図面 (/)

技術 TADG−15:癌において過剰発現されている細胞外セリンプロテアーゼ

出願人 ザボードオブトラスティーズオブザユニヴァーシティーオブアーカンソーシステム
発明者 オブライアン,ティモシージェイタニモト,ヒロトシ
出願日 2000年10月20日 (18年10ヶ月経過) 出願番号 2001-531854
公開日 2003年4月2日 (16年4ヶ月経過) 公開番号 2003-512036
状態 拒絶査定
技術分野 生物学的材料の調査,分析 特有な方法による材料の調査、分析 突然変異または遺伝子工学 酵素・酵素の調製 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理 糖類化合物 医薬品製剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 螺旋形態 マッチング数 ガス定量 特定位 製品取扱説明書 標準ソフトウェア タイフィ 実験記録
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2003年4月2日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、TADG−15タンパク質をコードするDNA、ならびにTADG−15タンパク質を提供する。また、組換え細胞における発現適合させた、本発明のDNAを発現できるベクター、および細胞におけるDNAの発現に必要である調節要素を提供する。さらに、本発明は、TADG−15の発現および/またはプロテアーゼ活性阻害する方法、TADG−15mRNAおよび/またはタンパク質を検出する方法、ならびに、TADG−15阻害剤スクリーニングする方法を提供する。さらには、本発明は、TADG−15を介した細胞特異的ターゲティング、ならびに個体にTADG−15に対するワクチン接種を行う方法を提供する。記載の方法は、癌、特に乳癌および卵巣癌診断治療、および予防に有用である。

概要

背景

概要

本発明は、TADG−15タンパク質をコードするDNA、ならびにTADG−15タンパク質を提供する。また、組換え細胞における発現適合させた、本発明のDNAを発現できるベクター、および細胞におけるDNAの発現に必要である調節要素を提供する。さらに、本発明は、TADG−15の発現および/またはプロテアーゼ活性阻害する方法、TADG−15mRNAおよび/またはタンパク質を検出する方法、ならびに、TADG−15阻害剤スクリーニングする方法を提供する。さらには、本発明は、TADG−15を介した細胞特異的ターゲティング、ならびに個体にTADG−15に対するワクチン接種を行う方法を提供する。記載の方法は、癌、特に乳癌および卵巣癌診断治療、および予防に有用である。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
3件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

(a)TADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(b)前記(a)の単離DNAに対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;ならびに、(c)遺伝暗号縮重のせいでコドン配列において前記(a)および(b)の単離DNAと異なり、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;より成る群から選択される、腫瘍抗原誘導遺伝子15(TADG−15)タンパク質をコードするDNA。

請求項2

列番号1記載の配列を有することを特徴とする請求項1記載のDNA。

請求項3

前記TADG−15タンパク質が、配列番号2記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1記載のDNA。

請求項4

請求項1記載のDNAと、細胞における該DNAの発現に必要である調節要素とを含んでなるベクター

請求項5

前記DNAが、配列番号2記載のアミノ酸配列を有するTADG−15タンパク質をコードすることを特徴とする請求項4記載のベクター。

請求項6

TADG−15アンチセンスmRNAが産生されるように、前記DNAが、前記調節要素に対して逆配向で配置されていることを特徴とする請求項4記載のベクター。

請求項7

TADG−15タンパク質を発現する請求項4記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞

請求項8

細菌細胞哺乳類細胞植物細胞、および細菌細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項7記載の宿主細胞。

請求項9

大腸菌であることを特徴とする請求項8記載の宿主細胞。

請求項10

(a)TADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(b)前記(a)の単離DNAに対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;ならびに、(c)遺伝暗号の縮重のせいでコドン配列において前記(a)および(b)の単離DNAと異なり、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;より成る群から選択されたDNAによってコードされる単離および精製TADG−15タンパク質。

請求項11

配列番号2記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項10記載のTADG−15タンパク質。

請求項12

(a)TADG−15に特異的なプローブ試料とを接触させ;さらに(b)前記試料中におけるTADG−15mRNAに対する前記プローブの結合を検出する;各工程を含んでなる、試料中のTADG−15 mRNAを検出する方法。

請求項13

前記試料が生物学的試料であることを特徴とする請求項12記載の方法。

請求項14

前記生物学的試料が個体由来であることを特徴とする請求項13記載の方法。

請求項15

前記個体が、癌を有する疑いがあることを特徴とする請求項14記載の方法。

請求項16

TADG−15に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含んでなる、TADG−15mRNAを検出するキット

請求項17

前記プローブを標識するための標識;および前記標識を検出する手段;をさらに含んでなる請求項16記載のキット。

請求項18

(a)TADG−15またはその断片に特異的な抗体と試料とを接触させ;さらに、(b)前記試料中におけるTADG−15タンパク質に対する前記抗体の結合を検出する;各工程を含んでなる、試料中のTADG−15タンパク質を検出する方法。

請求項19

前記試料が生物学的試料であることを特徴とする請求項18記載の方法。

請求項20

前記生物学的試料が個体由来であることを特徴とする請求項19記載の方法。

請求項21

前記個体が、癌を有する疑いがあることを特徴とする請求項20記載の方法。

請求項22

TADG−15タンパク質またはその断片に特異的な抗体を含んでなる、TADG−15タンパク質を検出するキット。

請求項23

前記抗体を検出する手段をさらに含んでなる請求項22記載のキット。

請求項24

TADG−15タンパク質またはその断片に特異的な抗体。

請求項25

(a)TADG−15タンパク質を含む試料と化合物とを接触させ;さらに、(b)TADG−15プロテアーゼ活性を測定する;各工程を含んでなり、前記化合物の不在下でのTADG−15プロテアーゼ活性と比較して、前記化合物の存在下でのTADG−15プロテアーゼ活性が低いことが、TADG−15を阻害する化合物の指標となることを特徴とする、TADG−15を阻害する化合物をスクリーニングする方法。

請求項26

細胞に請求項6記載のベクターを導入する工程を含んでなり、前記ベクターの発現によって前記細胞中にTADG−15アンチセンスmRNAが産生され、前記TADG−15アンチセンスmRNAが内因性TADG−15 mRNAにハイブリダイズし、それによって前記細胞におけるTADG−15の発現が阻害されることを特徴とする、細胞におけるTADG−15の発現を阻害する方法。

請求項27

TADG−15タンパク質またはその断片に特異的な抗体を細胞に導入する工程を含んでなり、前記抗体のTADG−15タンパク質への結合によって、TADG−15タンパク質が阻害されることを特徴とする、細胞におけるTADG−15タンパク質を阻害する方法。

請求項28

TADG−15に特異的なターゲット部分と、治療部分とを有する化合物を個体に投与する工程を含んでなる、個体にターゲティング療法を施す方法。

請求項29

前記ターゲット部分が、TADG−15に特異的な抗体、およびTADG−15に結合するリガンドまたはリガンド結合ドメインより成る群から選択されることを特徴とする請求項28記載の方法。

請求項30

前記治療部分が、放射性同位体毒素化学療法剤免疫促進剤、および細胞傷害性物質より成る群から選択されることを特徴とする請求項28記載の方法。

請求項31

前記個体が、卵巣癌肺癌前立腺癌結腸癌、およびTADG−15が過剰発現されている他の癌より成る群から選択される癌に罹っていることを特徴とする請求項28記載の方法。

請求項32

(a)個体から生物学的試料を採取し;さらに、(b)前記試料中におけるTADG−15を検出する;各工程を含んでなり、前記試料中にTADG-15が存在すれば前記個体に癌が存在することを示唆し、前記試料中にTADG−15が存在しなければ前記個体に癌が存在しないことを示唆する、個体における癌を診断する方法。

請求項33

前記生物学的試料が、血液、尿、唾液涙液間質液腹水腫瘍生検組織、および循環腫瘍細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項32記載の方法。

請求項34

前記TADG−15の検出が、ノーザンブロットウェスタンブロットPCRドットブロットELISAサンドイッチ法ラジオイムノアッセイDNAチップ、またはフローサイトメトリーより成る群から選択される手段によってなされることを特徴とする請求項32記載の方法。

請求項35

前記癌が、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、およびTADG−15が過剰発現されている他の癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項32記載の方法。

請求項36

TADG−15プロテアーゼ活性を欠くTADG-15タンパク質またはその断片を個体に接種する工程を含んでなり、TADG-15タンパク質またはその断片の接種によって、個体において免疫応答が誘導され、それによって、個体にTADG−15に対するワクチン接種が行われることを特徴とする、個体にTADG−15に対するワクチン接種を行う方法。

請求項37

前記個体が、癌を有し、癌を有する疑いがあり、あるいは癌に罹る危険性があることを特徴とする請求項36記載の方法。

請求項38

前記TADG−15断片が、9残基断片から20残基断片までの断片より成る群から選択されることを特徴とする請求項36記載の方法。

請求項39

前記TADG−15断片が、配列番号2、19、20、21、29、39、49、50、59、79、80、81、82、83、84、89、および90に記載の配列より成る群から選択される9残基断片であることを特徴とする、請求項38記載の方法。

請求項40

TADG−15プロテアーゼ活性を欠くTADG-15タンパク質またはその断片に、樹状細胞暴露させる工程を含んでなり、TADG−15またはその断片への暴露によって樹状細胞が活性化され、それによってTADG−15に特異的な免疫活性化細胞が産生されることを特徴とする、TADG−15に特異的な免疫活性化細胞を産生させる方法。

請求項41

前記免疫活性化細胞が、B細胞、T細胞、および樹状細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項40記載の方法。

請求項42

前記TADG−15断片が、9残基断片から20残基断片までの断片より成る群から選択されることを特徴とする請求項40記載の方法。

請求項43

前記TADG−15断片が、配列番号2、19、20、21、29、39、49、50、59、79、80、81、82、83、84、89、および90に記載の配列より成る群から選択される9残基断片であることを特徴とする、請求項42記載の方法。

請求項44

前記暴露前に個体から樹状細胞を単離し、暴露後、活性化樹状細胞を個体に再導入することを特徴とする、請求項40記載の方法。

請求項45

前記個体が、癌を有し、癌を有する疑いがあり、あるいは癌に罹る危険性があることを特徴とする請求項44記載の方法。

請求項46

TADG-15タンパク質の免疫原断片と、適切なアジュバントとを含んでなる免疫原組成物

請求項47

前記TADG−15断片が、9残基断片から20残基断片までの断片より成る群から選択されることを特徴とする請求項46記載の免疫原組成物。

請求項48

前記TADG−15断片が、配列番号2、19、20、21、29、39、49、50、59、79、80、81、82、83、84、89、および90に記載の配列より成る群から選択される9残基断片であることを特徴とする、請求項47記載の免疫原組成物。

