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図面 (11)

課題

大腸菌の場合,病原性因子プラスミドの遺伝子中に存在するので、感染後の疾患の診断治療法には,プラスミドの発見,特性の決定が必要であり,その特性配列を提供する。

解決手段

特定のヌクレオチド配列を有する細菌性プラスミドもしくはDNA配列,及びその分析および診断における使用を提供する。

概要

背景

プラスミドは、染色体外の主として環状で自己複製する小さなDNA分子であり、ほとんど全ての細菌あるいはまたいくつかの真核生物並びにミトコンドリアの中に存在している。プラスミドの大きさは、約1.5〜300kbの間で変動する。

細菌性プラスミドは、通常、環状で共有結合して閉じており、かつ超らせんになっている。これらは、多くの場合、抗生物質又は重金属抵抗性の遺伝子、非典型的基質の代謝のための遺伝子又は一連種特異的特徴、例えば代謝特性又は病原性因子のための遺伝子を有している。多くのプラスミドは、1つの細胞から別の細胞へ転写することもできる。細菌の病原性は、今日の見解によればプラスミドの性質によっても部分的に左右されるので、プラスミド−DNAの性質の解明に関して、重要性がより一層大きなものになっている。

腸内細菌科については、14の主属と6の別種が含まれるが、これらは、種々の性質を発達させることができることは公知である。代表的な例は、大腸菌(Escherichia)、サルモネラ菌(Salmonella)及び肺炎桿菌(Klebsiella)である。大腸菌(E.coli)は、バクテリア遺伝学の古典的対象である。ようやく、大腸菌E.coliの種々の病原性因子の発見特性決定により、前記の種類の菌株が、最近広がった「EHEC」として公知の変種の場合のように無毒性から高度な毒性にまで達する部分的に極端に異なるヒトもしくは動物病原性を示すことについての一般に満足のいく説明を見出すことが可能になった。それで、腸管外並びに腸内の大腸菌E.coli株については、部分的に十分に特性決定されている一連の病原性因子が既に記載されている。血清グループO6:K5の病原性大腸菌E.coli株については、例えば前記の血清グループの非病原性の代表の場合には明らかに生じない溶血及びp−フィンブリ癒着(P-Fimbrienadheasine)のような病原性が見出された。

ビルレンス遺伝子は、腸内細菌の場合には、通常大きなプラスミド(約60kb)上に見出される。あるいはまた、小さな、いわゆる潜在プラスミドを有する腸内細菌も存在しているが、その機能は、これまでにまだ確定できてはいなかった。

概要

大腸菌の場合,病原性因子がプラスミドの遺伝子中に存在するので、感染後の疾患の診断治療法には,プラスミドの発見,特性の決定が必要であり,その特性配列を提供する。

特定のヌクレオチド配列を有する細菌性プラスミドもしくはDNA配列,及びその分析および診断における使用を提供する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

列番号2で表されるDNA配列を有するプラスミド

請求項2

配列番号2で表されるヌクレオチド列を有するか又はこれからなるDNA配列。

請求項3

微生物学的分析及び/又は診断における、請求項1または2記載のプラスミド又はDNA配列の使用。

請求項4

発現ベクターとしての、請求項1または2記載のプラスミド又はDNA配列の使用。

技術分野

0001

本発明は、細菌性プラスミドに関するものである。

背景技術

0002

プラスミドは、染色体外の主として環状で自己複製する小さなDNA分子であり、ほとんど全ての細菌あるいはまたいくつかの真核生物並びにミトコンドリアの中に存在している。プラスミドの大きさは、約1.5〜300kbの間で変動する。

0003

細菌性プラスミドは、通常、環状で共有結合して閉じており、かつ超らせんになっている。これらは、多くの場合、抗生物質又は重金属抵抗性の遺伝子、非典型的基質の代謝のための遺伝子又は一連種特異的特徴、例えば代謝特性又は病原性因子のための遺伝子を有している。多くのプラスミドは、1つの細胞から別の細胞へ転写することもできる。細菌の病原性は、今日の見解によればプラスミドの性質によっても部分的に左右されるので、プラスミド−DNAの性質の解明に関して、重要性がより一層大きなものになっている。

