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技術 酪農水流の濾過方法

出願人 ネオステクノロジーズインコーポレイテッド
発明者 スティーブン・エー・ロスジョナサン・ケー・ウェイルマイケル・スペイド
出願日 2001年2月6日 (19年10ヶ月経過) 出願番号 2001-559275
公開日 2003年7月29日 (17年5ヶ月経過) 公開番号 2003-522539
状態 拒絶査定
技術分野 医薬品製剤 糖工業 化粧料 微生物による化合物の製造 乳製品
主要キーワード 流出水流 塩基性タイプ ナノ濾過法 シート膜 綿状沈殿 水性母液 ミクロ濾過 クラリファイヤー
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課題・解決手段

濾過法によるシアリルオリゴサッカリドの単離で遭遇される純度に関する特別な問題は、ラクトースからの分離である。分子サイズの類似性のため、濾過による廃棄水流から、ラクトースの存在しないシアリルオリゴサッカリドを単離することはしばしば困難である。従って、酪農水流から高い純度で、シアリルオリゴサッカリドを得るための濾過方法が所望されるであろう。本発明は、シアリルオリゴサッカリドとラクトースとを含む酪農水流をプロセッシングする方法を提供することによりこの問題を解決し、ここでは酪農水流が、シアリルオリゴサッカリドの分離の前に、ラクトースの加水分解を果たすように処理される。

概要

背景

概要

濾過法によるシアリルオリゴサッカリドの単離で遭遇される純度に関する特別な問題は、ラクトースからの分離である。分子サイズの類似性のため、濾過による廃棄水流から、ラクトースの存在しないシアリルオリゴサッカリドを単離することはしばしば困難である。従って、酪農水流から高い純度で、シアリルオリゴサッカリドを得るための濾過方法が所望されるであろう。本発明は、シアリルオリゴサッカリドとラクトースとを含む酪農水流をプロセッシングする方法を提供することによりこの問題を解決し、ここでは酪農水流が、シアリルオリゴサッカリドの分離の前に、ラクトースの加水分解を果たすように処理される。

目的

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請求項1

i)ラクトースシアリルオリゴサッカリドを含む酪農水流のラクトース構成成分を加水分解する工程;ii)シアリルオリゴサッカリド構成成分を単離する工程;を含む、酪農水流のプロセッシング方法。

請求項2

加水分解が、β-ガラクトシダーゼ酵素で実施される、請求項1記載の方法。

請求項3

ラクトース加水分解速度:シアリルオリゴサッカリド加水分解速度の比が、10:1である、請求項1記載の方法。

請求項4

前記シアリルオリゴサッカリド構成成分が、膜濾過によって単離される、請求項1記載の方法。

請求項5

前記膜濾過が、ナノ濾過である、請求項4記載の方法。

請求項6

ナノ濾過が、Desal Gk膜を使用して実施される、請求項4記載の方法。

請求項7

前記シアリルオリゴサッカリド構成成分が、≦5重量%のラクトース含量を有する、請求項1記載の方法。

請求項8

前記シアリルオリゴサッカリド構成成分が、≦5重量%のグルコースガラクトース含量を有する、請求項1記載の方法。

請求項9

前記シアリルオリゴサッカリド構成成分が、3'シアリルラクトース、6'シアリルラクトース、6'シアリルラクトサミン、3'シアリルラクトサミン、ジシアロラクトース、及びこれらの混合物からなる群から選択されるシアリルオリゴサッカリドを含む、請求項1記載の方法。

請求項10

ラクトースの加水分解が、グルコースとガラクトース生産し、前記グルコースと前記ガラクトースの単離をさらに含む、請求項1記載の方法。

請求項11

ガラクトースからのグルコースの分離をさらに含む、請求項10記載の方法。

請求項12

i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドを含む酪農水流のラクトース構成成分を加水分解する工程;ii)シアリルオリゴサッカリド構成成分を単離する工程;並びにiii)組成物に前記シアリルオリゴサッカリド構成成分を添加する工程;を含む、シアリルオリゴサッカリド含有組成物調製方法

請求項13

前記シアリルオリゴサッカリド含有組成物が、幼児用処方化粧品組成物製薬組成物、及び食料からなる群から選択される、請求項12記載の方法。

請求項14

i)シアリルオリゴサッカリド;ii)グルコース;並びにiii)ガラクトースを含む組成物であって、グルコースとガラクトースが0.95から1.05:1の比で存在する組成物。

請求項15

i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドとを含む酪農水流のラクトース構成成分を加水分解し、グルコースとガラクトースを形成する工程;並びにii)グルコースとガラクトースを単離する工程;を含む、グルコースとガラクトースの製造方法。

