドが元々持っていた選択マーカー(例えばpUC118ではアンピシリン)に感受性を示し、ベンゼン-cis-グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子間に新たに挿入した選択マーカー(例えば、カナマイシン)に耐性を示す形質転換体を選別すればよい。これは、相同組換えが一箇所で起こった形質転換体は、相同組換えによってベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミド全体が宿主のゲノムに挿入されるため、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入された選択マーカー遺伝子のほかに、プラスミドベクター自体が有するマーカーも機能することになるのに対し、相同組換えが二箇所で起こった形質転換体は、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入された選択マーカー遺伝子は機能するが、プラスミドベクター自体のマーカー機能は発揮されないという、両者の性質の違いを利用したものである。
採取した形質転換体が、相同組換えが二箇所で起こったベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体であることは、例えば、サザンブロット解析により確認することができる。

0028

本発明のプラスミドは、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないプラスミドである。ここで、「自律複製できない」とは、宿主細胞中で機能できる複製開始配列を持たないためにコピーを生じることができず、娘細胞に安定に遺伝できないことを意味する。
図7に、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製可能なプラスミドを用いて形質転換を行った場合(a)と、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないプラスミドを用いて形質転換を行った場合(b)の概要を説明する図を示す。
図7(a)に示すように、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製可能なプラスミドを用いてベンゼン資化細菌を形質転換すると、該プラスミドは宿主内で複製され、宿主内でプラスミドとして安定に存在することができる。その結果、相同組換えが起こってベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体のほかに、相同組換えを起こさず、プラスミドをそのままの形で含み、従って、宿主のゲノムをそのまま保持した形質転換体も形成される。このようなベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体と宿主のゲノムをそのまま保持しベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を有する形質転換体は、同じ外来遺伝子を含んでいるため、薬剤耐性の有無によって選択的に採取することは困難である。従って、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製可能なプラスミドを用いて形質転換を行うと、相同組換えが起こってベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体のみを選択的に採取することは困難になる。それに対し、図7(b)に示すように、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができない本発明のプラスミドを用いて形質転換を行えば、薬剤耐性の有無等によって、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体を選択的に得ることができる。

0029

本発明のプラスミドが、導入される宿主内で自律複製できないものであることは、前もって検討しておくことが好ましい。一般的には、大腸菌のようなグラム陰性菌用のプラスミドベクターは、ロドコッカス属細菌のようなグラム陽性菌中では自律複製できないものであるため、この点も考慮して、使用するプラスミドベクターおよび宿主を適宜選択することが好ましい。

0030

前述のように、本発明のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能破壊用プラスミドは、ベンゼン資化細菌由来のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の少なくとも一部の領域を有する。前記ベンゼン資化細菌は、ベンゼンに対する耐性を有するものであることができる。なお、「ベンゼンに対する耐性を有する」とは、ベンゼン濃度が水に対する飽和濃度であっても増殖することをいう。
そのような細菌としては、ロドコッカス属細菌を挙げることができ、具体的には、ロコドッカス・オパカスB−4株(寄託番号 FERM BP−8281)、ロドコッカス・オパカスB−9株(寄託番号 FERM BP−8282)、およびロドコッカス・オパカスB−10株(寄託番号 FERM BP−8283)を挙げることができる。

0031

本発明の形質転換体は、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子を有し、かつ、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失した形質転換体である。本発明の形質転換体は、ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子およびベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する宿主を、本発明のプラスミドを用いて相同組換えすることによってベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子機能を欠失させることにより得ることができる。前記宿主は、ベンゼン資化細菌であることができる。
そのような細菌としては、ロドコッカス属細菌を挙げることができ、具体的には、ロコドッカス・オパカスB−4株(寄託番号 FERM BP−8281)、ロドコッカス・オパカスB−9株(寄託番号 FERM BP−8282)、およびロドコッカス・オパカスB−10株(寄託番号 FERM BP−8283)を挙げることができる。
なお、ロドコッカス・オパカスB−4株は、寄託当初は種の特定がされていなかったため、ロドコッカス・エスピーB−4株(寄託番号 FERM BP−8281)として寄託されている。但し、その後の研究で、当該菌株は、オパカスに属することが判明したため、本明細書中では、ロドコッカス・オパカスB−4株(寄託番号 FERM BP−8281)として表記するものとする。

0032

更に、本発明は、ベンゼンからフェノールを製造する方法であって、前記形質転換体を、ベンゼン存在下で培養する工程を含む方法に関する。本発明の形質転換体が、ベンゼンに対する耐性を有するものであれば、ベンゼン存在下でベンゼンを酸化することが可能となる。これにより、本発明の形質転換体をベンゼン存在下で培養することによって、ベンゼン→ベンゼン−cis−グリコール→フェノールの経路で、フェノールを得ることができる。

