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課題・解決手段

本発明はライゲーション可能末端を有する非ランダムに産生されたヌクレオチド断片ベクタークローニングすることにより核酸およびポリヌクレオチドライブラリーを調製する方法に向けられている。ポリヌクレオチド発現はそれによりポリヌクレオチドライブラリーをスクリーニングするための間接的な手段を提供する。

概要

背景

概要

本発明はライゲーション可能末端を有する非ランダムに産生されたヌクレオチド断片ベクタークローニングすることにより核酸およびポリヌクレオチドライブラリーを調製する方法に向けられている。ポリヌクレオチド発現はそれによりポリヌクレオチドライブラリーをスクリーニングするための間接的な手段を提供する。

目的

それゆえ、ある商業上の必要性(例えばある特定のセットの商業上の処理条件下において機能できる分子に関する必要性)を満たすために、自然進化が提供してきたおよび/または近い将来提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
1件

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請求項1

それにより祖先鋳型のセットがシャッフリングされ、子孫ポリヌクレオチド分子および対応するようにコードされたポリペプチドライブラリーを産生することができ、かつそれにより子孫ポリヌクレオチドライブラリーのスクリーニングが望ましい特性を有する望ましい種を同定する手段を提供する、全体の非ランダム集合順序を有するキメラ核酸分子のライブラリーを非確率論的に産生する方法であり、(a)相互に互換性のあるライゲーション可能末端を有する複数の核酸構築ブロックを非ランダムに産生する段階;および(b)設計された全体の集合(assembly)順序が達成されるように核酸構築ブロックを集合させる段階を含む方法。

請求項2

それにより祖先鋳型のセットがシャッフリングされ、子孫ポリヌクレオチド分子および対応するようにコードされたポリペプチドのライブラリーを産生でき、かつそれにより子孫ポリヌクレオチドライブラリーのスクリーニングが望ましい特性を有する望ましい種を同定するための方法を提供する、設計により選抜された全体の集合順序を有するキメラ核酸分子の1つ又は複数の分類からなる、規定された数の分類からなる非確率論的にライブラリーを産生する方法であり、以下の段階を含む方法:(a)相互に互換性のある有用なライゲーション可能末端を有する特定の核酸構築ブロックセットを各分類について設計により産生する段階;および(b)設計された全体の集合順序が達成されるように該分類にしたがってこれらの核酸構築ブロックを集合させる段階を含む方法。

0001

発明の分野
本発明はタンパク質操作分野に関する。具体的には本発明はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製するための定方向進化法に関する。より具体的には本発明は、新規ポリペプチドが、それ自身が改良型生物学的分子である、および/または、別の改良型生物学的分子の産生に寄与するような、新規ポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドを産生するために突然変異導入を使用する方法に関する。さらにより具体的には、本発明は非確率論的ポリヌクレオチドキメラ化および非確率論的部位特異的点突然変異導入の両方を実施するための方法に関する。

0002

したがって、ある局面において本発明は、子孫ポリヌクレオチドの設計が親ポリヌクレオチドセットおよび/または親ポリヌクレオチドにより対応するようにコードされるポリペプチドの分析により導き出される、合成的および非確率論的な手段によりキメラポリヌクレオチド子孫セットを産生する方法に関する。別の局面においては、本発明は、網羅的、体系的および非確率論的な手段を用いて部位特異的突然変異導入を実施する方法に関する。

0003

さらに、本発明は、末端選抜(end−selection)と名づけられた過程によることを含む、産生された子孫分子セットの中から特に望ましい種からなるサブセットを選抜する段階に関し、サブセットはその後更にスクリーニングされうる。本発明はまた、ポリペプチドおよび/または有用な特性を有する発現された別の生物学的分子を産生するためのポリヌクレオチドセットをスクリーニングする段階に関する。

0004

本発明によりその製造が教示されている新規生物学的分子には、遺伝子、遺伝子経路、および、直接コードされるポリペプチドおよび/またはそのようなポリペプチドにより影響をうける任意の分子を含む、それにより発現が影響をうける任意の分子が含まれる。上記新規生物学的分子には炭水化物、脂質、核酸および/またはタンパク質成分を含有するものが含まれ、これらに限定されないが、具体的なこれらの例には抗生物質、抗体、酵素ならびにステロイド性ホルモンおよび非ステロイド性ホルモンが含まれる。

0005

ある特定の非制限的局面においては、本発明は、酵素、特に耐熱性酵素、および定方向進化によるそれらの産生に関する。より詳細には、本発明は高温において安定であり低温において改良された活性を有する耐熱性酵素に関する。

0006

発明の背景
解決すべき課題の一般的概要
簡単な要約
自然の多様性の完全な潜在力(potential)を得る段階は、発見段階および発見されたものの最適化段階の両方を含むことができることは、即座に理解される。例えば発見段階は商業的な有用性を有する生物学的分子を採掘することを可能にする。生物多様性の完全な富を得る、すなわち広範囲環境条件から生物学的分子を採掘する能力は、商業応用において見出されうる極限環境を含む多様な条件下において機能するよう適合された新規分子を発見する能力は必須であることは即座に理解される。

0007

しかし、特定の商業上の必要性に正確に方向付ける自然の選抜および/または生存のための基準はごくたまにしか存在しないこともまた即座に理解される。代わりに、未達成である特定の商業上の必要性をみたすために、天然の分子がある一定量の変化−微調整から全面的な変更まで−を必要とすると考えられる場合ががしばしばある。それゆえ、ある商業上の必要性(例えばある特定のセットの商業上の処理条件下において機能できる分子に関する必要性)を満たすために、自然進化が提供してきたおよび/または近い将来提供する可能性があるものを超えた特性を達成するために天然に発現した分子を実験的に変更することが、しばしば有利である。

0008

生物学的分子を望ましい特性へと実験的に変更する、定方向進化と名づけられた方法は、1つ又は複数の親分子鋳型に突然変異導入する段階、および子孫分子の中から任意の所望の分子を同定する段階により達成されうる。定方向進化において現在利用可能な技術には、確率論的(すなわちランダムな)突然変異導入を達成するための方法および非確率論的(非ランダムな)突然変異導入を達成するための方法が含まれる。しかし両方の種類の方法における重大な不足点が、本開示において同定されている。

0009

前置きとして、ある客観的視点から考慮されるならば、全ての突然変異導入は非確率論的であり、かつさらに、ある客観的な視点から考慮されるならば、全宇宙は非確率論的な過程を経ていると、哲学的に主張する者がいるかもしれないことは注目すべきである。これが真実であるかどうかは本考察の範囲外である。したがって、本明細書で用いられているように、「ランダム性」、「不確実性」および「予測不可能性」という用語は主観的な意味を有しており、実験過程の設計者の知識、特に予測知識が、その過程が確率論的または非確率論的であるかの決定因子である。

0010

説明のために、事前決定されていない変異を有する子孫分子セットを得るために祖先分子鋳型が変異される(変更されるまたは変化される(change))状況により、確率論的又はランダムな突然変異導入が例示されている。それゆえインビトロ確率論的突然変異導入反応においては、例えば、その産生が意図されているような特定の事前決定産物は存在せず、むしろ、達成される変異の正確な性質に関して、かつそれゆえ産生される産物に関しても、不確実性、それゆえにランダム性が存在する。対照的に、1つ又は複数の事前決定変異を有する子孫分子を得るために祖先分子鋳型が変異される(変更されるまたは変化される)状況により、非確率論的又は非ランダムな突然変異導入が例示されている。分子処理が起こる多くの反応においてある量のバックグラウンド産物の存在が現実であること、およびこれらのバックグラウンド産物の存在は事前決定産物を有する突然変異導入過程の非確率論的性質を減少させないことは理解される。

0011

従って、本明細書で用いられているように、確率論的突然変異導入は、達成される変異がランダムであるか事前決定されていない、エラープローン(error−prone)PCRおよび確率論的シャッフリング等の過程において示されている。対照的に、本明細書で用いられているように、非確率論的突然変異導入は、意図された産物の正確な化学構造が事前決定されている、遺伝子部位飽和性突然変異導入および合成ライゲーション再集合等の、本発明で開示された過程において示されている。

0012

要するに、既存の非確率論的突然変異導入法は、方法の適用ごとに1つから非常に少数の事前決定変異を産生するために役立ち、それゆえ事前決定された分子構造を有する1つからごくわずかな数の子孫分子を方法の適用ごとに産生する。さらにこれらの非確率論的方法の適用により現在利用可能な変異の種類もまた制限されており、それゆえ子孫変異分子の種類も制限されている。

0013

対照的に、本質的に確率論的な既存の突然変異導入法は、ランダムな様式を介し、かつ多数のしかし望ましくないバックグラウンド化合物不可避な分割(contigency)を通常伴うが、方法の適用ごとに若干多い数の変異を産生するために役立つ。それゆえ、これらの既存の確率論的方法は、方法の適用ごとに未決定の分子構造を有するが、より多数の子孫分子を産生することができる。これらの現在の確率論的方法の適用により達成可能な変異の種類もまた制限されており、したがって子孫変異分子の種類も制限されている。

0014

以下のような、非確率論的突然変異導入法の開発が必要であることは即座に理解される:
1)事前決定された分子構造を有する多数の子孫分子を産生するために使用することが可能である;
2)より多くの種類の変異を容易に産生するために使用することが可能である;
3)より多様な子孫変異分子を産生することが可能である;
4)不要バックグラウンド産物の産生を減少させる;
5)全ての可能性に関して網羅的な方法において使用することが可能である;及び
6)体系的かつ非反復的な方法により子孫分子を産生することが可能である。

0015

本発明はこれらの必要性を全て満たす。

0016

定方向進化は自然進化を補う
自然進化は定方向進化又は実験的進化の出発点であり、模倣すべき方法および突然変異導入されるべき分子鋳型の両方の宝庫としてはたらく。(好ましいおよび/または許容される突然変異導入過程の種類において)その過程に関連する本質的な限界およびその速度にも関わらず、自然進化は数百万年間の過程および多様な環境全体を通して進行中であるという優位点を有していることは理解される。したがって自然進化(自然における、分子突然変異導入および選抜)は、ある商業応用において有用性が示されている豊富生物学的化合物の産生をもたらしてきた。

0017

しかし未達成である多くの商業上の必要性は、自然に見出される任意の進化上の圧力および/または方向とは一致しないことが即座に理解される。さらに、商業上有用な変異が天然の分子レベルにおいてその他の点で好ましくない場合、(好ましい変異が有害変異に付随するとき等の様に)例えば全体として生物体に対して併発する害がある場合、自然進化はそのような変異の正選抜をしばしば優先する(override)ケースがよくある。その上、自然進化は遅いことが多く、多くの複製腫において正確性を好む。さらにその上、自然進化は連続した有益な変異により主に開かれた経路を好むことが多く、一方、負の変異が組み合わされると恩典を証明しうるか、又は回り道を介して有益な最終的状態を導きうるとしても、複数の連続したそのような負の変異を避ける傾向がある。

0018

さらに自然進化は特定の段階(例えば特異的突然変異導入および選抜過程)を介して、あまり好ましくない段階を避けながら進行する。例えば、多くの核酸は作用環境においてキメラ化もしくは取り込みまたは、ある種から別の種へのその他の種類の移転を受けるのにかろうじて十分な互いの近傍には到達しない。それゆえ、例えば特定の2つの種間の性交が天然では避けられている場合、分子間遭遇およびDNA交換の非常に遅い経路の一例としてはたらく、2種に共通の寄生虫を用いたこれら2種由来の核酸のキメラ化は、同様に可能性が低い。他の例として、自己毒性もしくは自己致死または性的不能を引き起こす分子の産生は自然では避けられている。さらに別の例としては、生物体に特定の迅速な利益を有さない分子の増殖(propagation)は、生物体の次世代において消失されやすい。さらに、例えば内在性環境においてそれが暴露されているもの以外の条件下において分子の性能を改良するための選択圧が存在しない、例えば細胞質分子が細胞質内においてそれに必要とされるものを超えて進展した機能特性を獲得する可能性は低い。その上さらに、生物学的分子の増殖は、それ自身により引き起こされるかどうかにかかわらず、その生態系に対する任意の全体的な有害効果にも感受性である。これらおよびその他の特性は自然において増殖可能である変異の種類を大きく制限する。

0019

一方、特に本明細書中で提供されるような、定方向(または実験的)進化はよりずっと迅速に実施されうり、自然がそれを提供しないおよび/または提供する可能性が低いところの商業的に望ましい事前決定された分子特性を進化させる点により効率的な様式で方向付けられうる。さらに本明細書において提供される定方向進化発明は、突然変異導入および選抜過程において使用することができる種類の段階においてより広範囲の可能性を提供することができる。したがって天然に得られた鋳型を用いて、本定方向進化発明は、産生されうる子孫分子の種類においておよびそれらが産生されうる速度において、しばしば自然自身が同じ期間において期待されるかもしれないよりも、より広範囲の可能性を提供する。

