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技術 コレラトキシンの免疫原性無毒化変異体およびトキシンLTの免疫原性無毒化変異体、それらの調製、ならびにワクチンの調製のためのそれらの使用

出願人 ジーエスケイヴァクシンズエス.アール.エル.
発明者 マリオドメニギーニリノラプオリマリアグラツィアピザウィムホル
出願日 1992年12月30日 (27年2ヶ月経過) 出願番号 2002-119970
公開日 2003年1月7日 (17年2ヶ月経過) 公開番号 2003-000287
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 視覚スクリーン 日常試験 同一様式 両電解質 バングラデシュ 閉塞体 オタマ キヤリア
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図面 (5)

課題

遺伝子的に無毒化された、CTあるいはLT由来トキソイドである1つの抗原からなる、二次発生産物による、コレラあるいは毒素原性E.coliに対する完全な予防を与えるワクチンを提供すること。

解決手段

コレラトキシンサブユニットA(CT-A)またはそのフラグメントアミノ酸配列、あるいは、Escherichiacoli非耐熱性トキシンのサブユニットA(LT-A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含有する免疫原性無毒化タンパク質であって、ここで、Val-53、Val-97、Tyr-104、またはSer-63またはこれに対応する位置にあるアミノ酸が他のアミノ酸と置換されている、免疫原性無毒化タンパク質。

概要

背景

発明の背景
コレラは、広く世界中、特に第三世界に蔓延する伝染病であり、ある地域では、それは風土病である。腸系に生じるこの重い病気は、この疾患の記録されているケースの高い割合で致命的であることが示される。

コレラの病因は、グラム陰性微生物Vibrio cholerae(V.cholerae)である。これは、汚染された食物あるいは水の摂取を介して接触した個体の腸管コロニー化し、そして非常に高密度繁殖する。基本的な症状は、激しい下痢であり、その結果被検体は、ふん便によって一日あたり10〜15リットルもの液体損失し得る。この激しい脱水および電解質の損失の結果、被検体は、この感染の50〜60%のケースにおいて耐えられず、死亡する。V.choleraeにより起きた下痢は、アデニレートシクラーゼ酵素活性化を刺激することにより作用して細胞ベル障害を引き起こす、コレラトキシンCTの分泌による。コレラは、制御された強烈な水分再吸収(rehydration)再水和により効果的に治癒され得るが、この疾患の完全な制御および将来的な絶滅には、ワクチンの普及が望まれる。

現在、死滅細菌の非経口投与からなる、コレラに対するワクチン接種が存在する。いくつかの国では、この疾患に対するワクチン接種が要求されているが、現在の細胞性ワクチンは、感染の50%のケースにおいてのみ予防し、そしてその予防はまた6ヶ月未満の持続極度に制限されるので、その真の有用性が非常に疑わしい。

バングラデシュでは、高度な免疫原性であることが知られる、コレラトキシンのサブユニットBを付加した死滅細菌からなる経口ワクチンの、実験的な試みが進行中である(1990−92)。この産物は、特別な副作用も伴わず、永続的な予防を持続する(Holmgren J., Clemens J., Sack DA., Sanchez J.およびSvennerholm AM;「コレラに対する経口免疫処置」Curr. Top. Microbiol.Immunol.(1988), 146, 197−204)。

コレラトキシンは、Escherichia coliの毒素原性株の非耐熱性トキシンに、アミノ酸配列、構造、および作用様式において、類似する。

E.coliの毒素原性株の感染の結果は、コレラに類似しており(コレラよりも激しくないが)、激しい下痢および腸の疾患からなる。

CTおよびLTトキシンはすべて、トキシンの酵素活性の原因である1つのAサブユニット(あるいはプロトマーA)(本明細書中ではCT−AあるいはLT−A)、および、トキシンと腸上皮細胞との結合に関連する、5つの同一の(identical)Bサブユニット(あるいはプロトマーB)(本明細書ではCT−BあるいはLT−B)を含有する。

このAサブユニットは、細胞膜を通過して、酵素活性を制御するGTP結合タンパク質NAD依存ADPリボシル化により、アデニレートシクラーゼの活性化を引き起こす。これの臨床的な影響は、腸での大量の液体の損失を引き起こすことである。

かなりの研究が、コレラトキシンおよびE.coli非耐熱性トキシンについて行われてきた。

CTの配列は公知であり、記載されている(Mekalanos J.J.ら、Nature 306,551ページ(1983))。

E.coliの毒素原性株由来のLTの配列は、掲載されているように、CTに80%相同であり、これもまた周知で科学文献に記載されている。Spicer E.K.ら(Biol.Chem. 257 p.5716−5721(1982))には、ブタに認められるE.coliの毒素原性株由来の非耐熱性トキシンのAサブユニットのアミノ酸配列が記載されている。

LTの細菌染色体型が、Pickett C.L.ら(J. Bacteriol.169,5180−5187,(1987))により、同定され、そして配列決定された。

ヒトに感染することが周知である、E.coliの株由来のLTのAサブユニットの配列もまた、配列決定された(Yamamotoら、J. Biol.Chem., 259, 5037−5044(1984))。

コレラおよび毒素原性細菌に対するワクチンの可能な臨床上の重要性の観点から、コレラおよび毒素原性細菌に対して免疫し得る、無毒化トキシンを生産する、継続的かつ偉大な目的が存在する。遺伝子工学の技術は、このトキシンをコードする遺伝子への特定の変異株の導入、ならびに、遺伝子発現およびタンパク質精製の従来の技術による、変異トキシンの生産を可能にする。

多くのグループが、コードされたタンパク質の毒性特性の損失に関連する、遺伝子変異の同定を試みてきた。これらの研究は、主としてE.coli由来のトキシンLTの遺伝子に関して実施されている。

Harford,Sら(Eur. J. Biochem. 183, 311ページ(1989))には、ブタに対して病原性のE.coli由来のLT−A遺伝子のインビトロ変異誘発による、トキソイドの生産が記載されている。得られた成功例の変異は、Ser−61−Phe置換およびGly−79−Lys置換を包含する。前者はより重要と考えられる。Harfordらは、ヒトおよびブタに病原性であるE.coli中のLT−A遺伝子と、CT−A遺伝子との間の類似性、ならびに、このトキシンは共通の機構により作動すると考えられることから、Ser−61−Phe変異をCT−A遺伝子に導入することにより、コレラのハロトキソイドを生産する可能性があり得ることを示唆している。

Tsuji, T.ら(J. Biol. Chem.265,p. 22520(1990))には、変異LTの毒性に影響するが、そのタンパク質の免疫原性は変化させない、1つの置換Glu−112−Lysを産生するプラスミドEWD299由来のLT−A遺伝子の変異が記載されている。

Grant, C.C.R.ら(第92回 General Meetingof The American Society for Microbiologyの要旨集 B289,1992年5月26−30日)には、酵素活性を著しく低下させる、LT−A中の、44位および70位のヒスチジンならびに127位のトリプトファン同類置換が記載されている。

いくつかの研究が、CTに対する変異についてなされてきた。

Kaslow,H.R.ら(第92回 General Meeing ofthe American Society for Microbiologyの要旨集 B291, 1992年5月26−30日)には、本質的に全ての活性を排除する、CT−A中の、Asp−9およびHis−44の変異、ならびに、アミノ酸180位以降の切断(truncating)が記載されている。Arg−9変異は著しく活性を弱めると言われている。その他のアミノ酸部位の変異は、毒性に対してほとんど影響はなかった。

Burnette, W.N.ら(Inf. and Immun. 59(11),4266−4270,(1991)には、Bordetella pertussisトキシンのAサブユニットの公知の無毒化変異と平行する、Arg−7−Lys変異を産生するCT−Aの部位特異的変異誘発が記載されている。変異は、検出可能なADPリボシルトランスフェラーゼ活性を完全に撤廃させた。

国際特許出願WO92/19265(Burnette, Kaslow and Amgen Inc.)には、Arg−7、Asp−9、Arg−11、His−44、His−70、およびGlu−112でのCT−Aの変異が記載されている。

Glu−110(LTおよびCT)ならびにArg−146(LT)での変異もまた、文献に記載されている(Lobet, Inf. Immun., 2870, 1991; Lai, Biochem.Biophys. Res. Comm. 341 1983; Okamoto J.Bacteriol. 2208, 1988)。

LTの結晶構造が、Sixmaら(Nature, 351, 371−377, 1991年5月)により決定され、変異誘発が以前の文献に記載された結果生じることが確認された。このことは、Aサブユニットの活性に、Glu−112およびSer−61の構造的な重要性を説明し、そして、非常にすぐ近位のHis−44、Ser−114、およびArg−54が、触媒作用および認識に重要であり得ることを示唆する。

概要

遺伝子的に無毒化された、CTあるいはLT由来のトキソイドである1つの抗原からなる、二次発生産物による、コレラあるいは毒素原性E.coliに対する完全な予防を与えるワクチンを提供すること。

コレラトキシンのサブユニットA(CT-A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列、あるいは、Escherichiacoli非耐熱性トキシンのサブユニットA(LT-A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含有する免疫原性無毒化タンパク質であって、ここで、Val-53、Val-97、Tyr-104、またはSer-63またはこれに対応する位置にあるアミノ酸が他のアミノ酸と置換されている、免疫原性無毒化タンパク質。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

コレラトキシンサブユニットA(CT-A)またはそのフラグメントアミノ酸配列、あるいは、Escherichiacoli非耐熱性トキシンのサブユニットA(LT-A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含有する免疫原性無毒化タンパク質であって、ここで、Val-53、Val-97、Tyr-104、またはSer-63またはこれに対応する位置にあるアミノ酸が他のアミノ酸と置換されている、免疫原性無毒化タンパク質。

請求項2

Ser-63-Lysの置換を包含する、請求項1に記載の免疫原性無毒化タンパク質。

請求項3

請求項1または請求項2に記載の免疫原性無毒化タンパク質であって、ここで、Arg-7、Asp-9、Arg-11、His-44、Val-53、Arg-54、Ser-61、His-70、Val-97、Tyr-104、Pro-106、His-107、Glu-110、Glu-112、Ser-114、Trp-127、Arg-146、またはArg-192またはこれらに対応する位置にある、1つまたはそれより多いアミノ酸がさらに置換されている、免疫原性無毒化タンパク質。

請求項4

1つまたはそれより多い、次のアミノ酸置換:Val-53-Asp、Val-53-Glu、Val-53-Tyr、Val-97-Lys、Val-97-Tyr、His-107-Glu、Tyr-104-Lys、Tyr-104-Asp、Tyr-104-Ser、Pro-106-Ser、Ser-114-Glu、Ser-114-Lysを含有する、請求項3に記載の免疫原性無毒化タンパク質。

請求項5

請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンとして用いられる、免疫原性組成物

請求項6

請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、ワクチン組成物

請求項7

アジュバントをさらに含有する、請求項6に記載のワクチン組成物。

請求項8

請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク質をコードする、DNA配列

請求項9

請求項8に記載のDNA配列を保有するベクター

請求項10

請求項9に記載のベクターで形質転換される、宿主細胞株

請求項11

請求項10に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク質の製造方法。

請求項12

CT-AまたはLT-AをコードするDNAあるいはそれらのフラグメントを部位特異的変異誘発に供する工程を包含する、請求項8に記載のDNAの製造方法。

請求項13

請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク質を薬学的に受容可能なキャリアと結合させる工程を包含する、請求項6に記載のワクチンの処方の方法。

