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課題

本発明は、ブタRAG-1蛋白質をコードするDNAを提供することを課題とする。さらに、本発明は、ブタRAG-1遺伝子の機能が抑制されたブタを作製することを課題とする。

解決手段

ブタゲノムDNAライブラリースクリーニングを行い、ブタRAG-1遺伝子を含むBACクローンを得た。このBACクローンよりRAG-1遺伝子を含む領域をサブクローニングし、3つのクローンを得た。これらのクローンのシークエンスによる塩基配列決定制限酵素消化によるマッピングを行い、遺伝子地図を作製した。この情報をもとにRAG-1遺伝子をノックアウトするターゲティングベクターを作製した。該ベクターを利用して内因性のブタRAG-1遺伝子の機能を抑制することにより、獲得免疫の無いブタを作製することが可能である。

概要

背景

脊椎動物において、外来病原体戦う主戦力は、獲得免疫系である。獲得免疫系は、生後に外来の異物抗原)の刺激の結果、生体の免疫系が後天的に得るその抗原特異的な免疫状態であり、T細胞の抗原受容体又はB細胞生産する免疫グロブリンが抗原を識別することが引き金となって開始される。T細胞抗原受容体と免疫グロブリンは、胎性細胞のゲノム遺伝子がT細胞乃至B細胞に分化する過程遺伝子再構成して、その結果機能遺伝子になり、獲得免疫能を発揮する。この獲得免疫系発生での遺伝子再構成の発見により、利根川博士が1987年ノーベル生理学医学賞を受賞した。

遺伝子再構成は、ゲノム遺伝子上の再構成シグナル配列を、RAG-1蛋白質(再構成活性化遺伝子(Recombination Activating Gene)の1型産物)とRAG-2蛋白質との複合体が切断することで開始される。RAG-1遺伝子が無いと、T細胞抗原受容体と免疫グロブリンが出来ないことが判明しており、獲得免疫の無い重症複合免疫不全症になることが知られている。実際、ノックアウト法により作出したRAG-1遺伝子欠損マウスでは、T細胞抗原受容体と免疫グロブリンが出来ないことが知られている(Mombaerts, P. et al., Cell, 1992, 68(5), 869-77.)。

このような獲得免疫が無いマウスを、異種移植用、再生医学用などに用いることが考えられるが、マウスはヒトと比べて臓器のサイズが小さく、さらに、マウスは生理学的にヒトとは大きく違う(例えば、マウスの寿命は約2年であり、細胞の老化速度ヒト細胞に比べて速い)ので、異種移植用、再生医学用などに適さないという問題があった。

概要

本発明は、ブタRAG-1蛋白質をコードするDNAを提供することを課題とする。さらに、本発明は、ブタRAG-1遺伝子の機能が抑制されたブタを作製することを課題とする。

ブタゲノムDNAライブラリースクリーニングを行い、ブタRAG-1遺伝子を含むBACクローンを得た。このBACクローンよりRAG-1遺伝子を含む領域をサブクローニングし、3つのクローンを得た。これらのクローンのシークエンスによる塩基配列決定制限酵素消化によるマッピングを行い、遺伝子地図を作製した。この情報をもとにRAG-1遺伝子をノックアウトするターゲティングベクターを作製した。該ベクターを利用して内因性のブタRAG-1遺伝子の機能を抑制することにより、獲得免疫の無いブタを作製することが可能である。

目的

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その第一の目的は、ブタRAG-1蛋白質をコードするDNAを提供することにある。さらに、本発明は、該DNAを発現するベクター、該ベクターが導入された形質転換体、ブタRAG-1蛋白質およびその製法、並びに該蛋白質に結合する抗体を提供することを目的とする。

また、本発明は、ブタRAG-1遺伝子の機能が抑制されたブタを作製することを目的とする。さらに、該ブタの作製に利用されるベクターおよび細胞を提供することも本発明の目的である。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

以下の(a)から(c)のいずれかに記載のブタ由来のDNA。(a)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNA。(b)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA。(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失置換、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、DNA組み換え誘導活性を有する蛋白質をコードするDNA。

請求項2

請求項1に記載のDNAを含むベクター

請求項3

請求項1に記載のDNAまたは請求項2に記載のベクターを保持する形質転換細胞

請求項4

請求項1に記載のDNAによりコードされる蛋白質。

請求項5

請求項3に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、請求項4に記載の蛋白質の製造方法。

請求項6

請求項4に記載の蛋白質に結合する抗体。

請求項7

相同組み換えにより内因性のブタRAG−1遺伝子の機能を抑制するDNA配列を含むベクター。

請求項8

請求項7に記載のベクターが導入されたブタ細胞

請求項9

以下の(a)および(b)の工程を含む、内因性RAG−1遺伝子の機能が抑制されたブタの製造方法。(a)請求項8に記載の細胞の核を除核卵子移植する工程(b)工程(a)で得られた除核卵子をブタに移植する工程

請求項10

請求項8に記載の細胞をブタに移植する工程を含む、内因性RAG−1遺伝子の機能が抑制されたブタの製造方法。

技術分野

Met Glu Phe

背景技術

0001

本発明は、ブタRAG-1遺伝子およびその利用に関する。

0002

脊椎動物において、外来病原体戦う主戦力は、獲得免疫系である。獲得免疫系は、生後に外来の異物抗原)の刺激の結果、生体の免疫系が後天的に得るその抗原特異的な免疫状態であり、T細胞の抗原受容体又はB細胞生産する免疫グロブリンが抗原を識別することが引き金となって開始される。T細胞抗原受容体と免疫グロブリンは、胎性細胞のゲノム遺伝子がT細胞乃至B細胞に分化する過程遺伝子再構成して、その結果機能遺伝子になり、獲得免疫能を発揮する。この獲得免疫系発生での遺伝子再構成の発見により、利根川博士が1987年ノーベル生理学医学賞を受賞した。

0003

遺伝子再構成は、ゲノム遺伝子上の再構成シグナル配列を、RAG-1蛋白質(再構成活性化遺伝子(Recombination Activating Gene)の1型産物)とRAG-2蛋白質との複合体が切断することで開始される。RAG-1遺伝子が無いと、T細胞抗原受容体と免疫グロブリンが出来ないことが判明しており、獲得免疫の無い重症複合免疫不全症になることが知られている。実際、ノックアウト法により作出したRAG-1遺伝子欠損マウスでは、T細胞抗原受容体と免疫グロブリンが出来ないことが知られている(Mombaerts, P. et al., Cell, 1992, 68(5), 869-77.)。

発明が解決しようとする課題

0004

このような獲得免疫が無いマウスを、異種移植用、再生医学用などに用いることが考えられるが、マウスはヒトと比べて臓器のサイズが小さく、さらに、マウスは生理学的にヒトとは大きく違う(例えば、マウスの寿命は約2年であり、細胞の老化速度ヒト細胞に比べて速い)ので、異種移植用、再生医学用などに適さないという問題があった。

0005

本発明者らは、体液組成生理機能がヒトに似ており、霊長類に比べ世代時間が短い動物であるブタは、異種移植用、再生医学用などに適するサイズの動物としても好適であると考えた。しかしながら、現在までに、RAG-1遺伝子ノックアウトブタに関する報告は皆無である。また、ノックアウトブタを作製するためにはブタRAG-1遺伝子の同定が前提となるが、いまだブタRAG-1蛋白質をコードするDNAが単離されたという報告もない。

0006

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その第一の目的は、ブタRAG-1蛋白質をコードするDNAを提供することにある。さらに、本発明は、該DNAを発現するベクター、該ベクターが導入された形質転換体、ブタRAG-1蛋白質およびその製法、並びに該蛋白質に結合する抗体を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0007

また、本発明は、ブタRAG-1遺伝子の機能が抑制されたブタを作製することを目的とする。さらに、該ブタの作製に利用されるベクターおよび細胞を提供することも本発明の目的である。

0008

本発明者らは、まず、ブタゲノムDNAライブラリースクリーニングを行い、ブタRAG-1遺伝子を含むBACクローンを得た。このBACクローンよりRAG-1遺伝子を含む領域をサブクローニングし、3つのクローンを得た。これらのクローンのシークエンスによる塩基配列決定制限酵素消化によるマッピングを行い、遺伝子地図を作製した。この情報をもとにRAG-1遺伝子をノックアウトするターゲティングベクターを作製した。

0009

具体的には、RAG-1遺伝子開始コドンの5’側直前にあるKpnI認識部位からその下流約1.4kbの位置にあるHincII認識部位までをピューロマイシン耐性遺伝子置換した。このピューロマイシン耐性遺伝子は、遺伝子導入の際の陽性選択に用いる。この置換によりRAG-1遺伝子は発現することが出来ない。相同組換え領域としては開始コドン上流約9.0kbに存在するXhoI認識部位から開始コドンの下流約2.5kbの位置に存在するXhoI認識部位までとした。また、遺伝子導入の際の陰性選択用にDT-A遺伝子を結合した。作製したターゲティングベクターを用いて、ブタの内因性RAG-1遺伝子の機能を抑制することにより、獲得免疫系の無いブタを作製することが可能である。

