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課題

人間を含む哺乳動物における真皮および表皮におけるT細胞活性の増加および異常な抗原提示により特徴付けられる皮膚の状態を治療するための方法の提供。

解決手段

概要

背景

概要

人間を含む哺乳動物における真皮および表皮におけるT細胞活性の増加および異常な抗原提示により特徴付けられる皮膚の状態を治療するための方法の提供。

CD2/LFA−3相互作用の阻害剤を使用する。皮膚症状乾癬、UV障害アトピー性皮膚炎真菌ポリープ等の皮膚T細胞リンパ腫アレルギー性および刺激性接触皮膚炎蘚、円形脱毛症膿皮壊疽白斑眼球瘢痕疱瘡および蕁麻疹が含まれる。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

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請求項1

真皮および表皮におけるT細胞活性の増加および異常な抗原提示により特徴付けられる、ヒトの皮膚症状を含む哺乳動物の皮膚症状の予防または治療のための医薬の製造方法であって、該方法は、該医薬にCD2ポリペプチド、抗CD2抗体または抗CD2抗体同族体および抗LFA−3抗体または抗LFA−3抗体同族体からなる群から選択されるCD2/LFA−3相互作用の阻害剤包含させる行程を含み、ただし該抗体同族体はモノクローナル抗体組換抗体キメラ組換抗体、ヒト化組換抗体およびそれらの抗原結合部位からなる群から選択される、前記方法。

請求項2

前記皮膚症状がアトピー性皮膚炎皮膚T細胞リンパ腫アレルギー性および刺激性接触皮膚炎蘚、円形脱毛症膿皮壊疽白斑眼球瘢痕疱瘡および蕁麻疹から成る群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項3

前記症状が乾癬であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項4

前記阻害剤が抗LFA−3抗体同族体または抗CD2抗体同族体であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項5

前記阻害剤がモノクローナル抗LFA−3抗体またはモノクローナル抗CD2抗体であることを特徴とする請求項4に記載の方法。

請求項6

前記阻害剤が、受入番号ATCCHB 10693(1E6)、ATCC HB 10694 (HC−1B11)、ATCC HB 10695(7A6)およびATCC HB 10696(8B8)を有するハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗LFA−3抗体、あるいは、モノクローナル抗体TS2/9であることを特徴とする請求項5に記載の方法。

請求項7

前記モノクローナル抗LFA−3抗体が受入番号ATCCHB 10695(7A6)およびATCC HB 10693(1E6)を有するハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより生成されたことを特徴とする請求項6に記載の方法。

請求項8

前記阻害剤がキメラ組換え抗LFA−3抗体同族体またはキメラ組換え抗CD2抗体同族体であることを特徴とする請求項4に記載の方法。

請求項9

前記阻害剤がヒト化組換え抗LFA−3抗体同族体またはヒト化組換え抗CD2抗体同族体であることを特徴とする請求項4に記載の方法。

請求項10

前記阻害剤がFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(v)フラグメントおよび抗LFA−3抗体同族体または抗CD2抗体同族体の完全な免疫グロブリンH鎖から選択されることを特徴とする請求項4に記載の方法。

請求項11

前記阻害剤が可溶性CD2ポリペプチドであることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項12

前記哺乳動物が人間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項13

前記医薬が前記阻害剤を体重1kg当たり0.001および50mgの間の投薬量投与するための医薬であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項14

前記医薬が前記阻害剤を体重1kg当たり0.01および10mgの間の投薬量で投与するための医薬であることを特徴とする請求項13に記載の方法。

請求項15

前記医薬が前記阻害剤を体重1kg当たり0.1および4mgの間の投薬量で投与するための医薬であることを特徴とする請求項13に記載の方法。

請求項16

前記医薬が前記阻害剤を1週間に1回ないし3回投与するための医薬であることを特徴とする請求項13に記載の方法。

請求項17

前記医薬が前記阻害剤を1日に1回ないし3回投与するための医薬であることを特徴とする請求項13に記載の方法。

請求項18

前記医薬が前記阻害剤を3日および7日の間で毎日1回ないし3回投与するための医薬であることを特徴とする請求項17に記載の方法。

請求項19

前記医薬が前記阻害剤を毎月3日および7日の間で毎日1回ないし3回投与するための医薬であることを特徴とする請求項18に記載の方法。

請求項20

前記医薬が静脈内、筋肉内、皮下、関節内、包膜内、骨膜腫瘍部内、障害部内、障害部周辺、経口、局所的または吸入投与用として処方されることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項21

前記医薬が筋肉内、静脈内または皮下投与用として処方されることを特徴とする請求項20に記載の方法。

請求項22

前記阻害剤が抗LFA−3抗体同族体、抗CD2抗体同族体、可溶性LFA−3ポリペプチド、可溶性CD2ポリペプチド、細胞障害性物質および薬剤から成る群から独立して選択される1種以上の物質に連結することを特徴とする請求項1に記載の方法であって、ただし該抗体同族体はモノクローナル抗体、組換抗体、キメラ組換抗体、ヒト化組換抗体およびそれらの抗原結合部位からなる群から選択される、前記方法。

請求項23

前記症状がUV障害であることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項24

CD2ポリペプチド、抗CD2抗体または抗CD2抗体同族体および抗LFA−3抗体または抗LFA−3抗体同族体からなる群から選択されるCD2/LFA−3相互作用の阻害剤を含むことを特徴とする、真皮および表皮におけるT細胞活性の増加および異常な抗原呈示により特徴付けられる、ヒトの皮膚症状を含む哺乳動物の皮膚症状の予防または治療のための医薬であって、ただし該抗体同族体はモノクローナル抗体、組換抗体、キメラ組換抗体、ヒト化組換抗体およびそれらの抗原結合部位からなる群から選択される、前記医薬。

請求項25

前記皮膚症状がアトピー性皮膚炎、皮膚T細胞リンパ腫、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎、苔蘚、円形脱毛症、膿皮性壊疽、白斑、眼球瘢痕性疱瘡および蕁麻疹から成る群から選択されることを特徴とする請求項24に記載の医薬。

請求項26

前記阻害剤が抗LFA−3抗体同族体、抗CD2抗体同族体および可溶性CD2ポリペプチドから成る群から選択されることを特徴とする請求項24に記載の医薬。

請求項27

前記阻害剤が、受入番号ATCCHB 10693(1E6)、ATCC HB 10694 (HC−1B11)、ATCC HB10695(7A6)およびATCC HB 10696(8B8)を有するハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗LFA−3抗体、あるいは、モノクローナル抗体TS2/9であることを特徴とする請求項24に記載の医薬。

請求項28

前記哺乳動物が人間であることを特徴とする請求項24に記載の医薬。

請求項29

前記阻害剤が抗LFA−3抗体同族体、抗CD2抗体同族体、可溶性LFA−3ポリペプチド、可溶性CD2ポリペプチド、細胞障害性物質および薬剤から成る群から独立して選択される1種以上の物質に連結することを特徴とする請求項24に記載の医薬であって、ただし該抗体同族体はモノクローナル抗体、組換抗体、キメラ組換抗体、ヒト化組換抗体およびそれらの抗原結合部位からなる群から選択される、前記医薬。

技術分野

上述の如く本発明の数多くの実施態様を説明したが、これらの基本的実施態様は変更可能であり、したがって、本発明の手法を利用する他の実施態様を当該変更によって提供することも可能である。それゆえ、本発明の範囲は本明細書における上記の記載とこれに添付した請求の範囲とにおいて定めることのできるすべての変更態様および変形例を含むと解されるべきである。すなわち、本発明は、例示の目的で上述した当該特定の実施態様によって制限されるものではない。

背景技術

0001

本発明は人間を含む哺乳動物における真皮および表皮内のT細胞活性の増加および異常な抗原提示により特徴付けられる皮膚の状態の治療においてCD2/LFA−3相互作用の阻害剤を用いる方法に関する。なお、このような状態として、乾癬、UV障害アトピー性皮膚炎真菌症ポリープ等の皮膚T細胞リンパ腫アレルギー性および刺激性接触皮膚炎蘚、円形脱毛症膿皮壊疽白斑眼球瘢痕疱瘡および蕁麻疹などが挙げられる。

0002

真皮および表皮内のT細胞活性の増加および異常な抗原提示により特徴付けられる皮膚の障害が数多くある。このような炎症プロセス進展に関係する病態生理学的機構はまだよく理解されていない。しかしながら、皮膚の炎症性応答の発生において皮膚細胞が重要な関わりをもっていることが明らかになってきている(Kupper、「皮膚組織における免疫および炎症プロセス」(J.Clin.Invest.,86,pp.1783−89(1990)))。

0003

正常な成人表皮には1−2%のランゲルハンス細胞と98%のケラチン細胞が含まれている。このケラチン細胞とその他の非造血的に派生する細胞が皮膚内に存在すると、免疫性血流停止や種々の細胞分裂を引き起こしてT細胞の移動や付着分子発現に影響を及ぼす。

0004

抗原提示細胞として、ランゲルハンス細胞は当該細胞表面上において高濃度クラスII(Class II)主要組織適合複合体MHC)を発現する。該MHCクラスII分子エンドサイトーシスされた抗原から派生するペプチドを結合し、主にヘルパーTリンパ球により認識される。T細胞上のT細胞受容体は抗原を当該MHCによりコードされた細胞表面分子に結合したペプチドフラグメントとして認識する(Springer、「免疫システムの付着受容体」(Nature,346,pp.425−27(1990)))。

