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技術 赤色発光[8,9]ベンゾフェノキサジン核酸色素およびそれらの使用のための方法

出願人 アプライドバイオシステムズリミテッドライアビリティーカンパニー
発明者 ヤン,ションウェイミラグリア,シェリユアン,パウミアウ
出願日 2000年9月1日 (19年3ヶ月経過) 出願番号 2001-522339
公開日 2003年3月11日 (16年9ヶ月経過) 公開番号 2003-509528
状態 未登録
技術分野 生物学的材料の調査,分析 化学反応による材料の光学的調査・分析 電気化学的な材料の調査、分析 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 N,O含有複素環式化合物 発光性組成物 染料
主要キーワード 環境研究 級末端 生サンプル 発光光子 サンプル媒体 物理的性 自己蛍光発光 光脱色
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図面 (3)

課題・解決手段

種々の状況における核酸を染色するのに有用な赤色発光蛍光[8,9]ベンゾフェノキサジン色素新規クラスが提供される。これらの状況として、溶液中、電気泳動ゲルまたは他のマトリクス中、ブロッティング実験中およびインタクト生細胞を使用するアッセイ中が挙げられる。この新規な色素は、現在利用可能な赤色発光生細胞核酸染色より、鮮やかであり、かつ迅速に浸透する。本発明の新規な[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、親[8,9]ベンゾフェノキサジン環に結合した脂肪族カチオン性鎖によって特徴付けられる。

概要

背景

概要

種々の状況における核酸を染色するのに有用な赤色発光蛍光[8,9]ベンゾフェノキサジン色素新規クラスが提供される。これらの状況として、溶液中、電気泳動ゲルまたは他のマトリクス中、ブロッティング実験中およびインタクト生細胞を使用するアッセイ中が挙げられる。この新規な色素は、現在利用可能な赤色発光生細胞核酸染色より、鮮やかであり、かつ迅速に浸透する。本発明の新規な[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、親[8,9]ベンゾフェノキサジン環に結合した脂肪族カチオン性鎖によって特徴付けられる。

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請求項1

以下の構造式(I):

請求項

ID=000003HE=059 WI=137 LX=0370 LY=0555に従い、任意の付随対イオンを含むベンゾフェノキサジン化合物であって、ここで、R1は、単独の場合、水素ハロゲン、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR2と一緒になる場合、(C5−C14)アリレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;R2は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR1と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;R3は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキルおよび(C5−C14)アリールからなる群から選択されるか、あるいはR3'と一緒になる場合、(C2−C8)アルキルジイルであり;R3'は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキルおよび(C5−C14)アリールからなる群から選択されるか、あるいはR3と一緒になる場合、(C2−C8)アルキルジイルであり;R4は、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択され;R6は、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択され;R7は、合計で約4〜20個の水素ではない原子、および約pH6〜pH9の範囲内のpHで正に荷電される1〜4個のヘテロ原子を含む脂肪族カチオン性鎖であり;R11は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR12と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;R12は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR11またはR13と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;R13は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR12またはR14と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;R14は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR13と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;各々のWは、独立して、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択され;そして、各R’は、独立して、水素または(C1−C6)アルキルである、ベンゾフェノキサジン化合物。

請求項2

浸透性である、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項3

R1、R2、R4およびR6が、各々水素である、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項4

R3およびR3'が、各々独立して、(C1−C3)アルキルである、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項5

R1が、R2と一緒になる場合、ベンゾ、[1,2]ナフタレノまたは[2,3]ナフタレノである、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項6

R11、R12、R13およびR14が、各々水素である、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項7

R11が、R12と一緒になる場合、ベンゾである、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項8

R12が、R13と一緒になる場合、ベンゾである、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項9

R13が、R14と一緒になる場合、ベンゾである、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項10

R7が、−(CH2)n−NRRR、−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRおよび−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRからなる群から選択され、ここで、各nが、独立して2〜3の整数であり、各Rが、独立して、水素および(C1−C3)アルキルからなる群から選択される、請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項11

請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物であって、該化合物は、以下の構造式(II):

請求項

ID=000004HE=059 WI=137 LX=0370 LY=0300に従い、任意の付随の対イオンを含む化合物であり、ここで、R7が、合計で約4〜20個の水素ではない原子、および約pH6〜pH9の範囲内のpHで正に荷電される1〜4個のヘテロ原子を含む脂肪族カチオン性鎖である、ベンゾフェノキサジン化合物。

請求項12

膜浸透性である、請求項11に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項13

R7が、−(CH2)n−NRRR、−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRおよび−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRからなる群から選択され、ここで、各nが、独立して2〜3の整数であり、各Rが、独立して、水素および(C1−C3)アルキルからなる群から選択される、請求項11に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項14

以下の構造式:

請求項

ID=000005HE=059 WI=137 LX=0370 LY=2000を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項11に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項15

以下の構造式:

請求項

ID=000006HE=059 WI=137 LX=0370 LY=0470を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項11に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項16

請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物であって、該化合物は、以下の構造式(III):

請求項

ID=000007HE=059 WI=137 LX=0370 LY=1490に従い、任意の付随の対イオンを含む化合物であり、ここで、R7が、合計で約4〜20個の水素ではない原子、および約pH6〜pH9の範囲内のpHで正に荷電される1〜4個のヘテロ原子を含む脂肪族カチオン性鎖である、ベンゾフェノキサジン化合物。

請求項17

膜浸透性である、請求項16に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項18

R7が、−(CH2)n−NRRR、−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRおよび−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRからなる群から選択され、ここで、各nが、独立して2〜3の整数であり、各Rが、独立して、水素および(C1−C3)アルキルからなる群から選択される、請求項16に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項19

以下の構造式:

請求項

ID=000008HE=059 WI=137 LX=0370 LY=0725を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項16に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項20

以下の構造式:

請求項

ID=000009HE=059 WI=137 LX=0370 LY=1660を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項16に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項21

以下の構造式:

請求項

ID=000010HE=059 WI=137 LX=0370 LY=0300を有し、任意の付随の対イオンを含む、請求項16に記載のベンゾフェノキサジン化合物。

請求項22

核酸を請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物と接触させる工程を包含する、核酸を染色する方法。

請求項23

前記核酸が、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記核酸がDNAである、請求項22に記載の方法。

請求項25

前記核酸がRNAである、請求項22に記載の方法。

請求項26

前記核酸が生物学的構造に含まれる、請求項22に記載の方法。

請求項27

前記生物学的構造が、細胞膜である、請求項26に記載の方法。

請求項28

前記核酸が、マトリクス内に包埋される、請求項22に記載の方法。

請求項29

前記マトリクスが、電気泳動ゲルである、請求項22に記載の方法。

請求項30

生物学的サンプル中の核酸を染色する方法であって、該方法が、該生物学的サンプルを請求項1に記載のベンゾフェノキサジン化合物と接触させる工程を包含する、方法。

請求項31

前記生物学的サンプルが細胞全体を含み、前記ベンゾフェノキサジン化合物が膜浸透性である、請求項30に記載の方法。

請求項32

前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項31に記載の方法。

請求項33

前記核酸が、DNAである、請求項30に記載の方法。

請求項34

前記細胞が、真核生物細胞である、請求項31に記載の方法。

0001

(1.発明の分野)

0002

本発明は、核酸を染色、標識および/または検出するのに有用な蛍光赤色発光[8,9]ベンゾフェノキサジン色素に関する。

0003

(2.発明の背景

0004

基本的研究の多くの領域は、迅速かつ敏感に核酸を検出する能力から利益を得る。例えば、生命科学研究の多くの分野(生物学的研究、生医学的研究、遺伝的研究、発酵養殖漁業農業法医学研究および環境研究を含む)において、標準実験方法慣用的成分として細胞内および細胞を含まない核酸の両方を同定する必要がある。一般的な例は、核酸を特徴付けるためのゲル電気泳動の広範な使用であり、この1つの限界は、核酸バンドを検出するために使用される染色方法感度である。

0005

生命医学において、研究者らおよび技術者らは、しばしば、細胞内核酸を同定および/または細胞内に存在する核酸の量に基づく細胞を識別する必要がある。存在する核酸の量は、細胞の型、または細胞(有核ヒト赤血球)内の疾患状態の存在でさえも示し得る。このような適用は、細胞膜によって結合される(または、囲まれる)場合でさえ、核酸を検出し得る迅速で感受性でかつ選択的な方法を必要とする。