0020

ある特定の例示においては、本発明において開示された定方向進化法は、自然では増殖する(すなわち産生されるおよび/または選抜される)可能性が低いと考えられるが、自然進化では達成不可能である望ましい下流突然変異導入産物の産生をもたらしうる、子孫分子の結合(例えば連続したセットの子孫分子を含む)を産生するために反復して適用されうる。

0021

以前の定方向進化法は最適以下(suboptimal)である
突然変異導入は過去多くの機会において、しかし本発明の目的にとって不適切である方法によって、実施されてきた。例えば、過去に記載された非確率論的方法は(しばしば単に単独の子孫分子からなる)非常に小さな子孫分子セットのみの産生において役に立った。説明のために、各断片が別々の祖先(又は親)分子に由来するような、制限酵素により産生された互換的な粘着末端を用いて2つのポリヌクレオチド断片を連結することによりキメラ遺伝子が作製された。別の例は、ある単一の部位突然変異導入ポリヌクレオチドをコードする、単一の子孫ポリヌクレオチドを産生するために、親ポリヌクレオチドにおける単一コドン部位の突然変異導入(すなわち、コドン置換、付加または欠失を達成するための)であってもよい。

0022

以前の非確率論的方法は、方法の適用ごとに1個から数個の変異の産生において役立つに過ぎなかった。それゆえ、以前に記載されたこれらの非確率論的方法は本発明の中心的目標の一つ、すなわち核酸の網羅的および非確率論的なキメラ化に応えることができない。したがって以前の非確率論的方法は、非常に望ましい子孫分子の産生につながりうる、潜在的な点変異、キメラ化、およびそれらの組み合わせの大部分を未開発のまま残している。

0023

対照的に、確率論的方法は、非確率論的方法よりも多数の点変異および/またはキメラ化を達成するために使用されてきた。この理由から、確率論的方法は、スクリーニングに供されうる子孫分子セットを産生するための、かつその中で所望の分子種がうまくいけば発見されうる、最も有力なアプローチを含んでいた。しかし、これらのアプローチの大きな欠点は、それらの確率論的性質のために、産生される子孫分子の各セットの正確な(exact)構成成分にランダム性が存在することである。したがって実験者は、通常ある特定の反応容器内において、どの正確な子孫分子種が示されているかについてその産生前にはほとんどまたは全くわからない。それゆえ、(例えば望ましい子孫分子の探索の続行中において)確率論的手法が反復される時、以前に破棄された望ましくない分子種の再産生および再スクリーニングは、進行に対する労働集約的な障害となり、環状ではないとしても、遠回りの経路がとられることになる。それらの分子構造を同定するために塩基配列決定等の労働負担的(labor−incurring)過程に、確率論的に産生された子孫分子セットを供することにより、しかしこれでさえ不完全救済法ではあるが、そのような非常に最適以下の経路の欠点は処理されうる。

0024

さらに現在の確率論的方法は、ある特定の変異分類内における全ての分子種を包括的にまたは網羅的に産生すること、ある鋳型分子(例えばある特定の一つのアミノ酸部位または、2つもしくはそれ以上のアミノ酸部位からなる配列)における特定の構造基に機能性を帰すること、および特定の変異分類を分別および比較することのためには非常に不適である。したがって、現在の確率論的方法は不要な突然変異導入結果を体系的に除去することが本質的にできず、かつ要するに本質的な欠点が多すぎて定方向進化に最適化できないことが負担となっている。

0025

非制限的局面においては、親鋳型において全ての可能な点変異を包括的および網羅的に産生するための非確率論的手段を提供することにより、本発明はこれらの問題に取り組む。別の非制限的局面においては、本発明はさらにキメラ化群内における全ての可能なキメラ化を網羅的に産生するための手段を提供する。したがって前述の課題は本発明により解決される。

0026

本発明により取り組まれる技術的眺望における具体的な欠点は、以下を含む:1)精度又は忠実度の低いPCRのような部位特異的突然変異誘発技術は、ポリペプチド配列上の各位置(部位)において、完全な(飽和状態の)種類の可能な突然変異(即ち、全ての可能なアミノ酸置換)を系統的に達成するために有効でない;
2)分子配列に含まれ、そして一つ又は複数の分子鋳型の定方向進化により得られると想像されるおそらく膨大な数の子孫分子に含まれうる大量の情報を、迅速に分析するための比較的容易な系統的手段が存在しない;
3)分子の位置について、構造と機能とを関係付け総合的な経験的情報を提供するための比較的容易な系統的手段が存在しない;
4)ある種の突然変異誘発(例えば、キメラ化)法における主要な段階のための、陽性対照などの内部対照を組み込むための容易な系統的手段が存在しない;及び
5)より小さい部分配列の中から、全長キメラのような子孫分子の特異的な群を選択するための容易な系統的手段が存在しない。

0027

有用なハイブリッドタンパク質及びこれらのハイブリッドタンパク質をコードする対応する生物学的分子、即ちDNA、RNAを作製するための、タンパク質内のアミノ酸の意図的及びランダムな組み合わせには、極めて多数の可能性が存在する。従って、そのような極めて多様なハイブリッドタンパク質、特に、多様性の大きいランダムタンパク質を作製し、所望の有用性に関してそれらをスクリーニングする必要が存在する。

0028

生物学的高分子(例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の両方を含む分子)の活性配列の複雑度は、情報含有量(information content)(「IC」)と呼ばれている。ICとは、活性タンパク質アミノ酸配列変動に対する抵抗性同一機能を有する関連配列ファミリーを記載するために必要な不変アミノ酸の最小数ビット)から計算される)と定義されている。ランダム突然変異誘発に対する感受性が比較的高いタンパク質は、高い情報含有量を有する。

0029

分子ライブラリーのような分子生物学発達は、極めて多数の可変塩基の同定を可能にし、さらに、ランダムライブラリーから機能的配列を選択するための方法をも提供した。そのようなライブラリーにおいて、大部分の残基が、状況における補正変化に依存して変動しうる(ただし、典型的には、全て同時ではない)。従って、100アミノ酸のタンパク質は、異なる突然変異を2,000個しか含有できないが、20100個の配列組み合わせが可能である。

0030

情報密度(information density)とは、配列の単位長さ当たりのICである。酵素の活性部位は、高い情報密度を有する傾向がある。対照的に、酵素内の情報のフレキシブルリンカーは、低い情報密度を有する傾向がある。

0031

ライブラリー形式で別タンパク質を作製するために広範に使用されている現在の方法は、エラープローン(error−prone)ポリメラーゼ連鎖反応、及び最適化すべき特異的領域を合成的に突然変異誘発されたオリゴヌクレオチドと交換するカセット突然変異誘発である。いずれの場合においても、最初の配列内のいくつかの部位の周辺に、実質的な数の変異部位が生成する。

0032

エラープローンPCRは、低レベルの点突然変異を長い配列へとランダムに導入するための忠実度の低い重合条件を使用する。未知の配列を有する断片の混合物においては、エラープローンPCRが、混合物を突然変異誘発するために使用されうる。発表されているエラープローンPCRプロトコルにおいては、ポリメラーゼの低い進行度(processivity)が問題となる。従って、そのプロトコルは、平均的なサイズの遺伝子のランダム突然変異誘発をもたらすことができない。そのため、エラープローンPCRの実際の適用は制限されている。点突然変異のみでは、あまりに逐次的であるため、継続的かつ劇的な配列進化に必要な大規模ブロック変化を可能にし得ない場合が多いことが、いくつかのコンピュータシミュレーションにより示唆されている。さらに、発表されているエラープローンPCRプロトコルでは、0.5から1.0kbより大きいDNA断片増幅することができず、実際の適用は制限されている。さらに、エラープローンPCRのサイクルを繰り返すことにより、結合親和性ではなくタンパク質の免疫原性に影響を与えるような望ましくない結果を有する中性的な突然変異が蓄積しうる。

0033

オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発においては、短い配列が、合成的に突然変異誘発されたオリゴヌクレオチドと交換される。この手法は、離れた突然変異の組み合わせを生成させず、従ってコンビナトリアルではない。膨大な配列長と比較すると限定されているライブラリーサイズは、タンパク質を最適化するために多くの回数の選択が不可欠であることを意味する。合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発には、各回の選択の後、個々のクローン配列決定し、続いてそれらをファミリーに分類し、単一のファミリーを任意に選択し、コンセンサスモチーフへと縮小することが必要である。そのようなモチーフが、再合成され、単一遺伝子へと再挿入され、続いてさらなる選択を行われる。この段階は、統計的な障害物を構成し、大きな労力を要し、多くの回数の突然変異誘発にとっては実用的でない。

0034

従って、エラープローンPCR及びオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、配列微調整の単一サイクルにとっては有用であるが、複数のサイクルに適用する場合には急速に限定されたものとなる。

0035

エラープローンPCRのもう一つの限界は、ダウンミューテーション(down−mutations)の速度が、配列の情報含有量と共に増大するという点である。情報含有量、ライブラリーサイズ、及び突然変異誘発速度が増大するにつれ、ダウンミューテーションとアップミューテーション(up−mutations)との均衡が、さらなる改良の選択を統計的に妨害するであろう(統計的上限)。

0036

カセット突然変異誘発においては、単一鋳型の配列ブロックが典型的には(部分的に)ランダム化された配列と交換される。従って、入手されうる最大情報含有量が、ランダム配列の数(即ち、ライブラリーサイズ)によって統計的に制限される。これは、現在は最良でないが、長期的には大きな潜在能力を有するかもしれない、その他の配列ファミリーを除去する。

0037

また、合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発は、各回の選択後の個々のクローンの配列決定を必要とする。従って、そのような手法は、面倒であり、多くの回数の突然変異誘発にとっては実用的でない。

0038

従って、エラープローンPCR及びカセット突然変異誘発は、比較的低い情報含有量の区間を微調整するためには最も適しており、広範に使用されている。一つの明らかな例外は、エラープローンPCR及び選択による多くの回数の増幅を使用した、ランダムライブラリーからのRNAリガーゼリボザイムの選択である。

0039

天然において、大部分の生物の進化は、天然の選択及び有性生殖により起こる。有性生殖は、選択された個体の子孫における遺伝子の混合及び組み合わせを確実にする。減数分裂においては、親からの相同染色体が、長さに沿って互いに整列し、一部を交差することによって、遺伝材料をランダムにスワッピングする。そのようなDNAのスワッピング又はシャッフリングは、生物がより迅速に進化することを可能にする。

0040

組換えにおいては、挿入配列相同な環境において有用性を有することが立証されたため、挿入配列は、新たな配列に挿入された後も、実質的な情報量を有している可能性が高い。

0041

理論的には、100アミノ酸のタンパク質には2,000個の異なる単一変異体が存在する。しかしながら、100アミノ酸のタンパク質は20100個の可能な配列組み合わせを有し、この数は、従来の方法により徹底的に検索するには大きすぎる。これらの可能な組み合わせ突然変異の全てを生成させ、スクリーニングすることを可能にするであろう系を開発することは、有利であると考えられる。

0042

当技術分野における数人の研究者は、ファージ系における発現のため、軽鎖抗体遺伝子重鎖抗体遺伝子とを組み合わせたハイブリッドを生成させるため、インビボ部位特異的組換え系を利用している。しかしながら、それらの系は、特定の組換え部位に依存しており、従って限定されている。オーバーラッピング伸長及びPCRによる、一本鎖抗体(scFv)における抗体CDR領域の同時突然変異誘発が、報告されている。

0043

ランダムインビボ組換えを使用して、複合ハイブリッドの大集団を生成させるための方法も記載されている。この方法は、それぞれが異なる選択可能マーカーを有する2つの異なるプラスミドライブラリーの組換えを必要とする。その方法は、存在する選択可能マーカーの数と等しい有限の組換え数に限定されており、選択された(一つ又は複数の)配列と連結したマーカー遺伝子の数を同時に直線的に増加させる。

0044

2つの相同であるが短縮されているプラスミド上の昆虫毒素遺伝子間のインビボ組換えが、ハイブリッド遺伝子を作製する方法として報告されている。ハイブリッド分子形成をもたらす、欠陥ミスマッチ修復酵素を有する宿主細胞における、実質的にミスマッチDNA配列のインビボ組換えが、報告されている。

0045

発明の概要
本発明は一般に、核酸工学の分野に関し、対応してコードされた組換えタンパク質工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、核酸の定方向進化、並びに進化した核酸を含有するクローンの、結果的な目的の(一つ又は複数の)活性、例えば核酸の(一つ又は複数の)活性、及び/又は特定のタンパク質、特に酵素の目的の(一つ又は複数の)活性に関するスクリーニングに関する。

0046

本発明により提供される突然変異導入分子は、炭水化物、脂質、核酸および/またはタンパク質成分を含有する生物学的分子を含み、具体的なこれらの例は抗生物質、抗体、酵素ならびにステロイド性ホルモンおよび非ステロイド性ホルモンを含むがこれらに限定されない、キメラ分子および点変異を有する分子を有しうる。