0005

このようなT細胞受容体/MHC相互作用に加えて、ランゲルハンス細胞やT細胞の表面上で発現される分子間の相互作用が数多くある。これらの表面分子はしばしば付着分子と呼ばれ、細胞付着抗原認識、T細胞活性化における相互刺激的伝達およびT細胞細胞毒性エフェクタ刺激を含む多くの機能に関係する(「特性における付着分子および炎症性の病気の治療」(The Lancet,336,pp.1351−52(1990)))。また、このような細胞付着は免疫応答の発生におけるT細胞増殖活性化に関与すると思われる(Hughes他、「T細胞機能レギュレータとしての内皮細胞」(Immunol.Rev.,117,pp.85−102(1990)))。

0006

また、真皮および表皮におけるT細胞活性および異常な抗原の提示によって種々の皮膚の病状が特徴付けられている(Cooper、「皮膚における免疫調節」(Cutaneous Lymphoma,Curr.Probl.Dermatol.,eds.van Volten et al.,19,pp.69−80,at pp.73,74,76(1990)))。例えば、接触アレルギー性皮膚炎においては、皮膚内T細胞の活性化が観られる。また、アトピー性皮膚炎の患者から得た皮膚には増加したランゲルハンス細胞が含まれていることが知られている(Cooper、「皮膚における免疫調節」(Cutaneous Lymphoma,Curr.Probl.Dermatol.,eds.van Volten et al.,19,at p.74(1990)))。さらに、乾癬症の皮膚には、ランゲルハンス細胞と非ランゲルハンス細胞のクラスIIMHC担持抗原提示細胞の両方から成る抗原提示細胞の増加が観られる(Cooper、「皮膚における免疫調節」(Cutaneous Lymphoma,Curr.Probl.Dermatol.,eds.van Volten et al.,19,pp.69−80,at p.75(1990)))。

0007

紫外線暴露した皮膚はランゲルハンス細胞の全体的な減少と非ランゲルハンス細胞の抗体提示細胞集団の表皮内への移動によって特徴付けられ、自己のT細胞を活性化して増殖する(Cooper、「皮膚における免疫調節」(Cutaneous Lymphoma,Curr.Probl.Dermatol.,eds.van Volten et al.,19,at pp.75−76(1990)))。例えば、人間の皮膚において、UV Bの最小の紅斑線量を4回照射後に、ランゲルハンス細胞(構成抗原提示細胞集団)が約3日間不活性になる(Cooper他、「人間の表皮細胞アロ抗原提示についての紫外線放射の影響:ランゲルハンス細胞依存型機能の初期的低下の後、表皮アロ抗原提示を高めるT6−DR+細胞が現れる」(J.Immunol.,134,pp.129−37(1985)))。この種のUVによる損傷を受けた皮膚においては、CD1aDR+マクロファージ集団(抗原提示細胞の集団)が全体の表皮細胞集団の0%(正常な皮膚)から約2−10%に増加して、T細胞の増殖を誘発してアロ抗体にするべく作用する(Cooper他、J.Immunol(同上)、Baadsgaard他、「インビボで紫外線暴露した人間の表皮細胞はCD4+ CD45RA+サプレッサーインデュサーT細胞を含むTサプレッサー細胞経路を活性化する」(J.Immunol.,145,pp.2845−61(1990)))。

0008

また、皮膚のT細胞リンパ球は真皮および表皮におけるT細胞の悪性クローナル集団の拡張によって特徴付けられる。この場合、障害のある表皮細胞は増加したCD1+ DR+抗原提示細胞を含む(Cooper、「皮膚における免疫調節」(Cutaneous Lymphoma,Curr.Probl.Dermatol.,eds.van Volten et al.,19,at pp.76−77(1990)))。

0009

上述の皮膚の状態に対して、現在知られている治療法は十分ではない。例えば、乾癬、苔蘚、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、UV障害、膿皮性壊疽、白斑、眼球瘢痕状疱瘡、円形脱毛症、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎および皮膚T細胞リンパ腫の治療においては、ステロイドシクロスポリンAが一般に使用されている。加えて、これらの皮膚障害のいくつかについては、レチノイド、PUVA、ナイトロジェンマスタードインターフェロン化学療法メトトレキセートUV光抗生物質および抗ヒスタミン薬等による種々の療法がある(参照:Fitzpatrick、(Dermatology in GeneralMedicine,3rd Ed.,McGraw Hill(1987)))。

0010

また、これらの療法についての副作用も知られている。例えば、シクロスポリンAの場合の最も一般的に見られる欠陥免疫抑制による毒性および腎臓毒や神経毒が挙げられる。ステロイドもクッシング症候群の誘発を含む副作用が知られている。さらに、上述の他の治療法のいくつかにおける副作用として、皮膚癌骨髄毒および体質性毒性、靭帯石灰化肝臓線維症および他の疾患が挙げられる。

0011

T細胞は標的細胞や抗原提示細胞と相互作用して免疫応答における主要な役割を担っている。例えば、T細胞媒介による標的細胞の消滅は、まず、細胞溶解T細胞(エフェクター細胞)が標的細胞に付着することから始まる、多段階のプロセスから成っている。また、ヘルパーT細胞は抗原提示細胞への付着によって当該免疫応答の開始を補助する。

0012

これらのT細胞の標的細胞および抗原提示細胞との相互作用は、当該T細胞の表面上の多くの特異的抗原受容体の一による標的細胞や抗原提示細胞の表面上の抗原の認識に高度に特異的でありかつこれに依存している。

0013

また、該T細胞の他の細胞との受容体−抗原相互作用も、例えば、抗原−受容体複合体CD3およびCD4、LFA−1、CD8およびCD2等の補助付着分子を含む種々のT細胞表面蛋白質によって容易化される。さらに、当該相互作用は、上記の標的細胞や抗原提示細胞の表面上で発現される、LFA−3、ICAM−1およびMHC等の補助付着分子によっても容易化される。例えば、LFA−1およびそのカウンター受容体ICAM−1またはICAM−2並びにCD2およびそのカウンター受容体LFA−3は細胞付着やT細胞活性化において関係があると考えられている。また、LFA−1/ICAMおよびCD2/LFA−3の相互作用は互いに独立していることも知られている。

0014

さらに、T細胞を休止する際に存在する他の多くの分子もまた当該T細胞の付着に関与していると考えられている。このような物質としては、E2(MIC2)、VLA−4(CD49d)、CD44(Hermes,Pgp−1,ECMRIII)およびH19(N4)が挙げられる(参照:Makgoba他、「CD2−LFA−3およびLFA−1−ICAM経路:T細胞認識への関連性」(Immunol.Today,10,pp.417−22(1989)))。

0015

T細胞を活性化する一方法として、抗原特異性のT細胞受容体をマクロファージ等の抗原提示細胞の表面上のペプチドーMHC複合体に結合する方法がある。T細胞が活性化すると、2種類の機能的T細胞、すなわち、抗体生成性Bリンパ球の増殖および熟成を促進するヘルパー細胞と、標的細胞を溶解するキラー細胞の増殖と分化が刺激される(Bierer他、「LFA−3に対するモノクローナル抗体であるCD2リガンドは主要組織適合複合体蛋白質を特異的に固定化する」(Eur.J.Immunol.19,pp.661−65(1989))、Springer、「免疫システムの付着受容体」(Nature,346,pp.425−34(1990)))。

0016

T細胞の活性化については、CD2とLFA−3の相互作用はまだよく理解されていないが、最近の研究では、T細胞の標的細胞や抗原提示細胞への付着の媒介において、当該CD2(T細胞付着分子)とLFA−3(標的細胞や抗原提示細胞付着分子)との間には特異的な相互作用があると示唆されている。このような細胞間付着はT細胞の機能的応答の開始において考えられていたことである(Dustin他、「精製リンパ球機能を伴う抗原3はCD2に結合し、Tリンパ球の付着を媒介する」(J.Exp.Med.,165,pp.677−92(1987))、Springer他、「リンパ球機能を伴うLFA−1、CD2およびLFA−3分子:免疫システムの細胞付着受容体」(Ann.Rev.Immunol.,5,pp.223−52(1987)))。

0017

人間の赤血球を含む広範な細胞の表面上に見い出されるLFA−3はT細胞の種々の相互作用におけるその役割をさらに明らかにするために多大な研究がおこなわれてきた(参照例:Krensy他、「LFA−1、LFA−2およびLFA−3の機能的意義分布および構造:CTL標的相互作用を伴う細胞表面抗原」(J.Immunol.,131(2),pp.611−16(1983)、Shaw他、「人間の細胞障害性T細胞クローンにより用いられる2種の抗原非依存型付着経路」(Nature,323,pp.262−64(1986)))。これまでに、LFA−3の天然の形態が2種類同定されている。その内の一つの形態(「トランスメンブランLFA−3」)はトランスメンブラン疎水性ドメインにより細胞膜内に連結する。このLFA−3の形態をコードするcDNAクローン化されシーケンス化されている(参照例:Wallner他、「リンパ球機能を伴う抗原−3(LFA−3)の主構造」(J.Exp.Med.,166,pp.923−32(1987)))。また、当該LFA−3の他の形態は糖脂質を含むフォスファチジルイノシトール(「PI」)に対する共有連結を介して細胞膜に結合する。この後者の形態は「PI連結LFA−3」として示され、当該LFA−3の形態をコードするcDNAもまたクローン化されシーケンス化されている(Wallner他、PCT特許出願WO90/02181)。