請求項16

ガラクトースからのグルコースの分離をさらに含む、請求項15記載の方法。

0001

本発明は、酪農水流濾過方法に関する。

0002

ホエーチーズ作製の主要な副産物であり、それは環境的な理由のため、難しい廃棄物の廃棄の問題を提供する。ホエーは典型的に、約5重量%のラクトース、1重量%のタンパク質、及び約0.5重量%の塩からなり、ここで混合物バランスは水である。タンパク質構成成分が、しばしば超濾過によって回収され、従って食料製品において使用できる一方で、ラクトース構成成分は今までほとんど価値を有していない。

0003

ホエー廃棄水流経済的価値を増大する一つの方法は、破棄水流からシアリルオリゴサッカリドを単離することである。アニオン交換クロマトグラフィーは、ラクトースから荷電したシアリルオリゴサッカリド構成成分を除去するために有効である。塩の存在、特に酸の添加から由来するクエン酸塩の存在は、シアリルオリゴサッカリドの除去の有効性を著しく減少し、そのためシアリルオリゴサッカリドの有効な回収を達成するために、ホエー廃棄水流から塩を除去することが従来法となっている。

0004

シアリルオリゴサッカリド分画除去方法報告されているが、抽出及びイオン交換法は、スループット及び純度の観点から完全に満足なものとはなっていない。

0005

Shimatani等, 米国特許第5,118,516号は、(a)電気透析、または(b)カチオン交換樹脂と強力な塩基性アニオン交換樹脂によるイオン交換、または(c)電気透析と、透過物脱塩するためのカチオン交換樹脂と強力な塩基性アニオン交換樹脂によるイオン交換との組み合わせによる、ホエー、スキムミルク、または脱タンパク質化溶液からのシアル酸含有ラクトースの単離を報告している。

0006

Shimatani等, 米国特許第5,270,462号は、チーズホエーのpHを酸性に調節し、ホエーをカチオン交換因子と接触させ、溶出物濃縮して脱塩することによる、高濃度のシアル酸を含む組成物の製造方法を報告している。

0007

日本国特開平1-168,693号は、ミルク、ノンファットミルク、バターミルク、またはホエーを超濾過にかけ、4.0から6.0のpHで20,000から500,000ドルトンで分画し、第二の超濾過で、0.2から2.0MPaの下で6.0から8.0のpHで1,000から10,000ドルトンで分画し、ラクトースのような不純物を除去することによる、シアル酸組成物の調製を報告している。残余物スプレードライまたは凍結乾燥される。

0008

日本国特開平3-143,351号は、中和し、超濾過し、逆浸透し、脱塩し、強力な塩基性タイプアニオン交換樹脂にシアル酸を吸着し、その後溶出して脱塩して乾燥することによる、ホエーの脱塩で形成されたアニオン交換樹脂のアルカリ洗浄廃液からのオリゴサッカリド結合タイプのシアル酸の回収を報告している。

0009

日本国特開昭59-184,197号は、シアリルオリゴサッカリド含有糖蜜を脱塩し、脱塩した溶液をアニオン交換カラムに通し、溶出物を中和し、電気透析により溶出物を脱塩することによる、シアル酸に結合したオリゴサッカリドの製造を報告している。

0010

Gregory等, 米国特許第5,707,678号は、脂肪及びカゼインの除去の後、4.5から5.0のpHで超濾過することにより、ミクロフィルター膜またはデプスフィルターファウリングなくミクロ濾過できるホエー産物を提供する、ミルクまたは初乳アーのミクロ濾過の方法を報告している。シアリルオリゴサッカリドの単離は報告されていない。

0011

Marquardt等, 米国特許第4,497,836号は、ミネラル豊富食用のチーズホエーを超濾過にかけて、タンパク質が豊富な残余物とラクトースが豊富な濾過物生産する、幼児用食料処方における使用に適した産物の調製方法を報告している。次いでラクトースが豊富な濾過物は、電気透析によるように、部分的に脱ミネラル化され、タンパク質が豊富な残余物と混合される。この方式では、脱ミネラル化が可能である。さらにこの方法では、残余物はタンパク質が豊富な組成物であり、濾過物はラクトースとミネラルが豊富である。シアリルオリゴサッカリドの豊富な残余物の作製は開示されていない。

0012

Venkatsubramanian等, 米国特許第4,376,023号は、デキストロースとオリゴサッカリドを含む産物水流を、高い透過性及び低い透過性のイオン交換膜の変化を使用することによって、電気浸透セルにおいて分離し、デキストロースを選択的に除去して、デキストロースとオリゴサッカリドの豊富な別個流出水流をそれぞれ得ることを達成する方法を報告している。

