図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2003年7月9日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (4)

目的

副作用の危険性なしに腹膜中皮細胞再生を促すことを可能とする腹膜保護剤または腹膜保護液を提供することにある。

解決手段

腹膜中皮細胞に対して増殖活性遊走活性もしくは接着活性のいずれか、またはこれらの2つ以上の活性をかねそなえた生理活性ポリペプチドコラーゲン結合性ポリペプチドを結合したコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドを含有する。

概要

背景

腎不全患者に対する透析療法は、主に血液透析腹膜透析の2種類の方法が知られている。腹膜透析療法は、腹腔留置したカテーテルを通して腹腔内に高浸透圧透析液注入し、一定時間腹腔内に貯留することで生体内の余分な水と老廃物透析液中移行させ、再びカテーテルを通して透析液を体外へ排出することで実施される。この腹膜透析は血液透析に比べ、残存腎機能の保持、中分子量物質透析効率、社会復帰性等の面で優れている。しかし、腹膜透析は血液透析に比べ利点があるにもかかわらず、その普及率は全透析患者の5から6%程度にとどまっている。この原因として、腹膜透析療法の長期継続により腹膜機能低下に陥り、良好な除水や老廃物の除去が困難となることがあげられる。腹膜機能低下の原因として、腹膜透析液の低pH、高濃度ブドウ糖、高浸透圧、ブドウ糖分解物、さらに腹膜透析液の注廃液に伴う腹膜への機械的ストレスなどが問題視されている。このような透析液の非生理的因子や機械的ストレスに由来する刺激が長期間繰り返されることによる腹膜中皮細胞の損傷、基底膜からの脱落、腹膜中皮細胞再生阻害、腹膜の線維化という一連組織傷害に伴い腹膜機能低下が引き起こされることが指摘されている(Di Paolo N, et al., Nephron, 74, 594, 1996、Slater ND, et al., Nephron, 58, 466, 1991、Schneble F, et al., Pediatr Nephrol, 6, 542, 1992)。

また、腹膜透析患者は腹腔内への腹膜透析液の注廃液を毎日繰り返すため、腹腔内への細菌感染リスクが高く腹膜炎発症することが多い。この腹膜炎の発症に伴い、腹膜中皮細胞の脱落、腹膜の線維化といった一連の腹膜傷害が起き、腹膜機能低下が引き起こされることも多い。腹膜機能低下に対しては、より高濃度のブドウ糖を添加した高浸透圧の腹膜透析液を使用することで、適正な透析効率を確保する事が必要となる。しかし、このことで腹膜組織への傷害は増加し、腹膜機能低下に拍車がかかるという悪循環を招くことになる。現在、腹膜機能低下を予防するため、様々な着眼点で研究が進められている。この一つとして、腹膜透析液中の非生理的因子を除去する検討が進められ、従来よりも生体適合性が高い透析液が使用され始めている。例えば、低pHの影響を軽減するため、pHを中性付近にした腹膜透析液が開発されている。この中性化腹膜透析液の使用により腹膜機能低下が抑制され、腹膜透析可能期間の延長が期待できる。また、腹膜透析液中のブドウ糖分解物の量を低減する方法も検討されており、システインを加え加熱滅菌することでブドウ糖分解物(3-DG)の産生を防ぐ方法が見い出されている(特開平5-105633)。この他に、腹膜透析液中のブドウ糖分解物を低減する方法として、ブドウ糖以外の浸透圧物質も検討されている。例えば、グリセロールソルビトールキシリトールフルクトースグルコースポリマーゼラチンポリカチオンデキストランポリペプチド等がある。

以上のように腹膜透析液の生体適合性を向上させる工夫が行われているが、長期間の腹膜透析による腹膜機能低下への危惧が完全に解消されたとは言い難い。腹膜中皮細胞の保護、再生を促す透析液添加剤についての検討も行われており、ヒアルロン酸分解産物等について報告されている(特開平8-337590)。しかし、腹膜中皮細胞を保護、再生し腹膜機能低下を防ぐ腹膜保護剤は、実用化には至っていない。

一方、開腹手術後癒着は、腸管癒着においては腸閉塞消化管機能異常などの原因となり、婦人科領域の癒着においては不妊症の原因となるなど、非常に悩ましい合併症である。術後の腸管癒着の発生頻度については、開腹歴のある症例の93%に認められることが報告されている(Menzies D., et al., Ann R Coll Surg Engl , 72, 60, 1990)。また、全開手術例の 5 から8 % 程度に腸管癒着のために再入院が必要となり、3.8%から4% 程度に外科治療が必要であったと報告されている(Holmdahl L., et al., Eur J Surg., 163, 169, 1997、Ellis H., et al., Lancet, 353, 1476, 1999)。婦人科領域では、術後癒着の発生率は70%以上と非常に高いことも報告されている(佐孝道 ら,産婦実際, 39, 347,1990、川内博人, 日不妊会誌, 33, 250, 1988)。現在癒着を予防する方法としては、大量の生理的食塩水による洗浄または副腎皮質ステロイド剤ヘパリン組織プラスミノーゲン活性化因子等の癒着防止剤腹腔内投与または酸化再生セルロース膜、シリコンラバー製薄膜カルボキシメチルセルロースヒアルロン酸ナトリウムセルロース化学修飾した合成吸収性癒着防止剤等の癒着防止物理的バリアの装着が知られている。しかし、癒着防止剤の使用は一般的とはなっておらず、癒着防止用物理的バリアについては、酸化再生セルロース膜は血液存在下での効果の低下、シリコンラバーシート非吸収性のため外科抜去を必要とする等の欠点がある。また、カルボキシメチルセルロースにヒアルロン酸ナトリウムとセルロースを化学修飾した合成吸収性癒着防止剤は、その貼付部位での癒着の発生率が34%程度であるとの報告があり(藤井 正一ら, 臨床外科,55, 213, 2000)、完全に癒着を予防するには至っていない。

ところで、細胞成長因子などの生理活性ポリペプチド医薬品として期待されているものが多く創傷治癒剤としての用途が検討されている。例えば、上皮増殖因子(EGF)については上皮細胞血管内皮細胞繊維芽細胞などの増殖促進、血管新生活性などから創傷治癒剤としての用途が期待されている(Ziegler ら編、Growth factors and Wound Healing、第3部、第12章、206〜228頁(1997)、Springer-Verlag、 New York)。また、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)は中胚葉神経外胚葉由来の様々な細胞の増殖分化促進活性、血管内皮細胞、繊維芽細胞、血管平滑筋細胞アストログリア細胞に対する細胞増殖活性細胞遊走活性および血管新生活性など多くの生物活性を有するポリペプチドであり、創傷治癒剤等の用途が期待されている。また、肝細胞増殖因子HGF)についても、上皮系細胞や血管内皮細胞に対して細胞増殖活性、細胞遊走活性、抗アホ゜トーシス作用および形態形成促進活性を有することが知られており、創傷治癒剤としての利用が期待されている。