0018

人間のCD2(T11)分子は95%以上のリンパ球および実質的にすべての末梢Tリンパ球上に発現される50kD表面糖蛋白質である。特異的なモノクローナル抗体を用いる生化学分析によって、該CD2がTリネージ特異性を有しており、数種の異なるクリコシル化形態において該細胞表面上に存在することが示されている(Howard他、「E−ロゼット形成を阻止するモノクローナル抗体により定義された人間のTリンパ球弁別標識」(J.Immunol.,126,pp.2117−22(1981)、Brown他、(Leukocyte TypingIII,ed.Mcmichael,Oxford University Press,pp.110−12(1987)、Sayre他、「T11cDNAの分子クローニングおよび発現は人間のTリンパ球上の受容体類似構造を提示する」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.2941−45(1987)))。

0019

人間のCD2遺伝子の配列は既に報告されている(SeedおよびAruffo、「高速免疫選択手法によるCD2抗原、T細胞赤血球受容体、の分子クローニング」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.3365−69(1987)、Sayre他、「T11cDNAの分子クローニングおよび発現は人間のTリンパ球上の受容体類似構造を提示する」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.2941−45(1987)))。CD2cDNAのクローンにより、24個のアミノ酸残基から成る開裂信号ペプチド、185個の残基から成る細胞外セグメント、25個の残基から成るトランスメンブランドメインおよび117個の残基から成る細胞質領域予見されている(Sayre他、(同上)、Sewell他、「人間のT−リンパ球表面CD2(T11)抗原の分子クローニング」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,pp.8718−22(1986))、SeedおよびAruffo、(同上)、Clayton他、(Eur.J.Immunol.,17,pp.1367−70(1987)))。

0020

また、LFA−3結合ドメインを有する可溶性CD2ポリペプチドが報告されている(PCT特許公報WO90/08187)。

0021

TS2/18、T111、T112、T113等のCD2に対するモノクローナル抗体およびTS2/9等のLFA−3に対するモノクローナル抗体もまた報告されている(参照例:Hughes他、「T−細胞機能のレギュレータとしての内皮細胞」(Immunol.Reviews,117,pp.85−102(1990))、Meuer、「T−細胞活性化の別経路:50kdT11羊赤血球受容体蛋白質に対する機能的役割」(Cell,36,pp.897−906(1984)))。

発明の概要

0022

現在、増加したT細胞活性および異常な抗原提示を示す皮膚の状態を防止しかつ治療するための改善された方法が依然として要望されている。

0023

本発明は上述の問題の大部分を概ね解消する。すなわち、本発明は、哺乳動物における真皮および表皮内の増加したT細胞活性および異常な抗原提示により特徴付けられる皮膚の状態を防止または治療するための方法を提供し、この結果、CD2/LFA−3相互作用の阻害剤が哺乳動物に投与される。而して、本発明の方法は、従前の治療法に比して、免疫抑制を低減し、毒性の少ないより特異的な治療を提供する等の多くの理由により、上記の皮膚障害に対して優れた治療法である。

0024

好ましくは、本発明の方法は乾癬、UV障害、アトピー性皮膚炎、真菌症ポリープ等の皮膚T細胞リンパ腫、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎、苔蘚、円形脱毛症、膿皮性壊疽、白斑、眼球瘢痕状疱瘡および蕁麻疹等の皮膚障害の治療または予防に使用され、とりわけ、乾癬またはUV障害に対して用いられるのが好ましい。

発明を実施するための最良の形態

0025

本発明の方法において使用可能な阻害剤としては、CD2/LFA−3相互作用を阻害するいかなる分子でもよい。好ましくは、該阻害剤は抗LFA−3抗体の同族体、抗CD2抗体の同族体、可溶性LFA−3ポリペプチド、可溶性CD2ポリペプチド、CD2またはLFA−3擬態物質およびこれらの派生体から成る群から選ばれる。

0026

「CD2」とは、天然のLFA−3ポリペプチドに結合するCD2ポリペプチドを意味し、(a)天然の哺乳類のCD2DNA配列(例:SEQID NO:5)、(b)天然のCD2DNA配列に縮重するDNA配列、または(c)Tm以下の約20℃ないし27℃で1M塩化ナトリウム匹敵する条件下で上記DNA配列の一に対合するDNA配列によりコードされるものである。

0027

「LFA−3」とは、天然のCD2ポリペプチドに結合するLFA−3ポリペプチドを意味し、(a)天然の哺乳類のLFA−3DNA配列(例:SEQID NO:1またはSEQ ID NO:3)、(b)天然のLFA−3DNA配列に縮重するDNA配列、または(c)Tm以下の約20℃ないし27℃で1M塩化ナトリウムに匹敵する条件下で上記DNA配列の一に対合するDNA配列によりコードされるものである。

0028

「可溶性LFA−3ポリペプチド」または「可溶性CD2ポリペプチド」とは、細胞膜内にそれ自体で連結不可能なLFA−3またはCD2ポリペプチドである。このような可溶性ポリペプチドとしては、当該ポリペプチドを連結するための膜連結ドメインの領域を十分に有していないか、あるいは、当該膜連結ドメインが非機能的となるように改質されているCD2およびLFA−3ポリペプチドが挙げられる。さらに、ここで言う可溶性LFA−3ポリペプチドには完全長または部分切除(truncated)した(例:内部欠失)PI連結LFA−3等が含まれる。

0029

抗体同族体」とは、1種以上の抗原に結合可能な免疫グロブリンL鎖、免疫グロブリンH鎖およびこれらの抗原結合性フラグメントから選択される1種以上のポリペプチドから成る蛋白質である。なお、2種以上のポリペプチドから成る抗体同族体の構成ポリペプチドは必要に応じてジスルフィド結合していてもよく、また、共有的架橋していてもよい。而して、当該抗体同族体にはIgAIgGIgEIgDIgM(およびこれらのサブタイプ)の完全な免疫グロブリンが含まれ、当該免疫グロブリンのL鎖はκまたはλタイプでよい。さらに、該抗体同族体には、例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(v)フラグメント、H鎖モノマーまたはダイマー、L鎖モノマーまたはダイマー、1種のH鎖および1種のL鎖から成るダイマー等の抗原結合特異性を保有する完全な免疫グロブリンの部分も含まれる。

0030

人間化した組換え抗体同族体」とは、組換えDNA技法により生成された抗体同族体であり、抗原結合に要さない人間の免疫グロブリンL鎖またはH鎖のアミノ酸の全部または一部が対応する人間以外の哺乳動物の免疫グロブリンL鎖またはH鎖のアミノ酸に置き換えられている。

0031

キメラ組換え抗体同族体」とは、組換えDNA技法により生成された抗体同族体であり、免疫グロブリンL鎖、H鎖またはその両方のヒンジ領域および不変領域の全部または一部が別の免疫グロブリンL鎖またはH鎖の対応する領域に置き換えられている。

0032

皮膚の状態
本発明の方法は、CD2/LFA−3相互作用の阻害剤を投与することによって、真皮および表皮において増加したT細胞活性と異常な抗原提示により特徴付けられる皮膚の状態を人間を含む哺乳類動物を対象に防止または治療するのに有用である。このような病状としては、乾癬、UV障害、アトピー性皮膚炎、真菌症ポリープ等の皮膚T細胞リンパ腫、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎、苔蘚、円形脱毛症、膿皮性壊疽、白斑、眼球瘢痕状疱瘡および蕁麻疹等が含まれる。なお、膿皮性壊疽および蕁麻疹等の皮膚障害の治療および予防が本発明の範囲に含まれることは明らかに理解されると考える。すなわち、これら後者の皮膚障害はシクロスポリンA感応性皮膚病であるため、T細胞の活性化に関与するものである。ただし、本発明の方法は乾癬およびUV障害の予防または治療に使用されるのがより好ましい。また、本発明の方法はいかなる哺乳動物体にも実施可能であるが、人間を対象に使用するのがより好ましい。

0033

本発明者は、理論的に限定するものではないが、本発明の方法にしたがって使用するCD2/LFA−3相互作用の阻害剤がT細胞と抗原提示細胞との間の相互作用を阻害し、とりわけ、当該T細胞の増殖および活性化を阻害するので、上記皮膚障害の予防および治療に有効であると考えている。また、本発明者はこの種の病気の逆の作用がこのようなT細胞の増殖や活性化によるものと考えている。さらに、本発明者は本発明の方法が、すべての抗原提示に対する抗原特異性相互作用の阻害、T細胞を減少させることなく当該細胞の活性化を阻害すること、一般的な免疫抑制作用がなんら関与しないこと、さらに、寛容性誘因の可能性等を含む多くの理由により、これらの病気に対して従前実施されていた治療法に比して優れていると考える。

0034

特に、本発明者は本発明の方法の使用が多形核白血球またはマクロファージ媒介のエフェクター機構上になんら影響を及ぼすことなく当該病変初期段階において実際にT細胞に対してより特異的に作用すると考える。したがって、患者に対する影響をステロイドあるいはその他の一般的な免疫抑制剤を使用する場合に比べてより低減することができる。それゆえ、本発明により提供されるT細胞活性化を阻害する方法は上記の皮膚障害に対して有効な予防法かつ治療法である。

