図面 (/)

技術 G2期細胞周期停止の阻害、およびDNA損傷剤に対する細胞感作のための組成物および方法

出願人 株式会社キャンバス
発明者 菅沼正司河邊拓己
出願日 2000年9月21日 (20年9ヶ月経過) 出願番号 2001-525330
公開日 2003年6月10日 (18年1ヶ月経過) 公開番号 2003-518368
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 糖類化合物 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 酵素、微生物を含む測定、試験 動物,微生物物質含有医薬 生物学的材料の調査,分析 ペプチド又は蛋白質 非環式または炭素環式化合物含有医薬 特有な方法による材料の調査、分析 微生物、その培養処理 化合物または医薬の治療活性 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 酵素・酵素の調製
主要キーワード 手仕事 非カルボン酸 ビニログ 構造群 SHF 透過作用 模造物 アルキルアラニン
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2003年6月10日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (12)

課題・解決手段

本発明はChk1および/またはChk2キナーゼ阻害するための組成物および方法を提供する。また特に哺乳類、例えばヒト細胞において、G2期細胞停止チェックポイントを阻害するための組成物および方法も提供される。本発明の組成物および方法はまた癌などの細胞増殖障害治療するために使用される。特に、本発明はG1チェックポイントが損なわれた癌細胞を、DNA損傷性の薬剤および処置に対して選択的に感作するための方法を提供する。またChk1および/またはChk2/Cds1キナーゼなどの、G2期細胞周期停止チェックポイントに関与している酵素相互作用する、例えば阻害することのできる化合物スクリーニング法も提供する。

概要

背景

概要

本発明はChk1および/またはChk2キナーゼ阻害するための組成物および方法を提供する。また特に哺乳類、例えばヒト細胞において、G2期細胞停止チェックポイントを阻害するための組成物および方法も提供される。本発明の組成物および方法はまた癌などの細胞増殖障害治療するために使用される。特に、本発明はG1チェックポイントが損なわれた癌細胞を、DNA損傷性の薬剤および処置に対して選択的に感作するための方法を提供する。またChk1および/またはChk2/Cds1キナーゼなどの、G2期細胞周期停止チェックポイントに関与している酵素相互作用する、例えば阻害することのできる化合物スクリーニング法も提供する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
2件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

単離または組換えポリペプチドであって、アミノ酸配列:X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11を含んでおり、X1はL、F、W、M、R、I、V、Y、K、また無であり、X2はY、F、A、W、S、またはTであり、X3はいずれかのアミノ酸であり、X4はいずれかのアミノ酸であり、X5はいずれかのアミノ酸であり、X6はS、A、N、H、またはPであり、X7はいずれかのアミノ酸であり、X8はいずれかのアミノ酸であり、X9はいずれかのアミノ酸または無であり、X10はN、G、L、S、M、P、N、A、または無であり、X11はLまたは無であり、細胞投与されるか、または細胞において発現された場合にG2期細胞周期停止チェックポイント破壊するポリペプチド

請求項2

X1がL、F、W、M、R、または無である請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項3

X1がL、F、またはWである請求項2の単離または組換えポリペプチド。

請求項4

X2がY、F、Aである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項5

X3がR、T、S、H、D、G、A、L、K、A、N、Q、またはPである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項6

X3がR、T、S、H、D、G、A、またはLである請求項5の単離または組換えポリペプチド。

請求項7

X3がR、T、S、またはHである請求項6の単離または組換えポリペプチド。

請求項8

X4がS、T、G、A、L、R、I、M、V、Pである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項9

X4がS、T、G、A、L、Rである請求項8の単離または組換えポリペプチド。

請求項10

X4がSである請求項9の単離または組換えポリペプチド。

請求項11

X5がP、A、G、S、またはTである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項12

X5がPである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項13

X6がS、N、H、P、A、G、またはTである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項14

X6がS、N、またはHである請求項13の単離または組換えポリペプチド。

請求項15

X6がSである請求項14の単離または組換えポリペプチド。

請求項16

X7がM、F、Y、D、E、N、Q、H、G、I、L、V、A、P、N、またはWである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項17

X7がM、F、Y、D、E、N、Q、またはHである請求項16の単離または組換えポリペプチド。

請求項18

X7がM、F、Y、Q、またはHである請求項17の単離または組換えポリペプチド。

請求項19

X8がP、F、Y、W、L、G、M、D、E、N、Q、H、I、V、A、またはPである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項20

X8がP、F、Y、またはWである請求項19の単離または組換えポリペプチド。

請求項21

X8がYである請求項20の単離または組換えポリペプチド。

請求項22

X9がE、G、L、S、M、P、N、D、A、T、P、または無である請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項23

X10が無である請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項24

X11が無である請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項25

X2がYであり、X5がPであり、さらにX10がNである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項26

X3がRであり、X8がPであり、さらにX11がLである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項27

X4がSであり、X5がPであり、X6がSであり、X9がEであり、X10がNであり、さらにX11がLである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項28

アミノ酸配列がYGGPGGGGNである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項29

アミノ酸配列がRYSLPPELSNMである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項30

アミノ酸配列がLARSASMPEALである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項31

アミノ酸配列がLYRSPSMPENLである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項32

アミノ酸配列がLYRSPAMPENLである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項33

アミノ酸配列がWYRSPSFYENLである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項34

アミノ酸配列がWYRSPSYYENLである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項35

アミノ酸配列がWYRSPSYYである請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項36

アミノ酸配列がL Y R S P S Y P E N L、L Y R S P S Y F E N L、L Y R S P S Y Y E N L、またはL Y R S P S Y W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項37

アミノ酸配列がL Y R S P S N P E N L、L Y R S P S N F E N L、L Y R S P S N Y E N L、またはL Y R S P S N W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項38

アミノ酸配列がL Y R S P S H P E N L、L Y R S P S H F E N L、L Y R S P S H Y E N L、L Y R S P S H W E N L、L Y S S P S M P E N L、L Y S S P S M F E N L、L Y S S P S M Y E N L、L Y S S P S M W E N L、L Y S S P S F P E N L、L Y S S P S F P E N L、L Y S S P S F F E N L、L Y S S P S F Y E N L、L Y S S P S F W E N L、L Y S S P S Y P E N L、L Y S S P S Y F E N L、L Y S S P S Y Y E N L、またはL Y S S P S Y W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項39

アミノ酸配列がL Y S S P S Q P E N L、L Y S S P S Q W E N L、L Y S S P S H P E N L、L Y S S P S H F E N L、L Y S S P S H Y E N L、L Y S S P S H W E N L、L Y T S P S M P E N L、L Y T S P S M F E N L、L Y T S P S M Y E N L、L Y T S P S M W E N L、L Y T S P S F P E N L、L Y T S P S F F E N L、L Y T S P S F Y E N L、L Y T S P S F W E N L、L Y T S P S Y P E N L、L Y T S P S Y F E N L、L Y T S P S Y Y E N L、またはLY T S P S Y W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項40

アミノ酸配列がL Y T S P S N P E N L、L Y T S P S N F E N L、L Y T S P S N Y E N L、またはL Y T S P S N W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項41

アミノ酸配列がL Y T S P S H P E N L、L Y T S P S H F E N L、L Y T S P S H Y E N L、またはL Y T S P S H W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項42

アミノ酸配列がL Y H S P S Y P E N L、L Y H S P S Y F E N L、L Y H S P S Y Y E N L、またはL Y H S P S Y W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項43

アミノ酸配列がL F T S P S Y P E N L、L F T S P S Y F E N L、L F T S P S Y Y E N L、またはL F T S P S Y W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項44

アミノ酸配列がF Y S S P S H P E N L、F Y S S P S H F E N L、F Y S S P S H Y E N L、F Y S S P S H W E N L、F Y T S P S M P E N L、F Y T S P S M F E N L、F Y T S P S M Y E N L、F Y T S P S M W E N L、F Y T S P S F P E N L、F Y T S P S F F E N L、F Y T S P S F Y E N L、F Y T S P S F W E N L、F Y T S P S Y P E N L、F Y T S P S Y F E N L、F Y T S P S Y Y E N L、またはF Y T S P S Y W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項45

アミノ酸配列がW Y R S P S M P E N L、W Y R S P S M F E N L、W Y R S P S M Y E N L、W Y R S P S M W E N L、W Y R S P S F P E N L、W Y R S P S F F E N L、W Y R S P S F Y E N L、W Y R S P S F W E N L、W Y R S P S Y P E N L、W Y R S P S Y F E N L、W Y R S P S Y Y E N L、またはW Y R S P S Y W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項46

アミノ酸配列がW Y T S P S M P E N L、W Y T S P S M F E N L、W Y T S P S M Y E N L、W Y T S P S M W E N L、W Y T S P S F P E N L、W Y T S P S F F E N L、W Y T S P S F Y E N L、W Y T S P S F W E N L、W Y T S P S Y P E N L、W Y T S P S Y F E N L、W Y T S P S Y Y E N L、またはW Y T S P S Y W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項47

アミノ酸配列がW Y T S P S H P E N L、W Y T S P S H F E N L、W Y T S P S H Y E N L、またはW Y T S P S H W E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項48

アミノ酸配列がL K R S P S M P E N L、L Y I S P S M P E N L、またはL Y R S P S M V E N Lを含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項49

細胞が哺乳動物細胞である請求項1の単または組換えポリペプチド。

請求項50

細胞がヒト細胞である請求項49の単離または組換えポリペプチド。

請求項51

さらに細胞膜透過作用物を含む請求項1の単離または組換えポリペプチド。

請求項52

細胞膜透過作用物がポリペプチドを含む請求項51の単離または組換えポリペプチド。

請求項53

ポリペプチドがTATタンパク質導入ドメインを含む請求項52の単離または組換えポリペプチド。

請求項54

TATタンパク質導入ドメインがYGRKKRRQRRRである請求項53の単離または組換えポリペプチド。

請求項55

細胞膜透過作用物が脂質を含む請求項51の単離または組換えポリペプチド。

請求項56

細胞膜透過作用物がリポソームを含む請求項55の単離または組換えポリペプチド。

請求項57

請求項1に示されたようなポリペプチドを含む第1のドメインと、細胞膜透過作用物を含む第2のドメインとを含むキメラポリペプチドであって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドであるキメラポリペプチド。

請求項58

ポリペプチドが組換え融合タンパク質である請求項57のキメラポリペプチド。

請求項59

請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドをコードしている単離または組換え核酸であって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドである核酸

請求項60

請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる発現ベクターであって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドである発現ベクター。

請求項61

請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞であって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドである細胞。

請求項62

細胞が細菌、酵母昆虫、または哺乳動物細胞である請求項61の細胞。

請求項63

薬剤組成物であって、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドであって、細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドと、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドをコードしている核酸であって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドである核酸と、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる発現ベクターであって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドである発現ベクターと、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる細胞であって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドである細胞;および、薬剤学的許容される賦形剤を含んでいる薬剤組成物。

請求項64

リポソームを含む請求項63の薬剤組成物。

請求項65

Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼの活性阻害する方法であって、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドか、または請求項63に示されたような薬剤学的組成物を、Chk1またはChk2キナーゼの活性を阻害するに充分な量で前記キナーゼに接触させることを含む方法。

請求項66

細胞のG2期細胞周期停止チェックポイントを破壊する方法であって、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドか、または請求項63に示されたような薬剤組成物を、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するに充分な量で細胞に接触させることを含む方法。

請求項67

DNA損傷剤に対して細胞を感作する方法であって、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドか、また請求項63に示されたような薬剤組成物を、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するに充分な量で細胞に接触させ、それにより細胞をDNA損傷剤に対して感作する方法。

請求項68

細胞がヒト細胞である請求項67の方法。

請求項69

細胞が癌細胞である請求項67の方法。

請求項70

傷害を受けたG1期細胞周期停止チェックポイントをもつ細胞をDNA損傷剤に対し選択的に感作する方法であって、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドか、または請求項63に示されたような薬剤組成物を、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するに充分な量で細胞に接触させ、それにより細胞をDNA損傷剤に対して感作する方法。

請求項71

細胞が癌細胞である請求項70の方法。

請求項72

個体中の細胞においてアポトーシス誘導する方法であって、請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドか、または請求項63に示されたような薬剤組成物を、癌細胞においてG2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するに充分な量で投与し、それにより癌細胞をDNA損傷剤に対して感作すること、およびDNA損傷剤を投与することを含む方法。

請求項73

DNA損傷剤が5-フルオロウラシル(5-FU)、リベカマシンアドリアマイシンブレオマイシンシスプラチン温熱療法UV照射、またはガンマ照射である請求項72の方法。

請求項74

Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼの活性を調整することができる化合物スクリーニングする方法であって、以下のステップ(a)検査化合物を用意すること;(b)Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼを用意すること;(c)請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドであって、Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼと結合するポリペプチドを用意すること;および(d)検査化合物をキナーゼおよびポリペプチドと接触させ、キナーゼに対するポリペプチドの結合を阻害する検査化合物の能力を測定することを含む方法。

請求項75

Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼの活性を調整することができる化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ(a)検査化合物を用意すること;(b)Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼを用意すること;(c)請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドであって、Chk1またはChk2キナーゼによりリン酸化されるポリペプチドを用意すること;および(d)検査化合物をキナーゼおよびポリペプチドと接触させ、キナーゼによるポリペプチドのリン酸化を阻害または消去する検査化合物の能力を測定することを含む方法。

請求項76

ヒトCdc25Cを用意することをさらに含む請求項75の方法。

請求項77

でステップ(c)のポリペプチドがヒトCdc25Cのアミノ酸残基セリン216を含む請求項75の方法。

請求項78

ポリペプチドがヒトCdc25Cのおよびアミノ酸残基200からおよそアミノ酸残基250までを含むペプチドである請求項77の方法。

請求項79

ステップ(c)のポリペプチドがグルタチオン-S-トランスフェラーゼをさらに含む請求項74または請求項75の方法。

請求項80

ステップ(c)のポリペプチドが固定化されている請求項74または請求項75の方法。

請求項81

G2期細胞周期停止チェックポイントを特異的に阻害または消去することができる化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ(a)検査化合物および請求項1または請求項57に示されたようなポリペプチドを用意すること;(b)G1期チェックポイントが傷害を受けた細胞を用意すること;(c)ステップ(b)の細胞を、検査化合物またはステップ(a)のポリペプチド、およびDNA損傷処理またはM期チェックポイントアクティベーターと接触させること;および(d)検査化合物がG2期細胞周期停止チェックポイントを阻害または消去したかどうかを決定するため、ステップ(c)の接触の後に細胞中DNA量を測定し、その際にステップ(a)のポリペプチドをG2期細胞周期停止チェックポイント阻害の正の対照として使用すること、を含む方法。

請求項82

DNAの量がヨウ化プロピジウムおよびFACS分析を用いて測定される請求項81の方法。

請求項83

DNAの量がステップ(c)の接触の後、約10〜約72時間後に測定される請求項81の方法。

請求項84

細胞がM期チェックポイントアクティベーターおよび検査化合物またはステップ(a)のポリペプチドと接触され、細胞をM期アクティベーターと接触させた後に細胞周期のM期チェックポイントでの停止を阻害または消去しなかった検査化合物を、G2期細胞周期チェックポイントの特異阻害剤とする請求項81の方法。

請求項85

M期チェックポイントアクティベーターがコルヒチンまたはノコダゾールである請求項84の方法。

請求項86

DNA損傷処理が5-フルオロウラシル(5-FU)、リベカマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、温熱療法、UV照射、またはガンマ照射である請求項81の方法。

0001

本発明は全般的医学および癌治療の分野に関するものである。特に、本発明は新規な遺伝子およびポリペプチドと、それらの作成および使用法を提供する。具体的には、本発明の組成物および方法は癌などの細胞増殖障害治療するために用いられる。特に、本発明はG1チェックポイント傷害を受けた癌細胞を、DNA損傷性の薬剤および処置に対し、選択的に感作する為の方法を提供する。また、例えばChk1および/またはChk2/Cds1キナーゼといった、G2細胞周期停止チェックポイントに深く関与している酵素相互作用する、例えば酵素を阻害することのできる化合物スクリーニング方法も提供される。

0002

正常な細胞に影響を及ぼすことなく、癌細胞の増殖を阻害または殺すことができる抗癌剤を開発することが絶え間なく試みられている。研究者はそのような新規な抗癌剤を創薬するための糸口を見つけるため、癌細胞の遺伝的突然変異焦点を合わせてきた。