0006

一般に、広範な適用にわたって核酸を染色するために適用可能な色素は、好ましくは、以下の特性を有する:

0007

i)核酸−色素複合体は、少量の核酸が、細胞を含まないアッセイおよび細胞ベースのアッセイの両方において敏感に検出され得るように、低バックグラウンドを有する非常に高いシグナルを生成すべきである;および

0008

ii)核酸−色素複合体が、この蛍光シグナルが有意な光脱色なしに観察、モニターそして記録され得るように光安定性であるべきである。

0009

細胞(特に、生細胞)内の核酸を染色する工程を包含する適用に対して、色素は、好ましくは以下のさらなる特性を有するべきである。

0010

iii)この色素が、それが細胞内に隔離された核酸を結合し得るように細胞膜に対して浸透性であるべきである;

0011

iv)この膜浸透速度が、検出可能なシグナルがこの色素に対する比較的短時間の曝露の際に得られ得るように比較的迅速でなければならない;および

0012

v)この色素が、染色が細胞の正常な代謝プロセスを乱さないか、または早発性細胞死を引き起こさないように、生細胞に対して非毒性であるべきである。

0013

細胞を含まないアッセイおよび/または細胞内アッセイにおいて核酸を染色するのに有用な種々の色素が、記載されている。例えば、核酸を染色するのに有用な種々の非対称シアニン色素(Brookerら、1942、J.Am.Chem.Soc.64:199)およびチオフラビン色素(米国特許第4,554,546号および同第5,057,413号)が、記載されている。商品名Thiazole Orangeで販売される非キメラ非対称性シアニン色素は、未熟血球または網状赤血球定量分析(米国特許第4,883,867号)および血液運搬寄生虫の核酸を優先的に染色する際(米国特許第4,937,198号)において、特定の利点を提供する。Thiazole Orangeおよび他のチオフラビンシアニン色素は、多くの哺乳動物細胞の膜に対して浸透性であるが、それらは多くの真核生物細胞に対して非浸透性である。

0014

他の関連したシアニン色素は、生細胞の膜が乱されない限り、生細胞に対して非浸透性であると記載される(米国特許第5,321,130号および同第5,410,030号を参照のこと)。電気泳動ゲルにおいて核酸を染色するのに有用なカチオン性部分を有する種々のダイマー色素が、米国特許第5,312,921号;同第5,401,847号;同第5,565,554号;および同第5,783,687号に記載される。

0015

スペクトルの生細胞および死細胞の両方の膜を浸透し得る置換された非対称性シアニン色素もまた、記載されている(米国特許第5,436,134号を参照のこと)。

0016

これらの色素の多くが、核酸染色としての使用を見出している一方で、それらは、特に生細胞アッセイにおいて、それらの一般的適用を制限する幾つかの欠点に苦しむ。例えば、利用可能な色素のほとんどが、可視スペクトル緑色領域において蛍光発光する。緑色レーザーは単に赤色レーザーより高価であるだけでなく、緑色蛍光は、特に、細胞性成分自己発光およびアッセイ装置に起因する生細胞アッセイ内のより高いバックグラウンドシグナルを生じる。これらのより高いバックグランドシグナルは、アッセイの感度を低下させる。さらに、多くの細胞性成分は、緑色光を吸収し、さらにアッセイの感度を低下させる。

0017

赤色レーザーは、緑色レーザーより高価ではなく、細胞性成分が一般的に赤色光に対して透過性であるため、可視スペクトルの赤色領域励起極大および発光極大を有する核酸染色が、生細胞アッセイに好ましい。しかし、生細胞アッセイに適切な特性を有する膜浸透性の赤色発光核酸染色の利用可能性は、制限される。不運なことに、最も通常の水溶性赤色発光色素、色素Cy5のようなシアニン色素は、光安定ではない。従って、光安定である感受性核酸染色は、可視スペクトルの赤色領域において励起極大および発光極大を有し、細胞膜に対して浸透性である感受性核酸染色が、非常に所望される。

0018

(3.発明の要旨)

0019

これらの有利な特性および他の有利な特性を有する色素が本発明によって提供され、これは、1局面において、核酸を標識、染色および/または検出するための赤色発光[8,9]ベンゾフェノキサジン色素の新規クラスを提供する。本発明の新規な[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、親[8,9]ベンゾフェノキサジン環に結合した脂肪族カチオン性鎖によって特徴付けられる。親[8,9]ベンゾフェノキサジン環は、以下の2個の窒素含有置換基を含む:C3炭素におけるアミノ置換基およびC7炭素におけるイミニウム(imminium)置換基。C3アミノ置換基は、一級アミノ基、二級アミノ基または三級アミノ基であり得る。アミノ基が二級アミノまたは三級アミノである場合、窒素置換基は、同じかまたは異なる(C5−C14)アリール基または(C1−C6)アルキル基の1個以上であり、より好ましくは、同じかまたは異なる(C1−C6)アルキル基の1個以上である。あるいは、窒素脂肪族環に含まれ得、この場合、アミノ窒素は、脂肪族架橋(代表的には、(C2−C8)アルキルジイル)で置換される。以下により詳細に記載されるカチオン性鎖は、メチレン炭素を介してC7イミニウム窒素に結合される。

0020

親[8,9]ベンゾフェノキサジン環は、独立して、C1位、C2位、C4位、C6位、C11位、C12位、C13位および/またはC14位にて、広範な種々の異なる置換基(同じであっても異なっていてもよい)で置換され得る。任意のこのような置換基は、一般的に、色素が細胞膜を通って浸透する能力、または色素が細胞膜を横切って拡散する能力に悪影響を及ぼさないように荷電されないべきである。代表的な置換基は、ハロゲン、(C1−C6)アルキル、−OR、−SR、−NRR、−CN、−NO2および−C(O)Rからなる群から選択され、ここで、各Rは、独立して、水素または(C1−C6)アルキルである。このような置換基は、特定の適用および装置のために、色素の励起および/または発光スペクトル特性を調整または微調整するために使用され得る。さらに、親[8,9]ベンゾフェノキサジン環は、C1およびC2炭素;C11およびC12炭素;C12およびC13炭素;ならびに/あるいはC13およびC14炭素に融合した1個以上の(C5−C14)アリレノ架橋を含み得る。親[8,9]ベンゾフェノキサジン環に対するこのようなアリーレノ架橋置換基の付加は、一般的に、色素の励起極大および発光極大をレッドシフトさせる。これらのアリーレノ架橋はまた、上記のように、同じかまたは異なる非荷電の基の1個以上でさらに置換され得る。

0021

脂肪族カチオン性鎖は、代表的に、合計で約4〜20個の水素でない原子を含み、色素が使用される条件下で正電荷を寄与する1〜4個のヘテロ原子を有する。親[8,9]ベンゾフェノキサジン環のC7イミニウム窒素によって寄与される正電荷を含まず、このカチオン性鎖は、色素が使用される条件下で、少なくとも1個の正電荷を有し、通常、4個以下の正電荷を有し、より代表的には、3個以下の正電荷を有する。親[8,9]ベンゾフェノキサジン環が合計で4個の融合環を含む実施形態において、カチオン性鎖は、好ましくは、1個または2個の正電荷を有し、C7イミニウム窒素によって寄与される正電荷を含まない。親[8,9]ベンゾフェノキサジン環が合計で5個の融合環を含む実施形態において、カチオン性鎖は、好ましくは1個または3個の正電荷を有し、C7イミニウム窒素によって寄与される正電荷を含まない。この正電荷は、代表的に、アミノ基またはイミノ基に基づくが、硫黄リンおよびヨウ素のような正電荷を支持し得る他の元素はまた、これらのカチオンが使用の条件下で安定である程度に使用され得る。

0022

1級アミノ基または1級イミノ基でさえも、使用の代表的pH(すなわち、pH6〜pH9の範囲のpH)において少なくとも部分的な正電荷を寄与するのに十分塩基性であるため、アミノ基またはイミノ基(脂肪族鎖に対して内部にあるか、または末端にある)は、置換されても置換されなくてもよい。アミノ基およびイミノ基の塩基性は、一般的に置換の増加とともに増加するため、内部アミノ基は、好ましくは、少なくとも一置換され、そして末端アミノ基は、好ましくは、少なくとも二置換される。末端イミノ基は、好ましくは、少なくとも一置換される。あるいは、アミノ基またはイミノ基は、それらが永久的な正電荷を保有するように、完全に置換され得る(すなわち、四級アミノまたは四級イミノ)。カチオン性鎖が、単一の内部アミノ基のみを含む場合、それは好ましくは、四級アミノである(二置換される)。カチオン性鎖が、1個より多くの内部アミノ基を含む場合、これらの基の少なくとも1個は、四級アミノであるべきである。任意の末端アミノ基は、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基または四級アミノ基であり得るが、好ましくは、三級(二置換される)または四級である。

