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図面 (3)

課題

神経変性疾患治療(特に球脊髄性筋萎縮症)に有用な物質を得ることができるトランスジェニックショウジョウバエ、及びそれを用いたスクリーニング方法を提供する。

解決手段

前記トランスジェニックショウジョウバエは、グルタミン残基38個以上のポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体をコードする遺伝子を発現可能に組み込んでいる。また、前記スクリーニング方法は、前記トランスジェニックショウジョウバエに、ヒトアンドロゲン受容体リガンドと、試験物質とを投与する工程、及び前記ショウジョウバエの眼の形質変化を調べる工程を含む。

概要

背景

球脊髄性筋萎縮症(ケネディー病)は、顔面、及び四肢近位優位筋萎縮及び筋力低下を特徴とする下位運動ニューロン疾患であり、30〜50代の男性発症する神経変性疾患である(Kennedy,W.R.ら,Neurology,18,671−680,1968)。遺伝地図作成研究と機能解析により、アンドロゲン受容体(AR)遺伝子の第一エクソンに存在する、ポリグルタミンポリQ)をコードするトリヌクレオチドCAGの繰り返し部分の伸長増加が同定され、健常人ではグルタミン残基15〜35個のポリQの繰り返しが存在し、患者ではグルタミン残基38〜62個のポリQの繰り返しが存在することが判明した(La,S.A.ら,Nature,352,77−79,1991;Choong,C.S.及びWilson,E.M.,J.Mol.Endocrinol.,21,235−257,1998;Harry,t.Orr,Genes & Development,15,925−932,2001)。

本疾患の患者は、軽度のアンドロゲン不応症を伴うことが多く、これはポリQ伸長によるARの機能不全示唆している(Pinsky,L.ら,Clin.Invest.Med.,15,456−472,1992)。しかしながら、アンドロゲン完全不応症患者では、一般に、ケネディー病によると考えられる神経変性が見られないことから、ケネディー病における運動ニューロン細胞死は、単なるARの機能喪失によるものではないと考えられている(Young,E.L.ら,Lancet,344,826−827,1994;Brown,T.R.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8151−8155,1988)。

ハンチントン病(Trottier,Y.ら,Nature,378,403−406,1995)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症Igarashi,S.ら,Nat.Genet.,18,111−117,1998;Nagafuchi,S.ら,Nat.Genet.,8,177−182,1994)、又は脊髄小脳失調症(Imbert,G.ら,Nat.Genet.,14,285−291,1996;David,G.,Nat.Genet.,17,65−70,1997;Paulson,H.L.ら,Neuron,19,333−334,1997;Riess,O.ら,Hum.Mol.Genet.,6,1289−1293,1997)といった、ポリQ伸長を伴う他の神経変性疾患と同様に、球脊髄性筋萎縮症患者では、原因の変異遺伝子産物の凝集体を伴う一部ニューロン欠落が観察される。それぞれの変異遺伝子産物特異的な機序と共に、異常なタンパク質の折り畳みによって生じると考えられるこれらの凝集体が、共通の神経毒性機序によって神経細胞死を引き起こすと考えられている(Ross,C.A.ら,Neuron,19,1147−1150,1997;Kim,T.W.及びTanzi,R.E.Neuron,21,657−659,1998)。

また、培養細胞において、ポリQの伸長したARは転写活性の低下を示し、細胞質及び核内で凝集体を形成することが示されたが、この凝集体形成にはリガンド結合が必須であった(Stenoien,D.L.ら,Hum.Mol.Genet.,8,731-741,1999)。このリガンド依存的な凝集体の形成は、ポリQ伸長を伴うAR変異体特異的であり、ポリQ伸長を伴う他の神経変性疾患の原因である変異遺伝子産物では見られていない。更に、本疾患は、変異ARを有する女性では発症せず、変異を有する男性のみで、しかも、30歳以上で発症することから、変異ARへのリガンド結合が発症に重要な可能性が考えられている。

ARは、ステロイド甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーに属し、リガンド誘導性転写因子として働く(Beato,M.ら,Cell,83,851−857,1995;Mangelsdorf,D.J.ら,Cell,83,835−839,1995;Chambon,P.,Faseb J.,10,940−954,1996)。アンドロゲンは、ARを介した標的遺伝子転写調節を通じて、男性生殖器官その他の標的組織発達及び維持並びに男性の性行動に作用する(Zhou,Z.X.ら,Rec.Prog.Hor.Res.,49,249−274,1994)。

核内受容体ファミリーは、異なった機能領域を有するA〜E(F)の共通(領域)構造を持つ(Danielian,P.S.ら,EMBO J.,11,1025−1033,1992;Durand,B.ら,EMBO J.,13,5370−5382,1994)。DNA結合領域は、保存度の高いC領域に存在し、リガンド結合領域は、保存度の低いC末のE/F領域に存在する。ARを含む多くの核内受容体の解析から、リガンド結合領域は、12個のヘリックスからなり、リガンドを捕らえるポケットを形成することが判明している(Shiau,A.K.ら,Cell,95,927−937,1998;Westin,S.ら,Nature,395,199−202,1998;Poujol,N.ら,J.Biol.Chem.,275,24022−24031,2000)。最もC末側にあるヘリックス12は、リガンドが結合すると移動し、ヘリックス3〜5と共に相互作用領域を形成し、共役抑制因子複合体の解離共役活性化因子複合体の結合に重要な役割を果たす(Freedman,L.P.ら,Cell,97,5−8,1999;Glass,C.K.及びRosenfeld,M.G.,Genes Dev.,14,121−141,2000)。

ステロイド受容体N末のA/B領域とリガンド結合領域の二つの領域は、リガンド誘導性の転写活性化において共役因子との相互作用に働く(He,B.ら,J.Biol.Chem.,274,37219−37225,1999;Watanabe,M.ら,EMBO J.,20,1341−1352,2001)。これらは、リガンド依存性に関しては性質を異にし、A/B領域に存在する転写活性化能(AF)−1それ自身は、リガンド非依存性で、一方、リガンド結合領域に存在するAF−2は、リガンド結合によって誘導される(Tasset,D.ら,Cell,62,1177−1187,1990;Kato,S.ら,Science,270,1491−1494,1995)。すなわち、リガンドが結合していない状態では、リガンド結合領域はAF−1活性を抑制しており、リガンド結合領域へのリガンドの結合によってAF−2活性が誘発されると同時に、ステロイド受容体の分子内の全体構造の変化によって、AF−1活性の抑制が解除されると考えられている(Fuse,H.ら,Mol.Endocrinol.,14,889−899,2000)。

概要

神経変性疾患治療(特に球脊髄性筋萎縮症)に有用な物質を得ることができるトランスジェニックショウジョウバエ、及びそれを用いたスクリーニング方法を提供する。

前記トランスジェニックショウジョウバエは、グルタミン残基38個以上のポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体をコードする遺伝子を発現可能に組み込んでいる。また、前記スクリーニング方法は、前記トランスジェニックショウジョウバエに、ヒトアンドロゲン受容体リガンドと、試験物質とを投与する工程、及び前記ショウジョウバエの眼の形質変化を調べる工程を含む。

目的

従って、本発明の課題は、神経変性疾患治療(特に球脊髄性筋萎縮症)に有用な物質を得ることができるトランスジェニックショウジョウバエ、及びそれを用いたスクリーニング方法を提供することにある。

効果

実績

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請求項1

グルタミン残基38個以上のポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体をコードする遺伝子を発現可能に有することを特徴とする、トランスジェニックショウジョウバエ

請求項2

前記遺伝子が、配列番号3で表される塩基配列からなるDNAである、請求項1に記載のトランスジェニックショウジョウバエ。

請求項3

請求項1又は2に記載のトランスジェニックショウジョウバエに、ヒトアンドロゲン受容体リガンドと、試験物質とを投与する工程、及び前記ショウジョウバエの眼の形質変化を調べる工程を含むことを特徴とする、神経変性疾患治療に有用な物質スクリーニングする方法。

発明の効果

0001

本発明は、ヒトアンドロゲン受容体発現ショウジョウバエに関する。

背景技術

0001

本発明は、新規神経変性疾患治療(特に球脊髄性筋萎縮症)のモデルとなるトランスジェニックショウジョウバエを提供した。本発明のトランスジェニックショウジョウバエによれば、公知の培養細胞系での転写レポーターアッセイなどでは見いだし得ない、神経変性疾患治療(特に球脊髄性筋萎縮症)に有用な物質を得ることができる。

0002

0002

球脊髄性筋萎縮症(ケネディー病)は、顔面、及び四肢近位優位筋萎縮及び筋力低下を特徴とする下位運動ニューロン疾患であり、30〜50代の男性発症する神経変性疾患である(Kennedy,W.R.ら,Neurology,18,671−680,1968)。遺伝地図作成研究と機能解析により、アンドロゲン受容体(AR)遺伝子の第一エクソンに存在する、ポリグルタミンポリQ)をコードするトリヌクレオチドCAGの繰り返し部分の伸長増加が同定され、健常人ではグルタミン残基15〜35個のポリQの繰り返しが存在し、患者ではグルタミン残基38〜62個のポリQの繰り返しが存在することが判明した(La,S.A.ら,Nature,352,77−79,1991;Choong,C.S.及びWilson,E.M.,J.Mol.Endocrinol.,21,235−257,1998;Harry,t.Orr,Genes & Development,15,925−932,2001)。

0003

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
<120> Drosophila expressing human androgen receptor
<130> YAM013071P

<160> 17
<210> 1
<211> 2760
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2760)
<400> 1
atg gaa gtg cag tta ggg ctg gga agg gtc tac cct cgg ccg ccg tcc 48
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
aag acc tac cga gga gct ttc cag aat ctg ttc cag agc gtg cgc gaa 96
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
gtg atc cag aac ccg ggc ccc agg cac cca gag gcc gcg agc gca gca 144
Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala
35 40 45
cct ccc ggc gcc agt ttg ctg ctg ctg cag cag cag cag cag cag cag 192
Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
50 55 60
cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag caa gag act 240
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr
65 70 75 80
agc ccc agg cag cag cag cag cag cag ggt gag gat ggt tct ccc caa 288
Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln
85 90 95
gcc cat cgt aga ggc ccc aca ggc tac ctg gtc ctg gat gag gaa cag 336
Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln
100 105 110
caa cct tca cag ccg cag tcg gcc ctg gag tgc cac ccc gag aga ggt 384
Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly
115 120 125
tgc gtc cca gag cct gga gcc gcc gtg gcc gcc agc aag ggg ctg ccg 432
Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro
130 135 140
cag cag ctg cca gca cct ccg gac gag gat gac tca gct gcc cca tcc 480
Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
acg ttg tcc ctg ctg ggc ccc act ttc ccc ggc tta agc agc tgc tcc 528
Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser
165 170 175
gct gac ctt aaa gac atc ctg agc gag gcc agc acc atg caa ctc ctt 576
Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu Leu
180 185 190
cag caa cag cag cag gaa gca gta tcc gaa ggc agc agc agc ggg aga 624
Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg
195 200 205
gcg agg gag gcc tcg ggg gct ccc act tcc tcc aag gac aat tac tta 672
Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr Leu
210 215 220
ggg ggc act tcg acc att tct gac aac gcc aag gag ttg tgt aag gca 720
Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala
225 230 235 240
gtg tcg gtg tcc atg ggc ctg ggt gtg gag gcg ttg gag cat ctg agt 768
Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser
245 250 255
cca ggg gaa cag ctt cgg ggg gat tgc atg tac gcc cca ctt ttg gga 816
Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly
260 265 270
gtt cca ccc gct gtg cgt ccc act cct tgt gcc cca ttg gcc gaa tgc 864
Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys
275 280 285
aaa ggt tct ctg cta gac gac agc gca ggc aag agc act gaa gat act 912
Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp Thr
290 295 300

