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図面 (2)

課題

新規コポリマー1の提供。

解決手段

本発明は、40キロダルトンを超える分子量を有する種類が実質的にないコポリマー1を含むコポリマー1の改良された組成物に関する。

概要

背景

概要

新規コポリマー1の提供。

本発明は、40キロダルトンを超える分子量を有する種類が実質的にないコポリマー1を含むコポリマー1の改良された組成物に関する。

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請求項1

コポリマー1が約4〜約8キロダルトンの平均分子量を有することを特徴とするコポリマー1画分。

請求項2

コポリマー1が約6.25〜約8.4キロダルトンの平均分子量を有することを特徴とするコポリマー1画分。

請求項3

多発性硬化症治療のための組成物であって、医薬的に有効な量のコポリマー1画分であって、該画分中のコポリマー1が、約4〜約8キロダルトンの平均分子量を有する画分と、医薬として許容される担体と、を含む組成物。

請求項4

多発性硬化症の治療のための組成物であって、医薬的に有効な量のコポリマー1画分であって、該画分中のコポリマー1が、約6.25〜約8.4キロダルトンの平均分子量を有する画分と、医薬として許容される担体と、を含む組成物。

請求項5

要求される分子量のコポリマー1を製造する方法であって、保護されたコポリマー1を臭化水素酸と反応させて要求される分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルコポリマー1を形成するステップであって、該反応がテスト反応により予め決められた時間及び温度で行われるステップと、前記要求される分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルコポリマー1をピペリジン水溶液で処理して要求される分子量プロフィールを有するコポリマー1を形成するステップと、を含む方法。

請求項6

前記保護されたコポリマー1を、約10〜50時間、約20〜28℃の温度で臭化水素酸と反応させることを特徴とする請求項5に記載の方法。

請求項7

前記保護されたコポリマー1を、約17時間、約26℃の温度で臭化水素酸と反応させることを特徴とする請求項6に記載の方法。

請求項8

純粋な前記コポリマー1が、約5〜9キロダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項7に記載の方法。

請求項9

保護されたコポリマー1を臭化水素酸と反応させて要求される分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルコポリマー1を形成するステップであって、該反応がテスト規模の反応により予め決められた時間及び温度で行われるステップと、前記要求される分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルコポリマー1をピペリジン水溶液で処理して要求される分子量プロフィールを有するコポリマー1を形成するステップと、を含む方法により調製される要求される分子量プロフィールを有するコポリマー1。

請求項10

前記保護されたコポリマー1が、約10〜50時間、約20〜28℃の温度で臭化水素酸と反応させられることを特徴とする請求項9に記載のコポリマー1。

請求項11

前記保護されたコポリマー1が、約17時間、約26℃の温度で臭化水素酸と反応させられることを特徴とする請求項10に記載のコポリマー1。

請求項12

純粋な前記コポリマー1が、約5〜9キロダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項9に記載のコポリマー1。

請求項13

保護されたコポリマー1を、テスト反応により予め決められた時間及び温度で、臭化水素酸と反応させるステップを含む方法により生産される、要求される分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルコポリマー1。

請求項14

前記保護されたコポリマー1が、約10〜50時間、約20〜28℃の温度で、臭化水素酸と反応させられることを特徴とする請求項13に記載のトリフルオロアセチルコポリマー1。

請求項15

前記保護されたコポリマー1が、約17時間、約26℃の温度で、臭化水素酸と反応させられることを特徴とする請求項14に記載のトリフルオロアセチルコポリマー1。

請求項16

要求される分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルコポリマー1を製造する方法であって、保護されたコポリマー1を、テスト反応により予め決められた時間及び温度で、臭化水素酸と反応させるステップを含む方法。

請求項17

前記保護されたコポリマー1を、約10〜50時間、約20〜28℃の温度で、臭化水素酸と反応させることを特徴とする請求項16に記載の方法。

請求項18

前記保護されたコポリマー1を、約17時間、約26℃の温度で、臭化水素酸と反応させることを特徴とする請求項17に記載の方法。

--

20gのトリフルオロアセチルコポリマー1を 100gのピペリジンが添加された1リッターの水内に分散させる。この混合物を室温で24時間撹拌してろ過する。粗コポリマー1の溶液透析バッグ内に分注して、pH=8に達するまで水に対して10°〜20℃において透析する。その後約 0.3%の酢酸に対して透析して、pH= 5.5〜6.0 となるまで再びで透析する。その後この溶液を濃縮して凍結乾燥して乾燥状態にする。