0003

多くの癌細胞はG1期細胞周期停止チェックポイントに深く関与している遺伝子に突然変異を有している。そのような遺伝子は傷害を受けた腫瘍抑制遺伝子、例えばp53、Rb、p16INK4、およびp19ARFである。あるいは、そのような突然変異は、例えばMDM-2およびcyclin Dのような発癌遺伝子発現を引き起こす。これらに加え、増殖因子過剰発現によって過剰な増殖因子シグナリングが引き起こされる場合もある。このような機能獲得性の突然変異とともに、増殖因子受容体または下流のシグナル変換分子が、G1チェックポイントを無効にすることにより細胞のトランスフォーメーションを引き起こすこともある。対照的に、ほとんどの癌はG2期細胞周期停止チェックポイントを破壊していない。したがって、G2チェックポイントは普通、傷害を受けたG1チェックポイントと共に癌細胞に保持されている。

0004

もしG2チェックポイントを選択的に破壊することができるなら、そのような損傷の修復なしにG1およびG2を経由した細胞はアポトーシス誘導することから、傷害を受けたG1チェックポイントをもつ癌細胞は、正常な細胞(G1が無傷)に比べ、DNA損傷処理に対してさらに感受性となる。

0005

DNA損傷後の細胞周期G2期停止を促進する機構は、酵母からヒトまでの種において保存されている。損傷されたDNAが存在する場合は、Cdc2キナーゼ上のトレオニン-14およびチロシン-15残基に対する阻害性リン酸化のため、Cdc2/サイクリンBキナーゼは不活性のままである。有糸分裂の開始時には、二重のホスファターゼCdc25キナーゼがこれらの阻害性のリン酸塩を取り除き、それによりCdc2/サイクリンBキナーゼを活性化する。

0006

分裂酵母では、プロテインキナーゼChk1が、損傷DNAに反応した細胞周期停止に必要とされる。Chk1キナーゼはいくつかのrad遺伝子産物の下流で作用し、DNA損傷によりリン酸化される。出芽酵母のキナーゼRad53と、分裂酵母のCds1とは、未複製DNAからのシグナルを伝達することが知られている。Chk1およびCds1の双方の除去は、DNA損傷により誘導されるG2期停止の破壊に至ることから、Chk1とCds1の間には何らかの重複性がある。興味深いことには、Chk1およびCds1の双方はCdc25キナーゼをリン酸化し、Rad24のCdc25への結合を促進し、そのことがCdc25を細胞質ゾルへ隔離し、Cdc2/サイクリンBの活性化を妨げる。したがって、Cdc25はこれらのキナーゼの共通のターゲットであり、おそらくはG2チェックポイントにおいて欠くことのできない因子であると考えられる。

0007

ヒトでは、分裂酵母Chk1のヒトホモログhChk1と、出芽酵母Rad53および分裂酵母Cds1のヒトホモログChk2/HuCds1の双方がDNA損傷に反応し、重要な調節部位であるセリン-216においてCdc25Cをリン酸化する。このリン酸化は、分裂酵母のRad24およびRad25のヒトホモログである低分子酸タンパク質14-3-3の結合部位をもたらす(Lopez-Girona(1999)Nature 397:172-175)。このリン酸化の調節的役割は、Cdc25C上のセリン-216のアラニンへの置換が、ヒト細胞におけるG2期細胞周期停止を破壊するという事実により明確に示された(Peng(1997)Science 277:1501-1505)。

0008

本発明は、良性および悪性腫瘍細胞に関連するような細胞増殖障害を治療するために使用可能な核酸およびポリペプチドを提供する。本発明はいかなる特定の機構にも限定されないが、本発明のポリペプチドはG2期細胞周期停止チェックポイントを阻害することにより機能することができる。したがって本発明はまた、傷害を受けたG1期細胞周期停止チェックポイントをもつ細胞、例えば癌細胞を、DNA損傷性の薬剤に対して選択的に感作するための組成物および方法を提供する。

0009

本発明は、単離または組換えポリペプチドであって、アミノ酸配列;X1X2X3X4
X5X6X7X8X9X10X11、を含んでおり、X1はL、F、W、M、R、I、V、Y、Kまた無であり、X2はY、F、A、W、SまたはTであり、X3はいずれかのアミノ酸であり、X4はいずれかのアミノ酸であり、X5はいずれかのアミノ酸であり、X6はS、A、N、HまたはPであり、X7はいずれかのアミノ酸であり、X8はいずれかのアミノ酸であり、X9はいずれかのアミノ酸または無であり、X10はN、G、L、S、M、P、N、Aまたは無であり、X11はLまたは無であり、細胞に投与されるかまたは細胞において発現された場合にG2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドを提供する。

0010

別の態様においては、本発明の単離または組換えポリペプチドについては:X1
はL、F、W、M、Rまたは無であるか、またはX1はL、FまたはWであり;X2はY、F、Aであり;X3はR、T、S、H、D、G、A、L、K、A、N、QまたはPであるか、またはX3
はR、T、S、H、D、G、AまたはLであるか、またはX3はR、T、SまたはHであり;X4
はS、T、G、A、L、R、I、M、V、Pであるか、またはX4はS、T、G、A、L、Rであるか、またはX4はSであり;X5はP、A、G、SまたはTであるか、またはX5はPであり;X6はS、N、H、P、A、GまたはTであるか、またはX6はS、NまたはHであるか、またはX6はSであり;X7はM、F、Y、D、E、N、Q、H、G、I、L、V、A、P、NまたはWであるか、またはX7はM、F、Y、D、E、N、QまたはHであるか、またはX7はM、F、Y、QまたはHであり;X8はP、F、Y、W、L、G、M、D、E、N、Q、H、I、V、AまたはPであるか、またはX8はP、F、YまたはWであるか、またはX8はYであり;X9はE、G、L、S、M、P、N、D、A、T、Pまたは無であり;X10は無であり;X11は無である。

0011

一つの態様において本発明は、X2がYであり、X5がPであり、X10がNであるポリペプチドを提供する。一つの態様において本発明は、X3がRであり、X8がPであり、X11がLであるポリペプチドを提供する。一つの態様において本発明は、X4がSであり、X5がPであり、X6がSであり、X9がEであり、X10がNであり、さらにX11がLであるポリペプチドを提供する。

0012

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がYGGPGGGGN;RYSLPPELSNM;LARSASMPEAL;LYRSPSMPENL;LYRSPAMPENL;WYRSPSFYENL;WYRSPSYYENL;またはWYRSPSYYを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0013

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLYRSPSYPENL、LYRSPSYFENL、LYRSPSYYENL、またはLYRSPSYWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0014

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLYRSPSNPENL、LYRSPSNFENL、LYRSPSNYENL、またはLYRSPSNWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0015

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLYRSPSHPENL、LYRSPSHFENL、LYRSPSHYENL、LYRSPSHWENL、LYSSPSMPENL、LYSSPSMFENL、LYSSPSMYENL、LYSSPSMWENL、LYSSPSFPENL、LYSSPSFPENL、LYSSPSFFENL、LYSSPSFYENL、LYSSPSFWENL、LYSSPSYPENL、LYSSPSYFENL、LYSSPSYYENL、またはLYSSPSYWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0016

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLYSSPSQPENL、LYSSPSQWENL、LYSSPSHPENL、LYSSPSHFENL、LYSSPSHYENL、LYSSPSHWENL、LYTSPSMPENL、LYTSPSMFENL、LYTSPSMYENL、LYTSPSMWENL、LYTSPSFPENL、LYTSPSFFENL、LYTSPSFYENL、LYTSPSFWENL、LYTSPSYPENL、LYTSPSYFENL、LYTSPSYYENL、またはLYTSPSYWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0017

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLYTSPSNPENL、LYTSPSNFENL、LYTSPSNYENL、またはLYTSPSNWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0018

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLYTSPSHPENL、LYTSPSHFENL、LYTSPSHYENL、またはLYTSPSHWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0019

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLYHSPSYPENL、LYHSPSYFENL、LYHSPSYYENL、またはLYHSPSYWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0020

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLFTSPSYPENL、LFTSPSYFENL、LFTSPSYYENL、またはLFTSPSYWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0021

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がFYSSPSHPENL、FYSSPSHFENL、FYSSPSHYENL、FYSSPSHWENL、FYTSPSMPENL、FYTSPSMFENL、FYTSPSMYENL、FYTSPSMWENL、FYTSPSFPENL、FYTSPSFFENL、FYTSPSFYENL、FYTSPSFWENL、FYTSPSYPENL、FYTSPSYFENL、FYTSPSYYENL、またはFYTSPSYWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0022

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がWYRSPSMPENL、WYRSPSMFENL、WYRSPSMYENL、WYRSPSMWENL、WYRSPSFPENL、WYRSPSFFENL、WYRSPSFYENL、WYRSPSFWENL、WYRSPSYPENL、WYRSPSYFENL、WYRSPSYYENL、またはWYRSPSYWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0023

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がWYTSPSMPENL、WYTSPSMFENL、WYTSPSMYENL、WYTSPSMWENL、WYYSPSFPENL、WYTSPSFFENL、WYTSPSFYENL、WYTSPSFWENL、WYTSPSYPENL、WYTSPSYFENL、WYTSPSYYENL、またはWYTSPSYWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0024

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がWYTSPSHPENL、WYTSPSHFENL、WYTSPSHYENL、またはWYTSPSHWENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0025

別の態様においては、本発明はアミノ酸配列がLKRSPSMPENL、LYISPSMPENL、またはLYRSPSMVENLを含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。

0026

一つの態様において、本発明は、細胞に投与されるかまたは細胞内において発現されると、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドであって、前記細胞が哺乳動物細胞である単離または組換えポリペプチドを提供する。前記細胞はヒト細胞、酵母細胞昆虫細胞細菌細胞植物細胞、およびその他とすることができる。

0027

一つの態様においては、本発明は細胞膜透過作用物をさらに含む単離または組換えポリペプチドを提供する。前記細胞膜透過作用物には、TATタンパク質導入ドメインなどの、例えば配列YGRKKRRQRRRを含むポリペプチドを含むことが可能である。あるいは、前記の細胞膜透過作用物にはリポソームなどの脂質を含むことができる。

0028

本発明は、本発明のポリペプチドを含む第1のドメインと、細胞膜透過作用物を含む第2のドメインとを含み、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞においてで発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドであるキメラポリペプチドを提供する。キメラポリペプチドは、組換え融合タンパク質とすることができる。

0029

本発明は、本発明のキメラポリペプチドであって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドであるキメラポリペプチドをコードしている単離または組換え核酸を提供する。

0030

本発明は、本発明のキメラポリペプチドであって、前記ポリペプチドが細胞に投与または細胞において発現された場合、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するポリペプチドであるキメラポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる発現ベクターを提供する。

0031

本発明は、本発明の核酸かまたは発現ベクターを含んでいる細胞を提供する。この細胞は細菌、酵母、昆虫、植物、または哺乳動物の細胞とすることができる。

0032

本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明の発現ベクター、または本発明の細胞;および薬剤学的許容される賦形剤を含んでいる薬剤組成物を提供する。一つの態様においては、薬剤組成物はリポソームを含むものとすることができる。

0033

本発明は、Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼの活性を阻害する方法であって、本発明のポリペプチドか、または本発明の薬剤学的組成物を、Chk1またはChk2キナーゼの活性を阻害するに充分な量で前記キナーゼに接触させることを含む方法を提供する。

0034

本発明は、細胞のG2期細胞周期停止チェックポイントを破壊する方法であって、本発明のポリペプチドか、または本発明の薬剤組成物を、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するに充分な量で細胞に接触させることを含む方法を提供する。別の態様においては、細胞は哺乳動物細胞、ヒト細胞、または癌細胞である。

0035

本発明は、DNA損傷剤に対して細胞を感作する方法であって、本発明のポリペプチドか、または本発明の薬剤組成物を、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するに充分な量で細胞に接触させ、それによりその細胞をDNA損傷剤に対して感作する方法を提供する。別の態様においては、その細胞は哺乳動物細胞、ヒト細胞、または癌細胞である。その癌細胞は傷害を受けたG1期細胞周期停止チェックポイントを有するものとすることができる。

0036

本発明は、傷害を受けたG1期細胞周期停止チェックポイントをもつ細胞をDNA損傷剤に対し選択的に感作する方法であって、本発明のポリペプチドか、または本発明の薬剤組成物を、G2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するに充分な量で細胞に接触させ、それによりその細胞をDNA損傷剤に対して感作する方法を提供する。別の態様においては、その細胞は哺乳動物細胞、ヒト細胞、または癌細胞である。

0037

本発明は、個体中の細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、本発明のポリペプチドか、または本発明の薬剤組成物を、癌細胞のG2期細胞周期停止チェックポイントを破壊するに充分な量で投与し、それにより癌細胞をDNA損傷剤に対して感作すること、およびDNA損傷剤を投与することを含む方法を提供する。別の態様においては、その細胞は哺乳動物細胞、ヒト細胞、または癌細胞である。その癌細胞は傷害を受けたG1期細胞周期停止チェックポイントを有するものとすることができる。DNA損傷剤は5-フルオロウラシル(5-Fu)、リベカマシンアドリアマイシンブレオマイシンシスプラチン温熱療法UV照射、またはガンマ照射とすることができる。

0038

本発明は、Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼの活性を調整することができる化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ:(a)検査化合物を用意すること;(b)Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼを用意すること;(c)本発明のポリペプチドであって、Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼに結合するポリペプチドを用意すること;および(d)検査化合物をキナーゼおよびポリペプチドと接触させ、そしてキナーゼに対するポリペプチドの結合を妨げる検査化合物の能力を測定することを含む方法を提供する。

0039

本発明は、Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼの活性を調整することができる化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ:(a)検査化合物を用意すること;(b)Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼを用意すること;(c)本発明のポリペプチドであって、Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼによりリン酸化されるポリペプチドを用意すること;および(d)検査化合物をキナーゼおよびポリペプチドと接触させ、そしてキナーゼによるポリペプチドのリン酸化を阻害または消去する検査化合物の能力を測定することを含む方法を提供する。この方法はさらに、完全長のヒトCdc25Cを用意することを含むことができる。この方法の一つの態様においては、ステップ(c)のポリペプチドは、ヒトCdc25Cのアミノ酸残基セリン216を含み、ヒトCdc25Cのおよそ200番目アミノ酸残基からおよそ250番目アミノ酸残基までを含むポリペプチドである。この方法の一つの態様においては、段階(C)のポリペプチドはさらにグルタチオン-S-トランスフェラーゼを含む。

0040

前記のスクリーニング法を含め、本発明の方法の一つの態様においては、本発明のポリペプチドは固定されている。

0041

本発明は、G2期細胞周期停止チェックポイントを特異的に阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ:(a)検査化合物および本発明のポリペプチドを用意すること;(b)G1期チェックポイントが傷害を受けた細胞を用意すること;(c)ステップ(b)の細胞を、ステップ(a)の検査化合物または本発明のポリペプチド、および5-フルオロウラシル(5-Fu)、リベカマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、温熱療法、UV照射、またはガンマ照射などのDNA損傷剤か、またはM期チェックポイントアクティベーターと接触させること:および(d)ステップ(c)の接触の後、検査化合物がG2期細胞周期停止チェックポイントを阻害したかどうかを決定するために細胞中DNA量を測定することであり、ステップ(a)のポリペプチドをG2期細胞周期停止チェックポイント阻害性の正の対照として使用することを含む方法を提供する。別の態様においては、細胞は哺乳動物細胞、ヒト細胞、または癌細胞である。一つの態様においては、DNAの量はヨウ化プロピジウムを用いて、例えばFACS分析か、またはその同等物により測定される。一つの態様においては、DNAの量はステップ(c)の接触の後、約10〜約72時間後に測定される。

0042

一つの態様においては、この方法はステップ(b)の細胞を、M期チェックポイントアクティベーターのみ(DNA損傷剤の代用として)、およびステップ(a)の検査化合物またはポリペプチドと接触させることを含んでおり、その細胞をM期アクティベーターと接触させた後に細胞周期のM期チェックポイントでの停止を阻害または消去しなかった検査化合物を、G2期細胞周期チェックポイント特異的阻害剤(なぜなら、それはM期チェックポイントに影響しなかったか、または非特異的な現象ではなかったので)とする。一つの態様においては、M期チェックポイントアクチベーターコルヒチンまたはノコダゾールである。

0043

本発明の一つまたはそれより多い態様についての詳細は、添付の図面および以下の記載において説明される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載および図面から、また請求項から明らかになるであろう。

0044

本文に引用されたすべての出版物、特許、特許出願、GenBank配列、およびATCC寄託は、あらゆる目的のための参考文献としてこの文書により明確に取り込まれている。