請求項14

請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク質をアジュバントと結合させる工程を包含する、請求項7に記載のワクチンの処方の方法。

請求項15

医薬品として使用するための請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク質。

請求項16

ワクチンとして使用するための請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性無毒化タンパク質。

請求項17

Vibrio choleraeまたはEscherichia coliの腸内毒素原性株に対して哺乳動物ワクチン接種するための医薬の調製のための、請求項1〜4のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパク質の使用。

請求項18

経皮投与のために適切な形態の請求項5または請求項6に記載の組成物

請求項19

前記使用が経皮投与のための使用である、請求項15または請求項16に記載の免疫原性無毒化タンパク質。

技術分野

0001

発明の分野
本発明は、Val−53、Ser−63、Val−97、Tyr−104、またはPro−106の1つ以上のアミノ酸置換を有する、コレラトキシン(CT)の免疫原性無毒化タンパク質、あるいは、Escherichia coli(E.coli)の毒素原性株により産生された非耐熱性トキシンLT)の免疫原性無毒化タンパク質、ならびに、コレラまたは毒素原性E.coliの感染の予防あるいは治療に有用なワクチンでのそれらの使用に関する。これらのタンパク質は、野生型トキシンをコードするDNAの部位特異的変異誘発による組換えDNA技術を用いて、適切に産生され得る。

背景技術

0002

発明の背景
コレラは、広く世界中、特に第三世界に蔓延する伝染病であり、ある地域では、それは風土病である。腸系に生じるこの重い病気は、この疾患の記録されているケースの高い割合で致命的であることが示される。

0003

コレラの病因は、グラム陰性微生物Vibrio cholerae(V.cholerae)である。これは、汚染された食物あるいは水の摂取を介して接触した個体の腸管コロニー化し、そして非常に高密度繁殖する。基本的な症状は、激しい下痢であり、その結果被検体は、ふん便によって一日あたり10〜15リットルもの液体損失し得る。この激しい脱水および電解質の損失の結果、被検体は、この感染の50〜60%のケースにおいて耐えられず、死亡する。V.choleraeにより起きた下痢は、アデニレートシクラーゼ酵素活性化を刺激することにより作用して細胞ベル障害を引き起こす、コレラトキシンCTの分泌による。コレラは、制御された強烈な水分再吸収(rehydration)再水和により効果的に治癒され得るが、この疾患の完全な制御および将来的な絶滅には、ワクチンの普及が望まれる。

0004

現在、死滅細菌の非経口投与からなる、コレラに対するワクチン接種が存在する。いくつかの国では、この疾患に対するワクチン接種が要求されているが、現在の細胞性ワクチンは、感染の50%のケースにおいてのみ予防し、そしてその予防はまた6ヶ月未満の持続極度に制限されるので、その真の有用性が非常に疑わしい。

0005

バングラデシュでは、高度な免疫原性であることが知られる、コレラトキシンのサブユニットBを付加した死滅細菌からなる経口ワクチンの、実験的な試みが進行中である(1990−92)。この産物は、特別な副作用も伴わず、永続的な予防を持続する(Holmgren J., Clemens J., Sack DA., Sanchez J.およびSvennerholm AM;「コレラに対する経口免疫処置」Curr. Top. Microbiol.Immunol.(1988), 146, 197−204)。

0006

コレラトキシンは、Escherichia coliの毒素原性株の非耐熱性トキシンに、アミノ酸配列、構造、および作用様式において、類似する。

0007

E.coliの毒素原性株の感染の結果は、コレラに類似しており(コレラよりも激しくないが)、激しい下痢および腸の疾患からなる。

0008

CTおよびLTトキシンはすべて、トキシンの酵素活性の原因である1つのAサブユニット(あるいはプロトマーA)(本明細書中ではCT−AあるいはLT−A)、および、トキシンと腸上皮細胞との結合に関連する、5つの同一の(identical)Bサブユニット(あるいはプロトマーB)(本明細書ではCT−BあるいはLT−B)を含有する。

0009

このAサブユニットは、細胞膜を通過して、酵素活性を制御するGTP結合タンパク質NAD依存ADPリボシル化により、アデニレートシクラーゼの活性化を引き起こす。これの臨床的な影響は、腸での大量の液体の損失を引き起こすことである。

0010

かなりの研究が、コレラトキシンおよびE.coli非耐熱性トキシンについて行われてきた。

0011

CTの配列は公知であり、記載されている(Mekalanos J.J.ら、Nature 306,551ページ(1983))。

0012

E.coliの毒素原性株由来のLTの配列は、掲載されているように、CTに80%相同であり、これもまた周知で科学文献に記載されている。Spicer E.K.ら(Biol.Chem. 257 p.5716−5721(1982))には、ブタに認められるE.coliの毒素原性株由来の非耐熱性トキシンのAサブユニットのアミノ酸配列が記載されている。

0013

LTの細菌染色体型が、Pickett C.L.ら(J. Bacteriol.169,5180−5187,(1987))により、同定され、そして配列決定された。

0014

ヒトに感染することが周知である、E.coliの株由来のLTのAサブユニットの配列もまた、配列決定された(Yamamotoら、J. Biol.Chem., 259, 5037−5044(1984))。

0015

コレラおよび毒素原性細菌に対するワクチンの可能な臨床上の重要性の観点から、コレラおよび毒素原性細菌に対して免疫し得る、無毒化トキシンを生産する、継続的かつ偉大な目的が存在する。遺伝子工学の技術は、このトキシンをコードする遺伝子への特定の変異株の導入、ならびに、遺伝子発現およびタンパク質精製の従来の技術による、変異トキシンの生産を可能にする。

0016

多くのグループが、コードされたタンパク質の毒性特性の損失に関連する、遺伝子変異の同定を試みてきた。これらの研究は、主としてE.coli由来のトキシンLTの遺伝子に関して実施されている。

0017

Harford,Sら(Eur. J. Biochem. 183, 311ページ(1989))には、ブタに対して病原性のE.coli由来のLT−A遺伝子のインビトロ変異誘発による、トキソイドの生産が記載されている。得られた成功例の変異は、Ser−61−Phe置換およびGly−79−Lys置換を包含する。前者はより重要と考えられる。Harfordらは、ヒトおよびブタに病原性であるE.coli中のLT−A遺伝子と、CT−A遺伝子との間の類似性、ならびに、このトキシンは共通の機構により作動すると考えられることから、Ser−61−Phe変異をCT−A遺伝子に導入することにより、コレラのハロトキソイドを生産する可能性があり得ることを示唆している。

0018

Tsuji, T.ら(J. Biol. Chem.265,p. 22520(1990))には、変異LTの毒性に影響するが、そのタンパク質の免疫原性は変化させない、1つの置換Glu−112−Lysを産生するプラスミドEWD299由来のLT−A遺伝子の変異が記載されている。

0019

Grant, C.C.R.ら(第92回 General Meetingof The American Society for Microbiologyの要旨集 B289,1992年5月26−30日)には、酵素活性を著しく低下させる、LT−A中の、44位および70位のヒスチジンならびに127位のトリプトファン同類置換が記載されている。

0020

いくつかの研究が、CTに対する変異についてなされてきた。

0021

Kaslow,H.R.ら(第92回 General Meeing ofthe American Society for Microbiologyの要旨集 B291, 1992年5月26−30日)には、本質的に全ての活性を排除する、CT−A中の、Asp−9およびHis−44の変異、ならびに、アミノ酸180位以降の切断(truncating)が記載されている。Arg−9変異は著しく活性を弱めると言われている。その他のアミノ酸部位の変異は、毒性に対してほとんど影響はなかった。

0022

Burnette, W.N.ら(Inf. and Immun. 59(11),4266−4270,(1991)には、Bordetella pertussisトキシンのAサブユニットの公知の無毒化変異と平行する、Arg−7−Lys変異を産生するCT−Aの部位特異的変異誘発が記載されている。変異は、検出可能なADPリボシルトランスフェラーゼ活性を完全に撤廃させた。

0023

国際特許出願WO92/19265(Burnette, Kaslow and Amgen Inc.)には、Arg−7、Asp−9、Arg−11、His−44、His−70、およびGlu−112でのCT−Aの変異が記載されている。

0024

Glu−110(LTおよびCT)ならびにArg−146(LT)での変異もまた、文献に記載されている(Lobet, Inf. Immun., 2870, 1991; Lai, Biochem.Biophys. Res. Comm. 341 1983; Okamoto J.Bacteriol. 2208, 1988)。

0025

LTの結晶構造が、Sixmaら(Nature, 351, 371−377, 1991年5月)により決定され、変異誘発が以前の文献に記載された結果生じることが確認された。このことは、Aサブユニットの活性に、Glu−112およびSer−61の構造的な重要性を説明し、そして、非常にすぐ近位のHis−44、Ser−114、およびArg−54が、触媒作用および認識に重要であり得ることを示唆する。

発明が解決しようとする課題

0026

発明の要旨
トキシンの構造のさらなる詳細な分析により、CT−AおよびLT−Aの配列中のかなり遠くのアミノ酸が、適切に、個別に、あるいはその他の変異と結合するように変異した際に、CTおよびLTの酵素活性を減少し得る位置に存在することが、発見された。

0027

本発明の目的は、遺伝子的に無毒化された、CTあるいはLT由来のトキソイドである1つの抗原からなる、二次発生産物による、コレラあるいは毒素原性E.coliに対する完全な予防を与えるワクチンの提供である。

0028

CTあるいはLTの遺伝子的無毒化は、毒性を著しく低下させ、そして、好ましくはなくするが、トキソイドの免疫原性特性は維持している。

課題を解決するための手段

0029

本発明の第一局面に従って、コレラトキシン(CT−A)のサブユニットAのアミノ酸配列またはそのフラグメント、あるいは、Escherichia coli非耐熱性トキシン(LT−A)のサブユニットAのアミノ酸配列あるいはそのフラグメントを含有する、免疫原性無毒化タンパク質が提供される。ここでVal−53、Ser−63、Val−97、Try−104、またはPro−106のいずれかの位置またはこれらに対応する位置にある、1つ以上のアミノ酸が、他のアミノ酸と置換される。

0030

置換されたアミノ酸は、CT−AあるいはLT−Aの配列中に位置している。これはアミノ酸配列中および構造的に保存されており、従って、CTおよび種々のLT類に共通である。

0031

本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、天然に存在する野生型トキシンと、本質的に同じ構造のコンフォメーションを有する。これは、免疫学的に活性であり、野生型トキシンに対する抗体と交差反応する。

0032

本明細書中では、CTおよびLTには、種々の天然に存在する変異株、さらに、構築された毒素の免疫原性に影響しない、本明細書で開示されている配列由来の変化を包含するその他の変異株が、包含される。

0033

本明細書中では、「Val−97」のようなアミノ酸等価物とは、成熟コレラトキシンサブユニットA(CT−A)の配列中のその位置のアミノ酸のことを示し、これにはシグナル配列がない(図1を参照のこと)。