しかし、一般的に生理活性ポリペプチドは生体内の標的部位局所保持されないことや、他部位での副作用が危惧されるため実用化が困難である場合が多い。このため、生理活性ポリペプチドの効率のよいデリバリー方法の開発が期待されている。この問題を解決する方法として、生理活性ポリペプチドと生体適合性を有する高分子を混合することで、生体内局所で生理活性ポリペプチドを徐放させようと言う検討が行われている。例えば、生理活性ポリペプチドをコラーゲンと混合することにより徐放性を持たせる技術が報告されている(特開平5-43453、特公平4-18865)。しかし、一般にコラーゲンと生理活性ペプチドの親和性は低く、単に両者を混合するだけでは生理活性ペプチドを長期間かつ安定にコラーゲンマトリックスに保持する事は困難である。また、生理活性ポリペプチドとコラーゲンをグルタルアルデヒドなどにより化学結合する方法も試みられているが、この場合生活性ポリペプチド生理活性の低下や消失が起きてしまうという問題がある。また、ターゲット部位によっては生理活性ポリペプチドと生体適合性を有する高分子の混合物局所投与する事は困難であり、腹膜機能低下に利用する場合この方法は適当とは言えない。

この他に前述の問題を解決する方法として、遺伝子組み換え技術により、異なる機能をもつポリペプチドを組み合わせたハイブリッドポリペプチドについて検討がされている。例えば、細胞外マトリックス成分の一つであるフィブロネクチン(FN)の細胞接着ドメイン配列とbFGFとをハイブリッド化した機能性ポリペプチドについての報告がある(特開平5-178897)。また、細胞外マトリックスを介しての徐放効果をねらったものとしては、ウシフォンビルブランド因子由来のデカペプチドトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)とのハイブリッドポリペプチド(USP 5, 800, 811、Tuan, et al., Connective Tissue Reserch, 34, 1, 1996、Han B, et al., Protein Expression and Purification, 11, 169, 1997)や、フィブロネクチンのコラーゲン結合ドメインとEGFとのハイブリッドポリペプチドを用いた皮膚の創傷治癒についての検討(Ishikawa T, et al., J Biochem(Tokyo), 129, 627, 2001)、嫌気性グラム陽性桿菌であるクロストリジウムヒストリチカム(Clostridium histolyticum)のコラーゲナーゼ由来のコラーゲン結合性ポリペプチドとbFGFやEGFとのハイブリッドポリペプチドについての検討が行われている(Nishi N, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 7018, 1998)。しかし、このようなハイブリッドポリペプチドによる腹膜中皮細胞の再生に関する検討は行われていない。

概要

副作用の危険性なしに腹膜中皮細胞の再生を促すことを可能とする腹膜保護剤または腹膜保護液を提供することにある。

腹膜中皮細胞に対して増殖活性遊走活性もしくは接着活性のいずれか、またはこれらの2つ以上の活性をかねそなえた生理活性ポリペプチドにコラーゲン結合性ポリペプチドを結合したコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドを含有する。

目的

腹膜透析における腹膜機能低下は長期腹膜透析を困難とし、開腹手術後の癒着は腸閉塞、消化管機能異常、不妊症などの原因となる。本発明は、腹膜透析においては腹膜中皮細胞脱落部分における腹膜中皮細胞の再生を促し、腹膜機能を長期間維持することを可能とし、術後癒着においては、腹膜組織傷害部位で腹膜中皮細胞の再生を促すことで、癒着予防を可能とする腹膜保護剤または腹膜保護液を提供するものである。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

有効成分として、腹膜中皮細胞に対して増殖活性遊走活性もしくは接着活性のいずれか、またはこれらの2つ以上の活性をかねそなえた生理活性ポリペプチドコラーゲン結合性を有するポリペプチドが連結したハイブリッドポリペプチドであって、生理活性およびコラーゲン結合性の両方を有するコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドを含む腹膜保護剤

請求項2

前記生理活性ポリペプチドが上皮増殖因子ファミリー(EGFファミリー)に属し、上皮増殖因子レセプターへの結合能を有する生理活性ポリペプチド、もしくはインターロイキン1β(IL-1β)、インターフェロンγ(IFN-γ)、血小板由来増殖因子(PDGF)、あるいはこれらの生理活性ポリペプチドと相同または1もしくは数個アミノ酸欠失置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる生理活性ポリペプチドである請求項1に記載の腹膜保護剤。

請求項3

前記生理活性ペプチドが上皮増殖因子(EGF)、あるいは該上皮増殖因子と相同または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる生理活性ポリペプチドの配列である請求項2に記載の腹膜保護剤。

請求項4

前記コラーゲン結合性を有するポリペプチドがフィブロネクチン由来のポリペプチドである請求項1〜3のいずれかに記載の腹膜保護剤。

請求項5

フィブロネクチン由来のポリペプチドが、ヒト・フィブロネクチンのAla260からTrp599までのポリペプチドを構成するアミノ酸配列、あるいは該配列と相同または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である請求項4に記載の腹膜保護剤。

請求項6

前記生理活性ポリペプチドが、前記フィブロネクチン由来のポリペプチドのカルボキシル末端に連結されている請求項1〜5のいずれかに記載の腹膜保護剤。

請求項7

前記生理活性ポリペプチドが、前記フィブロネクチン由来のポリペプチドに遺伝子工学的手法により連結されたものである請求項1〜6のいずれかに記載の腹膜保護剤。

請求項8

前記腹膜保護剤が液状である請求項1〜7のいずれかに記載の腹膜保護剤。

請求項9

前記コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドを1nM〜1μMの濃度で含有する請求項8に記載の腹膜保護剤。

請求項10

有効成分として、腹膜中皮細胞に対して増殖活性、遊走活性もしくは接着活性のいずれか、またはこれらの2つ以上の活性をかねそなえた生理活性ポリペプチドとコラーゲン結合性を有するポリペプチドが連結したハイブリッドポリペプチドであって、生理活性およびコラーゲン結合性の両方を有するコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドを含む腹膜透析液

技術分野

0001

本発明は、腹膜中皮細胞再生を促す機能を有する腹膜保護剤または腹膜透析液に関する。より詳しくは、腹膜透析療法においては腹膜中皮細胞の再生を促すことで腹膜機能低下を防止し長期腹膜透析を可能とし、開腹手術においては腹膜中皮細胞の再生を促すことで術後の癒着防止を可能とする腹膜保護剤または腹膜透析液である。