0045

本発明の遺伝子およびポリペプチドは、例えば癌細胞の増殖を停止すること、または殺すことを含め、細胞増殖に関連する障害を治療するための新規な手段を提供する。本発明はいかなる特定の作用機序によっても限定されないが、本発明のポリペプチドの投与は細胞におけるG2期細胞周期停止チェックポイントを遅らせるか、または消去することができる。本発明の遺伝子およびポリペプチドはまた、Chk1および/またはChk2/Cds1キナーゼ活性を阻害するために用いることができる。Chk1および/またはChk2/Cds1キナーゼの阻害は、それによってG2期チェックポイントが阻害される機構となりうる。本発明はまた、G1チェックポイントが傷害を受けた癌細胞を、DNAを損傷する薬剤および処理に対して選択的に感作する方法も提供する。また、G2期細胞周期停止チェックポイントに深く関わっているChk1および/またはChk2/Cds1キナーゼなどの酵素と相互作用する、例えば阻害する、ことが可能な化合物をスクリーニングする方法も提供される。したがって、本発明は細胞周期G2チェックポイントを阻害または消去する化合物についてスクリーングする方法を提供する。

0046

本発明は、ヒトChk1(hChk1)(配列番号3)およびヒトChk2/ヒトCds1(Chk2/HuCds1)(配列番号4)キナーゼ活性のための基質モチーフである、ヒトCdc25C(hCdc25C)ポリペプチド(配列番号1)におけるアミノ酸ペプチドモチーフについて初めて記載する。本発明のキナーゼ阻害性ポリペプチドおよび核酸は、これらのhCdc25Cペプチドモチーフをもとにして作成されている。野性型hCdc25Cは、hChk1(配列番号3)およびChk2/HuCds1(配列番号4)によりリン酸化される。

0047

Cdc25Cのリン酸化は、細胞のG2期チェックポイントでの停止に必要である。したがって、本発明のポリペプチドおよびペプチドは、Cdc25Cのリン酸化を阻害することにより(おそらくChk1およびChk2/HuCds1を含む酵素により)、細胞のG2期チェックポイント特性を阻害または消去することができる。DNA損傷後の有効なG2期チェックポイントの欠如は、細胞にとり致命的となる(例えば、Maity(1994)Radiother. Oncol. 31:1-13参照)。もし細胞がDNA損傷に対する充分な修復なしにG2期を通って進行すれば、それはアポトーシス状態となる。したがって、本発明の組成物は腫瘍細胞などの細胞を、DNA損傷剤に対して感作するために用いることが可能である。事実、以下に議論されるように、本発明の組成物は癌細胞を、正常細胞に対してはほとんどまたは全く細胞毒性のない状態でDNA損傷剤のアポトーシス効果に対して、感作することができる。

0048

以下の実施例1は、本発明の二つの代表的なポリペプチドの合成および使用について記述する。ヒトCdc25C(配列番号1)のアミノ酸211〜221に相当する二つのペプチドをHIV-1-TAT(配列番号5)と融合した。これらのペプチドはhChk1キナーゼ(配列番号3)およびChk2/HuCds1キナーゼ(配列番号4)活性をin vitroにおいて阻害し、かつin vivoにおいてG2期チェックポイントを特異的に消去することが証明されている。これらのペプチドは、正常細胞に対する明白な細胞毒性効果なしに、p-53欠損癌細胞株をDNA損傷剤のアポトーシス効果に対して感作した。このような結果は、本発明のモチーフを含んでいるポリペプチドが細胞周期G2期チェックポイントを特異的に阻害または消去するために使用可能であることを明確に証明している。これらの結果は、本発明の組成物がChk1またはChk2キナーゼ活性を阻害する組成物をスクリーンするために使用可能であることを証明している。これらの結果はまた、本発明の組成物が癌治療に使用可能であることを証明する。本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されないが、本発明のポリペプチドおよびペプチドは、hChk1(配列番号3)およびChk2/HuCds1(配列番号4)キナーゼを標的とし、かつ阻害するために使用することが可能である。

0049

他に定義されない限り、ここで用いられた技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者により一般的に理解される意味を有する。ここで用いられているように、以下の用語は他に明記されない限り、それらに割り当てられた意味を有するものである。

0050

本文において用いられたような「細胞膜透過作用物」は、本発明のペプチドまたはポリペプチドか、または本発明の核酸と結合された場合、細胞内への組成物の移入現象(internalization)を引き起こすか、または促進する組成物を意味する。この結合は共有結合(例えば、リンキング結合性)薬剤か、または融合タンパク質として)または非共有結合(例えば、リポソームによるような)とすることができる。例えば、一つの態様においては、細胞膜透過作用物ドメインは、融合タンパク質ドメイン、例えばTATタンパク質導入ドメイン(例えば、Vives(1997)J. Biol. Chem. 272:16010-16017)として、本発明のペプチドまたはポリペプチドに結合される。他の細胞膜透過作用物ドメインは、例えばB型肝炎ウイルス表面抗原のPreS2-およびS-ドメインを含む。例えばOess(2000)Gene Ther. 7:750-758参照。

0051

本文において用いられたような「ヒトCdc25C」または「hCdc25C」は、状況に応じ、ヒトCdc25Cポリペプチド(配列番号1)か、またはヒトCdc25Cポリペプチド(配列番号1)のメッセージcDNA)(配列番号2)または遺伝子を意味する(例えば、Peng(1997)Science 277:1501-1505)。この用語はまた、例えば、対立遺伝子による変異、機能性突然変異、機能上の活性を保持した付加、欠失、置換による変異を含めたhCdc25Cのすべての機能性の変異も含む。機能性の活性を有するCdc25Cポリペプチドは、野性型のCdc25Cと同様の活性を有する。すなわち、適当にリン酸化された場合、それは他の細胞周期調節ポリペプチドと協力し、適切な条件下、例えばもし細胞がG2チェックポイントを通過すれば、アポトーシスを誘導するに充分なDNA損傷を招く条件下において、細胞の増殖をG2期において停止するように作用することができる。

0052

「DNA損傷処理」または「DNA損傷剤」という用語は、既知のDNA損傷薬剤、例えば、5-フルオロウラシル(5-FU)、リベカマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、およびその他に加え、例えば温熱療法、UV照射、またはガンマ照射を含めた、薬剤、放射線、環境上のショック、およびその他を含めた、細胞に対してDNA損傷を引き起こすであろういかなる処理または薬剤も含む。

0053

「細胞周期G2期チェックポイントの破壊」または「細胞周期G2期チェックポイントの阻害」という用語は、Chk1キナーゼおよび/またはChk2キナーゼ活性、例えばヒトChk1(hChk1)キナーゼ(配列番号3)(例えば、Yin(2000)Mol. Pharmacol. 57:453-459参照)や、ヒトChk2/ヒトCds1キナーゼ(Chk2/HuCds1)(配列番号4)(例えば、Hirao(2000)Science 287:1824-1827参照)などの、あるいは哺乳類キナーゼを阻害(消去を含む)するか、または適当な条件下、例えばある抗腫瘍薬剤によるDNA損傷の蓄積といった、もしそうでなければG2期細胞周期停止を引き起こす条件下に、G2期チェックポイントにおいて増殖を停止する細胞の能力を破壊する、本発明のペプチドまたはポリペプチドの能力を意味する。

0054

本発明のペプチドまたはポリペプチドの、Chk1キナーゼおよび/またはChk2キナーゼ活性を調節または阻害する能力は、in vitroまたはin vivoにおいて、例えば、以下の実施例1において記載される検定法またはそれらの変形において容易に検査される。ペプチドまたはポリペプチドは、もし、例えばそれがキナーゼに結合してキナーゼ活性を阻害または消去するなら、有効な阻害剤とみなされる。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドはまた、もしそれがリン酸化の基質として作用し、かつ天然の基質、例えば野性型Cdc25Cのリン酸化を阻害し、それにより適当な条件下で細胞のG2期チェックポイントにおいて増殖を停止する能力を破壊するなら、キナーゼ活性に対する有効な阻害剤とみなされる。

0055

本発明の代表的なペプチドまたはポリペプチドの、G2期チェックポイントにおいて増殖を止める細胞の能力を破壊する、すなわち、他の細胞周期調節ポリペプチドと協力して、適当な条件下、例えばもし細胞がG2期チェックポイントを通過すればアポトーシスを誘導するに充分なDNA損傷を招く条件下に、G2期において細胞の増殖を停止するように作用する能力は、in vivoにおいて容易に検査され、例えば細胞培養は以下の実施例1において説明されている。

0056

本文において用いられたような「発現カセット」という用語は、構造遺伝子(すなわち、タンパク質をコードしている配列)の、そのような配列に合致した宿主細胞における発現に影響を及ぼすことが可能なヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、ポリペプチドをコードしている配列に操作可能に連結された少なくとも一つのプロモーターを;および、任意で、他の配列、例えば転写終止シグナルとともに含む。発現に必要か、または影響を及ぼすことに役立つ付加的な因子、例えばエンハンサーもまた用いることができる。本文において用いられたような「操作可能に連結された」は、DNA配列上流におけるプロモーターの、そのプロモーターがDNA配列の転写を仲介するように連結することを指す。したがって、発現カセットはプラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、および何らかの形状の組換え「むき出しのDNA(naked DNA)」ベクター、およびその他を含む。「ベクター」は、細胞に感染し、トランスフェクトし、一過性または永続性形質転換することが可能な核酸を含む。ベクターが、むき出しの核酸か、またはタンパク質あるいは脂質と複合した核酸であることが可能であることも認識されよう。このベクターは、任意にウイルスまたは細菌の核酸および/またはタンパク質、および/または膜(例えば、細胞膜、ウイルス脂質外皮など)を含む。ベクターは、それに対してDNAフラグメントが結合し、かつ複製されるようになってもよいレプリコン(例えば、RNAレプリコンバクテリオファージ)を含むが、これに限定されない。したがって、ベクターはRNA、自律性自己複製性環状または直鎖DNAまたはRNA(例えば、プラスミド、ウイルス、およびその他、例えば、米国特許第5,217,879参照)を含むが、これに限定されず、また発現および非発現プラスミドの双方を含む。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」を受容しているとして記載される場合には、このことは染色体外の環状および直鎖DNAと、宿主染色体に取り込まれているDNAの双方を含む。宿主細胞にベクターが維持されている場合、そのベクターは自律性の構造物として有糸分裂の間に細胞により安定して複製されるか、または宿主のゲノム内に取り込まれるかのいずれかでよい。

0057

化学的に連結された」という用語は、二つの部分についての何らかの化学的な結合、例えば本発明の一つの態様における、本発明の少なくとも二つのペプチドモチーフを含んでいるようなポリペプチドを指す。このような化学的連結は、組換えによるか、またはin vivoで生成された融合タンパク質のペプチド結合を含む。

0058

キメラタンパク質」または「融合タンパク質」という用語は、第2のポリペプチドか、またはペプチドドメインまたはモチーフに結合している、少なくとも一つのポリペプチドか、またはペプチドドメインまたはモチーフを含んでいる組成物を指す。例えば、一つの態様において本発明は、少なくとも二つのドメインを含んでいる融合タンパク質をコードしており、第1のドメインが一つのキナーゼ阻害性またはG2期チェックポイント阻害性モチーフを含んでおり、第2のドメインが同一または同様の活性を有する第2のモチーフを含んでいる、単離または組換え核酸分子を提供する(例えば、モチーフ上にはキナーゼに対する高い結合親和性を有し、一方第2のモチーフは高いキナーゼ阻害活性を有してもよい)。付加的なドメインは、ポリペプチド、ペプチド、多糖、またはその他を含むことができる。「融合」は、ペプチド結合、化学的連結、電荷相互作用(例えば、塩橋、H-結合、その他といった静電引力)、またはその他により生成される結合とすることができる。もしそのポリペプチドが組換え体であれば、「融合タンパク質」は共通のメッセージから翻訳されることが可能である。別法として、ドメインの成分は何らかの化学的または静電的手段により連結されることが可能である。本発明のキメラ分子はまた、付加的な配列、例えば、リンカーエピトープタグ酵素切断認識配列シグナル配列分泌シグナル、およびその他を含むことができる。別法として、一つのペプチドが、キャリアに対し、単に操作またはペプチドの識別/位置づけを容易にするべく、連結されることが可能である。

0059

本文において用いられたような「G2期チェックポイント阻害活性」という用語は、G2期チェックポイントについての何らかの量の阻害を意味する。

0060

本文において用いられたような「単離された」という用語は、例えば本発明の核酸またはポリペプチドの様な分子または組成物を指している場合、その分子または組成物が、タンパク質または他の核酸(例えば、RNA)か、またはそれがin vivoにおいて、または天然に生じる状態において結合している混入物などの、少なくとも一つの他の化合物から分離されることを意味する。したがって、核酸またはポリペプチドは、それが天然に結合していた他の成分、例えば、細胞抽出物中である時は、細胞膜から分離されている場合に単離されたとみなされる。単離された組成物は、しかしながら、また実質的に純粋なものとすることができる。単離された組成物は均一な状態とすることができ、乾燥しているかまたは水溶液中に存在させることができる。純度および均一性は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)または高速液体クロマトグラフィーHPLC)などの分析化学の技術を用いて測定することができる。したがって、本発明の単離された組成物は、それらがin situの環境において正常に結合していた物質を含んでいない。タンパク質が均一な、または主要なバンドにまで単離されている場合でも、所望のタンパク質と同時に精製される極微量の混入物が存在する可能性はある。

0061

「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は本発明の組成物を含み、これは変異体由来するポリペプチドに実質的に相当する構造および活性をもつ「類似体」または「保存性の変異体」、および「模倣物」または「ペプチド模倣物」も含み、そのような変異体は、例えば哺乳動物のChk1および/またはChk2キナーゼを阻害するか、または哺乳動物のG2期チェックポイントを阻害することが可能な本発明のペプチドおよびポリペプチドの変異体を含む。

0062

「薬剤学的組成物」という用語は、薬剤学的な、例えば患者における抗癌剤としての使用に適した組成物を指す。本発明の薬剤学的組成物は、薬学的に有効な量の、例えば本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、または細胞を含んでいる組成物と、薬学的に許容される担体とを含む製剤である。

0063

「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指示する核酸調節配列アレイである。本文において用いられたように、プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーター、TATAエレメントの場合のように、転写開始部位付近の必須な核酸配列を含む。プロモーターはまた任意に、転写開始部位から数千塩基対もの位置に局在することが可能な遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。「構成性の」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下において活性のあるプロモーターである。「誘導性の」プロモーターは、環境または発生による調節下にあるプロモーターである。「組織特異的な」プロモーターは、個体のある組織型においては活性があるが、同一個体の他の組織においてはそうではない。「操作可能に連結された」という用語は、核酸発現調節配列(プロモーター、または転写因子結合部位のアレイなどの)と、第2の核酸配列との間の機能的な連結を指し、発現調節配列が第2の配列に相当する核酸の転写を指示する。

0064

「組換え」という用語は、合成されるか、またはin vitroにおいて別の方法で操作されたポリヌクレオチド(例えば、「組換えポリヌクレオチド」)、細胞または他の生体系において遺伝子産物を産生するために組換えポリヌクレオチドを用いる方法、または組換えポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド(「組換えタンパク質」)を指す。例えば、組換えペプチドまたはポリペプチドまたは核酸は、本発明の方法を実施するために使用することが可能である。「組換え手段」もまた、種々のコード領域、または異なる供給源からのドメインまたはプロモーターを有する核酸の発現、例えば本発明を実施するために用いられるベクターにおけるポリペプチドコード配列の誘導性または構成性の発現のための発現カセットまたはベクターへの連結を含む。

0065

本発明は、癌などの、制御されない細胞増殖の治療において用いるための、発現ベクターを含む新規な核酸と、これらの核酸を作成および発現するための手段とを提供する。本発明の遺伝子およびベクターはin vitroおよびin vivoにおいて作成および発現されることが可能であるため、本発明はこれらの遺伝子およびベクターを作成および発現するための種々の手段を供給する。当業者は、本発明のベクター内の遺伝子および核酸(例えば、プロモーター)の発現または活性を調節することによって、本発明のポリペプチドを所望のレベルで発現させることが可能であること認識するであろう。組織特異発現を含め、発現または活性を増進または低下させるための既知のどの方法も、本発明のために使用するることが可能である。本発明は、この技術において周知であり、科学および特許文献において充分に記載されているどの方法またはプロトコールとも関連させて実施することが可能である。

