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技術 RNAその他の生体分子の分子相互作用部位の修飾

出願人 アイオーニスファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド
発明者 エッカー,デービッド・ジェイグリフィー,リチャードクルーク,スタンリー・ティーサンパス,ランガスウェイズ,エリックモーハン,ベンカトラマンホフスタッドラー,スティーブンマクネイル,ジョン
出願日 1999年5月12日 (21年9ヶ月経過) 出願番号 2000-548700
公開日 2003年7月8日 (17年7ヶ月経過) 公開番号 2003-520940
状態 拒絶査定
技術分野 計算コンビナトリアル技術(1) CAD 核酸・ペプチド類を含むライブラリー技術 化合物または医薬の治療活性 計算コンビナトリアル技術(2) 生物学的材料の調査,分析 非環式または炭素環式化合物含有医薬 微生物による化合物の製造 有機低分子化合物及びその製造 検索装置 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 化学的手段による非生物材料の調査、分析 同定コンビナトリアル技術
主要キーワード フレキシビリテイ 送達ノズル フートプリント 固有質量 反応ノズル 調節機器 エキサイテーション 構造細部
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図面 (20)

課題・解決手段

生体分子阻害または刺激することのいずれかで修飾する化合物同定法が提供される。核酸、特にRNAはこのような修飾を受けやすい基質である。この方法は技術の新規組合せを提供する点で特に強力であり、これは通常有機「低」分子化合物を生じさせ、それはRNAその他の生体分子活性への強力な修飾剤である。本発明の好適実施例に従って、非常に多くの化合物がテストされ得て、本質的に同時に、その化合物が分子相互作用部位相互反応しそうか、生物分子活性を修飾しそうか決定され得る。薬剤動物用薬剤農業用化学薬品工業用化学薬品、研究用化学薬品その他多くの有用な化合物が本発明の態様に従って同定され得る。

概要

背景

概要

生体分子阻害または刺激することのいずれかで修飾する化合物同定法が提供される。核酸、特にRNAはこのような修飾を受けやすい基質である。この方法は技術の新規組合せを提供する点で特に強力であり、これは通常有機「低」分子化合物を生じさせ、それはRNAその他の生体分子活性への強力な修飾剤である。本発明の好適実施例に従って、非常に多くの化合物がテストされ得て、本質的に同時に、その化合物が分子相互作用部位相互反応しそうか、生物分子活性を修飾しそうか決定され得る。薬剤動物用薬剤農業用化学薬品工業用化学薬品、研究用化学薬品その他多くの有用な化合物が本発明の態様に従って同定され得る。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

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請求項1

以下の工程を包含する、標的RNAの活性を調節する化合物を同定する方法:前記標的RNA上の少なくとも1つの分子相互作用部位を同定する工程;該分子相互作用部位と相互作用することが推測されるかまたは計算された化合物の仮想ライブラリーをin silicoで作成する工程;および該分子相互作用部位との物理的な相互作用を形成するそれらのそれぞれの能力に従ってランク付けした該化合物の階層を作成するために、化合物の仮想ライブラリーのメンバーと該標的RNAの三次元表現を比較する工程。

請求項2

前記化合物の階層の高くランク付けされたメンバーを合成する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記分子相互作用部位と相互作用するそれらの能力を決定するために、前記高くランク付けされたメンバーを試験する工程をさらに包含する、請求項2に記載の方法。

請求項4

以下の工程をさらに包含する、請求項2に記載の方法:前記RNAと以下のメンバー(単数または複数)との間での複合体を提供する、前記高くランク付けされたメンバーの少なくとも1つと標的RNAとを接触させる工程:イオン化されている前記複合体;フラグメント化されている該イオン化された複合体;および高くランク付けされたメンバーが該RNAの分子相互作用部位に結合するかどうかを決定する工程。

請求項5

他の高くランク付けされたメンバーの結合強度と比較して、高くランク付けされたメンバーの結合の強度を決定する工程をさらに包含する、請求項4に記載の方法。

請求項6

以下の工程を包含する、標的の生体分子の活性を調節する化合物を同定する方法:該標的生体分子上の少なくとも1つの分子相互作用部位を同定する工程;該分子相互作用部位と相互作用することが推測されるかまたは計算された化合物の仮想ライブラリーをin silicoで作成する工程;および該分子相互作用部位との物理的な相互作用を形成するそれらのそれぞれの能力に従ってランク付けした該化合物の階層を作成するために、化合物の仮想ライブラリーのメンバーと該標的RNAの三次元の表現を比較する工程。

請求項7

前記化合物の階層の高くランク付けされたメンバーを合成する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記分子相互作用部位と相互作用するそれらの能力を決定するために、前記高くランク付けされたメンバーを試験する工程をさらに包含する、請求項7に記載の方法。

請求項9

以下の工程をさらに包含する、請求項7に記載の方法:前記RNAと以下のメンバー(単数または複数)との間での複合体を提供する、前記高くランク付けされたメンバーの少なくとも1つと標的RNAとを接触させる工程:イオン化されている前記複合体;フラグメント化されている該イオン化された複合体;および高くランク付けされたメンバーが該RNAの分子相互作用部位に結合するかどうかを決定する工程。

請求項10

他の高くランク付けされたメンバーの結合強度と比較して、高くランク付けされたメンバーの結合の強度を決定する工程をさらに包含する、請求項4に記載の方法。

請求項11

請求項1に従って同定された、化合物。

請求項12

請求項1に従って同定された化合物とRNAとを接触させる工程を包含する、RNAの作用を調節する方法。

請求項13

請求項1に従って同定された化合物を含有する薬学薬品農学的薬品、化学的薬品、または産業化学的薬品。

請求項14

請求項6に従って同定された、化合物

請求項15

請求項6に従って同定された化合物とRNAとを接触させる工程を包含する、生体分子の作用を調節する方法。

請求項16

請求項6に従って同定された化合物を含有する薬学的薬品、農学的薬品、化学的薬品、または産業化学的薬品。

請求項17

以下の工程を包含する、標的RNAの作用を調節する化合物を同定するための方法:該分子相互作用部位と相互作用することが推測されるかまたは計算された化合物の仮想ライブラリーをin silicoで作成する工程;該分子相互作用部位との物理的な相互作用を形成するそれらのそれぞれの能力に従ってランク付けした該化合物の階層を作成するために、化合物の仮想ライブラリーのメンバーと該標的RNAの三次元の表現を比較する工程;および該化合物の階層の高くランク付けされたメンバーを合成する工程。

請求項18

前記分子相互作用部位と相互作用するそれらの能力を決定するために、前記高くランク付けされたメンバーを試験する工程をさらに包含する、請求項17に記載の方法。

請求項19

以下の工程をさらに包含する、請求項18に記載の方法:前記RNAと以下のメンバー(単数または複数)との間での複合体を提供する、前記高くランク付けされたメンバーの少なくとも1つと標的RNAとを接触させる工程:イオン化されている前記複合体;フラグメント化されている該イオン化された複合体;および高くランク付けされたメンバーが該RNAの分子相互作用部位に結合するかどうかを決定する工程。

請求項20

他の高くランク付けされたメンバーの結合強度と比較して、高くランク付けされたメンバーの結合の強度を決定する工程をさらに包含する、請求項19に記載の方法。

請求項21

少なくとも24個のヌクレオチドであるが、70個を超えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する2個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個または5個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項22

前記内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記2個のヌクレオチドが、配列NCである、請求項21に記載のRNA。

請求項23

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記4個のヌクレオチドが、配列NNNNであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記4個のヌクレオチドが、配列NANNである、請求項21に記載のRNA。

請求項24

前記末端のループ領域を形成する前記4個または5個のヌクレオチドが、配列NNNUNまたはNNUNである、請求項21に記載のRNA。

請求項25

ビメンチンRNAの一部を含む、請求項21に記載のRNA。

請求項26

ビメンチンmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項21に記載のRNA。

請求項27

以下の構造によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する2個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個または5個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項28

前記内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記2個のヌクレオチドが、配列NCである、請求項27に記載のRNA。

請求項29

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記4個のヌクレオチドが、配列NNNNであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記4個のヌクレオチドが、配列NANNである、請求項27に記載のRNA。

請求項30

前記末端のループ領域を形成する前記4個または5個のヌクレオチドが、配列NNNUNまたはNNUNである、請求項27に記載のRNA。

請求項31

ビメンチンRNAの一部を含む、請求項27に記載のRNA。

請求項32

ビメンチンmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項27に記載のRNA。

請求項33

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する2個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個または5個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項34

前記内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記2個のヌクレオチドが、配列NCである、請求項33に記載のRNA。

請求項35

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記4個のヌクレオチドが、配列NNNNであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記4個のヌクレオチドが、配列NANNである、請求項33に記載のRNA。

請求項36

前記末端のループ領域を形成する前記4個または5個のヌクレオチドが、配列NNNUNまたはNNUNである、請求項33に記載のRNA。

請求項37

ビメンチンRNAの一部を含む、請求項33に記載のRNA。

請求項38

ビメンチンmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項33に記載のRNA。

請求項39

コンセンサス配列NNNNCNNNNNN(または、なし)NUNNANNNNNNNNを含み、そしてここで、該配列が、第1の二本鎖領域、内部のループ領域、第2の二本鎖領域、および末端のループ領域を有する、RNAフラグメント

請求項40

コンセンサス配列NNNNCNNNNNN(または、なし)NUNNANNNNNNNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示

請求項41

配列NNNNCNNNNNN(または、なし)NUNNANNNNNNNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項42

ヒト配列UUUACAACAUAAUCUAGUUUACAGAAAAAUCを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項43

ヒト配列UUUACAACAUAAUCUAGUUUACAGAAAAAUCを含む、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項44

少なくとも41ヌクレオチドであるが、70ヌクレオチドは超えない連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個または6個のヌクレオチド;第2の内部のループ領域の第1の側を形成する1個から3個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個から6個のヌクレオチド;該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該第2の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオチドのふくらみを有する、6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する7個または9個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項45

前記第1の二本鎖領域の第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UUNである、請求項44に記載のRNA。

請求項46

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NANである、請求項44に記載のRNA。

請求項47

前記第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GGAAACUNNまたはGGAAACUである、請求項44に記載のRNA。

請求項48

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AUGGGNまたはAUGGGであり、そして必要に応じて前記ふくらみを有する、該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UCCUAUである、請求項44に記載のRNA。

請求項49

前記第2の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUまたはUである、請求項44に記載のRNA。

請求項50

前記第2の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uである、請求項44に記載のRNA。

請求項51

前記第3の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前期ヌクレオチドが、配列CACAであり、そして該第3の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UGUGである、請求項44に記載のRNA。

請求項52

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUANCまたはNNUACである、請求項44に記載のRNA。

請求項53

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項44に記載のRNA。

請求項54

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項44に記載のRNA。

請求項55

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個または6個のヌクレオチド;第2の内部のループ領域の第1の側を形成する1個から3個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個から6個のヌクレオチド;該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該第2の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオチドのふくらみを有する、6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する7個または9個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項56

前記第1の二本鎖領域の第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UUNである、請求項55に記載のRNA。

請求項57

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NANである、請求項55に記載のRNA。

請求項58

前記第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GGAAACUNNまたはGGAAACUである、請求項55に記載のRNA。

請求項59

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AUGGGNまたはAUGGGであり、そして必要に応じて前記ふくらみを有する、該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UCCUAUである、請求項55に記載のRNA。

請求項60

前記第2の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUまたはUである、請求項55に記載のRNA。

請求項61

前記第2の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uである、請求項55に記載のRNA。

請求項62

前記第3の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前期ヌクレオチドが、配列CACAであり、そして該第3の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UGUGである、請求項55に記載のRNA。

請求項63

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUANCまたはNNUACである、請求項55に記載のRNA。

請求項64

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項55に記載のRNA。

請求項65

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項55に記載のRNA。

請求項66

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を有する、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個または6個のヌクレオチド;第2の内部のループ領域の第1の側を形成する1個から3個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個から6個のヌクレオチド;該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該第2の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオチドのふくらみを有する、6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する7個または9個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項67

前記第1の二本鎖領域の第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UUNである、請求項66に記載のRNA。

請求項68

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NANである、請求項66に記載のRNA。

請求項69

前記第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GGAAACUNNまたはGGAAACUである、請求項66に記載のRNA。

請求項70

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AUGGGNまたはAUGGGであり、そして必要に応じて前記ふくらみを有する、該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UCCUAUである、請求項66に記載のRNA。

請求項71

前記第2の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUまたはUである、請求項66に記載のRNA。

請求項72

前記第2の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uである、請求項66に記載のRNA。

請求項73

前記第3の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前期ヌクレオチドが、配列CACAであり、そして該第3の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UGUGである、請求項66に記載のRNA。

請求項74

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUANCまたはNNUACである、請求項66に記載のRNA。

請求項75

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項66に記載のRNA。

請求項76

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項66に記載のRNA。

請求項77

コンセンサス配列NNNNANAUGGGN(または、なし)N(または、なし)N(または、なし)UCACANNUAN(または、なし)CUGUGUUCCUAUGGAAACUN(または、なし)N(または、なし)UUNを含み、そして第1の二本鎖領域、第1の内部のループ領域、第2の二本鎖領域、第2の内部のループ領域、第3の二本鎖領域、および末端のループ領域を有する、RNA。

請求項78

配列NNNNANAUGGGN(または、なし)N(または、なし)N(または、なし)UCACANNUAN(または、なし)CUGUGUUCCUAUGGAAACUN(または、なし)N(または、なし)UUNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項79

配列NNNNANAUGGGN(または、なし)N(または、なし)N(または、なし)UCACANNUAN(または、なし)CUGUGUUCCUAUGGAAACUN(または、なし)N(または、なし)UUNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項80

ヒト配列UAGGAUAUGGGUCACACUUAUCUGUGUUCCUAUGGAAACUAUUUGを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項81

マウス配列UAGGAGAUGGGGGUCACACUUACUGUGUUCCUAUGGAAACUUUGを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項82

ラット配列UAGGAGAUGGGGGGUCACACUUACUGUGUUCCUAUGAAACUUUUGを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項83

少なくとも26個のヌクレオチドであるが、70個を超えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個または6個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する1個から3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個から6個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオチドのふくらみを有する、6個のヌクレオチド。

請求項84

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AUGGGNまたはAUGGGであり、そして必要に応じて前記ふくらみを有する、該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UCCUAUである、請求項83に記載のRNA。

請求項85

前記内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUまたはUである、請求項83に記載のRNA。

請求項86

前記内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uである、請求項83に記載のRNA。

請求項87

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列CACAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UGUGである、請求項83に記載のRNA。

請求項88

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUANCまたはNNUACである、請求項83に記載のRNA。

請求項89

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項83に記載のRNA。

請求項90

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項83に記載のRNA。

請求項91

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個または6個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する1個から3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個から6個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオチドのふくらみを有する、6個のヌクレオチド。

請求項92

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AUGGGNまたはAUGGGであり、そして必要に応じて前記ふくらみを有する、該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UCCUAUである、請求項91に記載のRNA。

請求項93

前記内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUまたはUである、請求項91に記載のRNA。

請求項94

前記内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uである、請求項91に記載のRNA。

請求項95

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列CACAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UGUGである、請求項91に記載のRNA。

請求項96

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUANCまたはNNUACである、請求項91に記載のRNA。

請求項97

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項91に記載のRNA。

請求項98

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項91に記載のRNA。

請求項99

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個または6個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する1個から3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する4個から6個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する4個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオチドのふくらみを有する、6個のヌクレオチド。

請求項100

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AUGGGNまたはAUGGGであり、そして必要に応じて前記ふくらみを有する、該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UCCUAUである、請求項99に記載のRNA。

請求項101

前記内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUまたはUである、請求項99に記載のRNA。

請求項102

前記内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uである、請求項99に記載のRNA。

請求項103

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列CACAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UGUGである、請求項99に記載のRNA。

請求項104

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUANCまたはNNUACである、請求項99に記載のRNA。

請求項105

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項99に記載のRNA。

請求項106

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項99に記載のRNA。

請求項107

コンセンサス配列AUGGGN(または、なし)N(またはなし)N(または、なし)UCACANNUAN(または、なし)CUGUGUUCCUAUを含み、そして第1の二本鎖領域、内部のループ領域、第2の二本鎖領域、および末端のループ領域を有する、RNA。

請求項108

配列AUGGGN(または、なし)N(またはなし)N(または、なし)UCACANNUAN(または、なし)CUGUGUUCCUAUを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項109

配列AUGGGN(または、なし)N(またはなし)N(または、なし)UCACANNUAN(または、なし)CUGUGUUCCUAUを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項110

ヒト配列AUGGGUCACACUUAUCUGUGUUCCUAUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項111

マウス配列AUGGGGGUCACACUUACUGUGUUCCUAUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項112

ラット配列AUGGGGGGUCACACUUACUGUGUUCCUAUを含む、、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項113

少なくとも17ヌクレオチドであるが、70個を超えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する7個のヌクレオチド;および該二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項114

前記二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列CAAGN、CAAGC、またはCAAGUであり、そして該二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GCUUGである、請求項113に記載のRNA。

請求項115

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NUUUNUA,GUUUGUA,AUUUGUA、またはAUUUAUAである、請求項113に記載のRNA。

請求項116

前記二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GCUUGである、請求項113に記載のRNA。

請求項117

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項113に記載のRNA。

請求項118

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項113に記載のRNA。

請求項119

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する7個のヌクレオチド;および該二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項120

前記二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列CAAGN、CAAGC、またはCAAGUであり、そして該二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GCUUGである、請求項119に記載のRNA。

請求項121

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NUUUNUA,GUUUGUA,AUUUGUA、またはAUUUAUAである、請求項119に記載のRNA。

請求項122

前記二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GCUUGである、請求項119に記載のRNA。

請求項123

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項119に記載のRNA。

請求項124

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項119に記載のRNA。

請求項125

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する7個のヌクレオチド;および該二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項126