背景技術

0002

腎不全患者に対する透析療法は、主に血液透析と腹膜透析の2種類の方法が知られている。腹膜透析療法は、腹腔留置したカテーテルを通して腹腔内に高浸透圧透析液注入し、一定時間腹腔内に貯留することで生体内の余分な水と老廃物透析液中移行させ、再びカテーテルを通して透析液を体外へ排出することで実施される。この腹膜透析は血液透析に比べ、残存腎機能の保持、中分子量物質透析効率、社会復帰性等の面で優れている。しかし、腹膜透析は血液透析に比べ利点があるにもかかわらず、その普及率は全透析患者の5から6%程度にとどまっている。この原因として、腹膜透析療法の長期継続により腹膜機能低下に陥り、良好な除水や老廃物の除去が困難となることがあげられる。腹膜機能低下の原因として、腹膜透析液の低pH、高濃度ブドウ糖、高浸透圧、ブドウ糖分解物、さらに腹膜透析液の注廃液に伴う腹膜への機械的ストレスなどが問題視されている。このような透析液の非生理的因子や機械的ストレスに由来する刺激が長期間繰り返されることによる腹膜中皮細胞の損傷、基底膜からの脱落、腹膜中皮細胞再生阻害、腹膜の線維化という一連組織傷害に伴い腹膜機能低下が引き起こされることが指摘されている(Di Paolo N, et al., Nephron, 74, 594, 1996、Slater ND, et al., Nephron, 58, 466, 1991、Schneble F, et al., Pediatr Nephrol, 6, 542, 1992)。

0003

また、腹膜透析患者は腹腔内への腹膜透析液の注廃液を毎日繰り返すため、腹腔内への細菌感染リスクが高く腹膜炎発症することが多い。この腹膜炎の発症に伴い、腹膜中皮細胞の脱落、腹膜の線維化といった一連の腹膜傷害が起き、腹膜機能低下が引き起こされることも多い。腹膜機能低下に対しては、より高濃度のブドウ糖を添加した高浸透圧の腹膜透析液を使用することで、適正な透析効率を確保する事が必要となる。しかし、このことで腹膜組織への傷害は増加し、腹膜機能低下に拍車がかかるという悪循環を招くことになる。現在、腹膜機能低下を予防するため、様々な着眼点で研究が進められている。この一つとして、腹膜透析液中の非生理的因子を除去する検討が進められ、従来よりも生体適合性が高い透析液が使用され始めている。例えば、低pHの影響を軽減するため、pHを中性付近にした腹膜透析液が開発されている。この中性化腹膜透析液の使用により腹膜機能低下が抑制され、腹膜透析可能期間の延長が期待できる。また、腹膜透析液中のブドウ糖分解物の量を低減する方法も検討されており、システインを加え加熱滅菌することでブドウ糖分解物(3-DG)の産生を防ぐ方法が見い出されている(特開平5-105633)。この他に、腹膜透析液中のブドウ糖分解物を低減する方法として、ブドウ糖以外の浸透圧物質も検討されている。例えば、グリセロールソルビトールキシリトールフルクトースグルコースポリマーゼラチンポリカチオンデキストランポリペプチド等がある。

0004

以上のように腹膜透析液の生体適合性を向上させる工夫が行われているが、長期間の腹膜透析による腹膜機能低下への危惧が完全に解消されたとは言い難い。腹膜中皮細胞の保護、再生を促す透析液添加剤についての検討も行われており、ヒアルロン酸分解産物等について報告されている(特開平8-337590)。しかし、腹膜中皮細胞を保護、再生し腹膜機能低下を防ぐ腹膜保護剤は、実用化には至っていない。

0005

一方、開腹手術後癒着は、腸管癒着においては腸閉塞消化管機能異常などの原因となり、婦人科領域の癒着においては不妊症の原因となるなど、非常に悩ましい合併症である。術後の腸管癒着の発生頻度については、開腹歴のある症例の93%に認められることが報告されている(Menzies D., et al., Ann R Coll Surg Engl , 72, 60, 1990)。また、全開手術例の 5 から8 % 程度に腸管癒着のために再入院が必要となり、3.8%から4% 程度に外科治療が必要であったと報告されている(Holmdahl L., et al., Eur J Surg., 163, 169, 1997、Ellis H., et al., Lancet, 353, 1476, 1999)。婦人科領域では、術後癒着の発生率は70%以上と非常に高いことも報告されている(佐孝道 ら,産婦実際, 39, 347,1990、川内博人, 日不妊会誌, 33, 250, 1988)。現在癒着を予防する方法としては、大量の生理的食塩水による洗浄または副腎皮質ステロイド剤ヘパリン組織プラスミノーゲン活性化因子等の癒着防止剤腹腔内投与または酸化再生セルロース膜、シリコンラバー製薄膜カルボキシメチルセルロースヒアルロン酸ナトリウムセルロース化学修飾した合成吸収性癒着防止剤等の癒着防止用物理的バリアの装着が知られている。しかし、癒着防止剤の使用は一般的とはなっておらず、癒着防止用物理的バリアについては、酸化再生セルロース膜は血液存在下での効果の低下、シリコンラバーシート非吸収性のため外科抜去を必要とする等の欠点がある。また、カルボキシメチルセルロースにヒアルロン酸ナトリウムとセルロースを化学修飾した合成吸収性癒着防止剤は、その貼付部位での癒着の発生率が34%程度であるとの報告があり(藤井 正一ら, 臨床外科,55, 213, 2000)、完全に癒着を予防するには至っていない。

0006

ところで、細胞成長因子などの生理活性ポリペプチド医薬品として期待されているものが多く創傷治癒剤としての用途が検討されている。例えば、上皮増殖因子(EGF)については上皮細胞血管内皮細胞繊維芽細胞などの増殖促進、血管新生活性などから創傷治癒剤としての用途が期待されている(Ziegler ら編、Growth factors and Wound Healing、第3部、第12章、206〜228頁(1997)、Springer-Verlag、 New York)。また、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)は中胚葉神経外胚葉由来の様々な細胞の増殖分化促進活性、血管内皮細胞、繊維芽細胞、血管平滑筋細胞アストログリア細胞に対する細胞増殖活性細胞遊走活性および血管新生活性など多くの生物活性を有するポリペプチドであり、創傷治癒剤等の用途が期待されている。また、肝細胞増殖因子HGF)についても、上皮系細胞や血管内皮細胞に対して細胞増殖活性、細胞遊走活性、抗アホ゜トーシス作用および形態形成促進活性を有することが知られており、創傷治癒剤としての利用が期待されている。