0023

実質的に、任意の置換基は、内部または末端のアミノ基またはイミノ基の窒素原子を置換するために使用され得る。通常、窒素原子は、各々独立して、同じかまたは異なる(C1−C6)アルキル基の1個以上で置換される。好ましくは、窒素原子は、各々独立して、同じかまたは異なる直鎖の(C1−C3)アルキル基の1個以上で置換され、最も好ましくは、1個以上のメタニル基(methanyl group)で置換される。従って、内部アミノ基および内部イミノ基は、代表的に、それぞれ式−NRR−および=NR−を有し、そして末端アミノ基および末端イミノ基は、代表的に、それぞれ、式−NRRRおよび=NRRを有し、ここで、各Rは、独立して、水素または(C1−C6)アルキルである。

0024

カチオン性鎖のアミノ基またはイミノ基は、通常、2個〜6個の炭素原子によって互いに隔てられる。代表的に、カチオン性鎖のアミノ基またはイミノ基は、2個または3個の炭素原子によって隔てられる。同様に、C7イミニウム窒素は、2個〜6個の炭素原子、好ましくは3個の炭素原子によって、アミノ基またはイミノ基から隔てられる。カチオン性鎖は、任意の数の炭素−炭素二重結合、炭素−窒素二重結合または炭素−炭素三重結合を含み得るが、好ましくは、飽和である。さらに、カチオン性鎖は、代表的に直鎖であり、唯一分岐点がアミノ基またはイミノ基で生じる。しかし、骨格炭素原子は、同じかまたは異なる(C1−C6)アルキル置換基の1個以上を含み得る。

0025

本発明の新規な[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、広範な状況(例えば、溶液中、電気泳動ゲル中ブロット上および他のアッセイ中を含む)における後の検出のための核酸を染色または標識するために、インターカレート色素または非インターカレート色素として使用され得る。操作についての任意の特定の理論に束縛されることを意図しないが、色素が、例えば二本鎖DNAまたはRNAを染色するためのインターカレート色素または染色として使用される場合、それらの核酸を結合する能力は、ほとんど塩基対間にインターカレートする親[8,9]ベンゾフェノキサジン環によって媒介されると考えられる。色素が、例えば一本鎖DNAまたはRNAを染色するための非インターカレート色素または染色として使用される場合、それらの核酸を結合する能力は、ほとんど核酸のアニオン性リン酸ジエステル骨格と色素のカチオン性鎖との間のイオン性相互作用によって媒介されると考えられる。しかし、当業者は、イオン性相互作用および疎水性相互作用の両方、ならびに他の型の相互作用が、一本鎖核酸および二本鎖核酸の両方を結合する際におそらく関与することを認識する。本発明の最も好ましい色素は、膜浸透性である色素である。

0026

本発明の新規な[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、広範な適用にわたって核酸を染色するのに理想的に適切にする幾つかの特性を有する。例えば、本発明の新規な[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は:(i)可視スペクトルの赤色領域(630nm以上)において50,000cm-1M-1以上の吸光係数を有する高いモル吸光率を有し;(ii)親[8,9]ベンゾフェノキサジン環の置換パターンに依存して、代表的に650nm以上の長発光波長を有し;(iii)優れた光安定性を有し;(iv)核酸を結合する際に量子収率の劇的な増加を生じ、代表的には、利用可能なおよび/または報告された核酸染色より顕著に輝き;そして(v)一本鎖核酸および二本鎖核酸の両方に対して高い結合親和性を有する。

0027

これらの所望の特性に加えて、本発明の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素のほとんどは、インタクトな生細胞の膜を通して受動的に浸透し得るか、またはインタクトな生細胞の膜を横切って拡散し得、それらを、DNAおよびRNAの両方の生細胞染色に理想的に適切にする。今日まで、本発明の膜浸透性色素は、試験される全ての細胞株において良好な浸透性を示した。非常に驚くべきことに、新規の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、現在利用可能な生細胞核酸染色より顕著に速い速度で細胞膜を横断する。公知のシアニン色素SYTO61(登録商標)(Molecular Probes,Eugene,OR)を用いた、本発明の2個の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素間のHCT−116細胞における取り込みの速度の直接の比較は、本発明の新規な色素による顕著に速い取り込み速度を示す(図2)。

0028

さらに、本発明の色素で染色した真核生物細胞は、SYTO61(登録商標)のような従来のシアニン色素で染色した細胞より、1000倍を超える大きい蛍光を示し得る。それらのより鮮やかなシグナルおよび増大した浸透速度により、本発明の新規の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、現在利用可能な色素より生細胞核酸アッセイにおいてはるかに少ない色素を用いて、速い結果を提供する。さらに、親[8,9]ベンゾフェノキサジン環に結合したカチオン性鎖および/または置換基の単純な合成改変によって、好ましい浸透特性、ならびに可視スペクトルの赤色領域において吸収および発光スペクトル特性を有する色素が、容易に得られ得る。従って、本発明の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、現在利用可能な生細胞核酸染色の多くの欠点を克服する、光安定で、可視励起可能な生細胞核酸染色の新規なクラスを表す。

0029

(5.好ましい実施形態の詳細な説明)

0030

(5.1番号付けステム

0031

本出願の目的のために、親[8,9]ベンゾフェノキサジン環は、以下のように番号付けされる:

0032

(5.2 定義)

0033

明細書中で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される:

0034

「アルキル」とは、親アルカン、親アルケンまたは親アルキンの単一の炭素原子から1個の水素原子を除去することによって誘導体化される、飽和または不飽和の、分枝鎖、直鎖または環式一価炭化水素基をいう。代表的なアルキル基として、これらに限定されないが、メチル(メタニル);エタニル、エテニルエチニルのようなエチルプロパン−1−イル、プロパン−2−イル(イソプロピル)、シクロプロパン−1−イル、プロプ−1−エン−1−イル、プロプ−1−エン−2−イル、プロプ−2−エン−1−イル、シクロプロプ−1−エン−1−イルのようなプロピル;シクロプロプ−2−エン−1−イル、プロプ−1−イン−1−イル、プロプ−2−イン−1−イルなど;ブタン−1−イル、ブタン−2−イル(sec−ブチル)、2−メチル−プロパン−1−イル(イソブチル)、2−メチル−プロパン−2−イル(t−ブチル)、シクロブタン−1−イル、ブト−1−エン−1−イル、ブト−1−エン−2−イル、2−メチル−プロプ−1−エン−1−イル、ブト−2−エン−1−イル、ブト−2−エン−2−イル、ブタ−1,3−ジエン−1−イル、ブタ−1,3−ジエン−2−イル、シクロブト−1−エン−1−イル、シクロブト−1−エン−3−イル、シクロブタ−1,3−ジエン−1−イル、ブト−1−イン−1−イル、ブト−1−イン−3−イル、ブト−3−イン−1−イルなどのようなブチルが挙げられる。

0035

「アルキルジイル」とは、親アルカン、親アルケンまたは親アルキンの同じかまたは2個の異なる炭素原子から2個の水素原子を除去することによって誘導体化された2個の一価ラジカル中心を有する、1〜20個の炭素原子の飽和または不飽和の、分枝鎖、直鎖または環式の炭化水素基をいう。代表的なアルキルジイル基として、1,2−エチルジイル、1,3−プロピルジイル、1,4−ブチルジイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

0036

芳香族環系」とは、共役π電子系を有する不飽和の環式環系または多環式環系をいう。具体的には、「芳香族環系」の定義には、環の1個以上が芳香族であり、環の1個以上が飽和または不飽和である融合した環系(例えば、インダンインデンフェナレンなど)が含まれる。代表的な芳香族環系として、アセアントリーレン(aceanthrylene)、アセナフチレン、アセフェナントリーレン(acephenanthrylene)、アントラセンアズレンベンゼンクリセンコロネンフルオランテンフルオレンヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、as-インダセン、s−インダセン、インダン、インデン、ナフタレンオクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−2,4−ジエン、ペンタセンペンタレン、ペンタフェン、ペリーレン、フェナレン、フェナントレンピセンプレイアデン(pleiadene)、ピレンピラントレン、ルビセン、トリフェニレントリナフタレンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