請求項49

請求項1記載のDNAに相補的であるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド

請求項50

請求項49記載のオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドのための生理学的に許容される担体とを含んでなる組成物

請求項51

有効量の請求項49記載のオリゴヌクレオチドを個体に投与する工程を含んでなる、治療を必要とする個体おける新生物性の症状を治療する方法。

請求項52

前記新生物性の症状が、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、およびTADG−15が過剰発現されている他の癌より成る群から選択されることを特徴とする請求項51記載の方法。

背景技術

0001

関連出願への相互参照
本発明は、1998年2月20日出願の米国特許出願第09/027,337号の一部継続出願であり、米国特許法第120条の規定による優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、概して、細胞生物学、および新生物性疾患診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、癌において過剰発現されている、腫瘍抗原誘導遺伝子(Tumor antigen-derived gene)15(TADG−15)と称される細胞外セリンプロテアーゼに関する。

0002

関連技術

0003

細胞外プロテアーゼ腫瘍増殖腫瘍細胞の脱離、および標的臓器への浸潤に直接関連している。限定はされないが、個々のクラスのプロテアーゼは、(a)腫瘍原発巣周りストローマ消化;(b)腫瘍細胞の解離をもたらす細胞接着分子の消化;(c)転移性増殖、ならびに腫瘍増殖因子および血管新生促進因子活性化のための基底膜の浸潤;に関連する。

0004

癌の進行および浸潤の過程において、プロテアーゼは特定のタンパク質分解を介在し、腫瘍細胞の周りの細胞外マトリックス成分の除去、悪性腫瘍細胞の解離をもたらす細胞間接着分子の消化、および多くの増殖因子および血管新生促進因子の活性化に寄与する1-3。触媒ドメインの特性に依存して、プロテアーゼは4つのファミリー分類される:セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼアスパラギン酸プロテアーゼ、およびシステインプロテアーゼ3。それらプロテアーゼの中で、メタロプロテアーゼは、腫瘍増殖および進行に関連して詳細に研究されており、細胞外マトリックスを分解し、それによって悪性腫瘍細胞の浸潤能を高め得ることが知られている1,4,5。セリンプロテアーゼに関して、今までの研究は、腫瘍細胞におけるプラスミノーゲン活性化因子の産生の増強、ならびに、プラスミノーゲン活性化因子の活性と癌の攻撃性との正の相関を示している6,7。前立腺特異的抗原(セリンプロテアーゼ)は異常な前立腺増殖指標としても広く用いられている8。つい最近、いくつかの他のセリンプロテアーゼ、すなわち、卵巣癌において過剰発現され、腫瘍細胞の細胞外溶解活性を高めることによって悪性進行に寄与する、ヘプシンおよび角質層キモトリプシン酵素(SCCE)が報告された9。

0005

先行技術は、癌において過剰発現されているプロテアーゼを同定するための有効なスクリーニング手段を欠く。本発明は、本技術分野における長年の必要性および要求を満たすものである。
発明の概要
本発明は、正常組織と比較して、初期の腫瘍および転移性腫瘍における差別発現を用いて、増幅PCR産物を調べることによって、癌において過剰発現されているプロテアーゼを同定するためのスクリーニングプログラムについて開示する。腫瘍細胞において過剰発現されている候補遺伝子を同定するための試みは、セリンプロテアーゼの触媒ドメインの三つ組アミノ酸残基(His-Asp-Ser)の周囲の高度に保存されたドメインを利用する。本明細書において、今まで文献で報告されていない、卵巣癌において高度に発現されている独自の形態のセリンプロテアーゼに関する証拠を示す。正常組織、悪性度の低い潜在的腫瘍(low malignant potential tumor)、および明らかな癌の、差別的PCR増幅を用いたスクリーニング法によって、癌にのみ存在するPCR産物サブクローン化および配列決定し、さらに、セリンプロテアーゼファミリーと一致する触媒ドメインを有することを見つけた。その転写物の完全クローニングおよび配列決定、ならびに卵巣腫瘍細胞におけるその発現に関する証拠をこの中で報告する。

0006

本発明の1つの実施形態において、(a)腫瘍抗原誘導遺伝子(TADG−15)タンパク質をコードする単離DNA;(b)前記(a)の単離DNAに対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(c)遺伝暗号縮重のせいでコドン配列において前記(a)および(b)の単離DNAと異なり、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;より成る群から選択される、TADG−15タンパク質をコードするDNAを提供する。本実施形態は、TADG−15 DNAと、細胞において前記DNAを発現させるのに必要な調節要素とを包含するベクターをさらに含む。さらには、TADG−15アンチセンスmRNAが産生されるように、TADG−15 DNAが調節要素に対して逆配向で配置されているベクターを含む。

0007

本発明の別の実施形態において、(a)TADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(b)前記(a)の単離DNAに対してハイブリダイズし、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(c)遺伝暗号の縮重のせいでコドン配列において前記(a)および(b)の単離DNAと異なり、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;より成る群から選択されたDNAによってコードされる、単離および精製TADG−15タンパク質を提供する。
本発明のさらに別の実施形態において、(a)TADG−15に特異的なプローブ試料とを接触させ;さらに(b)試料中におけるTADG−15mRNAに対するプローブの結合を検出する;各工程を含んでなる、TADG−15 mRNAを検出する方法を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、TADG−15に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含んでなるTADG−15 mRNAを検出するキットを提供する。キットにおいて、検出のための標識がさらに具体化されている。
さらに、本発明は、(a)TADG−15またはその断片に特異的な抗体と試料とを接触させ;さらに、(b)試料中におけるTADG−15タンパク質に対する抗体の結合を検出する;各工程を含んでなる、試料中のTADG−15タンパク質を検出する方法を具体化する。同様に、本発明は、TADG−15またはその断片に特異的な抗体を含んでなる、試料中のTADG−15タンパク質を検出するキットを具体化する。
別の実施形態において、本発明は、TADG−15タンパク質またはその断片に特異的な抗体を提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、(a)TADG−15タンパク質と化合物とを接触させ;さらに(b)TADG−15プロテアーゼ活性を測定する;各工程を含んでなる、TADG−15を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。通常、化合物の不在下でのTADG−15プロテアーゼ活性と比較して、化合物の存在下でのTADG−15プロテアーゼ活性が低いことが、TADG−15を阻害する化合物の指標となる。
本発明のさらに別の態様において、細胞にベクターを導入する工程を含んでなり、ベクターの発現によって細胞中にTADG−15アンチセンスmRNAが産生され、TADG−15アンチセンスmRNAが内因性TADG−15 mRNAにハイブリダイズし、それによって細胞におけるTADG−15の発現が阻害されることを特徴とする、細胞におけるTADG−15の発現を阻害する方法を提供する。
さらに本発明は、TADG−15タンパク質またはその断片に特異的な抗体を細胞に導入する工程を含んでなり、抗体のTADG−15タンパク質への結合によって、TADG−15タンパク質が阻害されることを特徴とする、細胞におけるTADG−15タンパク質を阻害する方法を提供する。
本発明の実施形態において、TADG−15に特異的なターゲット部分と、治療部分とを含む化合物を個体に投与する工程を含んでなる、個体にターゲティング療法を施す方法を提供する。
本発明の実施形態において、(a)個体から生物学的試料採取し;さらに、(b)その試料中におけるTADG−15を検出する;各工程を含んでなり、試料中にTADG-15が存在すれば個体に癌が存在することを示唆し、さらに試料中にTADG−15が存在しなければ個体に癌が存在しないことを示唆する、個体における癌を診断する方法を提供する。
本発明の別の実施形態において、TADG−15プロテアーゼ活性を欠くTADG-15タンパク質またはその断片を個体に接種する工程を含んでなり、TADG-15タンパク質またはその断片の接種によって、個体において免疫応答が誘導され、それによって個体にTADG−15に対するワクチン接種が行われる、個体にTADG−15に対するワクチン接種を行う方法を提供する。
本発明の実施形態において、TADG−15プロテアーゼ活性を欠くTADG-15タンパク質またはその断片に、樹状細胞暴露させる工程を含んでなり、TADG−15またはその断片の暴露によって樹状細胞が活性化され、それによってTADG−15に特異的な免疫活性化細胞が産生されることを特徴とする、TADG−15に特異的な免疫活性化細胞を産生させる方法を提供する。
本発明の別の態様において、TADG-15タンパク質の免疫原断片と、適切なアジュバントとを含んでなる、免疫原組成物を提供する。
本発明の他の態様、特徴および利点は、以下の開示の目的で提供された本発明の現在の好ましい実施形態の記載から明らかであろう。
本発明の前記の特徴、利点および目的、ならびに明らかになるであろう他の内容が達成されかつ詳細に理解されるように、添付図面に例示された本発明のある実施形態を参照することによって、前記において簡単に要約された本発明についてのより詳細な説明を行う。それら図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施形態を例示したものであり、本発明の範囲を限定することを意図していないことに注意すべきである。
図1は、ヘプシン(Heps、配列番号3)、SCCE(配列番号4)、トリプシン(Try、配列番号5)、キモトリプシン(Chymb、配列番号6)、7因子(Fac7、配列番号7)、および組織プラスミノーゲン活性化因子(Tpa、配列番号8)と、TADG−15のセリンプロテアーゼ触媒ドメインとの比較を示す。星印は、触媒三つ組残基の保存アミノ酸を指示する。
図2は、TADG−15cDNAヌクレオチド配列、ならびにTADG−15タンパク質のアミノ酸配列を示す。推定開始コドンは、ヌクレオチド23−25に位置する。
図3は、機能的部位およびドメインを含む、TADG−15プロテアーゼのアミノ酸配列を示す。潜在的膜貫通配列に下線を引いている。星印はCUBドメインの保存システイン残基を指示する。LDL受容体リガンド結合反復様ドメインのSDE-モチーフを線で囲んでいる。矢印は、活性化に基づき切断されるアルギニンバリン結合を示す。触媒三つ組残基:ヒスチジンアスパラギン酸、およびセリン残基:の保存アミノ酸を丸で囲む。
図4は、TADG−15タンパク質の図解を示す。1;細胞質ドメイン(aa #1-54)、2;膜貫通ドメイン(aa #55-57)、3;細胞外ドメイン(aa #78-213)、4−5;CUB反復(aa #214-447)、6−9;LDL受容体リガンド結合反復(クラスAモチーフ)様ドメイン(aa #453-602)、10;セリンプロテアーゼ(aa #615-855)。
図5は、正常卵巣、卵巣癌、癌細胞株、正常胎児性組織、および正常成体組織における、TADG−15mRNA発現ノーザンブロット分析を示す。全てのサブタイプの癌、および2つの卵巣癌細胞株SW626およびCAOV3において、TADG−15の1つの強い転写が観察されたが、一方、正常卵巣または2つの乳癌細胞株では全く可視的なバンドが検出されなかった。正常胎児性組織の中で、胎児性腎臓が増強された転写を示し、さらに、胎児性で弱い発現が検出された。正常成体組織では、小腸および前立腺における弱い発現と共に、結腸においてTADG−15が検出された。
図6Aは、TADG−15発現の定量的PCR分析を示す。β-チューブリンに対するTADG−15の発現レベルは、全てのLMP腫瘍において有意に上昇している。m;粘液性、s;漿液性