gct gag tat tcc cct ttc aag gga ggt tac acc aaa ggg cta gaa ggc 960
Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu Glu Gly
305 310 315 320
gag agc cta ggc tgc tct ggc agc gct gca gca ggg agc tcc ggg aca 1008
Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Thr
325 330 335
ctt gaa ctg ccg tct acc ctg tct ctc tac aag tcc gga gca ctg gac 1056
Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Leu Asp
340 345 350
gag gca gct gcg tac cag agt cgc gac tac tac aac ttt cca ctg gct 1104
Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala
355 360 365
ctg gcc gga ccg ccg ccc cct ccg ccg cct ccc cat ccc cac gct cgc 1152
Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala Arg
370 375 380
atc aag ctg gag aac ccg ctg gac tac ggc agc gcc tgg gcg gct gcg 1200
Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala Ala Ala
385 390 395 400
gcg gcg cag tgc cgc tat ggg gac ctg gcg agc ctg cat ggc gcg ggt 1248
Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala Gly
405 410 415

gca gcg gga ccc ggt tct ggg tca ccc tca gcc gcc gct tcc tca tcc 1296
Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser
420 425 430
tgg cac act ctc ttc aca gcc gaa gaa ggc cag ttg tat gga ccg tgt 1344
Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro Cys
435 440 445
ggt ggt ggt ggg ggt ggt ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc 1392
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc gag gcg gga gct gta gcc ccc tac 1440
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr
465 470 475 480
ggc tac act cgg ccc cct cag ggg ctg gcg ggc cag gaa agc gac ttc 1488
Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe
485 490 495
acc gca cct gat gtg tgg tac cct ggc ggc atg gtg agc aga gtg ccc 1536
Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val Pro
500 505 510
tat ccc agt ccc act tgt gtc aaa agc gaa atg ggc ccc tgg atg gat 1584
Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Asp
515 520 525
agc tac tcc gga cct tac ggg gac atg cgt ttg gag act gcc agg gac 1632
Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp
530 535 540
cat gtt ttg ccc att gac tat tac ttt cca ccc cag aag acc tgc ctg 1680
His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys Leu
545 550 555 560
atc tgt gga gat gaa gct tct ggg tgt cac tat gga gct ctc aca tgt 1728
Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys
565 570 575
gga agc tgc aag gtc ttc ttc aaa aga gcc gct gaa ggg aaa cag aag 1776
Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys
580 585 590
tac ctg tgc gcc agc aga aat gat tgc act att gat aaa ttc cga agg 1824
Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg
595 600 605
aaa aat tgt cca tct tgt cgt ctt cgg aaa tgt tat gaa gca ggg atg 1872
Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met
610 615 620
act ctg gga gcc cgg aag ctg aag aaa ctt ggt aat ctg aaa cta cag 1920
Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln
625 630 635 640
gag gaa gga gag gct tcc agc acc acc agc ccc act gag gag aca acc 1968
Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Thr
645 650 655
cag aag ctg aca gtg tca cac att gaa ggc tat gaa tgt cag ccc atc 2016
Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile
660 665 670
ttt ctg aat gtc ctg gaa gcc att gag cca ggt gta gtg tgt gct gga 2064
Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly
675 680 685
cac gac aac aac cag ccc gac tcc ttt gca gcc ttg ctc tct agc ctc 2112
His Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu
690 695 700
aat gaa ctg gga gag aga cag ctt gta cac gtg gtc aag tgg gcc aag 2160
Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val His Val Val Lys Trp Ala Lys
705 710 715 720
gcc ttg cct ggc ttc cgc aac tta cac gtg gac gac cag atg gct gtc 2208
Ala Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala Val
725 730 735
att cag tac tcc tgg atg ggg ctc atg gtg ttt gcc atg ggc tgg cga 2256
Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu Met Val Phe Ala Met Gly Trp Arg
740 745 750
tcc ttc acc aat gtc aac tcc agg atg ctc tac ttc gcc cct gat ctg 2304
Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu
755 760 765

gtt ttc aat gag tac cgc atg cac aag tcc cgg atg tac agc cag tgt 2352
Val Phe Asn Glu Tyr Arg Met His Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln Cys
770 775 780
gtc cga atg agg cac ctc tct caa gag ttt gga tgg ctc caa atc acc 2400
Val Arg Met Arg His Leu Ser Gln Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile Thr
785 790 795 800
ccc cag gaa ttc ctg tgc atg aaa gca ctg cta ctc ttc agc att att 2448
Pro Gln Glu Phe Leu Cys Met Lys Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile Ile
805 810 815
cca gtg gat ggg ctg aaa aat caa aaa ttc ttt gat gaa ctt cga atg 2496
Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met
820 825 830
aac tac atc aag gaa ctc gat cgt atc att gca tgc aaa aga aaa aat 2544
Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys Asn
835 840 845
ccc aca tcc tgc tca aga cgc ttc tac cag ctc acc aag ctc ctg gac 2592
Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp
850 855 860
tcc gtg cag cct att gcg aga gag ctg cat cag ttc act ttt gac ctg 2640
Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu
865 870 875 880

cta atc aag tca cac atg gtg agc gtg gac ttt ccg gaa atg atg gca 2688
Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala
885 890 895
gag atc atc tct gtg caa gtg ccc aag atc ctt tct ggg aaa gtc aag 2736
Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val Lys
900 905 910
ccc atc tat ttc cac acc cag tga 2760
Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln
915 920
<210> 2
<211> 919
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr
65 70 75 80
Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln
100 105 110
Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly
115 120 125
Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro
130 135 140
Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser
165 170 175
Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu Leu
180 185 190
Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg
195 200 205
Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr Leu
210 215 220
Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala
225 230 235 240
Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser
245 250 255
Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly
260 265 270
Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys
275 280 285
Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp Thr
290 295 300
Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu Glu Gly
305 310 315 320
Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Thr
325 330 335
Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Leu Asp
340 345 350
Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala
355 360 365
Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala Arg
370 375 380
Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala Ala Ala
385 390 395 400
Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala Gly
405 410 415
Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser
420 425 430
Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro Cys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr
465 470 475 480
Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe
485 490 495
Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val Pro
500 505 510
Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Asp
515 520 525
Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp
530 535 540
His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys Leu
545 550 555 560
Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys
565 570 575
Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys
580 585 590
Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg
595 600 605
Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met
610 615 620
Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln
625 630 635 640
Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Thr
645 650 655
Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile
660 665 670
Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly
675 680 685
His Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu
690 695 700
Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val His Val Val Lys Trp Ala Lys
705 710 715 720
Ala Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala Val
725 730 735
Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu Met Val Phe Ala Met Gly Trp Arg
740 745 750
Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu
755 760 765
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770 775 780
Val Arg Met Arg His Leu Ser Gln Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile Thr
785 790 795 800
Pro Gln Glu Phe Leu Cys Met Lys Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile Ile
805 810 815
Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met
820 825 830
Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys Asn
835 840 845
Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp
850 855 860
Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu
865 870 875 880
Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala
885 890 895
Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val Lys
900 905 910
Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln
915
<210> 3
<211> 2856
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: a nucleotide
sequence encoding human androgen receptor mutant
hAR(Q52)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2856)
<400> 3
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Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
aag acc tac cga gga gct ttc cag aat ctg ttc cag agc gtg cgc gaa 96
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
gtg atc cag aac ccg ggc ccc agg cac cca gag gcc gcg agc gca gca 144
Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala
35 40 45
cct ccc ggc gcc agt ttg ctg ctg ctg cag cag cag cag cag cag cag 192
Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
50 55 60
cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag 240
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
65 70 75 80
cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag 288
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
85 90 95
cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag caa gag act 336
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr
100 105 110
agc ccc agg cag cag cag cag cag cag ggt gag gat ggt tct ccc caa 384
Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln
115 120 125
gcc cat cgt aga ggc ccc aca ggc tac ctg gtc ctg gat gag gaa cag 432
Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln
130 135 140
caa cct tca cag ccg cag tcg gcc ctg gag tgc cac ccc gag aga ggt 480
Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly
145 150 155 160
tgc gtc cca gag cct gga gcc gcc gtg gcc gcc agc aag ggg ctg ccg 528
Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro
165 170 175
cag cag ctg cca gca cct ccg gac gag gat gac tca gct gcc cca tcc 576
Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser
180 185 190
acg ttg tcc ctg ctg ggc ccc act ttc ccc ggc tta agc agc tgc tcc 624
Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser
195 200 205
gct gac ctt aaa gac atc ctg agc gag gcc agc acc atg caa ctc ctt 672
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210 215 220
cag caa cag cag cag gaa gca gta tcc gaa ggc agc agc agc ggg aga 720
Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg
225 230 235 240
gcg agg gag gcc tcg ggg gct ccc act tcc tcc aag gac aat tac tta 768
Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr Leu
245 250 255
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Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala
260 265 270
gtg tcg gtg tcc atg ggc ctg ggt gtg gag gcg ttg gag cat ctg agt 864
Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser
275 280 285
cca ggg gaa cag ctt cgg ggg gat tgc atg tac gcc cca ctt ttg gga 912
Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly
290 295 300
gtt cca ccc gct gtg cgt ccc act cct tgt gcc cca ttg gcc gaa tgc 960
Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys
305 310 315 320

aaa ggt tct ctg cta gac gac agc gca ggc aag agc act gaa gat act 1008
Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp Thr
325 330 335
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340 345 350
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420 425 430

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Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr
500 505 510
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Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val Pro
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tat ccc agt ccc act tgt gtc aaa agc gaa atg ggc ccc tgg atg gat 1680
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Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp
565 570 575
cat gtt ttg ccc att gac tat tac ttt cca ccc cag aag acc tgc ctg 1776
His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys Leu
580 585 590
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Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys
595 600 605
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Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys
610 615 620
tac ctg tgc gcc agc aga aat gat tgc act att gat aaa ttc cga agg 1920
Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg
625 630 635 640
aaa aat tgt cca tct tgt cgt ctt cgg aaa tgt tat gaa gca ggg atg 1968
Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met
645 650 655
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Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln
660 665 670
gag gaa gga gag gct tcc agc acc acc agc ccc act gag gag aca acc 2064
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His Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu
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tcc ttc acc aat gtc aac tcc agg atg ctc tac ttc gcc cct gat ctg 2400
Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu
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Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met
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Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu
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Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala
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<211> 951
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: an amino acid
sequence of human androgen receptor mutant hAR(Q52)
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr
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Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala Arg
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435 440 445
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465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr
500 505 510
Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe
515 520 525
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645 650 655
Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln
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Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile
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740 745 750
Ala Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala Val
755 760 765
Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu Met Val Phe Ala Met Gly Trp Arg
770 775 780
Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu
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820 825 830
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Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met
850 855 860
Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys Asn
865 870 875 880
Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp
885 890 895
Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu
900 905 910
Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala
915 920 925
Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val Lys
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Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln
945 950