0033

前記方法において、本発明の形質転換体を、ベンゼン存在下で培養する条件および方法には、特に制限はなく、例えば、本発明の形質転換体を含む培地に、ベンゼンを添加して培養を行うこともでき、または、培地中にベンゼンを添加せずに、培養容器内にベンゼンを蒸気で供給し、ベンゼン雰囲気中で培養を行うこともできる。
本発明の形質転換体が、ベンゼンを炭素源として資化して増殖できない場合は、ベンゼン以外の適当な有機溶媒を増殖基質として用いることができる。そのような増殖基質としては、例えば、n−デカンを用いることができる。培養培地は、液体培地を用いることもでき、寒天培地を用いることもできる。培養は、例えば、増殖基質としてn−デカンを用いて、ベンゼンを蒸気で供給しながら、最少合成培地において、培養温度28℃、培養時間2日、で行うことができる。生成されたフェノールは、例えば、蒸留によって回収することができる。

0034

以下に、実施例によって本発明を具体的に説明する。
1.ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ベンゼンを炭素源として生育させたロドコッカス・オパカスB−4株(寄託番号 FERM BP−8281)に、1%カテコール/エタノール溶液を噴霧すると黄変した。このことから、ロドコッカス・オパカスB−4株は、カテコール2,3−ジオキシゲナーゼ活性を有することが示唆された。
グラム陽性細菌グラム陰性細菌に関わらずベンゼンジオキシゲナーゼ及びベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、カテコール2,3−ジオキシゲナーゼ遺伝子のすぐ上流もしくは下流に位置する場合が多い。カテコール2,3−ジオキシゲナーゼ活性は1%カテコール/アセトン溶液を細菌のコロニーに噴霧し、黄変の有無で容易に検出することができる。そこで、ベンゼン−cis−グリコール遺伝子をクローニングするために、まずカテコール2,3−ジオキシゲナーゼ活性を指標にクローニングを行った。

0035

ロドコッカス・オパカスB−4株から調製したゲノムDNA(調製方法は後述参照)60μl、フェルメンタス社制限酵素用緩衝液の10倍濃縮液12μl、制限酵素PstI(フェルメンタス社)1μl、蒸留水48μlを混合し、37℃に保温した。保温開始2分後にTE飽和フェノール/クロロフォルム混合液(1:1[vol/vol])120μlと混合し反応を停止した。TE飽和フェノール/クロロフォルム混合液と制限酵素反応液を混合したものを15,000rpm、5分間遠心分離し、上清を回収した。1.6μgの大腸菌のクローニングベクターpUC118(宝酒造)、4μlのフェルメンタス社制限酵素用の10xO緩衝液及び2μlのPstI(フェルメンタス社)を含む反応液40μlを37℃で1時間反応させた。ゲノムPstI部分分解反応液とpUC118 PstI分解反応液を1%アガロースによる電気泳動で分離した。ゲノム反応液からは3〜6kbの画分、pUC118からは3.2kb断片を回収し、DNA精製キット(ジーンクリーンIIキット(Geneclean II kit)、バイオ101社)で精製した。その後、ゲノム3〜6kb画分とPstI切断したpUC118を混合した後、混合液の半量の反応液(東洋紡製ライゲーションハイ(Ligation High))を添加し、16℃に保持した。一晩ライゲーション反応を行った後、反応溶液エシェリキアコリ(Escherichia coli)DH5αコンピテントセル東洋紡)を形質転換し、アンピシリンナトリウム塩(100 mg/l)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−DガラクトピラノシドX−gal)(20mg/l)及び0.1mMイソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)を含むL寒天培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl、2.0%寒天)に塗布し、37℃で一晩培養した。生じた白コロニーをアンピシリンナトリウム塩(100mg/l)を含むL寒天培地に爪楊枝レプリカし、再び37℃で一晩培養した。形成したコロニーに1%カテコールアセトン溶液を噴霧し、黄変したコロニーを選別した。

0036

選別したコロニーからプラスミドを標準的なアルカリ−SDS法で精製し制限酵素解析した結果、3.1kbの挿入DNA断片を持つことが判明した。このプラスミドをpB4BDO−1と命名した。M13(宝酒造)のユニバーサル及びリバースプライマーを用いてpB4BDO−1の挿入断片の両端のDNA塩基配列を決定した。決定したDNA塩基配列をGenBank,DDBJ,EMBLのDNAデータベースに対して相同検索を行ったところ、図1に示すようにベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子の一部、カテコール2,3−ジオキシゲナーゼ遺伝子及びベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部がコードされていることが示唆された。そこで、図1の1.3kb EcoRI−PstI断片をプローブとしてロドコッカス・オパカスB−4株ゲノムDNAのEcoRI消化物2.0kb断片をpUC118にクローニングした(ジーンウォーキング)。得られたプラスミドをpB4BDO−2と命名した。pB4BDO−2の挿入DNA断片の塩基配列を決定し、相同性検索を行った結果、この断片にベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が存在することが示唆された。図1にベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子周辺制限酵素地図を示す。