図面の簡単な説明

0008

図6Bは、正常卵巣、LMP腫瘍、および卵巣癌における、β-チューブリンの発現に対するTADG−15発現の比を示す。正常卵巣における発現と比較して、LMP腫瘍(*;p<0.001)および癌(**;p<0.0001)の両方において、TADG−15mRNA発現レベルは有意に上昇していた。10の正常卵巣試料の全てが、低レベルのTADG−15発現を示した。

0009

図7は、卵巣癌組織および乳癌組織の両方から派生した腫瘍細胞株におけるTADG−15の発現を示す。

0010

図8は、他の腫瘍組織におけるTADG−15の過剰発現を示す。

0011

図9は、SDS−PAGEによって分離しかつ免疫ブロットした、SW626およびCAOV3細胞の溶解物を示す。ライン1および2は、陰性対象として免疫前ウサギ血清を用いて実験した。ライン3および4は、TADG−15タンパク質配列由来カルボキシル末端ペプチドに対して作成されたウサギポリクロナール抗体を用いて実験した。

0012

図10は、TADG−15プロテアーゼペプチドに対するポリクロナール抗体を用いた正常卵巣上皮免疫組織化学染色が、ストローマまたは上皮の染色を全く示さないことを示唆する(図10A)。しかしながら、癌の抗体染色において、漿液性の悪性度の低い潜在的腫瘍(図10B);粘液性の悪性度の低い潜在的腫瘍(図10C);漿液性癌(図10D);の細胞質におけるTADG−15発現の存在;ならびに子宮内膜様癌(図10E)の細胞質および細胞表面の両方におけるTADG−15発現の存在を確認した。

0013

図11は、ヒトTADG−15タンパク質と、マウスエピチン(epithin)との配列の整列を示し、2つの配列が、843アミノ酸に亘り、84%類似で81%同一であることを示す。2つのタンパク質の間で同一の残基は、“−”で指示され、一方、“*”はTADG−15翻訳終結部分を示す。それら2つのタンパク質の間の最も重要な差異はカルボキシル末端にあり、エピチンはTADG−15に存在しない47アミノ酸を含む。

0014

図12は、TADG−15とヒトSNC−19(GeneBank登録番号#U20428)とのヌクレオチド配列の比較を示す。
発明の詳細な説明

0015

プロテアーゼは、腫瘍増殖および浸潤に必要とされる細胞外調節に関係している。卵巣癌の進行に寄与するプロテアーゼを分類する目的で、触媒三つ組残基His、Asp、およびSerの周囲の保存アミノ酸ドメインに対する重複プライマーを利用して、癌において差別的に発現されているセリンプロテアーゼを増幅させた。本方法を用いて、TADG−15(腫瘍抗原誘導遺伝子15)と称されるセリンプロテアーゼが卵巣腫瘍において過剰発現されていることを確認した。TADG−15は膜貫通型マルチドメインセリンプロテアーゼであると考えられる。PCR、ノーザンブロット、および免疫学的局在決定によると、TADG−15は卵巣腫瘍において高度に過剰発現されている。

0016

TADG−15cDNAは、855アミノ酸タンパク質(配列番号2)をコードする3147塩基対長(配列番号1)である。TADG−15遺伝子を利用可能であることは、多くの有用性をもたらす。例えば、卵巣癌、ならびに乳癌前立腺癌肺癌および結腸癌等の他の癌における診断または治療ターゲットとしてTADG−15遺伝子を用いることができる。

0017

本発明は、(a)TADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(b)前記(a)の単離DNAに対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(c)遺伝暗号の縮重のせいでコドン配列において前記(a)および(b)の単離DNAと異なり、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA:より成る群から選択される腫瘍抗原誘導遺伝子(TADG−15)タンパク質をコードするDNAに関する。DNAが配列番号1記載の配列を有し、かつTADG−15タンパク質が配列番号2記載のアミノ酸配列を有することが好ましい。

0018

本発明は、TADG−15 DNAと、細胞における該DNAの発現に必要な調節要素とを含んでなるベクター、あるいは、TADG−15アンチセンスmRNAが産生されるように、TADG−15 DNAが調節要素に対して逆配向で配置されているベクターに関する。通常、DNAは、配列番号2記載のアミノ酸配列を有するTADG−15タンパク質をコードする。また、本発明は、前記のベクターの何れかでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。例示的宿主細胞は、細菌細胞哺乳類細胞植物細胞、および昆虫細胞である。好ましくは、細菌細胞は大腸菌(E.coli)である。

0019

本発明は、(a)TADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(b)高ストリンジェントな条件下で前記(a)の単離DNAに対してハイブリダイズし、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;(c)遺伝暗号の縮重のせいでコドン配列において前記(a)および(b)の単離DNAと異なり、かつTADG−15タンパク質をコードする単離DNA;より成る群から選択されたDNAによってコードされる、単離および精製TADG−15タンパク質に関する。好ましくは、本タンパク質は配列番号2記載のアミノ酸配列を有する。

0020

本発明は、(a)TADG−15に特異的なプローブと試料とを接触させ;さらに、(b)試料中におけるTADG−15mRNAに対するプローブの結合を検出する;各工程を含んでなる、TADG−15 mRNAを検出する方法に関する。本発明はまた、(a)TADG−15またはその断片に特異的な抗体と試料とを接触させ;さらに、(b)試料中におけるTADG−15タンパク質に対する抗体の結合を検出する;各工程を含んでなる、試料中のTADG−15タンパク質を検出する方法に関する。通常、試料は生物学的試料であり;好ましくは、その生物学的試料は個体に由来するものであり;さらに通常、その個体は癌を有する疑いがある個体である。
本発明は、TADG−15に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含んでなる、TADG−15 mRNAを検出するキットに関する。本キットは:プローブを標識するための標識;および標識を検出する手段;をさらに含んでいて差し支えない。さらに、本発明は、TADG−15タンパク質またはその断片に特異的な抗体を含んでなる、TADG−15タンパク質を検出するキットに関する。本キットは、抗体を検出する手段をさらに含んでいて差し支えない。
本発明は、TADG−15タンパク質またはその断片に特異的な抗体に関する。
本発明は、(a)TADG−15タンパク質と化合物とを接触させ;さらに、(b)TADG−15プロテアーゼ活性を測定する;各工程を含んでなる、TADG−15を阻害する化合物をスクリーニングする方法に関する。通常、化合物の不在下でのTADG−15プロテアーゼ活性と比較して、化合物の存在下でのTADG−15プロテアーゼ活性が低いことが、TADG−15を阻害する化合物の指標となる。
内因性TADG−15 mRNAにハイブリダイズするTADG−15アンチセンスmRNAを発現するベクターを細胞に導入し、それによって細胞におけるTADG−15の発現を阻害する工程を含んでなる、細胞におけるTADG−15の発現を阻害する方法に関する。
本発明は、TADG−15タンパク質を阻害する、TADG−15タンパク質またはその断片に特異的な抗体を細胞に導入する工程を含んでなる、細胞におけるTADG−15タンパク質を阻害する方法に関する。通常、TADG−15タンパク質の阻害は、癌を治療するためである。
本発明は、TADG−15に特異的なターゲット部分と、治療部分とを含む化合物を個体に投与する工程を含んでなる、個体にターゲティング療法を施す方法に関する。例示的ターゲット部分は、TADG−15に特異的な抗体、およびTADG−15に結合するリガンドまたはリガンド結合ドメイン(例えば、CUB、LDLR、プロテアーゼ、および細胞外ドメイン)である。同様に、例示的治療部分は、放射性同位体毒素化学療法剤、および免疫促進剤である。通常、前記の方法は、個体が、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、および子宮頸癌に罹っている場合に有用である。
本発明は、(a)個体から生物学的試料を採取し;さらに、(b)その試料中におけるTADG−15を検出する;各工程を含んでなる、個体における癌を診断する方法に関する。通常、試料中にTADG-15が存在すれば個体に癌が存在することを示唆し、さらに試料中にTADG−15が存在しなければ個体に癌が存在しないことを示唆する。通常、生物学的試料は、血液、腹水、尿、涙液唾液、または間質液である。TADG−15を検出する一般的手段は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、PCR、ドットブロットELISAラジオイムノアッセイDNAチップ、または腫瘍細胞標識である。本方法は,卵巣癌、乳癌、ならびに肺癌、前立腺癌および結腸癌のようなTADG−15が過剰発現されている他の癌において有用であろう。
本発明はまた、TADG−15mRNA配列相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、そのようなアンチセンスヌクレオチド、および該アンチセンスヌクレオチドのための生理的に許容される担体を含んでなる組成物に関する。
本発明はまた、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを個体に投与する工程を含んでなる、治療を必要とする個体の個々の症候群における、新生物性の症状を治療する方法に関する。好ましくは、新生物性の症状は、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、ならびにTADG−15が過剰発現されている他の癌より成る群から選択される。そのような治療のため、オリゴヌクレオチド単独で、または他の抗新生物薬と組み合わせて、全身投与または局所投与等、種々の投与形態適応させて製剤化することができる。技術および製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Paに記載されている。通常、投与形態および剤形に基づき、例えば充填剤増量剤結合剤湿潤剤崩壊剤界面活性剤、または滑剤等の希釈剤または賦形剤のような生理的に許容される担体と、オリゴヌクレオチド活性材料とを組み合わせる。一般的な剤形として、錠剤粉末;懸濁液、エマルジョン、および溶液等の液体製剤顆粒剤カプセル;および坐剤;ならびにリポソーム製剤等の注射用液体製剤等が挙げられる。
全身投与のため、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下等の注射が好ましい。注射のため、本発明のオリゴヌクレオチドは、溶液中、好ましくは生理学的に適合するバッファー中に製剤化される。さらに、オリゴヌクレオチドを固形製剤とし、使用直前再溶解または懸濁させても差し支えない。凍結乾燥形態であっても差し支えない。全身投与に用いられる用量は、好ましくは、約0.01mg/kgから50mg/kgの範囲であり、1日当たり1回または2回投与する。しかしながら、(1)ターゲットDNAの活性を阻害する個々のオリゴヌクレオチドの能力、(2)病的症状の重篤度または程度、あるいは(3)所定のオリゴヌクレオチドの薬物動力学挙動に基づいて、様々な用量スケジュールを用いることができる。
本発明は、TADG−15プロテアーゼ活性を欠くTADG-15タンパク質またはその断片を個体に接種する工程を含んでなる、TADG−15過剰発現に対して個体にワクチン接種する方法に関する。TADG-15タンパク質またはその断片の接種は、個体における免疫応答を誘導し、それによって個体にTADG−15に対するワクチン接種が行われる。この中に記載のTADG−15のワクチン接種は、癌を有し、癌を有する疑いがあり、あるいは癌に罹る危険性のある個体を対象とする。通常、個体にワクチン接種するのに有用であるTADG−15断片は、配列番号2、19、20、21、29、39、49、50、59、79、80、81、82、83、84、89、および90に記載の好ましい9残基断片を有する、9残基断片から20残基断片である。
本発明は、TADG−15プロテアーゼ活性を欠くTADG-15タンパク質またはその断片に樹状細胞を暴露させる工程を含んでなり、TADG−15またはその断片への暴露によって樹状細胞が活性化され、それによってTADG−15に特異的な免疫活性化細胞が産生されることを特徴とする、TADG−15に特異的な免疫活性化細胞を産生させる方法を提供する。例示的免疫活性化細胞は、B細胞、T細胞、および樹状細胞である。通常、TADG−15断片は、配列番号2、19、20、21、29、39、49、50、59、79、80、81、82、83、84、89、および90に記載の好ましい9残基断片を有する、9残基断片から20残基断片である。好ましくは、暴露前に樹状細胞を個体から単離し、暴露後、活性化樹状細胞を個体に再導入する。通常、本方法が適用される個体は、癌を有し、癌を有する疑いがあり、あるいは癌に罹る危険性のある個体である。
本発明は、TADG-15タンパク質の免疫原断片と、適切なアジュバントとを含んでなる、免疫原組成物に関する。通常、TADG−15断片は、配列番号2、19、20、21、29、39、49、50、59、79、80、81、82、83、84、89、および90に記載の好ましい9残基断片を有する、9残基断片から20残基断片である。
本発明に基づき、当業技術内の従来の分子生物微生物および組換えDNA技術を用いて差し支えない。そのような技術は文献に全て記載されている。例えば、Maniatis, Fritsch&Sambrook, “Molecular Cloning”: A Laboratory Manual (1988); “DNA Cloning: A Practical Approach”, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” [B.D.Hames&S.J.Higgins eds. (1985)]; “Transcription and Translation” [B.D. Hames &S.J. Higgins eds. (1984)]; “Animal Cell Culture” [R.I. Freshney, ed. (1986)]; “Immobilized Cells And Enzymes” [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning” (1984)を参照。
従って、この中に出てきた場合に、以下の用語は次に示す定義を有する。
この中で用いられた「cDNA」の用語は遺伝子のmRNA転写物DNA複製物を称する。