0013

Hall, 米国特許第4,081,326号は、G4及び低級サッカリドを含むオリゴサッカリド組成物を、パン酵母及びマルターゼの両者で処理することによる、G4及び低級サッカリドを特に含まないオリゴサッカリド組成物の取得方法を報告している。

0014

Hermann, 米国特許第4,844,923号は、酸性沈降によるミルク産物からの血清タンパク質を除去方法を報告しており、そこでは酸沈降の前の少なくとも部分的な脱ミネラル化が、この方法の効率を著しく増大することが見出された。逆浸透によるシアリルオリゴサッカリドの除去は開示されていない。

0015

Eustache, 米国特許第4,042,576号は、タンパク質を熱処理により綿状沈殿し、次いで上清を超濾過する、ホエーからの糖タンパク質とシアル酸の抽出方法を報告している。超濾過残余物は加水分解によって処理され、次いでシアル酸が加水分解上清から抽出される。残余物組成物を制御するための超濾過におけるpHの調節は開示されていない。

0016

Brian等, 米国特許第5,714,075号は、イオン交換クロマトグラフィーによりシアリルオリゴサッカリドのリチウム塩を得て、溶媒で抽出することによってシアリルオリゴサッカリドを得る、チーズ加工廃棄水流のプロセッシングを報告している。

0017

濾過法によるシアリルオリゴサッカリドの単離で遭遇される純度に関する特別な問題は、ラクトースからの分離である。分子サイズの類似性のため、濾過による廃棄水流から、ラクトースの存在しないシアリルオリゴサッカリドを単離することはしばしば困難である。従って、酪農水流から高い純度で、シアリルオリゴサッカリドを得るための濾過方法が所望されるであろう。

0018

本発明は、シアリルオリゴサッカリドとラクトースとを含む酪農水流をプロセッシングする方法を提供することによりこの問題を解決し、ここでは酪農水流が、シアリルオリゴサッカリドの分離の前に、ラクトースの加水分解を果たすように処理される。

0019

従って、本発明の一つの目的は、酪農水流からシアリルオリゴサッカリドをプロセッシングする新規な方法を提供することである。

0020

本発明の第二の目的は、シアリルオリゴサッカリドの分離の前に、ラクトースの加水分解にかけられている酪農水流からシアリルオリゴサッカリドをプロセッシングする新規な方法を提供することである。

0021

本発明の目的は、以下の工程:
i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドを含む酪農水流のラクトースを加水分解する工程;
ii)シアリルオリゴサッカリドを分離する工程;
を含む、シアリルオリゴサッカリドとラクトースを含む酪農水流からシアリルオリゴサッカリドをプロセッシングする方法によって達成される。

0022

分離が、ラクトースがグルコースガラクトースに加水分解されている酪農水流で実施される場合に、シアリルオリゴサッカリドの純度が増大できることが発見された。

0023

本発明は、ラクトースがグルコースとガラクトースに加水分解されている廃棄水流で分離が実施される場合、シアリルオリゴサッカリドがより容易に分離されるという発見に部分的に基づく。

0024

加水分解化酪農水流の濾過は、廃棄水流がシアリルオリゴサッカリドとラクトースを含むことを条件に実施されて良い。しかしながらほとんどの酪農水流は、タンパク質、塩及び脂肪のようなオリゴサッカリド以外のさらなる構成成分を含み、従ってそれらの除去は、当業者に知られた一般的方法によって達成されて良い。

0025

例えば酪農水流は、濾過、当業者に知られた従来法によってオリゴサッカリド分画に精製されて良い。

0026

ナノ濾過膜は、Desalによって製造されたG20のような約35,000の分子量カットオフを有する逆浸透膜であろう。

0027

ナノ濾過は、10から1,000lbs/psi、好ましくは50から800lbs/psi、より好ましくは100から400lbs/psiの正圧で実施される。

0028

ナノ濾過の温度は特に制限されず、10℃から約40℃で実施されて良い。低pH及び高温では、シアリルオリゴサッカリドは分解し始めるであろう。

0029

ナノ濾過膜のサイズ(比表面積)は、処理される酪農水流の容量、ナノ濾過される溶液中の物質の濃度、及び所望のスループットに依存して、当業者によって適切なように選択されて良い。