0037

アリール」とは、芳香環系の単一炭素原子から1個の水素原子を除去することによって誘導体化される一価芳香族炭化水素基をいう。代表的なアリール基として、アセアントリーレン、アセナフチレン、アセフェナントリーレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、as−インダセン、s−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−2,4−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリーレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどから誘導される基が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、アリール基は、(C5−C20)アリールであり、であり、(C5−C10)がさらにより好ましい。特に好ましいアリールは、フェニル(C6アリール)およびナフチル(C10アリール)である。

0038

「アリーレノ」とは、親芳香族環系の2個の隣接炭素原子の各々から1個の水素原子を除去することによって誘導体化される2個の隣接一価ラジカル中心を有する二価架橋基をいう。アリーレノ架橋基(例えば、ベンゼノ)の親芳香族環系(例えば、ベンゼン)への結合は、融合した芳香族環系(例えば、ナフタレン)を生じる。この架橋は、得られた融合環系への結合と一貫した最大数の非累積二重結合を有することが想定される。アリーレノ置換基が、炭素原子の二重計測を避けるために、代替の置換基を含む構造上の2個の隣接置換基一緒になって形成される場合、アリーレノ架橋の炭素原子は、構造の架橋炭素原子を置き換える。例として、以下の構造が考えられる:

0039

ここで、

0040

R1は、単独の場合、水素であり、またはR2と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノであり;

0041

そしてR2は、単独の場合、水素であり、またはR1と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノである。

0042

R1およびR2が各々水素である場合、得られる化合物はベンゼンである。R2と一緒になるR1がC6アリーレノ(ベンゼノ)である場合、得られる化合物は、ナフタレンである。R2と一緒になるR1がC10アリーレノ(ナフタレノ)である場合、得られる化合物はアントラセンまたはフェナントレンである。代表的なアリーレノ基として、アセアントリーレノ、アセナフチレノ、アセフェナントリーレノ、アントラセノ、アズレノ、ベンゼノ(ベンゾ)、クリセノ、コロネノ、フルオランテノ、フルオレノ、ヘキサセノ、ヘキサフェノ、ヘキサレノ、as−インダセノ、s−インダセノ、インデノ、ナフタレノ(ナフト)、オクタセノ、オクタフェノ、オクタレノ、オバレノ、ペンタ−2,4−ジエノ、ペンタセノ、ペンタレノ、ペンタフェノ、ペリーレノ、フェナレノ、フェナントレノ、ピセノ、プレイアデノ、ピレノ、ピラントレノ、ルビセノ、トリフェニレノ、トリナフタレノなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の連結性が意図される場合、(アリーレノ架橋の)関与する架橋炭素は、括弧内に示され、例えば、[1,2]ベンゼノ([1,2]ベンゾ)、[1,2]ナフタレノ、[2,3]ナフタレノなどである。

0043

(5.3色素化合物自体)

0044

本発明は、後の検出のために核酸を染色または標識するのに有用な[8,9]ベンゾフェノキサジン色素の新規なクラスを提供する。要旨の節に記載されるように、この新規な色素は、一般的に、置換または非置換の親[8,9]ベンゾフェノキサジン環および脂肪族カチオン性鎖を含む。本発明の好ましい実施形態において、[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、以下の構造式(I):
に従い、任意の付随対イオンを含む化合物であり、ここで:

0045

R1は、単独の場合、水素、ハロゲン、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR2と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;

0046

R2は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR1と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;

0047

R3は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキルおよび(C5−C14)アリールからなる群から選択されるか、あるいはR3'と一緒になる場合、(C2−C8)アルキルジイルであり;

0048

R3'は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキルおよび(C5−C14)アリールからなる群から選択されるか、あるいはR3と一緒になる場合、(C2−C8)アルキルジイルであり;

0049

R4は、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択され;

0050

R6は、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択され;

0051

R7は、以前に記載されたような脂肪族カチオン性鎖であり;

0052

R11は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR12と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;

0053

R12は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR11またはR13と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;

0054

R13は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR12またはR14と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;

0055

R14は、単独の場合、水素、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択されるか、あるいはR13と一緒になる場合、(C5−C14)アリーレノまたは同じかもしくは異なるW基の1個以上で置換された(C5−C14)アリーレノであり;

0056

各々のWは、独立して、(C1−C6)アルキル、−OR’、−SR’、−NR’R’、−CN、−NO2および−C(O)R’からなる群から選択され;そして、

0057

各R’は、独立して、水素または(C1−C6)アルキルである。

0058

構造式(I)に従う好ましい化合物の1つの群は、R7が−(CH2)n−[NRR−(CH2)n]m−NRRRである化合物であり、ここで、各nは、独立して、2〜6の整数であり、mは、0〜6の整数であり、そして各Rは、独立して、水素および(C1〜C6)アルキルからなる群から選択される。

0059

構造式(I)に従う好ましい化合物の別の群は、生きた原核生物細胞または真核生物細胞の膜を通って受動的に浸透し得るか、または生きた原核生物細胞または真核生物細胞の膜を横切って拡散し得る化合物である。細胞が、哺乳動物細胞のような真核生物である場合、好ましい色素は、さらにより好ましくは、核膜を通って受動的に浸透し得るか、または核膜を横切って拡散し得、そして細胞の核の核酸を染色し得る。

0060

本発明の色素の膜浸透性は、1以上の細胞を、色素を含む染色溶液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)と接触させ(染色溶液は、以下により詳細に議論される)、そして、検出可能なシグナルについてアッセイすることによって容易に試験され得る。一般的に、色素が膜浸透性である場合、細胞は、試験される色素の励起波長および発光波長に適合した照明器および検出器を使用して検出される際に、暗スポットとして現れる。10pM〜100nM(またはそれ未満でさえ)の範囲内の濃度の染色溶液(pH6〜pH8−9の範囲のpH)中で使用される場合、5〜10分内に検出可能なシグナル(バックグラウンドの2〜3倍以上)を生成する色素は、膜浸透性であると考えられる。約1〜5分内に極端に低い濃度(すなわち、10nM以下、またはそれ未満でさえ)において非常に鮮やかなシグナル(すなわち、バックグラウンドの100倍以上)を生成する色素が、特に好ましく、これらの色素は増大した感度を提供する。

0061

構造式(I)に従う好ましい化合物のさらに別の群は、以下の特徴の群から選択される1つ以上の特徴を有する化合物である:

0062

R1、R2、R4およびR6は、各々水素であり;

0063

R3およびR3'は、各々独立して(C5−C10)アリールまたは(C1−C3)アルキルであり;

0064

R1がR2と一緒になって形成されるアリーレノ基は、ベンゾ、[1,2]ナフタレノまたは[2,3]ナフタレノであり;

0065

R11がR12と一緒になって形成されるアリーレノ基は、ベンゾであり;

0066

R12がR13と一緒になって形成されるアリーレノ基は、ベンゾであり;

0067

R13がR14と一緒になって形成されるアリーレノ基は、ベンゾであり;

0068

R11、R12、R13およびR14は、各々水素であり;および/または

0069

R7は、−(CH2)n−NRRR、−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRおよび−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRからなる群から選択され、ここで、各nが、独立して2〜3の整数であり、各Rが、独立して、水素および(C1−C3)アルキルからなる群から選択される。

0070

構造式(I)に従う好ましい化合物の別の群は、以下を有する化合物である:

0071

R1は、単独の場合、水素であるか、あるいは、R2と一緒になる場合、ベンゾ、ナフタレノ、[1,2]ナフタレノまたは[2,3]ナフタレノであり;

0072

R2は、単独の場合、水素であるか、あるいは、R1と一緒になる場合、ベンゾ、ナフタレノ、[1,2]ナフタレノまたは[2,3]ナフタレノであり;

0073

R3は、(C1−C3)アルキルであり;

0074

R3'は、(C1−C3)アルキルであり;

0075

R4は、水素であり;

0076

R6は、水素であり;