0021

この中で用いられた「誘導アミノ酸配列」の用語は、cDNAにおける3塩基連鎖読むことによって特定されるアミノ酸配列を意味する。

0022

この中で用いられた「ライブラリーをスクリーニングする」の用語は、標識プローブを用いて、適切な条件下においてプローブに対して相補的である配列が特定DNAライブラリ−中に存在するか否かを調べる方法を称する。さらには、「ライブラリーをスクリーニングする」ことは、PCRによって実施しても差し支えない。

0023

この中で用いられた「PCR」の用語は、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号(Mullis)の主題であるポリメラーゼ連鎖反応、ならびに当業界で現在公知である他の改良法を称する。

0024

この中に記載のアミノ酸は、好ましくは、「L」異性体である。しかしながら、ポリペプチドによる免疫グロブリン−結合の所望の機能的特性が維持される限り、「D」異性体の残基もLアミノ酸残基を代用し得る。NH2はポリペプチドのアミノ末端に存在するフリーアミノ基を称する。COOHはポリペプチドのカルボキシル末端に存在するフリーのカルボキシル基を称する。標準的ポリペプチド命名法, J Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969)を踏まえて、アミノ酸残基の省略形は当業界で公知である。

0025

この中で、全てのアミノ酸残基配列は、左から右への方向がアミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向で示されていることに注意すべきである。さらには、アミノ残基配列の始めまたは終わりにおけるダッシュ記号は、1つ以上のアミノ酸残基から成る別の配列に対するペプチド結合を指示する。

0026

レプリコン」は、インビボにおいてDNA複製の自律単位として機能する;すなわち、それ自体の制御下において複製し得る任意の遺伝要素(例えば、プラスミド染色体ウィルス)である。

0027

「ベクター」は、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンであり、それに対して別のDNA断片が結合してその結合した断片の複製をもたらすことができる。

0028

DNA分子」は、一本鎖形態または二本鎖螺旋形態の何れかのデオキシリボヌクレオチドアデニングアニンチミンまたはシトシン)の重合体を称する。DNA分子の用語は、その分子の1次および2次構造のみを称し、特定の3次構造に限定されない。従って、DNA分子の用語は、特に、線状DNA分子(例えば制限酵素断片)、ウィルス、プラスミドおよび染色体において認められる二本鎖DNAを含む。この中で構造について議論する際に、DNAの転写されない鎖(すなわちmRNAに相同な配列を有する鎖)に沿って5’から3’方向にある配列のみを与える通常のやり方に従う。

0029

発現ベクターは、細胞においてポリペプチドの発現をもたらし得る適切な制御配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列作動可能に結合した複製可能な構築物である。そのような制御配列の必要性は、選択された細胞および選択された形質転換法に依存して変化するであろう。通常、制御配列は、転写プロモーターおよび/またはエンハンサー、適切なmRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。適切な転写および翻訳制御シグナルを包含する発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. に記載の技術を参照のこと。転写制御配列が効率的に遺伝子の転写を制御する場合には、遺伝子とその転写制御配列とが「作動可能に結合している」と定義される。本発明のベクターとして、限定はされないが、プラスミドベクターおよびウィルスベクターが挙げられる。本発明の好ましいウィルスベクターとして、レトロウィルスアデノウィルスアデノ随伴ウィルス、SV40ウィルスまたはヘルペスウィルスが挙げられる。通常、発現ベクターは、挿入されたDNA断片の効率的な転写を促進させる、宿主と関連して用いられるプロモーター配列を含む。発現ベクターは、通常、複製起点プロモーターターミネーター、ならびに形質転換細胞において表現型の選択をもたらし得る特定遺伝子を包含する。当業界で公知の手段に従って形質転換宿主を発酵および培養して、最適な細胞増殖を得ることができる。
「複製起点」は、DNA合成を開始するDNA配列を称する。

0030

DNA「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビボにおいて、転写されかつポリペプチドに翻訳される二本鎖DNA配列を称する。5’(アミノ)末端における開始コドンおよび3’(カルボキシル)末端における翻訳終止コドンによって、コード配列の境界が特定される。コード配列として、限定はされないが、原核生物の配列、真核生物のmRNA由来のcDNA、真核生物(例えば、哺乳類)のDNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列等が挙げられる。ポリアデニル酸シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の3’側に位置する。
転写および翻訳の制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル酸シグナル、ターミネーター等のDNA調節配列である。
「プロモーター配列」は、細胞においてRNAポリメラーゼに結合しかつ下流(3’側)のコード配列の転写を開始し得るDNA調節領域である。本発明を特定する目的において、プロモーター配列は、その3’末端において転写開始部位に結合し、さらに、バックグラウンドを越える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数塩基または要素を含むように上流(5’側)に伸長する。プロモーター配列内に、転写開始部位、ならびにRNAポリメラーゼに対する結合を担うタンパク質結合部位コンセンサス配列)が認められるであろう。真核生物のプロモーターは、必ずではないが、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを包含することが多い。原核生物プロモーターは、−10および−35コンセンサス配列に加えて、シャインダルガーノ配列を包含する。
発現制御配列」は、別のDNA配列の転写および翻訳を制御および調節するDNA配列である。RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、さらにその転写物がそのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コード配列は転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
シグナル配列」はコード配列の近くに包含されていて差し支えない。シグナル配列は、宿主細胞に伝達してそのポリペプチドを細胞表面に方向付けし、あるいはそのポリペプチドを媒体中に分泌させる、そのポリペプチドのN末端にあるシグナルペプチドをコードし、シグナルペプチドは、タンパク質が細胞から遊離する前に宿主細胞によって切り離される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に天然に存在する種々のタンパク質と関連して見出される。

0031

この中で用いられている「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」の用語は、特定ヌクレオチド配列部分またはその近くで二本鎖DNAを切断する酵素を称する。

0032

外因性または異種DNAが細胞内に導入された場合、細胞はそのようなDNAによって「形質転換されている」。形質転換DNAは細胞のゲノム中に(共有結合して)組み込まれても組み込まれなくても差し支えない。例えば、原核細胞酵母および哺乳類細胞において、形質転換DNAは、プラスミドのようなエピソーム要素上に保持されていて差し支えない。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換DNAが染色体に組み込まれて、染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるような細胞である。その安定性は、真核細胞が、形質転換DNAを包含する娘細胞の集団から成る細胞株またはクローン樹立する能力によって説明される。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞または祖先に由来する細胞集団である。「細胞株」は何世代にも亘りインビトロで安定に増殖し得る初代細胞のクローンである。

0033

DNA配列の特定された長さに亘り、ヌクレオチドの約75%以上(好ましくは約80%以上、さらに最も好ましくは約90%または95%以上)が一致する場合、2つのDNA配列は「実質的に相同である」。配列データバンクにおいて利用可能な標準ソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、例えば、特定の系のために決定されたストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験において、実質的に相同である配列を同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を決定することは、当業技術の範囲内である。例えば、Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I&II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supraを参照。

0034

DNA構築物の「異種」領域は、より大きなDNA分子内の同定可能なDNA断片であって、そのより大きな分子に関連して天然では認められないDNA断片である。従って、その異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、通常、その遺伝子は、その由来生物のゲノム中ではその哺乳類遺伝子に隣接しないようなDNAに隣接するであろう。別の例において、コード配列は、そのコード配列自体が天然では認められないような構造である(例えば、ゲノムコード配列がイントロンまたは天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列を包含するようなcDNA)。対立遺伝子変異または自然に生じる突然変異事象は、この中で定義されたDNAの異種領域を生じさせない。