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<211> 2070
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<221> CDS
<222> (1)..(2070)
<400> 5
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Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
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Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly
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130 135 140
cag cag ctg cca gca cct ccg gac gag gat gac tca gct gcc cca tcc 480
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195 200 205
gcg agg gag gcc tcg ggg gct ccc act tcc tcc aag gac aat tac tta 672
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Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala
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gtg tcg gtg tcc atg ggc ctg ggt gtg gag gcg ttg gag cat ctg agt 768
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Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly
260 265 270
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340 345 350
gag gca gct gcg tac cag agt cgc gac tac tac aac ttt cca ctg gct 1104
Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala
355 360 365
ctg gcc gga ccg ccg ccc cct ccg ccg cct ccc cat ccc cac gct cgc 1152
Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala Arg
370 375 380
atc aag ctg gag aac ccg ctg gac tac ggc agc gcc tgg gcg gct gcg 1200
Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala Ala Ala
385 390 395 400
gcg gcg cag tgc cgc tat ggg gac ctg gcg agc ctg cat ggc gcg ggt 1248
Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala Gly
405 410 415

gca gcg gga ccc ggt tct ggg tca ccc tca gcc gcc gct tcc tca tcc 1296
Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser
420 425 430
tgg cac act ctc ttc aca gcc gaa gaa ggc cag ttg tat gga ccg tgt 1344
Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro Cys
435 440 445
ggt ggt ggt ggg ggt ggt ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc 1392
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc gag gcg gga gct gta gcc ccc tac 1440
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr
465 470 475 480
ggc tac act cgg ccc cct cag ggg ctg gcg ggc cag gaa agc gac ttc 1488
Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe
485 490 495
acc gca cct gat gtg tgg tac cct ggc ggc atg gtg agc aga gtg ccc 1536
Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val Pro
500 505 510
tat ccc agt ccc act tgt gtc aaa agc gaa atg ggc ccc tgg atg gat 1584
Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Asp
515 520 525

agc tac tcc gga cct tac ggg gac atg cgt ttg gag act gcc agg gac 1632
Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp
530 535 540
cat gtt ttg ccc att gac tat tac ttt cca ccc cag aag acc tgc ctg 1680
His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys Leu
545 550 555 560
atc tgt gga gat gaa gct tct ggg tgt cac tat gga gct ctc aca tgt 1728
Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys
565 570 575
gga agc tgc aag gtc ttc ttc aaa aga gcc gct gaa ggg aaa cag aag 1776
Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys
580 585 590
tac ctg tgc gcc agc aga aat gat tgc act att gat aaa ttc cga agg 1824
Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg
595 600 605
aaa aat tgt cca tct tgt cgt ctt cgg aaa tgt tat gaa gca ggg atg 1872
Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met
610 615 620
act ctg gga gcc cgg aag ctg aag aaa ctt ggt aat ctg aaa cta cag 1920
Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln
625 630 635 640
gag gaa gga gag gct tcc agc acc acc agc ccc act gag gag aca acc 1968
Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Thr
645 650 655
cag aag ctg aca gtg tca cac att gaa ggc tat gaa tgt cag ccc atc 2016
Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile
660 665 670
ttt ctg aat gtc ctg gaa gcc att gag cca ggt gta gtg tgt gct gga 2064
Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly
675 680 685
cac gac 2070
His Asp
690
<210> 6
<211> 690
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr
65 70 75 80
Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln
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Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln
100 105 110
Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly
115 120 125
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Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg
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225 230 235 240
Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser
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Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala
355 360 365
Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala Arg
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385 390 395 400
Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala Gly
405 410 415
Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser
420 425 430
Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro Cys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr
465 470 475 480
Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe
485 490 495
Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val Pro
500 505 510
Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Asp
515 520 525
Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp
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565 570 575
Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys
580 585 590
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gct gaa ggg aaa cag aag tac ctg tgc gcc agc aga aat gat tgc act 144
Ala Glu Gly Lys Gln Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Ala Leu Leu Ser Ser Leu Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val His
145 150 155 160
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ttt gat gaa ctt cga atg aac tac atc aag gaa ctc gat cgt atc att 864
Phe Asp Glu Leu Arg Met Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ile
275 280 285
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<211> 365
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<210> 9
<211> 2166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: a nucleotide
sequence encoding human androgen receptor mutant
hAR(Q52AF-1)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2166)
<400> 9
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cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag 240
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag 288
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
85 90 95
cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag caa gag act 336
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr
100 105 110
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Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln
115 120 125
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Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln
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Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro
165 170 175
cag cag ctg cca gca cct ccg gac gag gat gac tca gct gcc cca tcc 576
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acg ttg tcc ctg ctg ggc ccc act ttc ccc ggc tta agc agc tgc tcc 624
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Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg
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Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala
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Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr
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Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe
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530 535 540

tat ccc agt ccc act tgt gtc aaa agc gaa atg ggc ccc tgg atg gat 1680
Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Asp
545 550 555 560
agc tac tcc gga cct tac ggg gac atg cgt ttg gag act gcc agg gac 1728
Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp
565 570 575
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645 650 655

act ctg gga gcc cgg aag ctg aag aaa ctt ggt aat ctg aaa cta cag 2016
Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln
660 665 670
gag gaa gga gag gct tcc agc acc acc agc ccc act gag gag aca acc 2064
Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Thr
675 680 685
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Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile
690 695 700
ttt ctg aat gtc ctg gaa gcc att gag cca ggt gta gtg tgt gct gga 2160
Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly
705 710 715 720
cac gac 2166
His Asp
<210> 10
<211> 722
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: an amino acid
sequence of human androgen receptor mutant hAR(Q52AF-1)
<400> 10
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
65 70 75 80
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
85 90 95
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr
100 105 110
Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln
115 120 125
Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln
130 135 140
Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly
145 150 155 160

Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro
165 170 175
Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser
180 185 190
Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser
195 200 205
Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu Leu
210 215 220
Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg
225 230 235 240
Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr Leu
245 250 255
Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala
260 265 270
Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser
275 280 285
Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly
290 295 300
Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys
305 310 315 320

Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp Thr
325 330 335
Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu Glu Gly
340 345 350
Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Thr
355 360 365
Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Leu Asp
370 375 380
Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala
385 390 395 400
Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala Arg
405 410 415
Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala Ala Ala
420 425 430
Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala Gly
435 440 445
Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser
450 455 460
Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro Cys
465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr
500 505 510
Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe
515 520 525
Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val Pro
530 535 540
Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Asp
545 550 555 560
Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp
565 570 575
His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys Leu
580 585 590
Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys
595 600 605
Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys
610 615 620

Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg
625 630 635 640
Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met
645 650 655
Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln
660 665 670
Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Thr
675 680 685
Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile
690 695 700
Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly
705 710 715 720
His Asp
<210> 11
<211> 2025
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: a nucleotide
sequence encoding human androgen receptor mutant
hAR(Q5AF-1)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2025)
<400> 11
atg gaa gtg cag tta ggg ctg gga agg gtc tac cct cgg ccg ccg tcc 48
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
aag acc tac cga gga gct ttc cag aat ctg ttc cag agc gtg cgc gaa 96
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
gtg atc cag aac ccg ggc ccc agg cac cca gag gcc gcg agc gca gca 144
Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala
35 40 45
cct ccc ggc gcc agt ttg ctg ctg ctg cag cag cag cag cag caa gag 192
Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu
50 55 60
act agc ccc agg cag cag cag cag cag cag ggt gag gat ggt tct ccc 240
Thr Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro
65 70 75 80

caa gcc cat cgt aga ggc ccc aca ggc tac ctg gtc ctg gat gag gaa 288
Gln Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu
85 90 95
cag caa cct tca cag ccg cag tcg gcc ctg gag tgc cac ccc gag aga 336
Gln Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg
100 105 110
ggt tgc gtc cca gag cct gga gcc gcc gtg gcc gcc agc aag ggg ctg 384
Gly Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu
115 120 125
ccg cag cag ctg cca gca cct ccg gac gag gat gac tca gct gcc cca 432
Pro Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro
130 135 140
tcc acg ttg tcc ctg ctg ggc ccc act ttc ccc ggc tta agc agc tgc 480
Ser Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys
145 150 155 160
tcc gct gac ctt aaa gac atc ctg agc gag gcc agc acc atg caa ctc 528
Ser Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu
165 170 175
ctt cag caa cag cag cag gaa gca gta tcc gaa ggc agc agc agc ggg 576
Leu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly
180 185 190
aga gcg agg gag gcc tcg ggg gct ccc act tcc tcc aag gac aat tac 624
Arg Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr
195 200 205
tta ggg ggc act tcg acc att tct gac aac gcc aag gag ttg tgt aag 672
Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys
210 215 220
gca gtg tcg gtg tcc atg ggc ctg ggt gtg gag gcg ttg gag cat ctg 720
Ala Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu
225 230 235 240
agt cca ggg gaa cag ctt cgg ggg gat tgc atg tac gcc cca ctt ttg 768
Ser Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu
245 250 255
gga gtt cca ccc gct gtg cgt ccc act cct tgt gcc cca ttg gcc gaa 816
Gly Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu
260 265 270
tgc aaa ggt tct ctg cta gac gac agc gca ggc aag agc act gaa gat 864
Cys Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp
275 280 285
act gct gag tat tcc cct ttc aag gga ggt tac acc aaa ggg cta gaa 912
Thr Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu Glu
290 295 300
ggc gag agc cta ggc tgc tct ggc agc gct gca gca ggg agc tcc ggg 960
Gly Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly
305 310 315 320
aca ctt gaa ctg ccg tct acc ctg tct ctc tac aag tcc gga gca ctg 1008
Thr Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Leu
325 330 335
gac gag gca gct gcg tac cag agt cgc gac tac tac aac ttt cca ctg 1056
Asp Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu
340 345 350
gct ctg gcc gga ccg ccg ccc cct ccg ccg cct ccc cat ccc cac gct 1104
Ala Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala
355 360 365
cgc atc aag ctg gag aac ccg ctg gac tac ggc agc gcc tgg gcg gct 1152
Arg Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala Ala
370 375 380
gcg gcg gcg cag tgc cgc tat ggg gac ctg gcg agc ctg cat ggc gcg 1200
Ala Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala
385 390 395 400
ggt gca gcg gga ccc ggt tct ggg tca ccc tca gcc gcc gct tcc tca 1248
Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser
405 410 415
tcc tgg cac act ctc ttc aca gcc gaa gaa ggc cag ttg tat gga ccg 1296
Ser Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro
420 425 430

tgt ggt ggt ggt ggg ggt ggt ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc 1344
Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
435 440 445
ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc gag gcg gga gct gta gcc ccc 1392
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro
450 455 460
tac ggc tac act cgg ccc cct cag ggg ctg gcg ggc cag gaa agc gac 1440
Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp
465 470 475 480
ttc acc gca cct gat gtg tgg tac cct ggc ggc atg gtg agc aga gtg 1488
Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val
485 490 495
ccc tat ccc agt ccc act tgt gtc aaa agc gaa atg ggc ccc tgg atg 1536
Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met
500 505 510
gat agc tac tcc gga cct tac ggg gac atg cgt ttg gag act gcc agg 1584
Asp Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg
515 520 525
gac cat gtt ttg ccc att gac tat tac ttt cca ccc cag aag acc tgc 1632
Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys
530 535 540

ctg atc tgt gga gat gaa gct tct ggg tgt cac tat gga gct ctc aca 1680
Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr
545 550 555 560
tgt gga agc tgc aag gtc ttc ttc aaa aga gcc gct gaa ggg aaa cag 1728
Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln
565 570 575
aag tac ctg tgc gcc agc aga aat gat tgc act att gat aaa ttc cga 1776
Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg
580 585 590
agg aaa aat tgt cca tct tgt cgt ctt cgg aaa tgt tat gaa gca ggg 1824
Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly
595 600 605
atg act ctg gga gcc cgg aag ctg aag aaa ctt ggt aat ctg aaa cta 1872
Met Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu
610 615 620
cag gag gaa gga gag gct tcc agc acc acc agc ccc act gag gag aca 1920
Gln Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr
625 630 635 640
acc cag aag ctg aca gtg tca cac att gaa ggc tat gaa tgt cag ccc 1968
Thr Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro
645 650 655
atc ttt ctg aat gtc ctg gaa gcc att gag cca ggt gta gtg tgt gct 2016
Ile Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala
660 665 670
gga cac gac 2025
Gly His Asp
675
<210> 12
<211> 675
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: an amino acid
sequence of human androgen receptor mutant hAR(Q5AF-1)
<400> 12
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu
50 55 60
Thr Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro
65 70 75 80
Gln Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu
85 90 95
Gln Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg
100 105 110
Gly Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu
115 120 125
Pro Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro
130 135 140
Ser Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys
145 150 155 160
Ser Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu
165 170 175
Leu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly
180 185 190
Arg Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr
195 200 205
Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys
210 215 220