0034

本明細書でLT−Aと言うところは、アミノ酸等価物が、図1に示されるような、CT−A中の対応する位置をさしている。

0035

例えば、CT中のVal−53はLT1サブユニットのVal−52に対応し、そして、CT中のSer−63はLT1のSer−62に対応するので、LT1配列の番号をつけたアミノ酸89位までに1つのアミノ酸の異なりが存在する。CT配列中のVal−97は、配列中のその位置で4つのアミノ酸の異なりがあるので、LT1配列中のVal−93に対応する。

0036

さらに、本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、例えば、Arg−7、Asp−9、Arg−11、His−44、Arg−54、Ser−61、His−70、His−107、Glu−110、Glu−112、Ser−114、Trp−127、Arg−146、あるいはArg−192での1つ以上の置換のような、その他の変異を含み得る。

0037

野生型アミノ酸に対して置換されたアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であり得る、あるいは、改変または合成アミノ酸であり得る。置換には、アミノ酸全体の欠損が含まれ得る。ここで、変異は、必要な免疫原性特性を維持し、実質的に毒性の低下を示す。

0038

できる限り置換されたアミノ酸の立体効果は維持しているが、両電解質性および親水性を変化させる置換が、一般的には好ましい。

0039

好ましい置換には、Val−53−Asp、Val−53−Glu、Val−53−Tyr、Ser−63−Lys、Val−97−Lys、Val−97−Tyr、His−107−Glu、Tyr−104−Lys、Tyr−104−Asp、Tyr−104−Ser、Pro−106−Ser、Ser−114−Glu、Ser−114−Lysが含まれる。

0040

本明細書中に用いられる用語「無毒化された」とは、免疫原性組成物が、それに対応の天然に存在するトキシンに比較して、実質的により低い毒性を示すことを意味する。実質的により低い毒性は、著しい副作用の引き起こしを伴なうワクチンとして、免疫学的に有効な量で免疫原性組成物に使用されるタンパク質に関して、十分に低くあるべきである。例えば、免疫原性無毒化タンパク質は、それに対応の天然に存在するトキシンに0.01%未満の毒性を有するべきである。毒性は、マウスCHO細胞で、あるいは、好ましくはY1細胞に誘導された形態学的変化の評価により測定され得る。用語「トキソイド」とは、遺伝子的に無毒化されたトキシンを意味する。

0041

免疫原性タンパク質は、CTあるいはLTサブユニットAトキソイドであり得るが、好ましくは、1つの変異CT−AあるいはLTーAサブユニットおよびCTあるいはLTの5つのBサブユニットを含有する、構築された(assembled)トキシンである。Bサブユニットは、天然に存在するサブユニットであり得るか、あるいはそれ自身変異され得る。

0042

免疫原性タンパク質は、好ましくは、上記のように適切に改変された、天然に存在するCT−AあるいはLT−Aである。しかし、保守的アミノ酸変化は、免疫原性タンパク質の免疫原性あるいは毒性には影響せず、好ましくは、Bサブユニットタンパク質を有する完全なトキシンを形成する免疫原性タンパク質の活性には影響しないようになされ得る。さらに、免疫原性タンパク質は、CT−AあるいはLT−Aのフラグメントであり得る。ここで、フラグメントは、免疫原性かつ非毒性であり、本発明に従う変異の1つを含有する、少なくとも1つの保存領域を含有する。

0043

本発明の第二の局面に従って、本発明の第一の局面の免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンとしての使用のための、免疫原性組成物が提供される。

0044

免疫原性組成物はさらに、1つ以上のアジュバントおよび/または薬学的に受容可能な希釈剤を含有し得る。

0045

本発明はさらに、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチン組成物を提供する。このワクチン組成物はさらにアジュバントを含有し得る。

0046

本発明の第三の局面に従って、哺乳類に、Vibrio choleraeあるいはEscherichia coliの毒素原性株に対するワクチン接種の方法を提供する。この方法には、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質を免疫学的に有効な量で投与する工程が包含される。

0047

本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、従来のペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得るが、好ましくは、組換えDNA技術により生産される。

0048

本発明の第四の局面に従って、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質をコードするDNA配列が提供される。

0049

好ましくは、このDNA配列は、ポリシストロン性ユニット中に、無毒化サブユニットAおよびサブユニットBの両方をコードするDNAを包含する、完全なCTまたはLTをコードするDNA配列を含む。あるいは、このDNAは無毒化サブユニットAのみをコードし得る。

0050

本発明の第五の局面に従って、本発明の第四の局面に従うDNAを輸送するベクターを提供する。

0051

本発明の第六の局面に従って、本発明の第五の局面に従うベクターで形質転換された宿主細胞系を提供する。

0052

宿主細胞は、CTあるいはLTを産生し得る任意の宿主であり得るが、所望する免疫原性無毒化タンパク質を産生するように好適に設計された、好ましくは細菌、最も好ましくはE.coliあるいはV.choleraeである。

0053

本発明の第六の局面のさらなる実施態様では、宿主細胞はそれ自身、防御種(protective species)、例えば、野生型LTあるいはCTを欠き、そして本発明の第一局面の免疫原性無毒化タンパク質を運搬して発現する表現型に変異されたE.coliあるいはV.cholerae株を提供し得る。

0054

本発明の第六の局面のさらなる実施態様では、宿主細胞は、本発明の第一の局面に従う染色体LT−A遺伝子を発現し得る。

0055

本発明の第七の局面に従って、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質の製造方法を提供する。この方法には、本発明の第六の局面に従う宿主細胞を培養する工程が包含される。

0056

本発明の第八の局面に従って、本発明の第四の局面に従うDNAの製造方法を提供する。この方法には、CT−AまたはLT−AをコードするDNAあるいはそれらのフラグメントを、部位特異的変異誘発に供する工程を包含する。

0057

本発明の第九の局面に従って、本発明の第一の局面に従う免疫原性無毒化タンパク質を、薬学的に受容可能なキャリア、および、必要に応じてアジュバントと合わせる工程を包含する、ワクチンの調製方法を提供する。

0058

本願発明はまた、以下の項1〜14を提供する。
1.コレラトキシン(CT-A)のサブユニットAまたはそのフラグメントのアミノ酸配列、あるいは、Escherichia coli非耐熱性トキシン(LT-A)またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含有する免疫原性無毒化タンパク質であって、Val-53、Ser-63、Val-97、Tyr-104、またはPro-106のいずれかの位置またはこれらに対応する位置にある、1つまたはそれより多いアミノ酸が他のアミノ酸と置換されている、免疫原性無毒化タンパク質。
2.項1に記載の免疫原性無毒化タンパク質であって、Arg-7、Asp-9、Arg-11、His-44、Arg-54、Ser-61、His-70、His-107、Glu-110、Glu-112、Ser-114、Trp-127、Arg-146、またはArg-192のいずれかの位置またはこれらに対応する位置にある、1つまたはそれより多いアミノ酸がさらに置換されている、免疫原性無毒化タンパク質。
3.1つまたはそれより多い、次のアミノ酸置換:Val-53-Asp、Val-53-Glu、Val-53-Tyr、Ser-63-Lys、Val-97-Lys、Val-97-Tyr、His-107-Glu、Tyr-104-Lys、Tyr-104-Asp、Tyr-104-Ser、Pro-106-Ser、Ser-114-GluSer-114-Lysを含有する、項1または2に記載の免疫原性無毒化タンパク質。
4.前記項のいずれかに記載の免疫原性タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンに用いられる、免疫原性組成物。
5.項1〜3のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、ワクチン組成物。
6.アジュバントをさらに含有する、項5に記載のワクチン組成物。
7.項1〜3のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパク質をコードする、DNA配列。
8.項7に記載のDNAを輸送する、ベクター。
9.項8に記載のベクターで形質転換される、宿主細胞系。
10.項9に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、項1〜3のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパク質の製造法
11.CT-AまたはLT-AをコードするDNAあるいはそれらのフラグメントを部分特異的突然変異誘発に供する工程を包含する、項7に記載のDNAの製造方法。
12.免疫学的に有効な量の項1〜3のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパク質を投与する工程を包含する、Vibrio choleraeまたはEscherichia coliの毒素原性株に対するワクチン接種を哺乳類にする方法。
13.項1〜3のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパク質を薬学的に受容可能なキャリアとあわせる工程を包含する、項5に記載のワクチンの調製方法。
14.項1〜3のいずれかに記載の免疫原性無毒化タンパク質をアジュバントと合わせる工程を包含する、項6に記載のワクチンの調製方法。
工業的適用性
本発明の免疫原性無毒化タンパク質は、コレラ感染あるいはE.coliトキシン原性株による感染の予防および治療に有用なワクチン組成物の活性成分を構成する。従って、この組成物製薬業での使用に適用し得る。

発明を実施するための最良の形態

0059

(発明の実施様態の詳細な説明)本発明の実施は、他に示されていなければ、当該分野内の、分子生物学微生物学組換えDNA、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING; A LABORATORYMANUAL, 第2版(1989); DNA CLONING,I巻 および II巻(D.N.Glover 編 1985);OLIGONUCLEOTIDESYNHESIS(M.J. Gait編、1984);NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B.D. Hames および S.J. Higgins 編 1984);TRANSCRIPTION AND TRASLATION(B.D. Hames および S.J. Higgins 編 1984); ANIMAL CELLCULTURE(R.I.Freshney 編 1986);IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES(IRL Press, 1986);B. Perbal,APRACTICAGUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984);シリーズのMETHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc,);GENE TRANSFERVECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(J.H. MillerおよびM.P.Calos 編 1987, Cold Spring Harbor Laboratory),Methodsin Enzymology Vol. 154 および Vol. 155(それぞれ、WuおよびGrossman,およびWu, 編),Mayer および Walker, 編(1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London) Scopes, (1987),PROTEINPURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, 第2版 (Springer−Verlag,N.Y.)、およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,I−IV巻(D.M.WeirおよびC.C. Blackwell 編 1986)を、参照のこと。ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な略号が、本明細書で使用されている。本明細書に引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、参考として援用されている。

0060

特に、以下のアミノ酸の略号が使用される:

0061

ID=000003HE=125 WI=053 LX=0335 LY=1150
本発明に使用され得る免疫原性無毒化タンパク質の実施例に挙げた例には、特に掲載した変異の部位以外で、タンパク質の天然アミノ酸配列から比較的少ないアミノ酸の変異を有するポリペプチドが包含される。

0062

天然源からタンパク質を単離および精製するよりも、組換えDNA技術により免疫原性無毒化タンパク質を生産する重大な利点は、天然源からタンパク質を単離するのに必要とされる量よりも少量の開始物質を使用して、同量のタンパク質が生産され得ることである。組換え技術によるタンパク質の生産はまた、細胞内に通常存在するある種の分子非存在下での、タンパク質の単離を可能にする。事実、どのようなヒトタンパク質夾雑物(contaminants)も完全に含まないタンパク質組成物が、容易に製造され得る。なぜなら、組換え非ヒト宿主により生産されたヒトタンパク質のみが、問題の組換えタンパク質である。ヒトに対して病原性の、天然源からの潜在的ウイルス因子およびウイルス成分もまた、排除される。さらに、遺伝子的に無毒化されたトキシンは、従来の化学的に無毒化されたトキシンほど毒性が戻らないようである。