0035

CD2/LFA−3相互作用の阻害剤
CD2/LFA−3相互作用の阻害剤は本発明の方法において有用である。このような阻害剤としては、抗LFA−3抗体同族体、抗CD2抗体同族体、可溶性LFA−3ポリペプチド、可溶性CD2ポリペプチド、LFA−3およびCD2擬態物質およびこれらの派生体が挙げられる。これらの阻害剤の中で、可溶性LFA−3ポリペプチドおよび抗LFA−3抗体同族体がより好ましい。

0036

さらに、当該特定の可溶性CD2ポリペプチド、可溶性LFA−3ポリペプチド、抗LFA−3抗体同族体、抗CD2抗体同族体、または、LFA−3およびCD2擬態物質等の本発明の方法における有用性はこれらのCD2/LFA−3相互作用の阻害能力アッセイすることにより容易に決定することができる。例えば、該能力のアッセイは、当該阻害剤におけるLFA−3およびCD2を担持する細胞上でのこれら物質間の相互作用を阻害する能力の目視評価拡大処理下)を可能にする単純な細胞結合アッセイを用いて行うことができる。この場合、ジュルカット(Jurkat)細胞がCD2+基質として好ましく、赤血球細胞または人間のJY細胞がLFA−3+基質として好ましい。また、本発明において有用なこれらの可溶性ポリペプチド、抗体同族体および擬態物質の結合特性は、該抗体同族体、ポリペプチドまたは物質を放射性ラベリング(例:35Sまたは125I)した後、これらラベル処理したポリペプチド、擬態物質または抗体同族体を適当にCD2+またはLFA−3+細胞と接触させる等の幾つかの既知の方法によりアッセイすることができる。また、該結合特性は適当な酵素的ラベル化した二次抗体を用いてもアッセイすることができる。また、Seed他(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,pp.3365−69(1987))において記載されるようなロゼット形成競合アッセイも使用することができる。

0037

A.抗LFA−3および抗CD2抗体同族体
多くの種類の抗LFA−3または抗CD2抗体同族体が本発明の方法において有用である。これらには、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ組換え抗体、人間化組換え抗体並びにこれらの抗体結合性部位が含まれる。

0038

これらの抗LFA−3抗体同族体の中では、モノクローナル抗LFA−3抗体を用いることが好ましい。さらに、受入番号ATCCHB 10693(1E6)、ATCC HB 10694(HC−1B11)、ATCC HB 10695(7A6)およびATCC HB 10696(8B8)を有するハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより生成されるモノクローナル抗LFA−3抗体、あるいは、TS2/9として知られるモノクローナル抗体を用いるのがより好ましい(Sanchez−Madrid他、「人間T−リンパ球媒介の細胞溶解を伴う3種類の異なる抗原:LFA−1、LFA−2およびLFA−3」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,pp.7489−93(1982)))。さらに、該モノクローナル抗LFA−3抗体が上記受入番号ATCC HB 10695(7A6)およびATCC HB 10693(1E6)を有するハイブリドーマの群から選択されたハイブリドーマにより生成されることが最も好ましい。

0039

また、上述の抗CD2抗体同族体の中では、TS2/18を含むT111エピトープ抗体として知られる抗CD2モノクローナル抗体等のモノクローナル抗CD2抗体を用いることが好ましい。(Sanchez−Madrid他、「人間T−リンパ球媒介の細胞溶解を伴う3種類の異なる抗原:LFA−1、LFA−2およびLFA−3」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,pp.7489−93(1982)))
これらのモノクローナル抗体を生成する技法は周知である。簡単にいえば、特定の不死細胞系(骨髄腫細胞が典型的)を任意の抗原から成る標品(preparation)により免疫化した哺乳類から得たリンパ球(脾臓細胞が典型的)に融合し、次いで、生じたハイブリドーマ細胞培養上澄み液を当該抗原に対する抗体についてスクリーニングする(参照:Kohler他、「所定の特異性を有する抗体を分泌する融合細胞の連続的培養」(Nature,256,pp.495−97(1975)))。なお、本発明の目的において有用な免疫原としては、CD2またはLFA−3担持細胞並びにLFA−3、CD2またはこれらのカウンター受容体結合性フラグメント(例:LFA−3に結合するCD2フラグメントまたはCD2に結合するLFA−3フラグメント)を含む無細胞標品などが挙げられる。

0040

また、上記の免疫化は標準的な手法を用いることにより行える。なお、当該免疫化の様式およびその単位投与量は対象となる哺乳動物の種、免疫状態、体重等に依存する。一般に、免疫化された哺乳動物は採血されて、適当なスクリーニングアッセイにより、特定の抗体について各血液サンプルから血清がアッセイされる。例えば、有用な抗LFA−3または抗CD2抗体がジュルカット細胞の羊赤血球細胞ロゼット形成を阻止する免疫血清の能力を調べることにより同定でき、このことはこれらの細胞のそれぞれの表面上にLFA−3およびCD2が存在することに起因する。而して、上記のハイブリドーマ細胞の生成に用いるリンパ球は、一般に、当該スクリーニングアッセイにより所望の抗体の存在が既に確認済みの血清を有する免疫化した哺乳動物から単離される。

0041

一般に、不死細胞系列(例:骨髄腫細胞系列)はリンパ球と同一の哺乳類種から派生する。この場合、好ましい不死細胞系列は、ヒポキサンチンアミノプテリンおよびチミジンを含む培養地(「HAT培地」)に対して感応性を示すマウスの骨髄腫細胞である。

0042

HAT感応性マウス骨髄腫細胞は一般にポリエチレングリコール(「PEG」)3350を用いてマウスの脾臓細胞に融合する。その後、当該融合により生じたハイブリドーマ細胞はHAT培地を用いて選択され、未融合および未生成の融合骨髄腫細胞が消滅除去される(未融合の脾臓細胞は形質転換しないために数日後に死滅する)。その後、所望の抗体を生成するハイブリドーマが、当該ハイブリドーマの培養上澄み液における、例えば、カウンタ受容体への結合性やジュルカット細胞の羊赤血球細胞への付着能力についてスクリーニングすることにより検出される。さらに、限界希釈によるハイブリドーマ培養のサブクローニングがモノクローナル性を確保するために一般に行われる。

0043

さらに、抗LFA−3または抗CD2モノクローナル抗体を生成するために、上記スクリーニングにおいて陽性と判定されたハイブリドーマが、当該ハイブリドーマ細胞が所定の栄養培養液中にモノクローナル抗体を分泌する条件下においてこれに要する十分な時間で培養される。なお、このようなハイブリドーマ細胞に適する組織培養技法や培地は周知である。また、必要に応じて、該条件付ハイブリドーマ培養の上澄み液収集して、周知の方法によって所望の抗体をさらに精製することが可能である。

0044

また、当該所望の抗体は上記ハイブリドーマをプリスタン注入した(pristane−primed)マウスの腹膜腔内に注射することによっても生成できる。この結果、該ハイブリドーマ細胞は当該腹膜腔内において増殖して上述の抗体を分泌し、該分泌液腹水として蓄積する。したがって、この腹水液を注射器により該腹膜腔内から取り出すことにより、目的の抗体を得ることができる。

0045

さらに、本発明において有用な抗CD2および抗LFA−3抗体同族体は所望の抗体の免疫グロブリンL鎖およびH鎖をコードするDNAにより形質転換した宿主細胞によって生成した組換え抗体でもよい。この組換え抗体は既知の遺伝工学的技法により生成できる(参照例:米国特許第4816397号、同文献は本明細書の参考文献である)。

0046

例えば、該組換え抗体は、本発明において有用な抗体同族体を生成するハイブリドーマ細胞から得た所望の抗体の免疫グロブリンL鎖およびH鎖をコードするクローニングcDNAまたはゲノムDNAによって生成することができる。その後、これらのポリペプチドをコードするcDNAまたはゲノムDNAは発現ベクター内に挿入されて、両方の遺伝子がそれらの転写および翻訳発現制御配列に効果的に連結する。さらに、該発現ベクターおよび発現制御配列が使用した発現宿主細胞に適合するように選択される。なお、一般には、当該両方の遺伝子は同一の発現ベクターに挿入されている。

0047

この場合、真核または原核宿主細胞を用いることができる。ただし、真核細胞原核細胞に比して組み合わせが容易であり、また、適当に折りたたまれかつ免疫学的に活性な抗体を分泌しやすいという理由から、真核宿主細胞における発現の方が好ましい。しかしながら、不適当な折りたたみにより不活性となったいかなる抗体も周知の方法で再生することが可能である(KimおよびBaldwin、「小蛋白質の折りたたみ反応における特異的中間体および蛋白質の折りたたみの機構」(Ann.Rev.Biochem.,51,pp.459−89(1982)))。なお、該宿主細胞は、本発明による抗体同族体でもあるL鎖ダイマーやH鎖ダイマー等の完全な抗体の部分を生成することも可能である。

0048

上述の手法の変形もまた本発明において有用であることが理解されると考える。例えば、特定の抗体同族体のL鎖またはH鎖(両方ではない)をコードするDNAを用いて宿主細胞を形質転換することが望ましい場合が考えられる。また、組換えDNA技法により、CD2またはLFA−3カウンタ受容体結合のために必要でないL鎖およびH鎖のいずれかまたは両方をコードするDNAの全部または一部を除去するようにすることもできる。すなわち、このように部分的に削除したDNA分子から発現される分子もまた本発明の方法において有用である。加えて、1個のH鎖と1個のL鎖が抗CD2または抗LFA−3抗体同族体であり、他の1個のH鎖および1個のL鎖がCD2またはLFA−3以外の抗原、若しくは、CD2またはLFA−3の他のエピトープに対して特異的であるような二官能性の抗体を生成することもできる。