0030

オリゴサッカリド含有分画を得た後に、シアリルオリゴサッカリドは、ラクトースの加水分解と分離によってさらに精製されて良い。

0031

プロセッシングされる廃棄水流においてラクトースを加水分解するために使用される方法については、特に制限されない。ラクトースのグルコース−ガラクトース結合の切断について選択的な加水分解酵素での処理が好ましい。加水分解処理の使用は、シアリルオリゴサッカリド構成成分を顕著に加水分解せずに、モノサッカリドグルコースとガラクトースにラクトースを加水分解するのに十分である。

0032

本発明の文脈の範囲内で、シアリルオリゴサッカリドは、3'シアリルラクトース、6'シアリルラクトサミン、3'シアリルラクトサミン、及びジシアロラクトースを制限することなく含むであろう。

0033

好ましくは、ラクトースの加水分解の速度:シアリルオリゴサッカリドの加水分解の速度の比が、>10:1、より好ましくは>15:1、さらにより好ましくは>20:1、より好ましくは>500:1、及びさらにより好ましくは>50,000:1のような条件の下で、加水分解が実施される。

0034

一つの実施態様では、加水分解は、酵素、特にβ-ガラクトシダーゼ酵素によって触媒される。適切なβ-ガラクトシダーゼ酵素は、過度実験なくして当業者に知られた従来法によって得られて良い。好ましい実施態様では、β-ガラクトシダーゼは、Aspergillusの発酵によって作製される。適切な酵素は、New YorkのEnzyme Development社から得られても良い。適切な酵素は、Johnson and JohnsonのMcNeil Consumerプロダクト部門から得られるLactaid(登録商標)として入手可能である。

0035

典型的な酵素的加水分解は、水のような水性媒体で実施され、その媒体は当業者に知られているさらなる構成成分をさらに含んでも良い。

0036

酪農水流のpHは、シアリルオリゴサッカリドに対するラクトースの加水分解速度差異最大化するために、当業者に知られた従来法によって調節されて良い。例えば3-8、好ましくは4-7、より好ましくは約5.5のpHが選択されて良い。所望のpHの範囲は、HCl、H2SO4、HOAc、シュウ酸クエン酸、または乳酸のようなプロトン酸を加えることによって得られて良い。

0037

もし必要であれば、pHは、NaOH、NaHCO3、アンモニアのような適切な塩基を加えることによって調節されても良い。

0038

グルコース−ガラクトース結合の切断の最適な活性にpHを調節するために、反応媒体緩衝されて良い。適切なバッファーは、当業者によって選択されて良い。しかしながら、反応媒体のイオン強度を最小化する観点から、高い能力を有するバッファーが選択される。

0039

ホエーはラクトースに対する乳酸生産細菌の機能の結果として典型的に酸性であるため、ホエーは適切な加水分解媒体である。

0040

酪農水流の加水分解に作用するために使用される酵素の量は特に制限されず、所定の活性の所定の酵素に対して、コスト的に有効で時間的に有効な加水分解を得るように選択されて良い。4,500活性ユニットのβ-ガラクトシダーゼは、約1時間で0.45gのラクトースを含む溶液の>99%を加水分解するのに有効であり、ここで活性ユニットは、1分間に1マイクロモル(342μg)のラクトースを加水分解するであろう。加水分解の許容可能な速度は、0.45gのラクトースに対して作用する40活性ユニット程度で観察される。

0041

反応温度は特に制限されず、典型的に10から55℃、好ましくは20-40℃、より好ましくは25-38℃、より好ましくは約37℃で、コストと時間的に有効な加水分解を得るように選択されて良い。温度範囲高温端部で観察される選択性損失は存在しない一方で、高温と低pH(約2のpH)の組み合わせは、シアリルオリゴサッカリドとβ-ガラクトシダーゼ酵素の分解を引き起こし得る。

0042

酪農水流のラクトース構成成分の加水分解の後、加水分解化物質の、シアリルオリゴサッカリド含有分画とグルコース/ガラクトース含有分画への分離が実施されて良い。

0043

加水分解化酪農水流からのシアリルオリゴサッカリド構成成分の分離は、濾過(ナノ濾過及び超濾過、結晶化及びクロマトグラフィー)によるような、当業者に知られた従来法によっても良い。

0044

分離は、分子量及び/または荷電に基づいて分離して、膜を通じたナノ濾過によっても良い。例えば適切な膜は、Desal GKシート膜スパイラルウーンド、セラミックポリエーテルスルホンポリビニルジフオリド、、及び再生セルロースである。一般的な条件の下での典型的な膜選択性は、>50:1、好ましくは>75:1、より好ましくは>100:1、さらにより好ましくは>500:1の、シアリルオリゴサッカリドに対するグルコース及びガラクトースの選択である。