0035

そのような研究のために最も一般的に用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外線に暴露された際に蛍光を発する化学物質等である。多くの蛍光物質が公知であり、標識として用いることができる。蛍光物質として、例えば、フルオレセインローダミンオーラミンテキサスレッド、AMCAブルーおよびルシファーイエロー(Lucifer Yellow)が挙げられる。特定の検出物質は、ヤギにおいて調製しかつイソチオシアネートを介してフルオレセインに結合させた抗ウサギ抗体である。
また、放射性元素または酵素を用いてタンパク質を標識しても差し支えない。任意の現在利用可能な測定法によって放射能標識を検出することができる。3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131Iおよび186Reから好ましいアイソトープを選択することができる。
酵素標識も同様に有用であり、任意の現在利用されている比色、分光測光、蛍光測光電流滴定またはガス定量技術によって検出することができる。カルボジイミドジイソシアネートグルタールアルデヒド等のような架橋分子を用いた反応によって、選択された粒子に酵素を結合させる。それら方法において用いられる多くの酵素は公知でありかつ利用可能である。好ましい酵素は、ペロシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼウレアーゼグルコースオキシダーゼとペロキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。代替標識物質および方法の開示を例示する目的で、米国特許第3,654,090号、第3,850,752号および第4,016,043号を参照する。
本技術分野において開発されかつ利用される特定の測定系は、受容体測定法として知られている。受容体測定法において、測定すべき物質を適切に標識し、次に、多くのその標識物質を特定細胞試験コロニーに接種し、その後、標識物質が細胞受容体に結合する割合を特定するために結合試験を行う。本方法において、物質間の親和性の違いを確かめることができる。
本技術分野において有用である測定法は、「シス/トランス」測定法として知られている。詳細には、その測定法は2つの遺伝子構築物を用い、第一の構築物は通常適切な細胞株にトランスフェクトされた場合に特定の関心受容体を連続的に発現するプラスミドであり、第二の構築物は受容体/リガンド複合体の制御下においてルシフェラーゼのような受容体を発現するプラスミドである。従って、例えば、特定受容体に対するリガンドとして化合物を評価するのが望ましい場合、第一のプラスミドは選択された細胞株において受容体の発現をもたらす構築物であり、一方、第二のプラスミドは特定受容体に対する応答要素が挿入された、ルシフェラーゼ遺伝子に結合したプロモーターを有するであろう。試験された化合物が受容体のアゴニストである場合、そのリガンドは受容体と複合体を形成し、得られた複合体が応答要素に結合してルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始させるであろう。得られた化学ルミネセンス光度計測によって測定し、さらに用量反応曲線を作成して公知リガンドのものと比較する。前記プロトコルは米国特許第4,981,784号に詳細に記載されている。
この中で用いられている「宿主」の用語は、原核細胞のみでなく、酵母、植物および動物細胞等の真核細胞も含むことを意味する。本発明のヒトTADG−15タンパク質をコードする組換えDNA分子または遺伝子を用いて、当業者に周知である任意の技術を利用して、宿主を形質転換させることができる。原核生物を形質転換させる目的において、本発明のヒトTADG−15タンパク質をコードする遺伝子のコード配列を包含するベクターを用いることが特に好ましい。原核宿主として、大腸菌(E.coli)、サルモネラタイフィムリウム(S. typhimurium)(ネズミチフス菌)、セラシアマルセッセンスおよび枯草菌が挙げられる。真核宿主として、ピッチア・パストリス(Pichia pastoris)のような酵母、哺乳類細胞および昆虫細胞が挙げられる。
本発明は、実質的に純粋なTADG−15タンパク質をコードするDNAを含み、そのDNA鎖は、配列番号1記載の配列の少なくとも15連続ヌクレオチドから成る配列を包含するプローブに対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするであろう。本発明のDNAによってコードされるタンパク質は、図3および4に挙げられたアミノ酸(配列番号2)と80%以上(好ましくは85%以上、さらに最も好ましくは95%以上)の配列の一致を有するであろう。より好ましくは、そのDNAは、図2のヌクレオチド(配列番号1)のコード配列、またはそのような配列の縮重変異体を包含する。本発明はまた、図2に示されたヌクレオチド(配列番号1)の1から3147までのヌクレオチドの領域の少なくとも15(好ましくは20、より好ましくは30、さらに好ましくは50、最も好ましくは全て)の連続ヌクレオチドの配列を包含する実質的に純粋なDNAを含む。
「実質的に純粋なDNA」は、その環境中のいくつかのまたは全ての分子の分離(部分精製または全精製)によって、あるいは請求DNAに隣接する配列の変化によって、そのDNAが自然に生じた環境の一部ではなくなったDNAを意味する。従って、その用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミドもしくはウィルスに組み込まれたまたは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、あるいは他の配列から独立した分離分子(例えば、cDNA、あるいはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または制限エンドヌクレアーゼ消化によって作成されたゲノムもしくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。また、その用語は、例えば融合タンパク質のような追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。また、その用語は、TADG−15の選択的スプライシング変異体(TADG−15V)をコードする、図2に挙げられているヌクレオチド(配列番号1)の一部を包含する組換えDNAを含む。
「実質的に純粋なタンパク質」は、天然において付随する成分の少なくともいくつかから分離されたタンパク質を意味する。通常、インビボにおいて目的タンパク質と共に自然に生じたタンパク質および天然の他の有機分子を含まないで60重量%以上の純度である場合に、そのタンパク質は実質的に純粋である。好ましくは、調製物の純度は、75重量%以上、より好ましくは90重量%以上、さらに最も好ましくは99重量%以上である。例えば、天然供給源からの抽出によって;TADG−15ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって;またはタンパク質の化学合成によって;実質的に純粋なTADG−15タンパク質を得ることができる。TADG−15に特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィーポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析のような任意の適切な方法によって純度を測定することができる。天然の状態において目的タンパク質に付随する不純物の少なくともいくつかから分離された場合には、そのタンパク質は天然において付随する成分を実質的に含まない。従って、化学的に合成されたまたはそれが天然において由来する細胞と異なる細胞系において産生されたタンパク質は、定義によれば、天然において付随する成分を実質的に含まない。従って、実質的に純粋なタンパク質は、大腸菌、他の原核生物、あるいはそれらタンパク質が自然には生じない任意の他の生物体において合成された原核生物タンパク質を含む。
この中で用いられている「オリゴヌクレオチド」の用語は、2つ以上、好ましくは3つより多くのリボヌクレオチドを包含する分子として定義される。その正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終機能および用途に依存する多くの因子に基づくであろう。この中で用いられている「プライマー」の用語は、精製制限酵素消化物の場合のような自然に生じたものであるかあるいは合成されたものであるかにかかわらず、適切な条件下、すなわち適切な温度およびpHにおいてヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼのような誘発剤の存在下に置かれた場合に、特定核酸に相補的な鎖の合成を開始させることができるオリゴヌクレオチドを称する。プライマーは一本鎖であっても二本鎖であっても差し支えなく、誘発剤の存在下において所望の伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの配列および/または相同性、ならびに使用する方法等の多くの因子に依存するであろう。例えば、診断に用いる場合には、ターゲット配列の複雑さに依存し、オリゴヌクレオチドプライマーは通常15−25以上のヌクレオチドを包含するが、それより少ないヌクレオチドを包含するものであっても差し支えない。