0007

しかし、一般的に生理活性ポリペプチドは生体内の標的部位局所保持されないことや、他部位での副作用が危惧されるため実用化が困難である場合が多い。このため、生理活性ポリペプチドの効率のよいデリバリー方法の開発が期待されている。この問題を解決する方法として、生理活性ポリペプチドと生体適合性を有する高分子を混合することで、生体内局所で生理活性ポリペプチドを徐放させようと言う検討が行われている。例えば、生理活性ポリペプチドをコラーゲンと混合することにより徐放性を持たせる技術が報告されている(特開平5-43453、特公平4-18865)。しかし、一般にコラーゲンと生理活性ペプチドの親和性は低く、単に両者を混合するだけでは生理活性ペプチドを長期間かつ安定にコラーゲンマトリックスに保持する事は困難である。また、生理活性ポリペプチドとコラーゲンをグルタルアルデヒドなどにより化学結合する方法も試みられているが、この場合生活性ポリペプチド生理活性の低下や消失が起きてしまうという問題がある。また、ターゲット部位によっては生理活性ポリペプチドと生体適合性を有する高分子の混合物局所投与する事は困難であり、腹膜機能低下に利用する場合この方法は適当とは言えない。

0008

この他に前述の問題を解決する方法として、遺伝子組み換え技術により、異なる機能をもつポリペプチドを組み合わせたハイブリッドポリペプチドについて検討がされている。例えば、細胞外マトリックス成分の一つであるフィブロネクチン(FN)の細胞接着ドメイン配列とbFGFとをハイブリッド化した機能性ポリペプチドについての報告がある(特開平5-178897)。また、細胞外マトリックスを介しての徐放効果をねらったものとしては、ウシフォンビルブランド因子由来のデカペプチドトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)とのハイブリッドポリペプチド(USP 5, 800, 811、Tuan, et al., Connective Tissue Reserch, 34, 1, 1996、Han B, et al., Protein Expression and Purification, 11, 169, 1997)や、フィブロネクチンのコラーゲン結合ドメインとEGFとのハイブリッドポリペプチドを用いた皮膚の創傷治癒についての検討(Ishikawa T, et al., J Biochem(Tokyo), 129, 627, 2001)、嫌気性グラム陽性桿菌であるクロストリジウムヒストリチカム(Clostridium histolyticum)のコラーゲナーゼ由来のコラーゲン結合性ポリペプチドとbFGFやEGFとのハイブリッドポリペプチドについての検討が行われている(Nishi N, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 7018, 1998)。しかし、このようなハイブリッドポリペプチドによる腹膜中皮細胞の再生に関する検討は行われていない。

発明が解決しようとする課題

0009

腹膜透析における腹膜機能低下は長期腹膜透析を困難とし、開腹手術後の癒着は腸閉塞、消化管機能異常、不妊症などの原因となる。本発明は、腹膜透析においては腹膜中皮細胞脱落部分における腹膜中皮細胞の再生を促し、腹膜機能を長期間維持することを可能とし、術後癒着においては、腹膜組織傷害部位で腹膜中皮細胞の再生を促すことで、癒着予防を可能とする腹膜保護剤または腹膜保護液を提供するものである。

課題を解決するための手段

0010

本発明者は、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、生理活性ポリペプチドにコラーゲン結合性を付与したハイブリッド生理活性ポリペプチドが、腹膜中皮細胞が脱落しコラーゲンが露出した部位に局在し腹膜中皮細胞の再生を促すことを考案し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明の主旨は以下の通りである。
(1) 有効成分として、腹膜中皮細胞に対して増殖活性遊走活性もしくは接着活性のいずれか、またはこれらの2つ以上の活性をかねそなえた生理活性ポリペプチドとコラーゲン結合性を有するポリペプチドが連結したハイブリッドポリペプチドであって、生理活性およびコラーゲン結合性の両方を有するコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドを含む腹膜保護剤。
(2) 前記生理活性ポリペプチドが上皮増殖因子ファミリー(EGFファミリー)に属し、上皮増殖因子レセプターへの結合能を有する生理活性ポリペプチド、もしくはインターロイキン1β(IL-1β)、インターフェロンγ(IFN-γ)、血小板由来増殖因子(PDGF)、あるいはこれらの生理活性ポリペプチドと相同または1もしくは数個アミノ酸欠失置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる生理活性ポリペプチドである上記(1)に記載の腹膜保護剤。
(3)前記生理活性ペプチドが上皮増殖因子(EGF)、あるいは該上皮増殖因子と相同または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる生理活性ポリペプチドの配列である上記(2)に記載の腹膜保護剤。

0011

(4)前記コラーゲン結合性を有するポリペプチドがフィブロネクチン由来のポリペプチドである上記(1)〜(3)のいずれかに記載の腹膜保護剤。
(5)フィブロネクチン由来のポリペプチドが、ヒト・フィブロネクチンのAla260からTrp599までのポリペプチドを構成するアミノ酸配列、あるいは該配列と相同または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である上記(4)に記載の腹膜保護剤。
(6)前記生理活性ポリペプチドが、前記フィブロネクチン由来のポリペプチドのカルボキシル末端に連結されている上記(1)〜(5)のいずれかに記載の腹膜保護剤。
(7)前記生理活性ポリペプチドが、前記フィブロネクチン由来のポリペプチドに遺伝子工学的手法により連結されたものである上記(1)〜(6)のいずれかに記載の腹膜保護剤。
(8)前記腹膜保護剤が液状である請求項1〜7のいずれかに記載の腹膜保護剤。
(9)前記コラーゲン結合性生理活性ポリペプチドを1nM〜1μMの濃度で含有する請求項8に記載の腹膜保護剤。

0012

(10)有効成分として、腹膜中皮細胞に対して増殖活性、遊走活性もしくは接着活性のいずれか、またはこれらの2つ以上の活性をかねそなえた生理活性ポリペプチドとコラーゲン結合性を有するポリペプチドが連結したハイブリッドポリペプチドであって、生理活性およびコラーゲン結合性の両方を有するコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドを含む腹膜透析液。
(11) 前記生理活性ポリペプチドが上皮増殖因子ファミリー(EGFファミリー)に属し、上皮増殖因子レセプターへの結合能を有する生理活性ポリペプチド、もしくはインターロイキン1β(IL-1β)、インターフェロンγ(IFN-γ)、血小板由来増殖因子(PDGF)、あるいはこれらの生理活性ポリペプチドと相同または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる生理活性ポリペプチドである上記(10)に記載の腹膜透析液。
(12)前記生理活性ペプチドが上皮増殖因子(EGF)、あるいは該上皮増殖因子と相同または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる生理活性ポリペプチドの配列である上記(11)に記載の腹膜透析液。