発明を実施するための最良の形態

0010

従って、本発明は、ブタ由来のRAG-1蛋白質をコードするDNAおよびその利用、特に獲得免疫系の無いブタの作製のための利用に関し、より具体的には、〔1〕以下の(a)から(c)のいずれかに記載のブタ由来のDNA、(a)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNA、(b)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA、(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、DNA組み換え誘導活性を有する蛋白質をコードするDNA、〔2〕〔1〕に記載のDNAを含むベクター、〔3〕〔1〕に記載のDNAまたは〔2〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞、〔4〕〔1〕に記載のDNAによりコードされる蛋白質、〔5〕〔3〕に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、〔4〕に記載の蛋白質の製造方法、〔6〕〔4〕に記載の蛋白質に結合する抗体、〔7〕相同組み換えにより内因性のブタRAG−1遺伝子の機能を抑制するDNA配列を含むベクター、〔8〕〔7〕に記載のベクターが導入されたブタ細胞、〔9〕以下の(a)および(b)の工程を含む、内因性RAG−1遺伝子の機能が抑制されたブタの製造方法、
(a)〔8〕に記載の細胞の核を除核卵子移植する工程
(b)工程(a)で得られた除核卵子をブタに移植する工程
〔10〕〔8〕に記載の細胞をブタに移植する工程を含む、内因性RAG−1遺伝子の機能が抑制されたブタの製造方法を、提供するものである。

0011

本発明は、ブタRAG-1蛋白質をコードするDNAを提供する。本発明において「RAG-1蛋白質」とは、遺伝子再構成を開始するために必須なRAG蛋白質複合体のうち1型産物を意味する。本発明において、RAG-1蛋白質の活性は、DNA組み換え誘導活性として測定することが可能である。DNA組み換え誘導活性の測定は、公知の手法で行うことができる(AgawalA., Eastmanq.M. and Schatz D.G., 1998, Nature, 394, 744-751.)。本発明において明らかにされた、ブタRAG-1の遺伝子配列を配列番号:1、cDNA配列を配列番号:2、これらDNAがコードするRAG-1蛋白質のアミノ酸配列を配列番号:3に示す。

0012

本発明は、また、ブタRAG-1蛋白質の変異体をコードするDNAを包含する。このような蛋白質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、蛋白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ,and Smith, M.(1983) MethodsEnzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82,488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)などを用いて、ブタRAG-1蛋白質(配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質)のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ブタRAG-1蛋白質のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内(例えば、5アミノ酸以内)であると考えられる。

0013

変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ離(R、K、H)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)を挙げることができる(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。

0014

あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M.Nucleic AcidsResearch (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 )。

0015

ブタRAG-1蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質は、ブタRAG-1蛋白質と他のペプチド又は蛋白質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合蛋白質を作製する方法は、ブタRAG-1蛋白質(配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質)をコードするDNAと他のペプチド又は蛋白質をコードするDNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチド又は蛋白質としては、特に限定されない。

0016

ブタRAG-1蛋白質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 )、6個のHis(ヒスチジン)残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素HA)、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag 、SV40T抗原の断片、lck tag 、α-tubulinの断片、B-tag 、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、ブタ由来のRAG-1蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、例えば、GST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)、HA(インフルエンザ凝集素)、イムノグロブリン定常領域β−ガラクトシダーゼ、MBP(マルトース結合蛋白質)等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたは蛋白質をコードするDNAを本発明の蛋白質をコードするDNAと融合させ、これにより調製された融合DNAを発現させることにより、融合蛋白質を調製することができる。

0017

また、本発明は、上記DNAを含むベクター、該ベクターが導入された形質転換体、上記DNAによりコードされる蛋白質およびその製法、並びに該蛋白質に結合する抗体を提供する。

0018

本発明のベクターとしては、当業者において一般的に使用されるものを用いることができる。例えば、形質転換における宿主として大腸菌を用いる場合には、例えば、大腸菌内で複製させるための「ori」、および形質転換された大腸菌を選抜するための遺伝子(例えば薬剤アンピシリンテトラサイクリンカナマイシンクロラムフェニコール等)耐性遺伝子)をベクター上に有することが望ましく、このようなベクターとして具体的には、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEM-T、pDIRECT、pT7等を挙げることができる。

0019

RAG-1蛋白質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば大腸菌での発現を目的とした場合は、lacZプロモーター(Ward et. al., Nature, 1989, 341, 544-546.)、araBプロモーター(Better et. al., Science, 1988, 240, 1041-1043.)、またはT7プロモーター等を有するベクターを例示することができる。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1(ファルマシア社製)、「QIAexpress system」(キアゲン社製)、pEGFP、およびpET(この場合、宿主はT7RNAポリメラーゼを発現するBL21が好ましい)等が挙げられる。また、発現ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、例えば大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列(Lei, S. P. et. al., J. Bacteriol., 1987, 169, 4379.)等を使用すればよい。

0020

RAG-1蛋白質を製造するための他のベクターとしては、例えば哺乳動物由来の発現ベクター(例えばpcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res., 1990, 18(17), 5322.、pEF、pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター(例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(ギブコBRL社製)、pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター(例えばpMH1、pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター(例えばpHSV、pMV、pAdexLcw)、レトロウィルス由来の発現ベクター(例えばpZIPneo)、酵母由来の発現ベクター(例えば「Pichia ExpressionKit」(インビトロゲン社製)、pNV11 、SP-Q01)、枯草菌由来の発現ベクター(例えばpPL608、pKTH50)等が挙げられる。

0021

CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター(Mulligan et. al., Nature, 1979, 277, 108.)、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター(Mizushima et. al., Nucleic AcidsRes., 1990, 18, 5322.)、CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子(例えば薬剤(ネオマイシン、G418等)耐性遺伝子)を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えばpMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等が挙げられる。

0022

さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数増幅を目的とする場合には、核酸合成経路欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター(例えばpCHOI等)を導入し、メトトレキセートMTX)により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター(pcD等)で形質転換する方法が挙げられる。

0023

また、複製開始点としては、ポリオーマウィルスアデノウィルスウシパピローマウィルス(BPV)等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のために、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等を含むことができる。

0024

ベクターが導入される宿主としては特に制限はなく、例えば大腸菌や種々の真核細胞等を用いることが可能である。真核細胞を使用する場合、例えば動物細胞、植物細胞真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えばCHO、COS、3T3、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞(Valle, et. al., Nature 291: 358-340, 1981)、あるいは昆虫細胞、例えばSf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 4216-4220.)やCHO K-1(Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1968, 60, 1275.)を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。植物細胞としては、例えばニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、酵母、例えばサッカロミセス(Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えばアスペルギルス(Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)が知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞としては、大腸菌(E. coli)、例えばJM109、DH5α、HB101、XL1Blue、BL21等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。

0025

また、宿主として動物を使用する場合、哺乳類動物、植物、昆虫が挙げられる。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。さらに、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。

0026

本発明の形質転換体を作製するためには、上記宿主に上記ベクターを導入する。そのための方法としては、大腸菌等の宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えば塩化カルシウム法エレクトロポレーション法(Chu, G. et. al., Nucl. Acid. Res., 1987, 15, 1311-1326.)を用いることができる。また、培養細胞等の宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えばリン酸カルシウム法 (Chen, C. andOkayama, H. Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 2745-2752.)、DEAEデキストラン法(Lopata, M. A. et. al., Nucl. Acid. Res., 1984, 12, 5707-5717.、Sussman,D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol., 1985, 4, 1642-1643.)、カチオニックリボソームDOTAP(ベーリンガーマンハイム社製)を用いた方法、リポフェクチン法 (Derijard, B. Cell, 1994, 7, 1025-1037.、Lamb, B. T. et. al., Nature Genetics, 1993, 5, 22-30.、Rabindran, S. K. et. al., Science, 1993,259, 230-234.)等の方法を用いることが可能である。

0027

さらに、動物にDNAを導入する場合、該DNAを適当なベクター(例えばアデノウイルスベクター(例えばpAdexlcw)やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo)等が挙げられるが、これらに制限されない。)に組み込み、例えばレトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法等により生体内に導入することが可能である。また、昆虫にベクターを導入する場合、例えば目的の蛋白質をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより行うことができる(Susumu, M. et. al., Nature, 1985, 315, 592-594.)。また植物にDNAを導入する場合、例えば目的とする蛋白質をコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチアナ・タバカムに感染させることでベクターを導入することができる(Julian K.-C. Ma et. al., Eur. J. Immunol., 1994, 24, 131-138.)。

0028

本発明のRAG-1蛋白質は、例えば本発明の形質転換体を培養することにより生産させることが可能である。培養は公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養であれば、一般的に、培養液としては、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等を使用することができる。その際、牛胎児血清FCS)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、通常、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地交換通気攪拌を加える。

0029

本発明のRAG-1蛋白質は、宿主細胞内または細胞外(培地等)から単離し、実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。蛋白質の分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えばクロマトグラフィーカラムフィルター限外濾過塩析溶媒沈殿溶媒抽出蒸留免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動等電点電気泳動法透析再結晶等を適宜選択、組み合わせれば蛋白質を分離、精製することができる。または、さらにこれらのカラム複数組み合わせることにより精製することが可能である。

0030

クロマトグラフィーとしては、例えば後述する本発明のRAG-1蛋白質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィー疎水性クロマトグラフィーゲル濾過逆相クロマトグラフィー吸着クロマトグラフィー等が挙げられる(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。これらの精製方法を用い、本発明のRAG-1蛋白質を高度に精製することもできる。

0031

なお、蛋白質を精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えばトリプシンキモトリプシンリシルエンドペプチダーゼプロテインキナーゼグルコシダーゼ等が用いられる。

0032

また、本発明のRAG-1蛋白質をグルタチオンS-トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組換え蛋白質として宿主細胞(例えば動物細胞や大腸菌等)内で発現させた場合には、発現させた組換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクターXa等により切断し、除去することも可能である。

0033

さらに、個体で蛋白質を産生させる系から蛋白質を回収することも可能である。個体で蛋白質を産生させる系としては、例えば動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするDNAを導入し、動物または植物の体内で蛋白質を産生させた後に、蛋白質を回収する。