0049

キメラ組換え抗LFA−3または抗CD2抗体同族体は宿主細胞を所望の免疫グロブリンL鎖およびH鎖をコードするDNAから成る適当な発現ベクターにより形質転換することによって生成することができ、この場合、当該H鎖および/またはL鎖のヒンジ領域および不変領域をコードするDNAの全部または一部が異なる種の免疫グロブリンL鎖またはH鎖の対応領域から得たDNAで既に置き換えられている。このとき、元の組換え抗体が人間のものでなく、また、上記の阻害剤が人間に投与される場合、対応する人間の配列の置き換えが好ましい。例示的なキメラ組換え抗体としては、マウスの可変領域と人間のヒンジ領域および不変領域を有しているものが挙げられる(参照:米国特許第4816397号、Morrison他、「キメラ人間抗体分子:人間の不変領域ドメインを伴うマウス抗体結合性ドメイン」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,pp.6851−55(1984)))。

0050

また、人間化した組換え抗LFA−3または抗CD2抗体は所望の人間でない免疫グロブリンL鎖およびH鎖をコードするDNAから成る適当な発現ベクターにより宿主細胞を形質転換することによって生成することができる。この際、抗原結合に関与しないアミノ酸をコードするDNAの全部または一部が所望の人間の免疫グロブリンL鎖またはH鎖の対応領域から得たDNAで置き換えられている(参照例:Jone他、「人間の抗体における相補性決定領域とマウスの領域との置き換え」(Nature,321,pp.522−25(1986)))。

0051

完全な抗体でない抗CD2および抗LFA−3抗体同族体もまた本発明において有用である。このような同族体は上述の抗体同族体のいずれかから誘導することができる。例えば、抗体結合性フラグメント並びに上述の抗体から誘導できる完全長モノマー、ダイマーまたはトリマーポリペプチドはそれ自体で有用である。この種の有用な抗体同族体としては、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(v)フラグメント、H鎖モノマーまたはダイマー、L鎖モノマーまたはダイマー、1個のH鎖および1個のL鎖から成るダイマー等が含まれる。抗LFA−3H鎖は好ましい抗LFA−3抗体フラグメントである。

0052

該抗体フラグメントはまた、例えば、ペプシンまたはパパイン(papain)等のプロテアーゼを用いる完全な抗体の開裂や、当該開裂生成物を必要に応じて還元剤で処理する等の化学的方法によって生成することもできる。また、有用なフラグメントを宿主細胞の部分切除したHおよび/またはL鎖遺伝子による形質転換によって生成することも可能である。また、H鎖およびL鎖モノマーは、完全な抗体をジチオトレイトール(dithiothreitol)等の還元剤で処理した後、生成して当該鎖状体を分離することにより生成できる。さらに、該H鎖およびL鎖モノマーは所望のH鎖またはL鎖(両方ではない)のいずれか一方をコードするDNAを用いて形質転換した宿主細胞によっても生成することができる(参照例:Ward他、「大腸菌から分泌される単一免疫グロブリン可変領域の範囲における結合活性」(Nature,341,pp.544−46(1989))、Sastry他、「モノクローナル接触抗体の発生のための大腸菌における免疫学的領域のクローニング:H鎖可変領域特異性cDNAライブラリの構造」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.5728−32(1989)))。

0053

B.可溶性CD2およびLFA−3ポリペプチド
LFA−3およびCD2の相互作用を阻害する可溶性LFA−3ポリペプチドまたは可溶性CD2ポリペプチドは本発明の方法において有用である。これらのうち、可溶性LFA−3ポリペプチドの方が好ましい。

0054

可溶性LFA−3ポリペプチドはLFA−3のトランスメンブラン形態、特に、細胞外ドメイン(例:SEQID NO:2のAA1−AA187)から誘導することができる。このようなポリペプチドは米国特許第4956281号および同時係属の米国特許出願07/667971号(本出願と譲渡人を共通にする)に記載されており、これらは本明細書の参考文献である。好ましい可溶性LFA−3ポリペプチドはSEQ ID NO:2のAA1−AA92、SEQID NO:2のAA1−AA80、SEQ ID NO:2のAA50−AA65およびSEQ ID NO:2のAA20−AA80から成るポリペプチドを含む。また、SEQ ID NO:2をコードするDNA配列(すなわち、SEQ ID NO:1)から成るベクターはアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection,Rockville,MD)に受入番号75107で寄託されている。

0055

また、可溶性LFA−3ポリペプチドはPCT特許出願WO90/02181に記載されているようなLFA−3のPI連結形態から誘導することもできる。このPI連結LFA−3をコードするDNA配列(すなわちSEQID NO:3)から成るベクターはアメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville,MD)に受入番号68788で寄託されている。なお、該LFA−3のPI連結形態とLFA−3のトランスメンブラン形態が全細胞外ドメインを通して同一のアミノ酸配列を有することは当然理解されると考える。したがって、好ましいPI連結LFA−3ポリペプチドは上記LFA−3のトランスメンブラン形態の場合と同一である。

0056

可溶性CD2ポリペプチドは完全長CD2、特に、細胞外ドメイン(例:SEQID NO:6のAA1−AA185)から誘導できる。また、このようなポリペプチドは当該CD2の完全長ドメインの全部または一部から構成できる。例示的な可溶性CD2ポリペプチドが参考文献PCT WO90/08187に記載されている。 本発明において有用な可溶性ポリペプチドの生成は当業界において知られる種々の方法によって行うことができる。例えば、該ポリペプチドは完全なトランスメンブランLFA−3またはCD2分子、あるいは、完全なPI連結LFA−3分子から、エクソペプチダーゼと組み合わせた特異的なエンドペプチダーゼを用いる蛋白質分解エドマン分解またはこれらの両方によって誘導することができる。一方、完全なLFA−3分子または完全なCD2分子は従来法によりその天然供給源から精製できる。また、該完全なLFA−3またはCD2はcDNAを用いる既知の組換えDNA技法により生成することもできる(参照例:Wallner他の米国特許第4956281号、AruffoおよびSeed:Proc.Natl.Acad.Sci.,84,pp.2941−45(1987)、Sayre他:Proc.Natl.Acad.Sci.,84,pp.2941−45(1987)。

0057

好ましくは、本発明に有用な可溶性ポリペプチドを直接的に生成して、完全なLFA−3分子や完全なCD2分子を出発原料とする必要性を省く。このことは、従来の化学的合成技法や、所望のペプチドをコードするDNA配列のみを形質転換した宿主内に発現する周知の組換えDNA技法によって行うことができる。例えば、所望の可溶性LFA−3ポリペプチドや可溶性CD2ポリペプチドをコードする遺伝子はオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いる化学的手段により合成することができる。すなわち、このようなオリゴヌクレオチドは所望の可溶性LFA−3ポリペプチドや可溶性CD2ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。また、該所望のペプチドに対応する特異的なDNA配列のコード化は、特異的な制限エンドヌクレアーゼフラグメントの単離や当該特異的領域PCR合成によって完全長のDNA配列から誘導することもできる。

0058

本発明において有用な可溶性LFA−3ポリペプチドや可溶性CD2ポリペプチドをコードする遺伝子の合成には標準的な手法が適用できる。例えば、完全なアミノ酸配列を逆翻訳した(back−translated)遺伝子を構成するために用いることができる。また、本発明において有用な可溶性LFA−3ポリペプチドや可溶性CD2ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含むDNAオリゴマー単一ステップで合成することができる。さらに、当該所望のポリペプチドの部分をコーディングするいくつかの短いオリゴヌクレオチドを合成して連結することも可能である。好ましくは、本発明において有用な可溶性LFA−3ポリペプチドまたは可溶性CD2ポリペプチドをいくつかの分離したオリゴヌクレオチドとして合成し、その後、連結する。このような個々のオリゴヌクレオチドは一般に5’または3’方向の補足的な組合せ部分に対応する延出部(overhangs)を含んでいる。

0059

このようにして組み合わされた所望の遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼにより認識される配列(クローニングまたは発現ベクターへの直接的組合せに対応する特異的制限部位を含む)、使用の宿主発現システムを考慮した上での好ましいコドン、および、転写される際に安定で効果的に翻訳されるmRNAを生成する配列によって特徴付けられる。適切な組合せについてはヌクレオチド配列決定、制限マッピング、および、適当な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現により確認できる。

0060

なお、上述の特異的なDNA配列によりコードされる可溶性LFA−3およびCD2ポリペプチドは、遺伝子コード縮退により、他の多くのヌクレオチド配列から成るDNA分子によってもコードすることが可能であることは当業者において明らかである。これらの縮退配列はまた本発明において有用なポリペプチドをコード化する。

0061

上記のDNA配列は単細胞宿主において発現可能である。当業界において周知の如く、宿主内において形質転換した遺伝子の高い発現レベルを得るためには、当該遺伝子は該選択された発現宿主において機能的な転写および翻訳発現制御配列に有効に連結される必要がある。好ましくは、該発現制御配列および関係する遺伝子は、さらにバクテリア選択マーカーおよび複製開始点から成る発現ベクターに含まれる。もしも該発現宿主が真核細胞であれば、当該発現ベクターは当該発現宿主において有用であるさらに付加的な発現マーカーから構成されていなければならない。