Ala Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu
225 230 235 240
Ser Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu
245 250 255
Gly Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu
260 265 270
Cys Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp
275 280 285
Thr Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Gly Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly
305 310 315 320
Thr Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Leu
325 330 335
Asp Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala
355 360 365
Arg Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala Ala
370 375 380

Ala Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala
385 390 395 400
Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser
405 410 415
Ser Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro
420 425 430
Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro
450 455 460
Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp
465 470 475 480
Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val
485 490 495
Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met
500 505 510
Asp Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg
515 520 525
Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys
530 535 540
Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr
545 550 555 560
Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln
565 570 575
Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg
580 585 590
Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly
595 600 605
Met Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu
610 615 620
Gln Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr
625 630 635 640
Thr Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro
645 650 655
Ile Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala
660 665 670
Gly His Asp
675


<210> 13
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: a nucleotide
sequence containing eight androgen response
elements
<400> 13
tgttcttcca gaacatcctg ttcttccaga acatcctgtt cttccagaac atcctgttct 60
tccagaacat cctgttcttc cagaacatcc tgttcttcca gaacatcctg ttcttccaga 120
acatcctgtt cttccagaac a 141
<210> 14
<211> 1101
<212> DNA
<213> Drosophila melanogaster
<400> 14
ggtgaattct atatcttcag gtcgcgatga tctctcgcct tcgagcagct tgaacggata 60
ctcggcgaac gaaagctgcg atgcgaagaa gagcaagaag ggacctgcgc cacgggtgca 120
agaggagctg tgcctggttt gcggcgacag ggcctccggc taccactaca acgccctcac 180
ctgtgagggc tgcaaggggt tctttcgacg cagcgttacg aagagcgccg tctactgctg 240
caagttcggg cgcgcctgcg aaatggacat gtacatgagg cgaaagtgtc aggagtgccg 300
cctgaaaaag tgcctggccg tgggtatgcg gccggaatgc gtcgtcccgg agaaccaatg 360
tgcgatgaag cggcgcgaaa agaaggccca gaaggagaag gacaaaatga ccacttcgcc 420
gagctctcag catggcggca atggcagctt ggcctctggt ggcggccaag actttgttaa 480
gaaggagatt cttgacctta tgacatgcga gccgccccag catgccacta ttccgctact 540
acctgatgaa atattggcca agtgtcaagc gcgcaatata ccttccttaa cgtacaatca 600
gttggccgtt atatacaagt taatttggta ccaggatggc tatgagcagc catctgaaga 660
ggatctcagg cgtataatga gtcaacccga tgagaacgag agccaaacgg acgtcagctt 720
tcggcatata accgagataa ccatactcac ggtccagttg attgttgagt ttgctaaagg 780
tctaccagcg tttacaaaga taccccagga ggaccagatc acgttactaa aggcctgctc 840
gtcggaggtg atgatgctgc gtatggcacg acgctatgac cacagctcgg actcaatatt 900
cttcgcgaat aatagatcat atacgcggga ttcttacaaa atggccggaa tggctgataa 960
cattgaagac ctgctgcatt tctgccgcca aatgttctcg atgaaggtgg acaacgtcga 1020
atacgcgctt ctcactgcca ttgtgatctt ctcggaccgg ccgggcctgg agaaggccca 1080
actagtcgaa gcgatccaga g 1101
<210> 15
<211> 490
<212> DNA
<213> Drosophila melanogaster
<400> 15
tctccaagca gaatgaagtg cagtttgcaa caaattttaa ctacgattaa gttgataacg 60
attcattttt tatgaattta actaatttta tgaatttgtt atagttttcc acccttctat 120
agatctttct atctgatcat ctagctaccc gtattcctga tttctccttt ggcacaaagc 180
tcttctctat gctaaagaat caagtggaat aaatattgtt ttctaatttt aaaactacca 240
caaaaatacg attaaaatat acacgaagta attgaaaatc aaacaaaatg cttaaagttt 300
tagcagcaag cagtaaaacg acgatgaaga agagaaaccc aacgttaaat atatctgttg 360
tgtacatagt taaatgttaa attaaacaca aaaacatatt taaagtacat ataaatacac 420
ataattatta atgaagaaac ctatgcttaa aagattcaat gtttgattgg catcttagaa 480
aaccaagcga 490
<210> 16
<211> 2411
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
atggaagtgc agttagggct gggaagggtc taccctcggc cgccgtccaa gacctaccga 60
ggagctttcc agaatctgtt ccagagcgtg cgcgaagtga tccagaaccc gggccccagg 120
cacccagagg ccgcgagcgc agcacctccc ggcgccagtt tgctgctgct gcagcagcag 180
cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcaagagact 240
agccccaggc agcagcagca gcagcagggt gaggatggtt ctccccaagc ccatcgtaga 300
ggccccacag gctacctggt cctggatgag gaacagcaac cttcacagcc gcagtcggcc 360
ctggagtgcc accccgagag aggttgcgtc ccagagcctg gagccgccgt ggccgccagc 420
aaggggctgc cgcagcagct gccagcacct ccggacgagg atgactcagc tgccccatcc 480
acgttgtccc tgctgggccc cactttcccc ggcttaagca gctgctccgc tgaccttaaa 540
gacatcctga gcgaggccag caccatgcaa ctccttcagc aacagcagca ggaagcagta 600
tccgaaggca gcagcagcgg gagagcgagg gaggcctcgg gggctcccac ttcctccaag 660
gacaattact tagggggcac ttcgaccatt tctgacaacg ccaaggagtt gtgtaaggca 720
gtgtcggtgt ccatgggcct gggtgtggag gcgttggagc atctgagtcc aggggaacag 780
cttcgggggg attgcatgta cgccccactt ttgggagttc cacccgctgt gcgtcccact 840
ccttgtgccc cattggccga atgcaaaggt tctctgctag acgacagcgc aggcaagagc 900
actgaagata ctgctgagta ttcccctttc aagggaggtt acaccaaagg gctagaaggc 960
gagagcctag gctgctctgg cagcgctgca gcagggagct ccgggacact tgaactgccg 1020
tctaccctgt ctctctacaa gtccggagca ctggacgagg cagctgcgta ccagagtcgc 1080
gactactaca actttccact ggctctggcc ggaccgccgc cccctccgcc gcctccccat 1140
ccccacgctc gcatcaagct ggagaacccg ctggactacg gcagcgcctg ggcggctgcg 1200
gcggcgcagt gccgctatgg ggacctggcg agcctgcatg gcgcgggtgc agcgggaccc 1260
ggttctgggt caccctcagc cgccgcttcc tcatcctggc acactctctt cacagccgaa 1320
gaaggccagt tgtatggacc gtgtggtggt ggtgggggtg gtggcggcgg cggcggcggc 1380
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcgagg cgggagctgt agccccctac 1440
ggctacactc ggccccctca ggggctggcg ggccaggaaa gcgacttcac cgcacctgat 1500
gtgtggtacc ctggcggcat ggtgagcaga gtgccctatc ccagtcccac ttgtgtcaaa 1560
agcgaaatgg gcccctggat ggatagctac tccggacctt acggggacat gcgtttggag 1620
actgccaggg accatgtttt gcccattgac tattactttc caccccagaa gacctgcctg 1680
atctgtggag atgaagcttc tgggtgtcac tatggagctc tcacatgtgg aagctgcaag 1740
gtcttcttca aaagagccgc tgaagggaaa cagaagtacc tgtgcgccag cagaaatgat 1800
tgcactattg ataaattccg aaggaaaaat tgtccatctt gtcgtcttcg gaaatgttat 1860
gaagcaggga tgactctggg agcccggaag ctgaagaaac ttggtaatct gaaactacag 1920
gaggaaggag aggcttccag caccaccagc cccactgagg agacaaccca gaagctgaca 1980
gtgtcacaca ttgaaggcta tgaatgtcag cccatctttc tgaatgtcct ggaagccatt 2040
gagccaggtg tagtgtgtgc tggacacgac aacaaccagc ccgactcctt tgcagccttg 2100
ctctctagcc tcaatgaact gggagagaga cagcttgtac acgtggtcaa gtgggccaag 2160
gccttgcctg gcttccgcaa cttacacgtg gacgaccaga tggctgtcat tcagtactcc 2220
tggatggggc tcatggtgtt tgccatgggc tggcgatcct tcaccaatgt caactccagg 2280
atgctctact tcgcccctga tctggttttc aatgagtacc gcatgcacaa gtcccggatg 2340
tacagccagt gtgtccgaat gaggcacctc tctcaagagt ttggatggct ccaaatcacc 2400
ccccaggaat t 2411
<210> 17
<211> 895
<212> DNA
<213> Drosophila melanogaster

<400> 17
agcaagcgtg gtatcctcac cctgaagtac cccattgagc acggtatcgt gaccaactgg 60
gacgatatgg agaagatctg gcaccacacc ttctacaatg agctgcgtgt ggcacccgag 120
gagcaccccg tgctgctgac cgaggccccg ctgaacccca aggccaaccg tgagaagatg 180
acccagatca tgttcgagac cttcaacaca cccgccatgt atgtggccat ccaggctgtg 240
ctctcgctgt acgcttcggg tcgtaccacc ggtatcgttc tggactccgg cgatggtgtc 300
tcccacaccg tgcccatcta cgagggttat gccctccccc atgccatcct gcgtctggat 360
ctggctggtc gcgatttgac cgactacctg atgaagatcc tgaccgagcg cggttactct 420
ttcaccacca ccgctgagcg tgaaatcgtc cgtgacatca aggagaagct gtgctatgtt 480
gccctcgact ttgagcagga gatggccacc gctgccagca gctcctcgtt ggagaagtcc 540
tacgagctgc ccgacggaca ggtgatcacc atcggcaacg agcgtttccg ctgccccgag 600
gccctgttcc atccctcgtt ccttgggatg gagtcttgcg gcatccacga gaccacctac 660
aactccatca tgaagtgtga tgtggatatc cgtaaggatc tgtatgccaa caccgtgctg 720
tccggtggca ccaccatgta ccctggcatc gccgaccgta tgcagaagga gatcaccgcc 780
ctggcaccgt cgaccatgaa gatcaagatc attgccccgc cagagcgcaa gtactctgtc 840