0034

例えば目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい(Ebert, K. M. et. al., Bio/Technology, 1994, 12, 699-702.)。

0035

また、昆虫を使用する場合は、例えば目的の蛋白質をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスを感染させたカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる(Susumu, M. et. al., Nature, 1985, 315, 592-594.)。

0036

さらに、植物を使用する場合、例えば上記方法でベクターを導入したニコチアナ・タバカム由来の細胞から当業者に周知の方法(Toki et. al., Plant Physiol, 1995, 100, 1503-1507.)で再生させたタバコ(タバコの葉)より所望の蛋白質を得ることができる(Julian K.-C. Ma et. al., Eur. J. Immunol., 1994, 24, 131-138.)。

0037

本発明のRAG-1蛋白質に結合する抗体は、RAG-1蛋白質の精製や検出に使用することが可能である。本発明のRAG-1蛋白質の精製や検出に用いる抗体は、公知の方法により作製することができる。抗体の形態には特に制限はない。ウサギ等の免疫動物抗原蛋白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体遺伝子組換えによるヒト型化抗体も含まれる。さらに、抗体は、RAG-1蛋白質に結合する限り、抗体断片や抗体修飾物であってよい。

0038

抗体は、RAG-1蛋白質を感作抗原として使用し、取得することができる。感作抗原として使用されるRAG-1蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、また、蛋白質の部分ペプチドであってもよい。また、蛋白質を発現する細胞またはその溶解物あるいは化学的に合成したRAG-1蛋白質を感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニンウシ血清アルブミン卵白アルブミン等のキャリア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることができる。

0039

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、モノクローナル抗体の作製においては細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウス等のげっ歯目、ウサギ等のウサギ目アカゲザル等の霊長目の動物が使用される。感作抗原を動物に免疫する方法は、当業者にとっては周知である。

0040

ポリクローナル抗体を得る例としては、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。

0041

モノクローナル抗体を得る例としては、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えばミルステインらの方法(Galfre, G. and Milstein, C., MethodsEnzymol., 1981, 73, 3-46.) 等に準じて行うことができる。

0042

次いで、周知の方法で細胞融合により得られたハイブリドーマから目的とする抗体を産生するハイブリドーマのクローニングを行い、クローニングされたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収する。

0043

得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラムプロテインGカラムが挙げられる。例えばプロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。

0044

抗体の抗原結合活性を測定する方法としては、例えば吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)、EIA酵素免疫測定法)、RIA放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ELISAを用いる場合、抗体を固相化したプレートにRAG-1蛋白質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば抗体産生細胞培養上清精製抗体を加える。酵素、例えばアルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸等の酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。プレートに添加する蛋白質としては、RAG-1蛋白質の断片等を使用してもよい。

0045

また、本発明は、相同組み換えにより内因性のブタRAG-1遺伝子の機能を抑制するDNA配列を含むベクター(ターゲティングベクター)を提供する。該ベクターを用いることで、内在性のRAG-1遺伝子の機能が抑制された(RAG-1遺伝子がノックアウトされた)ブタ個体を作出することが可能である。該ベクターによるRAG-1遺伝子の機能の抑制は、RAG-1遺伝子の発現制御領域に変異を導入することにより、RAG-1遺伝子の発現を抑制することにより行うことができる。また、RAG-1遺伝子のエキソン領域に変異を導入することにより、野生型のRAG-1蛋白質に比べ活性が抑制されたRAG-1蛋白質変異体を発現させることによって行ってもよい。RAG-1遺伝子の機能の「抑制」には、完全に抑制する場合および部分的に抑制する場合の双方が含まれる。

0046

相同組み換えにより内因性のブタRAG-1遺伝子の機能を抑制するDNA配列を含むベクターは、相同組み換えにより、内因性のブタRAG-1遺伝子に該遺伝子の機能を抑制する変異を導入可能なベクターであれば特に制限はない。このようなベクターとしては、例えば、変異を有するブタRAG-1遺伝子の発現制御領域もしくはエキソン領域、および/または、相同組換え領域を含むベクターが挙げられる。また、陽性選択(DNAが導入された細胞のみを選び出すための選択)に用いる遺伝子、または、陰性選択(非相同組換え体を取り除くための選択)に用いる遺伝子をさらに含むベクターであってもよい。また、RAG-1遺伝子部位の組換えを促進する酵素、例えば、Cre-loxにおけるCreをコードする配列をさらに含むベクターであってもよい。

0047

変異の導入には、例えば、実施例に記載したように陽性選択に用いる遺伝子を使用することができるが、内因性RAG-1遺伝子の機能を抑制しうる限り、これに制限されない。陽性選択に用いる遺伝子としては、特に制限はなく、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、および、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。また、陰性選択に用いる遺伝子としては、チミジンキナーゼ遺伝子、および、ジフテリア毒素遺伝子などが挙げられる。

0048

また、本発明において、相同組換え領域とは、ゲノムDNAに、変異を有するブタRAG-1遺伝子の発現制御領域またはエキソン領域を導入する際の相同組換えを媒介するDNA配列を意味する。よって、本発明における相同組換え領域は、相同組換えの媒介が可能なDNA配列であれば、特に制限はない。このようなDNA配列の選択は、当業者であれば通常行いうることである。

0049

また、本発明は、本発明のターゲティングベクターが導入されたブタ細胞を提供する。該ブタ細胞としては、体細胞受精卵などが挙げられるが、これらに制限されない。

0050

本発明において、ターゲティングベクターの上記細胞への導入方法としては、当業者に公知の方法によって行うことができる。具体的には、電気穿孔法エレクトロポーレーション法)を挙げることができる。例えば、1×107個の細胞と50nMのターゲティングベクターを500μlのHEPESバッファーに懸濁し、4.0mmギャップのエレクトロポーレーション用キュベットに入れる。エレクトロポーレーターを用いて250V、960μF、抵抗無限大の設定(由来細胞により値変化あり)で1パルス与えて細胞内に遺伝子を導入する。

0051

さらに、本発明は、RAG-1遺伝子がノックアウトされた(内在性のRAG-1遺伝子の機能が抑制された)ブタの製造方法を提供する。該方法としては、特に制限はなく、例えば、内在性のRAG-1遺伝子の機能が抑制された体細胞の核を除核卵子に移植して、得られた除核卵子をブタに移植することで、ブタ個体を出産させる方法が挙げられる。また、別の態様としては、受精卵に本発明のターゲティングベクターを直接注入し、得られた受精卵をブタに移植することで、ブタ個体を出産させる方法が挙げられる。

0052

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

0053

[実施例1]ブタRAG-1遺伝子ノックアウト用ターゲティングベクターの作製
まず、ブタRAG-1のcDNAの単離を試みた。その際、既知の遺伝子を入手できなかった。また、既知のマウスとヒトのヌクレオチド配列情報を子細に検討したが、ブタRAG-1のcDNAの検索に他動物種プローブでは、クロスハイブリダイゼーションが出来ない可能性があると判断された。従って、ブタmRNAより逆転写PCRを行った。最初、ヒトRAG-1遺伝子で用いられている既報のPCRプライマー(Chunet al., Cell 64:189-200(1991))4本を用いたが、PCR産物はブタからは得られなかった。そこで、マウスとヒトのヌクレオチド配列の共通領域手がかりに多数のプライマーを作成して試行錯誤した結果、1161bp(9.1kbpの添付ヌクレオチド配列の7010bpから8171bp)のヒトRAG-1のcDNAとヌクレオチド配列で88%相同性のあるcDNA断片クローン化された。これをプローブとして、ブタの胸腺のcDNAライブラリーを検索して、全長の約80%をカバーするcDNAクローンを得た。尚、残りのcDNAヌクレオチド配列は、5’RACE法と3’RACE法を用いた。このように、ブタRAG-1のcDNA領域を部分的にクローニングするのは非常に困難であった。

0054

次に、このcDNAの情報をもとに、PCRプライマーを設計した。作成したPCRプライマーを用いて、ブタゲノムDNAライブラリーのスクリーニングを行い、ブタRAG-1遺伝子を含むBACクローン578B12を得た。このBACクローンよりRAG-1遺伝子を含む領域をサブクローニングし、3つのクローン(Rag1-BAC-SacI約6.1kb、Rag1-Clawn-genome-BamHI約6.0kb、pBKS-RagKp約12.6kb)を得た(図1)。これらのクローンのシークエンスによる塩基配列決定(約9.1kb)(配列番号:1)、制限酵素消化によるマッピングを行い、約16kbの遺伝子地図を作製した(図1および2)。この情報をもとにRAG-1遺伝子をノックアウトするターゲティングベクターを作製した。

0055

このターゲティングベクターでは、RAG-1遺伝子開始コドンの5’側直前にあるKpnI認識部位からその下流約1.4kbの位置にあるHincII認識部位までをピューロマイシン耐性遺伝子に置換してある(図3)。このピューロマイシン耐性遺伝子は、遺伝子導入の際の陽性選択に用いる。この置換によりRAG-1遺伝子は発現することが出来ない。相同組換え領域としては開始コドンの上流約9.0kbに存在するXhoI認識部位から開始コドンの下流約2.5kbの位置に存在するXhoI認識部位までとした。また、遺伝子導入の際の陰性選択用にDT-A遺伝子を結合してある(図3)。