0063

薬学的に受容可能なキヤリアには、それ自身、その組成物が与えられる個体に有害な抗体の産生を誘導しない、任意のキャリアが包含される。適切なキャリアは、典型的には大きく、徐々に代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖ポリ乳酸ポリグリコール酸ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー脂質凝集体(例えば、油滴またはリボソーム)、および不活性化ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキヤリアは、免疫刺激物質(アジュバント)として機能し得る。

0064

組成物の有効性を増強する好ましいアジュバントには、以下が包含されるが、限定はされない:水酸化アルミニウムリン酸アルミニウム硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩(alum)、ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激物質を伴うかまたは伴わない、オイルエマルジョン調製物、例えば、(1)MF59(公開国際特許出願第WO−A−90/14837号、5%スタアレン、0.5% TweenR80、0.5%SpanR 85を含有する(必要ではないが、場合に応じて、種々の量のMTP−PE(以下を参照のこと)を含有する);ここでMF59は、Model 110Yマイクロフルイダイザー(microfluidizer)(Microfluidics, Newton, MA 02164)のようなマイクロフルイダイザーを用いて、サブミクロン粒子に調製されている、(2)SAF、すなわち10%スタアレン、0.4% Tween 80、5%プルロニックブロックポリマーL121(Pluronic−blocked polymerL121)、およびthr−MDP(以下を参照のこと)を含有する;ここでSAFは、マイクロフルイダイザーでサブミクロンエマルジョンにするか、または、ボルテックスにかけてより大きな粒子サイズのエマルジョンにする、および、(3)RIBITMアジュバンド系(RAS)(Ribi Immunochem, Hamilton, MT);2%スタアレン、0、2% TweenR80、および、以下からなる群の1つ以上の細胞壁成分を含有する:モノホスホリルリピドA(MPL)、トレハロースマイコレートTDM)、および細胞壁骨格(CWS)、好ましくはMPL+CWS(DetoxTM)、ムラミルペプチド(例えば、N−アセチルムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルウラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2'−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)など)、およびサイトカインインターロイキン(IL−1、IL−2など)マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など)。さらに、StimulonTM(Cambridge Bioscience,Worcester, MA)のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、または、それからISCOMS(免疫刺激複合体)のような粒子がつくられ得る。さらに、完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)が、使用され得る。AlumおよびMF59が好ましい。

0065

免疫原性組成物(例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリアおよびアジュバント)は、典型的には、水、生理食塩水グリセロールエタノールなどの希釈剤を含有し得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質が、このような賦形剤に存在し得る。

0066

典型的には、免疫原性組成物は、注射し得るように、溶液または懸濁液のいずれかに調製される;それはまた、注射の前に液体賦形剤中で、溶液あるいは懸濁液とするのに適した固形として、調製され得る。調製物もまた、上記のように、薬学的に受容可能なキャリア中で、アジュバント効果を増強するために、乳化されるか、あるいはリポソームカプセル化され得る。

0067

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原ポリペプチドに加えて、必要に応じて、他の上記した成分を含有し得る。「免疫学的に有効な量」により、個体への投与量が、単回投与において、または一連の一部として、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療されるべき個体の健康状態または生理的状態、治療されるべき個体の分類群(例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など)、抗体合成に対する個体の免疫系の許容量、所望の予防の程度、ワクチン調製物医学上の治療医の見解、およびその他の関連因子に依存して変化する。その量は、日常試験により決定され得るが、比較的広範囲であることが予測される。

0068

免疫原性組成物は、非経口的に、例えば、皮下注射または筋肉内注射のいずれかで、従来より投与されている。その他の投与形態に適した調製物には、経口および用の調製物、坐薬および経皮塗布が包含される。投与治療は、単回投与スケジュールあるいは複数回投与スケジュールであり得る。ワクチンは、その他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

0069

本明細書に使用されている用語「組換えポリヌクレオチド」とは、ゲノムcDNA半合成、または合成起源の、以下の起源または操作による、ポリヌクレオチドのことを意味する: (1)天然に結合されているポリヌクレオチドの全体または部分に結合しない、(2)天然に連結されているその他のポリヌクレオチドに結合する、あるいは(3)天然に存在しない。

0070

本明細書に使用されている用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー型のヌクレオチドのことである。この用語は、分子の一次構造のみを呼ぶ。従って、この用語には、二本鎖および一本鎖DNAおよびRNAが包含される。さらに、この用語には、周知の改変型、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのアナログとの1つ以上の置換、ヌクレオチド内の改変(例えば、非帯電結合(例えば、メチルホスフェートトリエステルホスフェート、ホスホアミデートカルバメートなど)および帯電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)での改変(この場合、ペンダント部分として、例えば、タンパク質(ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチドポリ−L−レリジンなどを包含する)を有する)、挿入剤(例えば、アクリジンソラレンなど)での改変、キレ一夕ー(例えば、金属、放射活性金属、ボロン酸化金属など)を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結合(例えば、α−アノマー核酸など)での改変)、および、ポリヌクレオチドの非改変型が、包含される。

0071

レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律ユニットとして挙動する、すなわち、それ自身の制御下で複製し得る、遺伝要素(例えば、プラスミド、染色体、ウイルスコスミドなど)である。これには、選択可能なマーカーが含まれる。

0072

「ベクター」は、接続されたセグメントの複製および/または発現をもたらすように、他のポリヌクレオチドセグメントが接続されたレプリコンである。

0073

制御配列」とは、連結されるコード配列の発現をもたらすのに必要なポリヌクレオチドのことである。このような制御配列の特性は、宿主生物に依存して異なる;原核生物では、このような制御配列は一般的に、プロモーターリボソーム結合部位、および転写終結配列を含む;原核生物において、このような制御配列は一般に、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最少限で、発現に必要な全ての成分を含み、さらに、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列のような、存在すれぱ好都合である成分も含む。

0074

作動可能に連結された」とは、記載の成分が意図した様式で機能し得る関係にある並置のことである。コード配列に「作動可能に結合された」制御配列は、制御配列と適合する条件下で、コード配列の発現が達成されるように連結される。

0075

オープンリーディングフレーム」(ORF)は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域である;この領域は、コード配列の一部分または全コード配列を表し得る。

0076

「コード配列」は、適切な調節配列の制御の下におかれると、通常mRNAを介してポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5’−末端翻訳開始コドンおよび3’−末端の終止コドンにより決定される。コード配列には、cDNAおよび組換えポリヌクレオチド配列が含まれ得るが、限定はされない。

0077

PCR」とは、Saikiら、Nature 324:163(1986);およびScharfら、Science(1986)233:1076−1078;および米国特許第4,683,195号; および米国特許第4,683,202号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応の技術のことである。

0078

本明細書に使用されているように、xが本質的に同一様式でyと関連しない場合、xはyに関して「異種」である;すなわち、xが事実上yに関連しないか、あるいはxが実際に認められるのと同じ様式でyに関連しない場合である。

0079

「相同」とは、xとyとの間の類似性の程度のことである。1つの型とその他の型との配列間の相関は、当該分野に公知の方法により決定される。例えば、これらは、ポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定され得る。あるいは、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下で、ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ(例えば、ハイブリダイゼーションはS1消化に先だって用いられる)、その後、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより消化し、次に、消化フラグメントのサイズを測定することにより、相同が決定され得る。

0080

本明細書に使用されている用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸ポリマーのことであり、特定の長さの産物のことではない;従って、ポリペプチドの定義には、ペプチドオリゴペプチド、およびタンパク質が包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変、例えば、グリコシル化アセチル化リン酸化などを意味するのではなく、すなわち除外する。定義に含まれるものは、例えば、1つ以上のアミノ酸アナログ(例えば、非天然のアミノ酸を含む)を有するポリペプチド、置換連結(substituted linkages)、および、当該分野に公知の他の天然に存在ならびに天然に非存在の両方の、改変を有するポリペプチドである。

0081

指定の核酸配列「由来の」ポリペプチドあるいはアミノ酸配列は、その配列中にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいはその部分のことであり、ここでその部分は、少なくとも3−5のアミノ酸からなり、さらに好ましくは、少なくとも8−10のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも11−15のアミノ酸からなるか、または、そのペプチドは配列中にコードされたポリペプチドと免疫学的に同一であると見なし得る。この用語にはまた、指定の核酸配列から発現されるポリペプチドが包含される。

0082

タンパク質は、そのタンパク質に特異的な、モノクローナルあるいはポリクローナルのいずれかの抗体を産生するのに使用され得る。これらの抗体を産生する方法は、当該分野に公知である。

0083

組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」および、その他のこのような用語は、例えば、組換えベクターあるいはその他のトランスファーDNA用の受容体として使用され得るか、または使用された微生物昆虫細胞、および哺乳類細胞を意味し、そして、形質転換された初代細胞子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、自然的、偶発的あるいは意図的変異により、形態学あるいはゲノムDNAまたは全DNA相補鎖において、初代の親のようには必ずしも完全に同一であり得ないことは理解される。哺乳類宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞およびサル(COS)細胞が挙げられる。

0084

特に、本明細書に使用されている「細胞系」は、インビトロにおいて増殖および分化を継続あるいは延長し得る細胞群のことである。しばしば、細胞系は、単一の先祖細胞に由来するクローン群である。このようなクローン群の貯蔵あるいは移動の間に、自発変化あるいは誘発変化が核型において生じ得ることがさらに当該分野では知られている。従って、引用の細胞系由来の細胞は、先祖細胞あるいは培養物と正確には同一であり得ず、そして引用の細胞系は、そのような変種を含む。用語「細胞系」はまた、不死化細胞を包含する。好ましくは、細胞系は、非ハイブリッド細胞系あるいはハイブリドーマの2つの細胞型のみを含む。

0085

本明細書に使用されている用語「微生物」には、細菌および細菌のような原核および真核微生物種が包含され、細菌には、酵母および糸状菌が包含される。

0086

本明細書に使用されている「形質転換」とは、例えば、直接取り込み(direct uptake)、トランスダクション、f−メーティング、あるいはエレクトロポレーションのような、挿入に使用される方法に関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入のことである。外因性ポリヌクレオチドは、プラスミドのような非組込みベクターとして維持され得るか、あるいは宿主ゲノムに組込まれ得る。

0087

「ゲノムの」により、ベクターにクローニングされた制限フラグメントに由来するDNA分子コレクションあるいはライブラリーを意味する。これは、生物遺伝子物質の全てあるいは部分を包含し得る。

0088

「cDNA」により、DNAの相補鎖にハイブリダイズする、相補DNA鎖を意味する。

0089

「精製された」および「単離された」により、ポリペプチドあるいはヌクレオチド配列に関する場合には、指示される分子が、それと同じタイプの生物学的高分子が他に実質的に存在していない状態で、存在することを意味する。本明細書に使用されている用語「精製された」は、同じタイプの生物学的高分子が、少なくとも75重量%、好ましくは、少なくとも85重量%、さらに好ましくは、少なくとも95重量%、そして最も好ましくは98重量%存在することを意味する(しかし、水、緩衝液、およびその他の低分子、特に、分子量が1000未満の分子は、存在し得る)。

0090

一旦、適切なコード配列が単離されると、それは種々の異なった発現系において発現され得る;例えば、それは、哺乳類細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母と共に使用される。