0045

ナノ濾過条件は、許容可能な速度で許容可能なレベルの分離を生ずるように、当業者によって選択されて良い。圧力(典型的に10から1,000psig、好ましくは200-300psig)、典型的に10から60℃、好ましくは25-38℃の温度、及び流速の調節は、許容可能なレベルの分離を得るのに十分であろう。pHは特に制限されないが、3より低いpHでは、シアリルラクトースは典型的に膜を通過する。

0046

好ましい実施態様では、生成したシアリルオリゴサッカリド含有構成成分は、加水分解前のオリゴサッカリド構成成分に対する、>50:1、好ましくは>75:1、より好ましくは>100:1、さらにより好ましくは>500:1のラクトースに対するシアリルオリゴサッカリドの富化を有する。

0047

ナノ濾過の後の残余物は、≦5重量%、好ましくは≦3重量%、より好ましくは≦1重量%、さらにより好ましくは≦0.5重量%の残余ラクトース含量を有して良い。

0048

ナノ濾過の後の残余物は、≦5重量%、好ましくは≦3重量%、より好ましくは≦1重量%、さらにより好ましくは≦0.5重量%の残余のグルコースとガラクトースの組み合わせを有して良い。

0049

本発明に従ってプロセッシングされた酪農水流は、チーズ作製工程の間で生成したいずれの廃棄水流から得られても良い。例えば、スキムミルクをカッテージチーズを形成するために凝集する際に、酸ホエーが固体を分離することによって生成する。酸ホエーは、高い乳酸含量によって特徴付けされる。チーズを全乳から調製する場合、残余の液体スイートホエーであり、それは乾燥ホエーパウダーを形成するように蒸発によってさらにプロセッシングできる。スイートホエーはまた、乾燥し、脱ミネラル化し、蒸発して脱ミネラル化ホエー透過物を形成できる。スイートホエーはまた超濾過にかけることができ、ホエー透過物とホエー透過物濃縮物の両者を形成できる。ホエー透過物は、ラクトースを結晶化することによってさらにプロセッシングでき、ラクトースと母液の両者を形成できる。ホエー透過物からラクトースを結晶化することにより生成した母液は、当該技術分野で「Delac」として知られている。適切な酪農水流は、初乳、ミルク、ミルクパウダー、全ホエー、脱ミネラル化ホエー透過物、脱ミネラル化ホエー透過物から生成した水流、ホエー透過物、結晶化ラクトース、スプレー乾燥化ラクトース、ホエーパウダー、食用ラクトース、ラクトース、精製ラクトース、及びUSPラクトースを含む。好ましくは、ラクトースの結晶化から生成する水性母液物質(即ちDelac)が使用される。

0050

シアリルオリゴサッカリド分画の除去の前に、酪農水流は、シアリルオリゴサッカリドの含量を増大するためにプロセッシングされて良い。例えば、タンパク質分画を未だ含む酪農水流は、トランスシアリダーゼ酵素で処理されて良く、それはシアリル化タンパク質由来のシアル酸基をラクトースに変換することによって、シアリルオリゴサッカリドの濃度を増大する。適切なトランスシアリダーゼ酵素は、Trypanosomeから入手可能である。適切な反応条件は、25から40℃、好ましくは約37℃の温度、500μ/Lの酵素濃度、5-10重量%、好ましくは約7重量%の可溶性濃度、及び4-11、好ましくは約6のpHである。

0051

液体チーズホエーは典型的に、非吸湿性の非常に分散性のパウダーを生産するように典型的に乾燥される。新鮮な液体ホエーは、脱スラッジタイプのクラリファイヤーを通過することによって清浄化される。ホエーは脂肪を除去するように分離され、次いで約62重量%の固体含量に二重または三重用蒸発器において濃縮される。固体は室温での分離によって除去でき、またはより好ましくは濃縮ホエーは固体を除去する前に冷却される。

0052

プロセッシングされる酪農水流がホエーの乾燥から得られる固体である場合、約1から620g、好ましくは50から200g、より好ましくは約100gの固体/水のリットルの量に、固体は最初に水中に溶解される。チーズホエーの乾燥から得られる固体の溶解は、溶解工程を加速し、溶解される固体の量を増大するために、室温または高温で実施できる。好ましくは、20-80℃の温度が適している。

0053

正に荷電した物質を除去するために、当業者に知られたいずれの方法も使用できる。例えば、ホエータンパク質の吸着を引き起こすための一つの適切な方法は、J. N. DeWitt等(Neth. Milk Dairy J., 40: 41-56 (1986))及びJ. S. Ayers等(New Zealand J. Dairy Sci. & Tech., 21: 21-35 (1986))、並びに日本国特開昭52-15120号及び特開昭63-39545号、及び特開平2-104246号及び特開平2-138295号に記載されたように、カチオン交換樹脂と接触させることによる。