0077

R7は、前に記載されるように、脂肪族カチオン性鎖であり、好ましくは、−(CH2)n−NRRR、−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRまたは−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRであり、ここで、各nが、独立して2〜3の整数であり、各Rが、独立して、水素および(C
1−C3)アルキルからなる群から選択され;

0078

R11は、単独の場合、水素であるか、あるいはR12と一緒になる場合、ベンゾであり;

0079

R12は、単独の場合、水素であるか、あるいはR11またはR13と一緒になる場合、ベンゾであり;

0080

R13は、単独の場合、水素であるか、あるいはR12またはR14と一緒になる場合、ベンゾであり;そして

0081

R14は、単独の場合、水素であるか、あるいはR13と一緒になる場合、ベンゾである。

0082

構造式(I)に従う好ましい化合物のなお別の群は、以下の構造式(II)および(III):
に従い、任意の付随の対イオンを含む化合物であり、ここで、R7は、前に構造式(I)について記載された通りである。構造式(II)に従う化合物は、代表的に、630〜650nmの範囲に励起(吸収)極大を有し、660〜680nmの範囲に発光極大を有し、一方、構造式(III)に従う化合物は、代表的に、650〜660nmの範囲に励起(吸収)極大を有し、680〜720nmの範囲に発光極大を有し、これらは、緩衝液、pH、温度、および他のサンプル条件に依存する(例えば、以下の33頁、節6.2、表1を参照のこと)。

0083

構造式(II)および(III)に従う好ましい化合物は、R7が、−(CH2
)n−NRRR、−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRおよび−(CH2
)n−NRR−(CH2)n−NRR−(CH2)n−NRRRからなる群から選択される化合物であり、ここで、各nが、独立して2〜3の整数であり、各Rが、独立して、水素、(C1−C3)アルキルおよびメチルからなる群から選択される。

0084

良好な膜浸透性を示す構造式(II)に従う特に好ましい化合物は、以下:
に示される。

0085

良好な膜浸透性を示す構造式(III)に従う特に好ましい化合物は、以下:
に示される。

0086

当業者は、式(I)、(II)および(III)によって包含される化合物の多く、および特に上に記載した化合物種が、互変異性立体配座異性(conformational isomerism)、幾何異性および/または立体異性(stereo isomerism)の現象を示し得ることを理解する。本明細書および特許請求の範囲内の式の図は、可能な互変異性形態、立体配座異性形態鏡像異性形態または幾何異性形態のうちの1つのみを表し得るため、本発明が本明細書中に記載される有用性の1つ以上を有する化合物の、任意の互変異性形態、立体配座異性形態、鏡像異性形態および/または幾何異性形態を包含することは理解されるべきである。

0087

具体的な例として、C3アミノ置換基およびC7イミニウム置換基に対する参照番号が、本明細書を通して付けられる。この学術用語は、化合物の幾つかの可能な互変異性形態(または共鳴構造)のうちの一つのみを表す例示された構造式に対応するため、これらの参照番号は簡便さのみのためであり、任意のこのような参照番号が本明細書中に記載される化合物の範囲を限定することを意図しないことが理解される。

0088

さらに、当業者はまた、本発明の化合物が、特にそれらの環境のpHに依存して、多くの異なるプロトン化状態で存在し得ることを理解する。本明細書中に提供される構造式は、幾つかの可能なプロトン化状態のうちのたった1つで化合物を表すが、これらの構造が例示にすぎず、そして本発明は任意の特定のプロトン化状態に限定されず、化合物の任意および全てのプロトン化形態が、本発明の範囲内に入るように意図されることが理解される。

0089

本発明の化合物はそれらの物理的状態に依存して、複数の正電荷を有し得るため、本発明の化合物は、それらに付随した対イオンを有し得る。任意の付随の対イオンの同一性は、代表的に、化合物が得られる合成および/または単離方法によって決定される。代表的な対イオンとして、ハライドアセテートトリフルオロアセテートなど、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意の付随の対イオンの同一性が本発明の重要な特徴ではなく、本発明が任意の型の対イオンを付随した色素を包含することが理解される。さらに、化合物は種々の異なる形態で存在し得るため、本発明は、対イオンを付随する色素の形態(例えば、乾燥塩)のみならず、対イオンを付随しない形態(例えば、水溶液または有機溶液)を包含することが意図される。

0090

(5.4化合物を合成する方法)

0091

本発明の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、以下のスキーム(I)および(II)に例示されるように、都合よく、ヨード前駆体から合成され得る。スキーム(I)は、ヨード前駆体の合成を例示する。スキーム(II)は、本発明の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素を得るためのヨード前駆体の使用を例示する。スキーム(I)および(II)において、種々のRnは、構造式(I)について前に規定される通りである。

0092

スキーム(I)を参照して、3−ヒドロキシ−2−ニトロソアニリン誘導体30(10mM)、1−アミノナフタレン誘導体40(10mM)およびHCl(0.24M)をメタノール中で、約2−50時間還流し、[8,9]ベンゾフェノキサジン誘導体42を生成し、これを溶出液としてメタノール:塩化メチレンを使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離する。

0093

次いで、[8,9]ベンゾフェノキサジン誘導体42(水中で約60mM、約60℃)で、等量の水性NaOH(0.5M)で処理する。この反応物を塩化メチレン(100ml)で3回抽出し、合わせた抽出物ブライン、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、そして残留する溶媒エバポレーションによって除去し、化合物42の塩基形態を得る。この塩基性化合物42(0.2mmol)を水性トルエン(5ml)に溶解し、1,3−ジヨードプロパン10(2.0mmol)を加え、この混合物をアルゴン下で約16時間還流する。溶出液としてメタノール:塩化メチレンを使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、ヨード前駆体44を単離する。

0094

ヨード前駆体44を本発明の色素に転化するための方法が、スキーム(II)に例示される。

0095

スキーム(II)を参照して、ヨード前駆体44のヨウ素原子は、脂肪族アミンで置換される。脂肪族アミンの同一性は、所望のカチオン鎖の性質に依存する。例えば、ヨウ素原子のトリメチルアミン21との置換は、色素46を生成し、ここで、カチオン性鎖の末端アミノ基は、4級アンモニウムである。ヨウ素原子のN,N,N’,N’−テトラメチル−1,3−ジアミノプロパン10との置換は、4級内部アンモニウム基および/または3級末端アミノ基を有する色素48および50の混合物を生じる。ヨウ素原子のN,N,N’,N’,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン23との置換は、2個の内部アミノ基(1個の4級アミノ基および1個の3級アミノ基)および/または3級末端アミノ基を有する色素52および54の混合物を生じる。例示した反応を実行するための条件および色素生成物を単離するための方法は、実施例の節に提供される。

0096

スキーム(I)および(II)は、特定の例示的なカチオン性鎖を有する色素の合成を示す。当業者は、他のカチオン性鎖を有する色素が、適切なジヨードアルキルおよび脂肪族アミン出発物質を使用して容易に得られ得ることを理解する。例えば、C7イミニウム窒素およびヨウ素原子を隔てる異なる数のメチレン基を有する種々の異なるヨード前駆体は、化合物42を構造I−(CH2)n−Iを有するジヨードアルキレンと反応させることによって得られ得、ここで、nは、介在メチレン基の所望の数である。互いに、および末端アミノ基から種々の内部アミノ基の窒素原子を隔てるメチレン基の数は、同様な様式で、ヨード前駆体のヨウ素原子を置換するための適切な脂肪族アミンを選択することによって調整され得る。カチオン性鎖の飽和レベルは、同様に、ジヨードアルキルおよび脂肪族アミン反応物の適切な選択によって調整され得る。

0097

スキーム(I)および(II)は、本発明の色素の合成に特に好都合であり、なぜならアミノ基を除いて、種々のR置換基は、保護を必要としないためである。アミノ基は、周知の方法(例えば、Greene & Wuts、1991、Protective Groups in Organic Synthesis、John Wiley & Sons、New York、NYを参照のこと)に従って、Fmocまたは他の通常の塩基不安定アミノ保護基で好都合に保護され得る。

0098

本発明の特定の好ましい化合物を合成するための方法は、実施例の節に提供される。

0099

(5.5化合物を使用する方法)

0100

本発明の新規な[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、広範な範囲の適用における後の検出のために、核酸を標識または染色するために使用され得る。例えば、色素は、溶液、電気泳動ゲル、ブロッティング適用などにおいて核酸を染色するために使用され得る。使用において、本発明の色素は、核酸を含むサンプルと合わせられ、検出可能な蛍光シグナルを得るのに十分な時間をかけてインキュベートされ、蛍光シグナルを観察する。