0047

本発明は一般に、1)一つ又は複数の先祖又は親世代鋳型から、少なくとも一つの点突然変異、付加、欠失、及び/又はキメラ化を達成するため突然変異誘発された子孫世代分子(または複数)(ポリヌクレオチド配列を含む分子、ポリペプチド配列を含む分子、一部にポリヌクレオチド配列を含み一部にポリペプチド配列を含む分子を含む)を調製し、2)(酵素活性の改良、又は安定性の増加、又は新規な化学療法的効果のような)少なくとも一つの目的の特性に関して、好ましくはハイスループット法を使用して、子孫世代分子(または複数)をスクリーニングし、3)場合によって、親及び/又は子孫世代分子に関する構造的及び/又は機能的な情報を入手及び/又は目録化し、4)場合によって、段階1)から3)を繰り返す方法に関する。

0048

好ましい態様において、あらゆるコドン(又は同一アミノ酸をコードする縮重コドンのあらゆるファミリー)が各コドン位置において表されるよう、各々、最大3個の連続的な点突然変異(即ち、新たなコドンを構成する異なる塩基)を少なくとも一つ有するポリヌクレオチドの子孫世代が、(例えば、親ポリヌクレオチド鋳型から)、「コドン部位飽和突然変異誘発」という名称のものにおいて作製される。このポリヌクレオチドの子孫世代に対応して、そしてそれらにコードされて、各々、単一アミノ酸点突然変異を少なくとも一つ有する子孫ポリペプチドのセットも作製される。好ましい局面において、ポリペプチド上の全ての各アミノ酸位置における19種の天然にコードされたポリペプチド形成アルファ−アミノ酸置換それぞれについての、そのような一つの変異ポリペプチドが、「アミノ酸部位飽和突然変異誘発」という名称のものにおいて作製される。これは、親ポリペプチド上の全ての各アミノ酸位置について、最初のアミノ酸を含め全部で20種の異なる子孫ポリペプチドを与え、又は20種の天然にコードされたアミノ酸の代わりに、又はそれらに加えて、付加的なアミノ酸が使用される場合には、21種より多い子孫ポリペプチドを与えるかもしれない。

0049

従って、もう一つの局面において、この手法は、20種の天然にコードされたポリペプチド形成アルファ−アミノ酸に加え、かつ/又はそれらと組み合わせて、その他の稀にコードされ、かつ/又は天然にはコードされないアミノ酸及びアミノ酸誘導体を含有する変異体を生成させるためにも使用されうる。さらにもう一つの局面において、この手法は、適当な宿主の天然又は未改変のコドン認識系に加え、かつ/又はそれらと組み合わせて、改変、突然変異誘発、及び/又は設計されたコドン認識系(例えば、一つ又は複数のtRNA分子を有する宿主細胞)を使用することにより変異体を生成させるためにも使用されうる。

0050

さらにもう一つの局面において、本発明は、組換えに関し、より具体的には、部分的相同性を有する領域を含有するポリヌクレオチド配列のインビボ再類別の方法により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、少なくとも一つのポリヌクレオチドを形成させるためポリヌクレオチドを集合し、有用な特性を有する(一つ又は複数の)ポリペプチドの産生のためのポリヌクレオチドをスクリーニングするための方法に関する。

0051

さらにもう一つの好ましい態様において、本発明は、現在の技術により可能になった任意の分子特性(例えば、酵素活性)又は特性の組み合わせに関して、達成された任意の突然変異的変化(特に飽和突然変異導入を含む)の効果を分析し、目録化するためにも使用されうる。従って、親ポリペプチド内の各アミノ酸を、少なくとも19種の可能な各置換へ変化させることの効果を決定するための総合的な方法が提供される。これは、親ポリペプチド内の各アミノ酸を、特徴決定し、ポリペプチドの測定可能な特性に対する潜在的な効果のスペクトルに従い目録化することを可能にする。

0052

もう一つの局面において、本発明の方法は、分子を組換え、かつ/又は配列の複雑度、及び相同領域を保持する反復的もしくは連続的な配列の程度を減少させる減少過程を媒介する細胞の天然の特性を利用する。

0053

本発明の目的は、増強された活性を有する生物学的活性ハイブリッドポリペプチドをコードするハイブリッドポリヌクレオチドを生成させるための方法である。これら及びその他の目的を達成するため、本発明の一つの面に従い、ポリヌクレオチドを適当な宿主細胞へと導入し、ハイブリッドポリペプチドを産生する条件下で宿主細胞を増殖させる方法が提供された。

0054

本発明のもう一つの局面において、本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた生物学的活性ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングするための方法を提供する。本発明は、増強された生物学的活性を有する、生物学的活性ハイブリッドポリペプチドの同定を可能にする。

0055

本発明の別の局面によると、本明細書で提供されている合成ライゲーション再集合法の重要な利点は、整列化されうり、かつライゲーション再集合に供されうる開始鋳型は全長遺伝子に制限されないことである。事実、ゲノム配列を扱う場合、部分遺伝子配列がしばしば得られ、これらは本発明に従いライゲーション再集合に供されうる。

0056

本発明の重要な局面において、本発明のために役立つ核酸構築ブロックは、合成的手段によって、また一方、ポリメラーゼに基づくインビボもしくはインビトロの方法によって、また一方、合成的手段およびポリメラーゼに基づく方法の組み合わせにより産生うることが、本明細書において理解される。核酸取り込みエラーの可能性は各方法によって異なる。そのようなエラーの中のいくつかは、時々望ましくないかもしれない。例えば、核酸構築ブロック産生において単一ヌクレオチド誤りが存在すると、望ましくない終止コドンの導入がもたらされうる。望ましくない核酸取り込みエラーを取り除くために、いくつかの事前スクリーニング法が使用されうることが理解される。例えば、最終構築物は、不要な内部終止コドンの非存在下においてのみ産生されるGFPまたは6×His標識等のレポーター配列を含む融合タンパク質であることができる。核酸構築ブロックを産生するための全ての方法の選択は、考慮されている各方法のエラー率の考察に基づきうることが理解される。

0057

さらに、本発明によると、核酸構築ブロックは一重鎖または二重鎖ポリヌクレオチドであってよい。したがって、本発明によるライゲーション再集合は非合成核酸構築ブロックと同様合成核酸構築ブロックまたはそれらの組み合わせを用いて実施されうる。さらに一重鎖ポリヌクレオチドおよび二重鎖ポリヌクレオチドの両方が、相互排他的にまたは組み合わせてのいずれかでライゲーション再集合に使用されうる。

0058

本発明の別の局面において、平滑末端核酸構築ブロックが平滑末端の変更なしに使用されてもよく、また一方、合成ライゲーション結合のために役立つ突出を作製するために、例えばエキソヌクレアーゼIII等のエキソヌクレアーゼを用いた処理に供されてもよい。そのような処理は簡潔であり、例えばエキソヌクレアーゼIIIが動作可能な温度に使用試料を供してその後急速に冷却することにより、制御されうる。ライゲーション再集合の全ての局面において、T4DNAリガーゼ等のリガーゼ処理は、任意の段階である。

0059

特定の態様において、本発明は設計により選抜される全体の集合順序を有するキメラ核酸分子のライブラリーを非確率論的に作製する方法であり、以下の段階を含む方法を提供する:
(a)利用可能な相互互換性ライゲーション可能末端を有する複数の特定の合成核酸構築ブロックを設計により産生する段階;および
(b)設計された全体の集合順序が達成されるようにこれらの核酸構築ブロックを集合させる段階。それによって、祖先鋳型セット、例えば遺伝子(例えばエステラーゼ遺伝子ファミリー)または(たとえば抗生物質をコードする)遺伝子経路がシャッフリングされて子孫ポリヌクレオチド分子のかなり大きなライブラリー(例えば10100)および対応するコードされたポリペプチドが産生されうり、かつそれによって、子孫ポリヌクレオチドライブラリーの発現スクリーニングが、商業応用に役立つ特定の酵素活性等の所望の特性を有する所望の種を同定するための手段が提供される。

0060

設計により選抜された全体の集合順序を有するキメラ核酸分子の一またはそれ以上の分類からなる、規定された数の分類からなるライブラリーを非確率論的に産生する方法であり、以下の段階を含む方法もまた含まれる:
(a)利用可能な相互互換性ライゲーション可能末端を有する特定の核酸構築ブロックセットを各分類についての設計により産生する段階;および
(b)設計された全体の集合順序が達成されるように、該分類によりこれらの核酸構築ブロックを集合させる段階。それによって、祖先鋳型セット、例えば遺伝子(例えばエステラーゼ遺伝子ファミリー)または(たとえば抗生物質をコードする)遺伝子経路がシャッフリングされて子孫ポリヌクレオチド分子のかなり大きなライブラリー(例えば10100)および対応するコードされたポリペプチドが産生されうり、かつそれによって、子孫ポリヌクレオチドライブラリーの発現スクリーニングが商業応用に役立つ特定の酵素活性等の所望の特性を有する所望の種を同定するための手段が提供される。

0061

本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示すものであり、例示のためだけに与えられていることを理解されたい。なぜなら、本発明の本旨及び範囲の範囲内で様々な変化及び修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかとなろう。

0062

5. 用語の定義
本明細書で提供される実施例の理解を容易にするために、いくらかの頻出する方法および/または用語を記述する。

0063

薬剤」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、空間的に局在する化合物のアレイ(例えば、VLSIPSペプチドアレイポリヌクレオチドアレイ、および/または組み合わせ小分子アレイ)、生物高分子バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリー、バクテリオファージ抗体(例えば、scFV)ディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディスプレイライブラリー、もしくは細菌、植物、菌類、もしくは動物(特にほ乳類)細胞または組織のような生物材料から作成された抽出物を示すために、本明細書において用いられる。薬剤は、下述のスクリーニングアッセイにおいて封入による抗新生物抗炎症またはアポトーシス調節物として潜在活性について評価される。薬剤は、下述のスクリーニングアッセイにおける封入による特異的なタンパク質相互作用阻害剤として可能性のある活性について評価される(すなわち、あらかじめ測定された2つのペプチド間結合相互作用を選択的に阻害するが、実質的には細胞生存力を妨げない薬剤)。

0064

制限酵素部位における「あいまいな塩基要求」とは、最大限の程度まで特定されないヌクレオチド塩基の必要を示し、すなわち、それは特定の塩基ではなくが(非制限的な例示においてA、C、GおよびTから選択されるある特定の1塩基のような)、むしろ少なくとも2塩基またはそれ以上の塩基のうちいずれか1つであってもよい。 一般的に、当技術分野並びに本明細書において、塩基におけるあいまい性を示すための使用され、一般的に許容される省略は、以下を含む:R=GまたはA;Y=CまたはT;M=AまたはC;K=GまたはT;S=GまたはC;W=AまたはT;H=AまたはCまたはT;B=GまたはTまたはC;V=GまたはCまたはA;D=GまたはAまたはT;N=AまたはCまたはGまたはT。

0065

「アミノ酸」という用語は、アミノ基(−NH2)とカルボキシル基(−COOH)を含む任意の有機化合物を示し;好ましくは、遊離基としてまたは縮合後のペプチド結合の一部としてのどちらかを意味する。「20個の天然にコードされるペプチド形成α−アミノ酸」とは、当技術分野において以下を理解され、意味する:アラニン(alaまたはA)、アルギニン(argまたはR)、アスパラギン(asnまたはN)、アスパラギン酸(aspまたはD)、システイン(cysまたはC)、グルタミン酸(gluまたはE)、グルタミン(glnまたはQ)、グリシン(glyまたはG)、ヒスチジン(hisまたはH)、イソロイシン(ileまたはI)、ロイシン(leuまたはL)、リジン(lysまたはK)、メチオニン(metまたはM)、フェニルアラニン(pheまたはF)、プロリン(proまたはP)、セリン(serまたはS)、スレオニン(thrまたはT)、トリプトファン(trpまたはW)、チロシン(tryまたはY)、およびバリン(valまたはV)。

0066

「増幅」という用語は、ポリヌクレオチドのコピー数を増加することを意味する。

0067

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原エピトープに結合可能な免疫グロブリン分子、並びにFab、Fab’、(Fab’)2、Fv、およびSCA断片のような免疫グロブリン分子の断片を示す。これらの抗体断片は、それらの元となる抗体の抗原(例えば、ポリペプチド抗原)に選択的に結合するいくつかの能力を保持しており、これらの断片は当技術分野における周知の方法(例えば、前記のHarlowとLaneを参照のこと)を用いて作成されることができ、さらに以下に記述する。
(1)Fab断片は、抗体分子一価抗原結合断片からなり、酵素パパインで抗体分子全部の分解によって作成され、無傷の軽鎖と重鎖の一部からなる断片を作出することができる。
(2)抗体分子のFab’断片はペプシンで抗体分子全部を処理し、その後還元し、無傷の軽鎖と重鎖の一部からなる分子を作出することによって得ることができる。2つのFab’断片は、この方法で処理された抗体分子によって得られる。
(3)抗体の(Fab’)2断片は、抗体分子全部を酵素ペプシンで処理することによって、その後還元をすることなく得ることができる。(Fab’)2断片は、2つのジスルフィド結合によって1つになった2つのFab’断片の二量体である。
(4) Fv断片は、2つの鎖として示される軽鎖の可変部と重鎖の可変部を含む、遺伝子操作された断片である。
(5)一本鎖抗体(「SCA」)は、適当な柔軟なリンカーによって結合される軽鎖の可変部と重鎖の可変部を含む、遺伝子操作された一本鎖分子である。