0066

本発明の核酸配列および本発明を実施するために使用される他の核酸は、RNAであれ、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス、またはそのハイブリッドであれ、遺伝学的に工作され、増幅され、および/または組合せにより発現された、種々の供給源から単離されてよい。細菌細胞に加えて、例えば、哺乳動物、酵母、昆虫、または植物細胞の発現系を含めた、いかなる組換え発現系も用いられる。

0067

別法として、これらの核酸は、例えば、Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers(1994)Biochemistry 33:7886-7896; Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90; Brown(1979)Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage(1981)Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号に記載されたような、周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することが可能である。二本鎖DNAフラグメントは、したがって、相補鎖を合成し、この鎖を適当な条件下にアニールすることよるか、またはDNAポリメラーゼを適当なプライマー配列とともに用いて相補鎖を加えることにより取得することができる。

0068

例えば、配列における突然変異を生じさせること、サブクローニングプローブを標識すること、配列決定ハイブリダイゼーション、およびその他の核酸を操作するための技術は、科学および特許文献において充分に記述されており、例えばSambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORYMANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUESIN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照されたい。

0069

核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチド、およびその他は、当業者に周知の多くの一般的な手段のいずれによっても分析および定量することができる。これらは、例えば、NMR分光光度法X線撮影法電気泳動キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィーTLC)、およびハイパーディフュージョンクロマトグラフィーといった分析用生化学的方法、種々の免疫学的方法、例えば液体またはゲル沈降反応免疫拡散法免疫電気泳動法ラジオイムノアッセイRIAS)、固相酵素免疫検定法ELISAs)、免疫蛍光分析法サザン分析法、ノーザン分析法、ドット-ブロット法ゲル電気泳動法(例えば、SDS-PAGE)、核酸またはターゲットまたはシグナル増幅法放射能標識シンチレーションカウンティング、およびアフィニティークロマトグラフィーを含む。増幅法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR(PCR PROTOCOLS, AGUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) and PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.、リガーゼ連鎖反応(LCR)(例えば、Wu(1989)Genomics 4:560; Landegren(1988)Science 241:1077; Barringer(1990)Gene 89:117参照);転写増幅(例えば、Kwoh(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173参照);および自己持続性配列複製(例えば、Guatelli(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874参照);Qベータレプリカーゼ増幅(例えば、Smith(1997)J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491参照)、自動Qベータレプリカーゼ増幅分析法(例えば、Burg(1996)Mol. Cell. Probes 10:257-271参照)、および他のRNAポリメラーゼ介在性の技術(例えば、NASBA、Cangene, Mississauga, Ontario);またBerger(1987)MethodsEnzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; 米国特許第4,693,195号および4,683,202号;Sooknanan(1995)Biotechnology 13:563-564も参照されたい。

0070

一旦増幅されれば、ライブラリーは、もし所望であれば、種々のベクターのいずれかに、慣例的な分子生物学の方法を用いてクローン化することができる;増幅された核酸のin vitroにおけるクローニング法は、例えば、米国特許第5,426,039号に記載されている。増幅された配列のクローニングを促進するため、PCRプライマーペア制限部位を「取り付ける」ことが可能である。

0071

本発明は、本発明のポリペプチドおよびペプチドをコードする発現ベクターのライブラリーを提供する。これらの核酸は、ゲノムへ、または一つの細胞の細胞質または核へ導入され、科学および特許文献に充分に記載された種々の通常の技術により発現させることができる。例えば、Roberts(1987)Nature 328:731; Schneider(1995)Protein Expr. Purif. 6435:10; Sambrook、Tijssen、またはAusubelを参照されたい。ベクターは天然の供給源から単離されるか、ATCCまたはGenBankライブラリーなどの供給源から入手されるか、または合成または組換え法により調製することたできる。例えば、本発明の核酸は、発現カセット、ベクター、またはウイルスにおいて発現され、それらは細胞において安定して、または一過性に発現される(例えば、エピソーム発現系)。形質転換された細胞および配列上に選択可能な表現形をもたらすために、選択マーカーを発現カセットおよびベクターに取り込ませることが可能である。例えば、選択マーカーは、宿主ゲノムへ組み込む必要がないように、エピソームの維持および複製をコードするようにすることができる。

0072

一つの態様においては、本発明の核酸は、本発明のペプチドまたはポリペプチドのin situでの発現のためにin vivoで投与される。この核酸は「むき出しのDNA」として(例えば、米国特許第5,580,859号参照)、あるいは発現ベクター、例えば組換えウイルスの形状にて投与することができる。この核酸は、以下に述べるような腫瘍周辺、または腫瘍内を含め、どのような投与経路によっても投与することが可能である。in vivoにおいて投与されるベクターは、組換えにより修飾された外皮があるか、または外皮のない、DNAおよびRNAウイルスを含み、好ましくはバキョロウイルス科、パルボウイルス科ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科ポックスウイルス科アデノウイルス科、またはピコルナウイルス科から選ばれるウイルスのゲノムに由来するものとすることができる。各々の親ベクターの特性の都合のよい長所を利用したキメラベクターもまた用いることができる(例えば、Feng(1997)Nature Biotechnology 15:866-870参照)。このようなウイルスゲノムは、本発明の核酸を含むように組換えDNA技術により修飾されてよく;また、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントとなるべくさらに加工されてもよい。別の態様においては、ベクターはアデノウイルス(例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター、例えば米国特許第6,096,718号;6,110,458号;6,113,913号;5,631,236号参照);アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノムに由来するベクターである。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる;例えば、米国特許第6,117,681号;6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号;Buchscher(1992)J. Virol. 66:2731-2739; Johann(1992)J. Virol. 66:1635-1640参照)。アデノ随伴ウイルス(AAV)を主成分とするベクターは、例えば核酸およびペプチドのin vitroでの産生、およびin vivoおよびex vivoにおける遺伝子治療で使用されているように、標的核酸を細胞に形質導入するようにして使用することができる;例えば、米国特許第6,110,456号;5,474,935号;Okada(1996)Gene Ther. 3:957-964参照。

0073

本発明のペプチドおよびポリペプチドは、キナーゼCdc25Cの構造に由来するか、または基づいている。hCdc25CのcDNA核酸配列は、
1 caggaagact ctgagtccga cgttggccta cccagtcgga aggcagagct gcaatctagt
61 taactacctc ctttccccta gatttccttt cattctgctc aagtcttcgc ctgtgtccga
121 tccctatcta ctttctctcc tcttgtagca agcctcagac tccaggcttg agctaggttt
181 tgtttttctc ctggtgagaa ttcgaagacc atgtctacgg aactcttctc atccacaaga
241 gaggaaggaa gctctggctc aggacccagt tttaggtcta atcaaaggaa aatgttaaac
301 ctgctcctgg agagagacac ttcctttacc gtctgtccag atgtccctag aactccagtg
361 ggcaaatttc ttggtgattc tgcaaaccta agcattttgt ctggaggaac cccaaaatgt
421 tgcctcgatc tttcgaatct tagcagtggg gagataactg ccactcagct taccacttct
481 gcagaccttg atgaaactgg tcacctggat tcttcaggac ttcaggaagt gcatttagct
541 gggatgaatc atgaccagca cctaatgaaa tgtagcccag cacagcttct ttgtagcact
601 ccgaatggtt tggaccgtgg ccatagaaag agagatgcaa tgtgtagttc atctgcaaat
661 aaagaaaatg acaatggaaa cttggtggac agtgaaatga aatatttggg cagtcccatt
721 actactgttc caaaattgga taaaaatcca aacctaggag aagaccaggc agaagagatt
781 tcagatgaat taatggagtt ttccctgaaa gatcaagaag caaaggtgag cagaagtggc
841 ctatatcgct ccccgtcgat gccagagaac ttgaacaggc caagactgaa gcaggtggaa
901 aaattcaagg acaacacaat accagataaa gttaaaaaaa agtatttttc tggccaagga
961 aagctcagga agggcttatg tttaaagaag acagtctctc tgtgtgacat tactatcact
1021 cagatgctgg aggaagattc taaccagggg cacctgattg gtgatttttc caaggtatgt
1081 gcgctgccaa ccgtgtcagg gaaacaccaa gatctgaagt atgtcaaccc agaaacagtg
1141 gctgccttac tgtcggggaa gttccagggt ctgattgaga agttttatgt cattgattgt
1201 cgctatccat atgagtatct gggaggacac atccagggag ccttaaactt atatagtcag
1261 gaagaactgt ttaacttctt tctgaagaag cccatcgtcc ctttggacac ccagaagaga
1321 ataatcatcg tgttccactg tgaattctcc tcagagaggg gcccccgaat gtgccgctgt
1381 ctgcgtgaag aggacaggtc tctgaaccag tatcctgcat tgtactaccc agagctatat
1441 atccttaaag gcggctacag agacttcttt ccagaatata tggaactgtg tgaaccacag
1501 agctactgcc ctatgcatca tcaggaccac aagactgagt tgctgaggtg tcgaagccag
1561 agcaaagtgc aggaagggga gcggcagctg cgggagcaga ttgcccttct ggtgaaggac
1621 atgagcccat gataacattc cagccactgg ctgctaacaa gtcaccaaaa agacactgca
1681 gaaaccctga gcagaaagag gccttctgga tggccaaacc caagattatt aaaagatgtc
1741 tctgcaaacc aacaggctac caacttgtat ccaggcctgg gaatggatta ggtttcagca
1801 gagctgaaag ctggtggcag agtcctggag ctggctctat aaggcagcct tgagttgcat
1861 agagatttgt attggttcag ggaactctgg cattcctttt cccaactcct catgtcttct
1921 cacaagccag ccaactcttt ctctctgggc ttcgggctat gcaagagcgt tgtctacctt
1981 ctttctttgt attttccttc tttgtttccc cctctttctt ttttaaaaat ggaaaaataa
2041 acactacaga atgag (配列番号6)
である。

0074

ヒトhCdc25Cのアミノ酸配列は、
MSTELFSSTREEGSSGSGPSFRSNQRKMLNLLLERDTSFTVCPD
VPRTPVGKFLGDSANLSILSGGTPKCCLDLSNLSSGEITATQLTTSADLDETGHLDSS
LQEVHLAGMNHDQHLMKCSPAQLLCSTPNGLDRGHRKRDAMCSSSANKENDNGNLVD
SEMKYLGSPITTVPKLDKNPNLGEDQAEEISDELMEFSLKDQEAKVSRSGLYRSPSMP
ENLNRPRLKQVEKFKDNTIPDKVKKKYFSGQGKLRKGLCLKKTVSLCDITITQMLEED
SNQGHLIGDFSKVCALPTVSGKHQDLKYVNPETVAALLSGKFQGLIEKFYVIDCRYPY
EYLGGHIQGALNLYSQEELFNFFLKKPIVPLDTQKRIIIVFHCEFSSERGPRMCRCLR
EEDRSLNQYPALYYPELYILKGGYRDFFPEYMELCEPQSYCPMHHQDHKTELLRCRSQ
SKVQEGERQLREQIALLVKDMSP (配列番号1)
である。

0075

また、例えば、GenBankAccession No. NP001781(タンパク質)およびNM001790(核酸、cDNA)およびSadhu (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:5139-5143を参照されたい。

0076

本発明のペプチドおよびポリペプチドは、例えば、癌細胞の増殖を停止するか、または殺すためなど、細胞の増殖障害を治療するために投与することができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、細胞においてG2期細胞周期停止チェックポイントを阻害する(例えば、遅延する)か、または消去するために用いることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、Chk1および/またはChk2/Cds1キナーゼ活性を阻害するために用いることができる。

0077

本発明のペプチドおよびポリペプチドは、前文に述べたように、核酸の投与後に、組換えによりin vivoにおいて発現されるが、それらはまた、例えば、薬剤組成物として直接投与することもできる。

0078

本発明のペプチドおよびポリペプチドは天然の供給源から単離されるか、合成によるか、または組換えにより生成されたペプチドとすることができる。ペプチドおよびタンパク質は、in vitroまたはin vivoにおいて組換えにより発現させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、この技術において周知のいずれかの方法を用いて作成および単離される。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、この技術において周知の化学的方法を用いて、全体または部分的に合成される。例えば、Caruthers(1980)Nucleic AcidsRes. Symp. Ser. 215-223 ; Horn(1980)Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232;Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co., Lancaster, PAを参照。例えば、ペプチド合成は種々の固相法を用いて行なわれ(例えば、Roberge(1995)Science 269:202; Merrifield(1997)Methods Enzymol. 289:3-13参照)、また自動的な合成も、例えばABI431Aペプチド・シンセサイザー(Perkin Elmer)を用い、製造業者使用説明書に従って行うことができる。

0079

本発明のペプチドおよびポリペプチドは、前文に定義されたように、すべての「模倣体(mimetic)」および「ペプチド模倣体(peptidomimetic)」の形状を含む。「模倣体」および「ペプチド模倣体」という用語は、本発明のポリペプチドと実質的に同一の構造および/または機能を有する合成化学組成物を指す。模倣体とは、完全に合成による、非天然のアミノ酸類似体か、または部分的に天然のペプチドアミノ酸であり部分的に非天然のアミノ酸類似体から成るキメラ分子のいずれかとすることができる。模倣体はまた、ある程度のアミノ酸の保存的置換を、その置換もまた模倣体の構造および/または活性を実質的に変えない限り、包含することができる。保存性の変異体である本発明のポリペプチドについては、模倣体が本発明の範囲内にあるかどうか、すなわちその構造および/または機能が実質的に変えられていないことは、慣例的な実験方法によって決定される。したがって、模倣組成物は、もし細胞に投与されるか、または細胞において発現された場合、それがG2期細胞周期停止チェックポイントを破壊すれば、本発明の範囲内にある。模倣組成物はまた、もしそれがChk1および/またはChk2/Cds1キナーゼ活性を阻害することができるか、またはこれらの酵素のいずれかの活性部位に結合することができれば、本発明の範囲内となりうる。

0080

ポリペプチド模倣組成物は、何らかの組合せの非天然の構造成分を含むことができ、それらは典型的には3つの構造群に分けられる:a)天然のアミド結合(「ペプチド結合」)連結以外の残基連結群;b)天然に生じるアミノ酸残基の代わりの非天然残基;またはc)二次構造上の模倣物を誘導する、すなわち二次構造、例えばβ-ターン、γ-ターン、β-シートα-ヘリックス構造、およびその他を誘導または安定化するための残基。例えば、あるポリペプチドは、その残基の全てまたはいくつかが、天然のペプチド結合以外の化学的手段により結合されている場合、模倣体として特徴づけられる。個々のペプチド模倣残基は、ペプチド結合、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、2官能マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、またはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミドDIC)などの、他の化学結合またはカップリング手段により結合される。慣例的なアミド結合「ペプチド結合」連結の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン(例えば、-C(=O)-CH2-に対する-C(=O)-NH-)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレンオレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4-)、チアゾールレトロアミドチオアミド、またはエステルを含む(例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NYを参照のこと)。

0081

ペプチドは、天然に生じるアミノ酸残基の代わりに、全ての、またはいくつかの非天然のアミノ酸残基を含むことにより、模造物として特徴づけられることできる。非天然の残基は、学術文献および特許文献に充分に記述されている;天然アミノ酸残基の模倣物として有用ないくつかの代表的な非天然組成物およびガイドラインは以下に記載される。芳香族アミノ酸の模倣物は例えば、D-またはL-ナフィルアラニン(naphylalanine);D-またはL-フェニルグリシン;D-またはL-2チエネイルアラニン(thieneylalanine);D-またはL-1,-2,3-または4-ピレネイルアラニン(pyreneylalanine);D-またはL-3チエネイルアラニン(thieneylalanine);D-またはL-(2-ピリジニル)-アラニン;D-またはL-(3-ピリジニル)-アラニン;D-またはL-(2-ピラジニル)-アラニン;D-またはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン;D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン;D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン;D-p-フルオロ-フェニルアラニン;D-またはL-p-ビフェニルフェニルアラニン;K-またはL-p-メトキシ-ビフェニルフェニルアラニン;D-またはL-2インドールアルキル)アラニン;およびD-またはL-アルキルアラニン(alkylalanine)であって、アルキルが置換されたかまたは未置換のメチルエチルプロピルヘキシルブチルペンチル、イソプロピル、イソーブチル、2級-イソチル(isotyl)、イソーペンチル、または非酸性アミノ酸による置換によって生成することができる。非天然アミノ酸芳香環は、例えば、チアゾイルチオフェニルピラゾイル、ベンゾイミダゾリルナフチルフラニルピロリル、およびピリジル芳香環を含む。