0036

この中のプライマーは、特定ターゲットDNA配列に対して「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、プライマーが各鎖とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片(すなわち、制限酵素部位を有する)は、プライマー配列の残り部分がその鎖に相補的であるプライマーの5’末端に結合することができる。あるいは、プライマー配列がその鎖に十分な相補性を有しまたはその鎖とハイブリダイズして伸長産物の合成のための鋳型を形成することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列がプライマー中に散在していて差し支えない。
本発明のDNAがハイブリダイズするプローブは、好ましくは、図2に挙げられたヌクレオチド(配列番号1)のコード配列またはその相補体の好ましくは20連続ヌクレオチド、より好ましくは40ヌクレオチド、よりさらに好ましくは50ヌクレオチド、最も好ましくは100ヌクレオチド以上(100%まで)の配列から成る。そのようなプローブは、(a)細胞から採取したmRNAを、標識TADG−15ハイブリダイゼーションプローブと接触させ;さらに(b)そのプローブとmRNAとのハイブリダイゼーションを検出する;各工程を含んでなる方法によって、細胞におけるTADG−15の発現を検出するのに有用である。
「高ストリンジェント」とは、例えば約0.1xSSCの塩濃度による65℃での洗浄条件のような、高温および低い塩濃度によって特徴付けされるDNAハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件、あるいは機能的にそれに対応するような条件を意味する。例えば、非常に厳しい条件として:約50%ホルムアミドの存在下における約42℃でのハイブリダイゼーション;1%SDSを含有する約2xSSCによる約65℃での1回目の洗浄;続く約0.1xSSCによる約65℃での2回目の洗浄;が挙げられる。
DNAは、図2に挙げられているヌクレオチド(配列番号1)のコード配列に対して、約70%以上、好ましくは75%以上(例えば80%以上)、最も好ましくは90%以上の同一性を有する。その2つの配列間の同一性は、マッチング数または同一位置の数の一次関数である。例えば2つのDNA分子のそれぞれにおいて所定の位置がアデニンによって占められている場合のように、その2つの配列の両方における特定位置が同じ単量サブユニットで占められている場合に、その位置においてそれら2つの配列は同一である。例えば、長さが10ヌクレオチドの配列中の7つの位置が、第2の10ヌクレオチド配列中の対応する位置と同一である場合に、その2つの配列は70%配列同一性を有する。比較配列の長さは、通常、50ヌクレオチド以上であり、好ましくは60ヌクレオチド以上、より好ましくは75ヌクレオチド以上、最も好ましくは100ヌクレオチドである。通常、配列分析ソフトウェア(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group(GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)を用いて、配列同一性を測定する。
本発明は、ヒトTADG−15タンパク質をコードするDNA配列を包含するベクターを含み、そのベクターは、宿主において複製でき、作動可能に結合したa)複製起点;b)プロモーター;およびc)TADG−15タンパク質をコードするDNA配列:を包含する。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号1記載のDNA配列の一部を包含する。「ベクター」は、TADG−15タンパク質またはその断片をコードする核酸を増幅および/または発現させるために用いられる。
実質的に完全長のタンパク質に加えて、本発明は、TADG−15タンパク質(配列番号2)の断片(例えば抗原性断片)も含む。この中で用いられている、ポリペプチドに適用される「断片」は、一般的に6残基以上、より一般的に9−12残基以上、さらに好ましくは13−20残基以上の長さであるが、完全な無傷の配列よりは短い。あるいは、断片は、配列番号2からの20−120残基の個々のドメインであっても差し支えない。例えば、天然のまたは組換えのTADG−15タンパク質の酵素消化によって、またはTADG−15の特定断片をコードする発現ベクターを用いた組換えDNA技術によって、または化学合成によって、当業者に公知の方法でTADG−15タンパク質の断片を作成することができる。この中に記載の方法によって、候補断片がTADG−15の特性(例えばTADG−15に特異的な抗体に結合する)を示す能力を評価することができる。当業者に公知の標準的プロトコルによって、精製TADG−15またはTADG−15の抗原性断片を用いて、新規な抗体を作成しまたは既存の抗体を試験する(例えば、診断的測定における陽性コントロールとして)ことができる。例えばウサギにおいて免疫原としてTADG−15またはTADG−15の断片を用いることによって作成されたポリクロナール抗血清も本発明に含まれる。当業者に公知であるモノクロナールおよびポリクロナール抗体作成の標準的プロトコルを用いる。組換えTADG−15cDNAクローンを同定する能力、および公知のcDNAクローンからTADG−15 cDNAクローンを区別する能力について、本方法によって作成したモノクロナール抗体をスクリーニングすることができる。
さらには、例えば選択的mRNAスプライシングまたは選択的タンパク質プロセッシング事象の産物のような、配列番号2記載の配列の一部によって少なくともその一部がコードされているTADG−15タンパク質、あるいはTADG−15の配列の一部分が欠失しているTADG−15タンパク質も本発明に含まれる。例えば標識、リガンド、または抗原性を高める手段として作用するような別のポリペプチドに、TADG−15ポリペプチドの断片または完全TADG−15ポリペプチドを共有結合させて差し支えない。
また、本発明は、TADG−15に特異的に結合するポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体も含む。本発明は、完全なモノクロナール抗体のみならず、例えばFabまたは(Fab)2断片;人工単鎖Fv分子;または例えばマウス由来の1つの抗体の結合特異性および例えばヒト由来の別の抗体の残りの部分を有する抗体のようなキメラ分子:等の免疫活性抗体断片も含む。
1つの実施形態において、抗体またはその断片を、毒素、あるいは放射性標識非放射性同位体標識蛍光標識、化学ルミネセンス標識、常磁性標識、酵素標識または比色標識等の検出可能な標識に結合させて差し支えない。適切な毒素の例として、ジフテリア毒素シュードモナス内毒素A、リシン、およびコレラ毒素が挙げられる。適切な酵素標識として、リンゴ酸ヒドロゲナーゼブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−5−ステロイドイソメラーゼアルコール脱水素酵素、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼトリオースリン酸イソメラーゼ、ペロキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼリボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼグルコアミラーゼアセチルコリンエステラーゼ等が挙げられる。適切な放射性標識として、3H、125I、131I、32P、35S、14C等が挙げられる。
本発明の方法に基づいて、インビボ診断のために常磁性同位体を用いて差し支えない。磁気共鳴画像法において有用である元素について多くの例がある。インビボでの核磁気共鳴画像法について検討するために、例えば、Schaefer et al., (1989) JACC14, 472-480; Shreve et al., (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340; Wolf, G.L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR16, 93-95; Wesbey et al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al., (1984) Invest. Radiol. 19, 408-415を参照。適切な蛍光標識の例として、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、オフタルデヒド(ophthaldehyde)標識、フルオレサミン標識等が挙げられる。化学ルミネセンス標識の例として、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識等が挙げられる。
当業者は、本発明に基づいて用いることができる他の適切な標識を知っているであろう。当業者に公知の標準技術を用いて、それら標識を抗体またはその断片に結合させることができる。一般的な技術は、Kennedy et al., (1976) Clin. Chim. Acta 70, 1-31; and Schurs et al., (1977) Clin. Chim. Acta 81, 1-40に記載されている。後者の文献に記載のカップリング技術はグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、m−マレイミドベンジル−N−ヒドロキシスクシニミドエステル法である。それら方法の全てが参照によってこの中に組み込まれる。
生物学的試料中のTADG−15タンパク質を検出する方法も本発明の範囲内であり、その方法は、例えば放射能タグ付けしたTADG−15特異的抗体のような標識抗体と、試料とを接触させ、さらにその抗体が試料中の成分に結合したか否かを特定する工程を含む。免疫測定において、TADG−15タンパク質に対する抗体を用いて、新生物性形質転換の疑いが高い組織におけるTADG−15タンパク質発現レベルの上昇を検出することができる。ノーザンブロット法および分析を用いてそれら同じ用途を達成できる。
この中に記載のように、本発明は多くの診断的利点および用途を提供する。例えば、本発明において開示されたTADG−15タンパク質は、そのタンパク質が腫瘍細胞において高度に過剰発現されていることから、様々な組織における癌を診断するのに有用である。TADG−15に特異的なエピトープに結合する抗体(またはその抗原結合断片)は、癌または新生物の形質転換を診断するための、生物学的試料中のTADG−15タンパク質を検出する方法において有用である。本方法は、癌を有する疑いがある患者から生物学的試料(例えば細胞、血液、血漿、組織等)を採取し、さらにELISAのような標準的免疫測定技術を用いてTADG−15タンパク質を検出する各工程を含んでなる。生物学的試料に対する抗体結合は、その試料がTADG−15内のエピトープを有する成分を含むことを示唆する。
同様に、標準的なノーザンブロット法を用いて、当業者に公知の従来のノーザンハイブリダイゼーション技術に基づいて、癌であることが疑わしい細胞または組織中におけるTADG−15 mRNAの相対量を確かめることができる。そのノーザン法は、例えば、配列番号1(図2)に相補的である配列を有する完全長の一本鎖DNA、あるいは20以上(好ましくは30以上、より好ましくは50以上、さらに最も好ましくは100以上の連続ヌクレオチドの長さ)の前記DNA配列の断片の何れかを包含する放射性標識TADG−15 cDNAのようなハイブリダイゼーションプローブを用いる。当業者に周知の様々な方法によって、そのDNAハイブリダイゼーションプローブを標識することができる。
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的で与えられており、何ら本発明を限定することを意図していない。
実施例1
組織採取および保存

0037

患者の子宮摘出、両方の卵巣摘出、または新生組織外科切除の際に、試料を回収して上に置いた。特定組織試料の単離および同定のために、その試料を研修医病理学者に渡した。最終的に、液体窒素中においてその試料を凍結し、実験記録記入して、−80℃に保存した。

0038

時々ヒト組織ネットワーク協会(CHTN)から追加の試料を得た。それら試料はCHTNによって調製され、ドライアイスに入れて出荷された。到達すると、それら試料(例えば、血液(血清)、尿、唾液、涙液、および間質液)を実験記録に記入して、−80℃で保存した。腫瘍組織の提供において、ヒト組織ネットワーク協会(CHTN)の以下の部門の参加が承認されている:西部部門、ウェスタンリザーブ大学(クリーブランド、オハイオ州);中西部部門、オハイオ州立大学(コロンバス、オハイオ州);東部部門、NDRI(フィラデルフィア、ペンシルベニア州);小児科部門、子供病院(コロンバス、オハイオ州);部部門、バーミンガムアラバマ大学(バーミンガム、アラバマ州)。
実施例2
mRNAの単離およびcDNA合成

0039

41の卵巣腫瘍(10の悪性度の低い潜在的腫瘍、および31の癌)、ならびに10の正常卵巣を外科的試料から得て、液体窒素中において凍結した。American Type Culture Collection(Rockville, MD)から、ヒト卵巣癌細胞株SW626およびCAOV3、ならびに、ヒト乳癌細胞株MDA−MB−231およびMDA−MB−435Sを購入した。10%(v/v)ウシ胎児血清および抗生物質補足したダルベッコの改良イーグル培地中において、サブコンフルエントになるまで細胞を培養した。

0040

Becton Dickinsonから購入したMini RiboSepTM UltramRNA単離キットを用いて、その取扱説明書に基づいて、mRNAを単離した。その方法において、オリゴ(dT)セルロースを介したアフィニティークロマトグラフィーを用いて、組織溶解物からポリA+mRNAを直接単離した。回収されたmRNAの量は、UV分光測光法によって定量化された。
CLONTECH(Palo Alto, CA)から購入した第一鎖合成キットを利用して、製品のプロトコルに基づき、5.0μg mRNA、ならびにランダムヘキサマーまたはオリゴ(dT)プライマーの何れかを用いて、第一鎖相補的DNA(cDNA)を合成した。p53遺伝子に特異的なプライマーを用いたPCRによって、cDNAの純度を評価した。ゲノムDNAが混入したcDNAから純粋なcDNAを区別できるように、プライマーはイントロンに架かる。
実施例3
重複プライマーを用いたPCR、TADG−15 cDNAのクローニング、T-
ベクターライゲーションおよび形質転換、ならびにDNA配列決定

0041

セリンプロテアーゼの触媒三つ組残基の周囲のアミノ酸に対応する重複プライマーとして、前進の5’−TGGGTIGTIACIGCIGCICA(C/T)TG−3’(配列番号11)、および反対の5’−A(A/G)IGGICCICCI(C/G)(T/A)(A/G)TCICC−3’(配列番号12)を用いて、正常および癌のcDNAからのPCR産物を比較した。
製品取扱説明書に基づいて、プロメガT−ベクタープラスミド中に精製PCR産物を連結し、さらに、その連結産物を用いて、JM109コンピテント細胞(Promega)を形質転換した。増幅のために陽性コロニーを培養し、さらに、WizardT
M Miniprep DNA精製システム(Promega)によってプラスミドDNAを単離し、その後、ApaIおよびSacI制限酵素でプラスミドを消化し、挿入物のサイズを特定した。以前に記載のPCR産物ゲル電気泳動によって可視化されたサイズの挿入物を有するプラスミドを配列決定した。
個々のクローンを培養し、Wizard Miniprep DNA精製システム(Promega)を用いてプラスミドDNAを単離した。直接的cDNA配列決定のために、Applied Biosystemsモデル373A DNAシークエンスステムを用いた。クローニング部位近傍のプラスミド特異的プライマーを利用して、製品の取扱説明書に基づき、PRISMTM Ready Reaction Dye DeoxyTMターミネーターサイクルシークエンスキット(Applied Biosystems)を用いてヌクレオチド配列決定を実施した。Centri-sepTMスピンカラム(Princeton Separation)を用いて、完了した配列決定反応から染色ターミネーターを除去した。特定された配列に基づき、関心遺伝子を特異的に増幅させるプライマーを設計および合成した。
初代のTADG−15サブクローン(436bp)を無作為に標識して、標準的ハイブリダイゼーション技術13によって卵巣腫瘍cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。そのライブラリーは、ステージIII/グレードIIIの卵巣腺癌患者癌細胞から単離したmRNAを用いて、8ZAP中に構築された。3147ヌクレオチドに架かる3つの重複するクローンを得た。
実施例4
ノーザンブロット分析

0042

0.02M MOPS、0.05M酢酸ナトリウム(pH7.0)、および0.001MEDTA中の1%ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いた電気泳動によって、mRNA(10μg)をサイズ分離した。次に、20xSSPE中での毛管現象によって、Hybond-N+ナイロン膜(Amersham)上にmRNAをブロットした。80℃で2時間加熱乾燥することによって、RNAを膜に固定した。Prime-a-Gene標識システム(Promega)によって、32P標識cDNAプローブを作成した。前記と同じプライマーによって増幅させたPCR産物をプローブに用いた。ブロットを30分間プレハイブリダイズさせ、さらにExpressHybハイブリダイゼーション溶液(CLONTECH)中において、32P標識cDNAプローブと、68℃で60分間ハイブリダイズさせた。β−チューブリンプローブを用いて、相対的ゲル装填量を特定するための対照ハイブリダイゼーションを実施した。