0068

応用分子進化(Applied Molecular Evolution)(「AME」)という用語は、進化設計アルゴリズムの、特定の有用な目標への適用を意味する。AMEのための多くの異なるライブラリー形式がポリヌクレオチド、ペプチド、及びタンパク質(ファージ、lacI、及びポリソーム)に関して報告されているが、これらの形式はいずれも、コンビナトリアルライブラリー計画的に作製するためのランダム交差による組み合わせを提供していない。

0069

化学的特性」をもつ分子は、以下ような分子である:
1)1つ目の参照分子と部分的に相同性であり、かつ部分的に異種性である;
2)一方、2つ目の参照分子と部分的に相同性であり、かつ部分的に異種性であり;
3)また同時に、さらに1つまたはそれ以上の追加の参照分子と部分的に相同性であり、かつ部分的に異種性である可能性をあらかじめ排除していない分子である。非制限的な態様においては、キメラ分子は部分的な分子の配列を再集合させ構築することによって調製されてもよい。非制限的な局面においては、キメラのヌクレオチド分子は、結果として生じたキメラのポリヌクレオチドが大多数の鋳型の特性を持つように、多数の分子鋳型を用いてキメラのポリヌクレオチドを合成することによって調製してもよい。

0070

本明細書で使用される「同族の」という用語は、主観で進化的かつ機能的に関連のある遺伝子配列を示す。例えば、限定ではないが、ヒトゲノムにおいてヒトCD4遺伝子はマウス3d4遺伝子と同族遺伝子であり、その理由は、これら2つの遺伝子の配列と構造は、高い相同性を持ち、両遺伝子MHCクラスII限定抗原の認識を介したT細胞活性シグナリングの際に機能するタンパク質をコードすることを示していることである。

0071

本明細書で用いられる「比較ウインドウ」という用語は、少なくとも20個の隣接するヌクレオチドの位置の概念的部分であり、ポリヌクレオチド配列を少なくとも20個の隣接するヌクレオチドの参照配列と比較できる概念的部分であり、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部が2つの配列の最適なアライメントについて参照配列(追加又は欠失を含まない)と比較した場合、20%またはそれより少ない付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでもよい概念的部分である。比較ウインドウを整列するための配列の最適なアライメントを、スミス(Smith)の局所的相同性アルゴリズム(SmithとWaterman、Adv Appl Math、1981;SmithとWaterman、J Teor Biol、1981;SmithとWaterman、J Mol Bio、1981;Smithら、J Mol Evol、1981)によって、ニードルマンの相同性アライメントアルゴリズム(NeedlmanとWuncsch、1970)によって、ピアソン(Pearson)の相同性検索方法(PearsonとLipman、1988)によって、これらのアルゴリズムのコンピューター上の実行(Wisconsin Genetics Softwareパッケージ出品7.0、Genetics Computer Group、575サイエンスDr.、マディソン、ウィスコシン州におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または検査および選択される様々な方法によって作成された最もよいアルゴリズムによって行なってもよい。

0072

本明細書で使用される場合の「相補性決定領域」と「CDR」という用語は、超可変領域または高頻度可変性ループ(ChothiaとLesk、1987;Clothiaら、1989;Kabatら、1987;およびTramontanoら、1990)としても一般的に知られているカバット(Kabat)とコーシア(Chothia)CDR決定法によって例示されるような当技術分野で容認されている用語を示す。可変領域ドメインは、典型的には天然型免疫グロブリン鎖アミノ末端のおよそ105〜115のアミノ酸(例えば1番目から110番目までのアミノ酸)を含むが、それより多少短いかまたは長い可変領域は、一本鎖抗体の形成にも適当である。

0073

保存性アミノ酸置換」とは、同様の側鎖を有する残基が交換可能なことを示す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり;脂肪族ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンとスレオニンであり;アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンとグルタミンであり;芳香族側鎖側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり;塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり;かつ含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システインとメチオニンである。好ましい保存性アミノ酸の置換の群は以下である:バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミン。

0074

「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたはその一部に相同である(すなわち、同一であり、厳密には進化的には関連のない)ことを意味するために本明細書で使用される。それと対比して、「相補性」という用語は、相補性配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に相同性であるということを意味するために、本明細書で使用される。例証として、ヌクレオチド配列TATAC」とは、参照「TATAC」に対応し、参照配列「GTATA」と相補的である。

0075

「分解有効」量という用語は、酵素と接触しない基質と比較して、基質の少なくとも50%を処理するために必要とされる酵素量を示す。好ましくは、基質の少なくとも80%が分解される。

0076

本明細書で使用されるような「規定された配列のフレームワーク」という用語は、作為抽出原理によって、一般的には実験データまたは構造データを元に選択される1組の限定配列を示す;例えば、限定配列のフレームワークはβ−シート構造を形成すると予測される1組のアミノ酸配列を含んでもよく、または他の異型間でロイシンジッパー7つ組の繰返しモチーフ、ジンクフィンガードメインを含んでもよい。「限定配列カーナル(kernal)」とは、変動性について限定される範囲を含む1組の配列である。(1)20個の通常のアミノ酸の完全にランダムな10merの配列は、(20)10の配列のうちの任意のもので、かつ(2)20個の通常のアミノ酸の疑似乱数の10mer配列であることができるが、いくらかの位置および/または全体においてある残基のための偏りを示すと考えられるが、それに対して(3)各々の残基の位置が許容できる20個の通常のアミノ酸(および/または許容できる異例のアミノ酸/イミノ酸)のうちの任意のものであることが可能であった場合には、限定配列カーナルは、配列の部分集合である。定義された配列カーナルは、一般的には可変および不変残基位置を含み、かつ/またはアミノ酸残基の限定部分集合および選択される個々のライブラリーメンバー配列の全長を部分的または全長に渡るようなものなどから選択される残基を含むことができる可変残基位置を含む。限定配列カーナルは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のどちらかを示すことができる。NがA、T、GまたはCに相当し;KがGまたはTに相当し;かつMがAまたはCに相当し例証ではあるが、限定ではない配列(NNK)10と(NNM)10vは、限定配列カーナルである。

0077

DNAの「消化」とは、DNAにおけるある配列においてのみ作用する制限酵素でDNAの触媒的切断を示す。本明細書で使用される様々な制限酵素は、市販され入手可能であり、通常の当業者に周知であると思われるようなそれらの反応条件補因子および他の必要条件が用いられた。分析的目的のために、典型的には1μgのプラスミドまたはDNA断片は、約20μlの緩衝溶液中の約2ユニットの酵素と共に使用される。プラスミド構築のためのDNA断片を単離するために、典型的には5μgから50μgのDNAをより多い用量中の20ユニットから250ユニットまでの酵素で消化する。特定の制限酵素のための適当な緩衝液と基質の量を、製造業者によって指定されている。37℃で約1時間のインキュベーション時間が、通常は用いられるが、業者の指示に係って変更してもよい。消化後、反応物を直接ゲル電気泳動し、所望の断片を単離する。

0078

「定方向ライゲーション」とは、ポリヌクレオチドの5’端と3’端が好ましいライゲーション方向を特定するするために十分異なるライゲーションを示す。例えば、2つの平滑末端を持つ別の未処理および未消化のPCR産物は、消化されたクローニングベクターへライゲーションされ、そのマルチクローニングサイトにおいて平滑末端を作成する場合、典型的には好ましいライゲーション方向を持たない;従って、典型的にはこれらの環境下では、定方向ライゲーションは示されない。反対に、5’EcoRI処理末端と3’BamH I処理末端を有する消化されたPCR産物がEcoR IとBamH Iで消化されたマルチクローニングサイトを有するクローニングベクターへライゲーションされる場合、定方向ライゲーションは、典型的には示されると考えられる。

0079

「DNAシャッフリング」という用語は、実質的には相同性を示すが、同一ではない配列間の組換えを示すために配列本明細書において使用され、いくつかの態様においては、DNAシャッフリングがcer/loxシステムおよび/またはflp/frtシステム等のような異種性組換えを介した乗り換えを含んでもよい。

0080

本発明において使用されるような「エピトープ」という用語は、フィターゼ特異的抗原のような抗体のパラトープが結合する、フィターゼポリペプチドのような抗原における抗原決定基を示す。抗原決定基は、通常はアミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的反応性である表面の群からなり、かつ3次元構造的特徴、並びに特定の電荷の特徴を有することができる。本明細書で用いられるような「エピトープ」とは、抗体本体を結合する可変領域と相互作用する結合相互作用を形成できる、抗原の一部または他の高分子を示す。典型的には、そのような結合相互作用は、1つのCDRの1つまたはそれ以上のアミノ酸残基との分子間接触として明示される。

0081

参照ポリペプチドについて言及する場合、「断片」、「派生物」および「類似体」という用語は、参照ポリペプチドと少なくとも本質的に同様の、少なくとも1つの生物作用または生物活性を保持するポリペプチドを含む。さらに、「断片」、「派生物」または「類似体」という用語は、有意により高い活性を持つ成熟酵素を作成する切断によって改変されうる低い活性のプロタンパク質のような「前駆型(pro−form)」分子によって例示される。

0082

方法は、本明細書で鋳型ポリペプチドから「アミノ酸置換の全範囲」が各々のアミノ酸の位置を示される。1組の後代ポリペプチドを作成するために提供される。本明細書で使用されるような「1アミノ酸置換の全範囲」とは、本明細書で記述されるような20個の天然でコードされるポリペプチド形成α−アミノ酸に関連する。

0083

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の作成に関連するDNA部分を意味し;それは、コード領域の前にある領域とその後に続く領域(リーダートレーラー)並びに個々のコード部分(エキソン)間に介在する配列(イントロン)を含む。

0084

本明細書で使用されるような「遺伝的不安定性」とは、繰返し配列の欠失による配列の単純化を一般的には含む減少過程を介して欠失される、かなりの繰返し配列の本来の傾向を示す。欠失は、繰返し間の1コピーの繰返しおよび全てのものの欠失を含む傾向がある。

0085

「異種の」という用語は、1つの1本鎖核酸配列が別の一本鎖核酸配列またはその相補鎖ハイブリダイズすることができないことを示す。従って、異種性領域は、ポリヌクレオチド領域またはポリヌクレオチドが、別の核酸またはポリヌクレオチドにハイブリダイズできないそれらの配列内の部位または領域を有すことを意味する。例えば、そのような領域または部位は変異の部位である。

0086

「相同性」または「類似性」という用語は、1本鎖核酸核酸配列が相補的な1本鎖核酸配列にハイブリダイスできることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一量と後述の温度と塩濃度のようなハイブリダイゼーション条件を含む多くの因子に係る可能性がある。好ましくは、同一領域は約5bpより大きく、より好ましくは同一領域は10bpより大きい。

0087

免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は、CDR’sとも呼ばれる3次元高頻度可変領域によって割り込まれる「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域及びCDR部位は、正確に定義されている。「免疫学的に重要なタンパク質配列(Sequences of Protein Immunological Interest)(カバッタ(Kabat)ら、1987)」を参照されたい。様々な軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種間で比較的保存されている。本明細書で使用される「ヒトフレームワーク領域」とは、天然型ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一(約85またはそれ以上、通常は90〜95またはそれ以上)であるフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域は、組成物の軽鎖と重鎖のの組み合わせフレームワーク領域であり、この領域は、配置し、CDR’sとアライメントするために役立つ。CDR’sは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。

0088

本発明の利益は、「商業上の適用」(または商業的方法)に及び、その用語は、商業的な工業本体(または工業のみ)並びに非商業的適用(例えば、無利益の機関においての生物医学的な研究)を含むように使用される。直接関連する適用は、診断医学農業製造業、および学究的分野の領域における適用を含む。

0089

「同一の」または「同一性」という用語は、2つの核酸配列が同様の配列または相補的な配列を持つことを意味する。従って、「同一性のある部位」とは、ポリヌクレオチドまたは全ポリヌクレオチドの領域または部位が、別のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの部位と同一もしくは相補的であると意味する。

0090

「単離された」という用語は、材料が元の環境(例えば、天然の場合には天然環境)から除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然型のポリヌクレオチドまたは酵素は単離されていないが、天然系において共存する材料のいくつかまたはすべてから分離される同様のポリヌクレオチドまたは酵素は単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないので、ベクターの一部であり、かつ/またはそのようなポリヌクレオチドまたは酵素は、組成物の一部であることができ、かつさらに単離されることができる。