0001

コポリマーの組成物における改良
本願は、1994年3月24日に出願されたU.S.S.N.08/248,037 の継続である1994年11月23日に出願されたU.S.S.N.08/344,248 の一部継続である。
発明の背景
コポリマー1(Copolymer-1)はミエリン鞘天然構成物であるミエリン塩基性蛋白質(MBP)の合成ポリペプチドアナログである。多発性硬化症のため潜在的な治療剤として示唆されている(Eur. J. Immunol. (1971) 1 : 242 ; 及びNeurol. Sci. (1977) 31 : 433) 。本明細書に言及される全ての引用は、その全体において引用により本明細書に組み込まれている。多発性硬化症のための免疫療法としてのコポリマー1における関心は、MBP のようなミエリン構成物が実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を防ぐ又は抑えるという1950年代に最初に示された観察結果から生じている。EAE は感受性のある動物において誘導され得る多発性硬化症に似た病気である。

0002

コポリマー1は、Weizmann Institute (Rehovot, Israel)においてDrs. Sela.Arnon、及び彼らの共同研究者らにより開発された。それはEAEを抑制することが示されている(Eur. J. Immunol. (1971) 1 : 242 ; 米国特許第 3,849,550号)。更に最近に、コポリマー1は多発性硬化症の憎悪−軽減形態における患者に有益であることが示されている(N. Engl. J. Med.(1987)317:408 )。コポリマー1の毎日注入治療された患者はほとんど悪化せず、対照患者よりその廃疾状態が少し増加した。

0003

コポリマー1は各々約6:2:5:1のモル比におけるアラニングルタミン酸リシン及びチロシンからなるペプチドの混合物である。それは、23,000ダルトンの平均分子量を有する産物を形成する4つのアミノ酸化学的重合することにより合成される(米国特許第 3,849,550号)。

0004

本発明の目的はコポリマー1の改良された組成物を提供することである。
発明の概略
本発明は、40キロダルトン(KDa)を超える分子量を有するコポリマー1の種類が実質的にないコポリマー1の組成物に関する。

0005

本発明は更に、約2KDa 〜約20KDa の範囲の分子量におけるコポリマー1の分子フラクションの75%超を有するコポリマー1に関する。

0006

更に、本発明は、約4〜約8.6KDaの平均分子量を有するコポリマー1に関する。

0007

更に本発明は、先に記載されるコポリマー1を用いる多発性硬化症の治療のための医薬組成物及び方法に関する。
発明の詳細な記載
本発明は40キロダルトン(KDa)を超える分子量を有するコポリマー1の種類が実質的にないコポリマー1の組成物に関する。好ましくは、組成物は40KDa 以上の分子量を有するコポリマーの種類の5%未満を含む。更に好ましくは、この組成物は、40KDa 以上の分子量を有するコポリマー1の種類の 2.5%未満を含む。

0008

本発明は更に、約2KDa 〜約20KDa の範囲の分子量におけるコポリマー1の分子のフラクションの75%超を有するコポリマー1に関する。

0009

更に、本発明は、約4〜約8.6KDaの平均分子量を有するコポリマー1に関する。特に、本発明は約4〜約8KDa の平均分子量を有するコポリマー1及び約6.25〜約8.4KDaの平均分子量を有するコポリマー1に関する。

0010

本発明に従うコポリマー1は、当該技術において周知である方法、例えばチロシン、アラニン、y−ベンジルグルタメート及びE−N−トリフルオロアセチルリシンイニシェーターとしてジエチルアミンを用いて無水ジオキサン中において周囲の温度において合成される米国特許第 3,849,550号において開示される方法により調整され得る。グルタミン酸のy−カルボキシル基デブロッキング(debloking)は氷酢酸中の臭化水素により行われ、次に1Mビペリジンによりリシン残基からトリフルオロアセチル基が除去される。適用の目的のために、“周囲温度”及び“室温”という言葉は約20〜約26℃の範囲の温度を意味すると理解されるべきである。