発明の効果

0056

まず5’側の相同組換え領域を含むpBKS-RagKpをXhoI消化後自己連結し、pBKS-RagXKを得た。また、3’側の相同組換え領域を含むRag1-Clawn-genome-BamHIをHincIIとNotIで消化して得られた約2.2kbの断片を、同じくHincIIとNotIで消化したpBleuscriptKS(-)に連結し、pBKS-RagHNとした。このベクターをXhoIで部分消化して自己連結し、終止コドンを含む約1.2kbを除いたpBKS-RagHXを得た。このpBKS-RagHXをXhoIで部分消化した約4.0kbの断片と、ピューロマイシン耐性遺伝子を持つpPGK-puroをSalIで消化した約1.7kbの断片を連結した。これによりピューロマイシン耐性遺伝子の向きが異なる2種類のベクター、pBKS-PuroF-RagHXとpBKS-PuroR-RagHXを得た。この2つのベクターをKpnIとNotIで消化した約2.7kbの断片と、先に得たpBKS-RagXKをSalIとKpnIで消化して得た約9.0kbの断片を、DT-A遺伝子を持つベクターpMC1DTpAMCSをNotIとSalIで消化して得た約4.3kbの断片とともに連結し、2種類のターゲティングベクター、pTV-Rag1puroFとpTV-Rag1puroRを得た(図4)。

0057

本発明のターゲティングベクターを用いることにより、T細胞抗原受容体と免疫グロブリンの無いブタが出来る。このことは、獲得免疫が無いブタが得られることであり、幾つかの重要な応用が可能となる。

0058

(1)異種移植用ミニブタ
現在、脳死個体からの臓器移植は、技術の進歩により需要が臓器の供給の5倍以上あり、ヒトの臓器の闇市場まで出来ている程、深刻な供給不足である。ヒトへの臓器移植用のヒト遺伝子を導入した改良ミニブタが既に欧米のベンチャー企業数社で開発され、ヒヒ等の霊長類への移植で数ヶ月の移植状態持続成功している。これらの異種移植用ミニブタでは、超急性血管性拒絶反応等比較的早期に生じる拒絶反応は無くなっているが、徐々に出てくる細胞性拒絶反応がまだ長期の移植持続で解明されなければならない。この細胞性拒絶反応は、移植を受けたレシピエントの獲得免疫系がどう移植臓器に反応するかと云う問題と、移植臓器に付着したブタT細胞とB細胞が移植を受けたレシピエントの体内で増殖し、レシピエントを異物と認識したブタの免疫機能暴走の問題との二つの側面を検討する必要がある。異種移植用ミニブタのRAG-1をノックアウトして、T細胞とB細胞を無くしたブタでは、移植後のブタ獲得免疫系のレシピエントへの持ち込みが無くなる。このため、異種移植の成功率飛躍的に向上すると期待される。

0059

(2)再生医学用、ヒト臓器培養器としてのRAG-1ノックアウト・ブタ
胸腺の無いヌードマウスは、T細胞抗原受容体が無いので獲得免疫能が無く、ヒトの細胞や臓器に対する拒絶反応が失われている。そこで、現在、ヒトの耳介など形成外科移植用器官の生育が、ヌードマウスで行われている。しかし、マウスでは、動物のサイズに限界があり、より大きな再生医学用臓器の作製は可能で無い。

0060

家畜の中では、他の草食動物に比べ、雑食であるブタがより体液組成や生理機能がヒトに似ており、更に、霊長類に比べて動物の世代時間が短いので、再生医学用ヒト臓器培養母体として最も適切な動物である。RAG-1ノックアウト・ブタは、獲得免疫を失っているので、ヌードマウスの様に、ヒトの臓器を拒絶することはなく、栄養を補給して、臓器を培養作製できる。

0061

(3)ブタを用いたヒト獲得免疫能の開発
RAG-1ノックアウト・ブタにヒトの骨髄を導入すれば、自身の獲得免疫能がないので、ヒト獲得免疫能をブタ体内に構築できると予想される。獲得免疫能についてヒト-ブタ・骨髄キメラ動物が出来れば、現在行われている組換えDNA手法によりマウスの抗体をヒト化する等の必要もなくなり、直接、ヒト抗体を産生するブタが作出可能となる。T細胞についても、T細胞抗原認識に主要な役割をするMHC主要組織適合性抗原複合体)のクラスII分子が、ヒトとブタとで酷似しているので、ヒト体内で機能するヒト・ヘルパーT細胞を産生出来る。例えば、エイズ感染患者は、エイズウイルスがヘルパーT細胞のCD4分子を介して感染してヘルパーT細胞を死滅させ、その結果獲得免疫能が失われて日和見感染死亡する。が、ヒトのエイズウイルス耐性CD4分子が既に作製されており、自己のヘルパーT細胞をエイズウイルス耐性化後RAG-1ノックアウト・ブタ体内で増殖させ、エイズ患者に戻せば、獲得免疫能力回復できる。免疫不全患者や、老化による免疫能の低下は、RAG-1ノックアウト・ブタ体内で増殖させた自己の獲得免疫系細胞を注入する事により、免疫能や活力を回復できる。

図面の簡単な説明

0062

SEQUENCE LISTING

<110> National Institute of Agrobiological Sciences
<120> Pig RAG-1 gene and use thereof
<130> MOA-A0111
<140>
<141>
<160> 3
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 9098
<212> DNA
<213> Sus.scrofa
<220>
<221> exon
<222> (827)..(924)
<220>
<221> intron
<222> (925)..(5364)
<220>
<221> exon
<222> (5365)..(9098)