0091

「単離された核酸」によって、核酸、例えば、DNA分子またはRNA分子は意味され、それの由来となる生物の天然のゲノム中に存在する場合、それは通常隣接する5’近傍配列および3’近傍配列と近接しない。このように用語は、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターに組み込まれる核酸を説明している; 異種細胞(または相同細胞のゲノムで、それが天然で生じる部位と異なる部位以外において)のゲノムに組み込まれる核酸;かつ、例えばPCR増幅または制限酵素消化によって生成されるDNA断片、またはインビトロ転写によって生成されるRNA分子のような別々の分子として存在する核酸を説明している。用語はまた、例えば、融合タンパク質の生成において使用可能な付加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成する組換え核酸を説明する。

0092

本明細書で使用される「リガンド」とは、特定の受容体によって認識されるランダムペプチドまたは可変セグメント配列のような分子を示す。当業者が認識しているような分子(または高分子複合体)は、受容体とリガンドの両方であることができる。一般的には、より小さい分子量を持つ結合パートナーは、リガンドと呼ばれ、より大きい分子量を持つ結合パートナーは受容体と呼ばれる。

0093

「ライゲーション」とは、二本鎖核酸断片間のリン酸ジエステル結合を形成する過程を示す(Sambrookら、1982、p. 146;Sambrook、1989)。他の方法が提供されない限り、ライゲーションは、連結されるDNA断片のおよそ等モル量の0.5μgにつき10ユニットのT4DNAリガーゼ(「リガーゼ」)を用いて、既知の緩衝液と条件を使用して行なうことができる。

0094

本明細書で使用される「リンカー」または「スぺーサー」とは、DNA結合タンパク質とランダムペプチドのような2つの分子を連結し、かつ、例えばランダムペプチドがDNA結合タンパク質から立体的障害が最小である受容体に結合することができるように、好ましい配置に2つの分子を配置するために役に立つ、1つの分子または分子の群を示す。

0095

本明細書で使用されるような「進化するべき分子性質」とは、ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチド配列からなる分子、およびポリヌクレオチド配列を部分的に含みポリペプチド配列を部分的に含む分子についての言及を含む。特に、直接関連するが限定ではない進化するような分子の性質の例は、温度;塩濃度;圧力;pH;およびグリセロールDMSO、界面活性剤、および/または反応環境において接触される任意の他の分子種の濃度と関連するような特定の条件においての酵素活性を含む。付加的な特に直接関連するが、限定ではない開発される分子特性の例は、安定性、例えば、貯蔵の際に遭遇する可能性があるような特定の環境への特定の曝露時間後に示される残存分子特性の量を含む。

0096

「突然変異」という用語は、野生型または両親型(parental)の核酸配列の配列変化またはペプチドの配列変化を含む。そのような変異は、転位または転換のような点変異であってもよい。変異は、欠失、挿入または重複であってもよい。変異はまた、1つの親分子の配列の一部または全体ならびに少なくとも1つの別の親分子の配列の一部または全体を含むように産生された子孫分子において例示されている、「キメラ化」であってもよい。本発明はキメラポリヌクレオチドおよびキメラポリペプチドの両方を規定する。

0097

本明細書で使用されるような縮重した「N、N、G/T」ヌクレオチド配列は、「N」がA、C、GまたはTであることができる32個の起こりうるトリプレットを示す。

0098

対象に適用される場合に本明細書で使用される「天然の」という用語は、対象が天然で見出されうることを示す。例えば、天然の供給源から単離されうる生物(ウイルスを含む)において存在し、研究者によって意図的には改変されていないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。一般的には、天然という用語は、種に典型的であるような病気を持たない(疾患のない)個体も存在するような対象を言及する。

0099

本明細書で使用される「核酸分子」とは、少なくとも1塩基または1塩基対からなり、それは、それぞれ1本鎖または2本鎖であるかどうかに係る。さらに、核酸分子は、核酸分子が以下の群によって例示されるが、それに限定されないような包括的または化学的にヌクレオチド含有分子の任意の群に属してもよい:RNA、DNA、ゲノム核酸、非ゲノム核酸、天然の核酸と非天然核酸、および合成核酸。これは、非限定的な例として、ミトコンドリアリボソームRNAのような任意の器官と関連する核酸、および天然の組成物とともには天然には存在しない1つまたはそれ以上の組成物がキメラの状態で含まれる核酸分子を含む。

0100

さらに、「核酸分子」とは、アミノ酸と糖によって例示されるが、それに限定されないような1つまたはそれ以上のヌクレオチドが元となる組成物の一部を含んでもよい。従って、限定ではないが、例として、部分的にヌクレオチドに基づき、かつ部分的にタンパク質に基づくリボザイムは、1つの「核酸分子」と考えられる。

0101

さらに、限定ではなく例として、放射活性標識または別の非放射活性標識のような検出可能な部分で標識された核酸分子は、同様に1つの「核酸分子」と考えられる。

0102

特定の酵素を「コードする核酸配列」またはその酵素の「DNAコード配列」またはそれを「コードする塩基配列」という用語、並びに他の同義語は、適当な調節配列制御下に置かれた場合、転写され、かつ酵素へ翻訳されるDNA配列を示す。「プロモーター配列」とは、細胞中RNAポリメラーゼを結合でき、下流の(3’方向)コード配列の転写を開始できるDNA調節領域である。プロモーターは、DNA配列の一部である。この配列領域は、その3’末端において開始コドンを持つ。プロモーター配列は、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要なエレメントである最小の塩基数を含む。しかしながら、RNAポリメラーゼは配列に結合し、転写が開始コドン(プロモーターを持つ3’末端)で開始された後で、転写は3’方向で下流に進む。プロモーター配列内で、転写開始部位ヌクレアーゼS1によるマッピングによって都合よく定義された)並びにRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン共通配列)は見出されると考えられる。

0103

「酵素(タンパク質)をコードする核酸」または「酵素(タンパク質)をコードするDNA」または「酵素(タンパク質)をコードするポリヌクレオチド」という用語および他の同義語は、酵素のコード配列並びに付加的なコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドだけを含むポリヌクレオチドを含む。

0104

好ましい態様においては、「特定の核酸分子種」とは、その一次構造によって例示されるがそれに限定されないようなその化学的構造によって定義される。別の態様においては、特定の「核酸分子種」とは、核酸種の機能によって、または核酸種に由来する産物の機能によって定義される。従って、非限定的な例として、「特定の核酸分子種」とは、それに起因する1つまたはそれ以上の活性または特性によって定義されることができ、その発現産物に起因する活性または特性を含む。

0105

「核酸分子ライブラリーへ作用核酸試料を集合させること」の本明細書における定義は、ベクターへのライゲーションと宿主への形質転換に係るような、ベクターに基づくコレクションへ核酸試料を組み込む過程を含む。関連するベクター、宿主、及びその他の試薬並びにそれについての特定の非制限的な例についての説明は、下文で提供される。「核酸ライブラリーへの作用核酸試料を構築することこと」の本明細書における定義は、アダプターへのライゲーションによるようなベクターに基づかないコレクションへ核酸試料を組み込む過程も含む。好ましくは、アダプターは、PCRプライマーアニーリングし、PCRによる増幅を容易にできる。

0106

従って、非制限的な態様においては、「核酸ライブラリー」とは、1つまたはそれ以上の核酸分子のベクターに基づくコレクションからなる。別の好ましい態様においては、「核酸ライブラリー」は核酸分子のベクターに基づかないコレクションからなる。さらに、別の好ましい態様においては、「核酸ライブラリー」とは、部分的にベクターに基づき、かつ部分的にベクターに基づかない組み合わせの核酸分子のコレクションからなる。好ましくは、ライブラリーを含む子コレクションは、個々の核酸分子種によって探すことが可能で、分離可能である。

0107

本発明は、「核酸構築物」またはその代わりの「ヌクレオチド構築物」またはその代わりの「DNA構築物」を提供する。「構築物」という用語は、ベクターまたはベクターの一部のような1つまたはそれ以上の付加的な分子の部分へ化学的に任意に結合できるポリヌクレオチド(例えば、フィターゼポリヌクレオチド)のような分子を説明するために本明細書において使用される。決して限定ではないが特定の局面において、ヌクレオチド構築物は、宿主細胞の形質転換に適したDNA発現構築物によって例示される。

0108

「オリゴヌクレオチド(または同意義の「オリゴ」)」とは、化学的に合成されてもよい1本鎖ポリヌクレオチドまたは2つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のどちらかを示す。そのような合成的オリゴヌクレオチドは、5’リン酸基を持ってもよく、または持たなくともよい。リン酸基を持たないものは、キナーゼ存在下でATPでリン酸基を付加することなく別のオリゴヌクレオチドへは連結しないと考えられる。合成的オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片へ連結すると考えられる。ポリメラーゼに基づいて増幅するために(PCRによるような)、「連続して少なくとも1つの最初の相同性配列、縮重するN、N、G/T配列、および2番目の相同性配列からなる,32倍の縮重オリゴヌクレオチド」を記述する。本文脈において使用されるような「相同性」とは、オリゴとポリメラーゼに基づいて増幅されやすい親ポリヌクレオチド間の相同性に関するのものである。

0109

本明細書において使用されるような「動作可能に結合された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの結合を示す。核酸は、別の核酸配列との機能的な関係におかれた場合、「動作可能に」結合される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーが、コード配列の転写に影響を及ぼす場合には、動作可能に結合される。動作可能に結合されるということは、結合されるDNA配列が、典型的には隣接し、かつ2つのタンパク質コード領域を連結するために必要なところで、隣接し、および読み枠にあることを意味する。

0110

RNAポリメラーゼが2つのコード配列を1つのmRNAへ転写される場合、コード配列は、別のコード配列へ「動作可能に連結され」、その後、両コード配列に由来するアミノ酸を持つ単一のポリペプチドへ翻訳される。発現される配列は、最後にはプロセシングされ、所望のタンパク質を生成さえすれば、コード配列は、互いに隣接する必要がない。

0111

本明細書において使用されるような「親ポリヌクレオチドセット」という用語は、1組の1つまたはそれ以上の別個のポリヌクレオチド種から成る。通常この用語は、好ましくは親のセットの突然変異誘発によって得られる後代のポリヌクレオチドセットに関して使用されることが適当であり、その場合には「親の」、「出発」および「鋳型」という用語は、相互互換可能に使用される。

0112

本明細書で使用されるような「生理学的条件」という用語は、生存可能な生物と相互互換可能であり、かつ/または生存可能な培養された酵母細胞またはほ乳類細胞における細胞内で典型的な条件である、温度、pH、イオン強度粘性、および生化学的パラメーターなどを示す。例えば、典型的な実験培養条件下で増殖させた酵母細胞における細胞内条件は、生理学的条件である。インビトロ転写カクテルに適したインビトロ反応条件は、一般的には生理学的条件である。一般的には、インビトロ生理学的条件は、50〜200mMのNaClまたはKCl(pH6.5〜8.5、20〜45℃)および0.001〜10mMの、2価の陽イオン(例えば、Mg++、Ca++);好ましくは約150mMのNaClまたはKCl(pH 7.2〜7.6)、5mMの2価の陽イオンを含み、かつ多くの場合、0.01〜1.0%の非特定のタンパク質(例えば、BSA)を含む。多くの場合、非イオン性界面活性剤トゥィーン、NP−40、トライトンX−100)が、約0.001から0.2%(v/v)、一般的には0.05から0.2%(v/v)において存在する。特定の水溶条件は、従来の方法に係る現場の人によって選択されてもよい。一般的な手引きについては、以下の緩衝水溶液条件が適用可能でありうる:2価の陽イオンおよび/または金属キレターおよび/または非イオン性の界面活性剤および/または膜画分および/または抗気泡薬剤および/またはシンチラントを任意に添加した10〜250mM NaCl、5〜50mMトリス HCl(pH5〜8)。

0113

標準的な慣行(5’から3’へ)は、2本鎖ポリヌクレオチドの配列を説明するために使用される。

0114

本明細書で使用されるような「集団」という用語は、ポリヌクレオチド、部分またはポリヌクレオチドまたはタンパク質のような構成物のコレクションを意味する。「混合された集団」とは、:核酸またはタンパク質の同じファミリーに属する(すなわち、関連する)が、それらの配列が異なり(すなわち、同一ではない)、このためにそれらの生物活性が異なる構成要素のコレクションを意味する。

0115

「前駆型(pro−form)」を有する分子は、参照前駆型分子と比較して特性の相違を持つより成熟した分子の形に到達する途中で、1つまたはそれ以上の共有結合的かつ非共有結合的化学修飾(例えば、糖鎖付加タンパク質分解切断二量体形成またはオリゴマー形成、温度誘発構造変化またはpH誘発構造変化、補因子との会合など)の任意の組み合わせをされる分子を示す。2つまたはそれ以上の化学的修飾(例えば、2つのタンパク質分解切断、または1つのタンパク質分解切断および糖鎖除去)を成熟分子の生成の途中で区別できる場合、参照前駆体分子は「前前駆型」分子と呼んでもよい。

0116

本明細書で使用されるような「ランダム」という用語は、例えば、任意の偽ランダムな位置以外の位置においての残基の変動性の程度は、ある程度の残基の変化を許されるが、制限されているような、限定される変動性を持つ1組の配列を示す。