0004

腸内細菌科については、14の主属と6の別種が含まれるが、これらは、種々の性質を発達させることができることは公知である。代表的な例は、大腸菌(Escherichia)、サルモネラ菌(Salmonella)及び肺炎桿菌(Klebsiella)である。大腸菌(E.coli)は、バクテリア遺伝学の古典的対象である。ようやく、大腸菌E.coliの種々の病原性因子の発見特性決定により、前記の種類の菌株が、最近広がった「EHEC」として公知の変種の場合のように無毒性から高度な毒性にまで達する部分的に極端に異なるヒトもしくは動物病原性を示すことについての一般に満足のいく説明を見出すことが可能になった。それで、腸管外並びに腸内の大腸菌E.coli株については、部分的に十分に特性決定されている一連の病原性因子が既に記載されている。血清グループO6:K5の病原性大腸菌E.coli株については、例えば前記の血清グループの非病原性の代表の場合には明らかに生じない溶血及びp−フィンブリ癒着(P-Fimbrienadheasine)のような病原性が見出された。

0005

ビルレンス遺伝子は、腸内細菌の場合には、通常大きなプラスミド(約60kb)上に見出される。あるいはまた、小さな、いわゆる潜在プラスミドを有する腸内細菌も存在しているが、その機能は、これまでにまだ確定できてはいなかった。

発明が解決しようとする課題

0006

大腸菌の場合には、病原性因子が少なくとも部分的にプラスミドの遺伝子中にも存在していることは公知であるので、従って例えば腸内細菌による感染後の疾患の際の診断及び治療法を改善するために腸内細菌、殊に大腸菌E.coliの場合のプラスミドの発見及び特性決定のための他の試験に対する要求がある。プラスミドもしくはその細菌担体又は相応する合成DNAは、微生物学的分析又は診断の際、医学的には治療又は予防の際並びに栄養生理学的又は共生目的に使用することができる。その上更に、プラスミド、詳細には殊に大腸菌E.coliのプラスミドは、遺伝子工学における公知の発現ベクターであるので、前記の理由からも、この種のプラスミドの性質の訂正された知識は重要である。

課題を解決するための手段

0007

更に、大腸菌E.coli株DSM6601を用いる分子遺伝学的試験が実施された。この菌株によって得られるDNA配列は、DNA配列分析データバンクプログラムを用いて取出され、既に存在する別の細菌のDNA配列と比較されている。

0008

前記菌株DSM6601は、pMUT1もしくはpMUT2と呼称された3177(配列番号1)もしくは5552bp(配列番号2)の大きさの2種の小さなプラスミドを有している。

0009

より小さい方のプラスミドpMUT1のDNAは、酵素HindIIIを用いる制限切断後に、ベクターpUC18中の線状フラグメントとしてサブクローニングされ、引き続き、DNA配列が決定された。これは、添付図1から明らかである。こうして得られたDNA配列(配列番号1)を、GenEMBL−データバンクを用いて相同性を比較したが、前記の対比の結果は、図2から明らかである。

0010

前記の比較のために、HindIII−切断部位を1位と定めた。200〜800bp位で、プラスミドpMUT1のDNAは、別の腸内細菌のプラスミドの種々の重複出発地点(重複起点)、特にプラスミドNTP1、NTP16及びCloDF13に対する有意相同性を示している950。bp位の領域では、もともとサルモネラチフィムリウム(Salmonella typhimurium)から単離しておいたプラスミドNTP16に対する570bpの大きさの均一性が開始している。前記の相同性には、プラスミドNTP16の可動性にとって必要であるmobA-Gen、伝達起点(oriT)が含まれている。その上更に、1790〜1920bp位から、遺伝子parA及びcerに対する有意相同性が見出されたが、これは、細胞分裂の際の安定性及び連続的な情報伝達及びプラスミド分子分布にとって重要である。その他のDNA領域については、有意相同性を確認することはできなかった。

0011

その上更に、プラスミドpMUT1のDNA配列を、アミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取り枠の存在を分析した。6つの異なる読み取り枠の可能性を試験した。143、62、56、49及び48のアミノ酸の大きさを有する全部で5つの開いた読み取り枠を見出すことができた。分析図は、図3中に図示してある。