<400> 1
gagctcctgt tgtggctcag taggttaaga acccagcaca gggtctgtga ggattcgggt 60
tcaatccttg gtctcgatca gtgggttaag gatccgtcat tgccgtgagc tgtggtgtag 120
gttgcggatg caagtggatc cggtgtggct gtggtgcagg ctggcagatg caactccaat 180
tccaccccta acccaggaac ttccatatgc cgcaggtgca gtcctgaaaa gaaaagaaag 240
gaatggaaaa gcaaggaaag gaaaggaaaa gaaaagaact ccagtaatgt aaacatggtg 300
ttgttgcaag gagcacagaa ttccctgact gagaactgac cagggaggag aattctgcgg 360
gtggtttggt taccatttca aaattataat aaaaagtgct cagatagtta gcatttgatg 420
agtatctgct aaaggtaaac actgtcccaa gtcttctcct ataacaagtc tcactataac 480
ctcattgact ctcagaaatg actcttcaga tttccagctt gcaggtgggg aaactaaggc 540
acagagctgc gggagcttag cacaagcccg agcttatgtt gacaagatca tctccaaccc 600
aacagccttg gggagcgaac tggcagcttt ggcagtgctc cagcacacac ccatgtgtgg 660
gtcttcagat cccccagtta agcttcctga agagccaggt gccagctgga gctgggggct 720
cctggctggt gattggctgc catcactggt ggttagccct ctggggtggt gggggggacc 780
gggaaggaca ggggaggctg ataaataaag cagccatctg ctctgaggga tgggagagca 840
cattttgcct tctctttggt agcgagtaat atcaaccgaa gtgcagacat cctaacactt 900
tgcccaggca gcctgctgag caaggtaaca ctcatccttt tcatgccttg agtcacaata 960
tttatgacat ttttatgttt ctcattagaa gtacttgggc tttgttcctt gcggggaatg 1020
agaggaggga gcaagggacg ctggcgtaca tttgactttt cttgctaatg tacgaaaata 1080
ggaaaggaac cagaaaccaa gttgaggaag acactgtacg ttcaaagaga agacggaaaa 1140
tatctgaatt actgtaaata aatgctgcag gcagaggaag tgtttaagga gtgcttcttg 1200
agtggatgtg taaagcaaat cagcagaagg agaggtgtga gactcttgaa aaaaatattg 1260
tgctggtcca ggtaataaga gtaatcagga gcaaacaaat tccagggcgg gaggaaatgt 1320
acttgcccag gtatttgcca gggtagtgcc aggaatttcc tgaattatat aggaccagga 1380
gaccagtatt tctcagtgtg tgacctgtgg gccactgaaa tacagcagga tcattgaaat 1440
gcttgttaaa aaatatgatc tctggagttc ccgtcgtggc gcagtggtta acgaatccga 1500
ctaggaacca tgaggttgcg ggttcggtcc ctgcccttgc tcagtgggtt aacgatccgg 1560
cgttgccgtg agctgtggtg taggttgcag acgtggctcg gatcccgcgt tgctgtggct 1620
ctggcgtagg ccggtggcta cagctccgat tcgaccccta gcctgggaac ctccatatgc 1680
cgcgggagcg gcccaagaaa tagcaacaac aacaacaaca acaaaagaca aaagacaaaa 1740
aaaaaaaaaa aaaaatatga tctctggact ccaccccaga taaattgaat cagattctct 1800
gggacctgac gatctgcctt atttttttaa acccaagttc cctagtgatt ctgatacaga 1860
gcaattttga gaatgccacg gtagagccct acacagaggt tatgttcttg aacagggttc 1920
ctgaccaggg gctgaagtgc ttcaagcaag aagttgcctg gaggaagcgt aagaatcttc 1980
aggtcatctt gtagatgcct gagacttata aaaggctttt gatactatca ttttttgatg 2040
atggtgtttg gcaaagagta gacaataata tttgcggagt gaatgaatga gggattaagt 2100
gggacaggtg tgacaataaa ggatcacacc tgggcacact gcagtcactc aaactttgtg 2160
tgtggaccaa gtggaatatg ttaagaggag agatgactga ccaagggcca gctcggaggt 2220
gtgtgtaagg tgtgtgtgtc gggggagctt ggcagggagg tggagggggc gctgctgtaa 2280
ctctgccccc tgaggttact gatgattcac taacacaaat aacagcttct gaccctgcct 2340
gacttgtcaa aatgaatccg tgcccttaga gagaaggccc ctggttgctg tgatggcaag 2400
tgatggcaat actcagaggg cagagcccga tgggaacagc tgagccagca gcaaccaccc 2460
tgccttgtag agtctggtcc actgctgaaa ccttctgtta gaagagagga aatcaagcat 2520
tcacaaaatt cctgagtgtc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagaaa gaaagaacga 2580
aaatgactac aagataaccc ataatcctaa ctttatgtgc tgtcaacagg tccctctttt 2640
agtccccttt ctgcgtgttt accagaagag aaaggtaagc taagaatggt agtcagattt 2700
gcagcttagc caattaaaaa atttttttat tatagttgat ttatattgtt ctgccaattt 2760
ctgccgttaa cttagccaaa tcttaaattt ttctgggggg aaactataga aaagtgacct 2820
tggtacatag aaacctaggc tttaaaacat ttttttcccc taaggtgaat agatcacaaa 2880
aattaaatat aaatataaag cagttgagta gaaaagcaat ctaataaata aatttgattt 2940
ggatgtcaac gctagtaact gcatggtgat ggtactcttt ccatggtagt atttacacaa 3000
atatagttta ggcagatttt gatgcaacat ttcaggccac tgggagtcag gagaggattg 3060
ggtagggaga ggaggcagtt ctagggatcc ttccagtatg ccttgaggtt gactgactca 3120
ttgtgaaagt tcaatatttc atttgattag ctctacagat gaccatgcaa ttattcataa 3180
gaactcaaaa tatcgtctcg gaattccaga gaactagtgc attagaaaag gcagggaaag 3240
agttccctgg tagctcaatg ggttaaggac ccagcattgt ctctgttgtg gctcaggtca 3300
ctgctgtgat gtcggttcaa tccttggccc agacacaggg aaaggaaggg ctaaagaaac 3360
aaaacacatg gaaataagtt caaaccagtg ggacagaagt gacatccttg ccgctgatcc 3420
tgaatgtagg aacataactg aacaataagc aactttgagg cgttggtcgg actgcagttg 3480
aaatactttt gaggttaatg aggcctttga aatggtttgg aactgtttag ttctcacaca 3540
gtcctgcata tagaacagtg taacaggatt tccttttcaa ccaagacttg gaaattggct 3600
tttcgtcttt atgaaaaaca tgaatctctg aagcatcatg catgcaagat ggaacaaact 3660
tctgtggttg aaagggatga cctaacagga agctttgtta gcagcagtca ggatcaccct 3720
tgtggctttc ctttcccctc ccccaaatcc cacccctggg caaagtgtgt tcatcagagg 3780
attagtctcc ataccacagg acaataacaa tatcatcaac ttggttagtt agttaattga 3840
aggggaagca ttgtttgata taattggcgg gtcaagagca ctaacccagg aaaatatgga 3900
aaatttagat tgtagtttga aaatacaatt gctgtttttc cagtcatgct gatactaagg 3960
aattttgaga atattgtgct aattgggtct agagacactc aaatggcatt tttaaacttt 4020
tttctacagc tctgttgaag cctacaccac aacccaggtt gctagggttt cctggaatat 4080
ataatggcca atgttttttt tgaagaagaa aattattact cccacctctt cttattacaa 4140
acgatagagc taatgaccag tgcccagtaa tgacttttgg gatggcctgt gtgaattcga 4200
cctgaaacta cttgaatttt tcatcttaaa agtcctttgg agtctctgta catgcacact 4260
gtggtttgtt gcaggtttag agagttctgt gggttttgtt cctaatggag acacagcctt 4320
ataatttaca gcagcgttca ctaattaaaa ttgtaagcat aattactatc catgatactt 4380
gttattagtg tgcattcata aagctcaaaa ttcacttcat cctttcaagt agcgagtaat 4440
tagtttcttt ggatttgtag ctttatcatc cctttatgtc ccgtttcaga gaaataaaca 4500
accaacctcc tggcagactg ctttaaaaag ctggaaatac attgtccagc tagtgcaatg 4560
agactgatac agcgcggaaa atatgacttt tctttggttt tagtaaccag tttttccttg 4620
catttattca gcagataact attgagcatc taatgtgtgc tagaaagctt gggggagaca 4680
gagataaatc actcaaagat tccgtcctaa aaaacgtcca ggttttggtg gaaaggaaat 4740
aatatcgtac atagataata ttgtacatca actatatctc aataaaaaag aataattttt 4800
ataaaagaaa tgattgtaca tatatacgta aaatagacca tggtgatgat gcgtgaacgc 4860
agaaacatgt aaatggacaa tgccactgaa agaacaggaa atgactctgt tttctgtata 4920
tgatcagccc taacatagta tattaacata ggaagccaaa caattaactt tctgaatgct 4980
ttaataaatg aataggcgtt cccattgtgg cgcagtggtt aacgaatcca actaggaacc 5040
atgaggttgt gggttcgatc cctgcctttg ctcagtgggt taaggagccg gtattgccat 5100
gatctgtggt gtaggtcgca gatgcggctc aggtcccaag cagctgtggc tctggcgtag 5160
gccagcggct gcagctcccc tagcctggga acctccgtgt gctggttctg aaaaaaggca 5220
aaaagacaaa aaaataaaat aaataataaa ataaaataaa aaataaatga ataattgaat 5280
gtactaattg gtattccttc caagttgcat cagtgggtta tttacatttt ttttcctaac 5340
ctgacttgtc cttattgctc ccaggtacct cagccagcat ggctgtctct ttgccaccca 5400
ctctgggact cagttccgcc ccagatgaaa tccagcaccc ccacattaaa ttttcagaat 5460
ggaaatttaa gctattcagg gtgagatcct ttgaaaaggc acctgaaaag gctcaaacgg 5520
aaaagcagga ttcctccgag gggaaaccct cgctggagca atctccagca gtcctggaca 5580
agcctggtgg tcagaagtca gccctgcctc aaccagcatt caagccccat ccaaagtttt 5640
taaaggaatc ccacgaagat gggaaagcaa gagacaaagc catccaccaa gccaacctga 5700
gacgtctctg ccgcatctgt gggaattctt tcaacaccac tgggcacaag agaaggtatc 5760
cagtccacgg gcctgtggat ggtaaaaccc aagtcctttt acggaagaag gaaaagaggg 5820
ccacgtcctg gccagacctc attgccaaag ttttccggat cgatgtgaag gcagatgttg 5880
actcgatcca ccccactgag ttctgccata actgctggag cttcatgcac aggaagttta 5940
gcagcacccc atgtgaggtt tactccccaa ggaatgcagc catggagtgg cacccccaca 6000
ccctaaactg tgacatctgc cacattgcac gtcggggact caagaggaag agtcagcagc 6060
caaacatgca gctcagcaaa aaactcaaaa ctgtgattga ccgagcgaga caagcccgtc 6120
agcgcaagag gagagctcag gccaggatca gcagcaagga actgatgaag aagatcgcca 6180
actgcggtca gatacatctt agccccaagc tcctggcagt ggacttcccg gcgcactttg 6240
tgaaatctat ctcctgccag atttgtgaac acatcctggc cgacccggtg gagaccagct 6300
gcaagcatgt gttttgcagg atctgcattc tcaggtgcct caaagtcatg ggcagcagtt 6360
gtccctcttg ccactatccc tgttttccta ctgacctgga gagtccagtg aagtcttttc 6420
tgagcatctt gaataccctg atggtgaaat gcccagcaaa ggagtgcaac gaggagatca 6480
gcttggaaaa atataatcac catatctcaa gccacaagga gtcgaaggag acatttgtgc 6540
atattaataa agggggccgg ccccgccagc atctcctgtc cctgacgcgg agggctcaga 6600
aacaccgtct gagggagctc aagctgcaag tcaaggcctt cgccgacaaa gaagaaggtg 6660
gcgatgtgaa gtcagtgtgc ctgaccttgt tcctgctagt gctgagggcg aggaatgagc 6720
acagacaagc tgacgagctg gaggccatca tgcgaggcca gggctccggc ctgcagcctg 6780
ctgtttgctt ggccatccgc gtcaacacct tcctcagctg cagccagtac cacaagatgt 6840
acaggactgt gaaggccatc acgggcaggc agattttcca gcctttgcat gcccttcgga 6900
atgcggagaa ggtccttctg cccggctacc accccttcga gtggcagcca cctctgaaga 6960
atgtgtcttc cagcacagac gtgggcatta ttgatgggct gtctggactc tcctcctctg 7020
tggacgatta cccagtggac accattgcca agcgcttccg ctatgactcg gctctggtgt 7080
ccgctctcat ggacatggaa gaagacatcc tggagggtat gagagcccaa gaccttgacg 7140
actacctgaa tggccccttc actgtggtgg tgaaggagtc ttgtgatggg atgggagacg 7200
tgagtgagaa gcacggcagt gggccggtcg tgccggaaaa ggccgttcgg ttttccttca 7260
cagtcatgaa aatcaccatc gcacacgggt cacagaacgt gaaggtgttt gaggaagcca 7320
agcctaactc tgaactatgc tgcaagccct tgtgcctcat gctggccgac gaatccgacc 7380
atgagaccct gacggccatc ctgagccctc tcattgccga gagggaggcc atgaagagca 7440
gccagctaat gctggagatg ggaggcatcc tccggacttt caagttcatc ttcaggggca 7500
ccggatatga tgagaaactg gtccgggaag tggaaggcct tgaggcttct ggctctgtct 7560
acatctgtac cctctgtgat gccacccgcc tggaagcctc tcaaaatctg gtcttccact 7620
ccataaccag aagccacgcg gagaatttgg agcgctatga ggtctggcgt tccaacccat 7680
accatgagac ggtggatgaa cttcgggacc gggtgaaagg ggtctcggcc aaacccttca 7740
ttgagacggt gccttccata gatgccctcc actgtgacat tggcaatgca gccgagtttt 7800
acaagatttt ccagctcgag ataggggagg cgtataagaa cccccatgcc tccaaggagg 7860
aaaggaagag atggcaggcg accttggaca agcacctccg caagaagatg aatctgaagc 7920
ccatcatgag aatgaatggc aactttgcca ggaagctcat gaccaaagag actgtggaag 7980
cagtctgtga gttaattccc tccgaggaga ggcatgaagc tctgagggaa ctgatggacc 8040
tttacctgaa gatgaagccc gtctggcgat catcatgccc tgctaaagag tgcccggaat 8100
ccctctgcca gtatagtttc aattcacagc gttttgctga gctcctctcc accaagttca 8160
agtacagata tgagggcaaa atcaccaatt attttcacaa gacactggcc cacgtcccgg 8220
aaattatcga gagggacggc tccattgggg catgggctag cgagggaaat gagtctggga 8280
acaagctgtt caggcgcttc cgaaaaatga atgccaggca gtccaagtac tatgaaatgg 8340
aagatgtttt gaaacatcac tggttgtaca cctccaaata cctgcagaag tttatgaatg 8400
ctcataaagc atttaaaaac tcagggttta ccataaactt gcagagaagc tcaggggaca 8460
cattagacct agagaactct ccagaatctc aagatttgat ggaattttaa gcagggaagt 8520
tgcctaggca ttggttttgc aaatgggttt tctctgggtt gcatggagag cttctcctgg 8580
cacccttaac tcctgggtgt ggggcttcac cacccaagtg gtggtaggtt gatgaggcca 8640
gagatggtga acccatgtcg ggaataggta actggtgagc cgattgcttg agctgtttag 8700
ggagttcaga aaagcaatag gagaaaccag ttatttgaaa gctccatagc tgagaacagg 8760
ggtaactgca ggggaccaga ggtgaacaaa gatgtgtgga gaggattgag tgatgccaaa 8820
gtcaaagcca aggttgtcaa aggacagcca gtgaagccag aaaaggaatt tgacttgtgg 8880
tttccattcc ccctgcccaa gttattctag tttatactga gaggtgtttt tcatatcact 8940
tttgtagaat tttttatttt ataaatttca catattttgg cttattttac aagatttaaa 9000
aaaggttttc aagaattccc gctgtggcac aatgtggcat cttgggagtg ctgggacaca 9060
ggttccatcc ccagcctggc gtggtgggtt aaggatcc 9098
<210> 2
<211> 3831
<212> DNA
<213> Sus.scrofa
<220>
<221> CDS
<222> (113)..(3244)
<400> 2
gggatgggag agcacatttt gccttctctt tggtagcgag taatatcaac cgaagtgcag 60
acatcctaac actttgccca ggcagcctgc tgagcaaggt acctcagcca gc atg gct 118
Met Ala
1
gtc tct ttg cca ccc act ctg gga ctc agt tcc gcc cca gat gaa atc 166
Val Ser Leu Pro Pro Thr Leu Gly Leu Ser Ser Ala Pro Asp Glu Ile
5 10 15