0117

本明細書で使用されるような「準反復単位」とは、再集合される繰返しを示し、定義によっては同一ではない。実際に、方法は、同一の出発配列の変位誘発によって作製された事実上同一であるコード単位のためだけでなく、いくつかの領域において有意に異なる同様の配列または関連する配列の繰返しの再集合のために提示された。それにもかかわらず、配列がこのアプローチによって再び再集合するのに十分な相同性を持つ場合には、それは「準反復」単位として示されうる。

0118

本明細書で使用される「ランダムペプチドライブラリー」とは、1組のランダムペプチドをコードする1組のポリヌクレオチド配列を示し、かつそれらのポリヌクレオチド配列によってコードされる1組のランダムペプチド、並びにそれらのランダムペプチドを含む合タンパク質を示す。

0119

本明細書で使用される「ランダムペプチド配列」とは、2つまたはそれ以上のアミノ酸単量体から成り、統計学的またはランダムな方法によって構築されたアミノ酸配列を示す。ランダムペプチドは、不変配列を含んでもよいフレームワークまたは足場となるモチーフを含むことができる。

0120

本明細書で使用されるような「受容体」とは、所定のリガンドに対しての親和性を持つ分子を示す。受容体は、天然型分子または合成分子であることができる。受容体は、改変されていない状態で使用され、他の種との集合体として使用されうる。受容体は、直接または特定の結合物質を介してのどちらかで結合メンバーに共有結合的または非共有結合的に接触されうる。受容体の例には、モノクローナル抗体と特定の抗原決定基(ウイルス、細胞、または他の材料におけるような)に反応性である抗血清細胞膜受容体複合糖質糖タンパク質、酵素、およびホルモン受容体を含む抗体を含むが、これらに限定されない。

0121

「組換え」酵素は、組換えDNA技術によって生成された、つまり、所望の酵素をコードする外因的DNA構築物によって形質転換された細胞から生成された酵素を示す。「合成」酵素は、化学合成によって調製された酵素である。

0122

「関連するポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドの領域または部位が同一であり、ポリヌクレオチドの領域または部位が異種性であることを意味する。

0123

本明細書で使用されるような「還元的再組み合わせ」とは、繰返し配列によって調節される欠失(かつ/または挿入)現象によって生じる分子変化の増加を示す。

0124

以下の用語は、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記述するために使用される:「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列の同一性」、「配列の同一性の割合」および「実質的な同一性」。

0125

「参照配列」とは、配列比較のための基準として使用される限定配列であり;参照配列は、例えば、配列の列挙において示される、全長のcDNA部分または遺伝子配列のような、より大きい配列の部分集合であってもよく、または完全なcDNAまたは完全な遺伝子配列を含んでもよい。一般的には、参照配列は、長さが少なくとも20ヌクレオチドであり、しばしば少なくとも長さが25ヌクレオチドであり、多くの場合、長さが少なくとも50ヌクレオチドである。2つのポリヌクレオチドは、各々(1)2つのポリヌクレオチド間で類似の配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部)を含み、(2)さらに2つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含んでもよいので、典型的には2つ(またはそれ以上の)ポリヌクレオチド間の配列の比較は、「比較ウインドウ」に関して2つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行なわれ、配列が類似している局所的な領域を同定かつ比較する。

0126

本明細書で使用されるような「繰返しの指標(RI)」とは、クローニングベクターに含まれる準反復単位の平均コピー数である。

0127

「制限酵素部位」という用語は、制限酵素の作用の明示に必要な認識配列を示し、かつ触媒的制限酵素部位を含む。切断部位は、あいまい性が低い配列(すなわち、制限酵素部位の出現頻度について主要な決定因子を含む配列)を含む制限酵素部位の一部の中に含まれてもよく、または含まなくてもよい。従って、多くの場合、関連する制限酵素部位は、内在的切断部位(例えば、EcoR I部位のG/AATTC)または隣接する切断部位(例えば、EcoR II部位の/CCWGG)内のあいまい性が低い配列を含む。別の場合では、関連する制限酵素 [例えば、Eco57 I部位またはCTGAAG(16/14)]は、外部の切断部位(例えば、Eco57 I部位のN16部分)を持つあいまい性が低い配列(例えば、Eco57 I部位のCYGAAG)を含む。酵素(例えば、制限酵素)がポリヌクレオチドを「切断する」と言われる場合、制限酵素は、ポリヌクレオチドの切断を触媒、または促進することを意味することが理解されている。

0128

非制限的な局面において、「選択可能なポリヌクレオチド」とは、5’終端領域(または末端領域)、中間領域(すなわち、内部領域または中央領域)、および3’終端領域(または末端領域)から成る。この局面で使用されるような5’終端領域は5’ポリヌクレオチド末端の方に位置される領域(または5’ポリヌクレオチド末端)であり;従って、それはポリヌクレオチドの5’の半分の一部または全部である。同様に、3’終端領域は、3’ポリヌクレオチド末端の方に位置される領域(または3’ポリヌクレオチド末端)であり;従って、それはポリヌクレオチドの3’の半分の一部または全部である。この非制限的な例示において使用されるように、任意の2つの領域間またはすべての3つの領域の間でさえも重複する配列であってもよい。

0129

「配列の同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較ウインドウに関して(ヌクレオチド基準によるヌクレオチドにおいて)同一であることを意味する。「配列の同一性の割合」とは、比較ウインドウに関して最適にアライメントした2つの配列を比較し、両配列においてマッチする位置の数となる同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、U、またはI)が見出される数を測定し、比較ウインドウにおける位置の合計数(すなわち、ウインドウの大きさ)によってマッチする位置の数を割り、かつスコアを100で掛け配列同一性の割合を得ることによって計算される。本明細書で使用されるこの「実質的な同一性」とは、配列の同一性の割合が、比較ウインドウに関して参照配列の20%またはそれより少ない割合を占める、欠失または付加を含んでもよいポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することによって計算される、少なくとも25〜50ヌクレオチドの比較ウインドウの参照配列と比較した場合、ポリヌクレオチドが少なくとも80%の配列が同一で、好ましくは少なくとも85%が同一、多くの場合には90%から95%までの配列が同一、最も一般的には少なくとも99%の配列が同一である配列を含み、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。

0130

当技術分野において周知であるような2つの酵素間の「類似性」とは、アミノ酸配列と1つの酵素のその保存されたアミノ酸の置換を2つ目の酵素の配列と比較することによって決定される。類似性は、当技術分野でよく知られている手順、例えば、BLASTプログラム(国立生物学情センターのBasic Local Aligment Tool)によって決定されてもよい。

0131

本明細書で使用されるような「一本鎖抗体」という用語は、一般的にはスぺーサーペプチド(例えば、[Gly−Gly−Gly−Gly−Ser]x)を介して結合するポリペプチド結合におけるVHドメインとVLドメインを含み、かつアミノ末端および/またはカルボキシ末端の付加的なアミノ酸配列を含んでもよいポリペプチドを示す。例えば、一本鎖抗体は、コードしているポリヌクレオチドに結合するためのつなぎ鎖の部分を含んでもよい。例として、scFVは一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、一般的には免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によって実質的にコードされ(例えば、本明細書に参照として組み入れられている、WilliamとBarclay、1989、pp. 361−368を参照のこと)、最も多くの場合には齧歯動物、ヒト以外の霊長類鳥類ブタウシ亜科動物、ヒツジヤギ、またはヒトの重鎖または軽鎖の遺伝子配列によってコードされる、少なくとも10個の隣接するアミノ酸の1つまたはそれ以上のポリペプチド部分からなるタンパク質である。機能的な一本鎖抗体は、一般的には、特定の標的分子、典型的には受容体または抗原(エピトープ)に結合する特性を保持するように免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部分を含む。

0132

1対の分子のメンバー(例えば、抗体−抗原対または核酸の対)は、別の非特異的な分子よりも高い親和性で互いに結合する場合には、お互いを「特異的に結合する」と呼ばれる。例えば、非特異的なタンパク質よりも効率よく結合する、抗原に対する抗体は、抗原に特異的に結合すると記述される。(同様に、核酸プローブは、塩基対相互作用によって標的と特異的な2本鎖を形成する場合には、核酸の標的に特異的に結合すると記述されることができる(上を参照のこと)。)

0133

「特異的なハイブリダイゼーション」とは、実質的には関連のないポリヌクレオチド配列が混合液中でハイブリッドを形成しない、1つ目のポリヌクレオチドと2つ目のポリヌクレオチド(例えば、1つ目のポリヌクレオチドとは異なるが実質的に同一の配列を持つポリヌクレオチド)間のハイブリッド形成として本明細書で定義される。

0134

「特異的なポリヌクレオチド」という用語は、いくらかの終点を持ち、ある核酸配列を持つポリヌクレオチドを意味する。1つのポリヌクレオチドが、異なる末端以外は、2つ目のポリヌクレオチドの一部として同一配列を持つが、2つのポリヌクレオチドは、2つの異なる特異的なポリヌクレオチドを含む。

0135

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、配列間で少なくとも90%が同一であり、好ましくは95%が同一であり、最も好ましくは少なくとも97%が同一である場合には、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。本明細書によって完全に参照として組み入れられている、サムルック(Sambrook)ら、1989年、を参照されたい。

0136

列番号:1の1つのようなフィターゼポリペプチドの配列と「実質的に同一である」配列を持つポリペプチドもまた、本発明において含まれる。「実質的に同一である」アミノ酸配列は、保存性アミノ酸の置換、例えば同じクラスの別のものからあるアミノ酸への置換(例えば、別のものからイソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような1つの疎水性アミノ酸への置換、または、リジンからアルギニンへ、アスパラギン酸からグルタミン酸へ、またはアスパラギンからグルタミンへの置換のような別ものから1つの極性アミノ酸への置換)によってのみ参照配列と異なる配列である。

0137

さらに、「実質的に同一である」アミノ酸配列は、参照配列と異なり、もしくは、特に、そのような置換が分子の活性化部位ではない1つの部位で起こる場合の1つまたはそれ以上の非保存性置換、欠失、または挿入によって異なる配列であり、かつポリペプチドが反応特性を本質的に保持していることを提供される。例えば、1つまたはそれ以上のアミノ酸をフィターゼポリペプチドから除去でき、それによって結果的にポリペプチドの構造を改変できる。例えば、フィターゼの生物活性に必要のないアミノ末端のアミノ酸またはカルボキシ末端のアミノ酸を除去できる。そのような改変は、より小さい活性フィターゼポリペプチドの開発になりうる。

0138

本発明は、「実質的に純粋な酵素」を提供する、「実質的に純粋な酵素」という用語は、他のタンパク質、脂質、糖質、核酸、および天然で関連する他の生物材料が実質的にないポリペプチド(例えば、フィターゼポリペプチド、またはその断片)のような分子を記述するために本明細書で使用される。例えば、ポリペプチドのような実質的に純粋な分子は、乾重量において関心対象の分子の少なくとも60%であることができる。ポリペプチドの純度は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動(例えば、SDS−PAGE)、カラムクロマトグラフィー(例えば、高速液体クロマトグラフィーHPLC))、およびアミノ末端アミノ酸配列解析を含む標準的な方法を用いて測定されうる。

0139

本明細書で使用されるような「実質的に純粋な」という用語は、目的とする種が、存在する優勢な種(すなわち、1モルを基準として、それは組成物中の任意の他の個々の高分子種より豊富である)であり、好ましくは、目的とする種が存在するすべての高分子種の少なくとも約50%(1モルを基準として)を含む、実質的に純粋な画分が組成物であることを意味する。一般的には、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約80%から90%より多く含まれると考えられる。最も好ましくは、目的種は、組成物が本質的には単一の高分子種から成り、本質的に均一になるまで精製される(混入種を通常の検出方法によって組成物において検出できない)。溶媒種、小分子(500Daより小さい)、かつ元素イオン種は、高分子種とは考えられない。

0140

本明細書で使用されるような「可変セグメント」という用語は、ランダム配列、偽ランダムな配列、または限定カーナル配列の一部を示す。「可変セグメント」とは、ランダム配列、偽ランダムな配列、または限定カーナル配列を含む新生ペプチドの一部を示す。可変セグメントは、可変残基部分と不変残基部分の両方を含むことができ、かつ可変残基の位置における残基の変動性の程度を限定してもよく:両方の選択は現場の人の判断で選択される。典型的には、可部分は、長さが約5アミノ酸残基から20アミノ酸残基まで(例えば、8残基から10残基)であるが、可変セグメントは、それより長くてもよく、抗体断片、核酸結合タンパク質受容体タンパク質などのような抗体の一部または受容体タンパク質を含んでもよい。

0141

「野生型」という用語は、ポリヌクレオチドがいかなる変異も含まないことを意味する。「野生型」の部分は、天然で見出される活性レベルにおいて活性があり、タンパク質が天然で見出されるアミノ酸配列を含むことを意味する。