0054

適切なカチオン交換樹脂は、当業者に知られた従来法によって調製されて良い。例えば適切なカチオン交換樹脂は、ラジカルエマルション重合法によって重合可能一官能性及び多官能性モノマーの混合物から生産され、次いでプロトン化形態で存在するカルボン酸基またはスルホン酸基のような酸性基官能化されても良い。

0055

カチオン交換樹脂中の架橋度合いは、カチオン交換カラム操作条件に依存して選択できる。高度に架橋された樹脂は、耐久性と高い度合いの機械的強度の利点を与えるが、減少した多孔性マストランスファー下降という欠点を有する。低い架橋の樹脂はより脆弱で、移動相の吸着によって膨潤する傾向を有する。適切な樹脂は、2から12%の架橋、好ましくは8%の架橋を有して良い。

0056

カチオン交換樹脂の粒径は、酪農水流の有効な流れを許容する一方で、正に荷電した物質を有効に除去するように選択される。30×18cmのカラムについての適切な粒径は、100-200メッシュである。

0057

適切なカチオン交換樹脂は、CM-Sephadex、SP-Sephadex、CM-Sepharose、S-Sepharose、CM-Cellulose、Cellulose Phosphate、Sulfoxyethyl-Cellolose、Amberlite、Dowex-50W、Dowex HCR-S、Dowex Macroporous Resin、Duolit C433、SP Trisacryl Plus-M、SP Trisacryl Plus-LS、Oxycellulose、AG 50W-X2、AG 50W-X4、AG 50W-X8、AG 50W-X12、AG 50W-X16、AG MP-50 REsin、Bio-Rex 70を制限することなく含む。より好ましい適切な樹脂は、DOWEX(登録商標)50x8(Dow Chemical社製のポリスチレン架橋樹脂に結合した芳香族スルホン酸)及びAMBERLYST(登録商標)-15、AMBERLITE(登録商標)IR-120、及びAMBERLITE(登録商標)-200酸性樹脂である。

0058

酪農水流は、ホエータンパク質及び他の正に荷電した物質を、カチオン交換樹脂に吸着させるであろういずれかの適切な態様で、カチオン交換樹脂と接触できる。好ましくはカチオン交換樹脂はカラムに搭載され。酪農水流はカラムを通過させられて、ホエータンパク質を除去する。カチオン交換樹脂の量は、正に荷電した物質の除去を達成するように選択され、処理される酪農水流に依存して大きく変化するであろう。典型的に廃棄水流がホエー透過物である場合、カチオン交換樹脂に対する酪農水流の搭載比は、5から20、好ましくは8-15、より好ましくは9から12:1v/vであって良い。

0059

接触がカラムで実施される場合、酪農水流は好ましくは1から70cm/分、好ましくは2から15cm/分、より好ましくは4.6cm/分の速度で通過する。適切な圧力は、所望の流速を得るように選択されて良い。典型的に0から100PSIGの圧力が選択される。適切な流速はまた、カラムの溶出の最後に負の圧力を適用し、溶出物を回収することによって得られて良い。正圧と負圧の両者の組み合わせもまた使用されて良い。

0060

カチオン交換樹脂と酪農水流の接触のために使用される温度は、廃棄水流の構成成分の分解を引き起こさないようにあまり高温でない範囲で、特に制限されない。一般的に、17から25℃の環境室温が使用される。

0061

別法として、正に荷電した物質は、電気泳動、超濾過、逆浸透、または塩沈降のような方法によって除去できる。

0062

3'シアリルラクトース、6'シアリルラクトース、及び6'シアリルラクトサミンのようなシアリルオリゴサッカリドは、細菌抗接着、抗感染として、及び幼児用処方のための添加剤として有用である。シアル酸含有組成物有用性は、米国特許第5,270,462号に報告されている。シアリルラクトースはまた、関節炎治療方法において有用であると報告されている(米国特許第5,164,374号)。3'-シアリルラクトースは、Helicobacter pyloriによって引き起こされる潰瘍の予防と治療のために使用されても良い。

0063

逆浸透は好ましくは、300-1,600psi、より好ましくは400-600psi、さらにより好ましくは450psiの圧力で実施される。

0064

塩を逆浸透によって除去した後、精製した物質を濃縮して、3'-シアリルラクトース及び6'-シアリルラクトースのようなシアリルオリゴサッカリドを含む固体物質を提供でき、これらは水と有機溶媒の混合物から結晶化できる。