0091

i.哺乳類系
哺乳類発現系は当該分野で公知である。哺乳類プロモーターは、哺乳類RNAポリメラーゼを結合し、そしてコード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの下流(3’)転写を開始し得るあらゆるDNA配列である。プロモーターは、コード配列の5’末端近傍に通常位置する転写開始領域、および転写開始部位の25〜30塩基対(bp)上流に通常位置するTATAボックスを有する。TATAボックスは、RNAポリメラーゼIIを方向づけ、正しい部位でRNA合成を開始すると考えられている。哺乳類プロモーターはまた、TATAボックスの100から200bp上流内に通常位置する上流プロモーター要素も含む。上流プロモーター要素は、転写が開始される速度を決定し、いずれかの方向に作用し得る[Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版中のSambrookら、(1989)「哺乳類細胞におけるクローン化遺伝子の発現」]。哺乳類ウイルス遺伝子は、しばしば、非常高度に発現され、そして広い宿主の範囲を有する。従って、哺乳類ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。その例として、SV40初期プロモーター、マウス乳ガンウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス後期(major late)プロモーター(Ad MLP)および単純性疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、プロモーターがホルモン応答性細胞内のグルココルチコイドで誘導され得るか否かによって、構成的であり得るか、または調節され得る(誘導可能)。

0092

エンハンサー要素エンハンサー)が存在すると、これは上記のプロモーター要素と組合わさって、通常、発現レベルを増加させる。エンハンサーは、相同または異種のプロモーターと連結すると、正常なRNA開始部位での合成開始と共に転写を1000倍にまで増加し得る調節DNA配列である。エンハンサーはまた、転写開始部位から上流または下流に位置しても、正常な方向もしくは逆方向のいずれの方向でも、またはプロモーターから1000ヌクレオチドより遠く離れた位置にあっても機能する。[Maniatisら、(1987)Science 236:1237;Albertsら、(1989)MolecularBiology of the Cell,第2版]。ウイルス由来のエンハンサー要素は特に有用であり得る。なぜなら、これらは通常、より広い宿主の範囲を有するためである。その例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー[Dijkemaら、(1985)EMBO J. 4:761]、ならびにラウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR)[Gormanら、(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6777]およびヒトサイトメガロウイルス[Boshartら、(1985)Cell 41:521]由来のエンハンサー/プロモーターが挙げられる。さらに、エンハンサーの中には調節可能で、ホルモンまたは金属イオンなどの誘導物質の存在下でのみ活性となるものがある[Sassone−CorsiおよびBorelli、(1986)TrendsGenet.2:215,Maniatisら、(1987)Science 236:1237]。

0093

哺乳類細胞中では、DNA分子は細胞内で発現し得る。プロモーター配列はDNA分子と直接連結し得、その場合、組換えタンパク質のN末端の第1アミノ酸は、常にATG開始コドンによってコードされるメチオニンである。所望なら、臭化シアンを用いてインビトロでインキュベートすることによって、N末端はタンパク質から切断され得る。

0094

あるいは、哺乳類細胞内で異種タンパク質の分泌を促すリーダー配列フラグメントから構成され、そして融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を形成することによって、異種タンパク質もまた、細胞から増殖培地へ分泌され得る。リーダーフラグメントと異種遺伝子との間でコードされ、そしてインビボまたはインビトロで切断され得るプロセシング部位があることが好ましい。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からタンパク質を分泌させる疎水性アミノ酸で構成されるシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス3分節系(triparite)リーダーは、哺乳類細胞内で異種タンパク質を分泌するリーダー配列の一例である。

0095

通常、哺乳類細胞で認められる翻訳終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンから3’側に位置する調節領域であるため、プロモーター要素と共にコード配列に隣接する。成熟mRNAの3’末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化によって形成される[Birnstielら、(1985)Cell 41:349;Transcription and splicing(B.D.HamesおよびD.M.Glover編)中のProudfootおよびWhitelaw、(1988)「真核生物のRNAの終結および3’末端プロセシング」;Proudfoot、(1989)TrendsBiochem.Sci.14:105]。これらの配列は、DNAによってコードされるポリペプチドに翻訳され得るmRNAの転写をもたらす。転写ターミネ一夕ー/ポリアデニル化シグナルの例としては、SV40由来のものが挙げられる[Molecular Cloning: A Laboratory Manua1lのSambrookら、(1989)「培養哺乳類細胞におけるクローン化遺伝子の発現」]。イントロン介在配列とも呼ばれる)が存在すると、いくらかの遺伝子はより効率的に発現され得る。しかし、いくつかのcDNAは、スプライシングシグナルスプライス供与およびスプライス受容部位とも呼ばれる)を欠失するベクターから効率的に発現された[例えば、GothingおよびSambrook(1981)Nature 293:620を参照のこと]。イントロンは、スプライス供与部位およびスプライス受容部位を含むコード配列内の介在非コード配列である。これらは、一次転写産物のポリアデニル化に続く「スプライシング」と呼ばれる過程によって除去される。[Nevins(1983)Annu.Rev.Biochem.52:441;Green(1986)Annu.Rev.Genet.20:671;Padgettら(1986)AnnuRevBlochem55:1119,Transcription and spilicing(B.D.HamesおよびD.M.Glover編)中のKrainerおよびManiatis(1988)による「RNAスプライシング」]。

0096

通常、上記構成要素は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を包含し、共に発現構築物を形成する。エンハンサー、機能的スプライス供与部位および受容部位を有するイントロン、およびリーダー配列もまた、所望であれば、発現構築物中に含まれ得る。発現構築物は、しばしば、哺乳類細胞または細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外要素(例えば、プラスミド)のようなレプリコン中に維持され得る。哺乳類の複製系は、複製にトランス作用因子を必要とする動物ウイルス由来の複製系を含む。例えば、SV40[Gluzman(1981)Cell 23:175]またはポリオーマウイルスのようなパポーバウイルスの複製系を有するプラスミドは、適切なウイルス性T抗原の存在下で、極端に多いコピー数に至るまで複製する。哺乳類のレプリコンのさらなる例として、ウシパピローマウイルスおよびエプスタインバールウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、2種の複製系を有し得るため、レプリコンは、例えば、哺乳類細胞中には発現のために、そして原核宿主中にはクローニングおよび増幅のために維持され得る。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例として、pMT2[Kaufmanら、(1989)Mol.Cell.Biol.9:946]およびpHEBO[Shimizuら、(1986)Mol.Cell.Biol.61074]が挙げられる。

0097

使用する形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞中へ導入するための方法は、当業者に周知であり、デキストラン介在トランスフェクションリン酸カルシウム沈降法ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核中へのDNAの直接的なマイクロインジェクションを包含する。

0098

発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は、当業者に周知であり、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞系を含み、これらとして、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒーラ細胞シリアンハムスター腎(BHK)細胞、コス細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、および他の多くの細胞系を挙げることができるが、それらに限定されない。

0099

ii.バキュロウイルス系
タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、適切な昆虫発現ベクター中に挿入され得、そしてそのベクター内の制御要素に、作動可能に連結される。ベクター構築は、当業者に周知の技術を用いる。

0100

一般に、発現系の構成要素は、バキュロウイルスゲノムのフラグメントと異種遺伝子または発現されるべき遺伝子の挿入に都合のよい制限部位との両方を含み、そして通常は細菌のプラスミドである転移ベクター;転移ベクター中のバキュロウイルスに特異的なフラグメントと相同の配列を有する野生型バキュロウイルス(これは、異種遺伝子のバキュロウイルスゲノム中への相同的組換えを考慮に入れる);および適切な昆虫宿主細胞および増殖培地を有する。

0101

タンパク質をコードするDNA配列を、転移ベクター中に挿入した後、そのベクターとウイルスゲノムとが再結合することが可能な昆虫宿主細胞中に、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムをトランスフェクトする。パッケージされた組換えウイルスを発現し、組換えプラークを同定し、そして精製する。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系の材料および方法は、キットの形状で、特に、Invitrogen、San Diego CA(「マックスバック(Max Bac)」キット)から、市販されている。これらの技術は、一般に当業者に周知であり、SummersおよびSmith、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin 1555号(1987)(以後、「SummersおよびSmith」と記載)中に完全に記載されている。

0102

バキュロウイルスゲノム中にタンパク質をコードするDNA配列を挿入する前に、プロモーター、(所望ならば)リーダー、目的とするコード配列、および転写終結配列を含む上記構成要素を、通常、中間転位(transplacement)構築物(転移ベクター)に組み立てる。この構築物は、単一の遺伝子、および作動可能な連結された調節要素;それぞれが作動可能に連結された一連の調節要素を有する同義遺伝子;または、それと同じ一連の調節要素により調節される同義遺伝子を含み得る。中間転位構築物は、しばしば、細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外要素(例えば、プラスミド)のようなレプリコン中に維持される。このレプリコンは、複製系を有するため、レプリコンが、クローニングおよび増幅のために適切な宿主中に維持され得る。

0103

現在、外来遺伝子をAcNPV中に導入するために、最も一般的に使用される転移ベクターはpAc373である。当業者に周知の多くの他のベクターもまた、設計された。これらには、例えば、(ポリヘドリン開始コドンをATGからATTに変換し、そのATTから32塩基対下流にBamHIクローニング部位を導入する)pVL985が包含される;LuckowおよびSummers、Virology(1989)17:31を参照のこと。

0104

通常、このプラスミドはまた、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル(Millerら、(1988)Ann.Rev.Microbiol.、42:177)、および、E. coli.中の選択およひ増殖のための原核生物のアンピリシン耐性(amp)遺伝子および複製起点をも含有する。

0105

バキュロウイルス転移ベクターは、通常バキュロウイルスプロモ一夕ーを含有する。バキュロウイルスプロモ一夕ーは、バキュロウイルスRNAポリメラーゼを結合し、そしてコード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの下流(5’から3’)転写を開始し得る、あらゆるDNA配列である。プロモーターは、コード配列の5’末端の付近に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を通常含有する。バキュロウイルス転写ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第2ドメインを有し得、これが存在する場合、通常、このエンハンサーは構造遺伝子に対して遠位にある。発現は、調節されるかあるいは構成的(constitutive)である。ウイルス感染サイクル終期に大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、ウイルスポリヘドロンタンパク質をコードする遺伝子から得られる配列、The Molecular Biologyof Baculoviruses(Walter Doerfler編)中のFriesenら、(1986)「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」;欧州特許公開第127839号および第155476号;およびp10タンパク質をコードする遺伝子、Vlakら、(1988)、J Gen.Virol.69:765が挙げられる。

0106

適切なシグナル配列をコードするDNAは、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子(Carbonellら(1988)Gene、73:409)のような、分泌された昆虫あるいはバキュロウイルスタンパク質の遺伝子から得られ得る。あるいは、哺乳類細胞の翻訳後の(シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化のような)改変に対するシグナルが昆虫細胞に認識されるらしく、また分泌および核蓄積に必要なシグナルも、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されるらしいので、ヒトα−インターフェロン、Maedaら、(1985)、Nature 315:592;ヒトガストリン放出ペプチド、Lebacq−Verheydenら、(1988)、Molec.Cell.Biol.8:3129;ヒトIL−2、Smithら、(1985)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA、82:8404;マウスIL−3、(Miyajimaら、(1987)Gene 58:273;およびヒトグルコセレブシダーゼ、Martinら、(1988)DNA、7:99をコードする遺伝子から得られるリーダーのような非昆虫起源のリ一ダーも、昆虫での分泌を促すために用い得る。