0003

本疾患の患者は、軽度のアンドロゲン不応症を伴うことが多く、これはポリQ伸長によるARの機能不全示唆している(Pinsky,L.ら,Clin.Invest.Med.,15,456−472,1992)。しかしながら、アンドロゲン完全不応症患者では、一般に、ケネディー病によると考えられる神経変性が見られないことから、ケネディー病における運動ニューロン細胞死は、単なるARの機能喪失によるものではないと考えられている(Young,E.L.ら,Lancet,344,826−827,1994;Brown,T.R.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8151−8155,1988)。

0004

0004

ハンチントン病(Trottier,Y.ら,Nature,378,403−406,1995)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症Igarashi,S.ら,Nat.Genet.,18,111−117,1998;Nagafuchi,S.ら,Nat.Genet.,8,177−182,1994)、又は脊髄小脳失調症(Imbert,G.ら,Nat.Genet.,14,285−291,1996;David,G.,Nat.Genet.,17,65−70,1997;Paulson,H.L.ら,Neuron,19,333−334,1997;Riess,O.ら,Hum.Mol.Genet.,6,1289−1293,1997)といった、ポリQ伸長を伴う他の神経変性疾患と同様に、球脊髄性筋萎縮症患者では、原因の変異遺伝子産物の凝集体を伴う一部ニューロン欠落が観察される。それぞれの変異遺伝子産物特異的な機序と共に、異常なタンパク質の折り畳みによって生じると考えられるこれらの凝集体が、共通の神経毒性機序によって神経細胞死を引き起こすと考えられている(Ross,C.A.ら,Neuron,19,1147−1150,1997;Kim,T.W.及びTanzi,R.E.Neuron,21,657−659,1998)。

発明が解決しようとする課題

0005

また、培養細胞において、ポリQの伸長したARは転写活性の低下を示し、細胞質及び核内で凝集体を形成することが示されたが、この凝集体形成にはリガンド結合が必須であった(Stenoien,D.L.ら,Hum.Mol.Genet.,8,731-741,1999)。このリガンド依存的な凝集体の形成は、ポリQ伸長を伴うAR変異体特異的であり、ポリQ伸長を伴う他の神経変性疾患の原因である変異遺伝子産物では見られていない。更に、本疾患は、変異ARを有する女性では発症せず、変異を有する男性のみで、しかも、30歳以上で発症することから、変異ARへのリガンド結合が発症に重要な可能性が考えられている。

0006

ARは、ステロイド甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーに属し、リガンド誘導性転写因子として働く(Beato,M.ら,Cell,83,851−857,1995;Mangelsdorf,D.J.ら,Cell,83,835−839,1995;Chambon,P.,Faseb J.,10,940−954,1996)。アンドロゲンは、ARを介した標的遺伝子転写調節を通じて、男性生殖器官その他の標的組織発達及び維持並びに男性の性行動に作用する(Zhou,Z.X.ら,Rec.Prog.Hor.Res.,49,249−274,1994)。

課題を解決するための手段

0007

核内受容体ファミリーは、異なった機能領域を有するA〜E(F)の共通(領域)構造を持つ(Danielian,P.S.ら,EMBO J.,11,1025−1033,1992;Durand,B.ら,EMBO J.,13,5370−5382,1994)。DNA結合領域は、保存度の高いC領域に存在し、リガンド結合領域は、保存度の低いC末のE/F領域に存在する。ARを含む多くの核内受容体の解析から、リガンド結合領域は、12個のヘリックスからなり、リガンドを捕らえるポケットを形成することが判明している(Shiau,A.K.ら,Cell,95,927−937,1998;Westin,S.ら,Nature,395,199−202,1998;Poujol,N.ら,J.Biol.Chem.,275,24022−24031,2000)。最もC末側にあるヘリックス12は、リガンドが結合すると移動し、ヘリックス3〜5と共に相互作用領域を形成し、共役抑制因子複合体の解離共役活性化因子複合体の結合に重要な役割を果たす(Freedman,L.P.ら,Cell,97,5−8,1999;Glass,C.K.及びRosenfeld,M.G.,Genes Dev.,14,121−141,2000)。

発明を実施するための最良の形態

0008

ステロイド受容体N末のA/B領域とリガンド結合領域の二つの領域は、リガンド誘導性の転写活性化において共役因子との相互作用に働く(He,B.ら,J.Biol.Chem.,274,37219−37225,1999;Watanabe,M.ら,EMBO J.,20,1341−1352,2001)。これらは、リガンド依存性に関しては性質を異にし、A/B領域に存在する転写活性化能(AF)−1それ自身は、リガンド非依存性で、一方、リガンド結合領域に存在するAF−2は、リガンド結合によって誘導される(Tasset,D.ら,Cell,62,1177−1187,1990;Kato,S.ら,Science,270,1491−1494,1995)。すなわち、リガンドが結合していない状態では、リガンド結合領域はAF−1活性を抑制しており、リガンド結合領域へのリガンドの結合によってAF−2活性が誘発されると同時に、ステロイド受容体の分子内の全体構造の変化によって、AF−1活性の抑制が解除されると考えられている(Fuse,H.ら,Mol.Endocrinol.,14,889−899,2000)。

0009

先に述べたように、球脊髄性筋萎縮症(ケネディー病)における運動ニューロン細胞死は、単なるARの機能喪失によるものではないと考えられており、球脊髄性筋萎縮症治療剤スクリーニングするための良いモデルは知られていない。本発明者は、ポリQ伸長(stretch)ヒトアンドロゲン受容体[hAR(Q52)]を発現するトランスジェニックショウジョウバエを製造したところ、種々のリガンド(アゴニスト又はアンタゴニスト)を混餌投与すると、神経変性疾患の指標と考えられているラフアイ(rough eye;目がつぶれ形質)を示すことを初めて見出した。前記トランスジェニックショウジョウバエを用いて、リガンド依存的なラフ・アイを指標に、これを抑制する化合物を選択することにより、公知の培養細胞系での転写レポーターアッセイなどでは見いだし得ない、神経変性疾患治療(特に球脊髄性筋萎縮症)に有用な物質を得ることができる。本発明は、このような知見によるものである。

0010

従って、本発明の課題は、神経変性疾患治療(特に球脊髄性筋萎縮症)に有用な物質を得ることができるトランスジェニックショウジョウバエ、及びそれを用いたスクリーニング方法を提供することにある。

0011

前記課題は、本発明による、グルタミン残基38個以上のポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体をコードする遺伝子を発現可能に有することを特徴とする、トランスジェニックショウジョウバエによって解決することができる。また、本発明は、前記トランスジェニックショウジョウバエに、ヒトアンドロゲン受容体リガンドと、試験物質とを投与する工程、及び前記ショウジョウバエの眼の形質変化を調べる工程を含むことを特徴とする、神経変性疾患治療に有用な物質をスクリーニングする方法に関する。

0012

本発明のトランスジェニックショウジョウバエは、「グルタミン残基38個以上のポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体」をコードする遺伝子を、発現可能な状態で有する。ヒトアンドロゲン受容体は、例えば、配列番号2で表されるアミノ酸配列アミノ酸残基数=919個)からなるタンパク質であり、第一エクソンに存在するポリグルタミン(ポリQ)伸長領域(すなわち、グルタミン残基のみからなる繰り返し配列)の長さが異なる種々の天然体が存在することが知られている。例えば、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるヒトアンドロゲン受容体[以下、hAR(wt)と称することがある]では、配列番号2で表されるアミノ酸配列における58番目〜77番目の連続する20個のグルタミン残基からなる配列が、ポリグルタミン伸長領域である。過去の研究から、一般に、健常人では、15〜35個のグルタミン残基からなるポリグルタミン伸長領域を有し、球脊髄性筋萎縮症患者では、38〜62個のグルタミン残基からなるポリグルタミン伸長領域を有することが知られている(La,S.A.ら,Nature,352,77−79,1991;Choong,C.S.及びWilson,E.M.,J.Mol.Endocrinol.,21,235−257,1998;Harry,t.Orr,Genes& Development,15,925−932,2001)。

0013

なお、本明細書において、「ポリグルタミン伸長領域」とは、トリヌクレオチド「CAG」でコードされるグルタミン残基のみからなる領域を意味し、トリヌクレオチド「CAA」でコードされるグルタミン残基は含まないものとする。例えば、配列番号2で表されるアミノ酸配列では、ポリグルタミン伸長領域を構成する58番目〜77番目の連続する20個のグルタミン残基の直後にも、78番目のグルタミン残基が存在する。58番目〜77番目の20個のアミノ酸が全て、「CAG」でコードされるのに対して、78番目のグルタミン残基は、「CAA」でコードされる。従って、配列番号2で表されるアミノ酸配列におけるポリグルタミン伸長領域を構成するグルタミン残基は、58番目〜77番目のグルタミン残基であって、78番目のグルタミン残基は含まれず、ポリグルタミン伸長領域を構成するグルタミン残基数は20個とカウントする。

0014

本発明のトランスジェニックショウジョウバエでは、遺伝子導入に用いる遺伝子がコードするヒトアンドロゲン受容体として、グルタミン残基38個以上からなるポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体を使用する。ポリグルタミン伸長領域を構成するグルタミン残基数の上限は、充分量のヒトアンドロゲン受容体がトランスジェニックショウジョウバエ中で翻訳され、しかも、翻訳されたヒトアンドロゲン受容体が充分な転写活性を有する限り、特に限定されるものではない。ポリグルタミン伸長領域を構成するグルタミン残基数は、38個以上である限り、特に限定されるものではないが、38個〜92個であることが好ましく、38個〜62個であることがより好ましい。

0015

グルタミン残基38個以上からなるポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体としては、特に限定されるものではないが、例えば、後述の実施例で使用した、グルタミン残基52個からなるポリグルタミン伸長領域を有する、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるヒトアンドロゲン受容体の変異体hAR(Q52)が特に好ましい。前記変異体hAR(Q52)をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号3で表される塩基配列からなるDNAを挙げることができる。

0016

本発明のトランスジェニックショウジョウバエにおいては、「グルタミン残基38個以上からなるポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体をコードする遺伝子」(以下、単に、導入遺伝子と称することがある)を発現可能に組み込んでいる限り、その発現組織若しくは細胞、又は発現時期は特に限定されるものではなく、例えば、組織又は細胞特異的に発現させることもできるし、あるいは、全組織又は全細胞において発現させることもできる。また、前記導入遺伝子を、構成的に発現させることもできるし、あるいは、特定の時期に発現させることもできる。

0017

導入遺伝子を組織又は細胞特異的に発現させる場合、前記組織又は細胞としては、例えば、眼、特には複眼原基(eye disc)又は前記複眼原基中の光受容体ニューロン及び副色素(accessory pigment)細胞が好ましい。また、導入遺伝子を特定の時期に発現させる場合には、例えば、幼虫の期間が好ましい。