0142

「作用試料」などにおける「作用」という用語は、例えば、単に、人が用いている試料である。同様に、例えば「作用分子」とは、人が用いている分子である。

0143

6. 発明の詳細な説明
本明細書に記した発明は、組換えを通じて、DNA、RNAまたはタンパク質のような高度に複雑な線状配列の方向付けられた分子進化を可能にするような、縮小的再組合せ(reductive reassortment)、組換えおよび選択への反復サイクルの使用に関する。

0144

分子のインビボシャッフリングは、組換え多量体に対する細胞の天然の特性を用いて行うことができる。インビボにおける組換えは、分子多様性への主要な自然経路を提供するが、遺伝的組換えは、以下の点に関連して、依然比較的複雑な方法である:1)相同性の認識;2)組換えキアズマ形成に繋がる、鎖の切断、鎖の侵入(invasion)、および代謝の過程;並びに最後に、3)個別の組換え分子へのキアズマの解離(resolution)。キアズマの形成は、相同配列の認識を必要とする。

0145

好ましい態様において、本発明は、少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを作出する方法に関する。本発明は、適当な宿主細胞へ、部分的配列相同性の少なくとも1領域を共有する少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを導入することによる、ハイブリッドポリヌクレオチドの作出に使用することができる。この部分的配列相同領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを作出する配列の再組織化を生じるような方法を促進する。本明細書において使用される用語「ハイブリッドポリヌクレオチド」とは、本発明の方法により生じかつ少なくとも2種の本来のポリヌクレオチド配列由来の配列を含むようなヌクレオチド配列のいずれかを意味する。このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列組込みを促進する分子間組換え事象により生じ得る。加えてこのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子内のヌクレオチド配列を変更するために反復配列を利用する、分子内縮小的再組合せ法により作成することができる。

0146

本発明は、生物学的活性のあるハイブリッドポリペプチドをコードし得るハイブリッドポリヌクレオチドを作出する手段を提供する。ある局面において、本来のポリヌクレオチドは、生物学的活性のあるポリペプチドをコードしている。本発明の方法は、得られるハイブリッドポリヌクレオチドが本来の生物学的活性のあるポリペプチドに由来した活性を示すポリペプチドをコードしているように、本来のポリヌクレオチドの配列を組込むような細胞処理を用いて、新規ハイブリッドポリペプチドを作出する。例えば本来のポリヌクレオチドは、様々な微生物由来の特定の酵素をコードすることができる。ある生物由来の第一のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、例えば、高塩分のような特定の環境条件下で効果的に機能することができる。異なる生物の第二のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、極端な高温のような様々な環境条件下で効果的に機能することができる。第一および第二の本来のポリヌクレオチド由来の配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、本来のポリヌクレオチドでコードされた両方の酵素の特徴を発揮する酵素をコードすることができる。従って、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、第一および第二のポリヌクレオチドでコードされた各々の酵素により共有された環境条件下、例えば高塩分および極端な温度で、効果的に機能することができる。

0147

本発明の本来のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、酸化還元酵素転移酵素加水分解酵素リアーゼ異性化酵素、およびリガーゼを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の方法から得られるハイブリッドポリペプチドは、本来の酵素においてはディスプレイされない特定化された酵素活性を示すことができる。例えば加水分解酵素活性をコードしているポリヌクレオチドの組換えおよび/または縮小的再組合せの後、得られるハイブリッドポリヌクレオチドでコードされたハイブリッドポリペプチドは、各々の本来の酵素から得られた特定化された加水分解酵素活性、すなわち加水分解酵素が作用する結合の種類および加水分解酵素が機能する温度についてスクリーニングすることができる。従って、例えば加水分解酵素は、本来の加水分解酵素(hydrolyases)からハイブリッド加水分解酵素を識別するそれらの化学的機能性について確かめるためにスクリーニングすることができ、これは下記のようなものである:(a)アミド(ペプチド結合)、すなわちプロテアーゼ;(b)エステル結合、すなわちエステラーゼおよびリパーゼ;(c)アセタール、すなわちグリコシダーゼ、並びに例えばハイブリッドポリペプチドが機能する温度、pHまたは塩濃度についてである。

0148

本来のポリヌクレオチドの供給源は、個別の生物(「単離体」)、制限培地中で増殖された生物の収集(「富化培養」)、または最も好ましくは未培養の生物から(「環境試料」)単離されうる。環境試料由来の新規生体活性をコードしているポリヌクレオチドを誘導する培養とは無関係の方法の使用が、生体多様性の利用されない給源に接近することができるので最も好ましい。

0149

「環境ライブラリー」とは、環境試料から作成され、かつ適当な原核生物宿主において増殖することができるクローニングベクターにおいて実現される天然の生物の集合的ゲノムを表している。クローニングしたDNAは最初に環境試料から直接抽出されるので、これらのライブラリーは、純粋な培養物において増殖することができる原核細胞の小さい画分に限定されない。加えてこれらの試料中に存在する環境DNAの標準化は、本来の試料中に存在する全ての種からのDNAのより同等の提示を可能にする。これは、ドミナント種と比較して大きさが数桁下回って提示されることがある試料の少量の成分から関心対象の遺伝子を発見する効率を劇的に増加することができる。

0150

例えば、1種以上の培養していない微生物から作成された遺伝子ライブラリーは、関心対象の活性についてスクリーニングされる。関心対象の生体活性分子をコードしている可能性のある経路は、最初に遺伝子発現ライブラリーの形で原核細胞において捕捉される。関心対象の活性をコードしているポリヌクレオチドは、このようなライブラリーから単離されかつ宿主細胞に導入される。この宿主細胞は、新規または増強された活性を伴う可能性のある活性を有する生体分子を作出する組換えおよび/または縮小的再組合せを促進する条件下で増殖される。

0151

ポリヌクレオチドが調製される微生物は、真正細菌および古細菌のような原核微生物、ならびに真菌、一部の藻類および原生動物のような比較的低等な真核微生物を含む。ポリヌクレオチドは、核酸が微生物の培養をせずに回収されるかまたは1種以上の培養された生物から回収される場合のように、環境試料から単離することができる。ある局面において、このような微生物は、極端を好む菌(extremophules)、例えば超高熱菌、好冷菌低温菌(psychrotrophs)、好高塩菌、好高圧菌、および好酸菌である。極端を好む微生物から単離された酵素をコードしているポリヌクレオチドが特に好ましい。このような酵素は、上の温泉および深海熱水口の100℃以上の温度、極地水の0℃以下の温度、死海飽和塩環境、石炭堆積層および地熱イオウ分が豊富な温泉のような0近傍のpH値、または下水スラッジの11を超えるpH値で機能することができる。例えば、極端を好む生物からクローングされかつ発現されたエステラーゼおよびリパーゼのいくつかは、広範な温度およびpHを通じて高い活性を発揮する。

0152

前述のように選択および単離されたポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞に導入される。適当な宿主細胞は、組換えおよび/または縮小的再組合せを促進することが可能な細胞のいずれかである。選択されたポリヌクレオチドは、好ましくは既に適当な調節配列を含むベクター内にある。この宿主細胞は、例えば哺乳類細胞のような高等真核細胞、または酵母細胞のような比較的低等な真核細胞であることができ、もしくは好ましくは宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であることができる。構築体の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法DEAEデキストラン媒介型トランスフェクション法、または電気穿孔法により行うことができる(Davisら、1986)。

0153

適当な宿主細胞の代表例としては、大腸菌、Streptomyces、Salmonella typhimuriumのような細菌細胞;酵母のような真菌細胞;Drosophila S2およびSpodoptera Sf9のような昆虫細胞;CHO、COSまたはBowesメラノーマのような動物細胞アデノウイルス;ならびに植物細胞を挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書の内容から当業者の範囲内であると思われる。

0154

特に組換えタンパク質を発現するために使用することができる様々な哺乳類細胞培養システムに関する哺乳類発現システムの例は、「SV40形質転換されたシミアン細胞は、初期SV40変異体の複製を支持する」(Gluzman, 1981)に記された、サル繊維芽細胞のCOS−7系、および共存性のあるベクターの発現が可能な他の細胞系、例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株である。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにいずれか必要なリボソーム結合部位ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受容部位転写終結配列、ならびに5’隣接する非転写配列を含むであろう。SV40スプライシングおよびポリアデニル化部位由来のDNA配列は、必要な転写されない遺伝子エレメントを提供するように使用することができる。

0155

関心対象のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子増幅に適するように変更された常用栄養培地で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞でこれまでに使用されたものであり、かつ当業者には明らかであろう。特定の酵素活性を有することが確定されたクローンは、その後増強された活性を有する酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を確定するために、配列決定される。

0156

別の局面において本発明の方法は、1種以上のオペロン由来の生化学的経路をコードしている新規ポリヌクレオチド、またはそれらの遺伝子クラスターもしくは一部を作成するために使用することができるように構想されている。例えば、細菌および多くの真核生物は、その産物が関連したプロセスに関与しているような遺伝子を調節するための調和された機構を有する。これらの遺伝子は、クラスター化され、構造から単独の染色体上の「遺伝子クラスター」と称されており、かつクラスター全体の転写を開始する単独のプロモーターを含む単独の調節配列の制御下で一緒に転写される。従って遺伝子クラスターとは、通常はそれらの機能に関して同じまたは関連のある隣接遺伝子の群である。遺伝子クラスターによりコードされた生化学経路の例は、ポリケチドである。ポリケチドとは、生体活性の極端に豊富な給源分子であり、抗生物質(テトラサイクリンおよびエリロマイシンなど)、抗癌剤ダウノマイシン)、免疫抑制剤(FK506およびラパマイシン)、ならびに獣医学的産物(モネンシン)を含んでいる。多くのポリケチド(ポリケチドシンターゼにより形成される)は治療物質として価値がある。ポリケチドシンターゼは、長さならびに官能性および環化パターンが異なる多種多様炭素鎖生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は、遺伝子クラスターに分類され、およびポリケチドシンターゼの少なくとも1種(タイプIと称される)は、大きいサイズの遺伝子および酵素を有し、このことがこれらの遺伝子/タンパク質の遺伝的操作およびインビトロ試験を複雑化する。

0157

ポリケチドまたはそれらの断片のライブラリーから所望の成分を選択しかつ組合わせる能力、ならびに試験のための新規ポリケチド作成のためのポストポリケチド生合成遺伝子が明らかになっている。本発明の方法は、分子間組換えを通じての新規ポリケチドシンターゼ作出を促進することを可能にしている。

0158

好ましくは、遺伝子クラスターDNAは、様々な生物から単離することができ、かつベクターにライゲーションする、特にライゲーションした遺伝子クラスターからの検出可能なタンパク質の作出またはタンパク質関連アレイ活性を制御および調節することができる発現調節配列を含むベクターにライゲーションすることができる。内在性DNA導入のための例外的に大きい容量を有するベクターの使用は、このような遺伝子クラスターでの使用に特に適しており、かつ大腸菌のf因子(稔性因子)を含むことが例として本明細書に記されている。この大腸菌のf因子は、接合時にそれ自身の高頻度移行に作用するプラスミドであり、かつ混合微生物試料からの遺伝子クラスターのような、巨大なDNA断片を実現しかつ安定に増殖するのに理想的である。一旦適当なベクターにライゲーションされると、様々なポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターを含む2種以上のベクターを、適当な宿主細胞に導入することができる。これらの遺伝子クラスターと相同性を共有している部分配列の領域は、ハイブリッド遺伝子クラスターを生じる配列再構成を生じるプロセスを促進するであろう。その後この新規ハイブリッド遺伝子クラスターは、本来の遺伝子クラスターにおいては認められない増強された活性についてスクリーニングすることができる。

0159

従って、好ましい態様において本発明は、下記段階による、生物学的に活性のあるハイブリッドポリペプチドを作出し、かつこのようなポリペプチドを増強された活性についてスクリーニングする方法に関連している:
1)適当な宿主細胞へ、動作可能的にライゲーションされた少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび動作可能的に連結された第二のポリヌクレオチドを導入する段階であり、これらの少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが部分配列相同性を少なくとも1領域共有しているような段階;
2)配列再構成を促進する条件下で宿主細胞を増殖し、動作可能的に連結されたハイブリッドポリヌクレオチドを生じる段階;
3)ハイブリッドポリヌクレオチドでコードされたハイブリッドポリペプチドを発現する段階;
4)増強された生物学的活性の同定を促進する条件下でハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする段階;および
5)ハイブリッドポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する段階。

0160

様々な酵素活性をスクリーニングする方法が、当業者に公知であり、かつ本明細書において論じられている。このような方法は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離する際に利用することができる。

0161

本明細書において使用することができる発現ベクターの代表例は、ウイルス粒子バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミドコスミドフォスミド、細菌の人工染色体、ウイルスDNA(例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス仮性狂犬病、およびSV40誘導体)、P1に基づいた人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心対象の具体的な宿主に特異的ないずれか他のベクター(バシラスアスペルギルスおよび酵母など)を挙げることができる。従って、例えばDNAは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれかひとつに含むことができる。このようなベクターは、染色体性非染色体性および合成DNA配列を含む。適当なベクターの多数が、当業者に公知であり、かつ市販されている。下記のベクターを例として挙げることができる;細菌性:pQEベクター(Qiagen社)、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、λ−ZAPベクター(Stratagene社);ptrc99a、pKK223−3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia社);真核性:pXT1、pSG5(Stratagene社)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia社)がある。しかし、いずれか他のプラスミドまたは他のベクターを、宿主において複製および生存可能な限り使用することができる。低いコピー数または高いコピー数のベクターを、本発明において使用することができる。