0082

酸性アミノ酸の模倣物は、例えば負の電荷を維持している限りの非カルボン酸塩アミノ酸;(ホスホノ)アラニン;硫酸化トレオニンによる置換によって生成することができる。カルボキシル側基(例えば、アスパルチルまたはグルタミル)もまた、例えば1-シクロヘキシル-3(2-モルフォリニル-(4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメトルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R'-N-C-N-R')との反応によって選択的に修飾される。アスパルチルまたはグルタミルもまた、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換可能である。

0083

塩基性アミノ酸の模倣物は、例えば(リシンおよびアルギニンに加えて)アミノ酸、オルニチンシトルリン、または(グアニジノ)-酢酸、またはアルキルが前文に定義されている(グアニジノ)アルキル酢酸による置換によって生成することが可能である。ニトリル誘導体(例えば、COOHの代わりにCN-部分を含んでいる)は、アスパラギンまたはグルタミン用に置換することが可能である。アスパラギニルおよびグルタミニル残基は、対応するアスパルチルまたはグルタミル残基に対して脱アミノ基を行うことが可能である。

0084

アルギニン残基模倣物は、アルギニルを、例えば一つまたはそれより多い、通常の、例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンオン、またはニンヒドリンを含む試薬と、好ましくはアルカリ性の条件下に反応させることにより生成される。チロシン残基模倣物は、チロシルを、例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることにより生成される。N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、各々O-アセチルチロシル類および3-ニトロ誘導体を形成するために使用することができる。システイン残基模倣物は、システイニル残基を、2-クロロ酢酸などのα-ハロアセテート、またはクロロアセトアミドおよび相当するアミンと反応させ;カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じさせることにより生成することができる。システイン残基模倣物はまた、システイニル残基を、例えばブロモトリフルオロ酢酸、α-ブロモ-β-(5-イミダゾイル)プロピオン酸クロロアセチルホスファート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド;メチル2-ピリジルスルフィド;p-クロメルク安息香酸;2-クロロメルクリ-4ニトロフェノール;または、クロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることにより生成することができる。リジン模倣物は、リシニルを、例えば無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させることにより生成する(またアミノ末端残基が変更される)ことができる。リジンおよび他のα-アミノ-含有残基模倣物はまた、メチルピコリンイミダートピリドキサールホスファート、ピリドキサール、クロロボロヒドリドトリニトロベンゼンアスホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4ペンタンジオンといったイミドエステルを用いた反応、およびトランスアミダーゼ触媒されるグリオキシラートを用いた反応により生成することができる。メチオニンの模倣物は、例えば、メチオニンスルホキシドを用いた反応により生成することができる。プロリンの模倣物は、例えばピペコリン酸チアゾリジンカルボン酸、3-または4-ヒドロキシプロリンデヒドロキシプロリン、3-または4-メチルプロリン、または3,3,-ジメチルプロリンを含む。ヒスチジン残基模倣物は、ヒスチジルを、例えばジエチルプロカルボナートまたはパラーブロモフェナシブロミドと反応させることにより生成することができる。他の模倣物は、例えば、プロリンおよびリジンの水酸化;セエリルまたはトレオニル残基の水酸基のリン酸化;リジン、アルギニンおよびヒスチジンのα-アミノ基のメチル化;N-末端アミンアセチル化;主鎖アミド残基のメチル化またはN-メチルアミノ酸による置換;またはC-末端カルボキシル基アミド化を含む。

0085

本発明のポリペプチドの成分はまた、反対の光学異性をもつアミノ酸(またはペプチド模倣物残基)により置換されていてもよい。すなわち、天然に生じたL-構造のアミノ酸(その化学物質全体の構造に依存して、RまたはSとも呼ばれることがある)のどのアミノ酸も、同じ化学構造型またはペプチド模倣物のアミノ酸であるが、しかし反対の光学異性をもち、Dーアミノ酸と呼ばれるが、付加的にR-またはS-と呼ばれることもあるアミノ酸によって置換されることが可能である。

0086

当業者は、これらの模倣物を取り入れている個々の合成残基およびポリペプチドが、種々の手順および方法論を用いて合成され得ることを認識しているし、それらは学術文献および特許文献、例えばOrganic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NYにおいて充分に記載されている。本発明のペプチドおよびペプチド模倣物はまた、コンビナトリアルな方法論を用いて合成することもできる。ペプチドおよびペプチド模倣物ライブラリーの作成のための種々の技術が周知であり、それらの技術は例えばマルチピンティーバッグ、およびスプリットカップルミックス技術を含む;例えば、al-Obeidi(1998)Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby(1997)Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard(1997)Mol. Divers. 3:17-27;Ostresh(1996)Methods Enzymol. 267:220-234を参照のこと。本発明の修飾されたペプチドはさらに、化学的な修飾法によって生成することができ、例えばBelousov(1997)Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers(1994)Biochemistry 33;7886-7896を参照されたい。

0087

本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、それらに結合された一つまたはそれより多い付加的な、例えばより免疫原性のペプチドを産生するため、抗体および抗体を発現しているB細胞を同定および単離するため、およびその他のためのドメインをもつ融合タンパク質として合成および発現されることが可能である。検出および精製を促進するドメインは、例えば固定された金属上での精製を可能にする、ポリヒスチジン系およびヒスチジンートリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、およびFLAGSイクステンション/アフィニティー精製システム(Immunex Corp, Seattle WA)において利用されるドメインを含む。精製ドメインと、精製を促進するためのモチーフ含有ペプチドまたはポリペプチドとの間に第Xa因子またはエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego CA)などの、切断可能なリンカー配列を含有させてもよい。例えば、一つの発現ベクターは、チオレドキシンおよびエンテロキナーゼ切断部位を伴った、6個のヒスチジン残基に結合されたエピトープコード核酸配列を含むことができる(例えば、Williams(1995)Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli(1998)Protein Expr. Purif. 12:404-14参照のこと)。ヒスチジン残基は検出および精製を促進し、一方エンテロキナーゼ切断部位は、その融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードしているベクターと融合タンパク質の適用に関係する技術は、学術文献および特許文献に充分記載されており、例えばKroll(1993)DNA Cell. Biol., 12:441-53を参照されたい。

0088

本発明は、Chk1キナーゼまたはChk2キナーゼの活性を阻害する方法を提供する。本発明はまた、Chk1キナーゼおよび/またはChk2キナーゼの活性を阻害するか、または結合する(例えば、活性部位に対して結合する)組成物をスクリーニングする方法も提供する。ヒトChk1キナーゼのアミノ酸配列は、
MAVPFVEDWDLVQTLGEGAYGEVQLAVNRVTEEAVAVKIVDMKR
AVDCPENIKKEICINKMLNHENVVKFYGHRREGNIQYLFLEYCSGGELFDRIEPDIGM
PEPDAQRFFHQLMAGVVYLHGIGITHRDIKPENLLLDERDNLKISDFGLATVFRYNNR
ERLLNKMCGTLPYVAPELLKRREFHAEPVDVWSCGIVLTAMLAGELPWDQPSDSCQEY
SDWKEKKTYLNPWKKIDSAPLALLHKILVENPSARITIPDIKKDRWYNKPLKKGAKRP
RVTSGGVSESPSGFSKHIQSNLDFSPVNSASSEENVKYSSSQPEPRTGLSLWDTSPSY
IDKLVQGISFSQPTCPDHMLLNSQLLGTPGSSQNPWQRLVKRMTRFFTKLDADKSYQC
LKETCEKLGYQWKKSCMNQVTISTTDRRNNKLIFKVNLLEMDDKILVDFRLSKGDGLE
FKRHFLKIKGKLIDIVSSQKVWLPAT (配列番号3)である。

0089

また、Sanchez(1997) Science 277:1497-1501; Genbank Accession No.AF016582;AAC 51736;NP001265,NM 001274も参照のこと。

0090

ヒトChk2キナーゼのアミノ酸配列は、
MSRESDVEAQQSHGSSACSQPHGSVTQSQGSSSQSQGISSSSTS
MPNSSQSSHSSSGTLSSLETVSTQELYSIPEDQEPEDQEPEEPTPAPWARLWALQDG
FANLECVNDNYWFGRDKSCEYCFDEPLLKRTDKYRTYSKKHFRIFREVGPKNSYIAYI
EDHSGNGTFVNTELVGKGKRRPLNNNSEIALSLSRNKVFVFFDLTVDDQSVYPKALRD
EYIMSKTLGSGACGEVKLAFERKTCKKVAIKIISKRKFAIGSAREADPALNVETEIEI
LKKLNHPCIIKIKNFFDAEDYYIVLELMEGGELFDKVVGNKRLKEATCKLYFYQMLLA
VQYLHENGIIHRDLKPENVLLSSQEEDCLIKITDFGHSKILGETSLMRTLCGTPTYLA
PEVLVSVGTAGYNRAVDCWSLGVILFICLSGYPPFSEHRTQVSLKDQITSGKYNFIPE
VWAEVSEKALDLVKKLLVVDPKARFTTEEALRHPWLQDEDMKRKFQDLLSEENESTAL
PQVLAQPSTSRKRPREGEAEGAETTKRPAVCAAVL (配列番号4)である。

0091

また、Brown (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3745-3750; Chaturvedi (1999) Oncogene 18:4047-4054; Genbank Accession No. NP 009125;NM 007194も参照のこと。

0092

本発明は、本発明のペプチドおよびポリペプチドに対し、特異的に結合する抗体を提供する。このような抗体は、これらのペプチドおよびポリペプチドの存在を同定するために使用することができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、対応するCdc25Cホスファターゼに特異的な抗体を作成するために使用することができる。本発明の抗ペプチド抗体は、Chk1またはChk2キナーゼの活性部位に対して特異的に結合する抗イデオタイプ抗体を作成するために使用することができる。

0093

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体作成法は当業者には周知であり、学術文献および特許文献、例えばColigan, CURRENTPROTOCOLS INIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.)BASICAND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONALANTIBODIES: PRINCIPLESAND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORYMANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照、において充分に記載されている。抗体は、動物を使った一般的なin vivoの方法に加えて、in vitroにおいて、例えば組換え抗体結合部位発現ファージディスプレイライブラリーを用いても作成することができる。例えばHuse(1989)Science 246:1275; Ward(1989)Nature 341:544; Hoogenboom(1997)Trens Biotechnol. 15:62-70; Katz(1997)Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45を参照のこと。ヒト抗体は、例えば米国特許第5,877,397号;5,874,299号; 5,789,650号; および5,939,598号に記載されているように、ヒト抗体のみを産生するように作出されたマウスにおいて作成することができる。このようなマウスからのB細胞は、標準的な技術を用いて(例えば、ミエローマなどの不死化細胞株との融合によるか、または他の不滅化するための技術を用いてそのようなB細胞操作することにより)、モノクローナルヒト抗体産生細胞を作成するために不死化させることができる。例えば、米国特許第5,916,771; 5,985,615号参照。キメラの、例えば「ヒト化された」抗体の作成には、例えば米国特許第5,811,522号; 5,789,554号; 5,861,155号を参照のこと。別法として、組換え抗体は、Norderhaug(1997)J. Immunol. Methods 204:77-87; Boder(1997)Nat. Biotechnol. 15:553-557におけるような、ヒトを含めた哺乳動物細胞における一過性または安定な発現ペプチドにより発現させることもできる;米国特許第5,976,833号も参照

0094

本発明は、Chk1および/またはChk2/Cds1キナーゼ活性、および/またはG2期細胞周期停止チェックポイントを阻害するかまたは消去するために使用できる潜在的な化合物(「候補化合物」)のスクリーニングのための組成物および方法を提供する。例えばそのようなスクリーニングは、Chk1およびChk2/Cds1キナーゼが本発明のモチーフを含むペプチドおよびポリペプチドをリン酸化することを、in vitroおよびin vivoで検定することが含まれる;以下の実施例1参照。ペプチドリン酸化の阻害剤が候補化合物である。別法として、以下の実施例1に示されたような実験、またはそれらの変形を取り入れた検定は、Chk1および/またはChk2/Cds1キナーゼ活性、および/またはG2期細胞周期停止チェックポイントを阻害または消去する候補化合物を検定するためにデザインされる。

0095

一つの態様においては、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、固形支持体に結合することができる。固形支持体は、例えば、膜(例えばニトロセルロースまたはナイロン)、マイクロタイタープレート(例えばPVC、ポリプロピレン、またはポリスチレン)、試験管ガラスまたはプラスチック)、ディップスティック(例えば、ガラス、PVC、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスおよびその他)、マイクロフュージチューブ、またはガラス、シリカ、プラスチック、金属またはポリマービーズ、または紙などの他の物質を含めることができる。一つの固形支持体は、ペプチド上に加工されたヒスチジンタグに対して特異的に結合する金属(例えば、コバルトまたはニッケル)-含有カラムを用いている。

0096

固形支持体に対するペプチドの接着は、直接的(すなわち、タンパク質がその固形支持体に接触する)か、または間接的(特定の化合物または複数の化合物がその支持体に結合し、標的タンパク質は固形支持体よりもこの化合物に対して結合する)とすることができる。ペプチドは共有結合により(例えば、システイン残基の単一の反応性チオール基を利用すること(例えば、Colliuod(1993)Bioconjugate Chem. 4:528-536参照)、または非共有結合的であるが、特異的に(例えば、固定された抗体により(例えば、Schuhmann(1991)Adv. Mater. 3:388-391; Lu(1995)Anal. Chem. 67:83-87参照;ビオチン/ストレプトアビジン系(例えば、Iwane(1997)Biophys. Biochem. Res. Comm. 230:76-80参照);金属キレート、例えばラングミュアブロジェット膜(例えば、Ng(1995)Langmuir 11:4048-55参照);ポリヒスチジン融合物の結合のための金属キレート自己集合単層(例えば、Sigal(1996)Anal. Chem. 68: 490-497参照)により固定化できる。

0097

間接的な結合は、市販の種々のリンカーを用いて行なうこと可能である。反応性の末端は:N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)活性エステル、イミドエステル、アルデヒドエポキシドハロゲン化スルホニルイソシアネートイソチオシアネート、およびハロゲン化ニトロアリールなどのアミノ反応性末端;およびピリジルジスルフィド、マレイミド、チオフタルイミド、および活性ハロゲンなどのチオール反応性末端を含むがこれに限定されることはなく、種々の官能物のいずれかとすることができる。ヘテロ二官能性架橋試薬は、二つの異なる反応性末端、例えばアミノ反応性末端およびチオール反応性末端を有するのに対し、ホモ二官能性架橋試薬は、二つの同様な反応性末端、例えばスルフヒドリル-含有化合物架橋を可能にするビスマレイミドヘキサン(BMH)を有する。スペーサー可変の長さの、脂肪族または芳香族とすることができる。市販のホモ二官能性架橋試薬は、ジメチルアジピミデートジヒドロクロリドDMA);ジメチルピメリミデートジヒドロクロリド(DMP);およびジメチルスベリミデートジヒドロクロリド(DMS)を含むが、これに限定されない。ヘテロ二官能性架橋試薬は、N-スクシンイミジルブロモアセテートおよびN-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)などの活性ハロゲン-NHS活性エステルカップリング剤、およびスルフォスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(スルホ-SIAB)(Pierce)などのスルフォスクシンイミジル誘導体を含む。カップリング剤のもう一つの群は、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジジチオプロパネート(SPDP)(Pierce Chemicals, Rockford,IL)などの、ヘテロ二官能性およびチオール切断可能な試薬である。

0098

本発明のポリペプチドおよびペプチドの固形支持体への結合のために、抗体を用いることができる。このことは、ペプチド特異抗体をカラムへ直接結合するによって行うことができ、または、例えば既知のエピトープ(例えば、タグ(例えばFLAG、myc)または適当な免疫グロブリン定常ドメイン配列(「イムノアドジン(immunoadhesin)」例えばCapon(1989)Nature 377:525-531(1989)参照)に結合されたモチーフを含んでいるペプチドを含む融合タンパク質を作成することによって行うことができる。

0099

Chk1および/またはChk2/Cds1キナーゼ活性、および/またはG2期細胞周期停止チェックポイントを阻害または消去する「候補化合物」のスクリーングに使用できる種々の検定フォーマットがある。例えば、前文に議論したように、本発明のモチーフを含んでいるペプチドのリン酸化を阻害する化合物を候補化合物とすることができる。別法として、本発明のモチーフに対して特異的に結合する化合物を候補化合物とすることとができる。結合検定のための異なるフォーマットについての全般的な記載は、例えばBASICAND CLINICALIMMUNOLOGY, 7th Ed. (D. Stiles and A. Terr, ed.)(1991); ENZYME IMMUNOASSAY, E.T. Maggio, ed.,CRCPress, Boca Raton, Florida (1980); and "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" in P. Tijssen, LABORATORY TECHNIQUESIN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier Science Publishers, B.V. Amsterdam (1985) を参照。