0018

導入遺伝子を特定の組織若しくは細胞及び/又は特定の時期に発現させる場合には、種々のプロモーター及び/又は転写調節因子などを用いることができる。例えば、導入遺伝子を発生中の複眼原基中の光受容体ニューロン及び副色素細胞で特異的に発現させる場合には、例えば、gmr(glass multimer)遺伝子プロモーター(Moses,K.及びRubin,G.M.,Genes Dev.,5,583−593,1991)を用いて、gmr(glass multimer)遺伝子プロモーターの直接的制御下で、導入遺伝子を発現させることができる。あるいは、前記プロモーターに加え、GAL4−UASシステム(Brand,A.H.及びPerrimon,N.,Development,118,401−415,1993)を用いて、前記プロモーターの間接的制御下で、導入遺伝子を発現させることができる。この系では、導入遺伝子の上流に、上流活性化配列(UAS)を配置すると共に、GAL4タンパク質(UASに結合して転写を促進する)をコードする遺伝子の上流に、gmr遺伝子プロモーターを配置することにより、gmr遺伝子プロモーターの間接的制御下で導入遺伝子を発現させることができる。

0019

本発明のトランスジェニックショウジョウバエは、導入遺伝子として、グルタミン残基38個以上からなるポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体をコードする遺伝子を使用し、それ自体公知のトランスジェニックショウジョウバエ作製法により、作製することができる。公知のトランスジェニックショウジョウバエ作製法としては、例えば、マイクロインジェクション法などを挙げることができる。

0020

前記マイクロインジェクション法では、例えば、導入遺伝子を含むベクターと、トランスポゼース遺伝子を含むベクター(例えば、pπ25.7トランスポゼースベクター;Kobayashi,S.,Cell Science,6,413−416,1990)とを、マイクロマニピュレーターを用いて、ショウジョウバエの(例えば、5〜30分齢のW1118胚;Matsubayashi,H.ら,Jpn.J.Genet.,70,211−221,1995)へ注入することにより、トランスジェニックショウジョウバエを得ることができる。

0021

本発明のトランスジェニックショウジョウバエに、ヒトアンドロゲン受容体のリガンド(アゴニスト又はアンタゴニスト)を混餌投与すると、後述の実施例3(2)に示すように、神経変性疾患(特に球脊髄性筋萎縮症)の指標と考えられる眼の破壊が生じる。前記のリガンド投与と一緒に、試験物質を投与し、眼の形質変化を調べることにより、本発明のトランスジェニックショウジョウバエにおける眼の破壊を防止することのできる物質をスクリーニングすることができる。眼の破壊を防止することのできる物質は、神経変性疾患治療及び/又は予防剤の有効成分として有用である。前記神経変性疾患としては、例えば、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、又は脊髄小脳失調症を挙げることができ、好ましくは球脊髄性筋萎縮症である。本発明のトランスジェニックショウジョウバエそれ自体を、神経変性疾患治療に有用な物質のスクリーニングツールとして使用することができる。

0022

本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイル登録されている種々の公知化合物(ペプチドを含む)、コンビナトリアルケミストリー技術(Terrett,N.K.ら,Tetrahedron,51,8135−8137,1995)によって得られた化合物群、あるいは、ファージディスプレイ法(Felici,F.ら,J.Mol.Biol.,222,301−310,1991)などを応用して作成されたランダムペプチド群を用いることができる。また、微生物培養上清、植物若しくは海洋生物由来天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物(ペプチドを含む)を、化学的又は生物学的に修飾した化合物(ペプチドを含む)を用いることができる。

0023

本発明のスクリーニング方法は、グルタミン残基38個以上からなるポリグルタミン伸長領域を有するヒトアンドロゲン受容体を、発生中の複眼原基中の光受容体ニューロン及び副色素細胞で特異的に発現させることのできる、本発明のトランスジェニックショウジョウバエに、ヒトアンドロゲン受容体リガンドと、試験物質とを投与する工程、及び前記ショウジョウバエの眼の形質変化を調べる工程を含む限り、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順で実施することができる。

0024

すなわち、幼虫期のトランスジェニックショウジョウバエに、リガンド及び試験物質を添加したを適当な期間(例えば、5日間)与える。前記リガンドとしては、例えば、アンドロゲン、アンドロゲンアゴニストであるDHT(dihydrotestosterone)、あるいは、アンドロゲンアンタゴニストであるHF(hydroxyflutamide)又はBIC(bicalutamide)等を用いることができる。リガンド及び試験物質を添加した餌の投与を開始してから適当な期間(例えば、10日間)経過した後のトランスジェニックショウジョウバエの眼の形質変化を観察することにより、前記試験物質が神経変性疾患治療に有用な物質であるか否かを判定する。すなわち、トランスジェニックショウジョウバエに眼の破壊が生じた場合には、神経変性疾患治療に有用な物質でないと判定することができ、トランスジェニックショウジョウバエに眼の破壊が生じなかった場合には、神経変性疾患治療に有用な物質であると判定することができる。

0025

なお、コントロールとして、リガンド及び試験物質を添加した餌の代わりに、リガンドのみを添加した餌(すなわち、試験物質を含まない餌)を用いて同様の操作を行ない、トランスジェニックショウジョウバエに眼の破壊が生じることを確認することが好ましい。

0026

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

0027

図1に示す正常ヒトARとその各種変異体の各cDNA(Yamamoto,A.ら,J.Cell Biol.,150,873−880,2000)を、以下に示す手順に従って、上流活性化配列(UAS)を含むhsp70プロモーターを有する発現ベクターpUAST(Brand,A.H.及びPerrimon,N.,Development,118,401−415,1993)に挿入した。すなわち、配列番号1の塩基配列からなるヒトAR(wt)ORFcDNA、及び配列番号3の塩基配列からなるヒトAR(Q52)ORFcDNAの各5’末端及び3’末端に、それぞれ、BamHIリンカー及びXhoIリンカーを結合させ、制限酵素BamHI及びXhoIで消化した。次に、制限酵素BglII及びXhoIで消化したプラスミドpUASTに、前記のAR(wt)ORFcDNA断片又はAR(Q52)ORFcDNAを組み込んだ。

0028

また、配列番号5の塩基配列からなるヒトAR(AF−1)cDNAに終止コドンをつなげたDNA断片、配列番号9の塩基配列からなるヒトAR(Q52AF−1)cDNAに終止コドンをつなげたDNA断片、及び配列番号11の塩基配列からなるヒトAR(Q5AF−1)cDNAに終止コドンをつなげたDNA断片の各5’末端及び3’末端に、それぞれ、EcoRIリンカー及びSalIリンカーを結合させ、制限酵素EcoRI及びSalIで消化した。次に、制限酵素EcoRI及びXhoIで消化したプラスミドpUASTに、前記のAR(AF−1)cDNA断片、AR(Q52AF−1)cDNA断片、又はAR(Q5AF−1)cDNA断片を組み込んだ。更に、配列番号7の塩基配列からなるヒトAR(AF−2)cDNA断片の5’末端及び3’末端に、BamHIリンカーを結合させ、制限酵素BamHIで消化した。次に、制限酵素BglIIで消化したプラスミドpUASTに、前記のAR(AF−2)cDNA断片を組み込んだ。

0029

得られた各トランスジェニック遺伝子ベクター1μgを、pπ25.7トランスポゼースベクター(Kobayashi,S.,Cell Science,6,413−416,1990)150ngと共に、マイクロマニピュレーターを用いて、ショウジョウバエの5〜30分齢のW1118胚(Matsubayashi,H.ら,Jpn.J.Genet.,70,211−221,1995)へ注入した。UASトランスジェニック系統のショウジョウバエを確立した後、Gal4タンパク質を組織特異的に発現するGal4−ドライバー(driver)系統(Bloomington Drosophila StockCenter,Indiana University)のショウジョウバエと交配した。

0030

リガンド誘導性のヒトAR転写活性をモニターするために、これらのショウジョウバエは、更に、アンドロゲン反応性配列(ARE)をプロモーターに有するグリーン蛍光タンパク質(GFP;Prasher,D.C.ら,Gene,111,229-233,1992)レポーター遺伝子の組み込まれたショウジョウバエと交配した。交配の手順、交配に用いた各ショウジョウバエの有する各遺伝子の配置状態、及び交配により得られたショウジョウバエにおける発現タンパク質と遺伝子との相互関係を、図2に示す。図2において、「UAS」は上流活性化配列を意味し、「hAR」はヒトアンドロゲン受容体を意味し、「hsp70TATA」は熱ショックタンパク質70のプロモーター領域を意味し、「ARE」はアンドロゲン反応性配列を意味し、「GFP」はグリーン蛍光タンパク質を意味し、「p」はプラスミドを意味する。図2に示すように、交配で得られたトランスジェニックショウジョウバエにおいては、リガンド結合ヒトARとAREとの結合により、GFPタンパク質の発現が誘導される。

0031

なお、AREをプロモーターに有するGFPレポーター遺伝子の組み込まれたショウジョウバエは、プラスミドpUAST−ARE−GFPを注入することにより製造した。前記プラスミドpUAST−ARE−GFPは、以下の方法で製造した。すなわち、GFPレポーター遺伝子の5’末端及び3’末端に、それぞれ、EcoRIリンカー及びBamHIリンカーを結合させ、制限酵素EcoRI及びBamHIで消化した。次に、制限酵素EcoRI及びBglIIで消化したpUASTに、先に処理したGFPレポーター遺伝子を挿入し、プラスミドpUAST−GFPを製造した。配列番号13で表される塩基配列からなるARE8回繰り返し配列の5’末端及び3’末端に、それぞれ、BglII/SmaIリンカー及びSmaIリンカーを結合させ、制限酵素BglII及びSmaIで消化した後、制限酵素BamHI及びSalIで消化したプラスミドpUAST−GFPに挿入することにより、プラスミドpUAST−ARE−GFPを得た。

0032

(2)正常ヒトAR[ヒトAR(wt)]の発現
正常ヒトAR[ヒトAR(wt)]をコードするcDNAを導入したトランスジェニックショウジョウバエを用いて、ヒトARのリガンドの存在下又は不在下におけるヒトARの組織特異的な発現を行なった。具体的には、(1)発生中の複眼原基中の光受容体ニューロン及び副色素細胞において、gmr(glassmultimer)遺伝子プロモーター(Moses,K.及びRubin,G.M.,Genes Dev.,5,583−593,1991)下で;(2)発生中の原基の真中部分において、dpp(decapentaplegic)遺伝子プロモーター(Morimura,S.ら,Dev.Biol.,177,136−151,1996)下で;そして、(3)胚性体節アンリア極において、ptc(patched)遺伝子プロモーター(Hinz,U.ら,Cell,76,77−87,1994)下で、それぞれ発現させた。

0033

いずれのトランスジェニックショウジョウバエ、すなわち、(1)表現型が、gmr−GAL4;UAS−hAR(wt);ARE−GFPであるトランスジェニックショウジョウバエ、(2)表現型が、dpp−GAL4;UAS−hAR(wt);ARE−GFPであるトランスジェニックショウジョウバエ、及び(3)表現型が、ptc−GAL4;UAS−hAR(wt);ARE−GFPであるトランスジェニックショウジョウバエのいずれにおいても、異常形質は観察されなかった。

