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技術 IgE産生抑制能のアッセイ方法

出願人 森永製菓株式会社
発明者 川原浩治柴田治樹橋爪秀一加藤正俊
出願日 2003年6月24日 (16年7ヶ月経過) 出願番号 2003-179644
公開日 2005年1月20日 (15年1ヶ月経過) 公開番号 2005-013042
状態 拒絶査定
技術分野 生物学的材料の調査,分析 特有な方法による材料の調査、分析 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード ドラモンド アメニティ 椎茸エキス ビフィズス菌末 細胞保存液 破壊物 事務機 段階希釈法
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2005年1月20日)のものです。
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課題

解決手段

ヒトから分離したリンパ球を適当な培養液で培養した後、被験物質の存在下で該リンパ球にIgEを産生させ、その結果産生したIgEの量を検出することを含むが、上記リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で安定的かつ有意にIgE産生を誘導することを特徴とし、被験物質のIgE産生抑制能、ひいては抗アレルギー性炎症活性のアッセイ方法を簡便に評価できる方法にかかる。

概要

背景

概要

被検物質IgE産生抑制能アッセイ方法の提供。ヒトから分離したリンパ球を適当な培養液で培養した後、被験物質の存在下で該リンパ球にIgEを産生させ、その結果産生したIgEの量を検出することを含むが、上記リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で安定的かつ有意にIgE産生を誘導することを特徴とし、被験物質のIgE産生抑制能、ひいては抗アレルギー性炎症活性のアッセイ方法を簡便に評価できる方法にかかる。なし

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

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請求項1

被験物質IgE産生抑制能アッセイ方法であって、当該方法は、1.ヒトから分離したリンパ球を適当な培養液中で培養し、2.被験物質の存在下で該リンパ球にIgEを産生させ、3.産生したIgEの量を検出することを含み、ただし、上記リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で行うことを特徴とする、前記方法。

請求項2

血漿の濃度が、培養液に対して5〜15(v/v)%である、請求項1に記載の前記方法。

請求項3

培養液の培養量を200μl〜1mlとする、請求項1または2に記載の前記方法。

--

0001

臨床医学の分野では、多くの疾患が最終的に炎症に至るため、これを効率的に抑えるためにステロイド系抗炎症剤が用いられてきた。しかしながら、こうしたステロイド系抗炎症剤は、体内ホルモンバランスを変化させるといった副作用の影響が大きいためその利用に限界がある。特に、アトピー性皮膚炎気管支喘息といったアレルギー性炎症のように致命的ではないものの、苦痛を伴う疾患に対しては日常生活における食事で症状を緩和することが患者の負担を減少させるための有効な手段である。

技術分野

0002

この、アレルギー発症メカニズムは多くの研究者によって研究されており、このメカニズムの最初にIgEとよばれる抗体が血中で増加することが知られている。また、血中でのIgEの産生に関与するリンパ球集団生体外に取り出して、IgEの産生を誘導させる実験系が構築されている(非特許文献1)。

発明が解決しようとする課題

0003

【非特許文献】
J.Immunol. Methods233(2000)pp.33−40
しかしながら、上述の培養系においては、IgEの産生が十分ではなく、該培養方法をIgEの安定な産生を必要とする実験系に安定的に用いることに問題があった。

0004

本願発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、培養リンパ球に安定的かつ有意にIgE産生を誘導しうる培養条件確立し、これを用いて、被験物質のIgE産生抑制能、ひいては抗アレルギー性炎症活性アッセイ方法を簡便に評価できる方法を完成するに至った。

0005

したがって、本願発明は、被験物質のIgE産生抑制能をアッセイする方法であって、ヒトから分離したリンパ球を適当な培養液で培養した後、被験物質の存在下で該リンパ球にIgEを産生させ、その結果産生したIgEの量を検出することを含むが、上記リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で行うことを特徴とするものである。

0006

本願発明において使用しうるリンパ球とは、ヒト末梢血リンパ球である。

0007

本願発明で使用しうる被験物質とは、食品素材食品構成成分食品化学物質である。被験物質の調製方法は、水溶性物質は水もしくは生理食塩水などの水を主体とする溶媒に溶解し、非水溶性の物質については、適宜、有機溶媒ジメチルスルホキシドエタノールメタノール)等を用いて溶解する。

0008

本願発明において使用しうるヒト血漿とはヒト末梢血リンパ球の提供者由来の血漿である。

0009

該方法において、リンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で行うとIgE産生量が有意に増加する。そこで、本願発明にかかるリンパ球の培養は、当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で行うものである。