0013

(13)前記コラーゲン結合性を有するポリペプチドがフィブロネクチン由来のポリペプチドである上記(11)〜(12)のいずれかに記載の腹膜透析液。
(14)フィブロネクチン由来のポリペプチドが、ヒト・フィブロネクチンのAla260からTrp599までのポリペプチドを構成するアミノ酸配列、あるいは該配列と相同または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である上記(13)に記載の腹膜透析液。
(15)前記生理活性ポリペプチドが、前記フィブロネクチン由来のポリペプチドのカルボキシル末端に連結されている上記(11)〜(14)のいずれかに記載の腹膜透析液。
(16)前記生理活性ポリペプチドが、前記フィブロネクチン由来のポリペプチドに遺伝子工学的手法により連結されたものである上記(11)〜(15)のいずれかに記載の腹膜透析液。

0014

本発明に用いるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドは、コラーゲン結合性を有するポリペプチドと腹膜中皮細胞に対し増殖活性、遊走活性もしくは接着活性のいずれか、またはこれらの2つ以上の活性をかねそなえた生理活性ポリペプチドを連結したハイブリッドポリペプチドであって、コラーゲン結合性および生理活性の両方を有し、コラーゲンと結合後生理活性を示す。本発明に用いるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドのコラーゲン結合性ペプチドとしては、コラーゲン結合性があれば特に限定されるものではないが、ヒト・フィブロネクチンのAla260からTrp599までのポリペプチドを構成するアミノ酸配列、あるいは該配列と相同もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を利用することができる。本発明に用いるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドの生理活性ポリペプチドとしては、腹膜中皮細胞に増殖活性、遊走活性もしくは接着活性のいずれか、または2つ以上の活性を持つ生理活性ペプチドであれば特に限定されるものではないが、上皮増殖因子ファミリー(EGFファミリー)に属し、上皮増殖因子レセプターへの結合能を有する生理活性ポリペプチド、インターロイキン1β(IL-1β)、インターフェロンγ(IFN-γ)、血小板由来増殖因子(PDGF)、あるいはこれらの生理活性ポリペプチドと相同または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる生理活性ポリペプチドの配列を利用することができる。

0015

本腹膜保護剤は、投与時に溶液の形態として投与することができる。溶液とする際には腹腔内に投与できるものであればいかなるものでも良いが、例えば生理的食塩水、リンゲル液を用いることができる。また、本発明の腹膜保護液の場合にも腹腔内に投与できる溶液中、例えば生理的食塩水、リンゲル液に本腹膜保護剤が含有されていればよい。なお、腹膜膜保護液が腹膜透析液である場合は、本腹膜保護剤が加えられている溶液に公知の腹膜透析液の成分組成、すなわち、グルコース等の浸透圧調節物質、各種透析用電解質、アルカリ化剤等が配合されている。本腹膜保護剤における投与濃度、または腹膜保護液中に含まれる前記腹膜保護剤の濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは1nM〜1μMである。投与量は特に限定されるものではないが、8ml/kgから40ml/kg程度が好ましい。

0016

本発明の腹膜保護剤または腹膜透析液の投与方法は特に限定されるものではないが、腹膜透析における腹膜機能低下の予防または治療に用いる場合には、腹膜透析を行うために腹腔に留置したチューブを用い容易に行うことができる。このチューブを用い腹腔内投与し一定時間腹腔内に貯留することにより、腹膜中皮細胞脱落部位に有効成分であるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドが効率的にデリバリーされる。貯留時間は特に限定されるものではないが、好ましくは10分から15分程度である。貯留後は、腹腔に留置したチューブより速やかに本腹膜保護剤または腹膜透析液を排出し、その後生理的食塩水、リンゲル液もしくは公知の腹膜透析液を腹腔内に注入し10分から15分後に廃液し腹腔内を洗浄することが好ましい。このことにより、有効成分であるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドの目的部位以外への拡散を防ぎ、副作用の危険性を回避することができる。本腹膜保護剤または腹膜透析液による腹腔内処理を行った後洗浄操作を行っても、腹膜中皮細胞が脱落しコラーゲンが露出した部位に有効成分であるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドは保持されており、局所で生理活性を発揮することができる。

0017

なお、本腹膜保護剤または腹膜透析液で腹腔内を処理した後、腹膜中皮細胞または腹腔内で腹膜中皮細胞と同等の働きをすることが期待される細胞の腹腔内移植も可能である。

0018

一方、術後癒着の予防に用いる場合は、術後癒着防止のために行われる腹腔内洗浄時、本腹膜保護剤を用いることにより容易に実施可能である。本腹膜保護剤による腹腔内洗浄後、生理的食塩水等による通常の腹腔内洗浄を行うことが好ましい。このことにより、有効成分であるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドの目的部位以外への拡散を防ぎ、副作用の危険性は回避できる。また、洗浄操作を行っても腹膜中皮細胞が脱落しコラーゲンが露出した部位には有効成分であるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドは保持されており、局所で生理活性を発揮することできる。また、本腹膜保護剤での腹腔処理後に、シリコンラバー製シートや合成吸収性癒着防止剤等の、癒着防止用物理的バリアーを装着することも可能である。さらに、本腹膜保護剤で腹腔内を処理した後、腹膜中皮細胞または腹腔内で腹膜中皮細胞と同等の働をすることが期待される細胞を、腹腔内移植する事も可能である。

0019

以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
(実施例1)ヒトフィブロネクチン由来のコラーゲン結合性ポリペプチド(ヒトFNCBD)をコードするcDNAクローニング
ヒト腎臓の細胞から抽出したmRNAテンプレートとしてプライマー1(cgggatcctt actcgagcca ctggatgggg tgggagttgg gctgac)(配列表配列番号1)を用いてcDNAに逆転写し、プライマー1(cgggatcctt actcgagcca ctggatggggtgggagttgg gctgac )(配列表配列番号1)およびプライマー2(gaggtaccatggtacatatg gcagctgttt accaaccgca gcctcaccc )(配列表配列番号2)の1組のプライマーを用いて、プラスミンキモトリプシン限定分解したときの配列に相当するヒトFNCBDをコードするcDNAをPCR増幅させた(RT-PCR)。