0100

コンビナトリアルケミカルライブラリーは、新規な化学組成物手がかり、すなわちChk1および/またはChk2/Cds1キナーゼを阻害、および/またはG2期細胞周期停止チェックポイントを阻害または消去する化合物を生成するための助けとなる一つの手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物学的合成により、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」を結びつけることにより生成される種々の化学組成物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリーは、アミノ酸と呼ばれる化学的なビルディングブロックのセットを、所与の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)について可能なすべての方法で結びつけることにより形成される。化学的なビルディングブロックについてのこのようなコンビナトリアルミキシングを通して、多数の化学組成物を合成することが可能である。例えば、100の可換的な化学的ビルディングブロックについての系統的なコンビナトリアルミキシングは、結果として1億個の4量体化合物または100億個の5量体化合物を系統的に生じる(例えば、Gallop et al.,(1994)37(9):1233-1250参照)。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、この技術における当業者には周知であり、例えば、米国特許第6,004,617号;5,985,365号を参照のこと。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ペプチドライブラリー(例えば米国特許第5,010,175号;Furka(1991)Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493、Houghton et al.,(1991)Nature, 354:84-88参照)を含むが、これに限定されない。化学的な多様なライブラリーを作成するための他の化学は、ペプトイド(peptoids)(例えば、WO91/19735参照)、コード化ペプチド(例えば、WO93/20242参照)、ランダムバイオオリゴマー(例えば、WO92/00091参照)、ベンゾジアゼピン(例えば、米国特許第5,288,514号参照)、ヒダントインベンゾアゼピン、およびジペプチド(例えば、Hobbs(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913参照)などのダイバーソマー(diversomer)、ビニログ性ポリペプチド(例えば、Hagihara(1992)J. Amer. Chem. Soc. 114:6568参照)、β-D-グルコース骨格をもつ非ペプチド性ペプチド模倣物(例えばHirschmann(1992)J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218参照)、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成(例えば、Chen(1994)J. Amer. Chem. Soc. 116:2661参照)、オリゴカルバメート(例えば、Cho(1993)Science 261:1303)、および/またはペプチジルホスホネート(例えば、Campbell(1994)J. Org. Chem. 59:658参照)を含むが、これに限定されない。またGordon(1994)J. Med. Chem. 37:1385参照;核酸ライブラリーペプチド核酸ライブラリーについては、例えば米国特許第5,539,083号参照;抗体ライブラリーについては、例えばVaughn(1996)Nature biotechnology 14:309-314参照;炭水化物ライブラリーについては、例えばLiang et al.,(1996)Science 274:1520-1522、米国特許第5,593,853号参照;有機低分子ライブラリーについては、例えばイソプレノイドについては米国特許第5,569,588号参照;チアゾリジノンおよびメタチアゾノンについては、米国特許第5,549,974号参照;ピロリジンについては米国特許第5,525,735号および5,519,134号;モルフォリノ化合物については、米国特許第5,506,337号;ベンゾジアゼピンについては、米国特許第5,288,514号を参照。

0101

コンビナトリアルケミカルライブラリーを調製するための装置は市販されている(例えば、米国特許第6,045,755号; 5,792,431号; 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, FosterCity, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA参照)。多くのロボット工学ステムもまた、液相化学用に開発されている。これらのシステムは、自動化されたワークステーション、例えばタケTakeda Chemical Industries,LTD(大阪、日本)、および多くのロボット工学システムを利用したロボットアーム(Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif)を含み、これらは化学者によって行なわれた手仕事による合成操作を模倣している。上記の装置のいずれもが、本発明の使用に適している。これらの装置をここで議論されたように操作するために変更することは(もしそれがあれば)、関連技術に熟練者には明らかであろう。さらに、多くのコンビナトリアルケミカルライブラリーそれ自体が市販されている(例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなど)。

0102

一つの態様においては、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、薬理学的組成物を形成するために薬剤学的に許容される担体(賦形剤)と結びつけられる。薬剤学的に許容される担体は、例えば安定化のため、または本発明の薬理学組成物の吸収またはクリアランス速度を増加または減少させるように作用する生理学的に許容される化合物を含む。生理学的に許容される化合物は、例えばグルコーススクロース、またはデキストロースなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンといった抗酸化剤キレート剤、低分子タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのクリアランスまたは加水分解を減じる組成物、または賦形剤または他の安定化剤および/または緩衝剤を含むことができる。界面活性剤もまた、リポソームを含め、この薬剤組成物を安定化させるか、または吸収を増加または減少させるように用いることができる。薬剤学的に許容される担体および、ペプチドおよびポリペプチドのための製剤は、当業者には周知であり、学術文献および特許文献において詳細に記載されている。例えばRemingtonのPharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaの最新版を参照されたい。

0103

他の生理学的に許容される化合物は、湿潤剤乳化剤分散剤、または微生物の増殖および活動を妨げるために特に有用な保存剤を含む。例えばフェノールおよびアスコルビン酸を含む種々の保存剤が周知である。当業者は、生理学的に許容される化合物を含め、薬理学的に許容される担体の選択が、本発明のペプチドまたはポリペプチドの、例えば投与経路、およびその特定の物理化学的特徴に依存することを納得するであろう。

0104

一つの態様においては、本発明のペプチドまたはポリペプチドは、薬理学的に許容される担体、例えば、もしその組成物が水溶性であれば、水溶性の担体に溶解される。腸内非経口、または経粘膜薬剤デリバリー用の製剤に使用されることが可能な水溶液の実例は、例えば水、食塩水リン酸緩衝化生理食塩水、ハンクス液リンガー液、デキストロース/食塩水、グルコース溶液等である。この製剤は、緩衝化剤張性調節剤、湿潤剤、界面活性剤等の、適当な生理学的条件に必要とされるような薬剤学的に許容される補助物質を含むことができる。添加剤はまた、殺菌剤または安定化剤などの付加的な活性成分を含むことができる。例えば、そのような溶液酢酸ナトリウム乳酸ナトリウム塩化ナトリウム塩化カリウム塩化カルシウムソルビタンモノラウレート、またはトリエタノールアミンオーレートを含むことができる。これらの組成物は、通常の、周知の滅菌技術により滅菌するか、またはろ過滅菌することができる。結果として得られる水溶液は、そのままで使用するか、または凍結乾燥して包装することが可能であり、凍結乾燥された標品は投与に先立ち滅菌水溶液と混合される。これらの製剤におけるペプチドの濃度は広く可変であり、主として溶液の体積粘性、体重、およびその他に基づいて選択された特定の投与様式および患者のニーズに従って、選択される。

0105

固形の製剤は、腸内(経口)投与用に使用することができる。それらは、例えば丸薬錠剤粉末、またはカプセルとして製剤化することができる。固形の組成物のためには、通常の非毒性担体が使用可能であり、それらは、例えば薬剤等級マンニトールラクトースデンプンステアリン酸マグネシウムサッカリンナトリウム滑石セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、その他を含む。経口投与用には、薬剤学的に許容される非毒性組成物は通常使用される何らかの賦形剤を加えることにより形成されるが、その賦形剤は先にリストされた担体などであり、一般的には活性成分(例えばペプチド)の10%〜95%である。非固形製剤もまた腸内投与用に使用することができる。その担体は種々の油から選択され、例えば石油、動物、植物または合成起源の油、例えばピーナツ油、大豆油鉱物油ゴマ油、その他である。適当な薬剤賦形剤は、例えばデンプン、セルロース、滑石、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン麦芽、米、小麦粉チョークシリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステア酸ナトリウムグリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳グリセロールプロピレングリコール、水、エタノールを含む。

0106

本発明のペプチドおよびポリペプチドは、経口投与された場合、消化から保護されることが可能である。このことは、ペプチドまたはポリペプチドを、酸性および酵素性の加水分解に対して抵抗性にする組成物と複合するか、またはそのペプチドまたは複合体をリポソームなどの適当な抵抗性担体内に包装するかのいずれかにより達成される。消化から化合物を保護するための手段は、この技術分野において周知であり、例えばFix(1996)Pharm. Res. 13:1760-1764; Samanen(1996)J. Pharm/Pharmacol. 48:119-135;治療薬剤の経口デリバリーのための脂質組成物について記載している米国特許第5,391,377号参照(リポソームデリバリーは以下においてさらに詳細に議論される)。

0107

全身投与もまた、経粘膜または経皮的手段として可能である。経粘膜または経皮投与のためには、浸透されるべきバリアに対する適当な浸透剤を使用して製剤化することが可能である。そのような浸透剤はこの技術分野において一般的に周知であり、例えば経粘膜投与のための浸透剤は胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。さらに、浸透を促進するためには界面活性剤の使用が可能である。経粘膜投与は、鼻用プレイまたは坐剤の使用が可能である。例えば、Sayani(1996)"Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae" Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85-184参照のこと。局所用の経皮投与用の薬剤は軟膏クリーム塗剤、粉末およびゲルとして製剤化される。経皮デリバリー系はまた、パッチも含むことができる。

0108

ペプチドおよびポリペプチド複合体はまた、製剤を内部に到達させることのできる持続性のデリバリーまたは持続性放出機構において投与されることも可能である。例えば、生物分解性マイクロスフェアまたはカプセル、あるいはペプチドの持続性デリバリーが可能な他の生物分解可能なポリマー構造を、本発明の製剤に含むことができる(例えば、Putney(1998)Nat. Biotechnol. 16:153-157参照)。

0109

吸入用には、ペプチドおよびポリペプチドは乾燥粉末エアロゾル、液体デリバリー系エアジェット系、噴射系、その他を含め、この技術分野において周知のどの系を用いてもデリバリーが可能である。例えば、Patton(1998)biotechniques 16:141-143; 例えば、Dura Pharmaceuticals (San Diego, CA)、Aradigm (Hayward, CA)、Aerogen (Santa Clara, CA)、Inhale Therapeutic Systems (San Carlos, CA)等によるポリペプチド高分子のための吸入デリバリーシステムを参照のこと。例えば、この薬剤製剤は、エアロゾルまたはミストの形状において投与される。エアロゾル投与用には、この製剤は界面活性剤および噴射剤とともに微細分配された形状で供給される。もう一つの態様においては、呼吸組織に対して製剤をデリバリーするための装置は、その中で製剤が気化される噴射器である。他の液体デリバリー系は、例えばエアジェットネブライザー(air jet nebulizers)を含む。

0110

本発明の薬剤の調製においては、薬物動態および生体内分布を変えるために、製剤が種々に変更され、かつ操作されることが可能である。当業者には、薬物動態および生体内分布を変えるための多くの方法が周知である。そのような方法の実例は、タンパク質、脂質(例えば、リポソーム、以下参照)、炭水化物、または合成ポリマー(前文に議論された)などの物質から成る小疱内での複合体の保護を含む。薬物動態についての全般的な議論は、例えばRemingtonの第37-39章を参照のこと。

0111

本発明の方法において用いられるペプチドおよびポリペプチド複合体は、単独または薬剤組成物として、この技術分野において周知の、例えば全身性局所性または局部性の(例えば、腫瘍の内部へ直接に、または腫瘍に向けた)手段により;動脈内、クモ膜下(IT)、静脈内(IV)、非経口、胸腔内局所、経口によるか、または皮下、気管内(例えば、エアロゾルによる)、または経粘膜(例えば、バッカル膀胱子宮直腸鼻粘膜への)のような局部性の投与により到達されることが可能である。投与可能な組成物の実際の方法は周知であるか、または当業者には明らかであろうし、また学術文献および特許文献において詳細に記載されており、例えばRemingtonを参照されたい。「局所効果」については、例えば特定の臓器に焦点を合わせるため一つの投与形式は、動脈内またはクモ膜下(IT)注射、例えば特定の臓器、例えば脳およびCNSに焦点を合わせるための注射を含む(例えば、Gurun(1997)Anesth Analg. 85:317-323参照)。例えば、本発明のペプチドまたはポリペプチド複合体を脳に直接到達させることが望ましい場合には、頚動脈内注射が好まし。非経口投与は、もし高い全身性の投与量が必要とされるなら、好ましいデリバリー経路である。非経口投与可能な組成物の調製のための実際の方法は、当業者には周知または明らかであり、例えばRemingtonに詳細に記載されている。また、Bai(1997)J. Neuroimmunol. 80:65-75; Warren(1997)J. Neurol. Sci. 152:31-38; Tonegawa(1997)J. Exp. Med. 186:507-515を参照のこと。

0112

一つの態様においては、本発明のペプチドまたはポリペプチドを含んでいる薬剤製剤は、脂質単層または二重層、例えばリポソームに取り込まれており、例えば米国特許第6,110,490号;6,096,716号;5,283,185号;5,279,833号を参照されたい。本発明はまた、水溶性のペプチドまたは複合体が単層または二重層の表面に付着されている製剤を提供する。例えば、ペプチドはヒドラジン-PEG-(ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン含有リポソームに付着させることが可能である(例えば、Zalipsky(1995)Bioconjug. Chem. 6:705-708参照)。リポソームまたは、平面脂質膜インタクトな細胞、例えば赤血球の細胞膜などの、何らかの形状の脂質膜が使用可能である。リポソーム製剤は静脈内、経皮(例えば、Vutla(1996)J. Pharm. Sci. 85;5-8参照)、経粘膜、または経口投与を含む、どの手段によることも可能である。本発明はまた、本発明のペプチドおよび/または複合体が、ミセルおよび/またはリポソーム内に取り込まれている薬剤製品(例えば、Suntres(1994)J. Pharm. Pharmacol. 46:23-28; Woodle(1992)Pharm. Res. 9:260-265参照)も提供する。リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な、かつまたこの技術分野において周知の方法に従って調製されることが可能であり、例えば、Remington;Akimaru(1995)Cytokines Mol. Ther. 1:197-210; Alving(1995)Immunol. Rev. 145:5-31; Szoka(1980)Auu. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467、米国特許第4,235,871号;4,501,728号;および4,837,028号を参照されたい。

0113

薬剤組成物は、投与の方法に依存して種々の単位用量の形状において投与することができる。ペプチドおよびポリペプチド薬剤組成物の典型的な用量が当業者に周知である。そのような用量は、典型的に全く随意であって、特定の治療内容および患者の許容度などに依存して調整される。このことを達成するためのペプチドまたはポリペプチドの量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用量スケジュールおよびこの用途のために有効な量、すなわち「投薬レジメ」は、疾病の段階または症状、疾病または症状の厳しさ、患者の全般的な健康状態、患者の肉体的状況年齢、および活性薬剤の薬剤製剤および濃度、その他を含む種々の因子に依存する。患者のための用量レジメの算定においては、投与の様式もまた考慮される。用量レジメはまた、薬物動態、すなわち薬剤組成物の吸収速度、生物学的利用能、代謝、クリアランス等も考慮しなければならない。例えば、Remingtonの最新版;Egleton(1997)"Bioavailability and transport of peptides and peptide drugs into the brain" Peptides 18:1431-1439; Langer(1990)Science 249: 1527-1533を参照のこと。

0114

治療用の適用のためには、組成物は癌を罹患している患者に対し、少なくとも部分的にその疾病および/またはその合併症を止めるために充分な量が投与される。例えば、一つの態様においては、可溶性ペプチド薬剤組成物の静脈内(IV)投与の用量は、数時間にわたり(典型的には1、3または6時間)約0.01mg/時間〜約1.0mg/時間となり、それは間欠性サイクルで数週間にわたって反復される。体腔内または臓器の内腔、例えば脳脊髄液CSF)などの、特にその薬剤が隔離された部位に投与され、血流内にではない場合は、かなり高い用量(約10mg/mlまで)を用いられることができる。

0115

以下の実施例は説明のために提供されるものであって、特許請求された本発明を限定するためのものではない。
実施例1:DNA損傷剤に対して癌細胞を選択的に感作するための本発明のペプチドの投与