0107

組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内で発現され得るか、または適当な調節配列により発現される場合に分泌され得る。非融合外来タンパク質の良好な細胞内発現は、通常、ATG開始シグナルの前に、適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を理想的に有する異種遺伝子を必要とする。所望であれば、N末端のメチオニンを、成熟したタンパク質から、臭化シアンを用いるインビトロのインキュベーションで切断し得る。

0108

あるいは、天然には分泌されない組換えポリタンパク質またはタンパク質は、昆虫内で、外来タンパク質の分泌を可能にするリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を作製することで、昆虫細胞から分泌され得る。このリーダー配列フラグメントは、通常、タンパク質を小胞体中に輸送する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。

0109

タンパク質の発現産物前駆体をコードするDNA配列および/または遺伝子の挿入の後、昆虫細胞宿主を、転移ベクターの異種DNAおよび野生型バキュロウイルスのゲノムDNAを用いて、同時形質転換する−−通常は、同時トランスフェクションによる。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの2〜5kbのセグメントを含む。異種DNAをバキュロウイルス中の所望の部位に導入する方法は、当業者に周知である。(SummersおよびSmith,上記;Juら(1987);Smithら、Mol. Cell. Biol.(1983) 3:2156;およびLuckowおよびSummers(1989)を参照のこと)。例えば、挿入は、相同的二重交差組換え(homologous double crossover recombination)により、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子中に行われ得る;挿入は、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計される制限酵素部位中にも行われ得る。Millerら、(1989)、Bioessays 4:91。このDNA配列は、発現ベクター中のポリへドリン遺伝子の場所にクローニングされた場合、5’および3’の両方がポリヘドリン特異的配列により隣接され、ポリヘドリンプロモーターの下流に位置する。

0110

新しく形成されたバキュロウイルス発現ベクターを、続いて、感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージする。相同的組換えは、低い頻度(約1%と約5%との間)で発生する;そのため、同時トランスフェクションの後に生産されるウイルスの大半は、まだ野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定する方法が必要である。この発現系の利点は、組換えウイルスの識別を可能にする視覚スクリーンである。天然のウイルスにより生産されるポリヘドリン遺伝子は、感染細胞の核中で、ウイルス感染の後遅い時期に、非常に高いレベルで生産される。蓄積されたポリヘドリンタンパク質は、包埋された粒子もまた含有する閉塞体(occlusion bodies)を形成する。これらの閉塞体は、サイズが15μmまでであり、屈折率が高いので、光学顕微鏡下で容易に可視化される、明るい光沢のある外観を与えられる。組換えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。野生型ウイルスから組換えウイルスを識別するために、トランスフェクション上清液を、当業者に周知の技術を用いて、昆虫細胞の単層上にプラークを形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在(野生型ウイルスを示す)または非存在(組換えウイルスを示す)についてスクリーニングする。「Current Protocols in Microbiology」第2巻(Ausubelら編)の16.8(10、1990増補);SummersおよびSmith、上記;Millerら(1989)。

0111

組換えバキュロウイルス発現ベクターが、いくつかの昆虫細胞中へ感染させるために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスが、とりわけ以下の種のために開発されている:Ades aegypti、Autographacalifornica、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda、およびTrichoplusia ni(PCT公開WO 89/046699号;Carbonellら、(1985)J. Virol. 56:153;Wright(1986)Nature 321:718;Smithら、(1983)Mol. Cell. Biol.3:2156;および一般的にはFraserら(1989)In Vitro Cell. Dev. Biol.25:225を参照のこと)。

0112

細胞および細胞培地は、バキュロウイルス/発現系での、異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために、市販され入手可能である;細胞培養技術は、通常、当業者に周知である。例えば、SummersおよびSmith,上記を参照のこと。

0113

次いで、改変された昆虫細胞を、適切な栄養培地中で増殖させ得、改変された昆虫宿主中に存在するプラスミドを安定して維持させる。発現産物の遺伝子が、誘導可能な制御下におかれている場合、宿主は高密度に増殖し得、そして発現を誘導し得る。または、発現が構成性である場合、生産物は培地中に継続的に発現させ、そして、目的の生産物を除去して消耗した栄養分を増加させる間、栄養培地は継続して一部取り換えなければならない。産物は、クロマトグラフィー、例えば、HPLC、アフィニィティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど;電気泳動密度勾配遠心分離溶媒抽出などのような技術により精製され得る。好適には、この生産物は、必要であれば、培地中に分泌されるか、または昆虫細胞の溶解から生じるいかなる昆虫タンパク質をも実質的に除去するために、宿主のデブリ(例えば、タンパク質、脂質および多糖類)を少なくとも実質的に含まない産物を提供するために、さらに精製され得る。

0114

タンパク質発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞を、組換えタンパク質コード配列を発現させる条件下でインキュベートする。これらの条件は、選択される宿主に依存して変化し得る。しかしながら、この条件は、当該分野で周知の技術に基づいて、当業者が容易に確定し得る。

0115

iii.細菌系
細菌発現技術は、当該分野で周知である。細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼを結合し得、コード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの順方向(3’’)転写を開始させ得る、いずれものDNA配列である。プロモーターは、通常コード配列の5’末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第2のドメインもまた含み、これはRNA合成が始まる、隣接するRNAポリメラーゼ結合部位に重複し得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、それにより特定の遺伝子の転写を阻害するので、オペレーターは、負に調節された(誘導可能)転写を可能にする。構成性発現は、オペレーターのような負の調節要素の非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得る。この遺伝子アクチベータータンパク質結合配列は、存在する場合、通常、RNAポリメラーゼ結合配列の近位(5’)にある。遺伝子アクチベータータンパク質の例には、Escherichia coli(E. coli)のlacオペロンの転写の開始を助けるカタボライト活性化タンパク質CAP)[Raibaudら(1984) Annu. Rev. Genet.18:173]がある。従って、調節発現は、正または負のいずれかであり得、それにより、転写を増大または低下させる。

0116

代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、ガラクトースラクトース(lac)[Changら(1977)Nature 198:1056]およびマルトースのような糖類を代謝する酵素に由来するプロモーター配列が包含される。さらに、例として、トリプトファン(trp)[Goeddelら(1980)Nuc. AcidsRes. 8:4057;Yelvertonら(1981)Nucl. Acids Res. 9:731;米国特許第4,738,921号;欧州特許公開第036776号および第121 775号]のような生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。g−ラオタマーゼ(bla)プロモーター系[Interferon 3(I. Gresser編)中のWeissmann(1981)「インターフェロンおよび他の誤り(mistakes)のクローニング」]、バクテリオファージラムダPL[Shimatakeら(1981)Nature 292:128]およびT5[米国特許第4,689,406号]プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。

0117

さらに、天然には存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を、他の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結し得、合成ハイブリッドプロモーターを生成する[米国特許第4,551,433号]。例えば、tacプロモーターは、lacリプレッサーにより調節されるtrpプロモーターおよびlacオペロン配列の両方を含むハイブリッドtrp−lacプロモーターである[Amannら(1983)Gene 25:167;de Boerら(1983)Proc. Natl. Acad.Sci. 80:21]。さらに、細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細胞起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合するRNAポリメラーゼと結合し得、原核細胞において、いくつかの遺伝子の高い発現レベルを生じさせる。バクテリオファージT7のRNAポリメラーゼ/プロモーター系は、結合されたプロモーター系の例である[Studierら(1986)J. Mol. Biol. 189:113;Taborら(1985)Proc Natl. Acad. Sci. 82:1074]。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびE.coliオペレーターから構成され得る(欧州特許公開第267 851号)。

0118

機能しているプロモーター配列に加えて、効果的なリボソーム結合部位もまた、原核細胞での外来遺伝子の発現に有用である。E. coliでは、リボソーム結合部位は、シャインダルガルノ配列(SD)と呼ばれ、開始コドン(ATG)および開始コドンの3〜11ヌクレオチド上流に位置する3〜9ヌクレオチド長の配列を含む[Shineら(1975)Nature 254:34]。SD配列は、SD配列とE. coli 16SrRNAの3’末端との間の塩基対合により、リボソームヘのmRNAの結合を促進すると考えられる[Biological Regulation and Development:Gene Expression(R. F. Goldberger編)中のSteitzら(1979)「メッセンジャーRNA中の遺伝シグナルおよびヌクレオチド配列」]。弱いリボソーム結合部位で真核遺伝子および原核遺伝子を発現させること[Molecular Cloning:A Laboratory Manual中のSambrookら(1989)「Escherichia coli.中でのクローニングされた遺伝子の発現」]。

0119

DNA分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、DNA分子と直接連結され得、この場合N末端の最初のアミノ酸は、常にメチオニンでありこのメチオニンは、ATG開始コドンでコードされる。所望であれば、N−末端のメチオニンは、臭化シアンを用いるインビトロのインキュベーションにより、または、細菌N末端ペプチダーゼを用いるインビボまたはインビトロでのいずれかのインキュベーションによりタンパク質から切断し得る(欧州特許公開第219237)。

0120

融合タンパク質は、直接発現の代わりに用い得る。通常、内在性細菌タンパク質のN末端部分または他の安定なタンパク質ををコードするDNA配列を、異種コード配列の5’末端に融合する。発現の際に、この構築物は、2種のアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージラムダ細胞遺伝子は、外来遺伝子の5’末端に連結され、細菌中で発現され得る。得られる融合タンパク質は、好適には、プロセシング酵素(因子Xa)に対する部位を保持し、外来遺伝子からのバクテリオファージタンパク質を切断する[Nagaiら(1984)Nature309:810]。融合タンパク質はまた、lacZ[Jiaら(1987)Gene 60:197]、trpE[Allenら(1987)J. Biotechnol. 5:93;Makoffら(1989)J. Gen. Microbiol. 135:11]、およびChey[欧州特許公開第324 647号]の遺伝子由来の配列を用いても作製され得る。2つのアミノ酸配列の連結部のDNA配列は、切断部位をコードしても、しなくてもよい。他の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好適には、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素(例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ)に対する部位を保持するユビキチン領域で作られる。この方法により、天然の外来タンパク質が単離され得る[Millerら(1989)Bio/Technology 7:698]。

0121

あるいは、外来タンパク質を、細菌中で外来タンパク質を分泌させるシグナルペプチド配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を作製することにより細胞から分泌させ得る[米国特許第4,336,336号]。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を支配する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地(グラム陽性菌)中、または細胞の内膜外膜との間に位置する細胞周辺腔グラム陰性菌)中のいずれかに分泌される。好適には、シグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間でコードされた、インビボまたはインビトロで切断され得るプロセシング部位がある。

0122

適切なソグナル配列をコードするDNAは、E. coli外膜タンパク質遺伝子(ompA) [Experimental Manipulationof Gene Expression中のMasuiら(1983);Ghrayebら(1984)EMBO J. 3:2437]およびE.coliアルカリホスファターゼシグナル配列(phoA)[Okaら(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]のような、分泌された細菌タンパク質に対する遺伝子に由来する。追加の例として、種々のBacillus株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列を、B. subtilis由来の異種タンパク質を分泌するために使用し得る[Palvaら(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582;欧州特許公開第244 042号]。