0020

プライマー1の塩基番号1〜2は、PCR後のBamHI消化に備えた隣接付加配列、塩基番号3〜8は、クローニング用のBamHI認識配列、塩基番号9〜11は、終止コドンアンチセンス配列、塩基番号12〜17は、EGFのcDNAと連結させるためのXhoI認識配列、塩基番号18〜46は、ヒトFNCBDのcDNAのアンチセンス配列である。プライマー2の塩基番号1 〜2は、PCR後のKpnI消化に備えた隣接付加配列、塩基番号3〜8は、クローニング用のKpnI認識配列、塩基番号7〜12は、NcoI認識配列、塩基番号13〜14は、発現フレーム合わせの配列、塩基番号15〜20は、NdeI認識配列、塩基番号18〜20は、ヒトFNCBDを発現させるための開始コドン配列、塩基番号21〜49は、ヒトFNCBDの塩基配列である。

0021

RT-PCRは、RNALAPCR Kit (AMV) Ver.1.1 (宝酒造)を用いて、まずトータルRNA 0.8μgを20μlの反応液量で60℃で20分間逆転写し、さらに99℃で5分間加温した。得られたcDNAをテンプレートとしたPCR反応は、100μlの反応液量で、94℃で1分間保持した後、94℃で30秒間→63度で1分間→72℃で2分間の温度サイクルを12回繰り返した。反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動解析した結果、約1kbp のDNA断片が認められた。これは、目的とするcDNAに相当するサイズであった。この増幅されたcDNA断片をKpnI及びBamHIで消化後、KpnI及びBamHIで消化したクローニングベクターpBluescriptSKに、25℃で3分間、ライゲーションし(宝酒造製ライゲーションキットVer.2を使用)、pBS(FNCBD) を得た。

0022

(実施例2)ヒトEGFをコードするcDNAのクローニング
ヒト腎臓の細胞より抽出したmRNAをテンプレートとしてプライマー3(gaattcttag cgcagttccc accacttcag)(配列表配列番号3)を用いてcDNAに逆転写し、プライマー3(gaattcttag cgcagttccc accacttcag)(配列表配列番号3)およびプライマー4(gtgtcgacga cgatgataag aatagtgact ctgaatgtcc cctg)(配列表配列番号4)の1組のプライマーを用いてヒトEGFのcDNAをPCR増幅させた。

0023

プライマー3の塩基番号1〜6はクローニング用のEcoRI認識配列、塩基番号7〜9は終止コドンのアンチセンス配列、塩基番号10〜30は、ヒトEGFのcDNAのアンチセンス配列である。プライマー4の塩基番号1〜2はPCR後のSalI消化に備えた隣接付加配列、塩基番号3 〜8 はクローニング用及びFNCBDのcDNAとの連結用SalI認識配列、塩基番号6 〜20はエンテロキナーゼの認識配列(DDDDK)をコードした塩基配列、塩基番号21〜44はヒトEGFのcDNAの塩基配列である。

0024

RT-PCRは、TaKaRa RNA LA PCRTM Kit (AMV) Ver.1.1(宝酒造)を用い、まずテンプレートのトータルRNA1.0μg を反応液量20μlで、60℃30分間逆転写反応させ、99℃で5分間加熱した。PCR反応は、反応液量100μlで94℃で1分間保持した後、94℃で30秒間→65℃で45秒間→72℃で2分間の温度サイクルを35回行った。反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、約150bpのDNA断片が認められた。これは、目的とするに相当するcDNAのサイズであった。このDNA断片をSalI及びEcoRIで消化後、SalI及びEcoRIで消化したpBluescriptSKにライゲーションし、pBS(EGF) を得た。

0025

(実施例3)ヒトFNCBDとEGFとのハイブリッドポリペプチド(コラーゲン結合性上皮増殖因子)の発現ベクターの調製
上記で得られたプラスミドpBS(FNCBD) から、KpnI及びXhoI(部分消化)処理で、挿入されていたFNCBDのDNA断片を切り出し、上記で得られたプラスミドpBS(EGF) のKpnI−SalIサイトにライゲーションし、pBS(FNCBD−EGF) を得た。pBS(FNCBD−EGF) に挿入されているハイブリッド遺伝子DNA断片をNdeIとEcoRIで切り出し、発現ベクターであるpTYB1 のNdeI−EcoRIサイトにライゲーションし、コラーゲン結合性上皮増殖因子の発現ベクターであるpTYB1(FNCBD-EGF)を得た。

0026

(実施例4−1)コラーゲン結合性上皮増殖因子の発現
以上のように構築されたプラスミドpTYB1(FNCBD-EGF)にて大腸菌ER2566(NEWENGLAND BioLabs)を形質転換した。形質転換した大腸菌は、100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地2mlで、一晩37℃で培養した。この前培養液0.2mlを100μg/mlのアンピシリンを含むSB培地200mlに接種した。ついで、IPTGを添加し37℃で培養し、集菌した。得られた菌体は100mlの超音波処理緩衝液(50mMトリス(Tris)-塩酸緩衝液pH8.0、50mM塩化ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA))で洗浄後、遠心分離して再び同緩衝液に懸濁し、超音波処理にて菌体を破砕した。この懸濁液に最終濃度1% になるようにトライトンX(TritonX-100)を添加し、4℃、5000回転/分で20分遠心分離した。得られた沈査をさらに洗浄液(0.5% TritonX-100、1mM EDTA)で3回洗浄した。この後、遠心分離し不溶画分を45mlの8M尿素溶液(8M尿素、50mM Tris-塩酸緩衝液pH8.0、1mM EDTA)中に1 時間室温で静置して溶解した。次にこの溶解液を4℃、14000回転/分で20分間遠心分離し上清回収した。上清は4M 尿素溶液、2M 尿素溶液で順次透析し、最後に超音波処理緩衝液に対して透析した。透析後4℃、14000回転/分で20 分間遠心し、上清を回収した。この上清50mlにゼラチンセファロース4B(超音波処理緩衝液で2回洗浄処理)を50ml加え、4℃で1時間混合した。この後、5分間遠心(5000回転/分)し、上清を除去した。この沈査に200mlの1M塩化ナトリウム溶液を加え攪拌後同様に遠心分離し、この沈査に25mlの8M尿素溶液を加え攪拌した後同様に遠心分離し上清を回収した。この溶液を、4M 尿素溶液、2M 尿素溶液、超音波処理緩衝液およびリン酸緩衝液に対して順次透析し、目的とするコラーゲン結合性上皮増殖因子(FNCBD-EGF)を含む溶液を得た。

0027

(実施例4−2)柔軟なプラスチック製容器収納された市販の腹膜透析液(商品名:ペリトリック135(テルモ株式会社製)、容量1リットル)に、実施例4で得たコラーゲン結合性上皮増殖因子(FNCBD-EGF)の溶液を生理食塩水に対して透析した後、2.5μMに調整したものを注射器を用いて上記容器混注口より20ml配合し、本発明の腹膜透析液を得た。このものは、上述したように通常の腹膜透析剤として使用でき、腹膜透析施行時に腹膜機能再生のための処置、あるいは腹膜損傷の予防を図ることができる。