0066

さらに、3'シアリルラクトース、6'シアリルラクトース、及び6'シアリルラクトサミンを含むシアリルオリゴサッカリドの混合物を含む、アニオン交換カラムからの溶出液は、酢酸ナトリウム酢酸アンモニウムのような適切な塩、または酢酸リチウム過塩素酸リチウム塩化リチウム、及び臭化リチウムの様なリチウム塩を溶出液としてバッファーで使用して、4から6のpHで、DOWEX 1x2アニオン交換樹脂でのカラムクロマトグラフィーによって、ここに含まれるシアリルオリゴサッカリドの分離にかけることができる。酢酸リチウムの溶液が好ましい。

0067

適切なアニオン交換樹脂は、前述のような当業者に知られた従来法によって調製されて良い。

0068

アニオン交換樹脂における架橋の度合いは、アニオン交換カラムの操作条件に依存して選択できる。適切な樹脂は、2から12%の架橋、好ましくは2%の架橋を有して良い。

0069

アニオン交換樹脂の粒径は、酪農水流の有効な流れが可能な一方で、負に荷電した物質のクロマトグラフィーでの分離に有効に作用するように選択される。20×100cmのカラムについての適切な粒径は、200-400メッシュである。

0070

適切なアニオン交換樹脂は、DEAESephadex、QAE Sephadex、DEAE Sepharose、Q Sepharose、DEAE Sephacel、DEAE Cellulose、Ecteola Cellulose、PEICellulose、QAE Cellulose、Amberlite、Dowex 1-X2、Dowex 1-X4、Dowex 1-X8、Dowex 2-X8、Dowex Macroporous Resins、Dowex WGR-2、DEAE Trisacryl Plus-M、DEAETrisacrylPlus-LS、Amberlite LA-2、AG 1-X2、AG 1-X4、AG 1-X8、AG 2-X8、AG MP-1 Resin、AG 4-X4、AG 3-X4、Bio-Rex 5、及びALIQUAT-336(Henkel Corp.社製のトリカプリルメチルアンモニウムクロリド)を制限することなく含む。好ましい樹脂は、DOWEX 1x2(Dow Chemical社製のポリスチレン架橋樹脂に結合したトリ-メチルベンジルアンモニウム)、並びにAMBERLYST及びAMBERLYST塩基性樹脂である。

0071

分離されるシアリルオリゴサッカリドの混合物は、アニオン交換樹脂でのカラムクロマトグラフィーにかけられる。アニオン交換樹脂の量は、異なるシアリルオリゴサッカリドの分離を実施するように選択される。典型的には、アニオン交換樹脂に対するシアリルオリゴサッカリドの搭載比は、0から10mMの塩の搭載濃度で、0.1から5、好ましくは0.2から4、より好ましくは1グラムの物質/樹脂のリットルである。クロマトグラフィーは、1から20cm/h、好ましくは4.6cm/hの見掛け流速で実施される。適切な圧力は、所望の流速を得るように選択されて良い。典型的には、0から22PSIGの圧力が選択される。適切な流速はまた、カラムの溶出の最後に負圧を適用し、溶出物を回収することによって得られて良い。正圧と負圧の両者の組み合わせもまた使用されて良い。

0072

シアリルオリゴサッカリドの構成成分の分解を引き起こさない程度に高い温度の範囲で、アニオン交換樹脂と酪農水流を接触するためのいずれかの温度が使用されて良い。一般的には、17から25℃の環境室温が使用される。

0073

バッファー溶出液がリチウム塩である場合、個々のシアリルオリゴサッカリドは溶出液を濃縮して固体を形成し、有機溶媒でリチウム塩を洗い流すことによって単離できる。リチウム塩溶出液からのシアリルオリゴサッカリドのリチウム塩の単離は、前述の通りである。

0074

シアリルオリゴサッカリドのナトリウム塩は、当業者に知られている従来のイオン交換法によって得ることができる。

0075

バッファー溶出液がリチウム塩ではない場合、個々のシアリルオリゴサッカリドは、逆浸透法によって単離できる。

0076

本発明はまた、以下の工程:
i)ラクトースとシアリルオリゴサッカリドを含む酪農水流のラクトース構成成分を加水分解する工程;
ii)シアリルオリゴサッカリド構成成分を単離する工程;並びに
iii)組成物に前記シアリルオリゴサッカリド構成成分を添加する工程;
を含む、シアリルオリゴサッカリド含有組成物の調製方法に関する。