cag cac ccc cac att aaa ttt tca gaa tgg aaa ttt aag cta ttc agg 214
Gln His Pro His Ile Lys Phe Ser Glu Trp Lys Phe Lys Leu Phe Arg
20 25 30
gtg aga tcc ttt gaa aag gca cct gaa aag gct caa acg gaa aag cag 262
Val Arg Ser Phe Glu Lys Ala Pro Glu Lys Ala Gln Thr Glu Lys Gln
35 40 45 50
gat tcc tcc gag ggg aaa ccc tcg ctg gag caa tct cca gca gtc ctg 310
Asp Ser Ser Glu Gly Lys Pro Ser Leu Glu Gln Ser Pro Ala Val Leu
55 60 65
gac aag cct ggt ggt cag aag tca gcc ctg cct caa cca gca ttc aag 358
Asp Lys Pro Gly Gly Gln Lys Ser Ala Leu Pro Gln Pro Ala Phe Lys
70 75 80
ccc cat cca aag ttt tta aag gaa tcc cac gaa gat ggg aaa gca aga 406
Pro His Pro Lys Phe Leu Lys Glu Ser His Glu Asp Gly Lys Ala Arg
85 90 95
gac aaa gcc atc cac caa gcc aac ctg aga cgt ctc tgc cgc atc tgt 454
Asp Lys Ala Ile His Gln Ala Asn Leu Arg Arg Leu Cys Arg Ile Cys
100 105 110
ggg aat tct ttc aac acc act ggg cac aag aga agg tat cca gtc cac 502
Gly Asn Ser Phe Asn Thr Thr Gly His Lys Arg Arg Tyr Pro Val His
115 120 125 130

ggg cct gtg gat ggt aaa acc caa gtc ctt tta cgg aag aag gaa aag 550
Gly Pro Val Asp Gly Lys Thr Gln Val Leu Leu Arg Lys Lys Glu Lys
135 140 145
agg gcc acg tcc tgg cca gac ctc att gcc aaa gtt ttc cgg atc gat 598
Arg Ala Thr Ser Trp Pro Asp Leu Ile Ala Lys Val Phe Arg Ile Asp
150 155 160
gtg aag gca gat gtt gac tcg atc cac ccc act gag ttc tgc cat aac 646
Val Lys Ala Asp Val Asp Ser Ile His Pro Thr Glu Phe Cys His Asn
165 170 175
tgc tgg agc ttc atg cac agg aag ttt agc agc acc cca tgt gag gtt 694
Cys Trp Ser Phe Met His Arg Lys Phe Ser Ser Thr Pro Cys Glu Val
180 185 190
tac tcc cca agg aat gca gcc atg gag tgg cac ccc cac acc cta aac 742
Tyr Ser Pro Arg Asn Ala Ala Met Glu Trp His Pro His Thr Leu Asn
195 200 205 210
tgt gac atc tgc cac att gca cgt cgg gga ctc aag agg aag agt cag 790
Cys Asp Ile Cys His Ile Ala Arg Arg Gly Leu Lys Arg Lys Ser Gln
215 220 225
cag cca aac atg cag ctc agc aaa aaa ctc aaa act gtg att gac cga 838
Gln Pro Asn Met Gln Leu Ser Lys Lys Leu Lys Thr Val Ile Asp Arg
230 235 240
gcg aga caa gcc cgt cag cgc aag agg aga gct cag gcc agg atc agc 886
Ala Arg Gln Ala Arg Gln Arg Lys Arg Arg Ala Gln Ala Arg Ile Ser
245 250 255
agc aag gaa ctg atg aag aag atc gcc aac tgc ggt cag ata cat ctt 934
Ser Lys Glu Leu Met Lys Lys Ile Ala Asn Cys Gly Gln Ile His Leu
260 265 270
agc ccc aag ctc ctg gca gtg gac ttc ccg gcg cac ttt gtg aaa tct 982
Ser Pro Lys Leu Leu Ala Val Asp Phe Pro Ala His Phe Val Lys Ser
275 280 285 290
atc tcc tgc cag att tgt gaa cac atc ctg gcc gac ccg gtg gag acc 1030
Ile Ser Cys Gln Ile Cys Glu His Ile Leu Ala Asp Pro Val Glu Thr
295 300 305
agc tgc aag cat gtg ttt tgc agg atc tgc att ctc agg tgc ctc aaa 1078
Ser Cys Lys His Val Phe Cys Arg Ile Cys Ile Leu Arg Cys Leu Lys
310 315 320
gtc atg ggc agc agt tgt ccc tct tgc cac tat ccc tgt ttt cct act 1126
Val Met Gly Ser Ser Cys Pro Ser Cys His Tyr Pro Cys Phe Pro Thr
325 330 335
gac ctg gag agt cca gtg aag tct ttt ctg agc atc ttg aat acc ctg 1174
Asp Leu Glu Ser Pro Val Lys Ser Phe Leu Ser Ile Leu Asn Thr Leu
340 345 350
atg gtg aaa tgc cca gca aag gag tgc aac gag gag atc agc ttg gaa 1222
Met Val Lys Cys Pro Ala Lys Glu Cys Asn Glu Glu Ile Ser Leu Glu
355 360 365 370
aaa tat aat cac cat atc tca agc cac aag gag tcg aag gag aca ttt 1270
Lys Tyr Asn His His Ile Ser Ser His Lys Glu Ser Lys Glu Thr Phe
375 380 385
gtg cat att aat aaa ggg ggc cgg ccc cgc cag cat ctc ctg tcc ctg 1318
Val His Ile Asn Lys Gly Gly Arg Pro Arg Gln His Leu Leu Ser Leu
390 395 400
acg cgg agg gct cag aaa cac cgt ctg agg gag ctc aag ctg caa gtc 1366
Thr Arg Arg Ala Gln Lys His Arg Leu Arg Glu Leu Lys Leu Gln Val
405 410 415
aag gcc ttc gcc gac aaa gaa gaa ggt ggc gat gtg aag tca gtg tgc 1414
Lys Ala Phe Ala Asp Lys Glu Glu Gly Gly Asp Val Lys Ser Val Cys
420 425 430
ctg acc ttg ttc ctg cta gtg ctg agg gcg agg aat gag cac aga caa 1462
Leu Thr Leu Phe Leu Leu Val Leu Arg Ala Arg Asn Glu His Arg Gln
435 440 445 450
gct gac gag ctg gag gcc atc atg cga ggc cag ggc tcc ggc ctg cag 1510
Ala Asp Glu Leu Glu Ala Ile Met Arg Gly Gln Gly Ser Gly Leu Gln
455 460 465
cct gct gtt tgc ttg gcc atc cgc gtc aac acc ttc ctc agc tgc agc 1558
Pro Ala Val Cys Leu Ala Ile Arg Val Asn Thr Phe Leu Ser Cys Ser
470 475 480