前記二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列CAAGN、CAAGC、またはCAAGUであり、そして該二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GCUUGである、請求項125に記載のRNA。

請求項127

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NUUUNUA,GUUUGUA,AUUUGUA、またはAUUUAUAである、請求項125に記載のRNA。

請求項128

前記二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GCUUGである、請求項125に記載のRNA。

請求項129

オルニチンデカルボキシラーゼRNAの一部を含む、請求項125に記載のRNA。

請求項130

オルニチンデカルボキシラーゼmRNAの3'UTRの一部を含む、請求項125に記載のRNA。

請求項131

コンセンサス配列CAAGNNUUUNUAGCUUGを含み、そして第1の二本鎖領域および末端のループ領域を有する、RNA。

請求項132

配列CAAGNNUUUNUAGCUUGを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項133

配列CAAGNNUUUNUAGCUUGを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項134

ヒト配列CAAGCAUUUGUAGCUUGUを含む、精製されそして単離され得たRNAフラグメント。

請求項135

マウス配列CAAGCGUUUGUAGCUUGUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項136

ラット配列CAAGCAUUUGUAGCUUGUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項137

少なくとも62個のヌクレオチドであるが、70個を超えないヌクレオチドでありる連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第2の内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する8個のヌクレオチド;該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第2の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する2個のヌクレオチド;第4の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第3の末端のループ領域を形成する5個のヌクレオチド;および該第4の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項138

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AAANU、AAAAU、またはAAAUUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNUNN、GUUUU、GGUUU、GGUGU、またはGGUUCである、請求項137に記載のRNA。

請求項139

前記第2の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドがUであり、そして該第2の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、N、U、またはCである、請求項137に記載のRNA。

請求項140

前記第3の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUAUUであり、そして該第3の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、NAUNNA、GAUAUA、AAUGUA、GAUGCA、またはGAUGUAである、請求項137に記載のRNA。

請求項141

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUUNUUN、UAUUUUUU、UAUUGUUG、またはUAUUUUUGである、請求項137に記載のRNA。

請求項142

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UUUであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NC,CC、GC,UC,またはACである、請求項137に記載のRNA。

請求項143

前記第4の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAN、UAC、またはUAAであり、そして該第4の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NUA、GUA、またはCUAである、請求項137に記載のRNA。

請求項144

前記第3の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列CUNUU、CUUUU、またはCUAUUである、請求項137に記載のRNA。

請求項145

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項137に記載のRNA。

請求項146

インターロイキン2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項137に記載のRNA。

請求項147

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第2の内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する8個のヌクレオチド;該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第2の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する2個のヌクレオチド;第4の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第3の末端のループ領域を形成する5個のヌクレオチド;および該第4の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項148

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AAANU、AAAAU、またはAAAUUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNUNN、GUUUU、GGUUU、GGUGU、またはGGUUCである、請求項147に記載のRNA。

請求項149

前記第2の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドがUであり、そして該第2の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、N、U、またはCである、請求項147に記載のRNA。

請求項150

前記第3の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUAUUであり、そして該第3の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、NAUNNA、GAUAUA、AAUGUA、GAUGCA、またはGAUGUAである、請求項147に記載のRNA。

請求項151

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUUNUUN、UAUUUUUU、UAUUGUUG、またはUAUUUUUGである、請求項147に記載のRNA。

請求項152

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UUUであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NC,CC、GC,UC,またはACである、請求項147に記載のRNA。

請求項153

前記第4の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAN、UAC、またはUAAであり、そして該第4の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NUA、GUA、またはCUAである、請求項147に記載のRNA。

請求項154

前記第3の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列CUNUU、CUUUU、またはCUAUUである、請求項147に記載のRNA。

請求項155

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項147に記載のRNA。

請求項156

インターロイキン2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項147に記載のRNA。

請求項157

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第2の内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する8個のヌクレオチド;該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第2の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する2個のヌクレオチド;第4の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第3の末端のループ領域を形成する5個のヌクレオチド;および該第4の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項158

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AAANU、AAAAU、またはAAAUUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNUNN、GUUUU、GGUUU、GGUGU、またはGGUUCである、請求項157に記載のRNA。

請求項159

前記第2の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドがUであり、そして該第2の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、N、U、またはCである、請求項157に記載のRNA。

請求項160

前記第3の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUAUUであり、そして該第3の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、NAUNNA、GAUAUA、AAUGUA、GAUGCA、またはGAUGUAである、請求項157に記載のRNA。

請求項161

前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUUNUUN、UAUUUUUU、UAUUGUUG、またはUAUUUUUGである、請求項157に記載のRNA。

請求項162

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UUUであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NC,CC、GC,UC,またはACである、請求項157に記載のRNA。

請求項163

前記第4の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAN、UAC、またはUAAであり、そして該第4の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NUA、GUA、またはCUAである、請求項157に記載のRNA。

請求項164

前記第3の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列CUNUU、CUUUU、またはCUAUUである、請求項157に記載のRNA。

請求項165

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項157に記載のRNA。

請求項166

インターロイキン2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項157に記載のRNA。

請求項167

コンセンサス配列UAUUUAUUUAAAUAUUUAAANUUUAUAUUUAUUNUUNNAUNNANGNUNNNCUANCUNUUNUAを含み、そして第1の二本鎖領域、第1の末端のループ領域、第1の内部のループ領域、第2の二本鎖領域、第2の内部のループ領域、第3の二本鎖領域、第2の末端のループ領域、第4の二本鎖領域、および第3の末端のループ領域を有する、RNA。

請求項168

配列UAUUUAUUUAAAUAUUUAAANUUUAUAUUUAUUNUUNNAUNNANGNUNNNCUANCUNUUNUAを含を含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項169

配列UAUUUAUUUAAAUAUUUAAANUUUAUAUUUAUUNUUNNAUNNANGNUNNNCUANCUNUUNUAを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項170

ヒト配列UAUUUAUUUAAAUAUUUAAAUUUUAUAUUUAUUGUUGAAUGUAUGGUUUGCUACCUAUUGUAを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項171

少なくとも32個のヌクレオチドであるが、70個を超えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する8個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項172

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AAANU、AAAAU、またはAAAUUであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNUNN、GUUUU、GGUUU、GGUGU、またはGGUUCである、請求項171に記載のRNA。

請求項173

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、N、U、またはCである、請求項171に記載のRNA。

請求項174

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUAUUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NAUNNA、GAUAUA、AAUGUA、GAUGCA、またはGAUGUAである、請求項171に記載のRNA。

請求項175

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUUNUUN、UAUUUUUU、UAUUGUUG、またはUAUUUUUGである、請求項171に記載のRNA。

請求項176

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項171に記載のRNA。

請求項177

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項171に記載のRNA。

請求項178

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する8個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項179

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AAANU、AAAAU、またはAAAUUであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNUNN、GUUUU、GGUUU、GGUGU、またはGGUUCである、請求項178に記載のRNA。

請求項180

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、N、U、またはCである、請求項178に記載のRNA。

請求項181

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUAUUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NAUNNA、GAUAUA、AAUGUA、GAUGCA、またはGAUGUAである、請求項178に記載のRNA。

請求項182

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUUNUUN、UAUUUUUU、UAUUGUUG、またはUAUUUUUGである、請求項178に記載のRNA。

請求項183

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項178に記載のRNA。

請求項184

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項178に記載のRNA。

請求項185

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する8個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項186

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AAANU、AAAAU、またはAAAUUであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNUNN、GUUUU、GGUUU、GGUGU、またはGGUUCである、請求項185に記載のRNA。

請求項187

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、Uであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、N、U、またはCである、請求項185に記載のRNA。

請求項188

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUAUUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NAUNNA、GAUAUA、AAUGUA、GAUGCA、またはGAUGUAである、請求項185に記載のRNA。

請求項189

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UAUUNUUN、UAUUUUUU、UAUUGUUG、またはUAUUUUUGである、請求項185に記載のRNA。

請求項190

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項185に記載のRNA。

請求項191

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項185に記載のRNA。

請求項192

コンセンサス配列AAANUUUAUAUUUAUUNUUNNAUNNANGNUNNを含み、そして第1の二本鎖領域、第1の内部のループ領域、第2の二本鎖領域、および末端のループ領域を有する、RNA。

請求項193

配列AAANUUUAUAUUUAUUNUUNNAUNNANGNUNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項194

配列AAANUUUAUAUUUAUUNUUNNAUNNANGNUNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項195

ヒト配列AAAUUUUAUAUUUAUUGUUGAAUGUAUGGUUUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項196

少なくとも43個のヌクレオチドであるが、70個のヌクレオチドを超えない連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の末端ループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する2個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領と第3の二本鎖領域との間にふくらみを形成する1個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する2個または4個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する2個または4個のヌクレオチド。

請求項197

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUNNN、GAUAAA、UAUAAA、またはUCUGUUであり、そして該第1のニ本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UNUNNN、UUUGUA、UCUGUA、またはUUUUGUである、請求項196に記載のRNA。

請求項198

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、NNN、UAU、CUA、またはCAUであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UUである、請求項196に記載のRNA。

請求項199

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NGAUCN、GGAUCU、またはAGAUCAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NGAUNC、AGAUUC、UGAUCC、またはUGAUUCである、請求項196に記載のRNA。

請求項200

前記第3のステム領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列N(または、なし)N(または、なし)CC、GCCC、またはCCであり、そして該第3のステム領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNN、GGGC、またはGCGUである、請求項196に記載のRNA。

請求項201

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項196に記載のRNA。

請求項202

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項196に記載のRNA。

請求項203

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の末端ループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する2個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領と第3の二本鎖領域との間にふくらみを形成する1個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する2個または4個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する2個または4個のヌクレオチド。

請求項204

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUNNN、GAUAAA、UAUAAA、またはUCUGUUであり、そして該第1のニ本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UNUNNN、UUUGUA、UCUGUA、またはUUUUGUである、請求項203に記載のRNA。

請求項205

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、NNN、UAU、CUA、またはCAUであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UUである、請求項203に記載のRNA。

請求項206

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NGAUCN、GGAUCU、またはAGAUCAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NGAUNC、AGAUUC、UGAUCC、またはUGAUUCである、請求項203に記載のRNA。

請求項207

前記第3のステム領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列N(または、なし)N(または、なし)CC、GCCC、またはCCであり、そして該第3のステム領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNN、GGGC、またはGCGUである、請求項203に記載のRNA。

請求項208

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項203に記載のRNA。

請求項209

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項203に記載のRNA。

請求項210

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の内部のループ領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する6個のヌクレオチド;第1の末端ループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の内部のループ領域の第2の側を形成する2個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する6個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領と第3の二本鎖領域との間にふくらみを形成する1個のヌクレオチド;第3の二本鎖領域の第1の側を形成する2個または4個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第3の二本鎖領域の第2の側を形成する2個または4個のヌクレオチド。

請求項211

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNUNNN、GAUAAA、UAUAAA、またはUCUGUUであり、そして該第1のニ本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列UNUNNN、UUUGUA、UCUGUA、またはUUUUGUである、請求項210に記載のRNA。

請求項212

前記第1の内部のループ領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、NNN、UAU、CUA、またはCAUであり、そして該第1の内部のループ領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、UUである、請求項210に記載のRNA。

請求項213

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NGAUCN、GGAUCU、またはAGAUCAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NGAUNC、AGAUUC、UGAUCC、またはUGAUUCである、請求項210に記載のRNA。

請求項214

前記第3のステム領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列N(または、なし)N(または、なし)CC、GCCC、またはCCであり、そして該第3のステム領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNN、GGGC、またはGCGUである、請求項210に記載のRNA。

請求項215

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項210に記載のRNA。

請求項216

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項210に記載のRNA。

請求項217

コンセンサス配列NNUNNNNNNNGAUCNUNNNNGAUNCUUUNUNNNAN(または、なし)N(または、なし)CCNNNNNNNを含み、そして第1の二本鎖領域、第1の内部のループ領域、第2の二本鎖領域、および第1の末端のループ領域、第3の二本鎖領域、および第2の末端ループ領域を有する、RNA。

請求項218

配列NNUNNNNNNNGAUCNUNNNNGAUNCUUUNUNNNAN(または、なし)N(または、なし)CCNNNNNNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項219

配列NNUNNNNNNNGAUCNUNNNNGAUNCUUUNUNNNAN(または、なし)N(または、なし)CCNNNNNNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項220

ヒト配列UAUAAAUAUGGAUCUUUUAUGAUUCUUUUUGUAAGCCCUAGGGGCを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項221

マウス配列GAUAAAUAUGGAUCUUUAAAGAUUCUUUUUGUAAUGCCCCAAGGGCを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項222

ラット配列GAUAAAUAUGGAUCUUUAAAGAUUCUUUUUGUAAGCCCCAAGGGCを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項223

少なくとも29個のヌクレオチドであるが、70個を超えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の末端ループ領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域と第2の二本鎖領域との間にふくらみを形成する2個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項224

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNGA,UAAGA、AAAGA,UAUGA、またはUUUGAであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNGNN、GGGCU、またはGCGUGである、請求項223に記載のRNA。

請求項225

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UNCU、UUCU、またはUCCUである、請求項223に記載のRNA。

請求項226

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AGCCCであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNGNN、GGGCU,またはGCGUGである、請求項223に記載のRNA。

請求項227

前記第2の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NAN、UAC、UAG、CAA、またはUAAである、請求項223に記載のRNA。

請求項228

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項223に記載のRNA。

請求項229

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項223に記載のRNA。

請求項230

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の末端ループ領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域と第2の二本鎖領域との間にふくらみを形成する2個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項231

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNGA,UAAGA、AAAGA,UAUGA、またはUUUGAであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNGNN、GGGCU、またはGCGUGである、請求項230に記載のRNA。

請求項232

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UNCU、UUCU、またはUCCUである、請求項230に記載のRNA。

請求項233

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AGCCCであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNGNN、GGGCU,またはGCGUGである、請求項230に記載のRNA。

請求項234

前記第2の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NAN、UAC、UAG、CAA、またはUAAである、請求項230に記載のRNA。

請求項235

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項230に記載のRNA。

請求項236

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部の一部を含む、請求項230に記載のRNA。

請求項237

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第1の末端ループ領域の第1の側を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖の第2の側を形成する5個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域と第2の二本鎖領域との間にふくらみを形成する2個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する5個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する5個のヌクレオチド。

請求項238

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNGA,UAAGA、AAAGA,UAUGA、またはUUUGAであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNGNN、GGGCU、またはGCGUGである、請求項237に記載のRNA。

請求項239

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列UNCU、UUCU、またはUCCUである、請求項237に記載のRNA。

請求項240

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列AGCCCであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列GNGNN、GGGCU,またはGCGUGである、請求項237に記載のRNA。

請求項241

前記第2の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NAN、UAC、UAG、CAA、またはUAAである、請求項237に記載のRNA。

請求項242

インターロイキン−2 RNAの一部を含む、請求項237に記載のRNA。

請求項243

インターロイキン−2mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項237に記載のRNA。

請求項244

コンセンサス配列NNNGAUNCUUUNNGUAAGCCCNANGNGNNを含み、そして第1の二本鎖領域、第1の末端のループ領域、第2の二本鎖領域、および第2の末端のループ領域を有する、RNA。

請求項245

配列NNNGAUNCUUUNNGUAAGCCCNANGNGNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項246

配列NNNGAUNCUUUNNGUAAGCCCNANGNGNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項247

ヒト配列UAUGAUUCUUUUUGUAAGCCCUAGGGGCUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項248

マウス配列AAAGAUUCUUUUUGUAAGCCCCAAGGGCUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項249

ラット配列AAAGAUUCUUUUUGUAAGCCCCAAGGGCUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項250

少なくとも26個のヌクレオチドであるが、70個を超えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する6個または7個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして単一のヌクレオチドのふくらみを有する、7個または8個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域と第2の二本鎖領域とを連結する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する2個または3個のヌクレオチド。

請求項251

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNNNN(または、なし)N、AUAACCU、UGGUAAA、UGAUAAU、UGAUAAA、GAUAACC、GAUAAAC、UGAUAU、GAGACCC、またはGACAAACであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列N(または、なし)UGNCUNN、UGUCUCC、UUGUCUCA、UUGCCUCA、UUGUCUCC、UUGUCUCU、CUGUCUUU,またはCUGUCUCAである、請求項250に記載のRNA。

請求項252

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNN、UAAU、CUAA,UUAA、UACU、またはAAAUである、請求項250に記載のRNA。

請求項253

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN,AUC、AUU、ACU,GUC、CCC、またはAAUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN(または、なし)、GA、AGU、ACU、GCG、またはACである、請求項250に記載のRNA。

請求項254

前記第2の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、ACU、GUC、AGG、GAA、またはCCUである、請求項250に記載のRNA。

請求項255

インターロイキン−4 RNAの一部を含む、請求項250に記載のRNA。

請求項256

インターロイキン−4mRNAの5'UTRの一部を含む、請求項250に記載のRNA。

請求項257

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する6個または7個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして単一のヌクレオチドのふくらみを有する、7個または8個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域と第2の二本鎖領域とを連結する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する2個または3個のヌクレオチド。

請求項258

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNNNN(または、なし)N、AUAACCU、UGGUAAA、UGAUAAU、UGAUAAA、GAUAACC、GAUAAAC、UGAUAU、GAGACCC、またはGACAAACであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列N(または、なし)UGNCUNN、UGUCUCC、UUGUCUCA、UUGCCUCA、UUGUCUCC、UUGUCUCU、CUGUCUUU,またはCUGUCUCAである、請求項257に記載のRNA。

請求項259

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNN、UAAU、CUAA,UUAA、UACU、またはAAAUである、請求項257に記載のRNA。

請求項260

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN,AUC、AUU、ACU,GUC、CCC、またはAAUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN(または、なし)、GA、AGU、ACU、GCG、またはACである、請求項257に記載のRNA。

請求項261

前記第2の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、ACU、GUC、AGG、GAA、またはCCUである、請求項257に記載のRNA。