0028

(実施例5)コラーゲン結合性上皮増殖因子のコラーゲン結合性(in vitro)
ELISA法を用い、コラーゲン結合性上皮増殖因子と市販の上皮増殖因子のコラーゲンに対する結合活性を比較した。まず、組織培養平底の96 wellマルチプレートに3 mg/mlのI、II、IIIもしくはIV型アテロコラーゲン塩酸溶液(pH 3.0)を200 μl/ウエル分注し、一晩4℃で静置した。その溶液を捨て、0.05% /Tween 20のリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で 6回ウエルを洗浄後、無血清DMEM培地希釈した0 nM、1.25 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM、20 nMのコラーゲン結合性上皮増殖因子溶液または0 nM、1.25 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM、20 nMの上皮増殖因子溶液を100μl各々のウエルに分注し、37℃、2時間静置した。次に、0.05% Tween 20/リン酸緩衝化生理的食塩水溶液で3回洗浄後、抗ヒト上皮増殖因子モノクローナル抗体(1:1000希釈)を100 μl 分注し、室温で1時間静置した。続いて0.05 %Tween 20/リン酸緩衝化生理的食塩水溶液で3回ウエル洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体(1:1000希釈)100 μlをウエルに分注し、室温で1時間静置した。最後に0.05% Tween 20/リン酸緩衝化生理的食塩水溶液でウェルを6回洗浄後、1 mg/mlオルト-フェニルエチレンアミン(o-phenylenediamine)と0.03%過酸化水素を含む0.1 Mクエン酸緩衝液pH 4.7 を分注し、約10分静置後、4規定硫酸50 μlで反応を停止した。プレートリーダーにて、492 nm-690 nmの吸光度を測定した。この結果、図1に示すようにコラーゲン結合性上皮増殖因子を添加したウエルでは濃度依存的に吸光度が増加したが、上皮増殖因子を添加したウエルではいずれの濃度においても吸光度に大きな違いはなかった。このことから、コラーゲン結合性上皮増殖因子は上皮増殖因子に比べ顕著なコラーゲン結合性を示すことが判明した。

0029

(実施例6)コラーゲン結合性上皮増殖因子のコラーゲン結合性と腹膜中皮細胞増殖活性(in vitro)
組織培養用24穴マイクロプレートに3 mg/mlのアテロコラーゲン塩酸溶液(pH3.0)を500μl/ウエルで分注し、一晩4℃で静置した。その溶液を捨て、0.05%Tween 20のリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で4回洗浄し、続いてリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で2回洗浄後、無血清DMEM培地で1回洗浄した。次に、無血清DMEM培地で希釈した0 nM、0.01 nM、0.1 nM、1.0 nMもしくは10 nMのコラーゲン結合性上皮増殖因子または上皮増殖因子溶液を250μl、各々のウエルに分注し、37℃で2時間静置した。溶液を捨て0.05% Tween 20のリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で2回洗浄し、次いでリン酸緩衝化生理的食塩水溶液で6回洗浄後、ハンクス緩衝液で1回洗浄した。次に、ラット腹膜中皮細胞をDMEM(0.5% FBS)中に懸濁し、24穴マイクロプレートに104細胞/0.5 ml/ウェルで分注した。この条件下で、腹膜中皮細胞を5%二酸化炭素存在下37℃で4日間培養した。その後、WST-1試薬を培地の10分の1容添加し、37℃で3時間インキュベートした。各ウエルの培地を96穴マイクロプレートのウエルへそれぞれに移し、マイクロプレートリーダーにて、450 nm−690 nmの吸光度を測定した。この結果、図2に示すように、コラーゲン結合性上皮増殖因子を添加したウエルでは濃度依存的に吸光度が増加したが、上皮増殖因子を添加したウエルではいずれの濃度においても吸光度に大きな違いはなかった。このことから、コラーゲン結合性上皮増殖因子は上皮増殖因子に比べ顕著なコラーゲン結合性を示し、なおかつコラーゲンに複合化した後に、腹膜中皮細胞に対する増殖活性を持つことが判明した。

0030

(実施例7)コラーゲン結合性上皮増殖因子の腹膜中皮細胞剥離部分へのデリバリー効果(in vivo)
ラット(Fischer、6週齢オス)をペントバルビタールにて麻酔後開腹し、腹膜中皮細胞を滅菌処理した紙ヤスリにて1.5cm×2cmにわたり剥離した。直ちに閉腹し、生理的食塩水で希釈した50nMの上皮増殖因子または50nMのコラーゲン結合性上皮増殖因子を3ml腹腔内投与した。コントロールとして生理的食塩水を同様に腹腔内投与した。サンプル投与5時間後に剖検し、中皮細胞剥離処理を施した部分および中皮細胞剥離処理を施していない部分の組織をそれぞれ摘出した。摘出した組織は定法に従いOTCコンパウンド中に凍結包埋し、クリオスタットにて薄切した。作成した病理標本を0.3%過酸化水素メタノール溶液に30分浸し、PBSで3回洗浄、5%正常ウサギ血清PBS溶液で30分間ブロッキングした後、抗ヒト上皮増殖因子モノクローナル抗体(1:500希釈)で120分反応した。次に、PBSで3回洗浄し、ビオチン標識抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体(1:500希釈)で30分反応した。PBSで3回洗浄した後、ABCコンプレックスで30分反応し、0.05% Tween 20/PBSに10分間浸し、PBSで4回洗浄、次いで0.02% 3, 3'-ジアミノベンチジン塩酸塩(DAB, 0.007% 過酸化水素, 50mMトリス緩衝溶液)に浸して発色した(2〜3分間)。以上のように作成した病理標本を顕微鏡観察したところ、中皮細胞剥離処理をした組織標本では、コラーゲン結合性上皮増殖因子を投与した組織のみに陽性像が確認された。また、中皮細胞剥離処理をしなかった組織標本では、陽性像は確認されなかった。このことから、コラーゲン結合生上皮増殖因子は、腹膜中皮細胞剥離部分に局在することが判明した。