0034

発現したヒトARは、生体内蛍光抗体を用いて、以下のようにして検出した。第3齢幼虫の眼及び羽の成虫原基又は幼虫全身を、リン酸緩衝化生食塩水PBS)中で解剖し、4%ホルムアルデヒドで室温にて20分間処理して固定した。その後、0.1%トリトンX-100を含むPBSで洗浄した後に、200分の1濃度の一次抗体AR(N−20)又はAR(C−19)(Santa Cruz Biotechnology社)で処理した。二次抗体として、Cy5標識したアフィニピュア抗ウサギIgGロバ抗体(Jackson Immunoresearch社)を1000分の1濃度で用いた。共焦点顕微鏡として、共焦点レーザースキャニングシステム510(Zeiss社)を用い、アドフォトショップ5.0(アドビシステムズ社)を用いて画像処理した。

0035

その結果、アンドロゲン(dihydrotestosterone;DHT)の摂取によって誘導されたGFPの発現は、いずれのトランスジェニックショウジョウバエにおいても、明瞭且つ限局して、緑蛍光として検出された。また、リガンドの無い培地飼育したショウジョウバエでは、緑蛍光はほとんど検出されなかった。更に、既知アンドロゲンアンタゴニストのHF(hydroxyflutamide)又はBIC(bicalutamide)は、GFPの発現を誘導しなかったが、ショウジョウバエ又は培養昆虫細胞S2細胞株において、DHTによる誘導を阻害した。なお、ヒトARは、いずれのトランスジェニックショウジョウバエにおいても、リガンド(DHT、HF、又はBIC)の存在の有無に関わらず、発現していた。

0036

(3)ヒトAR欠失変異体[AR(AF−1)及びヒトAR(AF−2)]の発現
ヒトAR(AF−1)及びヒトAR(AF−2)活性の性質は各々異なり、また、細胞特異的である(He,B.ら,J.Biol.Chem.,274,37219−37225,1999;Yamamoto,A.ら,J.CellBiol.,150,873−880,2000)ので、ヒトARのA/B領域及びLBD(リガンド結合ドメイン)領域の転写活性を、ヒトAR(AF−1)又はヒトAR(AF−2)をコードする各cDNAを導入したトランスジェニックショウジョウバエを用いて、検討した。ヒトAR(AF−1)はA/B領域を含み、ヒトAR(AF−2)はLBD領域を含む。

0037

ヒトAR(AF−1)及びヒトAR(AF−2)の欠失変異体の発現が、第3齢幼虫の複眼原基で検出された。ヒトAR(AF−2)の転写活性は哺乳類細胞では弱いことが報告されているが、ショウジョウバエの複眼原基においては、明確なリガンド依存的な転写活性化が観察された。一方、ヒトAR(AF−1)による明確なリガンド非依存的な転写活性化も観察された。より具体的には、表現型がgmr−GAL4;UAS−hAR(AF−2);ARE−GFPであるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド(DHT、HF、又はBIC)の存在の有無に関わらず、ヒトAR(AF−2)が発現していたが、GFPによる緑蛍光は、DHT存在下でのみ検出された。一方、表現型がgmr−GAL4;UAS−hAR(AF−1);ARE−GFPであるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド(DHT、HF、又はBIC)の存在の有無に関わらず、ヒトAR(AF−1)が発現しており、GFPによる緑蛍光も、リガンド(DHT、HF、又はBIC)の存在下又は不在下のいずれの場合にも検出された。

0038

本実施例のこれまでの結果から、ヒトARをショウジョウバエに発現させても、ヒト培養細胞内と同様に転写活性を発揮することが判明した。また、ARの部分体も、ヒト培養細胞内とほぼ同様な活性を示した。これらのことから、(1)この系においてヒトARは機能的であり、(2)この系は、ARのインビボ(in vivo)内での転写活性能を直接検出することのできる初めての例である。

0039

エクダイソン受容体標的遺伝子に対する影響》前記実施例1で示したように、正常ヒトARを異なった発生段階のショウジョウバエの幾つかの組織で発現させ、DHT又はアンドロゲンアンタゴニストを混餌投与したが、投与5日後でも明らかな異常は観察されなかった。しかし、ショウジョウバエ内在性の核内受容体系(Tsai,C.C.ら,Mol.Cell,4,175−186,1999;Bai,J.ら,Cell,103,1047−1058,2000)に必須な内在性転写共役因子の機能が、過剰発現したヒトARによって影響を受け、結果として内在性核内受容体の機能に干渉する可能性は排除することができない。ショウジョウバエの核内受容体Eip75Bは、そのプロモーターにエクダイソン(ecdysone)反応性配列を有し、エクダイソンレセプター(EcR)/ USP(ultraspiracle)ヘテロダイマーの転写調節下にある(White,K.P.ら,Science,276,114−117,1997)。本実施例では、アンドロゲン存在/非存在下でのヒトAR発現ショウジョウバエでの遺伝子発現変動をノザンブロッティング法によって以下の手順で調べた。

0040

トランスジェニックショウジョウバエとしては、(1)表現型が、gmr−GAL4;UAS−hAR(wt)であるトランスジェニックショウジョウバエ、(2)表現型が、dpp−GAL4;UAS−hAR(wt)であるトランスジェニックショウジョウバエ、及び(3)表現型が、ptc−GAL4;UAS−hAR(wt)であるトランスジェニックショウジョウバエを使用した。また、コントロールとして、表現型が、UAS−hAR(wt)、gmr−GAL4、dpp−GAL4、又はptc−GAL4である各トランスジェニックショウジョウバエを使用した。全RNAは、市販のRNA調製キット(ISOGEN;ニッポンジーン)を用いて、1μMのDHT添加又は非添加の第3齢幼虫から抽出し、オリゴdTアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ポリA−RNAを精製した。ポリA−RNA10μgを、1.1mol/Lホルムアルデヒド含有1%アガロースで分離した後、ニトロセルロース膜へ転写した。プローブとしては、EcR、Eip75B、ヒトAR、及びβ−アクチンの各cDNAの部分断片(配列番号14〜17で表される塩基配列からなるcDNA部分断片)を用いた(Takeyama,K.ら,Science,277,1827−1830,1997)。

0041

その結果、DHTの摂取は、ヒトARを発現させた組織内の内在性Eip75B及びEcRの各遺伝子の発現に影響を与えなかった。より具体的には、ヒトARのmRNAは、DHTの添加の有無に関わらず、UAS−hAR(wt)を有する各トランスジェニックショウジョウバエでのみ検出され、コントロールの各トランスジェニックショウジョウバエでは検出されなかった。一方、EcR、Eip75B、及びβ−アクチンの各mRNAは、DHTの添加の有無に関わらず、UAS−hAR(wt)を有する各トランスジェニックショウジョウバエ、及びコントロールの各トランスジェニックショウジョウバエの両方で検出された。このように,ショウジョウバエでのヒトARの発現は、ショウジョウバエの内在性核内受容体系に大きな影響を与えないことが判明した。すなわち、ショウジョウバエでのヒトARの(外因性の)発現やアンドロゲンの添加によって、ショウジョウバエ内在性の核内受容体やその下流遺伝子の発現に影響がないことから、ショウジョウバエで発現させたヒトARは、内在性核内受容体の活性に大きな影響を与える可能性は低いと考えられた。

0042

《ポリQ伸長変異ヒトARを介したリガンド誘導性の光受容器ニューロンの変性
(1)哺乳動物培養細胞におけるヒトARの発現
COS−1培養細胞中で、変異ヒトARのアンドロゲン誘導性の転写活性化能を以下の手順で測定した。COS−1細胞は、DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)に、活性炭処理した5%子牛血清(Kato,S.ら,Science,270,1491−1494,1995)を添加したものを用いて培養した。COS−1細胞に、プラスミドARE−tk−luc(Yamamoto,A.ら,J.Cell Biol.,150,873−880,2000)(1μg)とヒトAR発現ベクター(Nakajima,H.ら,J.Neurol.Sci.,142,12−16,1996)(0.1μg)とを、常法により同時遺伝子導入した。なお、ヒトAR発現ベクターとしては、正常ヒトAR[ヒトAR(wt)]又はその変異体[ヒトAR(Q52)、ヒトAR(Q92)、ヒトAR(Q132)、及びヒトAR(Q212)]の各cDNAを、発現ベクターpSG5(STRATAGENE社)に、それぞれ挿入したものを使用した。なお、前記各変異体の名称における記号「Q」の後の数字は、ポリグルタミン伸長領域を構成するグルタミン残基数を示す。また、コントロールとして、プラスミドARE−tk−lucと、ヒトARを含まない空ベクター(すなわち、発現ベクターpSG5)とを同時遺伝子導入した形質転換体も調製した。

0043

遺伝子導入された細胞を、終濃度10nmol/L−DHT存在下又は非存在下で18時間培養した後に、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した(Yamamoto,A.ら,J.Cell Biol.,150,873−880,2000)。結果を図3に示す。図3において、白棒は、DHT非存在下での結果を示し、黒棒は、DHT存在下での結果を示す。細胞内ルシフェラーゼ活性は、DHT非存在下で培養したコントロール用形質転換体の細胞内ルシフェラーゼ活性を1とした相対活性として示す。図3に示すように、COS−1培養細胞中における変異ヒトARのアンドロゲン誘導性の転写活性化能は、A/B領域にあるポリQ配列の長さに依存して低下した。

0044

一方、イン・ビトロ(in vitro)翻訳キット(Promega社)を用いて、前記の各ヒトAR発現ベクターから、[35S]標識したメチオニンを取り込んだヒトARタンパク質を発現させた。変異体の内、ヒトAR(Q52)及びヒトAR(Q92)は、正常ヒトAR[ヒトAR(wt)]と同程度の効率で翻訳が行なわれたが、ヒトAR(Q132)及びヒトAR(Q212)は、ほとんど翻訳が行なわれなかった。この結果と、先の図2に示す結果とを併せると、変異体の内、ポリQの長さが52である変異ヒトAR[hAR(Q52)]は、通常の効率で翻訳が行なわれたが、DHT誘導性の転写活性化において若干の減弱を示した。

0045

(2)ポリQ伸長変異ヒトAR[hAR(Q52)]のショウジョウバエにおける発現
次に、hAR(Q52)を用いて、ポリQの伸長したhARがショウジョウバエ成虫の眼で神経変性を誘導するかどうかを以下のようにして検討した。hAR(Q52)を発現するトランスジェニックショウジョウバエとして、gmr−GAL4;UAS−hAR(Q52)であるトランスジェニックショウジョウバエを使用し、コントロールとして、gmr−GAL4;UAS−hAR(wt)であるトランスジェニックショウジョウバエを使用した。ショウジョウバエは、の状態から、コーンミール酵母、及び寒天の混合物にリガンドを添加又は添加しないものを餌として、25度で飼育し、羽化から5日後に麻酔下で実体顕微鏡観察を行なった。また、走査型電子顕微鏡観察は、ショウジョウバエ全身をエタノール中で脱水し、臨界点まで乾燥させ、実施した。

0046

異常に伸長したポリQを有する、アンドロゲン受容体以外のタンパク質を、ショウジョウバエの光受容体ニューロンで発現させると、ラフ・アイ形質を示すことが知られている(Jackson,G.R.ら,Neuron,21,633−642,1998;Warrick,J.M.ら,Nat.Genet.,23,425−428,1999)が、リガンドのない状態で飼育したhAR(Q52)を眼に発現させた遺伝子導入ショウジョウバエでは、どの個体も、そして、観察した限り、どの組織も、その寿命の間、正常だった。しかし、孵化から5日間のDHT混餌投与した場合、全個体の眼の破損が誘導され、その光受容体ニューロンの(発生)後期欠失の形質は、光学顕微鏡(LM)や走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した限り、他の変異ポリQタンパク質を発現させたショウジョウバエの眼と同様であった。