0162

本発明において使用するのに好ましい種類のベクターは、f因子複製起点を含む。大腸菌におけるf因子(または稔性因子)は、接合時にそれ自身の高頻度の移行および細菌性染色体それ自身のより少ない頻度の移行に作用するプラスミドである。特に好ましい態様において、「フォスミド」または細菌性人工染色体(BAC)ベクターと称されるクローニングベクターを使用する。これらは、ゲノムDNAの大きいセグメントの安定した組込みが可能であるような大腸菌 f因子に由来している。混合未培養の環境試料由来のDNAを組込む場合、これは安定した「環境DNAライブラリー」の形の巨大なゲノム断片を実現することを可能にする。

0163

本発明において使用するのに好ましい別の種類のベクターは、コスミドベクターである。コスミドベクターは、最初にゲノムDNAの巨大なセグメントをクローニングしかつ増殖するように設計された。コスミドベクターへのクローニングは、「Molecular Cloning: A laboratory Manual」(Sambrook ら、1989)において詳細に説明されている。

0164

発現ベクター内のDNA配列は、RNA合成を指示するのに適当な発現制御配列(複数)(プロモーター)に動作可能的に連結されている。特に言及された細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびtrpを含む。真核プロモーターは、極初期CMV、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスのメタロチオネイン−Iを含む。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者には周知である。発現ベクターは同じく、翻訳開始および転写終結のためのリボソーム結合部位を含む。このベクターも、発現を増幅するための適当な配列から選択することができる。プロモーター領域は、CATクロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを伴う他のベクターを用い、いずれか所望の遺伝子から選択することができる。

0165

加えて、この発現ベクターは、真核細胞培養物についてのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する1種以上の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。

0166

一般に組換え発現ベクターは、複製起点、例えば大腸菌およびS. cerevisiae TRPl遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子のような宿主細胞の形質転換をもたらす選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高度に発現された遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。このようなプロモーターは、3−ホスホグリセレートキナーゼPGK)のような解糖酵素、α因子酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来することができる。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒質への分泌を指示することが可能であるリーダー配列の適当な相において集成される。

0167

クローニング戦略は、ベクター起動および内在性プロモーターの両方による発現を可能にし;ベクターの促進は、内在性プロモーターが大腸菌において機能しないような遺伝子発現において重要であろう。

0168

微生物から単離されるかまたはそれに由来したDNAは、選択されたDNAについてプロービングする前に、ベクターまたはプラスミドに挿入することが好ましい。このようなベクターまたはプラスミドは、プロモーター、エンハンサーなどを含む、発現調節配列を含むものが好ましい。このようなポリヌクレオチドは、ベクターおよび/または組成物の一部であることができ、かつこのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないように依然単離されている。特に好ましいファージまたはプラスミドおよびそれらへの導入およびパッケージングのための方法は、本明細書において言及されたプロトコールにおいて詳述されている。

0169

クローニングベクターの選択は採用された方法によって決まり、例えばベクターは、配列の反復コピーを増すか、または宿主細胞においてうまく形質転換および選択することができる配列を倍加するのに適当な容量を伴ういずれかのクローニングベクターであることができる。このようなベクターの一例は、「Polycosベクター:λファージパッケージング抽出物を用いる繊維状ファージおよびファージミドベクターパケージングシステム」(Alting−MecsおよびShort, 1993)に記されている。増殖/維持は、クローニングベクターにより保持された抗生物質耐性によるものであることができる。増殖期以降に、天然に短縮化された分子は、ゲルまたはカラム上のサイズ分画により回収されかつ同定されるか、もしくは直接増幅される。利用されたクローニングベクターは、長い構築体の挿入により破壊される選択可能な遺伝子を含むことができる。縮小的再組合せの進行に伴い、反復ユニット数が縮小され、かつ妨害された遺伝子は再度発現され、これによりプロセッシングされた構築体の選択が行われる。このベクターは、所望の生物学的特性を有する発現された産物の選択を可能にする発現/選択ベクターであることができる。挿入は、機能的プロモーターの下流に位置し、および所望の特性を適当な手段でスクリーニングすることができる。

0170

インビボ再組合せは、細菌内で、一般に「RecA依存」現象として見られるような、集合的に「組換え」と称される「分子間」のプロセスに焦点が当てられている。本発明は、配列を組換えおよび再組合せするための宿主細胞の組換え法、または欠失により細胞の準反復配列の複雑度を低下する縮小的方法を媒介する細胞の能力に頼ることができる。この「縮小的再組合せ」の方法は、「分子内」RecA依存法により生じる。

0171

従って、本発明の別の局面において、新規ポリヌクレオチドを、縮小的再組合せ法により作成することができる。この方法は、連続配列(本来のコード配列)を含む構築体を作成、それらの適当なベクターへの挿入、およびその後の適当な宿主細胞への導入に関する。個々の分子同定物の再組合せは、相同領域を有する構築体中の連続配列間、または準反復ユニット間において、コンビナトリアル法により行われる。再組合せ法は、反復配列の複雑度および程度を再度組合せおよび/または縮小し、かつ新規分子種の作成をもたらす。様々な処理を、再組合せ率を増すために適用することができる。これらは、紫外線処理、またはDNAを損傷する化学物質、および/または「遺伝子不安定性」の増強されたレベルをディスプレイする宿主細胞系の使用を含むことができる。従ってこの再組合せ法は、相同的組換えまたはそれら自身の進化を示す準反復配列の天然の特性に関する。

0172

反復配列または「準反復」配列は、遺伝的不安定性において役割を果たす。本発明において、「準反復物」とは、それらの本来のユニット構造に対して制限されない反復物である。準反復ユニットは、構築体の配列アレイ;類似の配列の連続ユニットとして示すことができる。一旦ライゲーションされたならば、連続配列間の接合は、本質的に不可視となり、かつ得られる構築体の準反復性の性質は、ここでは分子レベルで連続している。この細胞の欠失法は、準反復配列間で得られる構築体の操作の複雑度の低下をもたらす。準反復ユニットは、ずれ事象が生じ得るような鋳型の実践上の制限のないレパートリーを提供する。従って、準反復物を含む構築体は、準反復ユニット内で欠失(おそらく挿入)事象が実際に生じ得る十分な分子弾性を効果的に提供する。

0173

準反復配列が同じ方向、例えば頭から尾またはその逆でにライゲーションされる場合には、この細胞は個々のユニットを識別することはできない。結果的に、この縮小的プロセスは、この配列全体に発生し得る。対照的に、例えばこれらのユニットが、頭から尾よりもむしろ頭から頭へ示される場合には、この逆転は、隣接ユニットの終点(endpoint)を線引きすることができ、その結果欠失の形成は、個別のユニットの喪失に有利となる。従って、本発明の方法にとって、これらの配列が同方向であることが好ましい。準反復配列の無作為な方向は、再組合せ効率の低下を招く一方で、これらの配列の一貫した方向は高効率を提供する。しかし、同方向の連続配列が減ることは効率を低下する一方で、新規分子の効果的回収に十分な弾性が提供されもする。構築体は、より高い効率をもたらすよう同方向の準反復配列で作成することができる。

0174

配列は、下記を含む様々な方法のいずれかを用いて、頭から尾へ構築することができる:
a)一本鎖で作成された場合に方向を提供するような、ポリA頭およびポリT尾を含むプライマーを利用することができる。これは、RNAから作成され、その後容易にRNAseHで除去される、プライマーの最初の数塩基を有することによって実現される;
b)独自の制限酵素部位を含むプライマーを利用することができる。複数の部位、一連の独自の配列、ならびに反復合成およびライゲーション段階が必要であると考えられる;
c)プライマーの内側の2、3の塩基はチオール化され、かつエキソヌクレアーゼを使用して、適当に尾側の分子を作成する。

0175

再集合された配列の回収は、縮小されたRIを伴うクローニングベクターの同定に頼っている。その後再組合せされたコード配列は、増幅により回収することができる。これらの産物は再クローニングされ、かつ発現される。縮小されたRIを伴うクローニングベクターの回収は、下記により実現することができる:
1)該構築体の複雑度が低下した場合にのみ安定して維持される、ベクターの使用;
2)物理的方法による短縮化されたベクターの物理的回収
この場合、クローニングベクターは、標準のプラスミド単離法および標準の手法を利用するアガロースゲルまたは低分子量カットオフのカラムのいずれかを用いるサイズ分画を用いて、回収される;
3)挿入サイズが減少する場合に選択することができる切断された遺伝子を含むベクターの回収;
4)発現ベクターおよび適当な選択による直接の選択技術の使用。

0176

関連生物に由来するコード配列(例えば遺伝子)は、高度の相同性を示し、かつ極めて多様なタンパク質産物をコードしている。これらの配列の種類は、本発明において準反復物として特に有用である。しかし、下記に説明された例はほぼ同じ本来のコード配列(準反復物)の再組合せを明らかにする一方で、この方法はこのようなほぼ同じ反復物に限定されるものではない。

0177

以下の実施例は、本発明の方法を明らかにしている。3種の独自の種に由来したコード核酸配列(準反復物)について言及している。各配列は、個別の特性セットを伴うタンパク質をコードしている。各配列は、「A」、「B」および「C」と称される配列内の独自の位置において1個または数個の塩基対が異なる。この準反復配列は、個別にまたは集合的に増幅されかつランダム集成体へとライゲーションされ、その結果全ての可能性のある順列および組合わせがライゲーションされた分子集団において利用可能になる。準反復ユニットの数は、集成条件により制御することができる。構築体内の準反復ユニットの平均数は、反復指数(RI)と定義される。

0178

一旦構築物が形成されると、該構築体は公表されたプロトコールに従うアガロースゲル上のサイズ分画、クローニングベクターへの挿入、および適当な宿主細胞へのトランスフェクションを行うことも行わないこともできる。その後これらの細胞は増殖され、かつ「縮小的再組合せ」が実施される。望ましいならば、縮小的再組合せ法の率は、DNA損傷の導入により刺激することができる。RIの縮小が、「分子内」機構による反復配列間の欠失の形成により媒介されるか、もしくは「分子間」機構による組換え様事象により媒介されるかのいずれであるかは、重要ではない。最終結果は、全ての可能性のある組み合わせへの分子の再組合せである。

0179

任意に、本方法は、例えばタンパク質受容体、ペプチドオリゴ糖ビリオンのようなあらかじめ定められた巨大分子、または他のあらかじめ定められた化合物または構造と結合さもなければ相互作用する能力を有する個々のシャッフリングされたライブラリーメンバー(例えば触媒抗体など)を同定するために、シャッフリングされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングする追加段階を含む。

0180

このようなライブラリーから同定された、ディスプレイされたポリペプチド、抗体、偽ペプチド抗体、および変異領域の配列を、治療、診断、研究および関連目的(例えば触媒、水溶液浸透圧を増大する溶質など)に使用することができ、および/または1種以上のシャッフリングおよび/または親和性選択の追加サイクルを施すことができる。この方法は、表現型の特性についての選択段階があらかじめ定められた分子への結合親和性以外(例えば触媒活性、安定性、酸化抵抗性薬物耐性、または宿主細胞に付与された検出可能な表現型など)であるように変更することができる。

0181

本発明は、親和性相互作用スクリーニングに適したディスプレイされた抗体のライブラリーを作成する方法を提供することができる。この方法は、(1)ディスプレイされた抗体および該ディスプレイされた抗体をコードしている会合したポリヌクレオチドを含む第一の複数の選択されたライブラリーメンバーを得、かつ該ディスプレイされた抗体をコードしている会合したポリヌクレオチドを得、かつ得た会合したポリヌクレオチドまたはそのコピーを得る段階であり、ここで該会合したポリヌクレオチドと実質的に同じ変異領域フレームワーク配列領域を含んでいる段階、ならびに(2)該ポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、かつ組換えおよび縮小的再組合せを促進する条件下で細胞を増殖し、その結果シャッフリングされたポリヌクレオチドを生じる段階。シャッフリングされたプールにより構成されたCDR組合せは、第一の複数の選択されたライブラリーメンバー中に存在せず、該シャッフリングされたプールはCDR順列を含みかつ親和性相互作用スクリーニングに適したディスプレイされた抗体のライブラリーを構成する。任意にシャッフリングされたプールは、あらかじめ決定されたエピトープ(抗原)に結合するシャッフリングされたライブラリーメンバーの選択のために親和性スクリーニングが、およびそれによる複数の選択されたシャッフリングされたメンバーの選択が施される。さらに、複数の選択的にシャッフリングされたライブラリーメンバーがシャッフリングされ、かつ1〜約1000サイクルまたは望ましいならば所望の結合親和性を持つライブラリーメンバーが得られるまで、反復スクリーニングされる。

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