0012

より大きなプラスミドpMUT2のDNA(配列番号2)を、制限酵素SphIを用いる線状化後に同様にベクターpUC18中にサブクローニングし、引き続き、完全に順序付けした。DNA配列は、図4から明らかである。こうして得られたDNA配列を、遺伝子EMBL-データバンクプログラムを用いて、既に公知のDNA配列に対する相同性について試験した。結果は、図5中に図示してある。プラスミドpMUT2のDNAは、890〜1660bp位中で大腸菌E.coliの種々のColE1−プラスミドのレプリコン領域に対する有意相同性を示している。ColE1プラスミドに対するもう1つの有意相同性は、3800〜4950bp位の領域に存在している。この場合、ColE1−プラスミドの可動領域に対する相同性が重要である。3770〜4980bp位の領域中には、パスツレラヘモリチカ株A1のプラスミドに対する相同性が見出された。前記のプラスミド上には、パスツレラ属の場合に抗菌性耐性蛋白質についてコードする遺伝子が存在している。しかしながら、相同性は、遺伝子間領域に亘って延在しているので、プラスミドの可動性にとって必要である配列が重要であることもある。

0013

別の腸内細菌プラスミドに対する有意相同性を有する2つの領域を確認した。この場合、プラスミドの可動性にとって必要である複製領域の起点及びmob−領域が重要である。pMUT2については、その他のDNA断片にとって、有機相同性を確認することができなかった。

0014

また、プラスミドpMUT2のDNA配列を、引き続きアミノ酸配列中に書き換え、開いた読み取り枠の存在を分析した。結果は、図3中に同様に図示してある。327、318、264、76及び63のアミノ酸の大きさでのアミノ酸配列を有する5つの開いた読み取り枠が見出された。

0015

これまでに知られていないプラスミドpMUT1及びpMUT2以外に、これらの組合せ物も、これまで、E.coli菌株又は別の腸内細菌中に見出されていない。

0016

プラスミドの存在は、菌株DSM6601の代謝及び医薬及び/又は栄養生理学もしくは共生に利用可能な性質に関連していることもある。

0017

プラスミドの試験は、腸内細菌、殊に大腸菌属のより詳細な決定及び分析を可能にする。その上更に、前記プラスミドは、遺伝子工学にとって懸念されない発現ベクターとして提供されている。

0018

以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明する:
例 1:
プラスミド単離
プラスミド−DNAの単離を、Birnboim他(Birnboim, A. C.及びDoly, J.(1979) Nucl. Acid Res. 7:1513〜1523 A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA)に基づいて行った。

0019

LB−培地3mlに、細菌コロニー接種し、かつ37℃で一晩振盪させる。この培養物エッペンドルフ容器中で遠心分離し、培地残分をピペットで除去する。細胞沈殿物を、溶液I(グルコース50mM;EDTA10mM、pH8;トリス−HCl25mM、pH8)100μlで再懸濁させる。室温で5分間の培養後に、溶液II(NaOH0.2N;SDS1%)200μlを添加し、清澄になるまで混合し、かつエッペンドルフ容器を更に5分間の上に放置する。次に、溶液III(Na−アセテート0.2M、pH4.8)150μlを添加し、染色体DNAをフレーク上に沈澱するまで振盪し、かつ該沈殿物を再度5分間氷の上に放置する。沈澱した染色体DNA及び細胞残分を遠心分離器中で5分間ペレット化し、かつプラスミド−DNAを有する上清を、新たな容器の中に移送する。プラスミド−DNAの精製のために、フェノール50μl及びクロロホルムイソアミルアルコール(24:1)150μlを添加し、かつ短時間の振盪後に2分間遠心分離する。水相を新たな容器の中にピペットで入れる。プラスミド−DNAを、2用量の氷冷却したエタノールで沈澱させ、かつ10分間遠心分離する。ペレットを、70%のエタノールで洗浄し、かつ高速真空(Speedvac)中で乾燥させる。プラスミド−DNAをH2Obindest20ml中で再懸濁させ、かつ−20℃で保存する。

0020

例 2:
DNA−配列化
DNA−配列化を、F. Sanger他(Sanger, F.、Nicklen, S. 及びCoulson, A.R.(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74.:5463〜5467のDNA sequencing with chain terminating inhibitors)に基づいて行った。

0021

DNA配列化を、Firma Pharmacia LKB社のT7−配列化キットを用いて行った。

0022

変性工程のために、プラスミド−DNA8μl(1.5〜2μg)を2NのNaOH2μlと混合し、短時間遠心分離し、10分間室温で培養する。DNAを、3MのNa−アセテート3μl、pH4.8並びにH2Obidest7μl及び氷冷却したエタノールabsolut60μlを用いて−70℃で15分間沈澱させる。沈澱したDNAを10分間遠心分離し、70%のエタノールで洗浄し、かつ乾燥させる。