0011

必要とされる分子量プロファイルを有するコポリマー1はそれ自体周知である方法によりいずれにおいても得られうる。このような方法は高分子量の種類を含むコポリマー1のクロマトグラフィー及び不必要な種類を含まないフラクションの収集、又は部分酸又は酵素加水分解により高分子量種類を除去して次に透析もしくは限外ろ過による精製を含む。必要な分子量プロファイルを有するコポリマー1を得るための更なる方法は、アミノ酸がなお保護されてその後保護を除去することに直接よる正確な種類を得る必要な種類を調製することによる。本発明の組成物は当該技術において周知である慣用的方法により製剤される。好ましくは、組成物は凍結乾燥され、皮下注入に適した水溶液内に形成される。あるいは、コポリマー1はペプチド薬剤の経口、、又は直腸製剤を調製するための当該技術において周知である形態のいずれかにおいて調剤され得る。

0012

典型的には、コポリマー1は20mgの投与量において多発性硬化症を患う患者に毎日投与される。

0013

本発明は以下の実施例により例証されるであろうが必要に限定されない。
実施例1
低毒性コポリマー1の調製のクロマトグラフィー法コポリマー1の2つのバッチを当該技術において周知である方法、例えば米国特許第 3,849,550号に従って調製した。

0014

その後1つのバッチに以下に記載のようにクロマトグラフィー分離を行った。

0015

ゲルろ過のためのカラム、FRACTOGEL TSKHW 55 (600×26mm)を製造元説明書に従ってSuperformance 26 Merckカートリッジ中に調製した。カラムを水で平衡化してアセトン溶液を全容量決定のために注入した。このカラムを 0.2M酢酸アンモニウム緩衝液pH5.0 で平衡化した。30mlのコポリマー1サンプル(20mg/ml, 0.2M酢酸アンモニウムpH5.0 中)をカラム上に流して10分毎にフラクションを収集した。7〜8KDa の平均分子量を有するフラクションを 120〜130 分の間において単離した(バッチA)
分子量分
UVIKON 810分光光度計において 275nmにおけるUV吸収を測定した。サンプルを1吸収単位より低いUV吸収を得るために希釈した。2つのバッチの分子の分布検定用ゲルろ過カラム(Superose 12)上で測定した。

0016

コポリマー1バッチAが7〜8KDa の平均分子量を有することを見い出した。このバッチの 2.5%は32KDa を超える分子量を有していたが、40KDa を超える分子量を有するこのバッチ中に存在するコポリマー1種類はなかった。

0017

クロマトグラフィーを行っていないコポリマー1の他のバッチは12KDa の平均分子量を有していた。このバッチの 2.5%は42KDa を超える分子量を有し、このバッチ中の全コポリマー1種類の5%は40KDa を超える分子量を有していた。
実施例2
毒性分析
A:生体内
7.3 及び 8.4KDa (40KDaを超えるコポリマー1種類 2.5%未満)並びに22KDa(40KDaを超えるコポリマー1種類5%超)の平均分子量を有するコポリマー1の3つのバッチに以下に記載の毒性テストを行った。各々の場合において、各々の実験群において5のマウスを用いた。
方 法
コポリマー1を蒸留水中に溶解して2mg/mlの活性成分の溶液を作り出した。各々のマウスに外側尾部静脈に 0.5mlのテスト溶液を注入した。マウスを死及び関連する臨床的症状について48時間にわたり観察した。観察結果を注入後10分、24時間及び48時間に記録した。48時間の最後において全ての動物が生きており、不利な症状が観察されないのであれば、その後バッチを“非毒性”とした。しかしながら1以上のマウスが死ぬか又は不利な症状を示したならば、その後バッチを“毒性”とした。

0018

7.3及び8.4KDaの平均分子量を有するバッチは両方とも“非毒性”であり、一方22KDa の平均分子量を有するバッチにおいては、5のマウスの3以外が48時間の終りにおいて死んでおり、それは結果として“毒性”であった。