0101

色素は、サンプルに直接加えられ得るが、代表的に、サンプルと生物学的に適合性である水性染色溶液の成分として存在する。染色溶液は、水、緩衝溶液(例えば、リン酸緩衝化生食塩水;「PBS」)または細胞培養培地水混和性有機溶媒または水性溶媒と水混和性有機溶媒とを含む混合物のような水性溶媒中に、直接、色素を溶解することによって作製される。有用な水混和性有機溶媒として、ジメチルスルホキシドDMSO)、ジメチルホルムアミドDMF)、N−メチルピロリドン(NMP)、低級アルコール(例えば、エタノールプロパノールイソプロパノールなど)およびアセトニトリルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の色素は水溶性であるため、色素は、通常、まず染色溶液における使用に所望される濃度より約1,000〜10,000倍高い濃度の水溶液中に溶解され、次いで、生物学的細胞培養液またはPBS(pH7.4)のような水性溶媒で1回以上希釈され、有効量の色素を含む染色溶液を生じる。色素の有効量は、核酸の存在下において検出可能な蛍光シグナルを与えるのに十分な量である。

0102

操作の任意の特定の理論によって束縛されることを意図しないが、本発明の色素の、細胞膜を浸透する能力および/または核酸を結合する能力が、カチオン性鎖の正電荷に一部起因すると考えられる。カチオン性鎖の正味電荷が、種々の要因(例えば、染色溶液のpHを含む)によって影響(influenced/affected)され得るが、特定のpHの使用は、成功において重要ではない。本発明の色素は、細胞を浸透し得、および/または核酸を結合し得、広範囲pH値にわたって検出可能な蛍光シグナルを生じる。従って、核酸は、特定の適用に好都合であるpHを使用して、本発明の色素で染色され得る。ほとんどの核酸染色アッセイが、pH6〜pH8−9の範囲のpHで実施され得る。従って、染色電気泳動ゲルのようなインビトロ適用のための染色溶液は、代表的に、この同じ範囲のpHを有する。生細胞アッセイに関するインビボ適用のための染色溶液は、好ましくは、細胞培養培地のpHと同じpH(代表的に、約pH7.4)で維持される。

0103

代表的に、細胞サンプルのための染色溶液は、約0.1nMより高く約100μM未満、より代表的には、約1nMより高い色素濃度を有する。好ましくは、染色溶液は、約1nM〜20nM色素を含む。電気泳動ゲルのための染色溶液は、代表的に、約1μMより高く約10μM未満、より代表的には、約4〜5μMの色素濃度を有する。上記の染色溶液は一般的な基準を提供するが、染色溶液の特定の色素濃度が、特に、サンプルの物理的性質、存在する核酸の濃度および実施される分析の性質によって決定されることは当該分野で理解される。それ故に、特定のアッセイを実施するのに必要な色素濃度は、アッセイに依存し、当業者によって容易に決定される。

0104

染色溶液は、核酸を含むサンプルと合わせられる。サンプル中の核酸は、RNAまたはDNA、あるいはそれらの混合物のいずれかであり得る。あるいは、サンプルは、RNAおよび/またはDNAの染色特性と同様の染色特性を有するRNAおよび/またはDNAのアナログを含み得る。核酸がDNA(または、それらのアナログ)である場合、それは、任意の程度のストランド(例えば、一本鎖二本鎖、三本鎖または四本鎖)で存在し得る。核酸は、天然(すなわち起源において、生物学的である)または合成的(すなわち、人工的に調製される)のいずれかであり得、天然の状態で(例えば、mRNAまたは凝縮染色体の形態で)または非天然状態で(例えば、変性核酸の形態で)、サンプル中に存在し得る。

0105

核酸は、実質的に、10〜40ほどの少ないヌクレオチドまたは塩基対を含むオリゴヌクレオチドから、数百〜千の範囲のヌクレオチドまたは塩基対を含むポリヌクレオチドまで、cDNA、遺伝子および染色体全体でさえまでの任意の長さであり得る。核酸は、サンプル全体を通して均一に分散され得(例えば、核酸溶液に溶解される)、あるいはサンプルの一部のみに存在し得(例えば、電気泳動ゲルバンド内、または細胞もしくは細胞の一部内に隔離される)、それ故に、個々のサンプル間を識別するか、または単一サンプル内の一部もしくは領域を分化するために使用され得る。

0106

本発明の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素の有意な利点は、それらの細胞に対する浸透性であるため、核酸は、生物学的構造体内に封入され得、例えば、ウイルス粒子細胞小器官または細胞内に封入され得る。生物学的構造体に封入された核酸は、広範な種々の環境(培養された細胞、生物または組織濾過されていないかまたは分離された生物学的流体(例えば、尿、脳脊髄流体血液リンパ液など)、組織ホモジネート粘膜唾液糞便生理学分泌物土壌、水および空気を含むが、これらに限定されない)から得られ得る。この核酸は、サンプルに対して内因性であり得るか、またはそれは異物として(例えば、感染またはトランスフェクションによって)導入され得る。細胞全体が染色され得(生きていても死んでいてもよい)、そしてまず固定され、慣用的な組織学的手順または細胞化学的手順に従って処置され得る。

0107

このサンプルは、色素と核酸との間の接触を容易にする任意の手段を介して、染色溶液と合わせられ得る。この接触は、サンプルが溶液である場合、サンプル混合の際に、あるいは、電気泳動ゲルまたは他のマトリクス内に包埋された核酸を染色する場合、核酸を含む構造体の染色溶液とのインキュベーションの際に、起こり得る。本発明の色素は、染色溶液の細胞サンプルへの添加の際に、迅速かつ完全に細胞膜に浸透することが示されるが、好ましくは、細胞および/または膜完全性の最小の崩壊を伴い、膜を横切る色素を輸送するのに適切である任意の他の技術もまた、色素と組み合わせて使用され得る。例示的な技術として、化学薬剤界面活性剤酵素アデノシン三リン酸)、レセプタータンパク質または輸送タンパク質細孔形成タンパク質微量注入法エレクトロポレーション低浸透圧性ショック切屑充填(scrape loading)、粒子ボンバードメントなどの使用が挙げられる。

0108

このサンプルは、色素の存在下で、検出可能な蛍光シグナルを生じるのに十分な時間、インキュベートされる。操作の任意の理論によって束縛されることを意図しないが、本発明の色素は、核酸の存在下において量子収率の顕著な増加を示すため、この検出可能な蛍光シグナルは、核酸−色素複合体の形成の際に生じると考えられる。核酸の溶液中の検出可能な蛍光は、本質的に瞬間的である。細胞膜内の検出可能な蛍光は、色素の細胞内への浸透を必要とする。一般に、視覚的に検出可能な蛍光は、広範な種々の細胞において、本発明の実施形態を用いて、細胞を約1nM〜10nMの色素を含む染色溶液と合わせて約5分以内に得られ得る。

0109

染色後、この染色溶液は除去され得、適用に依存して、検出の前に核酸をリンスする。例えば、電気泳動適用において、染色されたゲルは、検出の前に、(例えば、水または緩衝液で)リンスされ得る。しかし、核酸との結合または複合体化の際のそれらの量子収率の大きな増加のために、非結合色素は、検出の前に除去される必要はない。色素のこの特性によって、それらは、静的血球計算法および/またはフローサイトメトリー(ここで、染色溶液は、検出の前に除去されない)によって生細胞内の核酸を分析するのに貴重となる。浸透および蛍光はほとんどの実施形態に対して迅速であるが、検出可能な蛍光シグナルの十分な形成に必要な時間は、特に、個々のサンプルおよびサンプル媒体の物理的性質および化学的性質に依存することが当業者に容易に理解される。

0110

本発明の色素のほぼ一般的な膜浸透性およびそれらの迅速な取り込み速度は、広範な種々の生サンプル中の核酸の試験を可能にする。実質的に任意の細胞型(細菌のような原核生物および哺乳動物細胞のような真核生物を含む)は、本発明の色素を使用してプローブ化され得る。幾つかの細胞株(例えば、HCT−116)において、色素は、これらの細胞の核を特異的に染色するため、特に有用である。