0123

通常、細菌により認識される転写終結配列は、翻訳停止コドンの3’に位置する調節領域であり、そのため、プロモーターと共に、コード配列の側面に位置する。これらの配列は、DNAによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るmRNAの転写を支配する。転写終結配列は、しばしば、転写の終了を助けるステムループ構造(stem loop structures)を形成し得る約50ヌクレオチドのDNA配列を含む。例としては、E. coliのtrp遺伝子および他の生合成遺伝子のような、強力なプロモーターを有する遺伝子由来の転写終結配列が挙げられる。

0124

通常、プロモーター、シグナル配列(所望の場合)、目的のコード配列、および転写終結配列を包含する上記構成要素を組立てて、発現構築物を生成する。発現構築物は、しばしば、細菌のような宿主中に安定して維持され得る染色体外要素(例えばプラスミド)のようなレプリコン中に維持される。レプリコンは複製系を有し、そのため、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、原核生物宿主中で維持されることが可能になる。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれのプラスミドでもあり得る。高コピー数のプラスミドは、一般的に約5〜約200、通常は約10〜約150に及ぶコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好適には、少なくとも約10、より好適には少なくとも約20のプラスミドを含有する。高コピー数または低コピー数のいずれかのベクターを、宿主におけるベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、選択し得る。

0125

あるいは、発現構築物を、組込みベクターを用いて、細菌ゲノム中に組込み得る。組込みベクターは、通常、ベクターヘの組込みを可能にする細菌染色体に相同である少なくとも1つの配列を含む。組込みは、ベクター中の相同DNAと細菌染色体との間の組換えの結果生じると思われる。例えば、種々のBacillus株由来のDNAを用いて構築される組込みベクターは、Bacillus染色体中に組込む(欧州特許公開第127 328号)。組込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列を含み得る。

0126

通常、染色体外の組込み発現構築物は、選択可能なマーカーを含み得、形質転換された細菌株選別を可能にする。選択可能なマーカーは、細菌宿主中で発現され得、アンピリシン、クロラムフェニコールエリスロマイシンカナマイシンネオマイシン)、およびテトラサイクリンのような薬剤に対する抵抗性を細菌に与える遺伝子を含み得る[Daviesら(1978)Annu. Rev.Microbiol. 32:469]。選択可能なマーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路における遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。

0127

あるいは、上記構成要素のいくつかを、形質転換ベクター中に組み立て得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコン中で維持されるか、または組込みベクターに発展される選択可能なマーカー(selectable market)を含む。

0128

染色体外レプリコンまたは組込みベクターの発現および形質転換ベクターが、多数の細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターが、とりわけ以下の細菌用に開発されている:Bacillus subtilis[Palvaら(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582;欧州特許公開第036 259号および第063 953号;PCT公開WO 84/04541号]、Escherichia coli[Shimatakeら(1981)Nature 292:128;Amannら(1985)Gene 40:183;Studierら(1986)J. Mol. Biol. 189:113;欧州特許公開第036 776号、第136 829号および第136 907号]、Streptococcus cremoris[Powellら(1988)Appl. Environ. Microbiol. 54:655];Streptococcuslividans[Powellら(1988)Appl. Environ. Microbiol. 54:655]、Streptomyces lividans[米国特許第4,745,056号]。

0129

細菌宿主に外因性DNAを導入する方法は、当該分野で周知であり、通常、CaCl2処理した細菌の形質転換、または二価カチオンおよびDMSOのような他の薬剤のいずれかを包含する。DNAはまた、細菌細胞中にエレクトロポーレーションによっても導入され得る。形質転換手順は、通常、形質転換される細菌の種により異なる。例えば、以下を参照のこと:[Massonら(1989)FEMS Microbiol. Lett. 60:273;Palvaら(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582;欧州特許公開第036 259号および第063 953号;PCT公開WO 84/04541号、Bacillus]、[Millerら(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856;Wangら(1990)J. Bacteriol. 172:949、Campylobacter]、[Cohenら(1973)Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110;Dowerら(1988)NucleicAcidsRes. 16:6127;Genetic Engineering:Proceedings of the InternationalSymposium on Genetic Engineering(H.W. BoyerおよびS. Nicosia編)中のKushner(1978)「ColE1−誘導プラスミドを用いるEscherchia coliの形質転換の改良法」;Mandelら(1970)J. Mol. Biol.53:159;Taketo(1988)Biochim. Biophys. Acta 949:318;Escherichia]、[Chassyら(1987)FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus];[Fiedlerら(1988)Anal. Biochem 170:38、Pseudomonas];[Augustinら(1990)FEMS Microbiol. Lett. 66:203、Staphylococcus]、[Baranyら(1980)J. Bacteriol. 144:698; Streptococcal Genetics(J. FerrettiおよびR. Curtiss III編)中のHarlander(1987)「エレクトロポーレーションによるStreptococcus lactisの形質転換」;Perryら(1981)Infec. Immun. 32:1295;Powellら(1988)Appl. Environ. Microbiol. 54:655;Somkutiら(1987)Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412、Streptococcus]。

0130

iv.酵母発現
酵母発現系はまた、当業者には公知である。酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼを結合し、そしてコード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの下流(3’)の転写を開始し得るあらゆるDNA配列である。プロモーターは、通常、コード配列の5’末端の近くに位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位(「TATAボックス」)および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列(UAS)と呼ばれる第2ドメインを有し得、この上流アクチベーター配列は、もし存在するならば、構造遺伝子の遠方にある。UASは、調節された(誘導可能な)発現が可能である。構成性発現は、UASが存在しない場合に起こる。調節された発現は正または負のいずれかであり得、それにより転写を促進するか、または減退するかのいずれかであり得る。

0131

酵母は、活性な代謝経路を有する発酵生物であり、従って、代謝経路中の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、アルコールデヒドロゲナーゼADH)(欧州特許公開第284044号)、エノラーゼグルコキナーゼグルコース−6−リン酸イソメラーゼグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPまたはGAPDH)、ヘキソキナーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ(PyK)(欧州特許公開第329203号)が挙げられる。酵母PH05遺伝子はまた、酸性ホスファターゼをコードし、有用なプロモーター配列を提供する(Myanoharaら(1983)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 80:1)。

0132

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた酵母プロモーターとして作用する。例えば、ある酵母プロモーターのUAS配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結して、合成ハイブリッドプロモーターを創り得る。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、GAP転写活性化領域に連結したADH調節配列が挙げられる(米国特許第4,876,197号および第4,880,734号)。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、ADH2、GAL4、GAL10またはPH05遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられ、これらは、GAPまたはPyKのような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域と結合している(欧州特許公開第164556号)。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に存在するプロモーターを包含し得る。このようなプロモーターの例としては、特に、(Cohenら(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078;Henikoffら(1981)Nature 283:835;Hollenbergら(1981)Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119;Hollenbergら(1979)Plasmidsof Medical. Environmental and CommercialImportance(K>N> TimmisおよびA. Puhler編)の「酵母Saccharomyces cerevisiae中での細菌抗生物質耐性遺伝子の発現」;Mercerau−Puigalonら(1980)Gene 11:163;Panthierら(1980)Curr. Genet. 2:109;)が挙げられる。

0133

DNA分子は、酵母の細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、DNA分子と直接連結し得、その場合には、組換えタンパク質のN末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、そのメチオニンは、ATG開始コドンによりコードされる。所望ならば、N末端のメチオニンは、インビトロで臭化シアンとインキュベーションすることによりタンパク質から切り放され得る。

0134

融合タンパク質は、酵母発現系に対して、および哺乳動物、バキュロウイルスおよび細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内在性酵母タンパク質、または他の安定タンパク質のN末端部分をコードするDNA配列は、異種コード配列の5’末端に融合する。発現すると、この構築物は2つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)遺伝子は、外来遺伝子の5’末端で連結され得、そして酵母中で発現し得る。2つのアミノ酸配列との連結部でのDNA配列は、切断可能な部位をコードし得るか、またはし得ない。例えば、欧州特許公開第196056号を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素(例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ)に対する部位を好ましくは保持するユビキチン領域を用いて作られる。従って、この方法により、天然外来タンパク質が単離され得る(例えば、PCT公開公報WO88/024066号を参照のこと)。

0135

あるいは、外来タンパク質はまた、外来タンパク質を酵母中で分泌するリーダー配列フラグメントを含有する融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を創り出すことにより細胞から増殖培地内へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切り離され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を命令する疎水性アミノ酸を含有するシグナルペプチドをコードする。

0136

適切なシグナル配列をコードするDNAは、分泌された酵母タンパク質の遺伝子、例えば、酵母インベルターゼ遺伝子(欧州特許公開第012873号;JPO公告公報第62,096,086号)およびA因子遺伝子(米国特許第4,588,684号)から誘導され得る。あるいは、酵母中でも分泌する、インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーが存在する(欧州特許公開第060057号)。

0137

好ましいクラスの分泌リーダーは、「プレ」シグナル配列および「プロ」領域の両方を含む、酵母アルファ因子遺伝子のフラグメントを用いるリーダーである。用いられ得るアルファ因子フラグメントのタイプは、全長プレーロアファ因子リーダー(約83個のアミノ酸残基)、および切形型アルファ因子リーダー(通常、約25〜約50個のアミノ酸残基)を包含する(米国特許第4,546,083号および4,870,008号;欧州特許公開第324274号)。分泌を行うアルファ因子リーダーフラグメントを用いる付加的リーダーは、2番目の酵母アルファ因子からのプロ領域ではなくて、1番目の酵母のプレ配列で作られるハイブリッドアルファ因子リーダーを含有する(例えば、PCT公開公報WO 89/02463号を参照のこと)。

0138

通常、酵母により認識される転写終結配列は、翻訳停止コドンの3’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターと共にコード配列の側面に位置する。これらの配列は、DNAによりコードされる、ポリペプチドへ翻訳され得るmRNAの転写を命令する。転写終結配列、および酵母に認識される他の終結配列の例としては、解糖酵素をコードする配列などがある。

0139

通常、上記の成分は、プロモーター、リーダー(所望ならば)、関連したコード配列、および転写終結配列を含み、発現構築物へ共に入れられる。発現構築物は、しばしば、レプリコン、(例えば、酵母または細菌のような宿主内で安定した維持が可能な染色体外要素(例えば、プラスミド)内に維持される。レプリコンは、2つの複製系を有し得ることにより、例えば、発現のための酵母内で、そしてクローニングおよび増幅のための原核生物宿主内で維持され得る。そのような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、YEp24(Botsteinら(1979)Gene8:17−24)、pCl/1(Brakeら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci USA 81:4642〜4646)、およびYRp17(Stinchcombら(1982)J.Mol.Biol 158:157)が挙げられる。さらに、レプリコンは、高または低コピー数のプラスミドのいずれでもあり得る。高コピー数のプラスミドは、一般に、約5〜約200、そして通常は約10〜約150の範囲のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは、少なくとも約10、そしてさらに好ましくは少なくとも約20を有する。高または低コピー数のベクターを入れることが、宿主上のベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、選択され得る。例えば、Brakeら上述を参照のこと。

