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解決手段

 HCV3型コア/E1領域の特定領域;及び/又はHCV3型のNS3領域の特定領域、及び/又はHCV3型のNS3/4領域の特定領域;及び/又はHCV3a型のBR36亜群のNS5領域の特定領域;コア領域内のヌクレオチド379で始まり、HCV4a型のコーディング領域;及び/又はHCV4型のコーディング領域;及び/又はHCV4型のコーディング領域;及び/又はHCV5型のコーディング領域;からのヌクレオチド配列に対応する8個以上の隣接ヌクレオチドを含む少なくとも1つのポリ核酸を含んで成るか、又はこのポリ核酸より構成され、しかもこのポリ核酸には上述の領域内に既知HCV1型及び/又はHCV2型ゲノムを含み、かつ少なくとも1つのヌクレオチドの差異を含む、ポリ核酸又はその相補体、その組成物に関する。

効果

 HCV型亜型)2d、3c又は異なる4型のための診断及び治療の手段となる。

概要

背景

概要

 HCV3型コア/E1領域の特定領域;及び/又はHCV3型のNS3領域の特定領域、及び/又はHCV3型のNS3/4領域の特定領域;及び/又はHCV3a型のBR36亜群のNS5領域の特定領域;コア領域内のヌクレオチド379で始まり、HCV4a型のコーディング領域;及び/又はHCV4型のコーディング領域;及び/又はHCV4型のコーディング領域;及び/又はHCV5型のコーディング領域;からのヌクレオチド配列に対応する8個以上の隣接ヌクレオチドを含む少なくとも1つのポリ核酸を含んで成るか、又はこのポリ核酸より構成され、しかもこのポリ核酸には上述の領域内に既知HCV1型及び/又はHCV2型ゲノムを含み、かつ少なくとも1つのヌクレオチドの差異を含む、ポリ核酸又はその相補体、その組成物に関する。 HCV型亜型)2d、3c又は異なる4型のための診断及び治療の手段となる。   なし

目的

本発明の背景にある技術的問題点は、HCV4型及び5型ならびにHCV2型及び3型の新しい変異体のコア、E1、E2、NS3、NS4及びNS5領域の新しい型特異的配列を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

 HCV4型特有であり、下記: − 配列番号167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187又は189に表されているとおりのE1領域の位置574〜957にまたがるHCVゲノム配列、 − 配列番号163、165又は193に表されているとおりのコア領域の位置1〜499にまたがるHCVゲノム配列、 − 配列番号191に表されているとおりのコア領域の位置1〜289にまたがるHCVゲノム配列、 − 配列番号205に表されているとおりのNS5B領域の位置7932〜8271にまたがるHCVゲノム配列、から選択されるHCVゲノム配列を有する、単離されたHCVポリ核酸ストリンジェントな条件下で任意の該HCVゲノム配列にハイブリダイズするポリ核酸、又は任意の該HCVゲノム配列又は任意の該HCVゲノム配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ核酸の相補物

請求項2

 請求項1に記載のHCVゲノム配列に由来する8以上の連続するヌクレオチドからなる単離されたHCVポリ核酸であって、該8以上の連続するヌクレオチドが、HCV4型に特有である、単離されたHCVポリ核酸。

請求項3

 請求項1又は2に記載のHCVポリ核酸を含む、単離されたポリ核酸。

請求項4

 請求項1〜3いずれか1項記載のHCV4型配列に由来するポリ核酸であって、上記ポリ核酸が、プライマーが由来する遺伝子型に属する所定のアイソレートのHCV4型核酸を特異的に増幅するためのプライマーとして作用することができる、ポリ核酸。

請求項5

 請求項1〜3いずれか1項記載のHCV4型配列に由来するポリ核酸であって、上記ポリ核酸が、HCV4型核酸の特異的検出及び/又はHCV4型の分類のためのハイブリダイゼーションプローブとして作用することができる、ポリ核酸。

請求項6

 少なくとも下記工程:(i)請求項5記載の1個以上のプローブを用いて適切な条件下で、生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズさせること、(ii)適切な条件下で洗浄すること、(iii)形成されたハイブリッドを検出すること、(iv)観察されたハイブリダイゼーションパターンから存在する1種以上のHCV遺伝子型の存在を推測することを含む、1種以上のHCV遺伝子型を含んでいる可能性の高い生物学的サンプル中に存在する、1種以上のHCV遺伝子型の存在をインビトロで検出するための、請求項1〜5いずれか1項記載のポリ核酸の使用。

請求項7

 請求項6の工程の前にサンプル核酸を抽出する工程を含む、1種以上のHCV遺伝子型を含んでいる可能性の高い生物学的サンプルに存在する、1種以上のHCV遺伝子型の存在をインビトロで検出するための、請求項6記載のポリ核酸の使用。

請求項8

 請求項6の工程の前に、サンプル核酸を抽出する工程、及び請求項4記載のプライマー又は他のHCV2型、HCV3型、HCV4型、HCV5型若しくは万能HCVプライマーの少なくとも1種以上を用いて核酸を増幅する工程を含む、1種以上のHCV遺伝子型を含んでいる可能性の高い生物学的サンプルに存在する1種以上のHCV遺伝子型の存在をインビトロで検出するための、請求項6記載のポリ核酸の使用。

請求項9

 請求項1〜3いずれか1項記載のポリ核酸のいずれかによってコードされるHCVポリペプチドからの少なくとも5以上の連続するアミノ酸からなる単離されたペプチド又はポリペプチドであって、該5以上の連続するアミノ酸がHCV4型に特有である、単離されたペプチド又はポリペプチド。

請求項10

 下記のアミノ酸残基:L7、A79、A127、S130、E152、V158、S177、Y177、V180、E180、R184、T189、Q192、I192、E192、N193、H193、H195、A210、V212、F214、V217、H218、H219、A232、S248、V249、I251、M251、D252、L255、V255、E256、M258、V258、Q260、M265、T268、H280、A284、V274、N292、S292、Q294、L297、I297、T308、F310、T310、A310、D310、V310、G317、P2645、K2650、K2653、G2656、V2658、T2668、A2673、N2673、K2681、H2686、D2691、L2692、Q2695、L2695、I2695、Y2704、V2712、F2715、V2719、T2722、S2725、G2729、Y2735、G2746、I2746、P2752、Q2753、P2754、T2754、T2757又はP2757の少なくとも1個を含む、請求項9記載の単離されたHCVペプチド又はポリペプチド。

請求項11

 下記のアミノ酸配列:VNYRNASGIYHI        (配列番号126)QHYRNISGIYHV        (配列番号127)EHYRNASGIYHI        (配列番号128)VNYRNASGVYHI        (配列番号226)QHYRNASGIYHV        (配列番号228)QHYRNVSGIYHV        (配列番号229)IHYRNASDGYYI        (配列番号230)VYETEHHILHL         (配列番号129)VYEADHIMHL         (配列番号130)VYEADYHILHL         (配列番号233)VYETDNHILHL         (配列番号234)VYETENHILHL         (配列番号235)VRVGNQSRCWVAL       (配列番号132)VRTGNTSRCWVPL       (配列番号133)VRAGNVSRCWTPV       (配列番号134)VKTGNQSRCWVAL       (配列番号243)VRTGNQSRCWVAL       (配列番号244)APYIGAPLES          (配列番号135)APYVGAPLES          (配列番号136)AVSMDAPLES          (配列番号137)APYIGAPVES          (配列番号253)AQHLNAPLES          (配列番号254)SPYVGAPLEP          (配列番号255)SPYAGAPLEP          (配列番号256)APYLGAPLES          (配列番号258)APYVGAPLES          (配列番号259)VPYLGAPLTS          (配列番号260)APHLRAPLSS          (配列番号261)APYLGAPLTS          (配列番号262)QPRRHWTTQD          (配列番号138)、又はRPRRHWTTQD          (配列番号139)の少なくとも1を含む、請求項9又は10記載の単離されたHCVペプチド又はポリペプチド。

請求項12

 請求項9〜11のいずれか1項に記載のHCVポリペプチドを含む、単離されたペプチド又はポリペプチド。

請求項13

 ベクター配列、適切な原核真核又はウイルスプロモーター配列、続いて請求項1〜3いずれか1項記載のポリ核酸配列を含む組換えベクターであって、上記組換えベクターが、のDNAとして注入されたとき、原核若しくは真核宿主、又は生きた哺乳動物の中で、請求項9〜12いずれか1項記載のHCV4型に由来するポリペプチドの発現を可能にする組換えベクター。

請求項14

 下記アミノ酸位置にまたがる下記HCV4型ポリペプチド: − コアタンパク質の発現については、位置1で始まり位置70〜326の領域内の任意の位置で終わるポリペプチド、 − E1の発現については、位置117〜192の領域の任意の位置で始まり263〜326の領域の任意の位置で終わるか、又は推定の膜アンカー欠失した形態である(位置264〜293±8アミノ酸)ポリペプチドのいずれかの発現を可能にする、請求項13記載の組換えベクター。

請求項15

 下記のアミノ酸位置にまたがる下記のHCV4型ポリペプチド: − E1の発現については、位置119〜326のポリペプチド、又は推定の膜アンカーが欠失した形態である(位置264〜293±8アミノ酸)ポリペプチドのいずれかの発現を可能にする、請求項14記載の組換えベクター。

請求項16

 上記ポリペプチドが、請求項13〜15いずれか1項記載の発現ベクターによって発現される組換えポリペプチドである、請求項9〜12いずれか1項記載のポリペプチド。

請求項17

 上記ペプチド又はポリペプチドの十分量を投与免疫応答を生ずることを含む、HCVに対して哺乳動物を免疫化するための方法における使用のための、請求項9〜12いずれか1項記載のペプチド又はポリペプチド。

請求項18

 医薬的に許容可能なアジュバントとともに上記ペプチド又はポリペプチドの十分量を投与し免疫応答を生ずることを含む、HCVに対して哺乳動物を免疫化するための方法における使用のための、請求項9〜12いずれか1項記載のペプチド又はポリペプチド。

請求項19

 請求項17又は18記載の方法によって、請求項9〜12いずれか1項記載のペプチド又はポリペプチドを用いた免疫化で産生される抗体であって、請求項9〜12いずれか1項記載のポリペプチドのいずれかと特異的に反応する、抗体。

請求項20

 少なくとも下記工程:(i)請求項9〜12又は16記載のペプチド又はポリペプチドのいずれかとHCV抗体の存在を分析すべき生物学的サンプルを接触させること、(ii)結合していない成分を除去すること、(iii)適切な条件下で、検出可能なラベルコンジュゲートしている異種抗体と、分析すべきサンプル中に存在する抗体と特異的に結合するこの異種抗体とで形成される免疫複合体インキュベートすること、(iv)視覚的に又はデンシトメトリーによって上記免疫複合体の存在を検出し、そしてHCVの存在を推定することを含む、HCVを含んでいる可能性の高い生物学的サンプルにおけるHCVの存在をインビトロで検出するための方法。

請求項21

 少なくとも下記工程:(i)ポリペプチドがビオチン化ポリペプチドの形態であり、そしてポリペプチドがストレプトアビジン又はアビジン複合体によって固体基質共有結合されている、請求項9〜12又は16記載のペプチド又はポリペプチドのいずれかをHCV抗体の存在について分析すべき生物学的サンプルと接触させること、(ii)結合していない成分を除去すること、(iii)適切な条件下で検出可能なラベルとコンジュゲートしている異種抗体と、分析すべきサンプル中に存在する抗体と特異的に結合するこの異種抗体とで形成される免疫複合体をインキュベートすること、(iv)視覚的に又はデンシトメトリーによって上記免疫複合体の存在を検出し、そしてHCVの存在を推定することを含むHCVを含んでいる可能性の高い生物学的サンプルにおけるHCVの存在をインビトロで検出するための方法。

請求項22

 少なくとも下記工程:(i)免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下での固定化形態における、請求項9〜12、又は16記載の少なくとも1種以上のペプチド又はポリペプチドと、1種以上の血清型のHCV抗体又は抗原の存在について分析すべき生物学的サンプルを接触させること、(ii)結合していない成分を除去することを含む、HCVを含んでいる可能性の高い生物学的サンプルにおける1種以上の血清型のHCVの存在を検出するための血清型アッセイに組み込むための、請求項9〜12、16、17又は18いずれか1項記載のペプチド又はポリペプチドの使用。

請求項23

 下記: − 少なくとも1種の請求項5記載のプローブ組成物 − バッファー、又はこのプローブと上記HCV遺伝子型との間のハイブリダイゼーション反応を可能にするバッファーを生産するために必要な成分 − 上記ハイブリダイゼーションから得られたハイブリッドを検出しそして観察されたハイブリダイゼーションパターンからサンプルに存在するHCV遺伝子型を推定するための手段、を含む、HCVを含んでいる可能性の高い生物学的サンプルに存在するHCV遺伝子型の存在を測定するためのキット

請求項24

 下記: − 請求項4記載のプライマー、HCV4型プライマー又は万能HCVプライマーから選択されたいずれかのプライマーを含有する少なくとも1種のプライマー組成物、 − 請求項5記載の少なくとも1種のプローブ組成物、 − バッファー、又はこのプローブと上記増幅産物との間のハイブリダイゼーション反応を可能にするバッファーを生産するために必要な成分 − 上記ハイブリダイゼーションから得られたハイブリッドを検出しそして観察されたハイブリダイゼーションパターンからサンプルに存在するHCV遺伝子型を推定するための手段、を含む、HCV遺伝子型を含んでいる可能性の高い生物学的サンプルに存在するHCV遺伝子型の存在を測定するためのキット。

請求項25

 下記: − 請求項9〜12又は16いずれか1項記載の少なくとも1種のペプチド又はポリペプチド、 − バッファー、又はペプチド又はポリペプチドと生物学的サンプルに存在するHCVに対する抗体との間の結合反応を可能にするバッファーを生産するために必要な成分、 − 上記結合反応において形成される免疫複合体を検出するための手段を含む、HCVを含んでいる可能性の高い生物学的サンプルに存在するHCV抗体の存在を測定するためのキット。