0111

多くの核酸染色と同様に、本発明の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素は、核酸の存在下で増大した蛍光を示す。核酸の非存在下における[8,9]ベンゾフェノキサジン色素のスペクトル特性(量子収率を含む)が、表1に示される。代表的には、量子収率は、核酸の存在下で顕著に増加する。利用可能な赤色発光生細胞色素と比較して、本発明の色素は、核酸へ結合の際に、向上した量子収率を有する。

0112

さらに、本発明の色素は、現在利用可能な赤色発光生細胞株より顕著に迅速な浸透速度を示し、一般的に、SYTO61(登録商標)(Molecular Probes,Eugene,OR)よりも顕著に速くとりこまれる。図2は、Bona12およびBona25色素が、およそ5分で有意な検出可能な蛍光を示し、一方SYTO61はおよそ1〜2時間必要とすることを示す。量子収率および浸透速度のこれらの改善は、核酸検出のほとんど全ての領域において、直接的に、改善した速度および感度に変えられる。

0113

本発明の色素の全ての実施形態が、以前の公知の核酸染色に対する量子収率および/または浸透速度の改善を示すわけではないが、本発明の色素の他の特性は、使用の他の局面において有意な改善を示し、特定の機器(例えば、レーザー励起周波数)に適合するようにそれらの励起バンドおよび/または発光バンドを選択的に調整する能力、および/またはそれらの増加した光安定性を含む。非常に重要なことに、本発明の色素の全てが、可視スペクトルの赤色領域(630nm以上)で励起および発光し、非常に光安定である。融合環系の5個の環を有する色素は、700nmより長い波長で発光する。現在、発光極大が700nmより長い、市販の光安定な生細胞核酸染色は、存在しない。

0114

核酸は、核酸−色素複合体の励起および発光スペクトル特性に基づいて検出される。一般に、染色されたサンプルは、核酸−色素複合体の励起極大またはその付近波長で光を発生し得る光源(例えば、レーザー)によって励起される。細胞性核酸核酸塩基および/または他の細胞性成分(例えば、タンパク質)は、高いモル吸光率で、紫外光(λmax=260〜280nm)を吸収する。結果として、本発明の色素の可視赤色励起プロフィールは、これらの細胞性成分のほとんどが赤色光を吸収しない(すなわち、透過性である)という重要な利点を提供する。

0115

核酸−色素複合体の蛍光は、適切な波長において得られる光発光を検出することによって、定性的または定量的に検出される。本発明の色素は、可視スペクトルの赤色領域で蛍光発光するため、蛍光シグナルは、代表的に、約650nmより長い波長で検出される。より長い発光極大を有する色素ほど、より長い波長で検出され得る。この発光は、可視検査写真フィルム蛍光定量量子計算器、プレートリーダーエピ蛍光顕微鏡ならびに静的血球計算器およびフローサイトメトリーを含む手段によって検出され得、これらは例示のためであり、限定するものではない。発光された光は、直接的に検出され得るか、またはそれは、まず、例えば、光増倍管を通過させ得ることによって増幅され得る。定量的な検出のために、発光光子は、光子カウンターを用いてカウントされ得る。

0116

本発明の色素の感度、浸透性、光安定性ならびに励起特性および発光特性は、核酸の染色に関する全てのアッセイにおける一般的な有用性、および現在利用可能な生細胞および他の核酸染色における実質的な改善を提供する。任意の溶液中の核酸、任意の基材上の核酸、および/または任意のサンプル由来の核酸、ならびに特に生細胞サンプル由来の核酸を赤色レーザーを用いて迅速に検出および/または定量する能力は、核酸の蛍光染色を利用する分野において空前の機会を提供する。

0117

(6.実施例)

0118

本発明が記載され、以下の実施例が例示の目的で提供されるが、限定されない。

0119

(6.1化合物合成)

0120

(6.1.1 Bona 11およびBona 12の合成)

0121

[8,9]ベンゾフェノキサジン色素のBona 11およびBona 12を以下のスキーム(III)に例示されるように合成した。

0122

スキーム(III)を参照して、1.18gのNile Blue Chloride(4;Aldrich)を、100mlの水中、60℃で、30分間懸濁した。100mlの0.5M水性NaOHを加えた。塩基性Nile Blueを塩化メチレン(3回、1回につき100ml)で抽出し、合わせた抽出物をブライン、次いで、無水Na2SO4で乾燥した。エバポレーションによる溶媒除去後残留物(塩基性Nile Blue)を真空下で一晩乾燥した。

0123

50mlの丸底フラスコ中で、64mgの塩基性Nile blue(0.2mmol)を5mlの無水トルエンに溶解した。230mlのジヨードプロパン(6;2mmol;Aldrich)を加えた。この混合物をアルゴン下で16時間還流した。88.1mgの化合物8を、溶出液として塩化メチレン中5%(v/v)メタノールを使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって得た(収率72%)。化合物8MS(M+H):計算値:486.1;実測値:486.3。

0124

50mlの丸底フラスコ中で、10mgの化合物8(16mmol)を10mlの無水エタノールに溶解し、17.2mlのN,N,N’,N’−テトラメチル−1,3−ジアミノプロパン(10;103mmol;Aldrich)を加え、この混合物をアルゴン下で6時間還流し、Bona 11およびBona12の混合物を得た。この2種類の色素を、溶出液として、緩衝液A(水中0.1%TFA)中の直線勾配(30分にわたって0%−70%)の緩衝液B(アセトニトリル中0.085%TFA)を使用する逆相HPLCを介して単離した。この勾配において、色素Bona 11を14.8分で溶出し;色素Bona 12を16.1分で溶出した。

0125

(6.1.2色素Bona 2の合成)

0126

[8,9]ベンゾフェノキサジン色素Bona 2を、以下のスキーム(IV)に例示されるように合成した。

0127

スキーム(IV)を参照して、250mlの丸底フラスコ中で、1.16gの2−ニトロソ−5−ジエチルアミノフェノール塩酸塩(14;5mmol;TCIAmerica)および0.97gの1−アミノアントラセン(16;4.5mmol;約90%純度;Aldrich)を、3mlの濃HCl(37%)を含む100mlのエタノールに溶解し、この混合物を2時間還流した。1.62gの化合物18(収率89%)を、溶出液としてメタノール/塩化メチレンを使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーを介して得た。

0128

101mgの化合物18(0.25mmol)を、10mlのメタノールに溶解し、90mlの塩化メチレンを加え、この溶液を、分離漏斗中で、50mlの1M NaOH(2回)、次いで、50mlのブライン(1回)で洗浄した。この有機層を無水Na2SO4で乾燥した。溶媒をエバポレーション後、この残渣をオイルポンプを用いて、6時間乾燥した。次いで、乾燥した残渣を20mlのトルエンに溶解し、345mLの1,3−ジヨードプロパン(6,3mmol)を加え、この混合物をアルゴン下で16時間還流した。95mgの化合物20(収率57%)を、溶出液として塩化メチレン中5%(v/v)メタノールを使用するフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって得た。

0129

25mlの丸底フラスコ中に、27mgの化合物20(0.041mmol)を5mlの無水エタノールに溶解し、34mlのN,N,N’,N’−テトラメチル−1,3−ジアミノプロパン(10;0.204mmol;Aldrich)を加え、この混合物をアルゴン下で4時間還流した。このエタノールをエバポレーション後、この残渣を0.5mlトリフルオロ酢酸(TFA)を有する15mlのH2Oに溶解し、酢酸エチル(1回につき50ml)で5回洗浄し、出発物質を除去した。次いで、水溶液を濃縮し、ゲル濾過カラム(Sephadex

0130

G−10)に通した。5%酢酸水溶液を溶出液として適用した。溶媒をエバポレーション後、9.1mgの純粋なBona 2を得た(収率31%)。

0131

(6.1.3色素Bona 22、Bona 24およびBona 25の合成)

0132

[8,9]ベンゾフェノキサジン色素Bona 22、Bona 24およびBona 25を、以下のスキーム(V)に例示されるように、合成した:

0133

(Bona 22)

0134

25mlの丸底フラスコ中で、3.0mgの化合物20(4.5mmol;前出の節6.1.2に記載されるように調製した)を、2mlの無水エタノールに溶解し、2.86mlのトリメチルアミン(21;45.2mmol;Aldrich)を加え、この混合物をアルゴン下で4時間還流した。エタノールをエバポレートした後、残渣を0.1%の水性TFAに溶解し、前出の節6.1.1に記載されるように、HPLCによって精製した。1.9mgの純粋なBona 22を得た(収率61%;保持時間17.0分)。