0023

アニーリング反応のために、変性したDNAをH2Obidest10μl中で懸濁させ、かつアニーリング緩衝液2μl及びプライマー2μl(40ng)と混合する。沈殿物を37℃で20分間培養すると、鋳型DNAへのプライマーの結合を行うことができる。反応バッチを室温で10分間冷却し、次に標識化反応のために直ちに使用するか又は−20℃で凍結させる。標識化反応のために、標識混合物(Labelling-Mix)3μl、[α−P32]dATP1μl及びT7−ポリメラーゼ(T7−ポリメラーゼを酵素希釈緩衝液で1:5希釈)2μlを、アニーリング反応バッチ中にピペットで入れ、かつ短時間の混合後に、室温で5分間培養する。この間に、停止反応のために既に用意した配列剤混合物(2.5μlを有する各容器1個を「略して」'G'−Mix、'A'−Mix、'T'−Mix及び'C'−Mix)を37℃で予備昇温させる。標識化反応の経過後に、それぞれその4μlを4種の配列化剤混合物に添加し、かつピペットで短時間混合する。停止反応物を37℃で5分間培養する。停止反応の終了のために、それぞれ5μlの停止溶液を添加する。こうして各バッチを95℃で培養器の中に移送し、2分間変性させ、次に氷の上に置いた。反応物それぞれ2.5μlを、配列化ゲル尿素25.2g、H2Obidest22ml、10×TBE6ml、ポリアクリルアミド(40%)10ml、過硫酸アンモニウム(16mg/ml)2ml、TEMED60μl]の上に、'G'、'A'、'T'、'C'の順序で載せる。電気泳動を40ワット及び1500ボルトで4.5時間行う。
配列表
(1)一般的情報
(i)出願人:
(A)名称:フアルマ−ツエトラーレ ゲゼルシヤフトミツト ベシユレンクテハフツング
(B):レルフエルトシユトラーセ 20
(C)市:ヘルデツケ
(E)国:ドイツ連邦共和国
(F)郵便コード:D−58313
(ii)発明の名称:細菌性プラスミド
(iii)配列の数:2
(iv)コンピューター読み取り可能形:
(A)媒体型:フロッピー登録商標ディスク
(B)コンピューター:IBM PCコンパチブル
(C)オペレーティングステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウエアパテントインリリース♯1.0,バージョン♯1.30(EPA)
(v)現在の出願のデータ:
出願番号:PCT/EP98/01720
(2) SEQID NO:1に関する情報:
(i)配列特徴
(A)長さ:3177塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:環状
(ii)配列の種類:Genomic DNA
(iii)ハイポテイカル:No
(iv)アンチセンス:No
(vi)起源
(A)生物名:エシェリキアコリ
(B)株名:DSM6601
(C)個体:pMUT1
(viii)ゲノム中の位置:
(C)単位:3177bp
(xi)配列:SEQ ID NO:1:

0024

0025

0026

0027

0028

0029

(2) SEQID NO:2に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:5552塩基対
(B)型:ヌクレオチド
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:環状
(ii)配列の種類:Genomic DNA
(iii)ハイポセテイカル:No
(iv)アンチセンス:No
(vi)起源:
(A)生物名:エシェリキア・コリ
(B)株名:DSM6601
(C)個体:pMUT2
(viii)ゲノム中の位置:
(C)単位:5552bp
(xi)配列:SEQ ID NO:2:

0030

0031

0032

0033

0034

0035

0036

0037

図面の簡単な説明

0038

図1A DSM6601菌株の約3kbの大きさのプラスミドpMUT1のヌクレオチド配列の1部を示す図。
図1図1Aの続きの配列図。
図1図1Bの続きの配列図。
図2プラスミドpMUT1の制限地図を示す図。
図32種類のプラスミドpMUT1(a)及びpMUT2(b)のために予め結合した開いた読みとり枠の図。
図4A DSM6601菌株の約5kbの大きさのプラスミドpMUT2のヌクレオチド配列の1部を示す図。
図4図4Aの続きの配列図。
図4図4Bの続きの配列図。
図4図4Cの続きの配列図。
図4図4Dの続きの配列図。
図5プラスミドpMUT2の制限地図を示す図。

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