0140

あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて酵母ゲノム内へ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込ませる酵母染色体と相同な、少なくとも1つの配列を含有し、そして好ましくは、発現構築物の側面に位置する2つの相同な配列を含有する。ベクター内の相同DNAと酵母染色体との間の組換えにより、組み込みが生じると考えられる(Orr−Weaverら(1983)Methodsin Enzymol. 101:228〜245)。組み込みベクターは、ベクター内に含有される適切な相同配列を選択することにより、酵母内の特異的遺伝子座へ導かれ得る。Orr−Weaverら上述を参照のこと。1つまたはそれ以上の発現構築物が組み込み得、あるいは産生する組換えタンパク質のレベルに影響する(Rineら(1983)のProc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6750)。ベクター内に含有される染色体配列は、ベクター内の1つのセグメント(ベクター全体の組み込みが生じる)として存在し得るか、または染色体内の隣接するセグメントと相同であり、ベクター内の発現構築物の側面に位置する2つのセグメント(発現構築物のみの安定な組み込みが生じ得る)として存在し得るかのいずれかである。

0141

通常、染色体外および組み込み発現構造物は、形質転換された酵母の菌株の選択を可能にする選択可能なマーカーを含有し得る。選択可能なマーカーは、酵母宿主内で、例えば、酵母細胞内でツニカマイシンおよびG418に対して耐性をそれぞれ与える、ADE2、HIS4、LEU、TRP1、およびALG7、ならびにG418耐性遺伝子)内で発現され得る生合成遺伝子を含有し得る。さらに、適切な選択可能なマーカーはまた、金属のような毒性化合物が存在しても増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、CUP1が存在すると、酵母は銅イオンが存在しても増殖し得る(Buttら(1987)Microbiol.Rev.51:351)。

0142

あるいは、上記成分のあるものは、形質転換ベクター内に共に入れられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコン内で維持されるか、または組込みベクターヘと開発される、選択可能なマーカーを含有し得る。

0143

発現および形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換に対して開発された。例えば、発現ベクターは、特に以下の酵母に対して開発された:Candida albicans(Kurtzら(1986)Mol.Cell.Biol.6:142)、Candida maltose(Kunzeら(1985)J.Basic.Microbiol.25:141)、Hansenula polymorpha(Gleesonら(1986)J.Gen.Microbiol.132:3459;Roggenkampら(1986)Mol.Gen.Genet.202:302)、Kluyveromyces fragills(Dasら(1984)J.Bacteriol.158:1165)、Kluyveromyces lactis(De Louvencourtら(1983)J.Bacteriol.154:737;Van den Bergら(1990)Bio/Technology 8:135)、Pichia guillerimondii(Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.25:141)、Pichia pastoris(Creggら(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376;米国特許第4,837,148号および第4,929,555号)、Saccharomyces cerevisiae(Hlnnenら(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929;Itoら(1983)J.Bacteriol.153:163)、Schizosaccharomyces pombe(BeachおよびNurse(1981)Nature 300:706)、およびYarrowia lipolytica(Davidowら(1985)Curr.Genet.10:380471;Gaillardinら(1985)Curr.Genet.10:49)。

0144

外因性DNAを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野では周知であり、そして通常は、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理した無傷の酵母細胞の形質変換のいずれかを含有する。形質転換の手法は、通常、形質転換される酵母の種によりさまざまである。例えば、(Kurtzら(1986)Mol.Cell.Biol.6:142;Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.25:141;Candida);(Gleesonら(1986)J.Gen.Microbioll.132:3459;Roggenkampら(1986)Mol.Gen.Genet.202:302;Hansenula);(Dasら(1984)J.Bacteriol.158:1165;De Louvencourtら(1983)J.Bacteriol.154:1165;Van den Bergら(1990)Bio/Technology 8:135;Kluyveromyces);(Creggら(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376;Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.25:141;米国特許第4,837,148号および4,929,555号,Pichia);(Hinnenら(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929;Itoら(1983)J.Bacteriol.153:163;Saccharomyces);(BeachおよびNurse(1981)Nature300:706;Schizosaccharomyces);(Davidowら(1985)Curr.Genet.10:39;Gaillardinら(1985)Curr.Genet.10:49;Yarrowia)を参照、のこと。

0145

実施例1−無毒化LT
制限酵素SmaIおよびEcoRIで消化することにより、LTの遺伝子のフラグメントをプラスミドEWD299(Dallas W.S.、Gill D.M.およびFalkow S.,1979,J.Bacteriol.,139,850−858)から抽出し、そしてDNAの一本鎖を生成するのに適切なベクターBluescript KS内で再クローン化した(SambrookJ.,Fritsch E.およびManiatis,T.の「Molecular Cloning」Cold Spring Harbor)。

0146

このようにして得られたクローンによりBW313細胞を形質転換し、そして1μg/mlのウリジンを添加したルリアブロス(Luria Broth)からなる培養培地中で、その細胞を14時間増殖させた。

0147

一連の合成オリゴヌクレオチド(下記の表1に示す)は、突然変異、または天然塩基の代わりに所望の塩基、および、天然塩基と同一である、同様の突然変異の10塩基上流および10塩基下流の配列を含有し、まず最初に化学的に合成され、次いでその1.5pmolを37℃で、キナーゼ5単位を用いてリン酸化した。

0148

100mMのEDTA溶液で反応を停止させた後、70℃で5分間加熱し、そして中で約1時間ゆっくりと冷却することにより、そのオリゴヌクレオチドをLT遺伝子を含有する一本鎖にアニールした。

0149

その段階で、この冷溶液(25μl)に遊離ヌクレオチド、酵素DNAリガーゼおよび酵素DNAポリメラーゼからなる溶液を加えて、最終容量が100μlになるようにした。

0150

このようにして得られた溶液を、氷中で5分間、周囲温度で5分間、そして37℃で2時間保った。

0151

通常の技術に従って、適切なE.coliの細胞を反応混合物で形質転換し(Sambrook J.、Fritsch E.およびManiatis T.の「Molecular Cloning」Cold Spring Harbor)、そして得られたクローンの配列決定により部位特異的変異誘発を検討した。

0152

種々の突然変異体を含有するSmaI−EcoRIフラグメントを、プラスミドEWD299中の元のSmaI−EcoRI挿入片に対して置換した。

0153

次いで、突然変異したトキシンをコードする株を37℃で12時間、10mlのルリアブロス中で増殖させた。

0154

培養物を遠心分離し、そして細胞を含有する沈澱物を、25%ショ糖およびpH8の50mM Tris緩衝液を含有する溶液300ml中に再懸濁させ、そしてこの混合物を周囲温度で1時間、1mg/mlのポリミキシン(polymixin)B溶液で処理した。

0155

周辺細胞質の上清液中にトキソイドが存在することが、ウェスタンプロットより実証され、そしてその毒性を、Y1細胞内の形態変化の誘発、または誘発の欠如により評価した(表1を参照のこと)。

0156

Y1細胞は、CTまたはLTを含有する溶液で処理すると、さらに著しく丸くなる副腎腫上皮細胞である(Yasamure Y.、BuonassisiV.およびSato G.の「動物細胞培養における分化機能クローン解析」Cancer Res.,1966,26,529−535)。CTおよびLTの毒性は、この形態トランジションと相関している。周辺細胞質の上清液を、F10培地、ウマ血清1.5%、できるだけ低濃度グルタミンおよびゲンタマイシンの溶液で希釈し、そしてY1細胞(250000個細胞/ml)を、CO2雰囲気下37℃で48時間、上記で得られた溶液でインキュベートする。細胞の形態を評価する。

0157

すべての場合において、完全トキソイドの正確な集合体により、およびトキソイドと野生型LTに対する抗体との交差反応により、免疫原性が示された。

0158

結果を以下の表Iに示す。

0159

この表(および以下の表II)では、毒性の記号は以下を意味する:

0160

ID=000004HE=095 WI=112 LX=0490 LY=1000
セリンの2種の突然変異体(Ser−114−Glu:477−GGAGGTGAAGCGTTAGG−494およびSer−114−Lys:477−GGAGGTTAAAGCGTTAGG−494)もまた実質的に毒性の減少を示した。

0161

ID=000005HE=070 WI=114 LX=0480 LY=0300
(NAとは、「集合しない」ことを意味し、すなわち、ホロトキシン(holotoxin)AB5は全く形成されない。)
実施例2−無毒化CT
トキシンCTの遺伝子の場合における手法は、上記と同様である。

0162

CTの遺伝子を含有するフラグメントを、プラスミドpCT322からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術により増幅させた。CT遺伝子の代わりとなり、かつ同等の遺伝子源(source)はプラスミドpJM17である(Pearsonら、PNAS USA,79,(1982),2976−2980)。

0163

以下の2種の合成プライマーを用いた:
1)GGCAGATTCTAGACCCCTGATGAAATAAA
2)TGAAGTTTGGCGAAGCTTCTTAATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGCAT
それぞれ、XbaI部位および人工的に作ったHindIII部位(下線で示す)を含有する。

0164

得られた増幅フラグメント、XbaI−HindIIIは1074塩基対の長さを有し、2つのサブユニットであるAおよびBのコドンを含有するが、Aサブユニットのリーダーペプチドをコードする配列を含有しない。このフラグメントをBluescriptKSベクター内で再クローン化させ、そしてLTに対して上記の手法に従って処理することにより、部位特異的変異誘発を起こす。

0165

ID=000006HE=070 WI=106 LX=0520 LY=1750
以下の突然変異体もまた、毒性をなくすことが証明された:107−Asn(TACAGTCCTAACCCAGATGAA)、Glu−110−Ser(TCATCCAGATTCGCAAGAAGT)、Glu−112−Ala(CAGATGAACAAGCTGTTTCTG)およびSer−114−Glu(CAAGAAGTTGAAGCTTTAGGT)。

0166

本発明は実施例のみによって上記のように説明され、そして詳細な改変が、本発明の範囲および意図内で行われ得ることが理解される。

図面の簡単な説明

0167

図1図1は、以下の野生型サブユニットAのアミノ酸配列を示す:
i)コレラトキシン(CT−Mekalanosら、前掲)ii)ヒトに認められるE.coli株由来の非耐熱性トキシン(LT1−1−Yamamotoら、前掲)iii)ブタに認められるE.coli株由来の非耐熱性トキシン(LT1−Spicerら、前掲)、およびiv)染色体源由来の非耐熱性トキシン(LT−1−Pickettら、前掲)シグナル配列は示していない。図1では、従来の1文字アミノ酸コードが使用される。記号「.」は、アミノ酸がないことを示し、印刷上のスペースで、比較が容易となるように配列を整列させた。記号「−」は、CT中の対応アミノ酸と一致するLT1およびLT2配列中のアミノ酸を示す。各列に対する番号は、その列の最初のアミノ酸のアミノ酸番号である。図1では、本発明の変異の位置には、下線を付けて示す。
図2図2aおよび2bは、LT1およびCTのAサブユニットのアミノ酸およびDNA配列の比較である。
図2図2aおよび2bは、LT1およびCTのAサブユニットのアミノ酸およびDNA配列の比較である。
図3図3は、LT−A遺伝子を有する、プラスミドEWD299(Dallasら)の制限マップである。

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