請求項26

 下記工程:(i)サンプル核酸を用意すること、(ii)請求項1〜3いずれか1項記載のポリ核酸を増幅すること、(iii)請求項1〜3いずれか1項記載のポリ核酸の配列を決定することを含む、生物学的サンプルに存在するHCV遺伝子型をインビトロで検出又はスクリーニングするための方法。

請求項27

 下記工程:(i)サンプル核酸を用意すること、(ii)請求項1〜3いずれか1項記載のポリ核酸を特異的に増幅すること、を含む、生物学的サンプルに存在するHCV遺伝子型を検出又はスクリーニングするための方法。

請求項28

 請求項1〜3いずれか1項記載のポリ核酸を含むHCV遺伝子型の存在を測定するためのキット。

請求項29

 請求項1〜5いずれか1項記載のポリ核酸を含む組成物

請求項30

 請求項9〜12又は16いずれか1項記載のペプチド又はポリペプチドを含む組成物。

技術分野

0001

 本発明はC型肝炎ウイルス(HCV遺伝子型の新しい配列及び治療及び診断用薬剤としての使用に関する。

0002

 本発明は、新しい2型亜型2dのコーディング領域に対応する新しいヌクレオチド及びアミノ酸配列、HCV3a型に対応する型特異的配列、新しい亜型3cのコーディング領域に対応する新しい配列及びHCV4型及び5型亜型5aのコーディング領域に対応する新しい配列;それらを調製するための方法、及び診断、予防及び治療のためのその使用に関する。

0003

 本発明の背景にある技術的問題点は、HCV4型及び5型ならびにHCV2型及び3型の新しい変異体コア、E1、E2、NS3、NS4及びNS5領域の新しい型特異的配列を提供することにある。これらの新しいHCV配列は、生物学的試料の中で2型及び/又は3型及び/又は4型及び/又は5型のHCV遺伝子型の存在を診断するのに有用である。さらに、これらの新しい型特異的配列を利用可能とすることにより、HCV検出の全体的感度を増大させることができ、同様に治療目的にも役立つことがわかるはずである。

0004

 C型肝炎ウイルス(HCV)は、非A非B型肝炎の主要な原因であることがわかってきた。いくつかのプロトタイプ分離株の完全なゲノム網羅するcDNAクローンの配列が決定されている(Kato et al., 1990; Choo et al., 1991; Okamoto et al., 1991; Okamoto et al., 1992)。これらの分離株の比較は、ヌクレオチド配列内の可変性を用いて、約68%の平均相同性をもつ少なくとも2つの異なる遺伝子型、1型(HCV−1及びHCV−J)及び2型(HC−J6及びHC−J8)を区別することができるということを示している。各型の中に、約79%の平均相同性をもつ少なくとも2つの亜型が存在する(例えばHCV−1及びHCVJで表わされる)。同じ亜型に属するHCVゲノムは、90%以上の平均相同性を示す(Okamoto et al., 1992)。しかしながらHCV−T分離株のNS5領域の部分的ヌクレオチドは、以前に公表された配列とせいぜい67%の相同性しか示さず、このことはさらにもう1つのHCV型の存在を表わしていた(Mori et. al., 1992)。この3型の5′非翻訳領域(UR)、コア、NS3及びNS5領域の一部分が公表され、これはさらに3つの主要な遺伝子型とその亜型の間の類似の進化上の距離をさらに立証している(Chan et al.,1992) 。

0005

 臨床的試料中の3型遺伝子型の同定は、NS5領域に対する型特異的プライマーを用いたPCRを用いて達成できる。しかしながら、これが成功する度合は、血清中に存在するウイルス力価及び配列可変性によって大きく左右される。従って、特に3型及び本発明に記述されている新しい4型及び5型及び/又はV群(Cha et al., 1992)遺伝子型についての読取り枠内の型通りのPCRは、成功しないものと予想することができる。保持レベルの高い5′UR内の変異に基づく新しい型分類システム(LiPA)は、5つの主要なHCV遺伝子型及びその亜型を決定できることから(Stuyver et al., 1993)、より有用なものであることが実証された。ネステッドPCRでは4つのプライマーが新しい3型、4型及び5型の遺伝子型の未知の配列と整合することが必要であるのに対して、高力価の分離株の選択により、わずか2つのプライマーでクローニングするためのPCRフラグメントを得ることができる。

0006

 5′の非翻訳領域(5′UR)の新しい配列が、Bukh et al. (1992)によってリストアップされた。これらのうちのいくつかについてのE1領域に関して、最近記述されている(Bukh et al., 1993)、Bukh et al. (1992)により記述されたDK12及びHK10及びChan et al (1991)により記述され3型として分類されたE−b1〜Eb8を含む一群の分離株に対して5′URにおいて類似の配列を伴う分離株が、5′UR、E1のカルボキシル末端部分及びNS5領域においてIV群としてCha et al (1992; WO92/19743)によって報告され記述され、同様に、この出願の発明者によって分離株BR56のための5′URの中で記述され3型として分類された(Stuyver et al., 1993)。

0007

 本発明の目的は、HCV感染の検出を可能にする新しいHCVヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供することにある。

0008

 本発明のもう1つの目的は、ゲノムレベルでの型及び亜型に明確に結びつけられた異なる血清学的群に、感染した生物学的流体を分類することを可能にする新しいヌクレオチド及びアミノ酸HCV配列を提供することにある。

0009

 本発明のもう1つの目的は、HCV検出速度全体を改善する新しいヌクレオチド及びアミノ酸HCV配列を提供することにある。

0010

 本発明のもう1つの目的は、HCVワクチン組成物の設計に有用な新しいHCV配列を提供することにある。

0011

 本発明のもう1つの目的は、治療又は診断のため、これらの新しいHCV配列によりコードされるポリペプチドに対して出現した抗体から成る薬学組成物を提供することにある。

0012

 本発明は、より特定的には、
− HCV3型ゲノム配列、より特定的には次の領域のいずれかの中の配列;
− HCV亜型3aのコア/E1領域の位置417〜957にまたがる領域、
− HCV3型のNS3領域の位置4664〜4730にまたがる領域、
− HCV3型のNS3/4領域の位置4892〜5292にまたがる領域、
− HCV亜型3aのBR36亜群のNS5領域の8023〜8235にまたがる領域、
− HCV亜型3cのゲノム配列、さらに特定的には、上述の領域のコーディング領域内の配列;
− HCV亜型2dゲノム配列、より特定的にはHCV亜型2dのコーディング領域;
 − HCV4型ゲノム配列、より特定的にはコーディング領域、より特定的には亜型4a、4e、4f、4g、4h、4i及び4jのコーディング領域;
− HCV5型ゲノム配列、より特定的にはHCV5型のコーディング領域、より特定的には、コア、E1、E2、NS3及びNS4をコードする領域、
といったHCV配列の少なくとも1つから選択された少なくとも5個、好ましくは8個以上の隣接ヌクレオチドを含む少なくとも1つのポリ核酸を含むか又はこれより構成された組成物に関し、ここで前記ヌクレオチド番号づけは、表1に示されている通りのHCV核酸の番号づけの関係にあるものであり、前記ポリ核酸には、上述の領域内に既知のHCV(1型、2型及び3型)ポリ核酸配列と少なくとも1つのヌクレオチドの差異を含むポリ核酸又はその相補体を含んでいる。

0013

 本発明のポリ核酸中のヌクレオチドの差異には、このポリ核酸によりコードされた対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸の差異を伴っていてもいなくてもよい。

0014

 本発明の好ましい実施態様に従うと、本発明は、ポリ核酸がHCVポリタンパク質をコードするHCVヌクレオチド配列の少なくとも1部分に対応する少なくとも5つ、好ましくは少なくとも8個のヌクレオチドを含み、しかも前記HCVポリタンパク質がその配列中に、表記がその1文字コードアミノ酸残基を表わす1つの文字とKato et al., 1990 に従ったアミノ酸番号づけを表わす1つの番号で構成されている、次のアミノ酸残基のうちの少なくとも1つを含んでいる状態で、HCVポリタンパク質をコードする少なくとも1つのポリ核酸を含んで成る組成物に関する。

0015

 L7, Q43, M44, S60, R67, Q70, T71, A79, A87, N106, K115, A127, A190, S130, V134, G142, I144, E152, A157, V158, P165, S177又はY177, I178, V180又はE180又はF182, R184, I186, H187, T189, A190, S191又はG191, Q192又はL192又はI192又はV192又はE192, N193又はH193又はP193, W194又はY194, H195, A197又はI197又はV197又はT197, V202, I203又はL203, Q208, A210, V212, F214, T216, R217又はD217又はE217又はV217, H218又はN218, H219又はV219又はL219, L227又はI227, M231又はE231又はQ231, T232又はD232又はA232又はK232, Q235又はI235, A237又はT237, I242, I246, S247, S248, V249, S250又はY250, I251又はV251又はM251又はF251, D252, T254又はV254, L255又はV255, E256又はA256, M258又はF258又はV258, A260又はQ260又はS260, A261, T264又はY264, M265, I266又はA266, A267, G268又はT268, F271又はM271又はV271, I277, M280又はH280, I284又はA284又はL84, V274, V291, N292 又は S292, R293 又はI293又は Y293, Q294 又はR294, L297又は I297 又は Q297,A299又は K299 又は Q299,N303又は T303, T308 又は L308,T310又は F310 又は A310 又はD310又は V310, L313, G317 又は Q317, L333, S351, A358, A359, A363, S364, A366, T369, L373, F376, Q386, I387, S392, I399, F402, I403, R405, D454, A461, A463, T464, K484, Q500, E501, S521, K522, H524, N528, S531, S532, V534, F536, F537, M539, I546, C1282, A1283,H1310, V1312, Q1321, P1368,V1372, V1373, K1405, Q1406,S1409, A1424, A1429, C1435, S1436, S1456, H1496, A1504, D1510, D1529, I1543, N1567, D1556, N1567, M1572, Q1579, L1581, S1583, F1585, V1595, E1606 又はT1606, M1611, V1612 又は L1612, P1630, C1636, P1651, T1656又はI1656, L1663, V1667, V1677, A1681, H1685, E1687, G1689, V1695, A1700, Q1704, Y1705, A1713, A1714又はS1714, M1718, D1719, A1721又はT1721, R1722, A1723 又は V1723, H1726 又はG1726, E1730, V1732, F1735, I1736, S1737, R1738, T1739, G1740, Q1741, K1742, Q1743, A1744, T1745,L1746, E1747 又はK1747,T11749, A1750, T1751又はA1751, V1753, N1755, K1756, A1757, P1758, A1759, H1762, T1763, Y1764, P2645, A2647, K2650, K2653又はL2653, S2664,N2673, F2680, K2681, L2686,H2692, Q2695又は L2695又はI2695, V2712, F2715, V2719又は Q2719, T2722, T2724, S2725, R2726, G2729, Y2735, H2739,I2748, G2746又はI2746, I2748, P2752 又は K2752, P2754 又はT2754, T2757又は P2757。

0016

 上述の残基の各々は、コア、E1、E2、NS3、NS4及びNS5領域についてHCVのその他の型又は亜型の既知の配列と並べて比較した本発明の新しいアミノ酸配列を示す図2、5、7、11又は12のいずれかに見い出すことができる。

0017

 より特定的に言うと、本発明に従った組成物内に含まれるポリ核酸は、
− 図5に示されている通りの、HCV亜型2d、3型(より特定的には亜型3a及び3cのための新しい配列)、新しい4型亜型(より特定的には亜型4a、4e、4f、4g、4h、4i及び4jのための新しい配列)及び5a型のコア/E1領域のアミノ酸位置1〜319にまたがる新しい配列;
− 図12に示されている通りの、HCV亜型5aのE1/E2領域のアミノ酸位置328〜546にまたがる新しい配列;
− 図7又は11に示されている通りの、HCV3型(より特定的には新しい亜型3aの配列)及び亜型5aのNS3/NS4領域のアミノ酸位置1556〜1764にまたがる新しい配列;
− 図2に示されている通りの、HCV亜型2d、3型(より特定的には新しい亜型3a及び3c)、新しい4型亜型(より特定的には亜型4a、4e、4f、4g、4h、4i及び4j)及び亜型5aのNS5領域のアミノ酸位置2645〜2757にまたがる新しい配列
といった新しいHCVアミノ酸配列をコードするHCV配列の少なくとも1つから選択された隣接ヌクレオチドの1配列に対応する少なくとも5個、好ましくは8個以上の隣接ヌクレオチドを含んでいる。

0018

 上述のLiPAシステムを用いて、高力価の3型のC型肝炎ウイルスをもつブラジル人の献血者、高力価の4型C型肝炎ウイルスをもつガボン人の患者及び高力価のHCV5型感染を受けたベルギー人の患者が選定された。これまで報告されたことのないコア、E1、NS5及びNS4領域内のヌクレオチド配列を本発明の枠内で分析した。あらゆる4型分離株のコーディング配列コア領域を除く)が初めて本発明において報告されている。新しい3型分離株についても、NS5b領域を分析した。NS5b配列を決定した後、Mori et al. (1992)により記述されたTa及びTb亜型との比較が可能であり、3型配列を3a型遺伝子型として同定することができた。新しい4型の分離株は、NS5及びE1領域の中の得られた相同性に基づき10個の亜型に分類した。新しい2型及び3型配列も同様に、ベルギー及びオランダ収集された血清からの以前に記述された2型又は3型の亜型から区別できた。

0019

 「ポリ核酸」という語は、完全ヌクレオチド配列に対して少なくとも5つの隣接ヌクレオチド(例えば少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個又はそれ以上の隣接ヌクレオチド)を含んでいてもよい1本鎖又は2本鎖の核酸配列を表す。長さが約100ヌクレオチドまでのポリ核酸は往々にしてオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。ポリ核酸は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドヌクレオチド類似体又は修飾ヌクレオチドで構成されてもよいし、或いは、治療目的のため適合させられていてもよい。ポリ核酸は、クローニング目的又はインビボ治療又は予防のために使用することのできる2本鎖cDNAクローンを含んでいてもよい。