cag tac cac aag atg tac agg act gtg aag gcc atc acg ggc agg cag 1606
Gln Tyr His Lys Met Tyr Arg Thr Val Lys Ala Ile Thr Gly Arg Gln
485 490 495
att ttc cag cct ttg cat gcc ctt cgg aat gcg gag aag gtc ctt ctg 1654
Ile Phe Gln Pro Leu His Ala Leu Arg Asn Ala Glu Lys Val Leu Leu
500 505 510
ccc ggc tac cac ccc ttc gag tgg cag cca cct ctg aag aat gtg tct 1702
Pro Gly Tyr His Pro Phe Glu Trp Gln Pro Pro Leu Lys Asn Val Ser
515 520 525 530
tcc agc aca gac gtg ggc att att gat ggg ctg tct gga ctc tcc tcc 1750
Ser Ser Thr Asp Val Gly Ile Ile Asp Gly Leu Ser Gly Leu Ser Ser
535 540 545
tct gtg gac gat tac cca gtg gac acc att gcc aag cgc ttc cgc tat 1798
Ser Val Asp Asp Tyr Pro Val Asp Thr Ile Ala Lys Arg Phe Arg Tyr
550 555 560
gac tcg gct ctg gtg tcc gct ctc atg gac atg gaa gaa gac atc ctg 1846
Asp Ser Ala Leu Val Ser Ala Leu Met Asp Met Glu Glu Asp Ile Leu
565 570 575
gag ggt atg aga gcc caa gac ctt gac gac tac ctg aat ggc ccc ttc 1894
Glu Gly Met Arg Ala Gln Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Asn Gly Pro Phe
580 585 590

act gtg gtg gtg aag gag tct tgt gat ggg atg gga gac gtg agt gag 1942
Thr Val Val Val Lys Glu Ser Cys Asp Gly Met Gly Asp Val Ser Glu
595 600 605 610
aag cac ggc agt ggg ccg gtc gtg ccg gaa aag gcc gtt cgg ttt tcc 1990
Lys His Gly Ser Gly Pro Val Val Pro Glu Lys Ala Val Arg Phe Ser
615 620 625
ttc aca gtc atg aaa atc acc atc gca cac ggg tca cag aac gtg aag 2038
Phe Thr Val Met Lys Ile Thr Ile Ala His Gly Ser Gln Asn Val Lys
630 635 640
gtg ttt gag gaa gcc aag cct aac tct gaa cta tgc tgc aag ccc ttg 2086
Val Phe Glu Glu Ala Lys Pro Asn Ser Glu Leu Cys Cys Lys Pro Leu
645 650 655
tgc ctc atg ctg gcc gac gaa tcc gac cat gag acc ctg acg gcc atc 2134
Cys Leu Met Leu Ala Asp Glu Ser Asp His Glu Thr Leu Thr Ala Ile
660 665 670
ctg agc cct ctc att gcc gag agg gag gcc atg aag agc agc cag cta 2182
Leu Ser Pro Leu Ile Ala Glu Arg Glu Ala Met Lys Ser Ser Gln Leu
675 680 685 690
atg ctg gag atg gga ggc atc ctc cgg act ttc aag ttc atc ttc agg 2230
Met Leu Glu Met Gly Gly Ile Leu Arg Thr Phe Lys Phe Ile Phe Arg
695 700 705
ggc acc gga tat gat gag aaa ctg gtc cgg gaa gtg gaa ggc ctt gag 2278
Gly Thr Gly Tyr Asp Glu Lys Leu Val Arg Glu Val Glu Gly Leu Glu
710 715 720
gct tct ggc tct gtc tac atc tgt acc ctc tgt gat gcc acc cgc ctg 2326
Ala Ser Gly Ser Val Tyr Ile Cys Thr Leu Cys Asp Ala Thr Arg Leu
725 730 735
gaa gcc tct caa aat ctg gtc ttc cac tcc ata acc aga agc cac gcg 2374
Glu Ala Ser Gln Asn Leu Val Phe His Ser Ile Thr Arg Ser His Ala
740 745 750
gag aat ttg gag cgc tat gag gtc tgg cgt tcc aac cca tac cat gag 2422
Glu Asn Leu Glu Arg Tyr Glu Val Trp Arg Ser Asn Pro Tyr His Glu
755 760 765 770
acg gtg gat gaa ctt cgg gac cgg gtg aaa ggg gtc tcg gcc aaa ccc 2470
Thr Val Asp Glu Leu Arg Asp Arg Val Lys Gly Val Ser Ala Lys Pro
775 780 785
ttc att gag acg gtg cct tcc ata gat gcc ctc cac tgt gac att ggc 2518
Phe Ile Glu Thr Val Pro Ser Ile Asp Ala Leu His Cys Asp Ile Gly
790 795 800
aat gca gcc gag ttt tac aag att ttc cag ctc gag ata ggg gag gcg 2566
Asn Ala Ala Glu Phe Tyr Lys Ile Phe Gln Leu Glu Ile Gly Glu Ala
805 810 815
tat aag aac ccc cat gcc tcc aag gag gaa agg aag aga tgg cag gcg 2614
Tyr Lys Asn Pro His Ala Ser Lys Glu Glu Arg Lys Arg Trp Gln Ala
820 825 830
acc ttg gac aag cac ctc cgc aag aag atg aat ctg aag ccc atc atg 2662
Thr Leu Asp Lys His Leu Arg Lys Lys Met Asn Leu Lys Pro Ile Met
835 840 845 850
aga atg aat ggc aac ttt gcc agg aag ctc atg acc aaa gag act gtg 2710
Arg Met Asn Gly Asn Phe Ala Arg Lys Leu Met Thr Lys Glu Thr Val
855 860 865
gaa gca gtc tgt gag tta att ccc tcc gag gag agg cat gaa gct ctg 2758
Glu Ala Val Cys Glu Leu Ile Pro Ser Glu Glu Arg His Glu Ala Leu
870 875 880
agg gaa ctg atg gac ctt tac ctg aag atg aag ccc gtc tgg cga tca 2806
Arg Glu Leu Met Asp Leu Tyr Leu Lys Met Lys Pro Val Trp Arg Ser
885 890 895
tca tgc cct gct aaa gag tgc ccg gaa tcc ctc tgc cag tat agt ttc 2854
Ser Cys Pro Ala Lys Glu Cys Pro Glu Ser Leu Cys Gln Tyr Ser Phe
900 905 910
aat tca cag cgt ttt gct gag ctc ctc tcc acc aag ttc aag tac aga 2902
Asn Ser Gln Arg Phe Ala Glu Leu Leu Ser Thr Lys Phe Lys Tyr Arg
915 920 925 930
tat gag ggc aaa atc acc aat tat ttt cac aag aca ctg gcc cac gtc 2950
Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Asn Tyr Phe His Lys Thr Leu Ala His Val
935 940 945

ccg gaa att atc gag agg gac ggc tcc att ggg gca tgg gct agc gag 2998
Pro Glu Ile Ile Glu Arg Asp Gly Ser Ile Gly Ala Trp Ala Ser Glu
950 955 960
gga aat gag tct ggg aac aag ctg ttc agg cgc ttc cga aaa atg aat 3046
Gly Asn Glu Ser Gly Asn Lys Leu Phe Arg Arg Phe Arg Lys Met Asn
965 970 975
gcc agg cag tcc aag tac tat gaa atg gaa gat gtt ttg aaa cat cac 3094
Ala Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Glu Met Glu Asp Val Leu Lys His His
980 985 990
tgg ttg tac acc tcc aaa tac ctg cag aag ttt atg aat gct cat aaa 3142
Trp Leu Tyr Thr Ser Lys Tyr Leu Gln Lys Phe Met Asn Ala His Lys
995 1000 1005 1010
gca ttt aaa aac tca ggg ttt acc ata aac ttg cag aga agc tca ggg 3190
Ala Phe Lys Asn Ser Gly Phe Thr Ile Asn Leu Gln Arg Ser Ser Gly
1015 1020 1025
gac aca tta gac cta gag aac tct cca gaa tct caa gat ttg atg gaa 3238
Asp Thr Leu Asp Leu Glu Asn Ser Pro Glu Ser Gln Asp Leu Met Glu
1030 1035 1040
ttt taa gcaggga agttgcctag gcattggttt tgcaaatggg ttttctctgg 3291

Phe

gttgcatgga gagcttctcc tggcaccctt aactcctggg tgtggggctt caccacccaa 3351
gtggtggtag gttgatgagg ccagagatgg tgaacccatg tcgggaatag gtaactggtg 3411
agccgattgc ttgagctgtt tagggagttc agaaaagcaa taggagaaac cagttatttg 3471
aaagctccat agctgagaac aggggtaact gcaggggacc agaggtgaac aaagatgtgt 3531
ggagaggatt gagtgatgcc aaagtcaaag ccaaggttgt caaaggacag ccagtgaagc 3591
cagaaaggaa tttgacttgt ggtttccatt ccccctgccc aagttattct agtttatact 3651
gagaggtgtt tttcatatca cttttgtaga attttttatt ttataaattt cacatatttt 3711
ggcttatttt acaagattta aaaaaggttt tcaagaattc ccgctgtggc acaatgtggc 3771
atcttgggag tgctgggaca caggttccat ccccagcctg gcgtggtggg ttaaggatcc 3831
<210> 3
<211> 1043
<212> PRT
<213> Sus.scrofa
<400> 3
Met Ala Val Ser Leu Pro Pro Thr Leu Gly Leu Ser Ser Ala Pro Asp
1 5 10 15