0043

同じハイブリダイゼーション法によって、正常なヒト組織;脾臓胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血白血球、ならびに正常ヒト胎児性組織;脳、肺、肝臓および腎臓(Human Multiple Tissue Northern Blot; CLONTECH)も評価した。CLONTECHから購入した別途の多様組織ノーザン(MTN)ブロットは、ヒトMTNブロット、ヒトMTN IIブロット、ヒト胎児性MTN IIブロット、およびヒト脳MTN IIIブロットを含む。
実施例5
ウェスタンブロット分析

0044

TADG−15タンパク質配列「LFDWKENTGV」(配列番号13)由来の、ポリリジン結合複合Agペプチドで免疫することによって、ウサギポリクロナール抗体を作成した。約20μgの細胞溶解物を15%SDS-PAGEゲルで分離し、4℃、100Vで40分間、PVDF電気ブロッティングした。50%MeOH中において10分間インキュベートすることによってタンパク質を膜に固定した。0.2%脱脂乳を含有するTBS(pH7.8)中において、膜を1晩ブロッキングした。0.2%乳/TBSで1:100に希釈した一次抗体を膜に添加し、室温で2時間インキュベートした。ブロットを洗浄し、1:3000に希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG(BioRad)と共に室温で1時間インキュベートした。ブロットを洗浄し、化学発光性基質と共にインキュベートした後、可視化のためにX線フィルムを10秒間感光させた。
実施例6
定量的PCR

0045

定量的PCRを用いて、TADG−15のmRNA過剰発現を特定した。以前報告された方法11、12に基づいて、定量的PCRを実施した。オリゴヌクレオチドプライマーとして:TADG−15のために、前進の5’−ATGACAGAGGATTCAGGTAC−3’(配列番号14)、および反対の5’−GAAGGTGAAGTCATTGAAGA−3’(配列番号15);およびβ−チューブリンのために、前進の5’−CGCATCAACGTGTACTACAA−3’(配列番号16)、反対の5’−TACGAGCTGGTGGACTGAGA−3’(配列番号17)を用いた。β−チューブリンは内部対照として用いられた。
PCR反応合物は、最終容積25μl中に、反応バッファー(Promega)と共に、mRNA(50ng)から誘導されたcDNA、TADG−15遺伝子およびβ−チューブリン遺伝子のためのセンスおよびアンチセンスプライマー(5pmol)、dNTPs(200μmol)、α-32PdCTP(5μCi)、ならびにTaqDNAポリメラーゼ(0.25unit)を含む。β−チューブリン遺伝子と並行させて、ターゲット配列を増幅させた。サーマルサイクラー(Thermal Cycler)(Perkin Elmer Gene Amp 2400; Perkin-Elmer Cetus)において、PCRを30サイクル実施した。PCRの各サイクルは、94℃での30秒間の変性、60℃での30秒間のアニーリング、および72℃での30秒間の伸長を含む。アニーリング温度は、PCR反応に用いられるプライマーによって変化する。縮重プライマーを含む反応のため、48℃のアニーリング温度を用いた。TADG−15特異的プライマーおよびβ-チューブリン特異的プライマーのための適切なアニーリング温度は62℃である。
2%アガロースゲル上でPCR産物の一部を分離し、さらに、ホスホイメージャー(Molecular Dynamics)を用いることによって、各PCR産物の放射能を特定した。本研究では、発現比(TADG−15/β−チューブリン)を用いて遺伝子発現を評価し、さらに、正常卵巣の平均値±2SDを、過剰発現を特定するためのカットオフ値として定義した。正常卵巣と腫瘍の平均値を比較するために、student’s-t testを用いた。
実施例7
免疫組織化学分析

0046

Vectastain Elite ABCキット(Vector)を用いて、免疫組織化学染色を実施した。ホルマリン固定およびパラフィン包埋した切片をいつものように脱パラフィン処理し、さらに、0.01Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)中においてマイクロ波熱処理によって処理した。湿気のあるチャンバー中において30分間、正常ヤギ血清と共にその切片をインキュベートした。ビオチン化抗ウサギIgGと共に30分間インキュベートした後、その切片をABC試薬(Vector)と共に30分間インキュベートした。ABC基質系(DAKO)を用いて最終生成物を可視化し、さらに標本にする前にヘマトキシリン対比染色した。一次抗体の代わりに正常血清を用いることによって、陰性対照を実施した。
実施例8
アンチセンスTADG−15

0047

アンチセンスRNA分子(配列番号18)が産生されるように、逆配向でTADG−15をクローン化および発現させた。例えば、アンチセンスRNAを用いて、細胞中の相補的RNAにハイブリダイズさせ、それによってTADG−15
RNAのタンパク質への翻訳を阻害する。
実施例9
ペプチドの順位付け

0048

ワクチンまたは免疫刺激のために、それぞれ9マーから11マーのTADG−15タンパク質を調べて、一般人口の上位8つのハプロタイプに対する各ペプチドの結合を順位付けした(Parker et al., (1994))。<http://www-bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hlabind/>において、その分析に用いられるコンピュータープログラムを見つけることができる。表1は、各ペプチドの特定HLA対立遺伝子に対する結合の予測半減期に基づくペプチドの順位付けを示す。より長い半減期は、そのペプチドと特定HLA分子とのより強い結合を示唆する。HLA対立遺伝子に対して強く結合するTADG−15ペプチドは推定上の免疫原であり、かつ個体にTADG−15に対するワクチン接種を行うために用いられる。
実施例10
TADG−15 cDNA

0049

正常組織と比較して腫瘍において特異的に増幅されるRT-PCR産物を調べることによる、ヒト癌において過剰発現されているプロテアーゼを同定するためのスクリーニング戦略を開発した。本試みの間、触媒ドメインのNH3末端にある保存されたヒスチジンドメインに対する重複センスプライマー、および下流の保存されたセリンドメインに対するアンチセンスプライマーを用いて、候補遺伝子を同定した。プロテアーゼをコードする遺伝子を同定するため、そのようなPCR反応において増幅された適切な480塩基対のバンドをサブクローニングおよび配列決定した。増幅された触媒ドメインの中で、TADG−15(腫瘍抗原誘導遺伝子15)と称される新規なセリンプロテアーゼ遺伝子を同定した。その新規に同定されたTADG−15タンパク質の触媒ドメインは、他のセリンプロテアーゼのものと類似しており、具体的には、チロシン様セリンプロテアーゼファミリーの触媒ドメインに適した保存アミノ酸を包含している。

0050

TADG−15プロテアーゼドメインに相同であるアミノ酸配列に関する、FASTAプログラム(Wisconsin Package Version 9.1,GCG, Madison, Wisconsin)を用いたGenEMBLデータベースコンピューター検索は、他の公知のヒトプロテアーゼとの相同性が55%を越えないことを示した。図1は、他のヒトセリンプロテアーゼと比較して、TADG−15のプロテアーゼドメインを整列させたものを示す。GCGを介して利用可能なBESTFITプログラムを用いた結果、TADG−15と、チロシン、キモトリプシン、および組織プラスミノーゲン活性化因子との間の類似性は、それぞれ、51%、46%、および52%であった。

0051

TADG−15触媒ドメイン由来の配列から、特異的プライマーを合成して、ライブラリーのスクリーニングのためTADG−15特異的プローブを増幅させた。卵巣癌ライブラリーをスクリーニングした後、TADG−15転写物の3’末端を含む1つの1785 bpクローンを得た。その新規に検出されたクローンの5’末端を用いてさらにスクリーニングすることによって、TADG−15転写物の5’末端を含む、別の1362 bpのcDNAを提供する、追加のクローンを同定した。配列決定されたcDNAの全長は、約3.15kbであった。得られた全ヌクレオチド配列は、予測された855アミノ酸部分をコードする単一のオープンリーディングフレームの前にあるコザックのコンセンサス配列を含む(図2)。
TADG−15ヌクレオチド配列によってコードされた予測オープンリーディングフレーム(図2、3、および4)は、以下のようないくつかの別個のドメインを含む:アミノ末端細胞質テイル(アミノ酸(aa) #1-54);潜在的膜貫通ドメイン(aa #55-57);細胞外膜ドメイン(aa #78-213);2つの補体サブコンポーネントClr/Cls、 Uegf、および骨形成タンパク質1(CUB)反復(aa #214-447);4つの低密度リポタンパク質(LDL)受容体様ドメインのリガンド結合反復(aa #453-602);ならびにセリンプロテアーゼドメイン(aa #615-855)。TADG−15タンパク質はまた、2つの潜在的N-結合グリコシル化部位(aa #109および302)、ならびに本タンパク質のカルボキシル末端においてプロテアーゼを遊離および/または活性化させることができる、プロテアーゼドメインの上流にある潜在的タンパク質分解性切断部位(aa #614)を含む。さらには、TADG−15は、細胞−細胞接着に関連するタンパク質において共通に見出されている、RGDモチーフ(aa #249-251)を含む。
実施例11
TADG−15発現

0052

TADG−15の転写物のサイズ、および様々な組織における発現パターンを調べるため、代表的な組織タイプの癌、一連の細胞株、胎児性組織、および正常生体組織について、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを実施した(図5)。TADG−15メッセージの転写物サイズは約3.2kbとして特定され、1つの強い転写物が、調べた癌の全てに存在することが観察されたが、正常卵巣では全く可視バンドが検出されなかった(図5)。その転写物サイズは、配列データから予測した転写物サイズ3.15kbともよく一致している。卵巣腫瘍細胞株SW626およびCAOV3も多量の転写物を示したが、乳癌細胞株MDA−MB−231およびMDA−MB−4355では殆どまたは全く転写物が検出されなかった。正常ヒト胎児性組織の中で、胎児性腎臓が多量のTADG−15転写物を示し、さらに胎児性肺においても低い発現が検出された。正常生体組織では、小腸および前立腺における低レベルでの発現と共に、結腸においてTADG-15が検出された(図5)。

0053

卵巣腫瘍および正常卵巣におけるTADG−15のmRNA転写物発現を評価するため。半定量的PCRを実施した(図6)。予備実験において、本測定法11
,12の直線性を確認しており、その結果はノーザンブロットおよび免疫組織化学分析と相関した。ホスホイメージャーを用いてデータを定量化し、発現比(TADG−15/β-チューブリン)として比較した。結果は、TADG−15転写物発現が、調べた腫瘍の全てにおいて、カットオフ値(正常卵巣の平均値±2SD)を越える高いレベルで検出されるが、正常卵巣では検出されないかまたは低レベルで検出されることを示唆した(図6AおよびB)。疾患の初期および末期を含む卵巣癌サブタイプの分析は、調べた全ての癌におけるTADG−15の過剰発現を確認した(表2)。5症例のステージIおよび3症例のステージIIの癌を含む、調べた癌の全てが、TADG−15遺伝子の過剰発現を示した。