0047

具体的には、gmr−GAL4;UAS−hAR(Q52)であるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド不在の場合には、眼の破損が認められないのに対し、リガンド(DHT、HF、又はBIC)存在下では、眼の破損が観察された。一方、コントロールのgmr−GAL4;UAS−hAR(wt)であるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド(DHT、HF、又はBIC)の存在の有無に関わらず、眼の破損は観察されなかった。

0048

なお、hAR(Q52)の発現量は、リガンド(DHT、HF、又はBIC)投与時又は非投与時に関わらず、hAR(WT)と同程度であることが、gmr−GAL4;UAS−hAR(Q52);ARE−GFPであるトランスジェニックショウジョウバエと、hARのN末を認識する抗体[抗体AR(N−20)]又はC末を認識する抗体[抗体AR(C−19)]とを用いた免疫染色によって確認された。また、hAR(Q52)は、明らかな神経変性を生じるにも関わらず、DHT存在下でのみGFPによる緑蛍光が検出されることから、COS−1細胞の場合と同様に、DHT誘導性の転写活性化能を示した。更に、アンドロゲンアンタゴニストであるHF又はBICは、他の組織の場合と同様に、ショウジョウバエの眼において、hAR(Q52)又はhAR(wt)の転写活性化能を誘導せず、ARのタンパク質発現量にも影響を与えなかった。しかし、神経変性においては、どちらのアンタゴニストも、神経変性を抑制するどころかむしろ誘導した。

0049

本実施例のこれまでの結果から、以下のことが判明した。すなわち、hAR(Q52)を発現させたショウジョウバエでは、転写活性においては正常型と同様の活性を示すにも関わらず、リガンド依存的な(神経変性モデルである)眼の破壊を生じる。また、アゴニストであるDHTだけでなく、アンタゴニストであるHF又はBICも同様に眼の破壊を生じる。従って、DHT又はアンドロゲンアンタゴニストの結合による構造変化は、神経変性の誘導においては差がないと考えられ、本モデルは、球脊髄性筋萎縮症(ケネディー病)を模倣していると考えられる。更に言えば、このモデルを用いることで前記疾患の治療薬を探索することが可能であり、これは、従来の培養細胞などを用いた転写活性能測定系などでは実現不可能なことである。

0050

《Q52系統のリガンド誘導性神経変性におけるアポトーシス》hAR(Q52)系統と既報の遺伝子導入系統との間での神経変性における共通の病理学的事象を確認するために、タネル法(TUNEL法)を用いて、アポトーシスが生じる際のDNA断片化を、hAR(Q52)第3齢幼虫の複眼原基において、以下のようにして検出した。hAR(Q52)を発現するトランスジェニックショウジョウバエとして、gmr−GAL4;UAS−hAR(Q52)であるトランスジェニックショウジョウバエを使用し、コントロールとして、gmr−GAL4;UAS−hAR(wt)であるトランスジェニックショウジョウバエを使用した。アポトーシス検出キット(TACS2 TdT−fluor in situアポトーシス検出キット;Trevigen,Inc社)を用いて、前記キットの説明書に従い、タネル法によるDNA断片の存在を調べた。断片化したDNAは、ターミナルデオキシヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ(terminal deoxynucleotidyl-exotransferase)で処理してビオチン化し、Cy5標識ストレプトアビジン(Jackson Immunoresearch社)を1000分の1の濃度で用いて染色した。

0051

その結果、DHT非投与時のhAR(Q52)系では、アポトーシスは観察されなかったが、DHT、HF、又はBICの各混餌投与時には、眼の破損を伴うアポトーシスが観察された。なお、コントロールのgmr−GAL4;UAS−hAR(wt)であるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド(DHT、HF、又はBIC)の投与又は非投与に関わらず、アポトーシスは観察されなかった。

0052

このDHT誘導性の眼の破損は、バキュロウイルス抗アポトーシス遺伝子p35(Davidson,F.F.及びSteller,H.,Nature,391,587−591,1998)をマイクロインジェクション法により共発現させることによって抑制され、また、ポリQ伸長タンパク質による神経変性の共通の抑制因子であるHsp40(dhdj−1)(Kazemi,E.P.及びBenzer,S.,Science,287,1837−1840,2000)の共発現によっても抑制された。

0053

本実施例の以上の結果から、他のポリQ伸長タンパク質と同様に、アポトーシスを伴って眼の破壊が起きていることが確認された。また、抗アポトーシス因子分子シャペロンによって眼の破壊が抑制されることも、他のポリQ伸長タンパク質による眼の破壊と同様で、例えば、過剰発現されたHsp40が、DHT誘導性の核凝集体に対して分子シャペロンとして作用し、hAR(Q52)の凝集体によるアポトーシスの誘導を阻害したと考えられる。このように、変異ヒトARへのリガンド結合は、他のポリQ伸長神経変性タンパク質を発現したショウジョウバエと同様の性質のアポトーシスを引き起こしたと考えられる。

0054

《リガンド結合とその結果生じる構造変化によって誘導されるポリQ伸長ヒトARのA/B領域によるアポトーシス》本実施例では、hAR(Q52)による神経変性のリガンド依存性の分子メカニズムを調べるため、最初に、ポリQ伸長型A/B領域のコンストラクトであるhAR(Q52AF−1)を用いて、マイクロインジェクション法によりその効果を検討した。

0055

リガンドのない状態で、hAR(Q52AF−1)はアポトーシスを生じ、同時にAF−1(転写)活性も発現した。また、hAR(Q52)の核内での局在は、DHT存在下でのみ観察されたが、hAR(Q52AF-1)は主に核内に限局した。一方、ポリQ短縮型のA/B領域を有するhAR(Q5AF−1)を、同様に発現させてもアポトーシスを示さなかった。また、LBDのみを同様に発現させても毒性を示さなかった。更に、hAR(Q52AF−1)によるアポトーシスは、リガンド未結合のLBDの共発現によって抑制された。

0056

具体的には、(1)表現型が、gmr−GAL4;UAS−hAR(AF−1)であるトランスジェニックショウジョウバエ、又は(2)表現型が、gmr−GAL4;UAS−hAR(Q52AF−1)であるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド不在下で、眼の破壊が観察された。また、(3)表現型が、gmr−GAL4;UAS−hAR(Q5AF−1)であるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド不在下で、眼の破壊が観察されなかった。更に、(4)表現型が、gmr−GAL4;UAS−hAR(AF−2)であるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド(DHT、HF、又はBIC)の存在下又は不在下に関わらず、眼の破壊が観察されなかった。

0057

更に、(1)表現型が、gmr−GAL4;UAS−hAR(Q52AF−1)であるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド不在下で、眼の破壊が観察された。(2)表現型が、gmr−GAL4;UAS−hAR(Q52AF−1);UAS−hAR(AF−2)であるトランスジェニックショウジョウバエでは、リガンド存在下で、眼の破壊が観察され、リガンド不在下で、眼の破壊が抑制された。

0058

次に、GST−プルダウン(pull down)法を用いて、リガンド誘導性のhARの構造変化について、以下のようにして評価を行なった。ヒトARのA/B領域(AF−1)又はそのQ52変異体(Q52AF−1)を、大腸菌内でGST融合タンパク質[GST−AR(AF−1)及びGST−AR(Q52AF−1)]として発現させ(Yamamoto,A.ら,J.Cell Biol.,150,873−880,2000)、グルタチオンセファロース(glutathione−sepharose)4Bビーズ(Pharmacia Biotech社)へ結合させた。[35S]標識したヒトAR欠失変異体(DNA結合領域とLBDとを含むCDE/F領域)を、前記GST融合タンパク質の各々と一緒に、フェニルメタンスルホニルフルオリドPMSF;終濃度=1mmol/L)を添加したNET−N緩衝液[0.5%ノニデットP−40,20mmol/Lトリス−HCl(pH7.5),200mmol/L塩化ナトリウム,1mmol/Lエチレンジアミン四酢酸EDTA)]中で、DHT存在下(終濃度=1μmol/L)又は非存在下でインキュベートした。結合タンパク質は、7.5%SDS−PAGE(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)で分離し、クマシーブルー染色により等量のタンパク質が泳動されていることを確認した後、オートラジオグラフィーで検出した。

図面の簡単な説明

0059

その結果、hAR(wt)においては、A/B領域とE/F領域とのリガンド依存的な結合が観察されたのに対し、hAR(Q52)では、リガンド依存的な解離が観察された。具体的には、GST−AR(Q52AF−1)では、DHTの存在下で、GST−AR(Q52AF−1)と[35S]標識化ヒトAR(AF−2)との複合体が検出されなかったのに対して、GST−AR(AF−1)では、DHT存在下で、GST−AR(AF−1)と[35S]標識化ヒトAR(AF−2)との複合体が検出された。

0060

更に、トリプシン分解法によっても、リガンド誘導性のhARの構造変化について、以下のようにして検討した。イン・ビトロで発現させた[35S]標識したヒトARタンパク質[hAR(wt)又はhAR(Q52)]を、終濃度1μmol/LのDHT存在下で25度にて30分間インキュベートした。その後,終濃度5μg/mL又は10μg/mLとなるようにトリプシンを加え、32度でインキュベートした。反応を、等量の2×SDSサンプルバッファーを添加することにより停止し、SDS−PAGEで分離した後、オートラジオグラフィーで検出した。

0061

その結果、トリプシン分解法において、DHT結合によるhAR(wt)とhAR(Q52)の分解パターンは異なっていた。具体的には、DHT存在下又は不在下に関わらず、hAR(wt)は、5μg/mL濃度のトリプシンでも、特定のバンドが観察されない程度まで全て分解された。一方、hAR(Q52)においては、DHT不在下の場合には、5μg/mL濃度のトリプシンでは、未分解のhAR(Q52)が若干認められ、DHT存在下の場合には、トリプシン分解により新たに生じる特定のバンド2本が検出された。

0062

本実施例のこれまでの結果から、AR変異体によるアポトーシス誘導は、核内で発現していると考えられる。また、リガンド未結合のLBDが、A/B領域に存在するポリQによるアポトーシス発現及びAF−1活性を共に抑制しており、リガンドが結合すると両機能の抑制が解除されると考えられる。更に、hAR(wt)とhAR(Q52)で異なったリガンド依存的構造変化を生じることが示された。これらのことからhAR(Q52)では、hAR(wt)と異なるリガンド依存的構造変化の結果、ポリQの伸長したA/B領域がタンパク質分解を受けやすくなり、その結果として毒性を生じるタンパク質断片を生じると考えられた。

0063

図1ショウジョウバエに導入した正常ヒトAR及びその各種変異体の構造を模式的に示す説明図である。
図2交配の手順、交配に用いた各ショウジョウバエの有する各遺伝子の配置状態、及び交配により得られたショウジョウバエにおける発現タンパク質と遺伝子との相互関係を示す説明図である。
図3変異ヒトARを導入したCOS−1細胞中におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。

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