0031

(実施例8)コラーゲン結合生上皮増殖因子の腹膜中皮細胞再生効果(in vivo)
ラット(Fischer、6週齢、オス)をペントバルビタールにて麻酔した後開腹し、腹膜中皮細胞を滅菌処理した紙ヤスリにて1.5cm×2cmにわたり剥離した。直ちに閉腹し、生理的食塩水で希釈した50nMの上皮増殖因子または50nMのコラーゲン結合生上皮増殖因子を3ml腹腔内投与した。また、コントロールとして生理的食塩水を同様に腹腔内投与した。術後2日目、サンプル投与群およびコントロール群いずれも同量のサンプルまたは生理的食塩水を腹腔内投与し、術後4日目に剖検し腹膜中皮細胞剥離処理を施した部分の組織を摘出した。摘出した組織は定法に従いホルマリン固定透徹パラフィン包埋した後、薄切し病理標本を作製した。この病理標本を脱パラフィン後100%エタノールに3回浸し、次いで0.3%過酸化水素メタノール溶液に30分浸し、PBSで3回洗浄した後、5%正常ウサギ血清のリン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)で30分間ブロッキングした。この後、抗中皮細胞抗体/HBME-1(1:50希釈)で30分反応し、PBSで3回洗浄後、ビオチン標識抗ウサギイムノグロブリンポリクローナル抗体(1:500希釈)で30分反応、PBSで3回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(1:700希釈)で30分反応した。この後、PBSで3回洗浄し、0.02% 3, 3'-ジアミノベンチジン四塩酸塩(DAB, 0.007% 過酸化水素, 50mMトリス緩衝溶液)に浸して発色した。以上の様に作成した病理標本を顕微鏡観察し、連続した8視野(1視野約0.7mm) について抗中皮細胞抗体陽性部分の長さを測定し、その平均値を各個体の腹膜中皮再生距離とした。各群の腹膜中皮細胞再生距離の平均値を求め、群間の腹膜中皮細胞再生距離を比較したところ、図3に示すようにコラーゲン結合性上皮増殖因子を投与した群の腹膜中皮細胞再生距離が最も長かった。このことから、コラーゲン結合性上皮増殖因子は腹膜中皮細胞剥離部分に局所保持され効率良く腹膜中皮細胞の再生を促すことが判明した。

発明の効果

0032

本腹膜保護剤または腹膜透析液は、腹膜透析における腹膜機能低下の予防または治療もしくは術後癒着の防止に有効である。詳しくは、本腹膜保護剤または腹膜透析液の有効成分は、コラーゲン結合性と腹膜中皮細胞に対する増殖、遊走、接着活性等の生理活性ポリペプチドの活性、これら両方を兼ね備えている。腹膜透析においては、腹膜透析施行中に腹膜中皮細胞の脱落が起きるが、この腹膜中皮細胞脱落部位にはコラーゲンが露出しており、本腹膜保護剤または腹膜透析液の有効成分であるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドが効率よくデリバリーされる。さらに、本腹膜保護剤または腹膜透析液の有効成分であるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドは、デリバリーされた部分で腹膜中皮細胞の増殖または遊走もしくは接着を促進し、腹膜中皮細胞の再生を促す。このことにより、腹膜中皮細胞が脱落した腹膜組織の傷害は速やかに治癒され、腹膜機能低下を抑制し長期腹膜透析を可能とする。しかも、本腹膜保護剤の有効成分であるコラーゲン結合性成長因子は腹腔内の腹膜中皮細胞が脱落したコラーゲン露出部位に効率よくデリバリーされるため、副作用の危険性も極めて少なく安全に長期腹膜透析を実現することが可能である。術後癒着の予防においては、腹膜組織傷害部位へ本腹膜保護剤の有効成分であるコラーゲン結合性生理活性ポリペプチドは効率よくデリバリーされ、デリバリーされた部位で腹膜中皮細胞の増殖または遊走もしくは接着を促進し、腹膜中皮細胞の再生を促す。このことにより腹膜組織の傷害部位は速やかに治癒され、癒着防止が可能となる。しかも、本腹膜保護剤の有効成分であるコラーゲン結合性成長因子は腹腔内の腹膜が傷害を受けたコラーゲン露出部位に効率よくデリバリーされるため、副作用の危険性も極めて少なく安全に癒着防止を実現することが可能である。

図面の簡単な説明

0033

図1コラーゲン結合性上皮増殖因子(FNCBD-EGF)と上皮増殖因子(EGF)のコラーゲン結合性を示すグラフである。
図2コラーゲン結合性上皮増殖因子(FNCBD-EGF)のデリバリー効果と腹膜中皮細胞増殖活性(in vitro) を示すグラフである。
図3コラーゲン結合性上皮増殖因子(FNCBD-EGF)の腹膜中皮細胞再生効果(in vivo) を示すグラフである。
配列表フリーテキスト
列番号1人工配列の説明:ヒトフィブロネクチン由来のコラーゲン結合性領域のPCRアンチセンスプライマー配列番号2人工配列の説明:ヒトフィブロネクチン由来のコラーゲン結合性領域のPCRセンスプライマー配列番号3人工配列の説明:ヒトEGFのPCRアンチセンスプライマー配列番号4人工配列の説明:ヒトEGFのPCRセンスプライマー
配列表
SEQUENCE LISTING<110> Terumo Corporation<120> peritoneal protecting agent<130> 0100149<160> 4<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 46<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: PCR Antisense Primer for HumanFibronectin Collagen-Binding Domain<400> 1cgggatcctt actcgagcca ctggatgggg tgggagttgg gctgac 46<210> 2<211> 49<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: PCR Sense Primer for Human Fibronectin Collagen-Binding Domain<400> 2gaggtaccat ggtacatatg gcagctgttt accaaccgca gcctcaccc 49<210> 3<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: PCR Antisense Primer for HumanEpidermal Growth Factor<400> 3gaattcttag cgcagttccc accacttcag 30<210> 4<211> 44<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: PCR Sense Primer for Human Epidermal Growth Factor<400> 4gtgtcgacga cgatgataag aatagtgact ctgaatgtcc cctg 44

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

  • 東レ株式会社の「 アニリド誘導体及びその医薬用途」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題・解決手段】本発明は、レチノイド関連オーファン受容体γアンタゴニスト活性を有し、乾癬等の自己免疫疾患に対して治療効果又は予防効果を発揮する新規な化合物を提供することを目的としている。本発明は、下... 詳細

  • 株式会社ADEKAの「 シート状脱細胞化材料及び同材料を用いる人工血管」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題・解決手段】本発明は、4方向の引張強さの最大値が4MPa以上であって、引張強さが最大となる方向における伸び率が50%〜300%である、生体材料由来シート状脱細胞化材料に関する。本発明によって、血... 詳細

  • 国民大学校産学協力団の「 Fcガンマ受容体変異体」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題・解決手段】本発明はFcガンマ受容体変異体を含むポリペプチドに関するものである。本発明のFcガンマ受容体変異体は、Fcガンマ受容体の一部アミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することによ... 詳細

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