0116

本発明は、特に癌細胞などの傷害を受けたG1期細胞周期停止チェックポイントをもつ細胞を、DNA損傷剤に対して感作するための組成物および方法を提供する。以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、(未損傷のG1期チェックポイントを有する正常細胞に対比して)癌細胞を選択的に殺すことが有効であることを証明する実験について記載する。具体的には、これらの実験は、本発明の二つの代表的なポリペプチドの合成および用途について記載する。ヒトCdc25C(配列番号1)のアミノ酸211〜221に対応する二つのペプチドを、HIV-1-TAT(配列番号5)と融合した。これらのペプチドはhChk1キナーゼ(配列番号3)およびChk2/HuCds1(配列番号4)キナーゼ活性をin vitroにおいて阻害し、かつin vivoにおいてG2期チェックポイントを特異的に消去することが証明された。
薬品および試薬:

0117

ブレオマイシンおよびコルヒチンは、和光純薬社(大阪、日本)から購入した。ヒドロキシウレアはSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から購入した。これらの化学物質は、蒸留水中に、各々10、5および50mg/mlで溶解し、4℃で貯蔵し。14-3-3βに対する抗体はSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から購入し、抗ウサギIgG西ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体はAmersham Life Sciences (Arlington Heights,IL)から購入した。HAおよびc-mycに対する抗体、およびプロテインGセファロースはSanta Cruz BiotechnologyおよびAmersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)から各々購入した。
細胞培養およびプラスミド:

0118

ヒトT細胞白血病由来の細胞株、Jurkatは、10%ウシ胎児血清(IBL: Immuno-Biological Laboratories、群、日本)を補充したRPMI1640(Sigma)中で、37℃/5% CO2にて培養した。ヒト膵臓類上皮癌由来の細胞株、MIAPaCa2およびPANC1は、イーグルMEM(Iwaki、千葉、日本)およびダルベッコ変法イーグル培地中にて、各々4mMのl-グルコース(Sigma)および1.0mMのピルビン酸ナトリウム(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)とともに、また10%ウシ胎児血清を補充し、37℃/5% CO2で培養した。正常なヒト末梢血白血球は、Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech)密度勾配により収集した。200万細胞/mlを、10%ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640中で、37℃/5% CO2にて、5μg/mlのPHA(Life Technologies)の存在下に1週間培養した。HA-タグhChk1(配列番号3)またはc-myc-タグChk2/HuCds1(配列番号4)を含むバキュロウイルス溶解物、およびGST-Cdc25C(アミノ酸200-256)用のプラスミドは、Matsuoka(1998)Science 282:1893-1897の記載に従って作成され、ナカニシ・マコト博士(名古屋市立大学、生化学教室)により提供された。

0119

ペプチド:

0120

TAT-S216ペプチドは、NH2-末端の11アミノ酸TATタンパク質導入ドメイン(YGRKKRRQRRR(配列番号5);例えばNagahara(1998)Nature Med. 4:1449-1452参照のこと)を含むように合成され、ヒトCdc25Cアミノ酸配列(配列番号1)由来の対応するアミノ酸211-221が連結された(S216;LYRSPASMPENL)。TAT-S216A(S216A;LYRSPSMPENL)(配列番号6)は、セリン-216をアラニンに変換した。TAT-コントロール(GGRSPAMPE)(配列番号7)は、Cdc25Cタンパク質は部分的に欠失され、グリシンを用いて置換された。すべてのペプチドはSawady Technology Co(東京、日本)により合成された。
組換えGST-Cdc25Cタンパク質の精製:

0121

大腸菌DH5α細胞をGST-Cdc25C(200-256)プラスミドにより形質転換した。細胞を0.1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシドとともに2時間インキュベートし、回収し、50mMトリスHCl(pH8.0)、100mMNaCl、0.5% NP-40、5μg/mlアプロティニン、5μg/mlペプスタチンA、および5μg/mlロイペプチンを含む緩衝液を用いて溶解した。溶解物を超音波処理し、遠心分離により清澄化し、グルタチオン-セファロース4BTMビーズとともに4℃にて1時間インキュベートし、5回洗浄した。
キナーゼ分析:

0122

組換えバキュロウイルス(例えば、Kaneko(1999)Oncogene 18:3673-3681)を用いて昆虫細胞内に発現したHA-タグhChk1(配列番号3)およびc-myc-タグChk2/HuCds1(配列番号4)を、抗HAおよび抗c-myc抗体、およびプロテインG-セファロースを用いた免疫沈降により精製した。免疫複合体のキナーゼ反応は、1mMのDTT、1mMのMgCl2、および100μCiの[γ-32P]ATP(Amersham;6000Ci/mmol)に加えて、精製された1μのMGST-Cdc25Cまたは10μMのCdc25Cペプチド(Cdc25Cのアミノ酸211-221(配列番号1));LYRSPSMPENL、Sawady Technology Co.)基質とともに30℃において15分間、10μMのTAT-S216、TAT-S216AまたはTAT-コントロールの存在下で行った。反応の後、試料を12%または15% SDS-PAGEにより分離し、GST-Cdc25Cまたはペプチドリン酸化を検出ためにオートラジオグラフ処理した。
細胞周期分析

0123

ペプチドおよび/またはブレオマイシンまたはコルヒチンにより処理した細胞の細胞周期状態は、Kawabe(1997)Nature 385:454-458に記載されているように、FACSにより分析した。簡単に説明すれば、200万個のJurkat細胞を再件濁し、300μlのKrishan's solusion(0.1%クエン酸ナトリウム、50μg/mlのPI、20μg/mlのRNaseA、および0.5% NP-40;上記参照)中で、4℃にて1時間インキュベートし、FACScanTM(Beckton Dickinson, Mountain View, CA)により、プログラムCELLQuestTM(Beckton Dickinson)を用いて分析した。
ヒストンH1キナーゼ分析:

0124

1000万個のJurkat細胞を、TAT-S216A、TAT-S216またはTAT-コントロール(10μM)を添加または無添加の状態で、ヒドロキシウレア(100μg/ml)、ブレオマイシン(10μg/ml)またはコルヒチン(5μg/ml)で6時間処理した。細胞を冷却されたPBS中で洗浄し、4℃で1mlの緩衝液A(50mMトリスpH8、2mMのDTT、5mMのEDTA、100mMのNaCl、0.5% NP40、20mMのNa3VO4、50mMのNaF、4μMのオカダ酸、5μg/mlのアプロティニン、5μg/mlのペプスタチンAおよび5μg/mlのロイペプチン)中にて溶解した。20マイクロリットルのp13suc1アガロースビーズ(Upstate Biotechnology., Saranac, NY)を清澄化された溶解物に添加し、4℃で4時間インキュベートし、5mMのEDTA、20mMのNa3VO4、50mMのNaF、4μMのオカダ酸のない緩衝液Aを用いて5回洗浄した。ビーズ上のヒストンH1キナーゼ活性は、Cdc2キナーゼ分析キット(Upstate Biotechnology)を、[γ-32P]ATPとともに使用することにより分析し、12% SDS-PAGE電気泳動を行う、さらにリン酸化されたヒストンH1を検出するためにオートラジオグラフ処理した。
細胞毒性検定:

0125

MIA PaCa2およびPANC1細胞(3x103/ウェル)を、96穴マイクロタイタープレートに播種した。一晩の接着の後、細胞をブレオマイシン(10μg/ml)と共に、様々な時点で指示されたTAT-ペプチドが存在するかまたは存在しない状態で96時間までインキュベートした。細胞毒性および細胞生存は、3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸水和物(XTT)検定(Cell Proliferation Kit IITM;Boehringer Mannheim, Germany)により測定した、この測定は、会社のプロトコールおよびScudiero(1988)Cancer Res. 48:4827-4833に従って行った。
TAT-S216およびTAT-S216AペプチドがhChk1およびChk2/HuCds1キナーゼ活性を阻害する:

0126

hChk1(配列番号3)およびChk2/HuCds1(配列番号4)キナーゼ活性を阻害するため、およびDNA損傷誘導性G2期停止を消去するため、Cdc25Cのアミノ酸残基(配列番号1)211-221を含む合成ペプチド、およびTATタンパク質導入ドメイン変異体(YGRKKRRQRRR(配列番号5)(TAT-S216)を生成した。

0127

この結果は図1に示されている:TAT-S216AおよびTAT-S216ペプチドは、in vitroにおいてhChk1およびChk2/HuCds1キナーゼ活性を阻害する。図1Aはペプチドの配列、図1BはGST-Cdc25Cを用いたin vitroにおけるリン酸化分析および精製されたhChk1である。大腸菌(DH5α)で産生されたGST-Cdc25C(アミノ酸200-256)を基質(1μM)として使用した。免疫複合体のキナーゼ反応は、TAT-S216A(10μM)およびTAT-S216(10μM)の存在下で行なわれた。図1CはCdc25C(LYRSPSMPENL)のアミノ酸211-221に相当する合成されたCdc25Cペプチドを基質(10μM)として用いたhChk1およびChk2/HuCds1のin vitroリン酸化分析である。

0128

セリン216がアラニンにより置換されたTAT-S216Aペプチド(-S216A; LYRSPSMPENL(配列番号6))は、そのhChk1(配列番号3)およびChk2/HuCds1(配列番号4)との相互作用の一過性の状態を安定化させために作成された(図1A)。このTATペプチドは、これらのペプチドを細胞内に効果的に導入するために加えられた(例えば、Nagahara(1998)上記参照)。この配列は、異質タンパク質の細胞膜を横切る取り込みを促進することが知られている。対照ペプチドとして、このペプチドのCdc25C部分の一部を欠失した(TAT-コントロール)。

0129

図1Bに示されたように、hChk1(配列番号3)は、GSTを融合したCdc25Cタンパク質(残基200-256)(配列番号1)をリン酸化することができた。Cdc25C(配列番号1)上のセリン-216は、この融合タンパク質のin vivoにおける主要なリン酸化部位である(例えば、Furnari(1997)Science 277:1495-1497; Sanchez(1997)Science 277:1497-1501; Peng(1997)Science 277:1501-1505参照のこと)。

0130

図1Bにおいては、TAT-S216およびTAT-S216Aの双方は、バキュロウイルスに産生されたhChk1(配列番号3)によるCdc25Cのリン酸化を阻害した。TAT-S216Aではなく、TAT-S216がhChk1によって効率的にリン酸化されたが、このことは、TAT-S216上のセリン216がhChk1によりリン酸化され、TAT-S216は、もし非常に充分な量で存在する場合には、過剰なモル比において基質のリン酸化を競合性に阻害することを示唆する。

0131

図1Cに示されたように、TAT-S216Aは低いストイキオメトリーにおいてでさえも(基質Cdc25Cに対して4倍のモル過剰のTAT-S216Aペプチドにおいて)、hChk1(配列番号3)およびChk2/HuCds1(配列番号4)で媒介されるCdc25Cペプチド(残基200〜256)(配列番号1)のリン酸化を有意に阻害した。
TAT-S216およびTAT-S216Aペプチドによる、DNA損傷誘導性G2期チェックポイントの消去:

0132

TAT-S216AまたはTAT-S216を用いて処理された細胞の細胞周期状態を、DNA損傷誘導性のG2期停止に関してFACS分析した。これらの細胞のヒストンH1キナーゼ活性を同時にモニターした。Jurkat細胞は、ブレオマイシン(10μg/ml)処理によりG2期で完全に停止したが、それは機能性のp53をもたないためである。結果は図2:TAT-S216AおよびTAT-S216ペプチドによるDNA損傷誘導性G2停止の消去に示されている。図2Aは、プレマシンおよびペプチドにより処理されたJurkat細胞についてのFACS分析である。細胞は、ペプチド(10μM)の存在または非存在下で、ブレオマイシン(10μg/ml)により20時間処理された。BはヒストンH1キナーゼ分析である。細胞溶解物は、指示された試薬を用いて6時間処理された細胞から調製された。使用された濃度は:ヒドロキシウレア(HU)は100μg/ml;ブレオマイシン(Bleo)は10μg/ml;コルヒチンは5μg/ml;TAT-S216AおよびTAT-S216は10μMであった。Cは、コルヒチン処理およびペプチド処理された細胞のFACS分析である。Jurkat細胞はペプチド(10μM)の存在または非存在下で、コルヒチン(5μg/ml)により20時間処理された。

0133

図2Aに示されたように、G2期停止はTAT-S216AまたはTAT-S216の添加により、ブレオマイシンに反応して完全に消去された。G2期停止はTAT-S216AまたはTAT-S216処理により、12時間および48時間の間のどの時点においても消去された。TAT-コントロールとともにブレオマイシンで処理されたJurkat細胞は、ブレオマイシンのみで処理された細胞と同様にG2期で停止した。

0134

また本発明者らは、TAT-S216AまたはTAT-S216がガンマ照射およびシスプラチン(ガンマ照射、5Gy;シスプラチン、1μg/mlの1時間処理)により誘導されるG2期停止も消去することを観察した。G2/M移行についてのこれらのペプチド効果をさらに分析するため、ヒストンH1キナーゼ活性をモニターした。上記の結果と一致して、H1キナーゼ活性はブレオマイシンまたはヒドロキシウレアによる処理により減じられたが、TAT-S216AまたはTAT-S216の存在下でのブレオマイシン処理では変化がないか、またはむしろ増加した(図2B)。TAT-コントロールペプチドの存在下では、ブレオマイシン処理はH1キナーゼ活性に影響を及ぼさなかった。

0135

図2Cに示されたように、コルヒチンにより誘導されるJurkat細胞のM期停止は、TAT-S216AまたはTAT-S216の添加により何ら影響されなかった。これらの結果は、TAT-S216AまたはTAT-S216が、hChk1(配列番号3)および/またはChk2/HuCds1(配列番号4)キナーゼ活性を阻害することにより、活性化したDNA損傷のG2期細胞周期チェックポイントを特異的に消去することを証明している。
TAT-S216AおよびTAT-S216ペプチドによる、Jurkat細胞のブレオマイシン誘導性細胞死への感作:

0136

ブレオマイシンによって誘導される細胞死に対するTAT-S216AまたはTAT-S216の効果を調べた。この結果は図3に示されている。図3は、指示されたペプチドの存在または非存在下で、ブレオマイシン(A)またはコルヒチン(B)により処理されたJurkat細胞におけるトリパンブルー色素排除分析である。バーはSD、縦軸は細胞の%生存率;Bleo5はブレオマイシン5μg/ml;Bleo10はブレオマイシン10μg/ml;コルヒチンは5μg/ml;TAT-S216またはTAT-S216Aは指示されたペプチドについて10μMである。TAT-S216AまたはTAT-S216ペプチドが、ブレオマイシンの正常細胞に対する細胞毒性を増大しなかったことに注意されたい。Cはブレオマイシンおよびペプチドにより処理されたPHA幼若細胞生存率分析である。縦軸はトリパンブルー色素排除分析により測定される細胞の%生存率;横軸は時間。Bleo5はブレオマイシン5μg/ml;Bleo10はブレオマイシン10μg/ml;TAT-S216またはTAT-S216Aは指示されたペプチドについて10μMである。Dは、ブレオマイシンおよびペプチドにより処理された細胞のFACS分析である。PHA幼若細胞は、ペプチドの存在または非存在下で、ブレオマイシンで20時間処理された。縦軸は細胞数;横軸はヨウ化プロピジウム染色により示されるDNA含有量である。

0137

図3Aに示されるように、TAT-S216AまたはTAT-S216の添加は、ブレオマイシンにより誘導される細胞死に対してJurkat細胞を効果的に感作した。5または10μg/mlでのブレオマイシンが27〜30%までのJurkat細胞を殺したにすぎないのに対し、10μMのTATー216AまたはTAT-S216の添加は、Jurkat細胞を80%近くまで殺した。対照的に、これらのペプチドはそれら自身では何ら有意な細胞毒性を示さなかった。さらに、対照ペプチドTAT-コントロールは、ブレオマイシン処理されたJurkat細胞の生存率に影響しなかった。さらに、図2Cの結果から期待されたように、TAT-S216AまたはTAT-S216はコルヒチンによる細胞毒性に影響しなかった(図3B)。この観察は、ブレオマイシンの存在下でこれらのペプチドにより誘導される細胞死が、非特異的な細胞毒性効果に帰せられることを示している。
TAT-S216およびTAT-S216Aペプチドは正常細胞の生存率に栄影響しない:

0138

これらのペプチドの、G1期チェックポイントが廃棄されている癌細胞に対する効果の特異性を確認するため、正常な細胞に対するこれらのペプチドの影響を調べた。マイトジェンに活性化された正常なヒトTリンパ球(PHA幼若細胞)は、健康なドナーから取得された末梢血単核細胞をPHAにより1週間刺激することにより調製した。これらの細胞は、TAT-S216AまたはTAT-S216の存在または非存在下で、ブレオマイシン(5および10μg/ml)で処理された。