0077

本発明の文脈の範囲内で、シアリルオリゴサッカリド含有組成物は、シアリルオリゴサッカリドを含むいずれかの天然に存在しない組成物である。本発明の方法の文脈の範囲内で、シアリルオリゴサッカリド構成成分は組成物に添加されても良く、またはさらなる構成成分がシアリルオリゴサッカリド構成成分に添加されて最終組成物を形成しても良い。

0078

調製可能であるシアリルオリゴサッカリド含有組成物の非制限的な例は、幼児用処方、化粧品組成物製薬組成物、及び食料を含む。シアリルオリゴサッカリドは母乳に見出され、幼児用処方内へのシアリルオリゴサッカリドの取り込みは、母乳により類似する組成物を幼児用処方に提供するであろう。皮膚に対するシアリルオリゴサッカリドの局所的投与から生ずる利益が存在し、従ってシアリルオリゴサッカリドを含む化粧品組成物が所望される。シアリルオリゴサッカリドは、関節炎の治療方法、並びにHelicobacter pyloriによって引き起こされる胃潰瘍の治療と予防において有用であることが報告されており、従ってシアリルオリゴサッカリドを含む製薬組成物の調製は有用である。シアリルオリゴサッカリドの消費は、神経細胞発達に対して有益であり、それ故シアリルオリゴサッカリドを含む食料は有用であろう。

0079

本発明はまた、以下のもの:
i)シアリルオリゴサッカリド;
ii)グルコース;並びに
iii)ガラクトース
を含む組成物であって、グルコースとガラクトースが0.9から1.1:1、好ましくは0.95から1.05:1の比で存在する組成物に関する。

0080

ラクトースの加水分解の結果、シアリルオリゴサッカリドとグルコースとガラクトースを含む酪農水流構成成分が作製され、ここでグルコースとガラクトースは、ほぼ1:1、典型的に0.95から1.05:1の比で存在する。そのような組成物は、β-ガラクトシダーゼ酵素及び/またはラクトースをさらに含んでも良い。

0081

本発明はまた、酪農水流のラクトース構成成分の加水分解による、グルコースとガラクトースの生産方法に関する。酪農水流のラクトース構成成分の加水分解、引き続きシアリルオリゴサッカリド構成成分の単離のための前述の条件を使用して、酪農水流からのグルコースとガラクトースの生産方法が記載される。加水分解化酪農水流からのグルコースとガラクトースの単離は、前述のようなナノ濾過法といった濾過によっても良い。グルコースとガラクトースの生産方法は、シアリルオリゴサッカリドの単離をさらに含んでも良く、グルコースとガラクトースとを含む産物水流と、シアリルオリゴサッカリドを含む産物水流を生成しても良い。グルコースとガラクトースの生産方法は、当業者に知られている従来法によってガラクトースからのグルコースの分離をさらに含んでも良く、グルコースを含む産物水流とガラクトースを含む産物水流を生成しても良い。本発明の文脈の範囲内で、グルコースを含む産物水流、ガラクトースを含む産物水流、グルコースとガラクトースを含む産物水流、及びシアリルオリゴサッカリドを含む産物水流は、少なくとも60重量%、好ましくは少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、さらにより好ましくは少なくとも95重量%の指摘された構成成分を含み、ここで重量%は産物水流の固体含量に基づく。

0082

本発明の他の特徴点は、以下の例示的な実施態様の記載の過程で明らかとなり、この例示的な実施態様は、本発明の説明のために与えられ、本発明を制限することを企図するものではない。
実施例1

0083

4,500ユニットのβ-ガラクトシダーゼを、37℃で5.5のpHでの水性媒体中に約0.45gのラクトースと0.1gの3'シアリルラクトースとを含む、超濾過ホエー透過物に添加した。60分後、ホエー透過物の組成を、BioRad HPX-87HカラムでのHPLCによる分析によって測定し、1重量%未満の最初のラクトース含量と、>99重量%の最初の3'シアリルラクトース含量を含んだ。
実施例2

0084

実施例1の加水分解化ホエー透過物からのグルコースとガラクトースの分離を、200-300psigの圧力でのナノ濾過によって実施した。固体の除去の有効性は、以下に記載される:
実施例3

0085

比較の目的のため、約0.45gのラクトースと0.1gの3'シアリルラクトースとを含むホエー透過物を、200-300psigの圧力でDesal GK膜を使用してナノ濾過にかけた。ホエー透過物は、β-ガラクトシダーゼ酵素での処理によっては加水分解されていなかった。固体の除去の有効性は、以下に記載される:

0086

本発明の明らかな数多くの変更及び変形例が、前述の教示に照らして可能である。それ故、添付した特許請求の範囲の範囲内で、本発明はここに特別に記載されたもの以外で実施できることが理解される。

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