0037

(ロドコッカス・オパカスB−4株のゲノムDNAの調製)
1) B−4株をDifco社製トリティック・ソイ・ブロス(10 ml)に植菌し、24時間28℃で振とう培養する。
2) 24時間培養液0.5 mlを1.5 mlマイクロ遠心チューブに入れ、15,000rpm、5分間の遠心で集菌する。培養上清は捨てる。
3) 集菌した菌体を1 mg/mlのリゾチームシグマ(Sigma)社カタログ番号L7651)を含むGTE緩衝液(50 mMグルコース、25 mM Tris−HCl (pH 8.0)、10 mMEDTA)に懸濁し、37℃5時間放置する。
4) 20 mg/mlのプロテイナーゼK(メルク社)を3μl及び10% SDSを50μl混合し、50℃で2時間放置する。
5) 室温にまで冷却した後、TE緩衝液(10 mM Tris−HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA)で飽和したフェノール/クロロフォルム混合液(1:1[vol/vol])を600μl添加し、5分間混合する。
6) 15,000rpm、5分間遠心した後、上清画分を新しいマイクロ遠心チューブに移す。
7) TE緩衝液で飽和したフェノール/クロロフォルム混合液(1:1[vol/vol])を600μl添加し、5分間混合する。
8) 15,000rpm、5分間遠心した後、上清画分を新しいマイクロ遠心チューブに移す。
9) 0.3M CH3COONa (pH 7.0)を50μl添加、混合した後、99.5%エタノールを1 ml添加し、よく混合する。
10) 生じた沈殿を15,000rpm、5分間の遠心で回収する。70%エタノールで1回洗浄する。
11) 50μg/mlのRNaseA(シグマ社)を含むTE 50μlに沈殿を溶解する。

0038

2.ベンゼン−cis−グリコール遺伝子破壊株の作製
(1)べンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの作製
ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の全領域を含むpB4BDO−2を用いてロドコッカス・オパカスB−4株のベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製を行った。
まず、pB4BDO−2のEcoRV消化断片とカナマイシン耐性遺伝子カセット供給ベクターpUC4K(ファルマシアバイオテク)由来のカナマイシン耐性遺伝子カセット(HincII 1.2kb断片)をT4DNAリガーゼで連結し、E.coli DH5αコンピテントセルを形質転換した。E.coli DH5αコンピテントセルは、形質転換後、アンピシリンナトリウム(100mg/l)およびカナマイシン(50mg/l)を添加したL寒天培地に塗布し、37℃で一晩培養した。この培養操作により、アンピシリン/カナマイシン耐性の形質転換株を選択した。
その結果得られたアンピシリン/カナマイシン耐性の形質転換株からプラスミドを回収し、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドpB4BDO−2.1を得た。

0039

(2)ロドコッカス・オパカスB−4株のエレクトロポレーションによる形質転換
1) ロドコッカス・オパカスB−4株をトリプティック・ソイ・ブロスで28℃、2日間振とう培養する。
2)培養液を1%グリシンを含むトリプティック・ソイ・ブロスに植菌(1%イノキュラム)し、28℃で一晩振とう培養する。
3) 4℃、10,000rpm、10分の遠心で集菌する。上清を捨て氷冷したHS緩衝液(272 mMスクロース、6 mMHEES[pH 7.0])に菌体を懸濁し、再び遠心する。この操作をあと2回繰り返す。HS緩衝液で3回洗浄した菌体を当初の培養液の10分の1量のHS緩衝液に懸濁する。
4) 菌体懸濁液を40℃10分加熱処理する。その後、氷冷する。
5) 菌体懸濁液390μlにDNA溶液を10μl混合する。
6)エレクトロ・セル・マニピュレーター(Electro Cell Manipulator) 630(BTX社)でエレクトロポレーションを行う。条件は、6.5kV/cm、50μFとした。
7) エレクトロポレーション後、菌体懸濁液をトリプティック・ソイ・ブロスに添加し、28℃一晩振とう培養する。
8) 50mg/lのカナマイシンを含むトリプティック・ソイ・ブロス寒天培地に塗布し、28℃で培養し、カナマイシン耐性の形質転換株を得る。