0054

腫瘍の病期および組織学的サブタイプに関してそれらデータを調べた結果、全ての病期および全ての組織学的サブタイプの癌がTADG−15を過剰発現していることが示唆された。発現比(平均値±SD)は、正常卵巣群が0.182±0.024、LMP腫瘍群が0.847±0.419、癌群が0.771±0.380であった(表2)。正常卵巣群と腫瘍群との比較は、LMP癌群と癌群の両方において、TADG−15遺伝子の過剰発現が統計的に有意であることを示した(LMP腫瘍:p<0.001、癌:p<0.0001)。

0055

図6に示すように、TADG−15転写物は、全ての卵巣癌において認められたが、以下の組織の何れにおいても、検出可能なレベルでは存在しなかった:a)正常卵巣、b)胎児性の肝臓および脳、c)生体の脾臓、胸腺、精巣、卵巣、および末梢血白血球、d)骨格筋、肝臓、脳、または心臓。本評価を約40腫瘍からなる標準的パネルに広げた。TADG−15特異的プライマーを用いて、図7に示すような卵巣癌組織および乳癌組織由来の腫瘍細胞株、ならびに図8に示すような他の腫瘍組織においても発現を調べた。TADG−15の発現は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、および肺癌でも観察された。

0056

プロテアーゼドメインのカルボキシル末端の合成ペプチド(12マー)に対して作成されたポリクロナール抗体を用いて、正常卵巣および卵巣腫瘍におけるウェスタンブロットおよび免疫学的局在決定によって、細胞株におけるTADG−15発現を調べた。抗体および免疫前血清の両方を用いて、SW626およびCAOV3細胞由来細胞抽出物のウェスタンブロットを調べた(図9)。約100,000ダルトン、約60,000ダルトン、および32,000ダルトンのバンドを含む、いくつかのバンドが、抗体を用いて検出された。完全TADG−15分子の予想分子サイズは、約100,000ダルトンと推定され、さらに、aa #614でタンパク質分解性切断によって遊離されるであろうプロテアーゼドメインは約32,000ダルトンと推定された。いくつかの中間のタンパク質分解産物が60,000ダルトンのバンドに該当するであろう。

0057

腫瘍細胞の抗体染色は、一連のLMP腫瘍、粘液性LMP腫瘍、および漿液性癌の細胞質にTADG−15プロテアーゼが存在することを支持する(それぞれ、図10B、C、およびD)。その広汎性染色パターンは、TADG−15が詰め込まれて細胞表面に輸送されている時の細胞内のTADG−15の検出のせいであろう。子宮内膜様癌において、抗原は癌細胞表面にはっきりと検出された(図10E)正常卵巣の上皮細胞およびストローマ細胞では全く染色が検出されなかった(図10A)。27の一連の腫瘍の免疫組織化学染色は、悪性度の低い潜在的腫瘍群を含む、調べた全ての癌のサブタイプに、TADG−15タンパク質が存在することを示唆した。9例の悪性度の低い潜在的腫瘍の内7例、および18の癌のうち13例において、強い染色が観察された(表3)。
実施例12
TADG−15の相同性

0058

最近、エピチン(GenBank登録番号AF042822)と称されるマウスタンパク質が報告されている14。エピチンは、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、2つのCUBドメイン、4つのLDLR様ドメイン、およびカルボキシル末端セリンプロテアーゼドメインを有する点においてTADG−15に類似する構造を有する、902アミノ酸タンパク質である。TADG−15とエピチンは、843アミノ酸に亘り84%類似しており、2つのタンパク質がオーソロガスな関係にある(orthologous)ことを示唆する(図11)。エピチンの正確な役割はまだ明らかにされていない。

0059

以前同定された類似配列に関するGenBankの調査は、TADG−15遺伝子の一部に相対的に高い相同性を有する1つの配列をもたらした。#182から3139ヌクレオチドまでのTADG−15の一部とSNC−19(GenBank登録番号#U20428)との類似性は、約97%である(図12)。しかしながら、SNC−19とTADG−15との間には顕著な違いがある。例えば、TADG−15は855アミノ酸のオープンリーディングフレームを有するが、SNC−19の最も長いオープンリーディングフレームは173アミノ酸である。さらに、SNC−19は翻訳開始のための適切な開始部位を含まないばかりか、TADG−15によってコードされているタンパク質のアミノ末端部分も含まない。さらには、SNC−19は、機能的であるために必要である触媒三つ組残基のHis、Asp、およびSer残基が異なるリーディングフレーム中にコードされているため、機能的セリンプロテアーゼのためのオープンリーディングフレームを含まない。
考察

0060

TADG−15タンパク質の全体の構造は、トロイド(tolloid)/BMP-1ファミリーのメンバー、および補体サブコンポーネントClr/Clsに相対的に類似している。それらタンパク質は、CUBおよびプロテアーゼドメインの両方を含み、リガンド結合ドメインを介した複合体形成がその機能に必須である。ClrおよびClsのセリンプロテアーゼドメインの活性化は、それぞれ、Arg-GlyおよびArg-Ile結合のタンパク質分解性切断を必要とする15。同様に、TADG−15タンパク質が、他のセリンプロテアーゼチモーゲン活性化機構に類似する、Arg614
とVal615との間の切断によって活性化されるチモーゲンとして合成されることが予測される。培養細胞の溶解物のウェスタンブロット分析は、推定されるチモーゲン(完全分子)およびTADG−15の切断プロテアーゼ産物に対応する100kDaおよび32kDaペプチドの両方を確認した(図9)。それらデータは、類似のII型セリンプロテアーゼにおいて生じるような、TADG−15のタンパク質分解性遊離および/または活性化のモデルを支持する。

0061

CUBドメインは、補体サブクローンClr/Cls16-18において初めて発見され、例えば骨形成タンパク質−1(BMP-1)およびトロイド遺伝子産物18-20のような、発生上調節されるタンパク質において広範囲に存在するモジュールであることが分かっている。それら反復の役割はまだ分かっていない。しかしながら、いくつかのモデルは、CUBドメインがタンパク質−タンパク質相互作用に関連していることを示唆する。ClrおよびClsのCUBドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインを提供することによって、補体の古典経路の活性化におけるCls-Clr-Clr-Cls四量複合体の集合に参加する15。ショウジョウバエデカペンタプレギック(decapentaplegic)タンパク質(DPP)は、背部腹部の指定に必須であり、さらにショウジョウバエのトロイド(TLD)は、その活性を調節するためにDPPと複合体を形成する19,20。トロイドタンパク質のCUBドメインにおけるミスセンス変異は、DPP複合体とのタンパク質相互作用を許さない発現型をもたらす19。

0062

TADG−15タンパク質は、214アミノ酸残基と447アミノ酸残基との間に、CUB様ドメインの2つのタンデム反復を含む。それら反復のそれぞれは、約110アミノ酸長であり、それぞれ、他のCUBの特性を示している4つの保存システイン残基を有する(アミノ酸214、244、268、294、340、366、397、410)。類推によると、TADG−15タンパク質のCUB反復は、多重結合複合体の形成を促進し、さらにターゲットタンパク質またはTADG−15自身の活性を調節することができる、インターラクティブなドメインを形成するであろう。

0063

また、TADG−15タンパク質は、4つの隣接したシステイン富む反復から成る、LDL受容体リガンド結合反復(クラスAモチーフ)様ドメイン(アミノ酸残基453−602)を含む。システインに富む反復のそれぞれは、約40アミノ酸長であり、6つのシステイン残基と共に、保存された負に荷電した配列(Ser-Asp-Glu)を含む。LDL受容体タンパク質において、その反復は、リポタンパク質中に存在するリジンおよびアルギニン残基相互作用するタンパク質結合ドメインとして機能すると考えられている21,22。さらには、LDL受容体の最初の反復は、Ca2+に結合し、リポタンパク質には結合しないと考えられる
23。類推によると、TADG−15におけるLDL受容体様反復は、他のタンパク質の正に荷電した領域と相互作用する同様の態様でおよび/またはCa2+結合部位として、作用する可能性がある。リガンド結合および受容体−リガンド複合体の形成の結果として、LDL受容体はクラスリン被覆小孔を介して内側に取り込まれる2,4。TADG−15は、サイトゾル領域中にそのモチーフを含まず、さらには、TADG−15の細胞質ドメインにおいて、他の公知タンパク質の配列との類似性が全く認められなかった。そのような所見は、TADG−15が、細胞外マトリックス中に類似のリガンド結合反復を有するが、エンドサイトーシス受容体(例えばLDL受容体)とは異なる態様で機能することを示唆する。

0064

TADG−15の正確な役割は分かっていないが、本遺伝子は卵巣腫瘍において明らかに過剰発現されている。例えばIV型コラゲナーゼおよびプラスミノーゲン活性化因子のような様々なプロテアーゼは、腫瘍浸潤の過程に関連し、悪性進行におけるプロテアーゼカスケードの構成要素であると考えられている。TADG−15は、そのような活性を構成し、さらに腫瘍の周囲の細胞外マトリックス成分を直接消化し、あるいは、不活性前駆体の切断によって他のプロテアーゼを活性化して、腫瘍の増殖および浸潤を間接的に増強させるであろう。TADG−15が、他の増殖因子または情報伝達タンパク質と複合体を形成してそれらの活性を調節することによって、トロイド/BMP-1ファミリーのメンバーと同様に機能することもあり得る。

0065

それらデータは、TADG−15遺伝子およびその翻訳タンパク質が、細胞外マトリックスおよび最終的に循環へのプロテアーゼドメインの遊離を介して、卵巣癌の早期検出のための有用なマーカーとなる可能性を高める。また、それらデータは、CUB/LDLRリガンド結合ドメインを狙った送達システムによる、治療的介入のためのターゲットとしてTADG−15を用いることができる可能性を示唆する。
以下の引例がこの中で挙げられている:

0066

明細書中に記載された任意の特許または刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。それら特許および刊行物は、個々の刊行物が具体的におよび個別的に参照によって組み込まれることが示唆されたのと同様に、参照によってこの中に組み込まれる。
当業者は、本発明をうまく応用して、その目的を達成しかつ記載のおよび本来の結果ならびに利点を得ることを容易に理解するであろう。この中において方法、手段、処置、分子および特定化合物と共に記載した本実施例は、現在での好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定として見なされない。当業者はそれらに対する変化および他の用途を考えつき、それらは本請求の範囲によって特定された本発明の精神に含まれる。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