0062

上記の所望の可溶性ポリペプチドをコードするDNA配列はシグナル配列をコードしてもしなくてもよい。ただし、上記の発現宿主が原核細胞である場合は、当該DNA配列はシグナル配列をコードしない方が一般的に好ましい。逆に、該発現宿主が真核細胞である場合は、シグナル配列がコードされる方が一般的に好ましい。

0063

また、アミノ末端メチオニンは上記の発現生成物上に存在していてもいなくてもよい。ただし、該末端メチオニンが発現宿主によって開裂していない場合は、必要に応じて、これを標準的な技法により化学的に除去することができる。

0064

また、種々の発現宿主/ベクターの組み合わせが使用できる。真核宿主細胞に対して有用な発現ベクターとしては、例えば、SV40ウシ乳頭腫ウィルスアデノウィルスおよびサイトメガロウィルスから得られる発現制御配列から成るベクターがある。また、細菌の宿主細胞に対して有用な発現ベクターとしては、col E1含む大腸菌のプラスミド、pCR1、pBR322およびこれらの派生体等のような既知の細菌のプラスミド、さらに、RP4、ファージDNA、例えば、ファージλの多種派生体、例えば、NM989、およびM13および線状一本鎖DNAファージ等の他のDNAファージ等のより広い宿主範囲を有するプラスミドが挙げられる。また、酵母細胞に対して有用な発現ベクターとしては、2μプラスミドおよびその派生体が挙げられる。さらに、昆虫細胞に有用なベクターとしてはpVL941がある。

0065

加えて、広範な発現制御配列のいずれもがこれらのベクターにおいて使用することができる。このような有用な発現制御配列には、上述の発現ベクターの構造遺伝子を伴う発現制御配列を含まれる。例えば、当該有効発現制御配列としては、SV40またはアデノウィルスの初期および後期プロモーターラクトース(lac)システムトリプロファン(trp)システム、TACまたはTRCシステム、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコート蛋白質の制御領域、3−ホスフォグリレーキナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモーター、酸ホスファターゼ、例、Pho5のプロモーター、酵母α接合システムおよび真核または原核細胞の遺伝子発現を制御することで知られる他の配列のプロモーター、およびこれらの種々の組み合わせが挙げられる。

0066

また、広範な単細胞宿主細胞が有用である。これらの宿主細胞としては、大腸菌株、プソイドナス属、バチルス属ストレプトミセス属真菌類、酵母、スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(SF9)等の昆虫細胞、CHOおよびマウス細胞等の動物細胞、COS1、COS7、BSC1、BSC40およびBMT10等のアフリカミドリザル(African green monkey)細胞、人間の細胞、並びに、組織培養における植物細胞等が挙げられる。なお、動物細胞の発現においては、本発明者はCHO細胞およびCHO7細胞が好ましいと考える。

0067

ただし、ここに記載するDNAを発現する上で、これらすべてのベクターおよび発現制御配列が一様に機能するとは限らないことは勿論のことである。また、すべての宿主細胞の当該同一発現システムにおける機能も同様である。しかしながら、当業者においては、過度実験を要することなく、これらのベクター、発現制御配列および宿主細胞からの選定を行うことが可能である。例えば、ベクターの選択においては、該ベクターが宿主細胞内で複製されるため、当該宿主細胞が考慮される必要がある。また、該ベクターのコピー番号、当該コピー番号を制御する能力、および、抗体マーカー等、当該ベクターによりコードされる他の任意の蛋白質の発現も考慮する必要がある。

0068

また、発現制御配列を選択する場合には、種々の因子を考慮する必要がある。例えば、該因子としては、配列の相対的強度、制御の可能性、上記DNA配列特に潜在的二次構造との適合性が挙げられる。また、単細胞宿主は、選択されたベクターとの適合性、該DNA配列によりコード化した生成物の毒性、分泌特性、可溶性ポリペプチドを正確に折りたたむ能力、発酵または培養の必要性、および、当該DNA配列によりコード化した生成物の精製の容易さを考慮した上で選択する必要がある。

0069

なお、これらのパラメータの範囲内において、当業者においては、発酵や例えばCHO細胞やCOS7細胞等の大規模な動物細胞の培養において必要なDNA配列を発現する種々のベクター/発現制御配列/宿主細胞の組み合わせを選択することが可能である。

0070

さらに、当該可溶性LFA−3およびCD2ポリペプチドは従来の種々の方法のいずれかを使用することにより上記の発酵や細胞培養から単離し精製することができる。当業者においては、これらの中で、最適の単離および精製法を選択することが可能である。

0071

組換えDNA技法は20個以上のアミノ酸配列を有する有用な可溶性CD2ポリペプチドや可溶性LFA−3ポリペプチドを生成する好ましい方法であるが、約20個以下のアミノ酸を有する短めのCD2やLFA−3ポリペプチドは従来の化学的な合成法により生成する方が好ましい。なお、本発明において有用な合成的に生成されるポリペプチドは極めて高収率であり容易に精製できる点で有利である。

0072

好ましくは、このような可溶性CD2ポリペプチドまたは可溶性LFA−3ポリペプチドは液相または固相のポリペプチド合成法により合成され、必要に応じて、カルボキシペプチダーゼにより(C末端アミノ酸を除去するために)消化されるか、手動式エドマン分解法により(N末端アミノ酸を除去するために)分解される。また、ポリペプチドの適切な折りたたみはKent(「ポリペプチドおよび蛋白質の化学的合成」(Ann.Rev.Biochem.57,pp.957−89(1988)))において記載されるようなジスルフィド架橋の形成に好適な酸化条件下で行うことができる。その後、このようにして生成したポリペプチドは当業界において広く知られる分離技法、好ましくは逆相HPLCを利用することにより、精製することができる。なお、液相合成法の使用はチロシンのいわゆるO−硫酸エステル等の成長過程ポリペプチド鎖に特定の派生アミノ酸を直接付加することを可能にする点で有利である。これにより、本発明において有用なポリペプチドの任意の残基を改変するための後続の処理が不要になる。

0073

C.LFA−3およびCD2擬態物質
本発明の方法においては、LFA−3およびCD2擬態物質もまた有用である。これらの物質はCD2/LFA−3相互作用の阻害剤であり、ペプチド、半ペプチド化合物または非ペプチド化合物のいずれでもよい。なお、最も好ましいCD2およびLFA−3擬態物質は該CD2/LFA−3相互作用を阻害すると共に、少なくとも抗LFA−3モノクローナル抗体7A6または抗CD2モノクローナル抗体TS2/18(上述)を阻害する。

0074

このような擬態物質は多種類のペプチド(例:5−20個のアミノ酸の長さのもの)、半ペプチド化合物または非ペプチド化合物および有機化合物を合成し、次いで、当該CD2/LFA−3相互作用を阻害する能力についてスクリーニングすることにより生成することができる(参照:本明細書における参考文献としての、米国特許第4833092号、ScottおよびSmith、「エピトープライブラリによるペプチドリガンドについてのサーチ」(Science,249,pp.386−90(1990))、およびDevlin他、「ランダムペプチドライブラリ特異的蛋白質結合分子供給源」(Science,249,pp.404−07(1990)))。

0075

D.派生阻害剤
本発明の方法においてはCD2/LFA−3相互作用の派生阻害剤もまた有用である。この場合、例えば、ここに記載の抗体同族体、可溶性CD2およびLFA−3ポリペプチド、あるいは、CD2およびLFA−3擬態物質のいずれかが、抗LFA−3および抗CD2抗体同族体、可溶性LFA−3およびCD2ポリペプチド、CD2およびLFA−3擬態物質、細胞障害性物質および薬剤から成る群から独立に選択した1種以上の物質に機能的に連結(化学的結合、遺伝的融合等により)している。

0076

このような派生的阻害剤の1種は2種以上の阻害剤(同一種または異種)を架橋することにより生成できる。この場合の、適当な架橋剤としては、ヘテロ二官能的な、適当なスペーサにより分離される2個の異なる反応基を有するもの(例:m−マレイミドベンゾイルーN−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、あるいは、ホモ二官能性のもの(例:スベリン酸ジスクシンイミジル)が挙げられる。なお、このような架橋剤はピアスケミカル社(Pierce Chemical Company,Rockford,IL)から市販されている。

0077

他の可能な架橋処理としては、PI連結LFA−3におけるPI連結信号配列やそのフラグメントを利用する方法がある。特に、該PI連結信号配列(例:SEQID NO:4のAA162−AA212)をコードするDNAは所望のポリペプチド、好ましくは、可溶性LFA−3ポリペプチドをコードするDNAの下流側で連結する。もしもこのような構造が適当な真核細胞内において発現されると、該細胞は当該PI連結信号配列を認識してPIを対応するポリペプチドに共有的に連結する。その後、該PIの疎水性により、当該ポリペプチドのミセル凝集体が形成される。

0078

また、1種以上の細胞障害性細胞または薬剤物質に連結した阻害剤も有用である。この場合の有用な薬剤としては、CD2またはLFA−3以外の人間のポリペプチドに特異的な抗体同族体またはその一部分等の生物学的に活性なペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質が挙げられる。さらに、当該有用な薬剤および細胞障害性物質として、シクロスポリンA、プレドニソン、FK506、メトトレキセート、ステロイド、レチノイド、インターフェロンおよびナイトロジェンマスタードが挙げられる。