請求項262

インターロイキン−4 RNAの一部を含む、請求項257に記載のRNA。

請求項263

インターロイキン−4mRNAの5'UTRの一部を含む、請求項257に記載のRNA。

請求項264

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する6個または7個のヌクレオチド;第1の末端のループ領域を形成する4個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域の第2の側を形成し、そして単一のヌクレオチドのふくらみを有する、7個または8個のヌクレオチド;該第1の二本鎖領域と第2の二本鎖領域とを連結する1個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;第2の末端のループ領域を形成する3個のヌクレオチド;および該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する2個または3個のヌクレオチド。

請求項265

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNNNN(または、なし)N、AUAACCU、UGGUAAA、UGAUAAU、UGAUAAA、GAUAACC、GAUAAAC、UGAUAU、GAGACCC、またはGACAAACであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列N(または、なし)UGNCUNN、UGUCUCC、UUGUCUCA、UUGCCUCA、UUGUCUCC、UUGUCUCU、CUGUCUUU,またはCUGUCUCAである、請求項264に記載のRNA。

請求項266

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNN、UAAU、CUAA,UUAA、UACU、またはAAAUである、請求項264に記載のRNA。

請求項267

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN,AUC、AUU、ACU,GUC、CCC、またはAAUであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN(または、なし)、GA、AGU、ACU、GCG、またはACである、請求項264に記載のRNA。

請求項268

前記第2の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、ACU、GUC、AGG、GAA、またはCCUである、請求項264に記載のRNA。

請求項269

インターロイキン−4 RNAの一部を含む、請求項264に記載のRNA。

請求項270

インターロイキン−4mRNAの5'UTRの一部を含む、請求項264に記載のRNA。

請求項271

コンセンサス配列NNNNNNNNNNNNUGNCUNNNNNNNNNNNNを含み、そして第1の二本鎖領域、第1の末端のループ領域、第2の二本鎖領域、および第2の末端のループ領域を有する、RNA。

請求項272

配列NNNNNNNNNNNNUGNCUNNNNNNNNNNNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項273

配列NNNNNNNNNNNNUGNCUNNNNNNNNNNNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項274

ヒト配列UGAUAAACUAAUUGCCUCACAUUGUCACUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項275

マウス配列GAUAAACUUAAUUGUCUCUCGUCACUGA、UGAUAUUACUCUGUCUUUCCCCAGGGCG、またはGAGACCCAAAUCUGUCUCACAAUGAAACを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項276

少なくとも19個のヌクレオチドであるが、70個を超えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有する、RNA;第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する5個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド;

請求項277

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、AUU、AAG,GAG,AUG,GAA,GAC、AAU,AAA、またはCCAであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN,UAU,UUU,AAA、CCU,ACU,またはGCUである、請求項276に記載のRNA。

請求項278

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNNN、UAAAA、AUAUC、AAAAA、AUAUU,UUAAU、CUAUU、AUGAG,UAAGG、CUUCC、またはAGGAGである、請求項276に記載のRNA。

請求項279

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、UUA,UGA,UUU,UAA,CCA、またはAAAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、UAA、UUA,AGC,AAA、AAU、UUC、またはCAAである、請求項276に記載のRNA。

請求項280

インターロイキン−4 RNAの一部を含む、請求項276に記載のRNA。

請求項281

インターロイキン−4mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項276に記載のRNA。

請求項282

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する5個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項283

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、AUU、AAG,GAG,AUG,GAA,GAC、AAU,AAA、またはCCAであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN,UAU,UUU,AAA、CCU,ACU,またはGCUである、請求項282に記載のRNA。

請求項284

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNNN、UAAAA、AUAUC、AAAAA、AUAUU,UUAAU、CUAUU、AUGAG,UAAGG、CUUCC、またはAGGAGである、請求項282に記載のRNA。

請求項285

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、UUA,UGA,UUU,UAA,CCA、またはAAAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、UAA、UUA,AGC,AAA、AAU、UUC、またはCAAである、請求項282に記載のRNA。

請求項286

インターロイキン−4 RNAの一部を含む、請求項282に記載のRNA。

請求項287

インターロイキン−4mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項282に記載のRNA。

請求項288

以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの連結された配列を含む、in silicoのRNA:第1の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;内部のループ領域の第1の側を形成する1個のヌクレオチド;第2の二本鎖領域の第1の側を形成する3個のヌクレオチド;末端のループ領域を形成する5個のヌクレオチド;該第2の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド;該内部のループ領域の第2の側を形成する1個のヌクレオチド;および該第1の二本鎖領域の第2の側を形成する3個のヌクレオチド。

請求項289

前記第1の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、AUU、AAG,GAG,AUG,GAA,GAC、AAU,AAA、またはCCAであり、そして該第1の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN,UAU,UUU,AAA、CCU,ACU,またはGCUである、請求項288に記載のRNA。

請求項290

前記第1の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNNNN、UAAAA、AUAUC、AAAAA、AUAUU,UUAAU、CUAUU、AUGAG,UAAGG、CUUCC、またはAGGAGである、請求項288に記載のRNA。

請求項291

前記第2の二本鎖領域の前記第1の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、UUA,UGA,UUU,UAA,CCA、またはAAAであり、そして該第2の二本鎖領域の前記第2の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列NNN、UAA、UUA,AGC,AAA、AAU、UUC、またはCAAである、請求項288に記載のRNA。

請求項292

インターロイキン−4 RNAの一部を含む、請求項288に記載のRNA。

請求項293

インターロイキン−4mRNAの3'UTRの一部を含む、請求項288に記載のRNA。

請求項294

コンセンサス配列NNNNNNNNNNNNNNNNNNNを含み、そして第1の二本鎖領域、内部のループ領域、第2の二本鎖領域、および末端のループ領域を有する、RNA。

請求項295

配列NNNNNNNNNNNNNNNNNNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、RNAフラグメントのin silicoでの提示。

請求項296

配列NNNNNNNNNNNNNNNNNNNを含む、少なくとも2つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

請求項297

マウス配列AAUCUGAAUGAGAAUGCCU、AUUGCCAUAAGGUUCUACU、CCACUGAAGGAGCAAGGCUを含む、精製されそして単離されたRNAフラグメント。

0001

本発明は1998年5月12日出願の米国出願番号09/076,404の一部継続で、1998年5月12日出願の米国出願番号60/085,092の優先権を主張し、これらのそれぞれは関連による
併合である。

0002

本発明は、生体分子阻害または刺激することのいずれかで修飾する化合物を同定することに関する。核酸とくにRNAはこのような修飾が行なわれる基質として好適で、このような基質のすべてが、このような修飾の「標的」になることが証明されている。本発明の方法は、RNAおよびその他の生体分子の活性に対して非常に強力な修飾作用がある、通常「低」分子有機化合物である化合物をつくりだす、新規な技術の組合せを提供する上で特に有効である。非常に多くの化合物が、分子相互作用を起こす部位に反応しそうか、即ち、生体分子の作用を修飾しそうかを決めるためにin silicoで試験される。薬剤動物用薬剤農業用化学薬品工業用化学薬品、研究用化学薬品およびその他多くの化合物が本発明の態様に従って同定されるだろう。

0003

ゲノム研究、分子生物学および構造生物学の最近の進歩は、細胞内でタンパク質発現するために必要な出来事の多くに、RNAがどのように関与し、制御しているかを明確にしてきた。単なる中間産物としての機能ではなく、RNA分子はDNAからの転写mRNAおよびtRNA分子のスプライスおよび編集リボゾーム内のペプタイド合成、新しく形成されたタンパク質の細胞膜への移動促進、およびメッセージ翻訳速度の微調整といったことを活発に行なっている。RNA分子は、これらの機能を発揮するのに必要な枠組みを提供する、多くの独自の構造上のモチーフを使うことができる。

0004

特に構造化RNA分子に結合する「低」分子の治療剤は、ポリマーではない有機化合物の分子である。「低」分子治療剤には、最も強力な自然に存在する抗生物質が含まれる。例えば、アミノグルコシドおよびマクセライド系抗生物質はリボゾームRNArRNA)構造中の特定領域に結合して作用する「低」分子であり、タンパク合成に必要なRNA中のコンフォメーション変化ブロックすることにより作用すると考えられている。RNA分子のコンフォメーションの変化は、mRNA分子の転写と翻訳を調整することが明らかにされている。

0005

別の組織で、細胞が同じタンパク質に翻訳される別のmRNA分子を頻繁に作り出す場合、薬剤発見のためにRNAを標的とする機会は増加する。例えば、別のスプライシングと別のポリアデニル化のプロセスは、特定の組織内に独自のまたは豊富な転写を行なうことがある。その結果、腫瘍を含め、必要な組織の特有なRNA部位に結合し、他の組織のタンパク発現に影響を与えないか、タンパク発現への影響が軽度で、その結果、タンパクを標的にする治療で、一般的に達成できない薬剤の特異性ベルを持つ薬剤を設計する機会が提供される。

0006

RNA分子または関連するRNA分子の基は、細胞によるタンパク合成を調節するのに用いられる調節部位を持っていると、出願人は考えている。その細胞は、タンパク質の合成されるタイミングと合成される量の両方を、mRNAとの直接、特定の相互作用により、調節すると考えられている。この考えは転写について非常に注目されている遺伝子調節についての科学文献を読むことによって得られる印象とは矛盾する。RNAの成熟、移動、細胞間局在および翻訳のプロセスは、薬剤結合に好適な機会を提供するRNAの認識部位で豊富に行なわれる。出願人の発明は、ヒトゲノムのみならず、その他の動物ゲノムおよび原核ゲノム中のRNA分子の、このような部位を発見しようとするものである。

0007

コンビナトリアルケミストリーは、化学者の手段として最近加えられたもので、多数の化学物質の合成を取り扱う化学の分野である。これは、一定の反応シーケンスにより決められるすべての組合せについて、少数試薬凝縮させることにより行なわれる。この化学分野の進歩には、実際のライブラリー化合物の合成より規模の大きい合成の可能性を検討することを可能にした化学ソフトウェアおよび高度なコンピュータハードウエアの使用が含まれる。仮想ライブラリー概念が、関連する反応およびこれらの反応に影響を与える薬剤を含む組合せ合成から理論的に出てくる候補となる構造のコレクションを示すのに用いられる。この仮想ライブラリーの中から実際に合成される化合物が選択される。

0008

Project Library(MDL Information Systems,Inc.,San Leandro,CA)は、組合せ研究の努力支援するデスクトップ・ソフトウェア・システムだと言われている(Practical Guide to Combinatorial Chemistry,A.W.Czarnik 及び S.H.DeWitt,eds.,1997,ACS,Washington,D.C.)。このソフトウェアはブロック、個々の分子、完全なコンビナトリアルライブラリーおよび分子の混合物の表示と検索のための情報管理モジュール、および混合物の追跡と散在した化合物ライブラリーのコンピュータによるサポート用のモジュールが含まれていると言われている。

0009

Molecular Diversity Manager(Tripos,Inc.,St.Louis,MO)は化合物ライブラリーの作成、選択および管理のためのソルトウエア・モジュールの一式だと言われている(Practical Guide to Combinatorial Chemistry,A.W.Czarnik 及び S.H.DeWitt,eds.,1997,ACS,Washington,D.C.)。LEGION and SELECTORモジュールは、二次元および三次元構造の両方のフィンガープリント置換基パラメタートポロジー的指標および物理化学的パラメターについてのライブラリーを作り、分子を特徴付けるのに有用だと言われている。

0010

Afferent Systems(San Francisco,CA)はデータベース用の仮想分子を作り出すコンビナトリアルライブラリー用のソフトウェアを提供すると言われている。これは、実際に合成できるであろう前駆分子を仮想的に反応させ、選択することによって行なわれると言われている(Wilson,C&EN,April 27,1998,p.32)。

0011

Project Library及びMolecular Diversity Managerだけが入手可能であるが、これらの製品は、生成された目的とする化合物にフラグメントを導入するのに用いた反応剤を効率的に追跡する設備が提供されていない。さらに、これらの製品は、複数の反応剤の使用により、複数のフラグメントを導入して得られた化合物の混合物を追跡することができない。従って、個々の化合物やそれらの混合物の合成に用いられた化学反応あるいは転換を追跡する方法のみならず、化合物の混合物を取り扱うことができる入手可能な方法があることが望ましい。

0012

コンビナトリアルケミストリーは、化学者の道具箱として最近加えられたもので、多数の化学物質の合成を扱う化学の分野を表している。この方法では、少数の反応剤を、一定の反応順序で、示されたすべての組合せで凝縮させることにより行なわれる。この分野の化学の発展には、化学ソフトウェアという道具およびライブラリーにある化合物を実際の合成よりも大きい規模で合成することを可能にした、先進のコンピュータ・ハードウエアを使用することにより達成される。「仮想ライブラリー」というコンセプトは、関心のある反応、およびそれらの反応に影響を与える反応剤を含む組合せ合成により理論的に得られる構造の候補のコレクションを指すのに用いられる。この仮想ライブラリーの中から、実際に合成される化合物が選択される。

0013

Project Library(MDL Information Systems,Inc.,San Leandro,CA)は組合せ研究の努力をサポートするソフトウェア・システムだと言われている(Practical Guide to Combinatorial Chemistry,A.W.Czarnik 及び S.H.DeWitt,eds.,1997,ACS,Washington,D.C.)。このソフトウェアには、構成ブロック、個々の化合物、完全なコンビナトリアルライブラリーおよび分子の混合物を、表示および検索のための情報管理モジュール、および混合物および散在している化合物のライブラリーを追跡するための、コンピュータによるサポートのためのその他のモジュールが入っていると言われている。

0014

Molecular Diversity Manager(Tripos,Inc.,St.Louis,MO)は、化合物ライブラリーの生成、選択および管理のためのソフトウェア・モジュールの一式だと言われている(Practical Guide to Combinatorial Chemistry,A.W.Czarnik 及び S.H.DeWitt,eds.,1997,ACS,Washington,D.C.)。TheLEGION and SELECTORモジュールは、二次元および三次元の両方の構造的フィンガー・プリント、置換基パラメター、トポロジー指標および物理化学的パラメターの観点からライブラリーを生成し、分子を特徴付けるのに有用と言われている。

0015

Afferent Systems(San Francisco,CA)はデータベース用の仮想分子を生成するコンビナトリアルライブラリーを提供するためのソフトウェアだと言われている。これらのことは、仮想的な反応前駆物質分子でおこない、実際に合成できる化合物を選択することができると言われている(Wilson,C&EN,April 27,1998,p.32)。

0016

Project Library及びMolecular Diversity Managerだけが入手可能であるが、これらの製品は、生成された目的とする化合物にフラグメントを導入するのに用いた反応剤を効率的に追跡する設備が提供されていない。さらに、これらの製品は、複数の反応剤を用いて、複数のフラグメントを導入して得られた化合物の混合物を追跡することができない。従って、個々の化合物やそれらの混合物の合成に用いられた化学反応あるいは転換を追跡する方法のみならず、化合物の混合物を取り扱うことができる入手可能な方法があることが望ましい。

0017

合成とスクリーニング用の化合物の選択は、どのような薬剤発見のプロセスでも決定的なステップである。このことは、コンビナトリアルケミストリーを基にする発見方法では特に重要で、合理的な時間の枠内で準備できるよりはるかに厖大な数の化合物を考え付くことができる。計算機化学の方法では、スクリーニングするための化合物の最良の組合せを見付けるために使用される。スクリーン上で、構造未知巨大分子の標的に対して、生物学的活性を持ったものを見付けだす可能性を増加させるために、ライブラリーの化学薬品の「広がり」を最適化する一つの方法が用いられた。

0018

核酸を標的とすることが、生物学的経路を阻害し、疾患治療のための有効な方法であることが認められた。この点に関して、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)の両方が、多くの治療法目標になっている。オリゴマーオリゴヌクレオチドのような「低」分子が核酸と結合親和性をもつことが明らかになってきた。核酸の機能を妨害する非常に多くの実験が、標的核酸中の特定塩基塩基対および/または塩基一次配列へのリガンドの特異な結合をへて行なわれる。ある化合物がDNA小溝中のA−T塩基対へ優先的に結合し、対応するRNA(塩基)配列には殆ど結合しないような、核酸の一次および二次構造の両方の特徴を認識して相互作用を生じる、複合特異性をもつことが証明された。

0019

生物学的標的の三次元構造の知識の活用は、薬剤設計および薬剤発見の見地から有用な手法である。このことは、多くの薬剤の設計および開発、および多くの病態生理学的経路に関係するタンパク質を標的とする薬剤候補の設計および開発で証明されている。タンパク質の三次元構造は、X線結晶学、分子モデリングおよびNMRのような技法により、広く決定されてきているが、核酸は困難な研究対象である。X線結晶法により決定されたと言われるtRNAを含む生物学的活性のあるRNAの三次元構造については、文献でもほとんど報告されていない。Quigleyら,Nucleic AcidsRes.,1975,2,2329;及び Morasら,Nature(London),1980,288,669.適当な結晶生成が困難になったこと、およびX線法による核酸研究に伴う困難が、生物学的に重要な小RNAの数の増加に伴い、新しい構造決定法とこのような標的に対する新薬剤研究法のニーズを増大させてきている。

0020

RNAの構造を予測する多くの方法が科学文献中で討論されている。本質的にこれらには、標的の一次配列と潜在的に折り畳まれた構造を示すことを第一歩として、RNAのような核酸の塩基配列およびゲノム分析が含まれる。第二段階として、塩基対のような構造上の制約意義架橋生化学的および遺伝的な構造−機能の研究から得られる情報に基づき塩基間の長いレンジの相互作用がでてくる。この情報はモデリングとシミュレーションのソフトウェアを共に用いることで、科学者はRNAおよびDNAの三次元モデルを予測することが可能になった。これらのモデルはX線結晶構造のように強力ではないが、ある種の構造上の特徴および構造と機能の関係を明らかにする上で有用である。