0010

さらに、前記方法においては、血漿の濃度が、培養液に対して5〜15(v/v)%である場合にIgE産生量が増加し、10(v/v)%である場合が特に好ましい。従って、本願発明の第二は、血漿の濃度が培養液に対して5〜15(v/v)%、特に10(v/v)%である前記方法である。

課題を解決するための手段

0011

次に、本願発明にかかる培養は培養量により免疫賦活能に差が見られ、96ウェルプレートで1ウェルにつき200μl容量で培養する場合に、24ウェルプレートで1ウェルにつき1ml容量で培養する場合より当該免疫賦活能が増大する。従って、本願発明の第三は、その培養量を200μl〜1mlとする前記方法である。

0012

本願発明はIgE産生抑制能のアッセイ方法であって、ヒトから分離したリンパ球について当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で培養し、被験物質の存在下で該リンパ球にIgEを産生させ、産生したIgEの量を検出することで、IgE産生抑制能、ひいては抗アレルギー性炎症活性のアッセイ方法を簡便に評価できる方法である。

0013

リンパ球は一般的な密度勾配遠心法により分離できるが、以下の手順で行うのが好ましい。すなわち、Ficoll−PaqueTM Plusを分注したチューブに血液を重層して遠心分離した後、血漿をチューブに採取する。次に、リンパ球を採取してチューブに注入し、培地を加えた後に遠心分離する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であるが、ERDF培地を用いるのが好ましい。

0014

その後、上清吸引除去し、培地を加え、細胞を懸濁後、さらに遠心分離する。本手順に使用しうる培地は動物細胞培養用培地であるが、ERDF培地を用いるのが好ましい。細胞保存液を加えて細胞の密度を調節し、チューブに分注する。

0015

体外免疫既知の方法で行ってもよいが、以下の手順で行うのが好ましい。すなわち、試料溶液と培地を混合し、段階希釈法にて数種類段階希釈液を作製し、各々ろ過滅菌して試料液を作製する。使用しうる試料は食品素材、食品構成成分、食品、化学物質である。試料の調製方法は水溶性の物質は水もしくは生理食塩水などの水を主体とする溶媒に溶解し、非水溶性の物質については、適宜、有機溶媒(ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール)等を用いて溶解する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であり、ERDFが好ましい。ヒト血漿は予め滅菌された穴径0.2ミクロンフィルタを用いて滅菌するが、不溶物が多い場合は0.4ミクロンのフィルタでろ過した後、0.2ミクロンのフィルタでろ過して使用する。その後、IL−2、IL−4、IL−6、ムラミルペプチド(MDP)、抗原ウシ胎児血清(FBS)、所定の培養溶液を混合したものに、上述のヒト血漿が特定の濃度となるように加えて、免疫賦活液を調製する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であり、ERDF培地が好ましい。特定の濃度に調製したリンパ球を遠心分離し培地を加えた後、遠心分離して上清を除去し、さらに培地を加え、該リンパ球を懸濁して特定の濃度になるように該培地を加えて調製し、リンパ球懸濁液を作製する。細胞培養は、既知の方法で行ってもよいが、培養プレートに試料溶液とリンパ球懸濁液を注入し、静置培養するのが好ましい。使用する培養プレートは、一般的な滅菌された組織培養用プレートであり、特に96ウェル培養プレートが好ましい。静置培養の条件は、一般的な37℃定温インキュベータで行うが、特に37℃、5%CO2/95%Airに調整するのが好ましい。細胞の計測は、血球計算盤もしくは、セルカウンターで行うが、培養後、培養プレートから上清を回収し、該上清にトリパンブルー溶液を加え、生細胞数死細胞数を計測するのが好ましい。

0016

IgE量は、酵素抗体法で測定することができるが、特にELISAによる測定が好ましい。すなわち、炭酸ナトリウム緩衝液に特定の抗体を混合した溶液を特定の濃度になるようにELISAプレートに注入する。使用しうる抗体は抗IgE抗体であるが、ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体、ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体が好ましい。一定時間放置した後、プレートの溶液を廃棄し、PBS−0.05%Tween 20を用いて数回洗浄操作を繰り返す。

0017

検量線作成は以下の手順で行うことができる。標準IgEについて標準希釈系列を作製したものをプレートに加えて静置した後、ウェル溶液を廃棄して、PBS−0.05%Tween 20で数回洗浄する。その後、BSA/PBSと酵素標識抗IgE抗体を混合してプレートに加えて静置し、ウェルの溶液を廃棄し、PBS−0.05%Tween 20で数回洗浄し、酵素基質を加え、その所定時間後に吸光度を測定する。各培養上清のIgE量は標準IgEをプロットした検量線から求める。