0135

(Bona 24およびBona 25)

0136

25mlの丸底フラスコ中で、1.5mgの化合物20(2.3mmol;前出の節6.1.2に記載されるように調製した)を、3mlの無水エタノールに溶解し、20.8mlのN,N,N’,N’,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン(23;0.1mmol;Aldrich)を加え、この混合物をアルゴン下で8時間還流し、色素Bona 24およびBona 25の混合物を得、これらを前出の節6.1.1に記載されるようにHPLCによって精製した。色素Bona 24は、17.8分で溶出し;色素Bona 25は、19.2分で溶出した。色素Bona 25の形成は、おそらく還流条件の間の化合物24の断片化に起因するものであった。

0137

スキーム(V)を参照して、代替の方法において、色素Bona 25を以下のように得た:10mlの丸底フラスコ中で、1mgの化合物20(1.5mmol)をメタノール中2Mジメチルアミン3mlに溶解した(26;6mmol;Aldrich)。この溶液を、アルゴン下で2時間還流し、純粋なBona

0138

25を上記のようにHPLCによって得た。

0139

(6.1.4色素Bona 27および28の合成)

0140

[8,9]ベンゾフェノキサジン色素Bona 27および28(上記に示される)(これらは、1級末端アミノ基を有する)は、アルキルアミンとして3,3’−ジアミノ−N−メチルジプロピルアミン(CH3N(CH2CH2CH2NH
2)2;Aldrich)を使用してスキーム(V)に例示されるように、化合物20から合成した。簡単にいうと、25mlの丸底フラスコ中で、1.5mgの化合物20(2.3mmol;前出の節6.1.2に記載されるように調製した)を、3mlの無水エタノールに溶解し、16.1mlの3,3’−ジアミノ−N−メチルジプロピルアミン(0.1mmol)を加え、この混合物をアルゴン下で8時間還流し、色素Bona 27およびBona 28の混合物を得た。純粋なBona 27およびBona 28を、前出の節6.1.1に記載されるように、HPLCによって得た。色素Bona27は、17.0分で溶出し;色素Bona28は、18.1分で溶出した。

0141

(6.2 本発明の色素のスペクトル特性)

0142

Tris緩衝液(pH 7.4)および/またはメタノール中の本発明の特定の例示的色素の吸収(励起)極大(λabs,max)、モル吸光係数(ε)、発光極大(λem,max)および量子収率(Q)を、以下の表1に提供する:

0143

(6.3 本発明の色素は、細胞膜を横切って拡散する)

0144

この実施例は、本発明の色素が、生細胞の膜を介して受動的に浸透するか、または生細胞の膜を横切って拡散する能力を実証する。

0145

(6.3.1実験プロトコル

0146

HCT−116結腸直腸細胞を、96ウェルマイクロタイタープレート(Costar 3603)中で、200μlの容量の培地(10%ウシ胎児血清を有するRPMI1640培地)中、約10,000細胞/ウェルの密度プレーとした。ペニシリンストレプトマイシンを、細胞培養物中の細菌感染阻害するために添加した。細胞をプレートマトリクスに結合した後(一晩、インキュベーション)、この細胞を50μlの染色溶液(各培地中1−10nMの色素、12.5mM CaCl2、140mM NaClおよび10mM Hepesを含むPBSまたはカルシウム緩衝液、pH 7.4)で染色した。FMAT 8100HTS Instrument(PE Biosystems、FosterCity,CA)上で染色直後、この細胞の画像を、収集した。

0147

(6.3.2 結果)

0148

膜浸透性実験の結果は、表2に提供される。

0149

表2に示されるように、色素Bona 11、Bona 12、Bona 24、およびBona 25は、優れた膜浸透性を示した。色素Bona 22は、良好な膜浸透性を示した。色素Bona 2、Bona 27およびBona

0150

28は、細胞膜に対して不浸透性であった。

0151

UC11(神経膠星状細胞腫)、COS(サル腎臓)、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)およびHUVEC(ヒト臍静脈内皮)細胞を用いて実施した同様の実験は、同様の結果を提供した。

0152

(6.4 本発明の色素は、細胞全体中の核酸を染色する)

0153

HCT−116細胞を、前出の節6.3.1に以前に記載されるように、色素Bona 12(20nM)、Bona 24(20nM)、Bona 25(20nM)および市販のSYTO61(登録商標)(4nM;Molecular Probes、Eugene,OR)で染色した。コントロールとして、細胞をまた、シアニン色素Cy5(Cy5−NHSエステル;Amersham)で標識されている0.57μg/μl抗体HLA−A,B,C(Pharmingen)で染色した。

0154

生細胞染色実験の結果は、図1A−Dに提供される。図1Aは、標識した抗体で染色した細胞を示し、これは、膜レセプターに結合し、従って、細胞全体を明るくする。図1Aにおいて、細胞全体は、明らかに目に見える。比較として、それぞれBona 12、Bona24およびBona25で染色した細胞を示す図1B、1Cおよび1Dにおいて、染色された領域は、はるかにより小さく、より局在化しており、このことは、この色素が核膜を浸透し、細胞の核を染色することを示す。SYTO 61(登録商標)で染色した細胞において(図1E)、細胞のより大きな領域は、目に見え、標識化抗体で染色した細胞によく似ていた。
従って、この実験は、本発明の色素が、市販の赤色発光色素SYTO 61(登録商標)より、鮮やかでかつ核酸に対してより特異的であることを証明する。

0155

(6.5 本発明の色素は、利用可能な赤色発光生細胞核酸染色より、鮮やかであり、優れた染色速度を有する)

0156

HCT−116細胞を、前出の節6.3.1に記載されるように、0.156nMの色素Bona 12、Bona 25およびSYTO 61(登録商標)で染色し、平均蛍光を時間の関数として記録した。時間依存蛍光のグラフを、図2に示す。ほとんど全ての時点において、本発明の色素は、SYTO 61(登録商標)より鮮やかなシグナルを生成し、このことは、本発明の色素が、SYTO 61(登録商標)より速く細胞膜を浸透することを示す。非常に驚くべきことに、200分において、Bona 12からの蛍光シグナルは、SYTO 61(登録商標)の蛍光シグナルより4桁以上大きく;Bona 25からのシグナルは、SYTO 61(登録商標)の蛍光シグナルより3桁以上大きかった。

0157

より速い浸透速度およびより鮮やかなシグナルはまた、より高い色素濃度で観察される。40nMの色素を使用する同様の実験(結果は示されない)において、SYTO 61(登録商標)に対して1〜2時間と比較して、HCT−116細胞をBona 25で検出可能なレベルにまで標識するのにたったの5分しかかからなかった。

0158

本発明の新規の[8,9]ベンゾフェノキサジン色素が、蛍光生細胞核酸染色の新規かつ重要なクラスを提供することは、上記の種々の実験から明らかである。この新規な色素は、市販のSYTO 61(登録商標)より、顕著に速い速度および鮮やかな蛍光を提供し、これによって、少ない色素を使用する生細胞アッセイにおけるのDNAの迅速な検出が可能となる。この色素はまた、それらの赤色励起および発光スペクトル特性に起因して、有意な利点を提供する。スペクトルの可視赤色領域における励起は、有利である。なぜなら、それは、細胞中に通常見られる発色団(例えば、フラビンポルフィリンなど)からの自己蛍光、水のラマン散乱およびアッセイ装置(例えば、プラスチック)によって寄与される蛍光を最小化するためである。従って、緑色で自己蛍光発光する多くの化合物および/または物質は、赤色において透明であり、それによって、バックグラウンドシグナルを減少させ、また、細胞内の化合物のアッセイをクエンチする可能性を最小化する。スペクトルの可視赤色領域内の発光は、有利である。なぜなら、それは、より低いコストの検出装置の使用を可能にするためである。従って、本発明の新規の色素は、インビトロおよびインビボの両方の核酸染色適用において有意な利点を提供する。

0159

本明細書中に言及される全ての公報、特許および特許出願は、各個々の公報、特許または特許出願が、特にかつ個々に参考として援用されることが示されるように、同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。

0160

本発明は、ここで、完全に記載されているが、多くの変更および改変が特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることは、当業者にとって明らかである。

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