0079

また、薬剤により派生した好ましい阻害剤としては、組換え的に生成したポリペプチドが挙げられ、この場合、可溶性LFA−3ポリペプチド、可溶性CD2ポリペプチドまたはペプチジルCD2やペプチジルLFA−3擬態物質が免疫グロブリンH鎖のヒンジ領域の全部または一部および該H鎖の不変領域の全部または一部に融合している。なお、このような融合蛋白質を作成するために好ましいポリペプチドは可溶性LFA−3ポリペプチドである。さらに、最も好ましいものは、人間のIgG1ヒンジ領域の一部分(内鎖ジスルフィド結合に関与すると考えられる2種のシステイン残基を含むヒンジ領域のC末端の10個のアミノ酸を含む)および該IgG1H鎖の不変ドメインにおけるCH2およびCH3領域に融合したLFA−3のAA1−AA92(例:SEQID NO:2)を含む融合蛋白質である。このような融合蛋白質は血清の半減期延長し、阻害剤の二量化を可能にすることが期待できる。

0080

薬剤組成物および本発明による方法
本発明はCD2/LFA−3相互作用の1種以上の阻害剤またはその派生形態を哺乳動物に投与することによって当該哺乳動物における上述の皮膚障害を防止あるいは治療するための方法を提供する。

0081

好ましくは、該阻害剤またはその派生形態の効果量が投与される。この「効果量」とは、本書に記載した皮膚障害の範囲または程度を低減し得る量を意味する。

0082

当業者においては、当該効果量の阻害剤が、とりわけ、投与スケジュール単位投薬量、該阻害剤の投与における他の治療剤との組み合わせ、患者の免疫状態および健康状態、投与した特定阻害剤の治療および予防における活性、および、血清の半減期に依存することは明らかである。

0083

好ましくは、該阻害剤は体重1kg当たり約0.001mgおよび約50mgの間で、より好ましくは体重1kg当たり約0.01mgおよび約10mgの間で、最も好ましくは体重1kg当たり約0.1mgおよび約4mgの間で投与される。

0084

単位投薬量は効果が現れるまで投与される。なお、この効果はインビトロなT細胞活性アッセイおよび影響を受けた皮膚領域の除去(clearing)を含む種々の方法によって計測できる。好ましくは、該単位投薬量の投与が1週間に1ないし3回または1日に1ないし3回行われる。より好ましくは、当該投与が約3日から7日の間で1日に1ないし3回または1カ月毎に約3日および7日の間で1日に1ないし3回行われる。なお、これよりも低いまたは高い投薬量および他の投与スケジュールを用いることもできる。

0085

さらに、当該阻害剤およびその派生形態は薬剤として許容可能なキャリヤを含む組成物中において投与されることが好ましい。この「薬剤として許容可能なキャリヤ」とは、投与を受ける患者においてアレルギー反応や他の不都合な作用を生じないキャリヤを意味する。

0086

適当な薬剤として許容可能なキャリヤは、例えば、水、生理食塩水リン酸塩バッファー処理した生理食塩水、デキストロースグリセロールエタノール、並びにこれらの組み合わせの1種またはそれ以上である。さらに、該薬剤として許容可能なキャリヤは、湿潤剤または乳化剤貯蔵寿命や阻害剤の効果を向上するための防腐剤バッファー等の少量の補助的物質を含んでいてもよい。

0087

また、該薬剤組成物または阻害剤は他の治療剤または予防剤と共に投与することができる。これらの薬剤としては、例えば、シクロスポリンA、ステロイド、レチノイド、ナイトロジェンマスタード、インターフェロン、メトトレキセート、抗体および抗ヒスタミン剤がある。

0088

なお、これらの薬剤は阻害剤と共に単一の投与形態(すなわち、同一の薬剤組成物の一部として)、該阻害剤とは別でかつ同時の複数の投与形態、あるいは、これら二成分が別々にかつ連続的に投与される複数の投与形態において投与できる。また、該阻害剤およびその他の活性薬剤を単一の複合分子の形態とすることができる。なお、このような二成分の複合化は当業界において周知の標準的な架橋技法により行うことができる。さらに、単一分子組換え融合蛋白質の形態を採ることもできる。加えて、本発明において有用な当該阻害剤または薬剤組成物はPUVA、化学療法およびUV照射等の他の療法との組み合わせで使用することもできる。このような組合せ療法は当該治療剤または予防剤の投薬量を低減できる点で有利である。

0089

さらに、該阻害剤または薬剤組成物は種々の形態を採り得る。これらは、例えば、錠剤丸薬粉体溶液、分散液または懸濁液、リポソーム座薬など注射可能、注入可能および局所投与可能な標品の固体半固体および液体の投与形態である。なお、好ましい形態は投与の態様や治療の適用性に依存するが、注射可能または注入可能な溶液がより好ましい。

0090

さらに、当該阻害剤または薬剤組成物は静脈内、筋肉内、皮下、関節内、包膜内、骨膜腫瘍内、障害部内または障害部周囲に、注入、経口、局所的投与または吸入により投与できる。好ましくは、皮下、筋肉内または静脈内に投与する。また、最も好ましくは、皮下に投与する。

0091

本発明をさらによく理解するために以下の実験例を説明する。なお、当該実験例は例示のためのみのものであり、これらによって本発明の範囲をいかなる意味においても限定するものではない。

0092

実験例1
実験対象
6人の成人の患者について調査した。プロトコルについて国内検閲局の認可を得た後、情報公開同意を得た。また、すべての患者は乾癬すなわち特徴的形態および分布の慢性丘疹プラークに対する主要診断基準を満たしていた。これらの患者には局所的なコルチコステロイド断続的投与を共通に行い、当該調査に入る前の2週間これを中断した。また、乾癬症や他の皮膚障害の経験のない健康的なボランティア一群を正常な対照群とした。

0093

表皮細胞サスペンションの標品
皮膚のバイオプシー試料角質部を用いて正常および障害のある皮膚の両方から得た後、50ユニット/mlのディスパーゼ(dispase)(Collaborative Research,Bedford,MA)を含有するダルベッコ(Dulbecco)のリン酸塩生理食塩水(「PBS」)(GibcoLabs,Grand Island,NY)に浸漬した。その後、該試料を4℃で18時間培養し、表皮部を内皮から除去した。

0094

これらの表皮シートを0.5%トリプシン(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO)を含有するダルベッコPBSに浸漬し、37℃で30分培養した。

0095

このようにトリプシンで処理した表皮シートを0.05%のデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)(Sigma)を含むダルベッコPBS中に移して細胞サスペンションにした。ウシ胎児血清(「FBS」)(Hyclone,Logan,UT)を不活性な残余トリプシンに加えた後、当該表皮細胞サスペンションを112μmナイロンフィルタ(Tetko,Elmsford,NY)に通した。この概ね単一細胞のサスペンションを1%FBSを含むダルベッコPBS中において3回洗浄した後、当該細胞を1%のペニシリンおよびストレプトマイシン、1%グルタミン(Gibco)および10%人間AB血清(Sigma)を含有するRPMI1640(Whittaker MA Bioproducts,Wakerfield,MD)から成る培養液中において再懸濁した。

0096

T細胞の単離および減少処理(Depletion)
末梢血液単核細胞(「MNC」)をフィコールハイパーク(Ficoll Hypaque:Pharmacia)密度勾配遠心分離を用いて当該製造者の指示するプロトコルにしたがってペパリン凝血防止した血液から単離した。マクロファージを37℃で1時間のプラスチック付着により除去した。次いで、非付着のマクロファージ減少されたMNCを洗浄した後、CD8+Tリンパ球、活性化T細胞B細胞、抗原提示細胞およびNK細胞を、CD8(ATCCCRL8014)、HLA−DR(ATCC CRL H355)およびCD11(ATCC CRL 8026)に対するモノクローナル抗体の存在下インキュベーションすることにより減少させた。これらの抗体はプリスタン注入したマウスの腹水液のPBS(1:200)における希釈液として用いた。

0097

この抗体処理したMNCを4℃で4.5nmの磁気粒子コートを用いて山羊抗マウスIgGの存在下に(DynabeadsM−450,Dynal,Oslo,Norway)1細胞当たり3ビーズ比率で培養した。次いで、抗体陽性細胞磁石(Advanced Magnetics,Cambridge,MA)に引き付けて減少させた。この場合、当該磁石を試験管側方に配して懸濁液中残存細胞デカンテーションを可能にした。さらに、デカンテーション処理した細胞懸濁液を再度磁石で処理してから残存細胞を収集した。その後、残存する抗体陽性細胞をさらに減少するために新鮮な山羊の抗マウスIgGビーズを再び収集した細胞の懸濁液に加え、このような磁気除去処理を繰り返した。次いで、細胞をPBS中で洗浄した後、使用する前に、培養液において再び懸濁した。このようにして、99%純度濃縮したCD4+Tリンパ球を含有し、固有の抗原提示活性のない標品を作成した。

0098

自己の乾癬細胞に対するTリンパ球の増殖応答
10万個のCD4+T細胞を丸底マイクロタイターウェル(Costar,Cambridge,MA)に10%人間AB血清(Sigma,St.Louis,MO)を含む0.2mlのRPMI中の8万個の乾癬表皮細胞と共に加えた。該1ウェル当たりの乾癬表皮細胞の数は当該数によりT細胞の自己反応的応答が誘引できたとするそれまでの実験結果から選択した。5%CO2/95%空気において37℃で6日間インキュベーションした後、1ウェル当たり1μCiの[3H]TdR(ICN Radiochemicals,Irvine,CA)を加え、18時間後に当該細胞をPHDセルハーベスタ上に収集した(Cambridge Technology Inc.,Cambridge,MA)。この[3H]TdRの取り込みはパッカード(Packard)シンチレーションカウンタ(Packard Instrument Co.,Downers Grover,IL)上で計測した。なお、当該[3H]TdR取み込み量はT細胞の増殖量に相当する。