0019

B:試験管
RBL顆粒消失テスト
I.導 入
好塩基球から遊離したヒスタミン(又はセロトニン)は迅速な過敏症のための試験管内モデルである。ラット好塩基性白血病(Rat Basophilic Leukemia)細胞系統(RBL-2H3)を発達させ、高感受性の、均一な、培養において維持するのが容易な、及び繁殖可能な系として特徴づけた(E.L. Basumian, C. Isersky, M.G.Petrino and R.P. Siraganian. Eur. J. Immunol. 11, 317 (1981)) 。ヒスタミン遊離のための生理学刺激抗原メンブラン結合IgE分子への結合に関連し、これは後者の複雑な生化学カスケードを誘発する。これらの生理学的免疫グロブリン媒体誘発の他に、異なる非IgE 媒体刺激により顆粒消失が誘導され得る。これらの間は種々のペプチド及び合成ポリマー、例えばポリリシンである(R.P. Siraganian. Trendsin Pharmacological Sciences, October 432 (1983))。それゆえ、RBL 顆粒消失テストは、実質的な顆粒消失を引きおこし、これにより不必要な局所的及び/又は全身副作用を引きおこすコポリマー1のこれらのバッチを選択排除するために用いられる。
II.テスト方法原理
ラット好塩基性白血病細胞(RBL-2H3)に〔3H〕−セロトニンを入れ、次にテストされるべきコポリマー1 100μgと共にインキュベートした。非特異的顆粒消失を誘導するコポリマー1のバッチは培地内に〔3H〕−セロトニンを遊離する。培地中の放射能シンチレーションカウンターにより計数して細胞内に組み込まれた全放射能標識セロトニンをペレット状の細胞において測定する。顆粒消失の割合を全部の組み込まれたものから遊離したセロトニンの割合として計算する。
III .結 果
6,250 〜14,500の間の平均分子量を有するコポリマー1の4つのバッチを40KDa を超える分子量を有する種類の及びRBL の顆粒消失のための両方の割合(%)について分析した。結果を次の表に要約する。

0020

0021

見られ得るように、高分子量の種類の割合(%)が低い場合(2.5未満)、毒性を示すセロトニンの遊離割合(%)は低く、逆もまた同じである。
実施例3
トリフルオロアセチル−コポリマー1の調製
Teitelbaum et al. Eur. J. Immun. Vol. 1p. 242 (1971)により記載されるように 3.5リッターのジオキサン中に溶解されたチロシンのN−カルボキシ無水物(18g)、アラニン(50g)、y−ベンジルグルタメート(35g)及びトリフルオロアセチルリシン(83g)から保護されたコポリマー1を調製する。

0022

0.01〜0.02%ジエチルアミンを加えることにより重合過程を開始する。この反応混合物を室温で24時間、撹拌して、その後10リッターの水中に注ぐ。この産物(保護されたコポリマー1)をろ過して水で洗浄し、乾燥する。撹拌と共に6〜12時間、室温において氷酢酸中33%の臭化水素酸で保護されたコポリマー1を処理することによりグルタミン酸残基からγ−ベンジルブロッキング基の除去を行う。この産物を過剰な水中に注ぎ、ろ過して洗浄し、乾燥させてトリフルオロアセチル−コポリマー1を製造する。
実施例4
トリフルオロアセチル−コポリマー1の調製
Teitelbaum et al. Eur. J. Immun. Vol. 1p. 242 (1971)により記載されるように 3.5リッターのジオキサン中に溶解されたチロシンのN−カルボキシ無水物(18g)、アラニン(50g)、γ−ベンジルグルタメート(35g)及びトリフルオロアセチルリシン(83g)から保護されたコポリマー1を調製する。

0023

0.01〜0.02%ジエチルアミンを加えることにより重合過程を開始する。この反応混合物を室温で24時間撹拌して、その後10リッターの水中に注ぐ。この産物(保護されたコポリマー1)をろ過して水で洗浄し、乾燥させる。

0024

グルタミン酸残基の5−カルボキシレートからω−ベンジル保護基を除去してポリマーをより小さなポリペプチドに切断する酢酸中33%のHBr で、保護されたコポリマー1を処理する。分子量 7,000±2,000Da のコポリマー1を得るために必要な時間は反応温度及び保護されたコポリマー1の大きさによる。20〜28℃の間の温度において、異なる時間、例えば10〜50時間、それぞれのバッチにおいてテスト反応を行う。

0025

これらの小さなスケールの反応の分子量に関する結果を計算して、時間に対する分子量の曲線を描く。分子量 7,000±2,000Da を得るために必要とされる時間をこの曲線から計算してより大きなスケールの反応を行う。平均に基づくと、26℃での反応において時間は17時間である。この産物を過剰な水中に注いで、ろ過して、洗浄し、そして乾燥させて、トリフルオロアセチル−コポリマー1を製造する。

図面の簡単な説明

0026

低毒性コポリマー1の調製

0027

図1図1はコポリマー1の3つのバッチの分子量分布を示し、40KDa を超える分子量を有する種の割合を示す。
図2図2はそれらのモル分率についての同様のデータを示す。

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