0021

核酸の特異な形状モチーフの構造上の特徴、特に、ヘアピンループらせん二重らせんのような特徴を理解することは、分子的洞察を得る上で有用であることが分かった。例えば、二重らせんのステムおよび一本鎖ループを含むヘアピンの形状モチーフは、核酸の最も簡単であるが非常に重要な構造要素だと考えられる。このようなヘアピン構造核形成部位だと提案されており、RNAの三次元構造の折畳みのための主要な構築ブロックとなっていると提案されている。Shenら,FASEB J.,1995,9,1023.ヘアピンにはまた、遺伝子発現を調節するための多様なタンパク質と特異な相互作用が含まれている。Fengら,Nature,1988,334,165,Witherellら,Prog.Nucleic AcidsRes.Mol.Biol.,1991,40,185 及び Phillipeら,J.Mol.Biol.,1990,211,415.従って、核酸のヘアピン構造は制約分子動力学および距離幾何学のような、NMR、分子モデル技法(Cheongら,Nature,1990,346,680 及び Cainら,Nuc.Acids Res.,1995,23,2153)、X線結晶学(Valegardら,Nature,1994,371,623 及び Chattopadhyayaら,Nature,1988,334,175)、および理論的方法(Tung,Biophysical J.,1997,72,876,Erieら,Biopolymers,1993,33,75 及び Raghunathanら,Biochemistry,1991,30,782)を用いて広く研究されてきた。

0022

核酸およびそれに伴う構造上の形状モチーフの潜在的三次元構造の決定は、RNAによる触媒作用の研究、RNA−RNA相互作用、RNA−核酸相互作用、RNA−タンパク質相互作用および核酸による低分子の認識といった分野を洞察することを可能にした。RNAの代表的な三次元構造の発生について、一般的には、四つの解決方法が文献に説明されている。これらの総てがRNAのような標的である核酸内での折畳みと三次元の相互作用のシミュレーションのための精巧な分子モデルとコンピュータを用いたアルゴリズムを使っている。Westhof 及び Altman(Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91,5133)は、会話形コンピュータ・モデリング・プロトコルにより、M1 RNA、E coliからRNA分解酵素触媒的RNAサブユニットの三次元的作業モデルの生成について記載している。極低温電子顕微鏡(cryo−EM)分野での重要な研究の本体部分をてこにして、リボゾームRNAの生化学的研究が、Mueller 及び Brimacombe(J.Mol.Biol.1997,271,524)により行なわれ、E coli 16SリボゾームRNAの三次元モデルがつくられた。核酸のヘアピンの形状モチーフをモデルにする方法は、核酸構造を描くための一組の換算座標軸を基にする方法と、モンテカルロ法(MC)によるシミュレーションを用いて構造を平衡状態におく、サンプリング・アルゴリズム法が開発された(Tung,Biophysical J.,1997,72,876、関連による併合)。MC−SYMは制約−満足法を用いたRNAの三次元構造を予測する、もう一つの方法である。Majorら,Proc.Natl.Acad.Sci.,1993,90,9408.MC−SYMプログラムは、質問入力の制約を満足させる、すべてのモデルに対して、コンフォメーション・スペース探す、制約−満足をベースとするアルゴリズムであり、例えば、Cedergrenら,RNA Structure And Function,1998,Cold Spring Harbor Lab.Press,p.37−75に記載されている。RNAの三次元構造は、成長するオリゴヌクレオチドモデルに対して、一つまたはそれ以上、いくつかのコンフォメーションを持つヌクレチオドを段階的に付加する方法で作られた。

0023

Westhof 及び Altman(Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91,5133)は、会話形コンピュータ・モデリング・プロトコルにより、M1 RNA、E coliからRNA分解酵素の触媒的RNAサブユニットの三次元的作業モデルの生成について記載している。このモデリング・プロトコルは、化学的および酵素の保護実験、系統分類分析突然変異体の活性研究および基質がM1 RNAへ結合することにより、触媒作用を受ける反応の動力学からのデータを入れた。モデリングは大部分、文献記載の通りに機能した。Westhofら,Theoretical Biochemistry and Molecular Biophysics,Beveridge
and Lavery(eds.),Adenine,NY,1990,399.一般的に、M1 RNAの第一次配列から始まり、ステム−ループ構造および二次構造のその他の要素が形成された。それに続くこれらの要素の三次元構造への組み立ては、コンピュータ・グラフィックステーションとFRODO(Jones,J.Appl.Crystallogr.,1978,11,268)を用いて行なわれ、それに続いて、NUCLIN−NUCLSQを用いた精密化が、正確な形を持ち、不適切な接触がなく、適正な立体化学に合ったRNAモデルを与えることにより実施された。このようにして出来たモデルは、M1 RNAの経験上の厖大なデータと矛盾せず、RNA分解酵素Pの作用メカニズムについての仮説に対する扉を開いた。しかし、この方法で作られたモデルは、X線結晶学により決められた構造に対しては、あまり解決にならなかった。

0024

Mueller 及び Brimacombe(J.Mol.Biol.,1997,271,524)はERNA−3Dというモデリング・プログラムを用いて、E coli 16SリボゾームRNAの三次元モデルを構築した。このプログラムは、低解像力回折データから得られた電子密度適合する一本鎖の動的ドッキングを経て、Aの形をしたRNAらせんおよび一本鎖部位の三次元構造を形成する。らせん要素が決定し、モデル内で位置が決まった後、一本鎖領域コンフィギュレーションは、RNAタンパク質架橋およびフートプリントのデータのような既知の生化学的制約を満足するように調整される。

0025

核酸のヘアピンの形状モチーフをモデルにする方法は、核酸構造を描くための換算座標軸のセットに基づくもの、およびモンテカルロ法(MC)によるシミュレーションを用いて構造を平衡にするサンプリング・アルゴリズムによる方法が開発された。Tung,Biophysical J.,1997,72,876、関連による併合。核酸のステムはカノニカル二重鎖形成法を用いて、充分モデル化できる。一組の換算座標軸を用いて、一組の所定の端を持った一本鎖ループの構造を形成することが可能なアルゴリズムが出来た。このことは、コンフォメーション・スペース内のループの効率的な構造的サンプリングにより可能になった。このアルゴリズムを変形メトロポリスモンテカルロのアルゴリズムと組合せて、コンピュータによる核酸のヘアピン構造の研究を単純化する構造シミュレーションパッケージが提供された。

0026

前述の技術の知識とその技術をマスターすることは、当業者にとっては技能の一部となっていると推量される。当業界では、核酸、特にRNAの重要な調節その他の要素の三次元構造を決定する改良された方法が提供されることが、長い間期待されていた。リガンドと潜在的リガンド、または核酸、特にRNAとの間の相互作用の本質について、新しい知識が得られることが非常に望まれている。本発明は、これらの目的を満たそうとするものである。

0027

薬剤発見のプロセスは、このプロセスにインパクトを与える多くの技術の急速な進歩進化により、非常に速いペースで変化している。薬剤の発見は、数十年前までは実質的に、天然物質ランダム・スクリーニングに始まり、リガンド、アゴニストアンタゴニスト阻害剤のような潜在的生物活性剤として、多くの合成分子が合理的で組合せ的に設計されたものを含むだけでなく、ポリペプタイド、タンパク質または核酸といった生物学的標的の同定、およびメカニスティックスや構造上の特徴までも含む科学的プロセスの検討が行なわれた。これらの薬剤設計および構造的生物学の重要な分野は、疾患を理解し治療する上で極めて重要である。しかしながら、特定の生物学的標的に高度の親和性をもつリガンドを同定しあるいは開発しようとする場合、重要なハードル乗り越えなければならない。このようなハードルには、他の分子が結合したり会合したりしている標的の構造を解明する課題をめぐる困難、新しくリードするためまたは現在のリードを最適なものにするために選別する必要がある多くの化合物、活性度および結合親和性に対応する構造上の特徴との関連で多くの化合物間の構造上の類似性および非類似性を分ける必要があること、および少しの構造変化でも化合物の生物学的活性に大きな影響を及ぼすことがあるという事実が含まれる。

0028

従来、薬剤の発見とその最適化には、費用と時間がかかり、従って、少しずつ構造が変わった一つ一つの化合物を合成し評価するという、ゆっくりしたプロセスで行なわれてきた。天然物を使用する場合には、抽出物の個々の成分の生物学的評価の前に、純粋な化合物にするという骨が折れる綿密な分離を行なわなければならない。更に、すべての化合物はin vitroのスクリーニングの前に注意深く分析され特徴を把握する必要がある。このスクリーニングでは、一般的に、候補にあがった化合物について、標的との結合親和性、リガンドの結合部位に対する競合、阻害、細胞増殖、活性化、あるいはきっ抗終点により決まる標的の動態の評価が含まれる。薬剤の設計およびスクリーニングでは、これらの総ての面を考慮しなければならないことが、薬剤発見のプロセスを遅いものにしており、これらの事項を減らし解決するための多くの方法が、薬剤発見に関わる人々によって実行されてきた。

0029

薬剤の発見プロセスを速くする一つの方法は、大きなコレクション、ライブラリーまたは化合物の配列を作り出すことである。この方法では、個々に合成してテストしていた化合物の間での薬剤としてリードで選抜する方法から、厖大な化合物のコレクションからスクリーニングすることになった。これらのコレクションは天然物からのもの(Sternbergら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995,92,1609−1613)、あるいは、コンビナトリアルケミストリーのような合成方法で作り出されたものであってもよい(Ecker 及び Crooke,Bio/Technology,1995,13,351−360およびU.S.パテント5,571,902、関連による併合)。これらの化合物のコレクションは、個々に特徴のある合成された化合物のライブラリーとして生成される。例えば、高スループットの平行合成により、数百または数千分子になるまで、分割−混合またはその他の組合せ方法により合成された混合物またはプールである。これらのコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングには通常、リガンド−受容体の相互作用の度合いを決めるための結合アッセイ(Chuら,J.Am.Chem.Soc.,1996,118,7827−35)が含まれる。しばしばリガンドまたは標的受容体は、ポリマーのビーズや板のようなものの表面に固定されている。結合力検出後、リガンドはレリーズされ同定される。固相スクリーニングアッセイは非特定相互作用による困難を軽減することができる。

0030

コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングは、固相−溶液法で行なわれるが、そうでなければ、標的に結合したライブラリーのこれらの成分を速く有効な方法で同定することは一つの挑戦になり、非常に興味深いことである。組合せの、およびその他の薬剤発見プロセスを容易かつ有効に達成するためには、尚これは改善されなければならないプロセスである。生体ポリマーおよびその他、治療対象である標的の構造理解を容易にするためのいくつかの方法が、薬剤の発見と発展のプロセスを促進するために開発された。これらには、タンパク質および核酸の配列決定法が含まれる(Smith,Protein Sequencing Protocols,Humana Press,Totowa,NJ,1997;Findlay 及び Geisow,Protein Sequencing: A Practical Approach,IRL Press,Oxford,1989;Brown,DNA Sequencing,IRL Oxford University Press,Oxford,1994;Adams,Fields及び Venter,Automated
DNA Sequencing and Analysis,Academic Press,San Diego,1994)。これらには、生体ポリマーの二次三次構造をNMRで(Jefson,Ann.Rep.Med.Chem.,1988,23,275;Eriksonら,Ann.Rep.Med.Chem.,1992,27,271−289)、X線結晶学で(Eriksonら,Ann.Rep.Med.Chem.,1992,271−289)、およびタンパク質の折畳みの予測を試みるコンピュータ・アルゴリズムの利用で(Copeland,Methods of Protein Analysis:
A Practical Guide to Laboratory Protocols,Chapman 及び Hall,New York,1994;Creighton,Protein Folding,W.H.Freeman and Co.,1992)解明することが含まれる。ELISAのような実験(Kemeny 及び Challacombe,ELISA andotherSolid Phase Immunoassays: Theoretical and Practical Aspects;Wiley,New York,1988)、および放射性リガンド結合アッセイ(Bersonら,Clin.Chim.Acta,l968,22,51−60;Chard,An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques,Elsevier press,Amsterdam/New York,1982)、表面プラズモン共鳴の利用(Karlsson,Michaelsson 及び Mattson,J.Immunol.Methods,1991,145,229;Jonssonら,Biotechniques,1991,11,620)、およびシンチレーション近接アッセイ(Undenfriendら,Anal.Biochem.,1987,161,494−500)が受容体−リガンド相互作用の本質を理解するために使用されている。

0031

前述の範例および技術のすべては、当業界で普通の技術を持つ人であれば入手可能で、それらを理解し習熟していると思われる。

0032

同様に、高スループットの生物学的スクリーニングのための化合物の化学合成でも進歩が起こっている。コンビナトリアルケミストリー、計算機化学、および大量の化合物の混合物または個別化合物のコレクションの合成により、in vitroスクリーニングのための大量の化合物の急速合成が容易になっている。これらの進歩にかかわらず、薬剤の発見と最適化のプロセスは困難な段階の連続である。このプロセスはまた、各段階に含まれるコストおよび個別に多数のものをスクリーニングする必要性のために費用がかかる。更に、標的の受容体の構造的特徴が確認しにくい。

0033

生体活性確認の一つのステップには、テストする化合物の特定のタンパク質または核酸あるいはそれらの組合せのような生体ポリマーまたはその他の受容体との結合親和性の決定が含まれる。コンビナトリアルケミストリーでは、合成能力または天然原料からの分離能力によって、in vitroの生物学的スクリーニング用に大量の化合物がつくられ、このチャレンジは尚増幅中である。コンビナトリアルケミストリーは大量の化合物、あるいは、しばしば混合物から分離される大量の天然物を生み出し、これらのライブラリーや混合物のメンバーで最も活性度が高く標的の受容体と最高の親和性で結合するものを急速に決定する方法が必要である。

0034

関連する見方から、薬剤発見を担当する科学者は、標的−リガンドの相互作用の力および化学量論を決めるため、生物学的に関心のある標的の構造解析のため、および組合せ混合物活性成分決定のために、多くの器具や技法が入手可能である。

0035

タンパク質や核酸のような生物学的標的の配列決定のための技術や機器は、前述のように入手可能である(即ち、Smith,Protein Sequencing Protocols,1997、Findlay 及び Geisow,Protein Sequencing: A Practical Approach,1989)。これらの技法は有用ではあるが、これらの配列決定方法感受性のない、ある種の生体ポリマー標的や構造があり、どんな場合でも、より便利で経済性のあるものが求められる。現在の配列決定技術の欠点は標的の一次構造または配列より以上のことは何も明らかにする能力がないことである。

0036

X線結晶学は生体ポリマー標的の二次三次構造のあるものの決定を可能にするが(Eriksonら,Ann.Rep.in Med.Chem.,1992,27,271−289)、この技術は費用がかかり、実施が困難である。生体ポリマーの結晶化は非常にむつかしく、十分な分解能で実施することは困難で、しばしば科学というよりは技能だとみなされる。更に、薬剤発見プロセスでX線による結晶構造解析を適用するのを躊躇させるのは、液相では結晶学真実を明らかにすることが出来ないことである。従って、生物学的に適切で、標的の構造解析に向くものがないことになる。

0037

以前に引用したように、リガンド(動作体、アンタゴニストまたは阻害剤)とその標的との間の性質および相互作用の力についての解析は、ELISA(Kemeny 及び Challacombe,ELISA andother
Solid Phase Immunoassays: 1988)、放射性リガンドの結合アッセイ(Bersonら,Clin.1968,Chard,An Introduction to Radioimmunoassayand Related Techniques,1982)、表面プラズモン共鳴(Karlssonら,l991,Jonssonら,Biotehcniques,1991)、またはシンチレーション近接アッセイ(Udenfriendら,Anal.Biochem.,1987)によって行なわれ、これらは既に引用されている。放射性リガンド結合アッセイは、放射性リガンドの結合で放射活性を使用する必要があるので、結合部位で未知のものと競合的結合をアッセイする場合にのみ典型的に有効である。表面プラズモン共鳴法は、使用上は直接的であるが、コストが非常に高い。従来から行なわれている、結合動力学および解離会合定数を測定する生化学的アッセイは、標的とリガンドの相互作用の性質を明らかにする上では有用である。

0038

化合物の組合せ混合物のスクリーニングの場合、薬剤を発見しようとする科学者は、通常活性のあるもののプールを同定し、その再合成をへて、個々のメンバーに分けて、コンピュータで解析し、個々の化合物の分析を通して活性メンバーを同定する。現在の多くの生物学的に適切な標的に対するコンビナトリアルライブラリーの研究用のプロトコルは多くの欠点を持っている。冗長性高コスト、段階的性格で、上記スクリーニング技法の多くが、低感度なことは現在入手可能な道具としての欠点である。更に、現在入手可能な技術が常に最も適切な構造情報を供給するものではなく、例えば、溶液中の標的の構造はその例である。それらは標的の構造の中を洞察することを可能にするが、それは固相の場合である。また、特注反応試薬や特定の課題のための実験は、現在の薬品発見およびスクリーニング技法の慣行に対する挑戦である。現在の方法は、プールまたは混合物中の分散したメンバーを手間のかかる方法で再合成・再分析することなしに、ライブラリー中の活性メンバーを解明し、同定することの必要性に対する便利な解答を提供することがで出来ていない。

0039

従って、複雑な化学ライブラリー、特にコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングと同定方法は、一つ以上の標的とリガンドの両方の構造、標的とリガンド間の相互作用の部位、および標的−リガンド相互作用の強さを決定できることが大きなニーズになっている。更に、薬剤発見を促進するために、混合物から生物活性メンバーを直接同定し、複数の生体ポリマーのスクリーニングを一回の手順で行なえる、新コンビナトリアルライブラリー・スクリーニング法が必要である。生体ポリマーの特異的で制御された切断を可能にする直截的方法は、構造情報を提供するフラグメントの分析をすることと共に、生化学および薬剤発見に関与した人々にとっては重大な価値があり、長い間求められてきたものである。更に、その方法は、生体分子標的一種に限定されず、核酸、ペプタイド、タンパク質およびオリゴ糖のような色々な標的に適用できることが望ましい。