0018

以下に、本願発明の実施例を例示するが、本願発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

0019

【実施例】
実施例1
リンパ球の分離
15mlコニカルチューブ(Falcon 2196)にFicoll−PaqueTM Plus(Amersham Biotechnology #17−1440−02)を4mlずつ分注し、5mlの血液をその上に静かに重層し、400×gにて常温で30分間遠心分離(トミー精工 LC−120)した。上から血漿、リンパ球、Ficoll−paque、赤血球の層が存在することを確認して、オートピペットドラモンドPA−300)を用いて血漿をチューブに採取し、−20℃に保存した。次に、オートピペットを用いて、Ficollを採取しないように血漿側からリンパ球を採取し、各チューブとも最大で10ml程度になるように50mlチューブ(BD社 35−2070)に注入した。ERDF培地(ERDF(極東製薬#26500))17.7g、NaHCO3(Wako #191−01305)1.13gを超純水1000mlに溶解し0.2μmフィルター(Millipore SLGPB 5010)にてろ過滅菌したのち、全容積が45mlになるように加え、400×gで常温で5分間遠心分離した。その後、上清を吸引除去し、10mlのERDF培地を加え、細胞を懸濁後、400×gで常温で5分間遠心分離した。細胞の密度が1〜3×107細胞/mlになるように予め調製しておいた細胞保存液(10%DMSO/20%FBS/70%ERDF培地(FBS:Hyclone、DMSO:Wako))に懸濁し、クライオチューブ(Corning #430289)に分注し、−80℃で保存した。

0020

実施例2
体外免疫
体外免疫は以下の手順で行った。
A.2%試料液の作製
本実施例で用いた試料は、牛肉抽出エキスカルニッチ5、伊ハム)、コラーゲンペプチド(PRA、ニッピ)、ロイヤルゼリーローヤルゼリー田屋本店)、難消化性デキストリンファイバーゾル化学工業)、ホエイペプチド(W2500、森永乳業)、カゼインペプチド(C2500、森永乳業)、小麦ペプチド(WGE80GPA、DMV)、メイラード反応産物(森永製菓)、ソバそば粉ベストアメニティー)、クロレラ(クロレラ粒、東海緑藻工業)、ウーロン茶(ウーロン茶、伊藤園)、ビフィズス菌ビフィズス菌末M−16V、森永乳業)、ハチミツ(純粋はちみつ、埼玉養蜂)、椎茸エキス(しいたけエキスパウダー協和発酵)、のほか食品成分で190試料であり、これらは、食品原料となる材料をはじめ、漢方薬に処方されるもの、微生物破壊物食品加工時に反応熱で生じる反応産物などである。

0021

まず、各々の400μl試料溶液と20mlのERDF培地を混合し、0.2μmフィルター(Millex−GV,Millipore #SLGVR25 LS)を用いて、ろ過滅菌した。以下、段階希釈法にて、上記混合液から2ml採取したものを18mlのERDF培地と混合し、ろ過滅菌したものを0.2%試料溶液とし、この混合液から2ml採取し、同様に18mlのERDF培地と混合してろ過滅菌したものを0.02%試料溶液とし、さらに、この混合液から2ml採取し、18mlのERDF培地と混合したものをろ過滅菌して0.002%の試料溶液を各々作製した。

0022

B.免疫賦活液の調製
まず、保存しておいたヒト血漿を37℃のウォーターバス解凍した後、400×gで常温で5分間遠心分離した。その後、0.45μmフィルター(Millex−GV,Millipore #SLHVR 25 LS)を用いてろ過した。ろ過したヒト血漿1mlに、0.1mlのIL−2(stock 1μg/ml)(Genzyme Techne,2202)、0.1mlのIL−4(stock 1μg/ml)(Genzyme Techne,2004)、0.1mlのIL−6(stock 1μg/ml)(Genzyme Techne,2006)、0.1mlのMDP(stock 1mg/ml)(Cemicon International AR004)、抗原としてCedar pollen(stock 1μg/ml)(LSL LG 5229)、0.5mlのFBS(Hyclone)、0.5mlのERDF培地を加え、全量を2.5mlとした。

0023

C.リンパ球懸濁液の作製
まず、−80℃に保存しておいたリンパ球(1×107細胞)を37℃培養器アステック社 AC−165)にて解凍した後に50mlチューブに移し、20mlのERDF培地を加えた後、400×gにて常温で5分間遠心分離した。上清を除去した後、2.5mlのERDF培地を加え、リンパ球を懸濁し、4×106細胞/mlとなるように調製した。

0024

D.細胞培養の条件
96ウェルプレート(Falcon)に、A.で調製した試料溶液を100μl、B.で調製した免疫賦活液を50μl、Cで調製したリンパ球懸濁液50μlを注入し、37℃、5%CO2/95%Airに調整した培養器(アステック社 ACI−165)内で、10日間培養した。