Glu Ile Gln His Pro His Ile Lys Phe Ser Glu Trp Lys Phe Lys Leu
20 25 30
Phe Arg Val Arg Ser Phe Glu Lys Ala Pro Glu Lys Ala Gln Thr Glu
35 40 45
Lys Gln Asp Ser Ser Glu Gly Lys Pro Ser Leu Glu Gln Ser Pro Ala
50 55 60
Val Leu Asp Lys Pro Gly Gly Gln Lys Ser Ala Leu Pro Gln Pro Ala
65 70 75 80
Phe Lys Pro His Pro Lys Phe Leu Lys Glu Ser His Glu Asp Gly Lys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Ala Ile His Gln Ala Asn Leu Arg Arg Leu Cys Arg
100 105 110
Ile Cys Gly Asn Ser Phe Asn Thr Thr Gly His Lys Arg Arg Tyr Pro
115 120 125
Val His Gly Pro Val Asp Gly Lys Thr Gln Val Leu Leu Arg Lys Lys
130 135 140
Glu Lys Arg Ala Thr Ser Trp Pro Asp Leu Ile Ala Lys Val Phe Arg
145 150 155 160
Ile Asp Val Lys Ala Asp Val Asp Ser Ile His Pro Thr Glu Phe Cys
165 170 175

His Asn Cys Trp Ser Phe Met His Arg Lys Phe Ser Ser Thr Pro Cys
180 185 190
Glu Val Tyr Ser Pro Arg Asn Ala Ala Met Glu Trp His Pro His Thr
195 200 205
Leu Asn Cys Asp Ile Cys His Ile Ala Arg Arg Gly Leu Lys Arg Lys
210 215 220
Ser Gln Gln Pro Asn Met Gln Leu Ser Lys Lys Leu Lys Thr Val Ile
225 230 235 240
Asp Arg Ala Arg Gln Ala Arg Gln Arg Lys Arg Arg Ala Gln Ala Arg
245 250 255
Ile Ser Ser Lys Glu Leu Met Lys Lys Ile Ala Asn Cys Gly Gln Ile
260 265 270
His Leu Ser Pro Lys Leu Leu Ala Val Asp Phe Pro Ala His Phe Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Cys Gln Ile Cys Glu His Ile Leu Ala Asp Pro Val
290 295 300
Glu Thr Ser Cys Lys His Val Phe Cys Arg Ile Cys Ile Leu Arg Cys
305 310 315 320
Leu Lys Val Met Gly Ser Ser Cys Pro Ser Cys His Tyr Pro Cys Phe
325 330 335
Pro Thr Asp Leu Glu Ser Pro Val Lys Ser Phe Leu Ser Ile Leu Asn
340 345 350
Thr Leu Met Val Lys Cys Pro Ala Lys Glu Cys Asn Glu Glu Ile Ser
355 360 365
Leu Glu Lys Tyr Asn His His Ile Ser Ser His Lys Glu Ser Lys Glu
370 375 380
Thr Phe Val His Ile Asn Lys Gly Gly Arg Pro Arg Gln His Leu Leu
385 390 395 400
Ser Leu Thr Arg Arg Ala Gln Lys His Arg Leu Arg Glu Leu Lys Leu
405 410 415
Gln Val Lys Ala Phe Ala Asp Lys Glu Glu Gly Gly Asp Val Lys Ser
420 425 430
Val Cys Leu Thr Leu Phe Leu Leu Val Leu Arg Ala Arg Asn Glu His
435 440 445
Arg Gln Ala Asp Glu Leu Glu Ala Ile Met Arg Gly Gln Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Gln Pro Ala Val Cys Leu Ala Ile Arg Val Asn Thr Phe Leu Ser
465 470 475 480

Cys Ser Gln Tyr His Lys Met Tyr Arg Thr Val Lys Ala Ile Thr Gly
485 490 495
Arg Gln Ile Phe Gln Pro Leu His Ala Leu Arg Asn Ala Glu Lys Val
500 505 510
Leu Leu Pro Gly Tyr His Pro Phe Glu Trp Gln Pro Pro Leu Lys Asn
515 520 525
Val Ser Ser Ser Thr Asp Val Gly Ile Ile Asp Gly Leu Ser Gly Leu
530 535 540
Ser Ser Ser Val Asp Asp Tyr Pro Val Asp Thr Ile Ala Lys Arg Phe
545 550 555 560
Arg Tyr Asp Ser Ala Leu Val Ser Ala Leu Met Asp Met Glu Glu Asp
565 570 575
Ile Leu Glu Gly Met Arg Ala Gln Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Asn Gly
580 585 590
Pro Phe Thr Val Val Val Lys Glu Ser Cys Asp Gly Met Gly Asp Val
595 600 605
Ser Glu Lys His Gly Ser Gly Pro Val Val Pro Glu Lys Ala Val Arg
610 615 620
Phe Ser Phe Thr Val Met Lys Ile Thr Ile Ala His Gly Ser Gln Asn
625 630 635 640

Val Lys Val Phe Glu Glu Ala Lys Pro Asn Ser Glu Leu Cys Cys Lys
645 650 655
Pro Leu Cys Leu Met Leu Ala Asp Glu Ser Asp His Glu Thr Leu Thr
660 665 670
Ala Ile Leu Ser Pro Leu Ile Ala Glu Arg Glu Ala Met Lys Ser Ser
675 680 685
Gln Leu Met Leu Glu Met Gly Gly Ile Leu Arg Thr Phe Lys Phe Ile
690 695 700
Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Asp Glu Lys Leu Val Arg Glu Val Glu Gly
705 710 715 720
Leu Glu Ala Ser Gly Ser Val Tyr Ile Cys Thr Leu Cys Asp Ala Thr
725 730 735
Arg Leu Glu Ala Ser Gln Asn Leu Val Phe His Ser Ile Thr Arg Ser
740 745 750
His Ala Glu Asn Leu Glu Arg Tyr Glu Val Trp Arg Ser Asn Pro Tyr
755 760 765
His Glu Thr Val Asp Glu Leu Arg Asp Arg Val Lys Gly Val Ser Ala
770 775 780
Lys Pro Phe Ile Glu Thr Val Pro Ser Ile Asp Ala Leu His Cys Asp
785 790 795 800
Ile Gly Asn Ala Ala Glu Phe Tyr Lys Ile Phe Gln Leu Glu Ile Gly
805 810 815
Glu Ala Tyr Lys Asn Pro His Ala Ser Lys Glu Glu Arg Lys Arg Trp
820 825 830
Gln Ala Thr Leu Asp Lys His Leu Arg Lys Lys Met Asn Leu Lys Pro
835 840 845
Ile Met Arg Met Asn Gly Asn Phe Ala Arg Lys Leu Met Thr Lys Glu
850 855 860
Thr Val Glu Ala Val Cys Glu Leu Ile Pro Ser Glu Glu Arg His Glu
865 870 875 880
Ala Leu Arg Glu Leu Met Asp Leu Tyr Leu Lys Met Lys Pro Val Trp
885 890 895
Arg Ser Ser Cys Pro Ala Lys Glu Cys Pro Glu Ser Leu Cys Gln Tyr
900 905 910
Ser Phe Asn Ser Gln Arg Phe Ala Glu Leu Leu Ser Thr Lys Phe Lys
915 920 925
Tyr Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Asn Tyr Phe His Lys Thr Leu Ala
930 935 940

His Val Pro Glu Ile Ile Glu Arg Asp Gly Ser Ile Gly Ala Trp Ala
945 950 955 960
Ser Glu Gly Asn Glu Ser Gly Asn Lys Leu Phe Arg Arg Phe Arg Lys
965 970 975
Met Asn Ala Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Glu Met Glu Asp Val Leu Lys
980 985 990
His His Trp Leu Tyr Thr Ser Lys Tyr Leu Gln Lys Phe Met Asn Ala
995 1000 1005
His Lys Ala Phe Lys Asn Ser Gly Phe Thr Ile Asn Leu Gln Arg Ser
1010 1015 1020
Ser Gly Asp Thr Leu Asp Leu Glu Asn Ser Pro Glu Ser Gln Asp Leu
1025 1030 1035 1040

0063

図1RAG-1遺伝子がサブクローンされたベクターを示す図である。KはKpnI、XはXhoI、SはSacI、HはHincII、BはBamHI、NはNotIを示す。
図2RAG-1遺伝子領域の遺伝子地図を示す図である。(1)の斜線で示したボックスは第一エキソン、(2)の斜線で示したボックスは第二エキソン、(1)と(2)の間の領域がイントロンを示す。(3)の太線はクローニングのために新規考案作製したプローブ(RAG-1小板橋プローブ)として用いた領域、(4)の太線はBACからサブクローニングのためにプローブ(イントロン5’上流プローブ)として用いた領域を示す。また、(A)(B)間の領域はClawn-genome-BamHIサブクローン部分、(C)(D)間の領域はBAC-SacIサブクローン部分を示す。
図3ターゲティングベクター、および、RAG-1遺伝子のターゲティング前後のRAG-1遺伝子領域の遺伝子地図を示す図である。KはKpnI、XはXhoI、SはSacI、HはHincII、BはBamHI、SalはSalI、NはNotIを示す。
図4RAG-1遺伝子ターゲティングベクターの構築過程を示す図である。KはKpnI、XはXhoI、SはSacI、HはHincII、BはBamHI、SalはSalI、NはNotIを示す。

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