0040

従って、本発明の主目的は、核酸、特にRNA中の分子の相互作用を同定することである。本発明の更なる目的は、「低」分子などと重要な治療用制御用、その他の相互作用を生じさせる確率が極めて大きいRNA中の二次構造要素を同定することである。RNA中の組織−富化したユニークな構造の同定が本発明のその他の目的である。

0041

本発明のその他の目的はRNAとその他の核酸およびリガンドまたは潜在的リガンド間の相互作用の改良された特徴を提供することである。

0042

本発明の更なる目的は、RNAの分子相互作用部位と、それと相互作用が提案されている化合物を比較することである。

0043

本発明の好適な態様に従い、RNAの分子相互作用部位と他の化合物との比較を、分子相互作用部位の三次元構造の色々な表現とリガンドの三次構造とのその方式での比較により、その相互作用が質の面で比較できるような方法で実施する。

0044

本発明の他の目的は、RNAおよび他の核酸標的の分子相互作用部位を、相互作用する能力に従って階層付け、あるいは並べて、リガンドの階層をつくることである。

0045

本発明の尚その他の目的は、核酸の分子相互作用部位の三次元構造およびリガンド・ライブラリーの三次元構造の数多くの表現のデータベースを作ることである。このようなデータベース・ライブラリーは潜在的リガンドの分子相互作用部位の構造と相互作用の解明および予測のための強力な手段を提供する。

0046

本発明の更なる目的は、ペプタイド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび核酸のような生体分子標的の生体ポリマーとしての一次配列、二次および折畳まれた構造、およびさらに高次の分子内および分子間相互作用に起因する生体分子の三次元および四次元構造のような、構造上の特徴を決めることである。

0047

本発明の尚その他の目的は、生体分子標的と結合しているリガンドまたはリガンド間の相互作用部位とその性質を明らかにすることである。結合リガンドは多分低分子で、ペプタイド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖、天然物質またはコンビナトリアルライブラリーのメンバーような生体分子である。

0048

本発明の更なる目的は、生体ポリマー標的に結合しているリガンドの相対的結合親和性または解離定数を決定することである。好ましくは、これはRNA/DNA標的とリガンド、即ち、組合せ合成されたライブラリーの構成メンバーのような生体ポリマー間の相対的結合親和性の決定を行なうことである。

0049

本発明の更なる目的は、生体ポリマー標的に結合しているリガンドの絶対結合親和性またはリガンドの解離定数を決定することである。

0050

本発明の更なる目的は、ライブラリーのどの成分が標的に結合しているかを決めるために、核酸のような生体分子標的に対して、個別の化合物あるいは化合物の混合物からなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングをする一般的方法を提供することである。

0051

本発明の追加の目的は、生体分子標的に結合しているコンビナトリアルライブラリーのメンバーの分子量と構造を決定するための方法を提供することである。

0052

本発明の尚その他の目的は、化合物のコンビナトリアルライブラリーに対する、核酸、タンパク質およびその他の生体分子およびオリゴマーのような複数の標的を同時にスクリーニングする方法を提供することである。

0053

本発明の尚更なる目的は、RNAのような、特に核酸である生物学的分子の分子相互作用部位と結合しまたは相互作用する「低」分子の有機化合物について、特に化合物の特異性と親和性を確認することである。このような分子は、多分ランク付けされ、望ましくは、分子相互作用部位において、予想または計算されたこれら部位での相互作用の可能性に従いランク付けされたリガンドおよび潜在的リガンドの階層を形成する。

0054

本発明のその他の目的は、スクリーニングする標的の混合物および組合せの、またはその他の化合物の混合物分析から生じた質量スペクトル内でのピークオーバーラップ問題を緩和することにある。好適な態様では、本発明は、組合せの、またはその他の化合物の混合物で質量重複性を解決するための方法を提案し、さらに、標的の混合物がスクリーニングされる場合の質量重複性の問題を解決する方法を提供する。

0055

本発明の更なる目的は、対照と比較して、標的に対して、リガンドの結合特異性を決める方法を提供することにある。本発明は、選択性の決定、非特異的効果の同定、および薬剤発見の努力に対する更なる
配慮から非特異性リガンドの除去を容易にする。

0056

本発明は生体分子、特にRNAの修飾を通じて作用する、新しい薬剤、農業用化学薬品、工業用化学薬品その他の同定を目指している。多くの方法およびプロトコルは、強力な薬品およびその他の生物学的に有用な化合物の同定を提供する多くのこのましい方法としてプロトコルが統合されている。

0057

出願人の発明は、「分子相互作用部位」と名付けられた、原核および真核RNAの二次構造を同定する方法を目指している。分子相互作用部位は、低分子量、好ましくは70ヌクレオチド未満、更に好ましくは50ヌクレオチド未満、もしくは30ヌクレオチド未満で、より大きなRNA分子内に含まれる、独立して折畳まれた、機能的下位領域である。出願人の方法は、好ましくは、核酸、好ましくはRNAの配列を分析し、その構造と機能を予測する統合されたプロセスのグループを含む。出願人の方法は、好ましくは、サブルーチン順番に実行するプロセスを含み、そこでは、一つのプロセスの結果がアクションの特定のコース引き金を引くか、他のステップへの数またはインプットを供給する。好ましくは、このプロセスに決定ポイントがあり、そこでは経路が、詳細なリアルタイムの人の介入なしに決定が下せるエキスパートプロセスにより決定される。RNA配列分析の自動化は、RNAの配列がゲノム配列データベースその他から入手可能になると同時に、調節部位を確認する能力を与えている。この発明は、例えば、中枢神経系(CNS)疾患、代謝疾患、痛み、老化による変性疾患がん炎症性疾患循環器系疾患および多くのその他の条件との関係で分子相互作用を同定するのに使用し得る。出願人の発明はまた、例えば真核細胞、特にヒトの真核細胞にはない分子相互作用を同定するのに使用でき、それは原核細胞のRNAの促進または抑制のいずれかの平行修飾をもった「低」分子結合用部位として利用できる。このようにして、ウイルス性または細菌性寄生虫による疾患の治療で、ヒトへの毒性を回避することができる。

0058

本発明は、好ましくは、標的核酸内の分子相互作用部位は、標的核酸のヌクレチオド配列を異なる分類学上の種からの複数の核酸のヌクレチオドの配列と比較し、複数の核酸中に有効に保存されたものおよび標的核酸中に、少なくとも一つの配列領域を同定し、その保存された領域が二次構造を持ち、かつ、二次構造をもつ保存された領域について二次構造を同定することにより得られる。

0059

本発明はまた、真核および原核RNA中の分子相互作用部位に関連するデータベースを提供することを目指すものである。このデータベースは標的核酸のヌクレチオド配列を異なる分類学上の種からの複数の核酸のヌクレチオドの配列と比較し、複数の核酸中に保存されたものおよび標的核酸中に、少なくとも一つの配列領域を同定し、その保存された領域が二次構造を持ち、かつ、二次構造をもつ保存された領域について二次構造を同定し、このような二次構造のグループを集積することにより得られる。

0060

本発明はなお、特定の生物のRNA中に存在し、かつ、少なくとももう一つの生物のRNA中にも存在する分子相互作用部位を含むオリゴヌクレチオドを提供することを目指すものであり、そこでは、分子相互作用部位は、少なくとも一つの分子に対して統合部位として役立ち、その分子相互作用部位へ結合した場合には、それにより特定生物体のRNA発現を修飾する。

0061

本発明はまた、原核細胞RNA中に存在し、かつ、少なくとももう一つの原核細胞RNA中に存在する分子相互作用部位を含むオリゴヌクレチオドを提供することを目指すものであり、そこでは、その分子相互作用部位は、少なくとも一つの分子の統合部位として役立ち、その分子相互作用部位に結合した場合には、原核細胞のRNAの発現が修飾される。

0062

本発明は、原核細胞RNAおよび少なくとももう一つの原核細胞RNA中に存在する分子相互作用部位をもつオリゴヌクレオチドを含む医薬用組成物に関係し、そこでは、その分子相互作用部位は、少なくとも一つの「低」分子のための結合部位として役立つ。このような分子は分子相互作用部位に結合した場合、原核細胞RNAの発現を修飾する。また、好ましくは、医薬用担体も含まれる。

0063

本発明はまた、特定生物体の中に存在し、少なくとももう一つの生物体のRNA中にも存在する分子相互作用部位を含むオリゴヌクレチオドを含む医薬用組成物を提供しようとするものである。分子相互作用部位は、少なくとも一つの分子の結合部位として役立ち、分子相互作用部位に結合した場合には、特定の生物体および医薬品用担体内のRNAの発現を修飾する。

0064

結局、本発明の方法は、その核酸が存在する生物体にとって非常に重要である、標的核酸中に存在する物理的構造を同定する。このような構造−−分子相互作用部位は分子種と相互作用が働くことができ、その結果、核酸の特徴または効果を変性させることになる。このことは、当業者には分かるように、医薬品として活用され得る。このような構造は農業汚染制御、工業用生化学、その他にとって重要である生物体の核酸中に見られる。従って、殺虫剤除草剤、防かび剤、酵母バクテリアウイルスその他のような工業的に用いられる生物体、および生体触媒系にとって有用であろう。

0065

本発明に従い、低分子の仮想コンビナトリアルライブラリー形成のための方法が提供される。これらのライブラリーの分子またはメンバーはin silicoに生成される。高分子量ライブラリーメンバー、例えば、性質が重合性のものもまた、本発明の方法を用いて生成することができる。

0066

更に本発明は、フラグメント、反応物およびライブラリーメンバーのin silicoでの生成に用いられた、これらのもののユニークな組合せをデータベース中で追跡し保存する方法を提供する。並列配列シンセサイザーのような、機器上でライブラリーメンバーを実際に合成することとを指示するよう設計された命令のように、in silicoでライブラリー生成に必要な情報をインターフェイスする方法もまた、本発明により提供される。

0067

本発明はまた、ライブラリーメンバーと同定された標的分子のドッキングをin silicoで行なう方法を提供する。この方法によれば、個々のライブラリーメンバーは標的に対して高親和性結合を示すこれらのライブラリーメンバーを同定するために必要な標的分子へ結合することを許容される。

0068

本発明によれば、低分子の仮想コンビナトリアルライブラリーを生成する方法が提供される。これらのライブラリーの分子またはメンバーはin silicoで生成される。高分子量のライブラリーメンバー、例えば、重合性の性質を持ったものも、本発明の方法を用いて形成することができる。

0069

更に、本発明は、フラグメント、反応剤およびライブラリーメンバーのin
silicoでの生成に用いられた、これらのもののユニークな組合せをデータベース中で追跡して保存するための方法を提供する。並列配列シンセサイザーのような機器上で実際にライブラリーメンバーを合成することを指示するように設計された命令のような、in silicoでライブラリーの生成に必要な情報をインターフェイスするための方法もまた、本発明により提供される。

0070

本発明はまた、分子相互作用部位の三次元的構造を数値表現し、多数の有機化合物の三次元的構造の数値表記を含む、化合物のデータセットを提供することを含む、核酸の分子相互作用部位へ結合する化合物を同定する方法を目指している。分子相互作用部位の数値表現は分子相互作用部位と物理的相互作用を形成する有機化合物のその能力に従ってランク付けされる有機化合物の階層を生成するための化合物のデータ・セットのメンバーと比較される。

0071

本発明はまた、分子相互作用部位の三次元構造の数値表現を含むデータベースおよび複数の有機化合物の三次元構造の数値表現を目指している。

0072

本発明は、核酸の分子相互作用部位に結合する化合物を同定する方法を目指している。この方法は、分子相互作用部位の三次元構造の数値表現を供給し、複数の有機化合物の三次元構造の数値表現を含む化合物のデータセットを供給し、分子相互作用部位の数値表現を化合物のデータセットのメンバーと比較し、その結果、分子相互作用部位の物理的相互作用を形成するために、有機化合物の能力に従ってランク付けされた有機化合物の階層を形成することからなる。

0073

本発明の一つの態様は、質量分析法を用いて核酸のような生物分子標的の構造を決定する方法である。この方法は核酸標的の配列を決定する第一次構造だけでなく、不適合な塩基対、ループ、バルジキンクおよびステム構造についての情報を含む、核酸、RNAおよびDNAの二次構造、三次構造についての情報を提供する。これは、一つの態様に従って達成され、デオキシヌクレオチド残基またはその他の変性された基をオリゴリボヌクレオチドの特定の部位へ取込むことにより、質量分析計の中で、これらのハイブリッドRNA/DNAの特異的切断が続いて起こった。核酸の電気スプレーによるイオン化、核酸の切断、それに続き直列MSn分光法は、核酸の配列とその構造を示すフラグメントのパターンを供給することが分かった。切断は、デオキシヌクレチオドまたはその他の外来残基の取込み部位および核酸の二次構造に依存する。従って、この方法は、核酸の配列中に存在する二次構造の部位およびタイプを同定する質量分析データを提供する。

0074

この方法が生体分子の標的の混合物およびリガンドまたは標的に結合している分子に対して行なわれたとき、リガンドと生体分子間の相互作用の程度および相互作用の場所を確認することができる。このリガンドの生体分子への結合は、生体分子上の結合部位を質量分析法で測定する間、簡単に切断することから保護する。従って、この方法を用いて発生した、リガンドまたは薬剤との結合がある場合とない場合の、RNA/DNAに対する、発生したESI−MSn質量分析の比較が結合場所を明らかにする。切断パターンが変わったスペクトルは、質量スペクトル内で明らかに識別され、核酸の配列および構造に関係する。このように、テスト・リガンドの絶対結合親和性は本発明の方法で測定できる。核酸・リガンドの非共有複合イオンの存在量とその結合親和力が知られている標準化合物(例えば、16S RNA A部位に対するパラモミシン)で生成する同様の複合イオンの存在量との比較により、テスト・リガンドの相対的結合親和力を決めることが可能になる。

0075

本発明の方法は、大量の化合物のコレクションをすばやくスクリーニングするのに用いることがでできる。また、本発明の方法は組合せ方法やその他の方法で生成した大量の化合物の混合物のスクリーニングにも使用することができる。化合物の大きな混合物を、核酸のような生物分子の標的に暴露すると、リガンドの小さな画分は、核酸にいくらかの結合親和力を示すことがある。バインダーとして検出されたリガンドの実数は、標的核酸の濃度、組合せ混合物の成分の相対的濃度、およびこれらの成分の絶対的および相対的な結合親和性に基づいている。この方法は、選択的イオントラッピング、または衝突活性化による解離MSn実験を用い、結合したリガンドの構造や同一性に対する個々の複合体の集積や分析のようなテクニックを用い異なる非共有複合体の分離に有効である。従って、本方法は、生体分子の標的に結合する分子を対象にコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法として役立つばかりでなく、直接的方法として、結合リガンドの構造的同一性を選択することができる。コンビナトリアルライブラリーの大量の重複も問題を提起することはない。というのは、この方法は、高分解能分子質量分析計が取り付けられ、尚且つ、直列接続同一分子質量のリガンドの異なる構造間の差を識別することができるから。

0076

好ましい態様において、分子相互作用部位を持ったRNAのような標的生体分子は、相互部位用の、一つまたはそれ以上のリガンドまたは潜在的リガンドを、そのリガンドの相互作用または結合が、分子相互作用部位と起こるような条件になっている。その結果として得られる複合体は、RNAその他の生物分子がついたリガンドの一つ、または、時として何百もの複合体であり、本発明の方法に準拠した質量分析評価対象である。「調整的」質量分析法は、個々の複合体を分離し、次いで質量分析的環境に制御された条件下で、次に続く分析用フラグメント化される。このようにして、リガンドの分子相互作用部位への性質と結合度合、または絶対結合親和性が確認される。特異的で強力な結合力をもったリガンドの同定が行なわれ、このように選択されたものは、治療用、農業用、工業用またはその他の化学薬品用として使用されたり、同じものが、これらの用途で改良された形へ引き続き変性させるための主導的化合物として用いられる。

0077

本発明のさらなる応用は、コンビナトリアルライブラリーまたは化合物の混合物に対する、複数の生体分子標的の同時スクリーニング用質量分析法として用いることである。このやや複雑なスクリーニング法は、質量分析法とスクリーニングを行なう方法の組合せによる力で可能になった。複数標的核酸をスクリーニングする場合、例えば、質量重複性が関係する場合、特に、もし二つまたはそれ以上の標的が類似の配列組成または質量スペクトルの場合である。この問題は、本発明により、異なる核酸標的に、特別の質量修飾法、分子量の標識を付けることが検討され、軽減された。これらの質量修飾タグとしては、代表的なものとして、多くの異なるサイズと重量のものが市販されていて、ポリエチレングリコールポリアクリルアミドおよびデキストランを含むが、それらに限定されない高分子量、非イオン性ポリマーも挙げられており、それらは核酸上の多くの異なる可能な部位のうちの一つ又はそれ以上に付着してもよい。このように、類似の核酸の標的には別々のタグが付けられ、質量スペクトルで、その電荷比(m/z信号)に対する明らかに異なる質量により、お互いを容易に区別することができる。本発明の方法を用いると、スクリーニングでは、複数の標的は多数の化合物の混合物でも、現在では同時にスクリーニングすることができるようになり、顕著な進歩が見られた。

0078

本発明の方法に関連するもうひとつの利点は、新しいリガンドと生体分子の標的との間の結合相互作用の特異性を決定する能力である。例えば、標的核酸および一つまたはそれ以上の対照核酸とコンビナトリアルライブラリーまたは特定のリガンドを同時スクリーニングすることにより、本発明の方法を使用することで、そのリガンドが標的とする核酸にだけ結合しているのか、あるいは、標的と共に測定された結合は対照の核酸でも再現され、従って非特異的なものなのかを確認することが可能になる。