0020

 「ポリ核酸組成物」という語は、基本的に前記ポリ核酸を含むあらゆる種類の組成物のことを言う。この組成物は、診断用又は治療用のいずれのものでもありうる。

0021

 「〜に対応するヌクレオチド」という表現は、特定のHCV配列内の指示されたヌクレオチド又は領域内に対し相同性又は相補性をもつヌクレオチドのことを言う。

0022

 「コーディング領域」という語は、HCVポリタンパク質をコードするHCVゲノムの領域に対応する。実際、これには、5′非翻訳領域及び3′非翻訳領域を除いて完全なゲノムが含まれる。

0023

 「HCVポリタンパク質」という語は、HCV−J分離株のHCVポリタンパク質のことを指す(Kato et al., 1990)。位置330にあるアデニン残基(Kato et al., 1990)は、HCV−J及びその他の1b型分離株内の3,010個のアミノ酸、及びHCV−1及びその他の1a型分離株内の3,011個のアミノ酸、及び2型分離株HC−J6及びHC−J8内の3,033個のアミノ酸の長いHCVポリタンパク質を開始するATGコドンの第1の残基である(Okamoto et al., 1992)。

0024

 本発明ではこのアデニンは、核酸レベルで位置1として呼ばれ、
このメチオニンアミノ酸レベルで位置1と呼ばれる。1a型分離株は1つの余分なアミノ酸をNS5a領域内に含んでいることから、1a型及び1b型のコーディング配列はコア、E1、NS3及びNS4領域の中の同一の番号づけを有するものの、表1に示されているようにNS5b領域では異なっていることになる。2型分離株は、1型分離株に比べてE2領域内に4つの余分なアミノ酸を、
又はNS5領域内に18個の余分なアミノ酸を有し、表1に表わされているようにNS3/4領域及びNS5b領域の中の1型分離株と番号づけが異なることになる。

0025

0026

 表1:その他のプロトタイプ分離株について用いられている番号づけと、本発明で使用されているHCVヌクレオチド及びアミノ酸番号づけシステム(*)の比較。例えば、8352/8564は、Kato et al. (1990)により記述されている通りのヌクレオチド8352〜ヌクレオチド8564までの番号づけによって指定された領域を表わす。本発明の番号づけシステムは、ポリタンパク質開始部位で始まることから、Kato et al. (1990)により記述されている5′非翻訳領域の329個のヌクレオチドを差し引かなくてはならず、対応する領域はヌクレオチド8023(「8352−329」)から8235(「8564−329」)まで番号づけされる。

0027

 「HCV型」という語は、HCV−J分離株(Kato et al., 1990)の長いHCVポリタンパク質の第1のATGコドン又は第1のメチオニンで始まる前記番号づけで、その群のその他の分離株のポリタンパク質に対して、その完全ゲノムが核酸レベルで74%以上の相同性を示すか、そのヌクレオチド位置7932と8271の間のNS5領域が核酸レベルで74%以上の相同性を示すか、又はその完全HCVポリタンパク質がアミノ酸レベルで78%以上の相同性を示すか、又は位置2645と2757のアミノ酸の間のNS5領域がアミノ酸レベルで80%以上の相同性を示すHCV分離株の一群に対応する。異なる型のHCVに属する分離株は、完全ゲノム全体にわたり、核酸レベルで74%未満、そしてアミノ酸レベルで78%未満の相同性を示す。同じ型に属する分離株は、通常同じ亜型に属する場合、核酸レベルで約92%〜95%、アミノ酸レベルで95〜96%の相同性を示し、同じ型に属するものの亜型が異なる分離株は、好ましくは核酸レベルで約79%、アミノ酸レベルで85〜86%の相同性を示す。

0028

 より好ましくはHCV型の定義は、以下に詳述されている通り、
計算されたそのヌクレオチド距離に従ってHCV分離株の分類から結論される。

0029

 (1)ヌクレオチド7935と8274(Choo et al., 1991)又は8261と8600(Kato et al., 1990)又は8342と8681(Okamoto et al., 1991)の間のNS5b領域内の核酸配列の系統分類分析に基づくと、同じHCV型に属する分離株は0.34未満、通常は0.33未満、そしてさらに普通には0.32未満のヌクレオチド距離を示し、同じ亜型に属する分離株は、0.135未満、通常は0.13未満、さらに普通には0.125未満のヌクレオチド距離を示し、その結果、同型であるが異なる亜型に属する分離株は0.135〜0.34、通常は0.1387〜0.2477、さらに普通には0.15〜0.32のヌクレオチド距離を示し、異なるHCV型に属する分離株は0.34以上、通常は0.35以上、さらに普通には0.358以上、さらに普通には0.1384〜0.2977のヌクレオチド距離を示す。

0030

 (2)ヌクレオチド378と957の間のコア/E1領域の中の核酸配列の系統分類分析に基づくと、同じHCV型に属する分離株は0.38未満、通常は0.37未満、より普通には0.364未満のヌクレオチド距離を示し、同じ亜型に属する分離株は0.17未満、通常は0.16未満、さらに普通には0.15未満、さらに普通には0.135未満、さらに普通には0.134未満のヌクレオチド距離を示し、結果として、同型であるが異なる亜型に属する分離株は0.15〜0.38、通常は0.16〜0.37、さらに普通には0.17〜0.36、さらに普通には0.133〜0.379の範囲のヌクレオチド距離を示し、異なるHCV型に属する分離株は0.34、0.35、0.36以上、通常は0.365以上、さらに普通には0.37以上のヌクレオチド距離を示す。

0031

 (3)ヌクレオチド4664と5292(Choo et al., 1991)又はヌクレオチド4993と5621(Kato et al., 1990)又はヌクレオチド5017と5645(Okamoto et al, 1991)の間のNS3/NS4領域内の核酸配列の系統分類分析に基づくと、同じHCV型に属する分離株は0.35未満、通常は0.34未満、さらに普通には0.33未満のヌクレオチド距離を示し、同じ亜型に属する分離株は0.19未満、通常は0.18未満、さらに普通には0.17未満のヌクレオチド距離を示し、結果として同じ型ではあるが異なる亜型に属する分離株は0.17〜0.35、通常は0.18〜0.34、さらに普通には0.19〜0.33のヌクレオチド距離を示し、異なるHCV型に属する分離株は0.33以上、通常は0.34以上、さらに普通には0.35以上のヌクレオチド距離を示す。

0032

0033

 PHYLIPプログラムDNAPISTにより作り出された数字は最小から最大まで(平均±標準偏差)として表わされている。同じ亜型に属する分離株(「分離株」)、同じ型の異なる亜型に属する分離株(「亜型」)、及び異なる型に属する分離株(「型」)のための系統分類距離が示されている。

0034

 利用可能な配列の比較系統分類分析において、ゲノムの異なる領域についての分子進化的距離の範囲は、系統分類推定パッケージPHYLIPバージョン3.5CのDNA DISTプログラムを用いた19781の対比較に基づいて、計算された(Felsenstein, 1993)結果を表2に示すが、各領域の中の得られた大部分の距離が一定の分離株の分類と合致するものの、340bpのNS5領域の中の得られた範囲のみが重複せず、従って決定的なものであることを表わしている。ただし、本発明において実施されたとおり、一定の与えられた分離株の最終的分類の前に少なくとも2つの領域からの配列情報を得ることが好ましい。

0035

 異なる型のHCVに対する番号及びHCV型の学名の指定は、異なる型の発見年代に基づいている。本発明において使用される番号づけシステムは、なおも国際協定又は指針に従って変異する可能性がある。例えば、「4型」は「5型」又は「6型」へと変更されるかもしれないのである。

0036

 「亜型」という語は、HCVポリタンパク質の開始コドンのアデニン残基で始まっている前記番号づけが、同じ群のその他の分離株のゲノムの対応する部分に対して、その完全ポリタンパク質が核酸及びアミノ酸の両レベルで90%以上の相同性を示すか、又はそのヌクレオチド位置7932と8271の間のNS5領域が核酸レベルで90%以上の相同性を示すHCV分離株の1群に対応する。同じHCV型であるが異なる亜型に属する分離株は、核酸レベルで74%以上の、そしてアミノ酸レベルで78%以上の相同性を示す。

0037

 「BR36亜群」という語は、位置8023から8235までのNS5b領域の中の配列番号1、3、5、7、9、11に表わされている通りの配列に対して95%、好ましくは95.5%、最も好ましくは96%の相同性をもつ3a型HCV分離株(BR36、BR33、BR34)の一群のことを表わす。

0038

 E1、E2及びNS4領域などの極端可変的な領域がポリタンパク質の完全ゲノムの平均的相同性よりも低い相同性を示すことを理解すべきである。

0039

 この基準を用いて、HCV分離株を少なくとも6つの型に分類することができる。位置7932と8271の間のNS5の一部分を含むコーディング領域及び5′URの相同性に基づいて、1型、2型、3型及び4型の中に、1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i及び4jといった複数の亜型を明らかに区別することができる。報告された分離株の大部分及び本発明の型分類システムに従ったそれらの提案された分類ならびにその他の提案された分類の概観が、表3に示されている。

0040

0041

 「相補体」という語は、指示された配列に相補的で、指示された配列にハイブリッド形成することのできるヌクレオチド配列のことを言う。

0042

 本発明の組成物は数多くの組合せを含むことができる。一例を挙げると、本発明の組成物は、以下のものを含むことができる:
− 同じ領域からの2つ(又はそれ以上の)核酸、又は、
− 同じ分離株又は異なる分離株について、それぞれ異なる領域からの2つ(又はそれ以上の)核酸、
− 又は、(同じ分離株又は異なる分離株についての)少なくとも2つの異なる領域から及び同じ領域からの核酸。

0043

 本発明は、より特定的には、上述の通りのポリ核酸組成物において、このポリ核酸が以下のHCV3型ゲノム配列のいずれかから選択されたヌクレオチド配列に対応している組成物に関する:

0044

− 図4に示されているような、コア/E1領域の位置417〜957にまたがる領域の中の、配列番号13、15、17、19、21、23、25又は27(HD10、BR36又はBR33配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して少なくとも67%、好ましくは69%以上、最も好ましくは71%以上、さらに一層好ましくは73%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0045

− 図4に示されているような、E1領域の位置574〜957にまたがる領域の中の、配列番号13、15、17、19、21、23、25又は27(HD10、BR36、又はBR33の配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して少なくとも65%、好ましくは67%以上、最も好ましくは69%以上、さらに好ましくは70%以上、最も好ましくは74%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0046

− 図4に示されているような、コア領域の位置1〜378にまたがる領域の中の、配列番号147(HVC3c型のコア領域の位置1〜346、配列BE98を表わす)に表わされている通りの配列のいずれかに対して少なくとも79%、より好ましくは少なくとも81%、最も好ましくは83%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0047

− 図4に示されているような、コア/E1領域の位置417〜957にまたがる領域の中の、配列番号13、15、17、19、21、23、25又は27(HD10、BR36又はBR33配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して少なくとも74%、より好ましくは少なくとも76%、最も好ましくは78%以上の相同性を有するHVC3a型のHCVゲノム配列、

0048

− 図4に示されているような、E1領域の位置574〜957にまたがる領域の中の、配列番号13、15、17、19、21、23、25又は27(HD10、BR36又はBR33配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して少なくとも74%、好ましくは76%以上、最も好ましくは78%以上の相同性を有するHCV3a型のHCVゲノム配列;

0049

− 図6に示されているような、NS3領域の位置4664〜4730にまたがる領域の中の、配列番号29(HCC153配列)に表わされている通りの配列に対して73.5%以上、好ましくは74%以上、最も好ましくは75%の相同性を有するHCVゲノム配列;

0050

− 図6又は10に示されているような、NS3/NS4領域の位置4892〜5292にまたがる領域の中の、配列番号29、
31、33、35、37又は39(HCC153、HD10、BR36配列)に表わされている通りの配列に対して70%以上、好ましくは72%以上、最も好ましくは74%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0051

− 図1に示されているような、NS5領域の位置8023〜8235にまたがる領域の中の、配列番号5、7、1、3、9又は11(BR34、BR33、BR36配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して95%以上、好ましくは95.5%以上、最も好ましくは96%以上の相同性を有するHCV3a型のBR36の亜群のHCVゲノム配列;

0052

− 図1に示されているような、NS5領域の位置8023〜8192にまたがる領域の中の、配列番号5、7、1、3、9又は11(BR34、BR33、BR36配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して96%以上、好ましくは96.5%以上、最も好ましくは97%以上の相同性を有するHCV3a型のBR36亜群のHCVゲノム配列;

0053

− 図1に示されているような、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号149(BE98配列)に表わされている通りの配列に対して79%以上、より好ましくは81%以上、最も好ましくは83%以上の相同性を有するものとして特徴づけられているHCV3c型のHCVゲノム配列。

0054

 好ましくは上述のゲノムHCV配列は、上述の配列全てのコーディング領域からの配列を描いている。

0055

 ヌクレオチド距離分類システムに従うと(このヌクレオチド距離は前述の通りに計算される)、前記組成物の前記配列は、以下のものから選択される。

0056

− 図4に示されている通り、コア/E1領域の位置417〜957にまたがる領域の中の、配列番号13、15、17、19、21、23、25又は27に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.44未満、好ましくは0.40未満、最も好ましくは0.36未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列;

0057

− 図4に示されている通り、E1領域の位置574〜957にまたがる領域の中の、配列番号19、21、23、25又は27に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.53未満、好ましくは0.49未満、最も好ましくは0.45未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列;

0058

− 図3に示されている通り、コア領域の位置1〜378にまたがる領域の中の、配列番号147に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.15未満、好ましくは0.13未満、最も好ましくは0.11未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列;