0040

得られたカナマイシン耐性の形質転換株からゲノムDNAを抽出し、カナマイシン耐性遺伝子カセット(1.2kbHincII断片)およびpB4BDO−2の2.0 kb EcoRI断片をプローブとして、サザンブロット解析を行った(図2)。その結果、形質転換株1のゲノムDNAでの解析において、正しく遺伝子破壊が行われたゲノムから予想されるシグナルが検出された。このことから、形質転換株1はベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株であることが示された。そこで、形質転換株1をロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBと命名した。
なお、形質転換株2は、相同組換えが一箇所でのみ生じた形質転換株である。
ロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBはベンゼンもしくはトルエンを唯一の炭素源として蒸気で供給して培養しても、増殖を示さなかった。このことも、ロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBでは、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることを支持するデータである。本実施例では、目的の形質を持つ形質転換体の取得効率が高く、得られた組換え体の50%は、目的の表現型を持つ形質転換体であった。

0041

3.ロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBを用いたベンゼンからのフェノールの生産
上記2で作製したベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株ロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBを用いて、ベンゼンからのフェノール生産を行った。
ロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBは、ベンゼンを炭素源として増殖できないので、n−デカンを増殖基質として用いた。まず、50ml容ラボランスクリュー管瓶(胴径35mm、高さ78mm、アズワン社)中の10mlトリプティック・ソイ・ブロス(Difco社)にロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBを植菌し、コントロールとしてロドコッカス・オパカスB−4株のコロニーを植菌し、28℃130rpmの振とうで2日間前培養を行った(図3)。前培養において、寒天培地を用いる場合は、トリプティック・ソイ・ブロス(ディフコ(Difco)社)に、寒天(ナカライ社)を2.0%添加すればよい。
この培養液0.1mlを50ml容スクリュー管瓶中の10ml最少培地に植菌した。最少培地の組成を以下に示す。
[最少培地]
K2HPO4 4.3 (g/l)
KH2PO4 3.4(g/l)
(NH4)2SO4 2.0(g/l)
MgCl2 0.16(g/l)
MnCl2・4H2O 0.001(g/l)
FeSO4・7H2O 0.0006(g/l)
CaCl2・2H2O 0.026(g/l)
Na2MoO4・2H2O 0.002(g/l)
ZnCl2 0.1(mg/l)
CoCl2・6H2O 0.01(mg/l)
NiSO4 0.01(mg/l)
Na2SeO4 10H2O 0.001(mg/l)
CuSO4・5H2O 0.01(mg/l)

0042

0.3mlのベンゼンを入れたダーラム管(胴径6mm、長さ60mm)と0.3mlのn−デカンを入れたダーラム管それぞれ一本ずつを植菌したスクリュー管瓶に入れ、スクリューキャップを閉めて28℃、130rpmの振とうで培養を行った(図3)。2日間培養した後、培養上清をガスクロマトグラフィー分析した。

0043

ガスクロマトグラフィーは、GC−2010(島津製作所)、カラムはDB−WAXキャピラリーカラム(長さ30.0m、内径0.32 mm、液層膜厚0.25μm、島津製作所)を用いた。分析条件は、キャリアガス:He、カラム流量:6.25ml/min、カラム温度:40℃で5分間保持した後、5℃/minで250℃まで昇温、250℃で30分保持気化室温度:250℃、検出器:FID、検出器温度:280℃、メイクアップガス:Heとした。この分析条件では、フェノールの保持時間は26.6分である。

0044

ロドコッカス・オパカスB−4株の培養上清をガスクロマトグラフィー分析したところ、フェノールはほとんど検出されなかった(図4)。一方、ロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBの培養上清を分析したところ、フェノールが検出された。ロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBの培養上清中のフェノール濃度は100 mg/lであった。

0045

ベンゼン資化性菌のほとんどは、ベンゼンに水酸基を2つ導入してカテコールを生成するベンゼンジオキシゲナーゼ経由でベンゼンを資化しているため、ベンゼンからフェノールを生成するバイオプロセスに用いることができなかったが、本発明によれば、このようなベンゼン資化性菌を形質転換することによって得られた形質転換体を用いて、生物学的方法によって、ベンゼンからフェノールを生産することが可能になる。

図面の簡単な説明

0046

ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子周辺の制限酵素地図を示す。
ベンゼン−cis−グルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株のベンゼン−cis−グルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域周辺の制限酵素地図(A)およびロドコッカス・オパカスB−4株と、そのカナマイシン耐性形質転換株のゲノムDNAのサザンブロット解析(B)を示す。
ベンゼンからフェノールを生成するための、ロドコッカス・オパカスB4ΔbnzBの培養方法を示す。
ベンゼンとn−デカンを供給した培養での培養上清のガスクロマトグラムを示す。
ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域が、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドに置換される、相同組み換えの概略を示す。
ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子領域が、ベンゼン−cis−グリコールデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドに置換される、相同組み換えの概略を示す。
ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製可能なプラスミドを用いて形質転換を行った場合(a)と、ベンゼン資化細菌の菌体内で自律複製することができないプラスミドを用いて形質転換を行った場合(b)の概要図を示す。
本発明のプラスミドの説明図である。

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