0079

本発明の方法は、次のように多様な生物分子標的の研究に応用可能であり、ペプタイド、タンパク質、受容体、抗体、オリゴヌクレオチド、RNA、DNA、RNA/DNAハイブリッド、オリゴ糖、炭水化物およびグリコペプチドが含まれるが、それに限定されるものではない。本発明の方法を用いてスクリーニングされ得る分子としては、次のものを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。即ち、有機化合物や無機化合物、低分子量から高分子量の個々の化合物、リガンドの混合物およびコンビナトリアルライブラリー、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、基質、およびペプタイド、核酸またはオリゴヌクレオチドのような生体ポリマーが含まれる。本発明の方法で用い得る質量分析技術には次のものがあるが、これらに限定されるものではない。即ち、MSn 、衝突活性化解離(CAD)および衝突誘導解離(CID)および赤外多重光子解離(IRMPD)などを含む。多くのイオン化技術が使用可能となり、エレクトロスプレー、MALDIおよびFABが含まれるが、これに限定されるものではない。本発明のこの方法に使用される質量検出器には次のものがあるが、これらに限定されるものではない。即ち、FTICR、イオントラップ、四本極、磁気セクター飛行時間型(TOF)、Q−TOFおよび三重四極型を含む。本発明のこの方法は尚ハイフン付の技法、例えば次のものが使用可能だが、それに限定されるものではない。即ち、LC/MSおよびCE/MSであるが、記述のこれらのことすべては、以後さらに充分説明する。

0080

分子相互作用部位とリガンド間の結合力を特徴付ける方法は、例えば、有機化合物で好まれる方法、米国特許出願番号Nos.09/076,440,09/076,405,09/076,447,09/076,206,09/076,214および09/076,404、これらはそれぞれ1998年5月12日に出願された。前記特許のすべては参照により本明細書中組み入れられる。

0081

以上説明したように、本発明はRNAその他の生物分子を修飾する能力をもった分子の同定法を提供するものである。新しい方法との組合せは本方法に非常な力と汎用性を与えている。以後、さらに詳細に説明するように、ある態様では、本出願の譲受人によって開発された多くの方法を組合せることが望ましく、他の方法との組合せがよい結果を生むということも認識しておく必要がある。このように、本発明の示すところに従いRNAやその他の分子上にある分子結合部位を決めることは非常に有用であるが、確認されたリガンドとリガンド・ライブラリーおよびRNAとその他の分子の間の相互作用は興味あるもので、本発明の他の面からも大いに役立つものである。このような組合せのすべては本発明の考え方に含まれるものである。

0082

好適な態様に従い、原核細胞および真核細胞の核酸、分子相互作用部位の特定な構成要素が同定されている。このようにして、本発明は、他の分子と相互作用し、RNAの修飾に影響を与える真核細胞および原核細胞の核酸、特にRNA分子内の特定の構造要素を同定する方法を指向している。「修飾」はRNAの活動または表現を増加させたり減少させたりすることを意味する。本発明の内容は図1フローチャートの形でアウトラインを示してある。真核細胞および原核細胞中の構造要素は「分子相互作用部位」と言われている。これらの要素は二次構造をもち、即ち、「低」分子その他と相互作用する能力がある三次元の形を持っており、また「低」分子、オリゴマー(例えば、オリゴヌクレオチド)とその他の化合物と相互作用するための部位として利用することが期待されている。

0083

図1について、標的である核酸中の分子相互作用部位の同定のための好ましい段階は、フローダイアグラムに示されている。標的核酸のヌクレオチドの配列は異なる分類学上の種,10からの複数の核酸のヌクレオチド配列と比較される。標的核酸は、真核細胞、原核細胞の中に存在することがあり、標的核酸は、例えばヒトのような高等な生物体に属することもあるし、バクテリアあるいはウイルスのものであることもある。どのようなタイプの核酸でも標的核酸として役立ち得る。好ましい標的核酸にはmessenger RNA(mRNA)、pre−messenger RNA(pre−mRNA)、transfer RNA(t−RNA)、リボゾーマルRNA(rRNA)、または小核RNA(snRNA)が含まれるが、それらに限定されない。特定の標的核酸を初めに選択するには、何らかの機能基準に基づく。核酸は、炎症、心臓血管関連疾患、痛み、がん、関節炎外傷肥満症ハンチントン病神経系疾患、その他疾患や障害に主要な関係があり、典型的な標的核酸である。

0084

核酸は病原性ゲノム、例えばバクテリアゲノム、ウイルスゲノム、および酵母ゲノムに含まれており、それらは代表的な原核細胞核酸標的である。病原性のバクテリア、ウイルス、酵母は当業者によく知られている。代表的な核酸標的を図1表に示した。しかし出願人は表1の標的に限定されるものではなく、本発明が極めて一般的であると考
えられている点が理解されなければならない。

0085

追加の核酸標的は独立に決めることもできるし、公入手可能な原核細胞および真核細胞については当業者によく知られている遺伝子データベースから決めることもできる。好ましいデータベースにはOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)、the Cancer Genome Anatomy Project(CGAP)、GenBankEMBL、PIR、SWISS−PROT等が含まれる。疾患に関連した遺伝子突然変異のデータベースであるOMIMは、部分的にthe National Center for Biotechnology Information(NCBI)によって開発される。OMIMはインターネットを通じてアクセス可能で、例えば、 HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/0min/ 。例えばCGAPはがん細胞の分子解剖学解読するために必要な情報および技術ツールとして設立された学際的なプログラム。CGAPはインターネットを通じてアクセスが可能で、例えば、 HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ncicgap/ 。これらのデータベースのあるものは、完全にまたは部分的にヌクレオチド配列を含む。さらに核酸標的は自分の遺伝子をデータベースから選ぶこともできる。代わりに核酸標的を入手可能な出版物から選択したり、あるいは特に本発明に関わる使用に決定することができる。

0086

核酸標的が選ばれ、使用可能になった後、核酸標的のヌクレオチド配列が決められ、次いで異なる分類学上の種からとった複数の核酸のヌクレオチド配列と比較される。本発明の一つの態様において、核酸標的ヌクレオチド配列は少なくとも一つの遺伝子データベースをスキャニングして決めるか、または入手可能な出版物において同定する。好ましいデータベースとして知られ、当業者が入手し得るものに例えば、The Expressd Gene Antomy Database(EGAD)およびUnigene−Homo Sapiens Database(Unigene),GenBanなどである。EGADにはヒトの転写された(HT)配列の重複のないセットが含まれ、インターネットを通じて、例えば、HYPERLINK "http://www.tigr.org/tdb/egad/egad.html" http://www.tigr.org/tdb/egad/egad.html からアクセスできる。UniGeneは自動的にGenBankの配列を分割して、重複性のない遺伝子指向のクラスターのセットにするシステムである。それぞれのUnigeneクラスターはユニークな遺伝子を代表する配列を含み、遺伝子が発現される組織型や地図の場所等の関連情報を含んでいる。

0087

さらにUnigene は無数の新しい発現配列タグ(EST)を含んでいる。Unigene はインターネットでアクセス可能で、例えば、HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ 。これらのデータベースは当業者によく知られており、入手可能なEntrez等の検索プログラムに関連して使用することができる。Entrezはインターネットでアクセス可能で、例えば、HYPERLINK "http://www.ncb.nlm.nih.gov/Entrez" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ 。好ましくは種々のデータベースから入手可能な最も完全な核酸配列の表現を使用する。当業者に知られている入手可能なGenBankのデータベースは最も完全なヌクレオチドは配列を入手するのに使用可能である。GenBankはNIHの遺伝子配列データベースであり、すべて公に入手可能なDNA配列注釈つきのコレクションである。例えばGenBankはNuc.AcidsRes.,1998,26,1−7に記載され(関連により併合)、その当業者はインターネット経由でアクセスすることができる。例えば、HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Genbank/index.html" http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Genbank/index.html である。代わりに核酸標的の部分ヌクレオチドの配列は完全なヌクレオチド配列が入手不可能な場合、使用可能である。

0088

本発明の他の態様で、核酸標的のヌクレオチドの配列は、オーバーラップしている複数の発現配列タグ(ESTs)を組み合わせて決定する。当業者によりよく知られており、入手可能なESTデータベース(db EST)は約500ないし1000のヌクレオチドからなる約100万の異なるヒトmRNA配列と多くの有機体からの様々な複数なESTが含まれている。db ESTはインターネットでアクセスでき、HYPERLINK "http://ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html である。これらの配列はゲノム配列用のcDNA発現クーロンを用いる。クーロン法により引出されたものである。ESTは新しい遺伝子の発見、ゲノムのマッピング、ゲノム配列中のコーデイング領域を同定できるアプリケーションを持っている。急速に利用できるようになっているEST配列情報の別の重要な特徴として、組織特異性のある遺伝子発現データがある。これは治療的発明のための選択的遺伝子を標的とする場合にきわめて有用である。EST配列は相対的に短いことから、それらは完全な配列を提供するように組み立てられなければならない。あらゆるの入手可能なクーロンは配列されているので多くの重複領域がデータベースに報告されている。

0089

5' および3' の両方に沿って伸ばされたオーバーラップするESTの組み立ては等身大の仮想転写物になる。この結果として得られた仮想転写配列は現に特徴付けられた核酸を示し、またはおそらく新規の核酸で完全に知られていない生物学的機能を持つものである。The Institute for Genomic Research(TIGR)Human Genome Index(HGI)databaseは当業者にはよく知られ利用可能で、ヒトの転写された配列のリストを含んでいる。TIGRはインターネットでアクセス可能で、例えば、HYPERLINK "http://www.tigr.org" http://www.tigr.org である。この転写物はTIGR−Assemblerを用いて生成でき、これは仮想転写物を作り出すエンジンである。このことは当業者にはよく知られており、利用可能である。TIGR−AssemblerはEST、BACでオーバーラップ配列データの大きなセットまたは小さなゲノムをアセンブルするためのツールであり、真核細胞または原核細胞の配列をアセンブルするのに使用できる。TIGR−Assemblerは例えばSuttonら,Genome Science & Tech.,1995,1,9−19関連により併合された。インターネット、例えば、http://ftp.tigr.org./pub/software/TIGR assemblerでアクセスできる。さらに当業者に知られており利用可能なGLAXO−MRCは仮想転写された配列を構成するためにプロトコルであり適応性のある当業者にはよく知られている Find Neighbors and Assemble EST Blast protocolはUNIXのプラットホーム上で動き出願人により仮想転写された配列を構成するために開発された。Find Neighbors andAssemble EST Blast protocolの好ましい段階は図2に示したフローチャートに記載されている。PHRAPはFind Neighbors and Assemble EST Blast protocolで配列のアッセンブリーに用いられている。PHRAPはインターネットを通して、例えば、HYPERLINK "http://chimera.washington.edu./uwgc/tools/phrap.html" http://chimera.biotechwashington.edu./uwgc/tools/phrap.htmlでアクセスできる。当業者は図2提示されている好ましい段階を実行するためのソースコードを構成することもできる。

0090

核酸標的のヌクレオチド配列は異なる分類学上の種から複数の核酸のヌクレオチド配列と比較する。異なる分類学上の種から核酸およびそのヌクレオチド配列は入手可能な出版物の遺伝子データベース内で得ることができ、あるいは本発明と関連して特別に使うことを決定することもできる。本発明の態様の一つとして、核酸標的は配列類似性検索オーソログ検索、または両方を使って異なる分類学上の種からの複数の核酸のヌクレオチド配列と比較する。このような検索は当業者の技能を持った人にはよく知られている。

0091

配列類似性検索の結果は、複数の核酸が標的核酸の少なくとも8〜20ヌクレオチド領域と同種のヌクレオチド配列の一部を持っており、ウインドウ領域と言う。複数のヌクレオチド配列が少なくとも一つの場所で標的核酸のウインドウ領域と少なくとも60%同種であることが好ましい。さらに同種であるものが少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、最も好ましいのは少なくとも90%である。例えばウインドウサイズ、複数の配列を比較すると標的ヌクレオチドの部分は約8から約20、好ましいのは10から15、最も好ましいのは約11から12の連続ヌクレオチドである。ウインドウサイズはそれ相応に調節することができる。異なる分類学上の種の複数の核酸は好ましくは複数配列の全ての部分が標的核酸のウインドウと比較されるまで同種らしい各ウインドウと比較される。複数の核酸の配列が少なくとも60%、好ましいのは少なくとも70%、さらに好ましいのは標的核酸とのウインドウ配列とも同種である部分を少なくとも80%、最も好ましいのは90%持っているものを同種らしい配列とみなす

0092

配列の類似性検索は手ですることもできるが、またはいくつかの入手可能な当業者に知られているコンピュータプログラムを使って行うこともできる。好ましくはBlast and Smith−Watermanアルゴリズムなどを使うことができ、これらは当業者が入手可能でよく知られている。Blastはヌクレオチドおよびタンパク質配列データベースの分析をサポートすされるために設計されたNCBIの配列類似性検索ツールである。Blastは例えばインターネット経由でアクセスできる。HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。公開ドメインデータベース又は、地方でも入手可能な検索に使えるデータベースで、一般に使えるBlastの地方バージョンGCG Packageにより提供されている。GCG PackageV.9.0は配列を編集しマッピングし、比較して位置合わせすることにより分析できる100を超える相互に関係したソフトウェア・プログラムを含む市販のソフトウェアパッケージである。GCG Packageに含まれる他のプログラムには、例えばRNA二次構造の予測、核酸フラグメントの組み立ておよび進化分析を容易にするプログラムである。さらに顕著な遺伝子データベース(GenBank,EMBL,PIR,及び SWISS−PROT)がGCG Packageと一緒頒布され、検索及び操作プログラムに充分アクセスできる。GCGはインターネット経由で、例えば、HYPERLINK "http://www.gcg.com/" http://www.gcg.com/ でアクセスできる。FetchはGCGの中で入手可能なツールで、アクセスナンバーを基にした注釈つきGenBankの記録を入手することができ、Entrez同様である。他の配列類似性検索は、GeneWorld およびPangeaからGene Thesaurusで行うことができる。GeneWorld 2.5は、ポリヌクレオチドおよびタンパク質配列の分析用に自動化され、フレキシブルで高スループットな分析ができる。GeneWorldは自動分析及び配列の注釈を可能にする。GCG同様、GeneWorldは、いくつかのツールを同種検索、遺伝子発見、複数配列の位置合わせ、二次構造予測およびモチーフ同定用に組み込んでいる。Gene Thesaurus 1.0tmは複数の情報源から情報を提供する公共およびローカル用データベースのため関連データモデルを提供する配列および注釈データ購読サービスである。

0093

その他、選び得る配列類似性検索は、例えばBlastParseで行える。BlastParseはUNIXのプラットホーム上で動くPERLスクリプトで、上記の方法で自動的に実行される。BlastParseは標的アクセス番号を取り込み、図3に説明されているフローチャート記載の好ましいプロセスを通して各番号を取り込む。BlastParseはすべてGenBank分野を構文分析して「タグで区切った」テキストにし、検索及び分析をより容易にするため「関連データベースフォーマットに保存する。その結果、柔軟性が得られる。最終結果は完全に構文分析された一連のGenBankレコードで、注釈つき関連データベースのように容易にソート、ふるいがけ、照会ができる。

0094

配列類似性検索およびデータ編集できる他のツールキットは、これもまたNCBIのSEALSである。このツールセットパールとCで書かれ、どのコンピュータプラットホームでも動かすことができ、この言語をサポートしている。これは例えば、HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Walker/SEALS/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Walker/SEALS/ からダウンロードすることができる。このツールキットはBlast2またはgapped blastへアクセスすることができる。またtax_collectorと言うツールをもっている。これはtax_breakとの関連でBlast2の出力を構文分析して、それぞれの存在する種に関する問い合わせ配列に対し最も同類らしい配列の識別子を返してくる。他の有用なツールfeature2fastaであり、注釈を基に入力された配列から配列フラグメントを抽出する。このツールの代表的な用途は、cDNA配列の5'非翻訳領域を含む配列ファイルを作り出すことである。

0095

好ましくは、配列類似性検索で上述のように、標的核酸と相同である異なる分類学の種からの複数の核酸について、その中に標的核酸のオーソログを見つけるためにさらに記述する。オーソログは遺伝子分類学上定義付けられた用語で、著しく相違する生物種の2つの遺伝子が類似の配列を持ち、その結果、生物体の構造内で類似の機能を果たすことを言う。反対にパラローグは一つの種内の遺伝子複製時に生じるが、新しい機能を発達させる遺伝子であり、アイソタイプと言われる。オプションとしてパラローグ検索もまた行うことができる。オーソログ検索を行うことにより、広い範囲の生物体から同種の配列の膨大なリストが得られる。従って、これらの配列はオーソログとして、規準を満たす最良の代表的配列を選択するために分析される。オーソログ検索は例えばcompareを含む当業者が入手し得るプログラムにより行うことができる。好ましくはオーソログ検索が配列のそれぞれに対してGenBankの注釈を完成し構文分析するようアクセスを行って実行する。現状ではGenBankからの記録は「フラットファイル」で自動化分析には理想的に適合していない。好ましくはオーソログ検索はQ−Compareプログラムを用いて行われる。Q−Compareプロトコルの好ましい段階は図4のフローチャートに記されている。Blast Result−Relationデータベースは図3に書かれてており、図3に書かれている注釈関連データベースはQ−Compareプロトコルの中で使用され、その結果は種間配列プログラムの中で以下に述べるように比較するためのオーソログ配列のリストになる。

0096

上記類似性検索はカットオフ値に基づく結果でありe−scoreと言われる。e−scoreはヌクレオチドの一定のウインドウ内でのランダムな配列マッチ確立を示している。e−scoreが低ければマッチングはよくなる。当業者はe−scoreに慣れている。ユーザーは厳重なe−valueカットオフまたは望ましい同一性の度合いを上記のように定義している。本発明の態様において原核細胞の分子相互作用部位が同定された場合、同定されたどのような同一性のヌクレオチド配列もヒトのものでないことが好ましい。