0059

− 図4に示されている通り、コア/E1領域の位置417〜957にまたがる領域の中の、配列番号13、15、17、19、21、23、25又は27に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.3未満、好ましくは0.26未満、最も好ましくは0.22未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCV3a型のHCVゲノム配列;

0060

− 図4に示されている通り、E1領域の位置574〜957にまたがる領域の中の、配列番号13、15、17、19、21、
23、25又は27に表わされている通りの配列のいずれかに対して、0.35未満、好ましくは0.31未満、最も好ましくは0.27未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCV3a型のHCVゲノム配列;

0061

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置8023〜8235にまたがる領域の中の、配列番号5、7、1、3、9又は11に表わされている通りの配列のいずれかに対して、0.0423未満、好ましくは0.042未満、好ましくは0.0362未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCV3a型のBR36亜群のHCVゲノム配列;

0062

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号149に表わされている通りの配列に対して、0.255未満、好ましくは0.25未満、より好ましくは0.21未満、最も好ましくは0.17のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCV3c型のHCVゲノム配列。

0063

 本出願においては、NS4エピトープ領域に加えて、Cha et al. (1992; WO92/19743)により開示されているE1のカルボキシ末端シグナルアンカー配列と重複しないE1タンパク質抗原ドメインをコードするE1配列及びNS5領域の一部分が、全て3a型(配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、35、37又は39)に属するBR33、BR34、BR36、HCC153及びHD10という4つの異なる分離株について開示されている。

0064

 同様に、新しい亜型3cの配列(コア及びNS5領域内の分離株BE98の配列番号147、149)も本発明の枠内に入る(図3及び1参照)。

0065

 最後に、本発明は又配列番号217に表わされている通りの新しい亜型3aの配列にも関する(図1参照)。

0066

 同様に発明の範囲内に入るのは、上述の配列番号のいずれかに与えられているとおりのヌクレオチド配列のいずれかから選ばれたポリ核酸の配列変異体であり、この配列変異体は主としてオリゴヌクレオチドの端部(3′又は5′)に単数又は複数のヌクレオチドの欠失及び/又は挿入、又はいくつかの非必須ヌクレオチドとその他のヌクレオチド(修飾ヌクレオチド及び/又はイノシンを含む)の置換を含んでおり、例えば1型又は2型の配列は、図1(NS5領域)、図3(コア領域)、図4(コア/E1領域)、図6及び10(NS3/NS4領域)に示されている通りの3型の型特異的ヌクレオチドと共に、1型又は2型の配列のいくつかのヌクレオチドを置換することにより、3型配列へと修飾することが可能である。

0067

 もう1つの実施態様に従うと、本発明はポリ核酸が以下のHCV5型ゲノム配列のいずれかから選択されたヌクレオチド配列に対応している、上述のとおりのポリ核酸組成物に関する。

0068

− 図9及び3に示されている通り、コア領域の位置1〜573にまたがる領域の中の、配列番号41、43、45、47、49、
51、53(PC配列)又は151(BE95配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して85%以上、好ましくは86%以上、最も好ましくは87%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0069

− 図4に示されている通り、E1の位置574〜957にまたがる領域の中の、配列番号41、43、45、47、49、51、
53(PC配列)、153又は155(BE95、BE100配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して61%以上、好ましくは63%以上、より好ましくは65%以上、さらにより好ましくは66%以上、最も好ましくは67%以上(例えば69及び71%)の相同性を有するHCVゲノム配列;

0070

− 図6又は10に示されているように、NS3領域の位置3856〜4209にまたがる領域の中の、配列番号55、57、197又は199(PC配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して76.5%以上、好ましくは77%以上、
最も好ましくは78%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0071

− 図13に示されている通り、E1/E2領域の位置980〜1179にまたがる領域の中の、配列番号157(BE95配列)に表わされている通りの配列と68%以上、好ましくは70%以上、最も好ましくは72%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0072

− 図6又は10に示されている通り、NS4領域の位置4936〜5296にまたがる領域の中の、配列番号59又は61(PC配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して57%以上、好ましくは59%以上、最も好ましくは61%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0073

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号159又は161(BE95又はBE96の配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して93%以上、好ましくは93.5%以上、最も好ましくは94%以上の相同性を有するHCVゲノム配列。

0074

 好ましくは、上述のゲノムHCV配列は、上述の全ての配列のコーディング領域からの配列を描いている。

0075

 ヌクレオチド距離分類システムに従うと(このヌクレオチド距離は、前述のとおりに計算される)、前記組成物の前記配列は、以下のものから選択されている:

0076

− 上述の5型配列に対し、E1領域について0.53未満、好ましくは0.51未満、より好ましくは0.49未満のヌクレオチド距離;
− 上述の5型配列に対し、コア領域について0.3未満、好ましくは0.28未満、より好ましくは0.26未満のヌクレオチド距離;
− 上述の5型配列に対し、NS5領域について0.072未満、好ましくは0.071未満、より好ましくは0.070未満のヌクレオチド距離。

0077

 Bukh et al (1992)により5′UR内で記されたSA1、SA3及びSA7を含む1群の分離株と5′UR内の類似の配列をもつ分離株が、Cha et al. (1992; WO92/19743)によりV群として報告され、5′UR及びNS5領域の中の記述されている。この分離株の群は、本発明に記されている通り5a型に属している(配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、151、153、155、157、159、161、197及び199)。

0078

 同様に本発明の範囲内に含まれるのは、上述の配列番号のいずれかに記されているとおりのヌクレオチド配列のいずれかから選択されたポリ核酸の配列変異体であり、この配列変異体には、主としてオリゴヌクレオチドの末端(3′又は5′)に単数又は複数のヌクレオチドの欠失及び/又は挿入、或いはいくつかの非必須ヌクレオチド(すなわちHCVの異なる遺伝子型を区別するのに必須でないヌクレオチド)のその他のヌクレオチド(修飾ヌクレオチド及び/又はイノシンを含む)による置換が含まれており、例えば、1型又は2型の配列は、1型又は2型の配列のいくつかのヌクレオチドを図3(コア領域)、図4(コア/E1領域)、図10(NS3/NS4領域)、図14(E1/E2領域)に示されている通りの5型の型特異的ヌクレオチドで置換することによって5型配列に修飾することが可能である。

0079

 Bukh et al (1992)により5′UR内で記述されている通りのZ6及びZ7を含む分離株と類似する5′UR内の配列をもつBU74及びBU79を含むもう1つの分離株の他の群が、本願の発明者によって5′UR内に記述され新しい4型として分類された(Stuyver et al., 1993)。この群に属する複数の新しいガボン人の分離株のコア、E1及びNS5配列を含むコーディング配列が、
本発明において開示されている(配列番号106、108、110、112、114、116、118、120及び122)。

0080

 さらにもう1つの実施態様に従うと、本発明は、前記ポリ核酸が以下のHCV4型ゲノム配列のいずれかから選択されたヌクレオチド配列に対応している、上述の通りの組成物に関する。

0081

− 図4に示されている通り、配列番号118、120又は122(GB358、GB549、GB809配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して、位置574〜957にまたがるE1領域の中の66%以上、好ましくは68%以上、最も好ましくは70%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0082

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号118、120又は122(GB358、GB549、GB809配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して71%以上、好ましくは72%以上、最も好ましくは74%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0083

− 図4に示されている通り、コア/E1領域の位置1〜378にまたがる領域の中の、配列番号163又は165(GB809、
CAM600配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して92%以上、好ましくは93%以上、最も好ましくは94%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0084

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号183、185又は187(GB116、GB215、GB809配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して85%以上、好ましくは86%以上、より好ましくは86.5%以上、最も好ましくは87%以上、88%以上又は89%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4c);

0085

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号189(GB908配列)に表わされている通りの配列に対して81%以上、好ましくは83%以上、最も好ましくは85%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4a);

0086

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号167又は169(CAM600、
GB908配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して85%以上、好ましくは87%以上、最も好ましくは89%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4e);

0087

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号171又は173(CAMG22、
CAMG27配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して79%以上、好ましくは81%以上、最も好ましくは83%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4f);

0088

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号175(GB549配列)に表わされている通りの配列に対して84%以上、好ましくは86%以上、最も好ましくは88%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4g);

0089

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号177(GB438配列)に表わされている通りの配列に対して83%以上、好ましくは85%以上、最も好ましくは87%以上の相同性を有する、HCVゲノム配列(亜型4h);

0090

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号179(CAR4/1205配列)
に表わされている通りの配列に対して76%以上、好ましくは78%以上、最も好ましくは80%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4i);

0091

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号181(CAR4/901配列)に表わされている通りの配列に対して84%以上、好ましくは86%以上、最も好ましくは88%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4j);

0092

− 図4に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号106、108、110、112、114又は116(GB48、GB116、GB215、GB358、GB549、GB809配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して73%以上、好ましくは75%以上、最も好ましくは77%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0093

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号106、108、110又は112(GB48、GB116、GB215、GB358配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して88%以上、好ましくは89%以上、最も好ましくは90%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4c);

0094

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号116又は201(GB809又はCAM600配列)に表わされている通りの配列のいずれかに対して88%以上、好ましくは89%以上、最も好ましくは90%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4e);

0095

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号203(CAMG22配列)に表わされている通りの配列に対して87%以上、好ましくは89%以上、最も好ましくは90%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4f);

0096

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号114(GB549配列)に表わされている通りの配列に対して85%以上、好ましくは87%以上、最も好ましくは89%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4g);

0097

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号207(GB437配列)に表わされている通りの配列に対して86%以上、好ましくは87%以上、より好ましくは88%以上、より好ましくは89%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4h);

0098

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号209(CAR4/1205配列)に表わされている通りの配列に対して84%以上、好ましくは86%以上、最も好ましくは88%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4i);

0099

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号211(CAR1/501配列)に表わされている通りの配列に対して81%以上、
好ましくは83%以上、最も好ましくは85%以上の相同性を有するHCVゲノム配列(亜型4j)。

0100

 好ましくは、上述のゲノムHCV配列は、上述の配列全てのコーディング領域からの配列を描いている。

0101

 ヌクレオチド距離分類システム(このヌクレオチド距離は前述のとおりに計算される)に従うと、前記組成物の前記配列は、以下のものから選択される。

0102

− 図4に示されている通り、コア/E1領域の位置1〜957にまたがる領域の中の、配列番号118、120又は122に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.52、0.50、
0.4880、0.46、0.44、0.43未満、又は最も好ましくは0.42未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(4型);

0103

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号118、120又は122に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.39、0.36、0.34、0.32未満、又は最も好ましくは0.31未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(4型);

0104

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号183、185又は187に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.27、0.26、0.24、0.22、0.20、0.18、0.17、0.162、0.16未満、又は最も好ましくは0.15未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4c);

0105

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号189に表わされている通りの配列に対して0.30、0.28、0.26、0.24、0.22、
0.21未満、又は最も好ましくは0.205未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4a);

0106

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号167又は169に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.26、0.25、0.23、
0.21、0.19、0.17、0.165未満、又は最も好ましくは0.16未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4e);

0107

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号171又は173に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.26、0.24、0.22、
0.20、0.18、0.16、0.15未満、又は最も好ましくは0.14未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4f);

0108

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号175に表わされている通りの配列に対して0.20、0.19、0.18、0.17未満、又は最も好ましくは0.16未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4g);

0109

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号177に表わされている通りの配列に対して0.20、0.19、0.18、0.17未満、及び最も好ましくは0.16未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4h);

0110

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号179に表わされている通りの配列に対して0.27、0.25、0.23、0.21未満、及び好ましくは0.16未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4i);

0111

− 図4に示されている通り、E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号181に表わされている通りの配列に対して0.19、0.18、0.17、0.165未満、及び最も好ましくは0.16未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4j);

0112

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号106、108、110、112、114又は116に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.35、0.34、0.32未満、及び最も好ましくは0.30未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(4型);

0113

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号106、108、110又は112に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.18、0.16、0.14、0.135、0.13、0.1275、又は最も好ましくは0.125未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4c);

0114

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号116又は201に表わされている通りの配列のいずれかに対して0.15、0.14、0.135、0.13未満、及び最も好ましくは0.125未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4e);

0115

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号203に表わされている通りの配列に対して0.15、0.14、0.135、0.13未満、又は最も好ましくは0.125未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4f);

0116

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号114に表わされている通りの配列に対して0.17、0.16、0.15、0.14、0.13未満、又は最も好ましくは0.125未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4g);

0117

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号207に表わされている通りの配列に対して0.155、0.15、0.145、0.14、0.135、0.13未満、又は最も好ましくは0.125未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4h);

0118

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号209に表わされている通りの配列に対して0.17、0.16、0.15、0.14、0.13未満、又は最も好ましくは0.125未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4i);

0119

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号211に表わされている通りの配列に対して0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13未満、及び最も好ましくは0.125未満のヌクレオチド距離を有するものとして特徴づけされているHCVゲノム配列(亜型4j)。

0120

 同様に本発明の範囲内に含まれているのは、上述の配列番号のいずれかにおいて与えられている通りのヌクレオチド配列のいずれかから選択されるポリ核酸の配列変異体であり、この配列変異体には、主としてオリゴヌクレオチドの末端(3′又は5′のいずれか)における単数又は複数のヌクレオチドの欠失及び/又は挿入、
又はいくつかの非必須ヌクレオチド(すなわちHCVの異なる遺伝子型の間で区別するのに必須でないヌクレオチド)のその他のヌクレオチド(修飾ヌクレオチド及び/又はイノシンを含む)による置換が含まれており、例えば、図3(コア領域)、図4(コア/E1領域)、図10(NS3/NS4領域)、図14(E1/E2領域)内に示されているような、4型の型特異的ヌクレオチドと1型又は2型の配列のいくつかのヌクレオチドを置換することによって、1型又は2型の配列を、4型配列へと修飾することが可能である。