0139

図3Cに示されたように、これらの細胞はJurkat細胞のように速く複製したが、これらのペプチドはブレオマイシンの細胞毒性効果を増大させなかった。図3Dに示されたように、ブレオマイシン(5μg/ml)により処理されたPHA幼若細胞は、おそらく野性型p53の活性のため、G1およびS期では停止したが、G2期では停止しなかった。これらの細胞が、ブレオマイシンに加えてTAT-S216AまたはTAT-S216により処理された場合、細胞周期の変更にさらなる変化は見られなかった。
TAT-S216AまたはTAT-S216ペプチドによる膵臓癌細胞のブレオマイシン誘導性の細胞死に対する感作:

0140

p53欠損性の二つの膵臓癌細胞株、MIA PaCa2およびPANC1細胞に対するこれらのペプチドの影響を調べた。図4は、ブレオマイシンおよびペプチドにより処理されたPANC1(A)およびMIA PaCa2(B)細胞の生存率分析の結果を示している。PANC1およびMIA PaCa2細胞は、指示されたペプチドの存在または非存在下で、ブレオマイシンにより処理された。細胞の生存率は、3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸水和物検定により、ブレオマイシンおよびペプチド添加後の指示された時間に測定した。Bleo60はブレオマイシン60μg/ml;TAT-S216またはTAT-S216Aは指示されたペプチドについて10μM。バーはSDである。

0141

これらの膵臓癌細胞は種々の抗癌剤に対して抵抗性であることが知られているが、これらの細胞もまたTAT-S216AおよびTAT-S216により、ブレオマイシンに誘導される細胞死に対して感作することができた(図4)。同様に、これらのペプチドはこれらの細胞を、シスプラチンおよびガンマ照射を含めた他のDNA損傷剤による細胞死に対して感作することができた。

0142

要約すれば、これらの実験は、hChk1およびChk2/HuCds1キナーゼ活性の双方を阻害する短いペプチドが、DNA損傷により誘導されたG2期細胞増殖停止チェックポイントを特異的に消去できることを示した。これらのデータはまた、G2期チェックポイントの特異的な消去が、正常な細胞周期およびその生存率に対しては明らかな影響なしに、癌細胞をDNA損傷剤、ブレオマイシンに対して感作したことを証明した。これらの観察は、G2期細胞周期停止チェックポイントに関与しているこれらのキナーゼが、G2期チェックポイントの特異的停止のための理想的な標的であること、および本発明のペプチドおよびポリペプチド、およびそれらの誘導体が、新規な癌療法において使用可能であることを示している。
実施例2:本発明のG2期消去ペプチドのための配列の最適化

0143

以下の実施例は、本発明の代表的なG2チェックポイント消去ペプチドを同定する実験を記載する。この実験は、ヒトChk2キナーゼ(配列番号4)および本発明のペプチドの構造をコンピューター分析することにより行った。

0144

ヒトChk2の3次構造は、コンピュータープログラム、MODELERTM(IMMD、東京、日本)を用いて、別のセリントレオニンキナーゼ、PKA(PDBタンパク質データベース:Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB), The National Science Foundation, Arlington, VA) (1CDK)の一次および3-D構造を比較することにより予測した。本発明のペプチドおよびChk2のアライメントは、Chen(2000)"The 1.7A crystal structure of human cell cycle checkpoint kinase Chk1: implications for Chk1 regulation" Cell 100:681-92に記載されているように、hChk1と種々のCdc25Cペプチドとのアライメントの比較により予測した。hChk2の予測された構造を本発明のペプチドと比較することにより、hChk2にはペプチドとの相互作用に重要な、図5のP1、P2、P3、およびP4において示されたような、4つのポケットがあることが予測された。このようなポケットの構造を、本発明の代表的なペプチドの配列をデザインおよび強めるために用いた。

0145

これらのペプチドに、Chk2キナーゼの活性を消去し、それによってG2期細胞周期チェックポイントを消去する能力を付与する能力は、ヒトChk2キナーゼの基質リン酸化として作用するそれらの能力により証明された。代表的なペプチドは、膜上に直接合成(固定化)し、ヒトChk2キナーゼと接触した。具体的には、3次元モデルから予測されるすべての配列をもつオリゴペプチドを、オートスポットペプチドシンセサイザー、Model ASP-22 2 (ABiMED, Germany)を使用して膜上に直接合成した。ペプチドの量は、約0.1マイクロモル/cm2であった。

0146

この膜を、2% Gly-GlyとともにPBS中にて室温(RT)で2時間(hr)インキュベートした。次いで、膜を0.1% Tween-PBSTMを用いて3回洗浄した。「キネーション(kination)」または「リン酸化」反応は、PBS中に1mM MgCl2、2% Gly-Glyおよびγ-33P-ATPを含む反応緩衝液4ml中に約5μgの濃度の組換え融合タンパク質Gst-Chk2を用いてRTにて1hr行なった。反応の後、膜をRIPA(1% SDS、1% NP-40、100mM NaCl)を用いて5回洗浄si、次いでBass2500TMイメージアナライザー(フジ、日本)により分析した。シグナルは「-」、「+」、「++」または「+++」に等級づけた。表1は、「++」よりも強いシグナルを生じるペプチド配列を示している。ペプチドRYSLPPELSNMおよびLYRSPSAMPENLは、この分析により「+」シグナルを生じる。

0147

以下のすべてのペプチドは、ヒトChk2キナーゼによりリン酸化された;位置「X」(位置X8に相当)においては、X=P、F、Y、またはWであり、X=アミノ酸チロシン(Y)である場合、シグナルは最強(「+++」)であった:
37-40 L Y R S P S H X E N L
52-53 L Y S S P S Y X E N L
92-95 L Y T S P S Y X E N L

0148

117-121 L Y T S P S H X E N L

0149

132-135 L Y H S P S Y X E N L
1127-1130 W Y R S P S F X E N L
1237-1240 W Y T S P S H X E N L

0150

372-375 L F T S P S Y X E N L

0151

637-640 F Y S S P S H X E N L

0152

642-645 F Y T S P S M X E N L

0153

648-651 F Y T S P S F X E N L

0154

652-655 F Y T S P S Y X E N L
1202-1205 W Y T S P S M X E N L
1207-1210 W Y T S P S F X E N L
1212-1215 W Y T S P S Y X E N L

0155

最良リン酸化基質は、ペプチドL Y R S P S Y Y E N LおよびW Y T S P S Y F E N Lであった。

0156

以下の表1は、検査されたペプチドと、ヒトChk2キナーゼ検定によるin vitroリン酸化の結果についての完全なリストである。結果は、下のペプチドの右に表されており:「+++」はそのペプチドが相対的に高度にリン酸化されたことを示し;「++」はそのペプチドが相対的に少なくリン酸化されたことを示し;「+」はそのペプチドが負の対照をよりも、検出可能に有意にリン酸化されたことを示しており、何も表示がないのはペプチドが負の対照よりも有意にリン酸化されなかったことを示している(注意:ペプチドのすぐ右の数字はそのペプチドの分子量である)。

0157

以下の実施例は、本発明の代表的なG2期チェックポイント消去ペプチドを同定した実験を記載する。本発明の以下のペプチドは、膜上に直接合成され、in vitroリン酸化について検査された(前文において記載されたような「キネーション」検定)。

0158

これらのペプチドは、in vitroキネーション反応について検査された。オリゴペプチドはリン酸化の基質として用いられた;添加されたキナーゼは細胞周期G2期チェックポイントに深く関与している。したがって、このキネーション反応を阻害する物質は、細胞周期G2期チェックポイントの消去物質となりえる。このスクリーニング法における基質のリン酸化状態の検出には、同位体標識されたATPおよび抗ホスホペプチド抗体が使用可能である。

0159

hChk1;hChk1融合タンパク質(MBP-ペプチド、GST-ペプチド)、HuCds1/Chk2;HuCds1/Chk2融合タンパク質(MBP-ペプチド、GST-ペプチド);またはDNA損傷細胞からの細胞抽出物を、スクリーニング検定におけるキナーゼとして使用することができる。

0160

基質として検査されたオリゴペプチドは、YX2X3PSX6X7X8N(X2からX9までの各々について;この略号化された9個の残基モチーフにおける第1の位置(X1)「Y」は、前文に記載された11残基のモチーフにおける位置X2に相当する)であり、位置2(X2)および位置3(X3)のアミノ酸残基はGly、Leu、SerまたはArgであり;位置6から8までのアミノ酸残基はGly、Leu、Ser、Met、ProまたはGluである。他の検査されたオリゴペプチド配列変異体は、位置2にはGly、Leu、SerまたはArgのようなアミノ酸残基を有する;位置3にはGly、LeuまたはSerのようなアミノ酸残基を;位置6にはGly、Met、Pro、Gluのようなアミノ酸残基;位置7にはGly、LeuまたはProのようなアミノ酸残基;位置8にはGly、Met、SerまたはGluのようなアミノ酸残基を有する。別の変異体においては、位置2における残基はArg、位置3はSer;位置6はMet;位置7はPro;および位置8はGluであった。

0161

欠損した細胞周期G1期チェックポイントをもつ細胞(ヒト白血病由来の細胞株、Jurkatなど)をDNA損傷剤により処理した。DNA損傷処理として、細胞はブレオマイシンまたは他の抗癌剤により処理した。これらの薬剤は細胞培養培地に添加した。別法として、細胞にガンマ放射線照射した。ペプチドをこれらの細胞に添加し、DNA損傷の約10〜48時間後にDNA量を測定し。回収された細胞を、ヨウ化プロピジウム、RNaseおよびNP-40を含む溶液に再懸濁し、フローサイトメーターにより分析した。もしオリゴペプチド「候補物質」が、この分析によりG2/MにおけるDNAの蓄積を誘導しなければ、その結果は陽性であり、その物質はG2/Mチェックポイントを潜在性に消去する。

0162

G2期細胞周期チェックポイントの選択的な阻害剤を同定するため、他のスクリーニング法を使用することも可能である。例えば、細胞はオリゴペプチド「候補リン酸化基質」と、コルヒチンまたはノコダゾールといったM期チェックポイント活性剤とによって同時に処理する。細胞のDNA含有量を、前文に記載したように処理の約10〜48時間後に分析する。G2/Mにおける細胞の蓄積を妨げない候補物は、このスクリーニング法においては、選択されたG2期チェックポイントの消去物質となりうる。

0163

一つの態様においては、G2期チェックポイント消去物質は、位置2および3においてアミノ酸残基Gly、Leu、SerまたはArgを有しており、位置5〜8においてアミノ酸残基Ser、Gly、Met、ProまたはGluを有する。

0164

本発明の一つの態様においては、その組成物はDNA損傷性抗癌処理のエンハンサーまたは促進剤である。抗癌処理と本発明のG2期チェックポイント阻害性組成物とを用いて、癌細胞を同時に、または連続して処理することにより、癌細胞を効果的に殺すことができる。ほとんどのヒト癌細胞はインタクトなG1期チェックポイントをもたないため、本発明のG2期チェックポイント阻害性組成物によるG2期チェックポイントの消去は、DNA損傷性の方法によって処理された癌細胞を効果的に殺すことになる。本発明の組成物は、薬剤として直接に(例えば、薬剤組成物として)使用されるか、またはこれらのオリゴペプチドはin vivo遺伝子療法として、例えばウイルスベクターまたは他の発現ベクター、例えばプラスミドから、in vivoでの組換えにより発現され得る。

0165

Jurkat細胞を、10%ウシ胎児血清を含む培地(RPMI1640)において:20μg/mlのブレオマイシン;20μg/mlのブレオマイシンおよびペプチド「4aa」(アミノ酸配列はGGSPSM);20μg/mlのブレオマイシンおよびペプチドAAA(表1);20μg/mlのブレオマイシンおよびペプチドYNP(表1)とともに37℃/5% CO2で培養した。DNA量はオリゴペプチド「4aa」、「YNP」および「AAA」の存在または非存在下で、10マイクログラムのブレオマイシン添加の0、6、12、24時間後に分析した。DNA量はフローサイトメーター(FACS)により、ヨウ化プロピジウム、RNaseおよびNP-40を含む溶液の添加後に分析した。

0166

この結果は図6に示されている。左のパネルは実際のフローサイトメーター(FACS)分析の結果である。右のパネルは細胞周期の各期(サブG1、G1、S、G2/M)の細胞の集団を示している。この細胞はG2/M期において蓄積しないことから、この結果はYNPペプチドがG2期チェックポイントを消去したことを示した。

0167

もう一つの実験において、M期チェックポイントアクティベーターであるコルヒチンを、ブレオマイシンの代わりに使用した:2.5μg/mlのコルヒチン;2.5μg/mlのコルヒチンおよびペプチド「4aa」;2.5μg/mlのコルヒチンおよびペプチドAAA(表1);2.5μg/mlのコルヒチンおよびペプチドYNP(表1)、および処理なし。この結果は図7に示されている。上記の検査されたオリゴペプチド(表1)はいずれも、YPNを含め、コルヒチン処理された細胞のG2/M期における蓄積に影響しなかった。これらのデータはYPNが特異的にG2期チェックポイントにおいて細胞周期を消去したことを示した。

0168

検査されたペプチドと、これらの実験からの結果は、図8および図9においてさらに要約されている。
実施例4: 本発明のペプチドはin vivo動物モデルにおいて癌細胞を感作する

0169

以下の実施例は、この技術分野で認められいる動物モデルの実験を記載しており、本発明の代表的なペプチドがDNA損傷剤に対して癌細胞を選択的に感作するための有効な薬剤であることを証明した。特に、ヌードマウス研究は、本発明の組成物および方法についてのin vivoでの有効性を証明した。

0170

ヒトの結腸癌細胞株SW620を、3週齢のBalb/cヌードマウスに皮下注射した(マウスあたり1x108細胞)。注射の約2週間後、定着した直径2〜4mmの皮下腫瘍切除し、同系マウスに移植した。移植の1週間後、シスプラチン(CDDP)およびペプチド(TAT-コントロールおよびTAT-S216、表1参照)の注射を開始した。ペプチドは、組換え融合タンパク質の形態であり、TATは配列番号YGRKKRRQRRRを有するタンパク質導入ドメインであった。シスプラチン(CDDP)は6mg/kgを週1回腹腔内に注射した。ペプチド(100nMにて)は週2回腫瘍内へ注射した。相対的な腫瘍の重量は3および5週時点で査定した。この結果は図10の上部パネルに示されている。同様の実験は、シスプラチンの代わりに5-FUを用いて行なわれた。その結果は図10の下部パネルに示されている。図10に示されたようにS-216を含んでいる融合タンパク質は、動物に投与されたDNA損傷剤に対し、in vivoにおいて癌細胞を効果的に感作した。

0171

同様の実験を、シスプラチン(CDDP)と本発明の別の代表的なペプチド「RandomII」または「R-II」を用いて行った(表1参照)S-216についてと同様に、RIIペプチドはTATとの組換え融合タンパク質の形態とした。シスプラチン(「CDDP」)、CDDPプラスDMSO、CDDPプラスTAT-FLAG、またはCDDPプラスTAT-RandomIIを用い、または用いずに、移植された皮下腫瘍の相対的な体積が測定した。図11に示されたように、R-IIを含んでいる融合タンパク質は、動物に投与されたDNA損傷剤に対してin vivoにおいて効果的に癌細胞を感作した。

0172

本発明の多くの態様が記載されてきた。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から離れることなく、種々の変更が行なわれてよいことが理解されるであろう。したがって、べつの態様は特許請求の範囲内にある。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

  • 株式会社アイムの「 肌状態評価方法」が 公開されました。( 2021/04/30)

    【課題】ターンオーバーのサイクルが長い肌であっても、スキンケア化粧品の本来の使用効果を評価することができる肌状態評価方法を提供する。【解決手段】本発明に係る肌状態評価方法は、スキンケア化粧品の使用効果... 詳細

  • ASSEST株式会社の「 肉質判別プログラム及びシステム」が 公開されました。( 2021/04/30)

    【課題】肉質をより人手に頼ることなく高精度かつ自動的に判別する。【解決手段】肉質を判別する肉質判別プログラムにおいて、判別対象の肉質の外観に関する画像情報を取得する情報取得ステップと、過去において取得... 詳細

  • フルハシEPO株式会社の「 植物栽培用養液の製造方法及び植物栽培方法」が 公開されました。( 2021/04/30)

    【課題】水中で有機物を分解させて硝酸イオンを得る反応を同一の系(槽)で行う植物栽培用養液の製造方法において、有機物分解菌と硝化細菌の添加を個別に制御でき、製造される養液に有害菌が混入する可能性を低くす... 詳細

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