0099

また、該T細胞(「TC」)のみまたは表皮細胞(「EC」)のみに対応する適当な対照の処理を上述のプロトコルを用いて行った。この結果、これらのアッセイにおいては[3H]TdRの取り込みが全く見られなかった。一方、乾癬表皮細胞に応じた自己T細胞の活発な増殖が見られた(データ示さず)。

0100

加えて、正常な皮膚に対する同種異系応答を試験するために、上述のプロトコルを10万個の同種異系T細胞および8万個の正常な皮膚細胞を用いて行った。この結果、これらの条件下において、当該同種異系T細胞の活発な増殖が見られた(データ示さず)。

0101

自己Tリンパ球増殖を刺激する乾癬表皮細胞の能力の 阻止
抗CD2モノクローナル抗体(TS2/18)(Sanchez−Madrid他、「人間Tリンパ球媒介の細胞溶解を伴う3種の異なる抗原:LFA−1、LFA−2およびLFA−3」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,pp.7489−93(1982)))、抗LFA−3モノクローナル抗体(7A6)(ATCCHB 10695)または無関係な特異性のイソタイプ適合型対照モノクローナル抗体(MOPC21,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)の[3H]TdR取り込み効果を、上述の如きプロトコルを用いて50μg/mlのそれぞれの抗体の存在下で計測した。

0102

第1図は、イソタイプ適合型対照抗体の存在下における増殖に対比した場合の、抗CD2または抗LFA−3の添加による障害乾癬表皮に対応する自己T細胞増殖の一貫した(n=4)実質的(約60%)阻害効果を示している。

0103

第1図は4人の患者のみのデータを示しているが、これら4人の患者は、なんらの抗原も当該システムに加えられていないにもかかわらず、自らの障害表皮に対する血液CD4+T細胞の自己反応性を示している。このことは異常な結果である。すなわち、正常な固体の同種異系血液T細胞の共通培養体および表皮細胞は反応しないからである。このような反応は当該皮膚内において生じた自己免疫反応のインビトロモデルであると考えられる。なお、他の二人の患者のEC標品は参考にならなかった。すなわち、これらのEC標品の一つはバクテリアにより汚染され、他の一つは自己反応性T細胞応答を誘発しない抗原提示細胞を含んでいたからである。

0104

また、50μg/mlの抗CD2または抗LFA−3抗体を上述の同種異系の正常皮膚アッセイに加えても、同種異系T細胞の活性化を阻止することがわかった。ただし、この場合の阻害の程度は乾癬障害の表皮細胞を用いた自己抗原提示細胞の活性に見られた結果(データ示さず)に比して実質的ではなかった(約40%)。

0105

また、イソタイプ適合型対照抗体(無関係な抗原に対して特異的)の添加は乾癬障害の表皮細胞により誘発した自己T細胞のT細胞増殖(データ示さず)の程度を実質的に変化させなかった。

0106

実験例2
実験対象
本調査には1人の成人を実験対象とした。プロトコルについて国内検閲局の認可を得た後、情報公開の同意を得た。当該実験に先立って、対象体において皮膚紅斑を誘発するに要する一組みの蛍光管FS40)からのUV Bの最小照射量を決定した。適度な日焼け(4個の最小の紅斑を生じる量)の照射を左の臀部に対して行い、3日後にUV障害の皮膚供給源とした。また、右臀部の未照射の皮膚を対照とした。

0107

表皮細胞サスペンションの標品
角質部を用いて当該正常および日焼けの皮膚から皮膚バイオプシー試料を得た。次いで、実験例1と実質的同一のプロトコルを用いてこれらの試料より表皮細胞のサスペンションを作成した。

0108

T細胞の単離および減少処理
末梢血液単核細胞(「MNC」)をフィコールハイパーク(Ficoll Hypaque:Pharmacia)密度勾配遠心分離を用いて当該製造者の指示するプロトコルにしたがって他の人間のペパリン凝血防止した血液から単離した。次いで、CD4+Tリンパ球を実験例1と概ね同様に作成した。

0109

同種異系のUV障害皮膚細胞に対するTリンパ球の増 殖応答
他の個体から得た10万個のCD4+T細胞を丸底のマイクロタイターウェル(Costar,Cambridge,MA)に当該対象体から得たUV障害の表皮細胞とともに加えて[3H]TdRの存在下でインキュベ−ションした後、収集した。その後、該[3H]TdRの取り込みを実験例1と概ね同様に計測した。なお、当該実験は抗原刺激が乾癬刺激性の自己抗原ではなくアロ抗原である点で実験例1と異なる。したがって、自己T細胞ではなく、同種異系のT細胞が使用されている。

0110

第2図は、UV障害表皮細胞(「EC+TC」)を用いてインキュベ−ションした場合の同種異系T細胞の活発な増殖の程度([3H]TdR取り込みによる計測値として)を示している。

0111

同種異系Tリンパ球増殖を刺激するUV障害表皮細胞の能力の阻止
抗LFA−3モノクローナル抗体(1E6)(ATCCHB 10693)、抗CD2モノクローナル抗体(TS2/18)(Sanchez−Madrid他、「人間Tリンパ球媒介の細胞溶解を伴う3種の異なる抗原:LFA−1、LFA−2およびLFA−3」(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,pp.7489−93(1982)))または無関係な特異性のイソタイプ適合型対照モノクローナル抗体(MOPC21,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)の[3H]TdR取り込み効果を、上述の如きプロトコルを用いて50μg/mlのそれぞれの抗体の存在下で計測した。

0112

第2図は、当該無関係な特異性のモノクローナル抗体(MOPC21,Sigma Chemical Co.)の存在下における[3H]TdRの取り込みが幾分減少していることを示している。しかしながら、抗LFA−3モノクローナル抗体1E6または抗CD2モノクローナル抗体TS2/18を添加すると、上記対照抗体の存在下における増殖に比して、実質的なT細胞増殖の阻害が生じた。

0113

寄託
本発明において有用なマウスのハイブリドーマ細胞および抗LFA−3抗体は1991年3月5日にブダペスト条約に基づきアメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville,Maryland,USA)に寄託された培養体により例示され,以下の如く同定される。

0114

指定名ATCC受入番号
1E6 HB 10393
HC−1B11 HB 10694
7A6 HB 10695
8B8 HB 10696
トランスメンブランLFA−3をコードするプラスミドのキャリヤであるバクテリオファージは1987年5月28日にブダペスト条約に基づきインビトロインターナシナル(In Vitro International,Inc.,Linthicum,Maryland,USA)に受入番号IVI−10133で寄託された。その後、当該寄託は1991年6月20日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに移され,以下の如く同定される。

0115

指定名ATCC受入番号
λHT16[λgt10/LFA−3] 75107
PI連結LFA−3をコードするプラスミドにより形質転換した大腸菌(E.coli)は1988年7月22日にブダペスト条約に基づきインビトロインターナショナル(In Vitro International,Inc.,Linthicum,Maryland,USA)に受入番号IVI−10180で寄託された。その後、当該寄託は1991年6月20日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに移され,以下の如く同定される。

0116

指定名ATCC受入番号
p24 68788
配列
以下は、配列リストにおいて述べた配列の概要である。

図面の簡単な説明

0117

SEQID NO:1トランスメンブランLFA−3のDNA配列
SEQ ID NO:2 トランスメンブランLFA−3のアミノ酸配列
SEQ ID NO:3 PI連結LFA−3のDNA配列
SEQ ID NO:4 PI連結LFA−3のアミノ酸配列
SEQ ID NO:5 CD2のDNA配列
SEQ ID NO:6 CD2のアミノ酸配列

0118

図1図1は、イソタイプ適合型対照抗体の存在下における増殖に対比した場合の、抗CD2または抗LFA−3の添加による障害乾癬表皮に対応する自己T細胞増殖の一貫した(n=4)実質的(約60%)阻害効果を示している。
図2図2は、当該無関係な特異性のモノクローナル抗体(MOPC21,Sigma Chemical Co.)の存在下における[3H]TdRの取り込みが幾分減少していることを示している。
シーケンスリスト
ID=000002HE=155 WI=098 LX=0560 LY=0300ID=000003 HE=155 WI=098 LX=0560 LY=0300ID=000004 HE=150 WI=098 LX=0560 LY=0300ID=000005 HE=140 WI=096 LX=0570 LY=0300ID=000006 HE=085 WI=086 LX=0620 LY=1700ID=000007 HE=100 WI=092 LX=0590 LY=0300ID=000008 HE=155 WI=098 LX=0560 LY=0300ID=000009 HE=115 WI=098 LX=0560 LY=0300ID=000010 HE=085 WI=096 LX=0570 LY=1450ID=000011 HE=080 WI=084 LX=0630 LY=0300ID=000012 HE=100 WI=082 LX=0640 LY=1100ID=000013 HE=155 WI=098 LX=0560 LY=0300ID=000014 HE=135 WI=098 LX=0560 LY=0300ID=000015 HE=135 WI=094 LX=0580 LY=0300ID=000016 HE=020 WI=094 LX=0580 LY=1650ID=000017 HE=140 WI=090 LX=0600 LY=0300ID=000018 HE=085 WI=082 LX=0640 LY=1700

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