0121

 本発明は又、配列番号193(GB724配列)に表わされている通りの配列にも関する。

0122

 GB48、GB116、GB215、GB358、GB549及びGB809のNS5又はE1配列を並べて比較した後、これらの分離株は、明らかに4型の中の3つの亜型に分類された:GB48、GB116、GB215及びGB358は、4cと呼称される亜型に属し、GB549は亜型4gに、及びGB809は亜型4eに属する。NS5では、GB809(亜型4e)は、GB549(亜型4g、79.7%)に対してよりも亜型4cの分離株(85.6−86.8%)に対しより高い核酸相同性を示し、一方、GB549はその他の両方の亜型に対し類似の相同性を示した(亜型4cに対して78.8〜80%、亜型4eに対して79.7%)。E1では、亜型4cは、亜型4g及び4eに対して75.2%の等しい核酸相同性を示し、一方4g及び4eは78.4%の相同性を示した。しかしながら、アミノ酸レベルでは、亜型4eは亜型4cに対し正常な相同性(80.2%)を示し、一方亜型4gは4c(83.3%)及び4e(84.1%)に対しより高い相同性を示した。

0123

 さらにもう1つの実施態様に従うと、本発明は、前記ポリ核酸が、以下のHCV2d型ゲノム配列のいずれかから選択されているヌクレオチド配列に対応する、上述の通りの組成物に関する。

0124

− 図4に示されている通り、コア/E1領域の位置379〜957にまたがる領域の中の、配列番号(NE92)143に表わされている通りの配列に対して78%以上、好ましくは80%以上、最も好ましくは82%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0125

− 図4に示されている通り、位置574〜957にまたがる領域の中の、配列番号143(NE92)に表わされている通りの配列に対して74%以上、好ましくは76%以上、最も好ましくは78%以上の相同性を有するHCVゲノム配列;

0126

− 図1に示されている通り、NS5領域の位置7932〜8271にまたがる領域の中の、配列番号145(NE92)に表わされている通りの配列に対して87%以上、好ましくは89%以上、最も好ましくは91%以上の相同性を有するHCVゲノム配列。

0127

 好ましくは、上述のゲノムHCV配列は、上述の配列全てのコーディング領域からの配列を描いている。

0128

 ヌクレオチド距離分類システム(このヌクレオチド距離は前述の通りに計算される)に従うと、前記組成物の前記配列は、以下のものから選択される:

0129

− 上述の配列のいずれかに対して、E1領域(574〜957)について0.32未満、好ましくは0.31未満、より好ましくは0.30未満のヌクレオチド距離、

0130

− 上述の配列のいずれかに対して、コア領域(1〜378)について0.08未満、好ましくは0.07未満、より好ましくは0.06未満のヌクレオチド距離、

0131

− 上述の配列のいずれかに対して、NS5領域について0.15未満、好ましくは0.13未満、好ましくは0.12未満のヌクレオチド距離。

0132

 配列番号により表わされている通りの配列に対する相同性をもつ本発明に従ったポリ核酸配列は、型又は亜型特異的プライマーを用いた増幅、多少の差こそあれ厳格な条件下での型又は亜型特異的プローブでのハイブリダイゼーション、血清学的スクリーニング方法(例えば4及び11)又はLiPA型分類システムを介して当該技術分野において既知の技術のいずれかに従って特徴づけし分離することができる。

0133

 当該例、図及び配列リストの中ではまだ描かれていない領域からの上述のゲノムのポリ核酸配列は、本発明の型又は亜型特異的配列からの適切なプライマーを用いた増幅技術のような当該技術分野において既知の技術のいずれかにより得ることができる。

0134

 本発明は又、前記ポリ核酸が、プライマーが導かれる遺伝子型に属する或る種の分離株の核酸を増幅するためのプライマーとして作用する可能性の高いものである、上述のとおりの組成物にも関する。

0135

 本発明のこの実施態様に従ったプライマーの一例は、表7に示されているようなHCPr 152である(配列番号79)。

0136

 「プライマー」という語は、コピーすべき核酸鎖に対し相補性をもつプライマー伸長産物の合成のための開始点として作用することのできる一本鎖DNAオリゴヌクレオチド配列のことをいう。プライマーの長さ及び配列は伸長産物の合成を引き出すのを許すようなものでなければならない。

0137

 好ましくは、プライマーは約5〜50個のヌクレオチドである。
特異的な長さ及び配列は、必要とされるDNA又はRNA標的の複雑さならびに温度及びイオン強度のようなプライマーの使用条件によって左右されることになる。

0138

 適切な増幅を保証するために増幅プライマーが対応する鋳型配列と正確に整合する必要はないという事実は、文献の中で充分に証明されている(Kwok et al., 1990)。

0139

 使用される増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR:Saiki et al., 1988)、リガーゼ連鎖反応(LCR:Landgren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991)、核酸配列ベースの増幅(NASBA:Guatelli et al., 1990; Compton, 1991)、転写ベース増幅システム(TAS:Kwoh et al., 1989)、鎖移動増幅(SDA;Duck, 1990; Walker et al., 1992)又はQβレプリカーゼを用いた増幅(Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989)又はプライマー伸長を用いて核酸分子を増幅するためのその他のあらゆる適切な方法のいずれかであってよい。増幅中、増幅された産物は、標識づけされたプライマーを用いるか又は標識づけされたヌクレオチドを取り込むことにより、適切に標識づけすることができる。標識は、同位元素(32P、35Sなど)又は非同位元素(ビオチンジゴキシゲニンなど)であってよい。増幅反応は20〜80回、有利には30〜50回くり返される。

0140

 本発明は又、前記オリゴヌクレオチドが場合によって標識づけされているか又は固体基材に付着されている状態で、前記ヌクレオチド配列を含む核酸の特異的検出及び/又は型分類のためのハイブリダイゼーションプローブとして前記ポリ核酸に作用できる、上述の通りの組成物にも関する。

0141

 「プローブ」という語は、検出すべきHCV遺伝子型の標的配列に対して相補的な配列をもつ1本鎖配列特異的オリゴヌクレオチドのことを言う。

0142

 好ましくは、これらのプローブは長さが約5〜50ヌクレオチド、より好ましくは約10〜25ヌクレオチドである。

0143

 「固体支持体」という語は、そのハイブリダイゼーション特性を保持していること及びハイブリダイゼーションの背景レベルが低い状態にとどまることを条件として、オリゴヌクレオチドプローブと結合することのできるあらゆる基材のことを言う。通常、固体基材は、マイクロタイタープレート、膜(例えばナイロン又はニトロセルロース)又はマイクロスフェアビーズ)である。膜への適用又は固定に先立って、固定を容易にしハイブリダイゼーション効果を改善するため核酸プローブを修飾することが適当でありうる。かかる修飾は、ホモポリマーテーリング脂肪族基、NH2 基、SH基カルボシキル基といった異なる反応基との結合、又はビオチン又はハプテンとの結合を包含しうる。

0144

 本発明は又、単数又は複数のHCV遺伝子型の存在を検出するため、より特定的には、それを含有している可能性の高い試料の中に存在する上述の通りのヌクレオチド配列を有するHCV遺伝子型のいずれかの核酸の存在を検出するため、少なくとも次の工程からなる上述の組成物の使用に関する。
 (i)場合によって試料の核酸を抽出する工程
 (ii)場合によって上述のプライマー又はその他のあらゆるHCV亜型2d、HCV3型、HCV4型、HCV5型又は万能HCVプライマーの少なくとも1つを用いて核酸を増幅する工程;
 (iii)好ましくは固体基材に付着されている状態の上述の通りの単数又は複数のプローブを用いて適切な条件下で、核酸が場合によって増幅中又は増幅後に標識づけされている状態で、場合によっては変性した条件下で、生物学的試料の核酸をハイブリッド形成する工程;
 (iv)適切な条件で洗浄する工程;
 (v)形成されたハイブリッドを検出する工程;
 (vi)観察されたハイブリッド形成パターンから存在する単数又は複数のHCV遺伝子型の存在を推定する工程。

0145

 好ましくは、この技術は、コア又はNS5領域の中の実施することができる。

0146

 「核酸」という語は、又分析物鎖と言うこともでき、1本鎖又は2本鎖の核酸分子に対応する。この分析物鎖は、好ましくは正鎖又は負鎖のRNA、cDNA又は増幅したcDNAである。

0147

 「生物学的試料」という語は、HCV核酸を含むあらゆる生物学的試料(組織又は流体)より特定的には血清又は血漿試料のことをいう。

0148

 「HCV亜型2dプライマー」という語は、試料中に存在するHCV亜型2d配列を特異的に増幅するプライマーのことをいう(実施例の項及び図面参照)。

0149

 「HCV3型プライマー」という語は、試料中に存在するHCV3型配列を特異的に増幅するプライマーのことをいう(実施例の項及び図面参照)。

0150

 「HCV4型プライマー」という語は、試料中に存在するHCV4型ゲノムを特異的に増幅するプライマーのことをいう。

0151

 「万能HCVプライマー」という語は、HCVゲノムの保存された領域のいずれかに対し相補的なオリゴヌクレオチド配列のことをいう。

0152

 「HCV5型プライマー」という語は、試料中に存在するHCV5型ゲノムを特異的に増幅するプライマーのことをいう。

0153

 「適切な」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件というのは、厳格なものとして理解されるべきであり、当該技術分野において一般に知られているものである(例えばManiatis et al.,分子クローニング、その実験室マニュアル、New York, Cold Spring Harb又は Lab又はat又はy, 1982)。

0154

 しかしながら、ハイブリダイゼーション溶液SSC、SSPEなど)に従って、これらのプローブは、充分な特異性を達成するためその適切な温度でハイブリッド形成されるべきである。

0155

 「標識づけされた」という語は、標識づけされた核酸の使用のことを言う。これには、Saiki et al. (1988)又はBej et al. (1990)により例示されているような増幅のポリメラーゼ工程中又は当業者にとって既知のその他のあらゆる方法によって取り込まれた標識づけされたヌクレオチドの使用が含まれる。

0156

 本発明の方法は、次の要素のうちの1つと、上述のとおりのプローブのいずれかを接触させる工程を含んでいる。
− ハイブリダイゼーションのために核酸が利用できる生物学的試料、
− 又は、生物学的試料の中に含まれている精製された核酸− 又は、精製された核酸から誘導された単一のコピー、
− 又は、前記要素又は前記プローブが固体基材に付着している状態で、精製された核酸から誘導された増幅したコピー。
 「観察されたハイブリダイゼーションパターンから単数又は複数のHCV遺伝子型の存在を推定する」という表現は、オリゴヌクレオチドプローブのパネル結合パターンを分析することによる試料中のHCVゲノムの存在の同定を意味する。単一のプローブは、試料中のHCVゲノムの存在又は不存在に関する有用な情報を提供することができる。一方、HCVゲノムの変異体は、自然界に分散しており、従ってどのプローブも特定のHCVゲノムだけを同定できるということはまれである。むしろHCV遺伝子型の同一性は異なるHCVゲノムの(異なる)セグメントに特異的であるオリゴヌクレオチドプローブのパネルの結合パターンから推定することができる。これらのオリゴヌクレオチドプローブの選択に応じて、各々の既知のHCV遺伝子型は、特異的組合せのプローブを使用した時の特異的ハイブリダイゼーションパターンに対応することになる。各々のHCV遺伝子型も同様に、オリゴヌクレオチドプローブの選択に応じて同じプライマと増幅されたその他のいずれかのHCV遺伝子型から区分されうる。予想されるハイブリダイゼーションパターンの図式に対して単数又は複数の未知のHCV配列を含む試料に対して正のハイブリッド形成力をもつプローブについて生成したパターンを比較することにより、この試料中に存在するHCV遺伝子型を明確に推定することができる。

0157

 本発明は、かくして、単数又は複数のハイブリダイゼーションプローブが配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59又は61、106、108、110、112、114、116、118、120、122、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、198、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、222、269のうちのいずれか又はその配列変異体のうちのいずれかから選択されており、かかる配列変異体には、主としてその末端(3′又は5′)で、単数又は複数のヌクレオチドの欠失及び/又は挿入したものを含む配列変異体、又はいくつかの非必須ヌクレオチド(即ち遺伝子型間で弁別するのに必須でないヌクレオチド)
をその他のヌクレオチド(例えば修飾されたヌクレオチド又はイノシン)で置換したものを含む配列変異体、又は上述のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの相補体からなる前記配列変異体、又はデオキシリボヌクレオチドの代りにリボヌクレオチドからなる前記変異体に関し、ここでこれら全ての前記変異体プローブをその誘導原であるオリゴヌクレオチドプローブと同じ特異性でハイブリッド形成させることができるものであるという条件で上述の方法に関する。

0158

 増幅されたHCVゲノムを互いから区別するためには、HCVポリ核酸内に位置づけされたHCV遺伝子型領域を標的にする一組の配列特異的DNAプローブに対して、標的ポリ核酸をハイブリッド形成させる。

0159

 これらのプローブの大部分は、HCV遺伝子型の型特異的領域を標的にするが、いくつかは複数のHCV遺伝子型に対しハイブリッド形成させることのできるものである。

0160

 ハイブリダイゼーション溶液(SSC、SSPEなど)に応じて、これらのプローブが、充分な特異性に到達するためには、その適切な温度で厳格にハイブリッド形成されなくてはならない。しかしながら、それらの末端(3′又は5′)で1つ又は数個のヌクレオチドを付加又は欠失させることによって、又はいくつかの非必須ヌクレオチド(すなわち型間で区別するのに必須でないヌクレオチド)をその他のヌクレオチド(修飾ヌクレオチド又はイノシンを含む)によって置換させるいずれかによって、DNAプローブをわずかに修飾することにより、これらのプローブ又はその変異体を同じハイブリダイゼーション条件(すなわち同じ温度及び同じハイブリダイゼーション溶液)下で特異的にハイブリッド形成させることができる。同様に、使用するプローブの量を変えることも又、より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るために有利でありうる。この状況の下で、同じ長さのプローブはそれらのGC含量の如何にかかわらず、TMAC1溶液内でほぼ同じ温度で特異的にハイブリッド形成することになるということに留意すべきである(Jacobset al., 1988) 。