0097

本発明の態様では、この必要とされる配列はオーソログデータベースを検索することにより得られた。このようにデータベースの一つはHovergenであり、脊椎動物のオーソログの巡回して得られたものである。オーソログのセットがこのデータベースからエクスポートされ、そのまままたは上記のように配列類似性検索のための種として使われる。例えば非脊椎動物のオーソログの検索が望まれる。Hovergenは、例えば、http://pbil.univ-lyonl.fr/pub/hovergen/ からダウンロードできる。原核細胞のオーソログのデータベースCOGSは入手可能でインターネット上で相互に使用できる。例えば、HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ で見ることができる。

0098

本発明のもう一つの態様として、異なる分類上の種からの複数の核酸のヌクレオチド配列を標的核酸のヌクレオチド配列dbESTのようなものを用いて配列類似性検索を実施し、仮想の文字列にした。EST情報の使用は2つの明らかな理由がある。第1はGenBankデータベースの中で進化論的明確な生物体の中にヒト遺伝子のオーソログを同定する能力に限られている。さらにこれらの進化的にあきらかな生物体からESTを同定する方向で努力が払われているdbESTはオーソログ情報のよりよいソースなったようである。

0099

第2にヒトゲノムを配列する試みで、完成したのは10%未満である。このようにヒトdbESTは第1の目標を同定するためにより多くの情報を提供すると思われる。これはヒトゲノムの配列は完成に近づいていくためである。ESTは短く、使うために組み立てる必要がる。好ましくは上記のようにヒト配列を除外してdbESTに対し、非常に厳しい状態で、配列類似性検索はSmith−Watermanアルゴリズムを使って行われた。dbESTには新しい配列への正確な検索のため挿入および削除があり、配列エラーを含み、使用された検索法はこれらのギャップを許容しなければならない。入手可能なクローンはどれも配列するから、多くのオーバーラップしている領域がデータベースに報告される結果になった。フルレングスまたは部分的なヒト以外のRNAの「仮想の文字化」はオーバーラップしているEST配列は「フルレングス」文字列が得られるまで5' および3' 両方向へ伸ばすというプロセスによって構成される。他の態様ではキメラのような仮想の文字化が構成されている。

0100

その結果得られた仮想文字化が既に特徴をもったRNA分子を表象することもありまた新しいRNA分子が今まで知られている生物学的機能をも持たなくなることもある。TIGR HgIデータベースはTIGR−Assemblerと言う仮想の文字を作るエンジンを利用可能にGLAXO−MRCおよびPangeaからのGeneWorlgは仮想の文字化の構築に同様に役立っている。既述Find Neigbors and AssembleEST Blastは仮想の文字化にも使うことができる。

0101

図1に関連して、上記のオーソログや仮想文字化は配列類似性検索やオーソログ・検索を通じて異なる種から複数の核酸の中に保留されていた、少なくとも1つの配列領域および標的核酸が同定された、20。種間の配列比較は多くのコンピュータ・プログラムを用いて行なうことができ、そのプログラムは入手可能で、当業者の人々にはよく知られている。好ましくは、種間配列比較はCompareを用いて行なわれ、それは入手可能で当業者には知られたものである。CompareはGCGツールで、window/stringency criterionを使用する配列の対での比較を行なうことを可能にする。Compareは特定の品質の突き合わせが見つかるポイントを含む出力ファイルをつくる。これらのものを構築するには、他のGCGtool、DotPlotを用いる。

0102

また、保存された配列領域の同定は、上記のようにCompareOverWinsとの組合せでQ−Compareから発生したオーソログ配列を用いて、種間配列比較により行なわれる。好ましくは、比較するための配列のリスト、即ち、図4に示したQ−Compareから生成したオーソログ配列はCompareOverWinsアルゴリズムにいれる。CompareOverWinsの中の好ましいステップ段階は図5A、図5B、図5Cに記載されている。好ましくは、種間配列比較は対方式の配列比較で行なわれる。そこで、質問の配列は、中心となる標的配列上のウィンドウ上をスライドする。好ましくは、ウィンドウは約9から約99のヌクレオチドであることである。

0103

標的核酸のウィンドウ配列および上記のようにして得られた、複数の核酸配列の問題配列の間の配列一致は、好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、一番好ましくは少なくとも90%である。最も好ましいしきい値を選ぶ方法は、コンピュータで自動的に、すべてのしきい値が50%から100%の間とし、それからユーザーにより支給される判定基準に基づいてしきい値を選ぶ。一つのこのような基準値はしきい値を正確にnヒットが返るようにする。この場合、nは普通3とする。このプロセスは、上記のように複数の核酸のメンバーである、問題の核酸上のそれぞれの塩基を、マスターの標的配列上のそれぞれの塩基と比較する。得られたスコアマトリックス散布プロットとして構築できた。ある一定の場所での一致の密度を基に、それは、点がない、隔離した点、または点の組が非常に密に集まり、その結果、線のようになる。しかし、線は細く、第1次の配列の一致を示している。代表的なこのような種間配列比較の代表的な散布・プロット図図6描写されている。核酸分子内配列の保存、特にRNAのUTR、は保存された調整要素インジケータであり2次構造を持っているようである。種間配列比較の結果は、MS Excelを用いて分析可能で、完全に自動化された方法により、目で見得る基本的なツールを用いて行い、この方法は当業者の間でよくしられている。

0104

図1において、核酸標的のヌクレオチド配列および分類学的異種、好ましくははオーソログを通じて、複数の核酸のヌクレオチド配列の間に保存された少なくとも1ヶの領域が確認され、その保存された領域は二次構造を持つか否か分析する、30。同定され、保存された領域が二次構造を持つか否かを決めることは、当業者に知られている多くの方法で行なうことができる。二次構造の決定は、好ましくは、自己相補性比較、位置合わせおよび共分散分析、二次構造予測あるいはこれらの組合せで行なわれる。

0105

本発明の一つの態様として、二次構造解析は、位置合わせおよび共分散分析で行なわれた。位置合わせおよび共分散分析のための、多くのプロトコルは、当業者には知られている。好ましくは、位置合わせはClustalWを用いて行なわれ、それは当業者の人々にとっては入手可能かつよく知られている。ClustalWは複数配列位置合わせのための方法であり、GCGの一部ではないが、現存のGCGツール・セットの延長として加えることができ、局部的な配列に用いられる。ClustalWは、インターネットを通じて、例えば
http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/Options/clustalw.html.
からアクセスできる。ClustalWはまた、Thompsonら、Nuc.AcidsRes.,1994,22,4673−4680の中に記載されており、これは関連により併合されたものである。これらのプロセスは、保存されたUTR領域を早期に同定し、自動的な使用になるようスクリプトしておくことができる。Seqed、UNIXのコマンドライン・インターフェイスは当業者によく知られており、入手可能である。これは、大きな配列から選択した局部的領域を抽出することができる。色々な異なる種からの多くの配列をクラスターし、その後の分析のために位置合わせすることができる。

0106

本発明の一つの態様として、すべての可能な、CompareOverWindows比較による、対方式の出力は集積し、AlignHitsというプログラムを使用して、対照配列と位置合わせをする。このプログラムの作業のダイヤグラム図5Dに示されている。このプログラムは当業者により再生することができる。このプログラムの好ましい目的は、対方式で比較したすべてのヒットを元の基準配列の上に戻そうというものである。CompareOverWindowsおよにAlignHitsと組合せるこの方法は、どのアルゴリズムよりも局部的位置合わせ(20−100塩基以上)を提供している。この局部的位置合わせは、後に述べるように共変化またはRevCompのような日常的なものに見られる構造の場合必要である。このアルゴリズムは位置合わせ配列のfasta fileを書き込む。既述のように、このアルゴリズムは、単一塩基の挿入や削除を訂正しない。このことは、通常アウトプットを他で紹介したClustalWで出力することで実施できる。これをCopareOverWindowsおよびAlignHitsなしに、それ自身でClustalWを使用する場合と区別することが重要である。

0107

共変化は系統発生分析で、一次配列情報を共通二次構造予測に使う場合に用いられるプロセスである。共変化は次の文献に記載されている(これらは関連による併合により記載された)。Gutellら、Comparative Sequence Analysis Of Experiments Performed During Evolution In Ribosomal RNA GroupI Introns,Green,Ed.,Austin:Landes,1996;Gautheretら、Nuc.AcidsRes.,1997,25,1559−1564;Gautheretら、RNA,1995,1,807−814;Londmellら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,1995,92,10555−10559;Gautheret et al.,J.Mol.Biol.,1995,248,27−43;Gutell,Nuc.Acids Res.,1994,22,3502−3517;Gutell,Nuc.Acids Res.,1993,21,3055−3074;Gutell,Nuc.Acids Res.,1993,21,3051−3054;Woese,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,3119−3122;およびWoeseら、Nuc.Acids Res.,1980,8,2275−2293。好ましくは、共分散分析には、共分散ソフトウエアが使われる。好ましくは、共変化、位置合わせからRNA構造の比較分析用の一組のプログラムが使用される。共変化は一次配列情報の系統樹分析を共通二次構造分析予測に使用する。共変化はインターネットを通じて、http://www.mbio.ncsu.edu/RNaseP/info/programs/programs.html.から入手できる。このプログラムの一つのVersionの完全な既述が出版されている。(Brown,J.W.1991 Phylogenetic analysis of RNA structure on the Macintosh computer.CABIOS7:391−393)現在の v4.1で、これは標準変化分析代償的塩基変化および相互情報分析を含むRNA配列位置合わせから、共変化分析の種々のタイプを行なうことができる。このプログラムはよく書かれており、厖大な実例ファイルが付いている。これは、スタンドアロン・プログラムとして集積しHypercardを必要としない(非常に小さい stack versionが含まれている)。このプログラムは、MacOSv7.1以上のどんなMacintoshシステム環境でも動く。より高速機(68040またはPowerPC)の方が、相互情報分析や大きな配列の位置合わせ分析には適当である。

0108

本発明は他の態様では、二次構造分析が二次構造予測によって行なわれる。熱動力パラメーターおよびエネルギー計算をもとにしたRNA二次構造を予測するアルゴリズムが沢山ある。好ましくは、二次構造予測は、M−fold or RNA Structure 2.52を用いて行なわれる。M−foldはインターネットを通じて、例えば、HYPERLINK http://www.ibc.wustl.edu http://www.ibc.wustl.edu-zuker/ma/form2.cgiまたはUNIXプラットホーム・ユースからダウンロードすることができる。GCG packageの一部として入手できる。RNA Structure 2.52はM−foldアルゴリズムのウィンドウ版でインターネットを通じて、例えば、http://128.151.176.70/RNA-structure.htmlからアクセスできる。

0109

本発明の他の態様としては二次構造分析は自己相補性比較により行なわれる。好ましくは、自己相補性比較は、前述の通りCompareを使用しておこなわれる。さらに好ましくは、Compareは従来からのWatson−Crick G−C/C−GまたはA−U/U−A対に加えてG−UまたはU−Gベース対も説明する。ペアリング・マトリックスを拡張するよう修正できる。このように、修正Compareプログラムは一定の配列内では、すべての可能な塩基対の予測を始めている。前述のように、小さい保存された領域、好ましくはUTRはオーソログのシリーズの一次配列比較を基に同定される。修正Compareでは、これらの配列のそれぞれは、自己の逆相補に比較され、図7は代表的な自己相補分析を示している。許容される塩基対には、Watson−Crick
A−U,G−Cペアリングおよび非規定G−Uペアリングがある。すべての入手可能なオーソログの自己相補性プロットおよび最も繰り返しが多いパターンに対する選択は、それぞれ可能性のある重ねられたたコンフィギュレーションになる。図8は代表定なオーバーレイの実例である。これらのオーバーレイは上記のエネルギー関連で強制されたり、最もありそうな二次構造を推論することを含め、追加の制約との関連で使用することができる。

0110

本発明の他の態様としてAlignHitsの出力はRevCompというプログラムで読まれる。このプログラムのブロック・ダイアグラム図53に示されている。このプログラムは、当業者の人々によって再生可能である。このプログラムの好ましい目的はRNA二次構造予測ための塩基対リング・ルールおよびオーソログを使用することである。RNAの二次構造はステムと言われる単一鎖領域および塩基対領域からできている。進化によって保存された構造について研究されているが、オーソログ配列の一定の位置合わせにおける最もあり得るステムは殆どの配列で形成され得た例である。可能性のあるステム形成または塩基対リングのルールは、NMRのような他の方法で決められたステムの塩基対リング分析することにより決定される。RevCompの出力はこの構造を形成できるオーソログ・セット・メンバーのパーセント位置付けられる。このアプローチはパーセントしきい値法を用いるが、ノイズ配列に対して感度が低い。ノイズ配列は本当はオーソログでないか、配列の同一性が高かったので、探している構造の例ではなかったが、AlignHitsの出力に出てしまったものである。与えられた配列のセットに対して、逆相補マトリックスを生成するために、PC上で動かすのには、Visualbasicfor Applications(VBA)およびMicrosoft Excelを用い、それらには非常に類似のアルゴリズムが使われている。

0111

上記の二次構造研究の結果は、位置合わせと共変化、自己補正性分析、例えば、M−foldまたはそれ以上のような二次構造予測が、どのように行なわれたかが、標的核酸および異種の分類学上の種からの複数の核酸中の保存された領域内における、二次構造の同定である、40。同定された代表的な二次構造には、次のものを含むが、それに限定されるものではない、即ち、バルジ、ループ、ステム、ヘアピン、ノットトリプルインタラクトクローバーの葉、またはらせん、あるいはそれらの組合せである。その代わり、新しい二次構造が同定される。

0112

本発明のその他の態様について、保存領域の二次構造が同定された場合、既述のように、二次構造を持つ保存領域のための、少なくとも一つの構造上のモチーフが同定される。これらの構造上のモチーフは上記の同定された二次構造と対応する。例えば、自己相補性による二次構造の分析は、一つのタイプの二次構造を提供し、その場合、M−foldによる分析は、他の二次構造を提供する。二次構造分析で同定された、すべての可能性のある二次構造は、構造モチーフファミリーにより代表される。

0113

異なる分類学上の種からの核酸の二次構造と同様に、標的とする核酸の二次構造が同定されると、上記のように一次のヌクレチド配列よりもさらに核酸は構造をもとに検索することにより同定される。上記のようにして見つかった二次構造類似か同一二次構造をもった付加された核酸は、上記のように、構造上のモチーフに対する記述子要素のファミリーを構成することにより同定され、そして、記述子要素に対応する二次構造を持つ他の核酸を同定する。二次構造を持つどのような、あるいは、すべての核酸の組合せは、データベースの中に集積できる。全体のプロセスは、他の標的とする核酸に対しても繰り返され、複数の異なる二次構造グループを生成し、それがデータベースへ集積できる。このように、分子相互作用部位のデータベースは、このような発明を記述することにより集積できる。

0114

仮定の構造上のモチーフが、二次構造分析から決定された後、構造記述子要素のファミリーが構築される。好ましくは、上記の構造上のモチーフは記述語のファミリーに転換される。代表的な記述子要素は、図9に示されている。当業者は記述語の構造に親しみを持っている。構造記述語は、例えばLaferriereら、Comput.Appl.Biosci.,1994,10,211−212(関連により併合された)に記載されている。記述子要素の異なる構造は、二次構造分析から固定された構造的モチーフのそれぞれに対して構成されている。簡単には、二次構造は図9に示されるように遺伝子テキストのストリングに転換される。新しいモチーフに対しては、更なる生化学的分析、例えば化学的マッピングあるいは突然変異誘発により、構造予測を確認する必要があるだろう。記述語エレメントは、多様な厳密さを持つことが決定されるだろう。

0115

例えば、図9によれば、ステムの一番目の領域を含むH1と名付けられた領域はNNN:NNNと記述することができ、それはG−C、C−G、A−UおよびU−Aを含む、何らかの相補的な塩基対リングを予想させる。H1領域もC−GまたはA−Uなどの塩基対リングしか含まない。さらに、記述語エレメントはゆらぎを許容するよう定義付けることもできる。このように、記述語のエレメントは使用者にとって必要とされる厳密さのレベルを保っていると言うことができる。出願人の発明は、このように、異なる記述語エレメントを含むデータベースを指向している。

0116

構造記述子要素のファミリーが構築された後、構造記述子要素に対応する二次構造をもつ核酸が同定される。好ましくは、構造記述子要素に対応する二次構造をもつ核酸は、少なくとも一つのデータベースを検索して、クラスタリングと分析を行い、オーソログの確認、またはそれらの組合せを行なうことにより同定される。このように、同定された核酸は、記述子要素により定義付けられる二次構造の範囲内に入る二次構造を持っている。このようにして、同定された核酸は、記述子要素の厳密さにより標的核酸と同じか殆ど同じである。

0117

本発明の一つの態様として、構造記述子要素に対応する二次構造を持つ核酸が、少なくとも一つのデータベースを検索することにより同定される。どのような遺伝子データベースも検索することができる。好ましくは、そのデータベースはメッセンジャーRNA内の非翻訳領域を集積したUTRデータベースである。UTRのデータはインターネット経由でftp://area.ba.cnr.it/pub/embnet/database/utr/ を通じてアクセスすることができる。好ましくは、このデータベースは、コンピュータ・プログラムDaniel Gautheretから入手できるモチーフ・検索・ツールであるRnamot。同じモチーフを持っているそれぞれの新しい配列は、パブリックドメインのデータベースから、配列付加を同定しているか質問を受ける。これらの結果は、既述のようにUTRで、オーソログ配列追加というパターンの再発について分析した結果、RNA二次構造のデータベースが構築された。当業者はRnamotをよく知っている。簡単に言えば、Rnamotは図9に示されている中の一つのように、記述語ストリングを取り、可能性のある一致に対してFastaフォーマットのデータベースを検索する。記述語は正確にヌクレオチドと一致するため、非常に特定的で、組み込まれた同義性をもつこともできる。ステムやループの長さも特異なものにすることもできる。一本鎖ループ領域可変長さとすることができる。G−Uペアリングは許容され、ゆらぎパラメーターとして特異なもにすることができる。許容し得るミスマッチとしては、記述語の定義に含ませることもできる。以前の分析に基づき、その生物学的役割が分かっていれば、機能上の重要性をモチーフに割り当てることができる。鉄反応成分のような調節領域として知られているものは、この技術を用いて発見された(後記実施例1参照)。本発明の態様において、原核細胞の分子相互作用部位を持つデータベースが集積され、ヒト配列の検索では繰り返しは好ましいが、逆にヒト配列が見つかったときは捨てている。