0025

細胞回収
上記の96ウェルプレートの各ウェルからピペットマン(Gilson P−200)を用いて100μlずつ上清を回収した。その細胞上清に、50μlのトリパンブルー溶液を加え、血球計算盤(ミナトメディカルKA−115ビルケンチュルク型)にて生細胞数と死細胞数をカウンターライオン事務機227−01)を用いて計測した。

0026

実施例3
IgE量のELISAによる測定

0027

10mlの15mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH 9.6)、5μlのヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体(タゴバイオソースAHI−1801)、5μlのヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体(タゴバイオソース AHI−1901)を混合したものを、96ウェルプレート(Nunc)に100μl/ウェルになるよう加え、室温で2時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、300μl/ウェルとなるようにPBS−0.05% Tween 20を加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を3回繰り返した。その後、300μl/ウェルとなるように1%BSA/PBSを加え、室温で2時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、PBS−0.05% Tween 20を300μl/ウェルになるように加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を3回繰り返した。1000ng/mlの標準IgE溶液から3倍希釈した標準希釈系列(333、111、37.0、12.3、4.12、1.37、0.46、0.152ng/ml)を作製し、標準希釈系列または回収した培養上清を各々50μl/ウェルになるようにウェルに加え、室温で2時間静置した後、ウェル溶液を廃棄した。その後、300μl/ウェルとなるようにPBS−0.05% Tween20を加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を3回繰り返した。次に、10mlの1% BSA/PBSと5μlのHRP−コンジュゲート抗ヒトIgEポリクローナル抗体を混合し、100μl/ウェルになるよう各々のウェルに加え、室温で2時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、PBS−0.05% Tween 20を300μl/ウェルになるように加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を3回繰り返した。そして4.5mlのクエン酸緩衝液(pH 4.0)(0.1Mクエン酸、0.0003%H2O2)に0.50mgのABTS(Wako 018 10311)を溶解して作製した液を50μl/ウェルになるように加えた後、プレートリーダー(Nalge Nunc. NJ2300)にて419nm(Sub.490nm)の吸光度を15分後、30分後、45分後に測定した。各培養上清からのIgEは標準IgEをプロットした検量線から求めた。生細胞の割合から、IgE量の補正を行った。結果の一部を表1に示した。

0028

【表1】
表1により、コラーゲンペプチドや蜂蜜などにはIgE抗体産生抑制効果が20〜30%見られた。

0029

実施例4
リンパ球と同一ヒト由来の血漿を用いた場合のIgE産生
ヒトリンパ球と同じヒト由来の血漿を使用した場合の効果を検討するため、被験者4人から採取したリンパ球と血漿を用いて、上述の手順により、IgE抗体産生濃度を測定し、結果を表2に示した。

0030

【表2】
表2により、リンパ球と同一のヒト由来の血漿を用いた場合のIgE産生誘導の効果は、他人由来の血漿を用いた場合に比し高いことが示された。

0031

実施例5
血漿の濃度の検討
上述の試験に用いるヒト血漿についての、最適濃度の検討を行った。培養液に加えるヒト血漿の濃度をそれぞれ0%、5%、10%、及び20%として、上述の手順に従って試験を行い、結果を表3に示した。

0032

【表3】
表3より、IgE産生に最適なヒト血漿濃度は10%であることが示された。

0033

実施例6
培養スケールの検討
食品成分のIgE抗体産生抑制効果を確認するための、IgE抗体の産生に最適な培養スケールの検討を行った。5%濃度の牛胎児血清及び、10%濃度のヒト血漿を含むERDF培地中に1×106細胞/mlのヒト末梢血リンパ球を懸濁し、MDP(10μg/ml)(Cemicon International AR004)、IL−2(10ng/ml)(Genzyme Techne,2202)、IL−4(10ng/ml)(Genzyme Techne,2204)、IL−6(10ng/ml)(Genzyme Techne,2206)、抗原となるコナヒョウダニ抽出物(100ng/ml)(LSL社LG−5339)を加えて、37℃の5%CO2インキュベータ(アステックACI−165)で10日間培養した。結果を表4に示した。

発明を実施するための最良の形態

0034

【表4】
表4に示したように培養培地に種々の免疫賦活剤を加えることによりIgE抗体が誘導されることを確認した。これにより、24ウェル、96ウェル培養プレートのいずれも、免疫賦活剤を加えることにより同等のIgE抗体が産生されるが、96ウェル培養プレートの方が、IgE抗体産生量の増加割合が高いことが示された。

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