0161

 試料中のオリゴヌクレオチドプローブと核酸配列との間で形成されたハイブリッドを検出する本発明の目的のために適切な検定方法には、従来のドットブロットフォーマットサンドイッチハイブリダイゼーション又は逆ハイブリダイゼーションといった当該技術において既知の検定フォーマットのいずれかを含む。例えば、ドットブロットフォーマットを用いて検出を達成することができ、この場合、標識づけされていない増幅された試料が膜に結合され、膜は適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で少なくとも1つの標識づけされたプローブと共に取り込まれ、結合されたプローブの存在が監視される。

0162

 代替的な好ましい方法は、増幅された配列に1つの標識が含まれる「逆」ドットブロットフォーマットである。このフォーマットでは、標識づけされていないオリゴヌクレオチドプローブが固体支持体に結合され、適切な厳格なハイブリダイゼーション及びそれに続く洗浄条件下で、標識づけされた試料に露呈される。同様に、本発明に従ったオリゴヌクレオチドプローブと試料の核酸との間のハイブリッド形成に依存するその他のあらゆる検定方法も使用することができるということも理解すべきである。

0163

 有利な実施態様に従うと、生物学的試料中に含まれている単数又は複数のHCV遺伝子型を検出する方法には、固体支持体上に平行線として固定化されたオリゴヌクレオチドプローブと、生物学的試料から誘導された増幅されたHCV核酸コピーを接触させる工程が含まれている。

0164

 この有利な方法に従うと、プローブはラインプローブ検定(LiPA)フォーマットに固定化される。これは、平行線として複数のオリゴヌクレオチドプローブ(負又は正の対照オリゴヌクレオチド)を適切に上に適用することのできる膜片を用いた逆ハイブリダイゼーションフォーマット(Saiki et al., 1989)である。

0165

 かくして本発明は又、平行線の形で支持体に結合された上述の単数又は複数のプローブを自らの表面上に支持している固体支持体、好ましくは膜片にも関する。

0166

 LiPAはきわめて迅速でユーザーが親しみやすいハイブリダイゼーション試験である。結果は増幅の開始から4時間後に読みとることができる。増幅産物内に通常非同位元素標識が取り込まれる増幅及びアルカリ性変性の後、増幅産物は膜上でプローブと接触させられ、約1〜1.5時間ハイブリダイゼーションが実施され、ハイブリッド形成されたポリ核酸が検出される。生じたハイブリダイゼーションパターンから、HCV型が目視によって、ただし好ましくは専用ソフトウエアによって推定することができる。LiPAフォーマットは、市販の走査用装置と完全な適合性を有しており、
かくして、結果の自動的解釈は非常に信頼性の高いものである。これらの利点全てのためLiPAフォーマットは日常セッティングにおけるHCV検出の使用に対して十分である。LiPAフォーマットは、異なるHCV遺伝子型の存在を検出するため特に有利であるはずである。

0167

 本発明は又、既知のHCVゲノムとは異なる新規なHCV遺伝子型を検出し同定するための方法に関し、次の工程を含む。
− 上述の方法に従って、生物学的試料中に存在するヌクレオチドがどのHCV遺伝子型に属するかを決定する工程;
−表3に規定されているものと適合性のあるハイブリダイゼーションパターンを生じない試料を観察する場合、検出すべき新しいHCV遺伝子型の異常にハイブリッド形成するプローブに対応するHCVゲノム配列の部分を配列決定する工程。

0168

 本発明は又、それを含んでいる可能性の高い生物学的試料の中に存在するHCVの単数又は複数の遺伝子型を検出するための、前述の通りの組成物の使用に関し、次の工程を含む。
 (i)場合によって試料の核酸を抽出する工程;
 (ii)上述の通りのプライマの少なくとも1つで核酸を増幅する工程;
 (iii)増幅された産物を配列決定する工程;
 (iv)既知の全てのHCV配列に対する比較により、決定された配列から存在するHCV遺伝子型を推定する工程。

0169

 本発明は又、表3に示されている通りの既知のHCV(1型及び/又は2型及び/又は3型)ポリタンパク質配列の対応する領域とは異なる少なくとも1つのアミノ酸を有する、上述のHCVゲノム配列のうちの少なくとも1つによってコードされている隣接アミノ酸配列に対応する、少なくとも5つのアミノ酸の隣接配列を含む少なくとも1つのペプチド又はポリペプチド、又はその突然変異タンパク質から成る又はこれを含む組成物にも関する。

0170

 アミノ酸配列のレベルでは、1つのアミノ酸の差(既知のHCVアミノ酸配列との関係において)が必要であり、このことはすなわち、本発明のポリペプチドが、1つのアミノ酸の差異を伴うヌクレオチドの差異(既知のHCVポリ核酸配列との関係において)を有するポリ核酸に対応するということを意味している、という点に留意すべきである。

0171

 開示されているヌクレオチド配列(配列番号1〜62及び106〜123及び143〜218、223〜270参照)から推定される通りの新しいアミノ酸配列は、NS4領域について1型及び2型のプロトタイプ配列とわずか59.9〜78%の相同性しか示さず、E1領域について1型及び2型のプロトタイプ配列とわずか53.9〜68.8%の相同性しか示さない。NS4領域は、例えば欧州特許公開明細書EP−A−0 489968号で特徴づけされている、いくつかのエピトープを含んでいることがわかっており、又E1タンパク質はウイルスエンベロープの一部として免疫攻撃を受けること及びエピトープを含むことが予想されることから、
新しい3型、4型及び5型のNS4及びE1エピトープは一貫して、1型及び2型の分離株内に存在するエピトープとは異なるだろう。このことは、例4に示されているようなNS4合成ペプチド型特異性及び例11内の組換えE1タンパク質の型特異性によって例示される。

0172

 新しい亜型2d、型3、4及び5(配列番号1〜62及び106〜123及び143〜218、223及び270)アミノ酸配列を1a型、1b型、2a型及び2b型のプロトタイプ配列と並べて比較した後、図5及び図7に示されている通りに型及び亜型特異的可変領域を明確に記述することができる。

0173

 本発明のポリペプチドから誘導された突然変異タンパク質については、表4が上述のとおりの突然変異タンパク質のいくつかのベースとなりうるアミノ酸置換概要を与えている。

0174

 本発明に従ったペプチドは、好ましくは少なくとも5つの隣接HCVアミノ酸、ただし好ましくは本発明の新しいHCV配列の少なくとも8個、少なくとも10個又は少なくとも15個の隣接アミノ酸(例えば少なくとも9、11、12、13、14、20又は25個のアミノ酸)を含んでいる。

0175

0176

 本発明のポリペプチド、特にフラグメントは、従来の化学合成によって調製されうる。
 この合成は、均質溶液内又は固体相の中で行なうことができる。

0177

 例えば、使用可能な均質な溶液中での合成技術は、E. Wunshにより編集された「Methode der 又はganischen chemie」(有機化学の方法)、第15−I巻、II巻、THIEME, Stuttgart 1974, という本の中でHoubenweylによって記述されているものである。

0178

 本発明のポリペプチドは、「固相ペプチド合成」(IRL Press,Oxf 又はd, 1989)という題の本の中でAtherson及びShepard が記述した方法に従って固相内で調製することもできる。

0179

 本発明に従ったポリペプチドは、Maniatis et al.,分子クローニング:実験室マニュアル, New York, Cold Spring Harb又はLab 又はat又はy, 1982)により記述されている通りの組換えDNA技術を用いて調製することができる。

0180

 本発明は、特に前記隣接配列が以下のアミノ酸残基のうちの少なくとも1つをその配列中に含んでいる、上述の通りのポリペプチド又はペプチド組成物に関する:
 L7, Q43, M44, S60, R67, Q70, T71, A79, A87, N106, K115, A127, A190, S130, V134, G142, I144, E152, A157, V158, P165, S177又はY177, I178, V180又はE180又はF182, R184, I186, H187, T189, A190, S191又は G191, Q192 又は L192 又はI192又はV192又は E192, N193 又は H193 又は P193, W194 又は Y194, H195, A197 又は I197 又は V197 又は T197,V202, I203又は L203, Q208, A210, V212,F214, T216, R217又はD217又はE217又はV217, H218又はN218, H219又はV219又はL219, L227又はI227, M231又はE231又はQ231, T232又はD232又はA232又はK232, Q235又はI235, A237又はT237, I242, I246, S247, S248, V249, S250又はY250, I251又はV251又はM251又はF251, D252, T254又はV254, L255又はV255, E256又はA256, M258又はF258又はV258, A260又はQ260又はS260, A261, T264又はY264, M265, I266又はA266, A267,G268 又は T268,F271又はM271又はV271, I277, M280又はH280, I284又はA284又はL84, V274, V291, N292 又は S292, R293 又は I293 又はY293, Q294又は R294, L297 又は I297 又はQ297, A299又はK299又は Q299, N303 又は T303, T308 又は L308, T310 又はF310又は A310 又は D310 又は V310,L313, G317又は Q317, L333, S351, A358, A359, A363, S364,A366, T369, L373, F376, Q386, I387, S392, I399, F402, I403, R405, D454, A461, A463, T464, K484, Q500, E501, S521, K522, H524, N528, S531, S532, V534, F536, F537, M539, I546, C1282, A1283, H1310, V1312, Q1321, P1368, V1372, V1373, K1405,Q1406, S1409, A1424, A1429, C1435, S1436, S1456, H1496, A1504, D1510, D1529, I1543, N1567, D1556, N1567, M1572, Q1579, L1581, S1583, F1585, V1595, E1606又はT1606, M1611, V1612 又は L1612, P1630, C1636, P1651, T1656又はI1656,L1663, V1667, V1677, A1681, H1685, E1687, G1689, V1695, A1700, Q1704, Y1705, A1713, A1714 又はS1714, M1718, D1719, A1721又はT1721, R1722, A1723 又は V1723, H1726 又はG1726, E1730, V1732, F1735, I1736, S1737, R1738, T1739, G1740, Q1741, K1742,Q1743, A1744, T1745, L1746, E1747 又はK1747, I1749, A1750, T1751又はA1751, V1753, N1755,K1756, A1757, P1758, A1759, H1762, T1763, Y1764, P2645, A2647, K2650, K2653 又は L2653, S2664, N2673, F2680, K2681, L2686, H2692, Q2695 又はL2695 又はI2695, V2712, F2715,V2719 又は Q2719, T2722, T2724, S2725, R2726, G2729, Y2735, H2739, I2748, G2746 又は I2746, I2748, P2752又は K2752, P2754 又はT2754, T2757又はP2757.

0181

 なおここで、この表記は、表1(その他の分離株との比較)の中に示されているとおりのKato et al., 1990 に従ったアミノ酸番号づけを表わす1つの番号と、その1文字コードでアミノ酸残基を表わしている1つの文字とで構成されている。同様に図2、5、7及び11内の番号づけ(並べての比較アミノ酸配列)中の番号づけも参照のこと。

0182

 本発明の特有で新しいアミノ酸残基の群の中で、以下の残基は、
本発明に使用されるHCV分類システムに従って以下のHCV型に対し特異的であることがわかった。

0183

− 図5及び2に示されている通り、本発明のHCV亜型2d配列に対して特異的であるQ208, R217, E231, I235, I246, T264, I266, A267, F271, K299, L2686, Q2719;

0184

− 図5に示されている通り、本発明のHCV3型のコア/E1領域に対して特異的であるQ43, S60, R67, F182, I186, H187,A190,S191, L192, W194, V202, L203, V219, O231, D232,A237,T254, M280, Q299, T303, L308,及び/又はL313;

0185

− 図7に示されている通り、本発明のHCV3型配列のNS3/4領域に対して特異的であるD1556, Q1579, L1581, S1584, F1585, E1606, V1612, P1630, C1636, T1656, L1663, H1685, E1687, G1689, V1695, Y1705, A1713, A1714, A1721, V1723, H1726, R1738, Q1743, A1744, E1747, I1749, A1751, A1759及び/又はH1762;

0186

− 図2に示されている通り、本発明のHCV3型のNS5領域に対して特異的であるK2665, D2666, R2670;

0187

− 図5に示されている通り、本発明のHCV4型配列のコア/E1領域に対して特異的であるL7, A79, A127, S130, E152,V158, S177又はY177, V180又はE180, R184, T189, Q192又はE192又はI192, N193又はH193, I197又はV197, I203, A210, V212, E217, H218, H219, L227, A232, V249, I251又はM251, D252, L255又は V255, E256, M258 又はV258又はF258, A260又はQ260, M265, T268, V271, V274, M280, I284, N292又は S292, Q294, L297 又はI297, T308, A310又はD310又はV310又はT310, 及びG317;

0188

− 図2に示されている通り、本発明のHCV4型配列のNS5領域に対して特異的であるP2645, K2650, K2653, G2656, V2658,T2668, N2673又はN2673, K2681, H2686, D2691, L2692,Q2695 又はL2695 又はI2695, Y2704, V2712, F2715, V2719, I2722, S2725, G2729, Y2735, G2746又はI2746, P2752又は K2752, Q2753, P2754又は T2754, T2757 又はP2757;

0189

− 図5に示されている通り、本発明のHCV5型配列のコア/E1領域に対して特異的であるM44, Q70, A87, N106, K115,V137, G142, P165, I178, F251, A299, N303, Q317;

0190

− 図12に示されている通り、本発明のHCV5型配列のE1/E2領域に対して特異的であるL333, S351, A358, A359, A363, S364, A366, T369, L373, F376, Q386, I387, S392, I399, F102, I403, R405, D454, A461, A463, T464, K484, Q500, E501, S521, K522, H524, N528, S532, V534, F537, M539, I546;