0118

本発明の他の態様では、例えば、Rnamotを用いるUTRデータベースを検索することで同定された核酸は、ゲノム内のその場所を決定するためにクラスターされ分析される。Rnamotで提供された結果は、簡単に二次構造を含む配列を同定したが、ゲノム内の配列場所といった指摘はなかった。クラスタリングと分析は後述のように、好ましくClustalWで行なわれる。

0119

本発明の他の実施様態において、前述のようにクラスタリングと分析が行なわれ、上述のようにオーソログが確認される。しかし、上記のようにオーソログが同定されたこととは対照的に、それは一次ヌクレオチド配列を基に単独で同定され、この新しいオーソログの配列は、Rnamotを使用して確認された核酸を用いて同定される。上述のようにオーソログの同定はBlastParseまたはQ−Compareを用いて行なわれる。本発明の態様において、分子相互作用部位を含むデータベースは集積され、ヒトのオーソログを見付けることを繰り返し、反対にヒトオーソログが見つかったら捨てる。

0120

構造記述子要素に対応する二次構造を持つ核酸が同定された後、いくらかまたは全部のヌクレオチド配列が、当業者に知られている標準的なコンパイルプロトコルにより、データベースに収集され得る。一つのデータベースは真核細胞の分子相互作用部位だけ、他のデータベースでは、原核細胞の分子相互作用部位のものだけを集める。

0121

本発明は、特定の生物のRNA内にあり、少なくとも1つ、好ましくはいくつかのRNA中にもある分子相互作用部位を含むオリゴヌクレオチドを指向している。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が選択され、上記分子相互作用部位の二次構造を提供することが決められた。上記標準核酸のヌクレオチド配列よりオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の方が好ましい。反対に複数の異なる種からの核酸のヌクレオチド配列よりヌクレオチド配列の方が好ましい。それは分子相互作用部位を持っている。分子相互作用部位は、分子相互作用部位で結合したとき、少なくとも一つの分子に対する結合部位になり、特定生物体内で、RNAの発現を修飾する。

0122

本発明はまた、分子相互作用部位を含む、オリゴ核酸に向けられており、そのオリゴ核酸は、原核細胞RNAにあり、また少なくとも一つの追加する原核細胞のもあり、そこでは、分子相互作用部位は、それが分子相互作用部位に結合する場合には、少なくとも分子の、結合部位として役立ち、原核細胞RNAの発現を修飾する。追加する生物体はすべて真核生物および原核生物から運ばれ、細胞は選択された生物種のように同じ生物種ではない。オリゴヌクレオキドとその変性物は、当業者によく知られている。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、分子相互作用部位と結合する天然に存在する分子を検出する研究用反応剤として使用できる。本発明のオリゴヌクレオチドは、研究・診断および治療用細胞内で天然に存在する分子相互作用部位と張り合うためのおとりとして使用できる。分子相互作用部位に結合する分子はRNAの発現を増強したり減少させたりして、RNAを修飾する。このオリゴヌクレオチドはまた、農業用、工業用およびその他の用途に使用できる。

0123

本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドが医薬品用に担体を組合せた場合を含む、薬剤組成物を指向している。「医薬品用担体」とは医薬品として受け付け得る溶媒希釈液懸濁剤、その他の医薬品的に不活性なビヒクルで、一つまたはそれ以上の核酸を動物へ送達する。そして、これらのことは、当業者にはよく知られているものである。担体は、液体または固体で、「投与計画方法を心において」、要求されるバルク、コンシステンシー医薬組成物の他の成分を結合したとき送達する。代表的な医薬品用担体には次のものが含まれるが、それに限定されるものではない。例えば、結合剤(例えば、プリゲラチナイズド(pregelanised)・トウモロコシ澱粉ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、フィラー(例えば、ラクトースおよびその他の糖、ミクロクリスタリンセルロースペクチンゼラチン硫酸カルシウムエチルセルロースポリアクレートまたは第二リン酸カルシウムなど)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウムタルクシリカコロダルシリコンジオキサイドステアリン酸、金属ステアリン酸塩水添植物油コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム酢酸トリムなど)、崩壊剤(例えば、硫酸ラウリルナトリウム塩など)。

0124

本発明は、in silicoで設計合成する低分子のコンビナトリアルライブラリーを用いる、計算法を指向している。ライブラリーメンバーは一般的にin silicoで生成する。本発明はまた、in silicoでライブラリーメンバーを生成、生じた情報を後からアクセスして使用するために、関連データベースへ入れる方法である。本明細書のこの目的のため、in silicoはコンピュータ・メモリー内、即ちシリコンその他のチップ創出すること。特記しなり限り、in silicoは仮想を意味する。

0125

本発明の方法により、おのおのの化合物またはライブラリーメンバーは、フラグメントと言われる、その成分または構成成分に区切られる。このように、生成された化合物は構成成分であるフラグメントを含み、その結果それぞれのフラグメントの分子式の合計は、それを足し合わせれば、全体として生成した化合物の分子式になる。この解体は化学的直感により色々な方法で行なえる。このようにして、多くの成分とのフラグメントは同定され、そのおのおのは、広範囲な化合物を生成するために入手可能な反応剤や反応を生み出すのに貢献する。さらに、それぞれのフラグメントは、少なくとも一つの反応剤と適合する、その化合物は、in silicoで発生したもので、その要求されるフラグメントを、その化合物に入れるために使用される必要な化学薬品である。化合物の解体は、反応剤の合成の容易さ、購入可能性、あるいはその組合せをもとにしている。それぞれのフラグメントおよび反応剤は関連データベースの中に蓄積され、データベース内の特徴を確認するため、記録されている。フラグメントは色々な出発原料または反応計画から入手可能になっている。従って、ライブラリーが生成したとき、それは結果として、データベースを作ることになり、このライブラリーを作るのに使用されたフラグメントは、データベース内に貯えられ対応する反応剤および反応条件のセットを使用する。他のライブラリーが生成される時には、データベース内に貯えられているフラグメント情報は、化合物の新しいライブラリーの生成に使用可能になる。同様に、第3のライブラリーが生成されると、もっと多くの量のフラグメント、反応剤・反応情報がデータベース内で使用可能になる。このようにして、本発明の方法は、化合物のライブラリーを作るのに伴い、データベースを生じるダイナミックな方法であることを示している。初めのライブラリーの生成は、フラグメント、反応剤および変換が望ましいライブラリーには必要である。しかし、データベースが成長すると、多くのフラグメント・反応剤がデータベース内で使用可能となり、そのことが、それ以後のライブラリーの生成を簡単にし、より日常的な組合せ合成努力が行なえ、ずっと容易に効率的に行えるようになる。

0126

データベース内に記録されたフラグメントは、同定用特性を使って定義付けられる。フラグメントを定義付ける同定特性としては、構造上の表示(二次元または三次元ファイルのように)、名称、分子量、分子式および付着ポイントまたはノード(フラグメントがin silicoで生成した化合物の他のフラグメントは付着または結合する時の部位を示す)が含まれる。この発明を記載する目的から二次元表示が使用され、さらには、特定の実在化学品とは関係ない記号表示が使用されることにより簡素化される。ここに用いられる記号表示は、単にいかにフラグメントが、本発明の更なる方法まで追跡できるかを示している。他の定義付け用特性がデータベースに付けられることもある。追跡したい特性は、データベース内に含まれ、生物学的データ化学反応速度またはその他の物理的または化学的性質である。さらに、フラグメントはまた反応剤を変えることにより生じ、このような修飾は反応剤の構造を変える変化に基づいてデータベースに加えられる。同定特性のあるものは、どのフラグメントについても、対応する反応剤に対しては共通である。このようにして生成された関連フラグメントは、関連データベース内に貯えられる。

0127

反応剤を定義する同定特性には、構造特性、名称、分子量、分子式、および例えば、供給者のような出典、あるいはユーザーにより定義付けされるようなユニークなものがある。反応剤の市販のソースの場合には、カタログナンバーウェブリンクも含む。反応剤および関連フラグメントに関して、同定特性間には共通の性質が存在することがある。

0128

さらに、本発明に関し、ある化合物が色々の変換の結果となる場合がある。変換は、本発明では、化学合成に起因する名称である。変換はフラグメントと反応剤の間の1:1結合である。従って、それぞれの変換は化合物に導入したときの対応するフラグメントへの特異的な反応剤の変換を示している。in silicoに生成される化合物はその成分であるフラグメントに分けられ、対応する反応剤が同定された時、各々のフラグメントは変換を記載するために1:1の関係で対応する反応剤に結びついている。このように、本発明によれば、変換はフラグメントのソースと見られており、これによりフラグメントを特定の合成法や反応に結び付ける。本発明の方法で、変換の記述は、また、使用されることにより反応に影響を与える、必要な温度、圧力、触媒、活性化剤、溶媒、その他添加物等の形質変換によって表示されるあらゆる補助反応剤や条件を含む。

0129

フラグメントと反応剤の1:1の各組合せで異なる変換が起こる場合がある。従って、各々の変換は、独自のものである。本発明は、それらのフラグメントがライブラリーの化合物の中に導入される反応または変換に関連したフラグメントの追跡を許容している。このように、データベースには化合物がその成分フラグメントに関連して生成されることを記載しているだけでなく、これらの化合物を生産する合成経路、即ち、これらのライブラリー化合物を生成する変換に関連して化合物が生成されることを記載している。この方法で、本発明のユーザーは、必要とするフラグメントを単に選択することで、仮想の化合物ライブラリーを生成することができる。逆に、ユーザーも化合物の実際の合成に必要な化学的経路を選択することで、化合物を生成することができる。これは、目的とする化合物の生成に関連して適切な変換を選択することにより実施される。これに、ユーザーは、目的とする化合物の生成または合成を許容すると期待されるそれらの変換を選択することを支援する直感またはin silico専門家システムを用いる。In silicoで生成される形転換の各々は関連データベースに蓄積され、同定特性に関連して記載する。変換を定義付ける同定特性には、フラグメント、反応剤、補助反応剤、または反応剤が化合物に組み入れられるフラグメントへ転換するのに影響を与えるに必要な条件が含まれる。

0130

例えば、図14における、本発明の方法による化合物CIのin silicoでの生成について考察する。図14に示すように、CIの分割(分子式はC12
H18N2 O5 S1 )で、その成分フラグメントはFi(分子式、H2 NO)、Fii(分子式、C5 H9 NO)、Fiii (分子式、C7 H7 O3 S)で示される。Fiはまた、ヒドロキシルアミンの部分であり、固相支持体とつながっている。即ちP−O−NH、ここでPは固相支持体。それぞれのフラグメントの分子式の合計は、化合物CIの分子式になる。

0131

図15に示すようにFi、FiiおよびFiiiのそれぞれは関連データベースに蓄積され、構造表示(おそらく、二次元または三次元)、識別名または名称、分子式および付着ポイントまたは化合物CI内で他のフラグメントに結合するフラグメントの部位を意味するノードを含む同定特性に関連して記載される。分子量などそれ以外の情報もデータベースのフラグメントと関連している。

0132

図16に示すように対応する反応剤(Ri、RiiおよびRiii)も又関連データベースに蓄積され同定特性に関連して記載される。反応剤を定義するために使用される同定特性には、構造表示、識別語または名前および分子式がある。フラグメントの場合と同様、分子量のような関連情報および情報源(商業的ソースかユーザー供給者か、在庫量、特別な取扱い等)も個別反応剤との関係でデータベースに蓄積しておく。

0133

次に、化合物CIのin silico生成に関連する各々の変換もまた、関連データベースに蓄積される。図17に示すように変換Tiは反応剤RiとFiとを1:1関係で結び、TiiはRiiとFiiとを1:1関係で結び、TiiiはRiiiとTiiiとを1:1関係で結ぶ。また、それぞれの変換に関連して、必要な反応条件、従って、変換Tiは反応条件αと関連し、Tiiは反応条件βに関連し、Tiiiは反応条件γに関連している。変換Tiiiの場合、反応剤Riiiはおそらくヒドロキシルアミンで、固形支持体へ付着し、その結果、フラグメントFiiiはヒドロキシルアミンの部分で、固体支持体へ付着していることを表す。

0134

それぞれのフラグメントは到着するか、あるいは独自の対応する反応剤で生成される間、本発明はまた、2またはそれ以上の反応剤を経て生成される、共通のフラグメントを包み込み、その結果、2またはそれ以上の変換がその同じフラグメントへリードする。図18に示すように、共通のフラグメントCH3 −CH2
−C(=O)−が変換Aを経て到着し、それは反応剤X(酸クロライド)、CH
3 −CH2 −C(=O)Clを用いる。共通のフラグメントはin silicoで変換Bを経由して、生成された化合物へ導入される。そこでは反応剤Y(酸無水物)、CH3 −CH2 −C(=O)−O−C(=O)−CH2 −CH3 を用いる。従って、本発明のこの方法により、共通のフラグメントは、2またはそれ以上の異なる反応剤を経由して、従って2またはそれ以上の明確な変換をへて、その化合物に導入された。

0135

また、1つの共通の反応剤が、2またはそれ以上の変換を行なって、2またはそれ以上の異なるフラグメントになる。次に異なる条件に関連する、2またはそれ以上の変換を提示する。例えば、図19Aに示すように共通の反応剤Z、CH
3 −CH2 −NH2 は、アルケン・フラグメントをその化合物にSchiff塩基形成条件下で導入する。これが変換Xである。しかし、同じ共通反応剤Zもまた、アミドフラグメントを、別の一組の条件を使い、その化合物に導入するために用いることができ、変換Yを構成する。このように、共通の反応剤が2またはそれ以上の異なるフラグメントをin silicoで生成されている最終化合物に導入することができ、2またはそれ以上の変換が、それぞれの変換に関連した条件下で起こる。

0136

さらに、一つのフラグメントが、一つの化合物に導入されれば、それがさらに修飾され、その形成される化合物内で、他の化学変化に影響を与えることなく、他のフラグメントに転換することがある。一例が図19Bに示されており、共通の反応剤Z 、CH3 −CH2 −C(=O)CH2 −Clについて考察する。共通の反応剤Z は、次の構造CH3 −CH2 −C(=O)−CH2 −を持つフラグメントに対応する。共通の反応剤Z は、還元脱水に適した条件下で、変換X‘に代表されるアルケン・フラグメントの最終化合物への導入に使用することもできる。しかしながら、共通反応剤Z は還元に適した条件Fで、ヒドロキシアルキルフラグメントを最終化合物に導入させることにも使用できる。これを変換Yとする。

0137

本発明は、記号表現の関連で、より一般的に記述してもよい。記号表現は本発明の方法説明に用いた。その理由は、このような表現は、特別の化学に限定されるものではないからである。記号表現は単に複数の化学薬品を用いた本発明の使用方法を示しているにすぎない。本発明を記述で提示するのに用いる、それぞれの記号は一つの化合物または複数の化合物を示してもよい。その理由は、本発明は一つの化合物を追跡するのに限らず、生成できる多くの化合物を追跡するのに使用し得る。

0138

図20は、化合物CIを得るフラグメントの付加を記号で示した。このフラグメントは、構造Fi、FiiおよびFiiiを持ち、それらは順次付加され、化合物CI を得る。構造Fi、FiiおよびFiiiは、化合物CI を構成するフラグメントの記号表示である。これらのフラグメントは、構造表示、名称、分子式および付着部位またはノードを含む各フラグメントの同定特性と共に、関連データバンクに蓄積することができる。化合物CIおよびCI の目視検査によると、化学化合物CIと化合物CI の記号表示との間は、フラグメントの化学構造とフラグメントの記号構造の間と同様、共通の性質があることが分かる。

0139

記号表示された反応剤の表が図21に示されている。反応剤R1からR10はその構造、名称、分子式、分子量およびソースについて記載され、それ以外の反応剤と関わればいいと思われる情報もまた記載される。R3およびR4は別の反応剤であるが同じフラグメントを1つの化合物に導入するのに用いてもよい。それは使用する反応条件に依存し、反応剤R3は1セットの条件による変換、反応剤R4は異なる反応条件のセットによる他の変換に用いられる。同様に反応剤R5は2つの反応剤または組成物で、構成される。それはおそらく(R)−および(S)立方異性体、DおよびL−異性体、あるいは2つの全く異なる反応剤である。R5は2つの反応剤または組成物も混合物であり、本発明の方法を2つまたはそれ以上の反応剤の混合物を用いて実施したことがある当業者により理解される。ライブラリーを構成するのに用いられる代表的な反応剤の混合物は混合物を構成する個別反応剤を4,5またはそれ以上もってもよい。

0140

図22は記号表示されたフラグメントを表で示したものである。フラグメントF1からF8は、構造表示、名称、分子量、分子式、および付着部位またはノードを含む同定特性と共に関連データバンクに蓄積される。この表では、図21で記号表示された反応剤を用いて、ライブラリー化合物に導入する各種フラグメントの記号表現を記載する。このようにしてフラグメントF1は反応剤R1を用いて化合物に導入することができる。フラグメントF1でX付着部位の識別子で、このことはXはF1が化合物の他のフラグメントに結合するときの部位である。同様にフラグメントF2は反応剤R2を用いて、化合物に導入(そのX部位に付着)されてもよい。

0141

しかしフラグメントF3は反応剤R3かR4を用いて化合物に導入することができる。このことは使用する反応剤の選択が許容されており、このことは他のフラグメントをその化合物に導入することに関して、化学の適合への考慮も許容されている。次いで、図21においてフラグメントF4(フラグメントの混合物)を反応剤の混合物である反応剤R5を用いても導入することができる。

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