0191

− 図7に示されている通り、本発明のHCV5型配列のNS3/NS4領域に対して特異的であるC1282, A1283, V1312, Q1321, P1368, V1372, K1405, Q1406, S1409, A1424, A1429, C1435, S1436, S1456, H1496, A1504, D1510, D1529, I1543, N1567, M1572, V1595, T1606, M1611, L1612, I1656, V1667, A1681, A1700, A1713, S1714, M1718, D1719, T1721, R1722, A1723, G1726, F1735, I1736, S1737, T1739, G1740, K1742, T1745, L1746, K1747, A1750, V1753, N1755, A1757, D1758, T1763, 及びY1764;

0192

− 図2に示されている通り本発明のHCV5型配列のNS5領域に対して特異的であるA2647, L2653, S2674, F2680, T2724,R2726, Y2730, H2739 ;

0193

− 図5及び7に示されている通り、本発明のHCV3型及び5型配列に対して特異的であるA256, P1631, V1677, Q1704,E1730, V1732, Q1741 及びT1751;

0194

− 図5及び2に示されている通り、本発明のHCV3型及び4型配列に対して特異的であるT71, A157, I227, T237, T240, Y250,V251, S260, M271, T2673, T2722, I2748 ;

0195

− 図5に示されている通り、本発明のHCV4型及び5型配列に対して特異的であるV192, Y194, A197, P249, S250, R294;

0196

− 図5に示されている通り、本発明のHCV4型及び亜型2d配列に対して特異的であるI293;

0197

− 図5に示されている通り、本発明のHCV3型、4型及び5型配列に対して特異的であるD217及びR294;

0198

− 図5に示されている通り、本発明のHCV3型及び亜型2d配列に対して特異的であるL192;

0199

− 図5に示されている通り、本発明のHCV3型、4型及び亜型2d配列に対して特異的であるG191及びT197;

0200

− 図5に示されている通り、本発明のHCV亜型2d及び5型配列に対して特異的であるK232。

0201

 なおここで、この表記は、その1文字コードによりアミノ酸を明白に表わしている1つの文字、及びKato et al., 1990(その他の分離株との比較について表1も参照のこと)ならびに図2(NS5領域)、図5(コア/E1領域)、図7(NS3/NS4領域)、図12(E1/E2領域)に従ったアミノ酸番号づけを表わす1つの番号で構成されている。上述のアミノ酸のいくつかは、型又は亜型特異的エピトープの中に内含されていてもよい。
 例えば、M231(5型内に検出されるもの)は、位置231におけるメチオニンのことを言う。3型分離株内では同じ位置231にはグルタミン(Q)が存在し、一方この位置は、1型分離株ではアルギニンにより又2型分離株ではリジン(K)又はアスパラギン(N)により占有されている(図5参照)。

0202

 本発明のこの実施態様に従ったペプチド又はポリペプチドは、場合によって標識づけされていてもよいし、固体基材に付着されていてもよいし、或いは又ビオチンのような担体分子に結合されていても、又適切なアジュバントと混合されていてもよい。

0203

 コアタンパク質内の可変的領域(図5中のV−CORE)は、血清学的型分類のために役立つことが示されてきた(Machida et al., 1992)。この領域中の開示された5型配列の配列は、型特異的特徴を示す。アミノ酸70〜78からのペプチドは本発明の配列に対して以下の非反復配列を示す。
 QPTGRSWGQ(配列番号93)
 RSEGRTSWAQ(配列番号220)
 及びRTEGRTSWAQ(配列番号221)
 もう1つの好ましいV−コアにまたがる領域は、
 SRRQPIPRARRTEGRSWAQ(配列番号268)
という配列を伴う亜型3cの位置60〜78にまたがるペプチドである。

0204

 図5に示されている通り、4つの遺伝子型のE1アミノ酸配列を並べて比較した後、5つの型特異的可変領域(V1〜V5)を同定することができる。

0205

 領域V1はアミノ酸192〜203を包含し、これは、E1タンパク質のアミノ末端の10個のアミノ酸である。図5に示されている通りの以下の非反復配列を推定することができる:
 LEWRNTSGLYVL(配列番号83)
 VNYRNASGIYHI(配列番号126)
 QHYRNISGIYHV(配列番号127)
 EHYRNASGIYHI(配列番号128)
 IHYRNASGIYHI(配列番号224)
 VPYRNASGIYHV(配列番号84)
 VNYRNASGIYHI(配列番号225)
 VNYRNASGVYHI(配列番号226)
 VNYHNTSGIYHL(配列番号227)
 QHYRNASGIYHV(配列番号228)
 QHYRNVSGIYHV(配列番号229)
 IHYRNASDGYYI(配列番号230)
 LOVKNTSSSYMV(配列番号231)

0206

 領域V2はアミノ酸213〜223を包含する。図5に示されている通りV2領域内には、以下の非反復配列を見い出すことができる。
 VYEADDVILHT(配列番号85)
 VYETEHHILHL(配列番号129)
 VYEADHHIMHL(配列番号130)
 VYETDHHILHL(配列番号131)
 VYEADNLILHA(配列番号86)
 VWQLRAIVLHV(配列番号232)
 VYEADYHILHL(配列番号233)
 VYETDNHILHL(配列番号234)
 VYETENHILHL(配列番号235)
 VFETVHHILHL(配列番号236)
 VFETEHHILHL(配列番号237)
 VFETDHHIMHL(配列番号238)
 VYETENHILHL(配列番号239)
 VYEADALILHA(配列番号240)

0207

 領域V3はアミノ酸230〜242を包含する。図5から以下の非反復V3領域配列を推定することができる。
 VQDGNTSTCWTPV(配列番号87)
 VQDGNTSACWTPV(配列番号241)
 VRVGNQSRCWVAL(配列番号132)
 VRTGNTSRCWVPL(配列番号133)
 VRAGNVSRCWTPV(配列番号134)
 EEKGNISRCWIPV(配列番号242)
 VKTGNQSRCWVAL(配列番号243)
 VRTGNQSRCWVAL(配列番号244)
 VKTGNQSRCWIAL(配列番号245)
 VKTGNVSRCWIPL(配列番号247)
 VKTGNVSRCWISL(配列番号248)
 VRKDNVSRCWVQI(配列番号249)

0208

 領域V4は、アミノ酸248〜257を包含している。図5から以下の非反復V4領域配列を推定することができる。
 VRYVGATTAS(配列番号89)
 APYIGAPLES(配列番号135)
 APYVGAPLES(配列番号136)
 AVSMDAPLES(配列番号137)
 APSLGAVTAP(配列番号90)
 APSFGAVTAP(配列番号250)
 VSQPGALTKG(配列番号251)
 VKYVGATTAS(配列番号252)
 APYIGAPVES(配列番号253)
 AQHLNAPLES(配列番号254)
 SPYVGAPLEP(配列番号255)
 SPYAGAPLEP(配列番号256)
 APYLGAPLEP(配列番号257)
 APYLGAPLES(配列番号258)
 APYVGAPLES(配列番号259)
 VPYLGAPLTS(配列番号260)
 APHLRAPLSS(配列番号261)
 APYLGAPLTS(配列番号262)

0209

 領域V5はアミノ酸294〜303を包含している。図5から以下の非反復V5領域ペプチドを推定することができる。
 RPRRHQTVQT(配列番号91)
 QPRRHWTTQD(配列番号138)
 RPRRHWTTQD(配列番号139)
 RPRQHATVQN(配列番号92)
 RPRQHATVQD(配列番号263)
 SPQHHKFVQD(配列番号264)
 RPRRLWTTQE(配列番号265)
 PPRIHETTQD(配列番号266)

0210

 アミノ酸位置471〜484にまたがる図12に示されている通りの5a型のE2領域(HVR−2)内の可変領域も、同様に、
 TISYANGSGPSDDK(配列番号267)
という配列をもつ本発明に従った好ましいペプチドである。

0211

 上述のペプチドリストワクチン及び診断法の開発のため特に適している。

0212

 同様に本発明に含まれているのは、それらのペプチド鎖の中に上述のペプチドから誘導された少なくとも5つの隣接アミノ酸を含むあらゆる合成ペプチド又はポリペプチドである。

0213

 特定の実施態様に従うと、本発明は、前記隣接配列が以下のHCVアミノ酸3型配列のいずれかから選択されている、上述の組成物に関する。

0214

− 図5に示されている通り、コア/E1領域の位置140〜319にまたがる領域の中の、配列番号14、16、18、20、22、24、26又は28(HD10、BR36、BR33配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して72%以上、好ましくは74%以上、より好ましくは77%以上、最も好ましくは80又は84%以上の相同性を有する配列;

0215

− 図5に示されている通り、位置192〜319にまたがるE1領域の中の、配列番号14、16、18、20、22、24、26又は28(HD10、BR36、BR33配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して70%以上、好ましくは72%以上、より好ましくは75%以上、最も好ましくは81%以上の相同性を有する配列;

0216

− 図5に示されている通り、コア領域の位置1〜110にまたがる領域の中の、配列番号148(3c型);BE98に表わされている通りのアミノ酸配列に対して86%以上、好ましくは88%以上、最も好ましくは90%以上の相同性を有する配列;

0217

− 図7及び11に示されている通り、NS3/NS4領域の位置1646〜1764にまたがる領域の中の、配列番号30、
32、34、36、38又は40(HCC153、HD10、BR36配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して76%以上、好ましくは78%以上、最も好ましくは80%以上の相同性を有する配列;

0218

− 図5に示されている通り、コア/E1領域の位置140〜319にまたがる領域の中の、配列番号14、16、18、20、22、24、26又は28(HD10、BR36、BR33配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して81%以上、好ましくは83%以上、最も好ましくは86%以上の相同性を有する配列;

0219

− 図5に示されている通り、位置192〜319にまたがるE1領域の中の、配列番号14、16、18、20、22、24、26又は28(HD10、BR36、BR33配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して81.5%以上、
好ましくは83%以上、最も好ましくは86%以上の相同性を有する配列;

0220

− 図2に示されている通り、NS5領域の位置2645〜2757にまたがる領域の中の、配列番号150(3c型BE98)に表わされている通りのアミノ酸配列に対して86%以上、好ましくは88%以上、最も好ましくは90%以上の相同性を有する配列。

0221

 さらにもう1つの実施態様に従うと、本発明は、前記隣接配列が、以下のHCVアミノ酸4型配列のいずれかから選択されている、上述の組成物に関する。

0222

− 図5に示されている通り、コア/E1領域の位置127〜319にまたがる領域の中の、配列番号119、121及び123(GB358、GB549、GB809配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して80%以上、好ましくは82%以上、最も好ましくは84%以上の相同性を有する配列;

0223

− 図5に示されている通り、コア/E1領域の位置140〜319にまたがる領域の中の、配列番号119、121及び123(GB358、GB549、GB809配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して、位置192〜319にまたがるE1領域の中の73%以上、好ましくは75%以上、最も好ましくは78%以上の相同性を有する配列;

0224

− 図5に示されている通り、E1の位置192〜319にまたがる領域の中の、配列番号119、121又は123(GB358、GB549、GB809配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して85%以上、好ましくは86%以上、最も好ましくは87%以上の相同性を有する配列;

0225

− 図2に示されている通り、NS5領域の位置2645〜2757にまたがる領域の中の、配列番号107、109、111、113、115又は117(GB48、GB116、GB215、GB358、GB549、GB809配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して73%以上、好ましくは74%以上、最も好ましくは75%以上の相同性を有する配列;

0226

− 図5に示されている通り、コア/E1領域の中の配列番号164又は166(GB809及びCAM600配列)に表わされている通りの配列のいずれかを有する配列;

0227

− 図5に示されている通り、E1領域の中の配列番号168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188又は190(CAM600、GB809、CAMG22、CAMG27、GB549、GB438、CAR4/1205、CAR4/901、GB116、GB215、GB958、GB809−4配列)に表わされている通りの配列のいずれかを有する配列;
− NS5領域の中の配列番号192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212(GB358、GB724、BE100、PC、CAM600、CAMG22など)に表わされている通りの配列のいずれかを有する配列。

0228

 上述の4型ペプチドポリペプチドには、Simmondset al., (1993, EG-29,図5参照)に開示されているコア配列を除いていずれかのHCV4型ポリタンパク質から選択された少なくとも1つのアミノ酸が含まれる。

0229

 さらにもう1つの態様に従うと、本発明は、前記隣接配列が以下のHCVアミノ酸5型配列のいずれかから選択される上述の通りの組成物に関する。

0230

− 図5に示されている通り、配列番号42、44、46、48、50、52又は54(PC配列)及び配列番号152(BE95)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対し、
コア位置1〜191にまたがる領域の中の93%以上、好ましくは94%以上、最も好ましくは95%以上の相同性を有する配列;

0231

− 図5に示されている通り、配列番号42、44、46、48、50、52又は54(PC配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対し、E1位置192〜319にまたがる領域の中の73%以上、好ましくは74%以上、最も好ましくは76%以上の相同性を有する配列;

0232

− 図5に示されている通り、コア/E1領域の位置1〜319にまたがる領域の中の、配列番号、42、44、46、48、50、52、54、154、156(BE95、BE100)(PC配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して78%以上、好ましくは80%以上、最も好ましくは83%以上の相同性を有する配列;

0233

− 図7又は11に示されている通り、NS3領域の位置1286〜1403にまたがる領域の中の、配列番号56又は58(PC配列)に表わされているアミノ酸配列のいずれかに対して90%以上、好ましくは91%以上、最も好ましくは92%以上の相同性を有する配列;

0234

− 図7又は11に示されている通り、NS3/4領域の位置1646〜1764にまたがる領域の中の、配列番号60又は62(PC配列)に表わされている通りのアミノ酸配列のいずれかに対して66%以上、より特定的には68%以上、最も特定的には70%以上の相同性をもつ配列。

0235

 さらにもう1つの実施態様に従うと、本発明は、前記隣接配列が以下のHCVアミノ酸2d型配列のいずれかから選択されている、
上述の組成物に関する。

0236

− 図5に示されている通り、コア/E1領域の位置1〜319にまたがる領域の中の、配列番号144(NE92)に表わされている通りのアミノ酸配列に対して83%以上、好ましくは85%以上、最も好ましくは87%以上の相同性を有する配列;

0237

− 図12に示されている通り、配列番号144(NE92)に表わされている通りのアミノ酸配列に対して、E1位置192〜319にまたがる領域の中の79%以上、好ましくは81%以上、最も好ましくは84%以上の相同性を有する配列;− 図2に示されている通り、NS5領域の位置2645〜2757にまたがる領域の中の、配列番号146(NE92)に表わされている通りのアミノ酸配列に対して95%以上、より特定的には96%以上、最も特定的には97%以上の相同性を有する配列。

0238

 本発明は又、組換えベクター、特にクローニング及び/又は発現のための組換えベクターに関し、該組換えベクターは、ベクター配列、適切な原核真核又はウイルスプロモーター配列とそれに続いて上述のヌクレオチド配列を含み、かつ該組換えベクターはのDNAとして注入された時、原核又は真核宿主又は生きた哺乳動物の中で、上述の通りのHCV2型及び/又はHCV3型及び/又は4型及び/又は5型の誘導ポリペプチドのいずれか1つの発現を可能にし、そしてより特定的には、該組換えベクターは以下のアミノ酸位置にまたがる以下のHCV2d型、3型、4型又は5型ポリペプチドのいずれかの発現を可能にする:

0239

− 位置1で始まり、位置70と326の間の領域内のいずれかの位置で終わるポリペプチド、より特定的には、コアタンパク質の発現のためには、位置1〜70、位置1〜85、位置1〜120、位置1〜150、位置1〜191、位置1〜200にまたがるポリペプチド、そしてコア及びE1タンパク質の発現のために位置1〜263、位置1〜326にまたがるポリペプチド;

0240

− 位置117と192の間の領域内のいずれかの位置で始まり、E1の発現のためには、位置263と326の間の領域内のいずれかの位置で終わるポリペプチド、又は推定上の膜アンカーが欠失した形態(位置264〜293±8アミノ酸);

0241

− NS4領域の発現のために、位置1556と1688の間の領域内のいずれかの位置で始まり、位置1739〜1764の間の領域内のいずれかの位置で終わるポリペプチド、より特定的にはNS4a抗原の発現のために、位置1658で始まり、位置1711で終わるポリペプチド、より特定的にはNS4bタンパク質又はその一部の発現のために位置1712で始まり、位置1743と1972の間、例えば1712−1743、1712−1764、1712−1782、1712−1972、1712−1782及び1902−1972の間で終わるポリペプチド。

0242

 「ベクター」という語は、プラスミドコスミドファージ又はウイルスを含んでもよい。

0243

 E. coli のような細菌、又はS. cerevisiae のような真核細胞、又は培養した脊椎動物又は無脊椎動物の宿主、例えば昆虫細胞チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、COS、BHK、及びMDCK細胞の中で本発明のポリペプチドを発現させるため、以下の工程が行なわれる:
− 組換えベクターでの適切な細胞宿主形質転換が、本発明のポリペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列に適切な制御要素、特に細胞宿主のポリメラーゼにより認識されるプロモーターが、原核宿主の場合には、ヌクレオチド配列の該細胞宿主内での発現を可能にする適切なリボソーム結合部位(RBS)の制御下で挿入される。真核宿主の場合には、どんなシグナル配列又はプリプロ配列でも提供することができ、或いは天然のHCVシグナル配列でも利用することができ、例えばE1の発現のためには、アミノ酸位置117及び170の間で始まり、アミノ酸位置191で終わるシグナル配列が使用でき、NS4の発現のためには、アミノ酸位置1646と1659の間で始まるシグナル配列を使用することができる。
− 前記挿入物の発現を可能にする条件下での前記形質転換された細胞宿主の培養。

0244

 本発明は又、前記ポリペプチドが、上述の通りの発現ベクターを用いて発現された組換えポリペプチドである、上述の組成物にも関する。

0245

 本発明は又、免疫応答を生じさせるため、場合によって薬学的に受容可能なアジュバントを伴って、充分な量の組成物を投与することを含む、哺乳動物好ましくはヒトをHCVに対して免疫化するための方法において使用するための、上述の通りの組成物、より特定的には、コア、E1又はNS4領域から誘導されたHCV3型ポリペプチド及び/又はHCV4型及び/又はHCV5型ポリペプチド及び/又はHCV2d型ポリペプチドを含むワクチン組成物にも関する。

0246

 本発明は又、上述の通りの方法を用いて上述の通りの組成物での免疫したとき産生する抗体について、上述の通りのポリペプチドのいずれかと反応する抗体について、及び好ましくはモノクローナル抗体である前記抗体にも関する。

0247

 本発明のモノクローナル抗体は、動物脾細胞、特に本発明に従ったHCVポリペプチド又はその突然変異体、又は上述のとおりのそのフラグメント、又一方では骨髄腫セルライン細胞のフラグメントに対して免疫化された、マウス又はラットからの脾細胞から古典的方法に従って形成され、しかも動物の免疫化のために当初用いられたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ能力によって選択される可能性の高いあらゆるハイブリドーマによって産生されうる。

0248

 本発明に包まれる抗体は、酵素螢光又は放射線タイプの適切な標識により標識づけされうる。

0249

 本発明のこの好ましい実施態様に従ったモノクローナル抗体は、H及びL鎖に対しコードするマウス及び/又はヒトゲノムDNA配列の一部分から、又はH及びL鎖に対しコードするcDNAクローンから出発して、組換えDNA技術を用いて作られるマウスモノクローナル抗体人体バージョンであってもよい。

0250

 代替的には、本発明のこの好ましい実施態様に従ったモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってよい。本発明の実施態様に従ったこれらの抗体は又、3型、4型又は5型HCVで感染を受けているか又はHCVに対しワクチン接種を受けた患者のヒト末梢血リンパ球から誘導することも可能である。このようなヒトモノクローナル抗体は、例えば重症複合型免疫不全(SCID)マウスのヒト末梢血リンパ球(PBL再増殖によって調製可能である(最近のレビューについては、Duchosal et al., 1992 を参照のこと)。

0251

 本発明は又、レペルトワークローニング方法(Persson et al., 1991)による組換え抗体の選択のための、本発明のタンパク質、その突然変異体又はそれから誘導されたペプチドの使用にも関する。

0252

 或る種の遺伝子型から誘導されたペプチドに向けられた抗体を、かかるHCV遺伝子型の検出のため、或いは又治療用薬剤として使用することができる。

0253

 本発明は又、それを含んでいる可能性の高い生物学的試料の中に存在するHCVを検出するため、免疫検定取込むための少なくとも以下の工程を含む上述の通りの組成物の使用にも関する。
 (i)前記ポリペプチドが、ビオチニル化されたポリペプチドであり、ストレプトアビジン又はアビジン複合体を用いて固体基材に共有結合されている状態で、免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で好ましくは固定化された形態で、上述の通りの組成物のいずれかと、HCV抗体の存在について分析すべき生物学的試料と接触させる工程;
 (ii)未結合成分を除去する工程;
 (iii)異種抗体が、適切な条件下で検出可能な標識に接合された状態で、分析すべき試料中に存在する抗体に特異的に結合するこの異種抗体を用いて形成された免疫複合体をインキュベートする工程;
 (iv)目視で、又はデンシトメトリーを用いて、前記免疫複合体の存在を検出し、観察されたハイブリダイゼーションパターンから存在するHCV血清型を推定する工程。

0254

 本発明は又、それを含んでいる可能性の高い生物学的試料の中に存在する単数又は複数のHCV血清型を検出するため、より特定的には1つの検定フォーマットに組合わされた検定すべき異なる型のE1及びNS4抗原又は抗体を検出するため、血清学的分類検定に取り込むための、少なくとも次の工程を含む上述のとおりの組成物の使用にも関する。
 (i)免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、固定された形態である上述の組成物の少なくとも1つを、単数又は複数の血清型のHCV抗体又は抗原の存在について分析すべき生物学的試料と接触させる工程;
 (ii)未結合成分を除去する工程;
 (iii)異種抗体が、適切な条件下で検出可能な標識に接合された状態で、分析すべき試料中に存在する抗体に特異的に結合するこの異種抗体を用いて形成された免疫複合体をインキュベートする工程;
 (iv)目視で、又はデンシトメトリーを用いて、前記免疫複合体の存在を検出し、観察された結合パターンから単数又は複数のHCV血清型の存在を推定する工程。

0255

 本発明は又、上述の方法に従ってHCVの遺伝子型又は存在を決定するため、固体基材上への固定化及び逆相ハイブリダイゼーション検定への取込み、好ましくは膜片のような固体支持体上への平行線としての固定化のための、上述の通りの組成物の使用にも関する。

0256

 従って、本発明は又、それを含んでいる可能性の高い生物学的試料の中に存在する、上述の通りのHCV遺伝子型の存在を検出するための次のものを含むキットに関する。
−場合によって、上述のプライマー又はその他のあらゆるHCV3型及び/又はHCV4型及び/又はHCV5型又は万能HCVプライマーの中から選ばれたいずれかのプライマーを含む少なくとも1つのプライマー組成物
−好ましくは固体基材上に、より好ましくは1つの同じ膜片上に固定化されている状態の、上述の通りの少なくとも1つのプローブ組成物
−これらのプローブと場合によって増幅された産物との間のハイブリダイゼーション反応が行なえるようにする緩衝液又はそれを作るのに必要な成分、
−上記ハイブリダイゼーションの結果得られたハイブリッドを検出するための手段、
−場合によっては同様に、観察されたハイブリダイゼーションパターンから試料中に存在するHCV遺伝子型を推定するための、自動化された走査及び解釈用装置。

0257

 遺伝子型は又、形成された免疫複合体を検出するべく、PCRにより後で増幅させることのできる、あらゆるポリヌクレオチド配列に連鎖されている上述の通りの型特異的抗体を用いて検出することも可能である(Immuno-PCR, Sano et al., 1992);

0258

 本発明は又、それを含んでいる可能性の高い生物学的試料の中に存在する上述の通りのHCV抗体の存在を検出するため、次のものを含むキットに関する。
−好ましくは固定基材上に、より好ましくは1つの同じ膜片上に固定されている状態の、好ましくはHCV1型、HCV2型又はその他HCV型からのその他のポリペプチド又はペプチドと組合せた形での、上述の少なくとも1つのポリペプチド組成物
−これらのポリペプチドと生物学的試料中に存在するHCVに対する抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又はそれを作るのに必要な成分、
− 上記結合反応によって形成された免疫複合体を検出するための手段、
− 場合によっては同様に、観察された結合パターンから試料中に存在するHCV遺伝子型を推定するための、自動化された走査及び解釈用装置。

0259

 例1:HCV3型のNS5b領域
 一定数のブラジル人の献血者からのINNO−LiPA HCV研究キット(Stuyer et al., 1993)を用いて選択された3型血清は、HCV抗体ELSIA(InnotestHCVAbII;Innogenetics)及び/又はINNO−LIA HCVAbII確認試験(Innogenetics)において陽性であった。第一回目PCR反応後に陽性であった血清(Stuyver et al., 1993)のみを、さらなる研究のために保持した。
 逆転写及びネステッドPCR;RNAを50μlの血清から抽出し、記述された通りに(Stuyver et al., 1993)cDNA合成に付した。このcDNAをPCRのための鋳型として用い、この合計体積は、各プライマーを10pmolesずつと3μlの10×Pfu緩衝液2(Stratagene)及び2.5UのPfuDNAポリメラーゼ(Stratagene)を含め50μlとなるまで増大させた。1分間94℃、1分間50℃及び2分間72℃から成る45サイクルにわたりcDNAを増幅させた。増幅させた産物を電気泳動により分離し、記述されている通りに隔離、クローニング及び配列を決定した(Stuyver et al., 1993)。
 以下の通り、公表された配列(Mori et al., 1992)からNS5領域内の3a型及び3b型に特異的なプライマーを選択した:
 3a型について:
 HCPr161(+):5'-ACCGGAGGCCAGGAGAGTGATCTCCTCC-3'(配列番号63)及び
 HCPr162(-):5'-GGGCTGCTCTATCCTCATCGACGCCATC-3'(配列番号64)
 3b型について:
 HCPr163(+):5'-GCCAGAGGCTCGGAAGGCGATCAGCGCT-3'(配列番号65)及び
 HCPr164(-):5'-GAGCTGCTCTGTCCTCCTCGACGCCGCA-3'(配列番号66)
 ラインプローブ検定(LiPA)(Stuyver et al., 1993)を用いて、7つの高力価3型血清を選択し、その後3a型についてはプライマーセットHCPr161/162、そして3b型についてはHCPr163/164を用いて分析した。これらの血清のどれも3b型プライマーに対してポジティブでなかった。血清BR36(BR36−23)、血清BR33(BR33−2)及び血清BR34(BR34−4)の3a型プライマーを用いて得たNS5 PCRフラグメントを、クローニングのために選択した。以下の配列を、PCRフラグメントから得た:
 フラグメントBR34−4から:
 BR34−4−20(配列番号1)、BR34−4−19(配列番号3)、
 フラグメントBR36−23から:
 BR36−23−18(配列番号5)、BR36−23−20(配列番号7)、
 フラグメントBR33−2から:
 BR33−2−17(配列番号9)、BR33−2−21(配列番号11)。
 既知の配列との配列番号1、5及び9をもつ配列の並べての比較が、図1に示されている。推定されたアミノ酸配列の並べての比較は、図2に示されている。3つの分離株は互いに(約95%の相互相同性)そして3a型の公表された配列(Mori et al., 1992)に対して非常に近い関係をもっているが、1型及び2型の配列に対しては遠位に関連しているにすぎない(表5)。従って、LiPA選択された3型血清からのNS5配列が実際3型ゲノムから誘導されていることが明確に実証されている。その上、Stuyver et al., (1993)に記述されている通りにいかなる5′UR配列も決定されなかった血清BR34のNS5領域を分析することにより、LiPAを用いた型分類とヌクレオチド配列決定から推定される通りの遺伝子型分類の間には、さらに優れた相関関係が立証された。

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