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課題

相乗効果的な抗菌性組成物を製造すること。

解決手段

ラクトペルオキシダーゼ系(LPS)等のペルオキシダーゼ系を、抗菌性脂肪酸又は脂肪酸誘導体と組み合わせる。これらの組成物は、表面に与えるのに有用であるとして開示されており、また微生物耐性のある食品又は化粧品等製品も開示されている。組成物の好ましい形体は、ラクトペルオキシダーゼ、モノラウリン又はドデシル硫酸ナトリウム過酸化物源、及びチオシアネートイオンを含有する。

概要

背景

概要

相乗効果的な抗菌性組成物を製造すること。

ラクトペルオキシダーゼ系(LPS)等のペルオキシダーゼ系を、抗菌性脂肪酸又は脂肪酸誘導体と組み合わせる。これらの組成物は、表面に与えるのに有用であるとして開示されており、また微生物耐性のある食品又は化粧品等製品も開示されている。組成物の好ましい形体は、ラクトペルオキシダーゼ、モノラウリン又はドデシル硫酸ナトリウム過酸化物源、及びチオシアネートイオンを含有する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
4件

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請求項1

下記成分からなる混合物を形成することからなる耐微生物組成物調製方法。(a)下記からなるペルオキシダーゼ系(PS):(i) ペルオキシダーゼ(ii)過酸化物源、及び(iii)抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子、及び、(b)少なくとも1種の脂肪酸又は脂肪酸の誘導体ここで、該脂肪酸又はその誘導体が該PSと相互作用して高い抗菌効果を生じさせるのに効果的な量で存在している。

請求項2

該ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼである、請求項1に記載の方法。

請求項3

過酸化物過酸化水素である、請求項1又は請求項2に記載の方法。

請求項4

該補助因子がチオシアネート又はヨウ化物から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

該補助因子がチオシアネートである、請求項4に記載の方法。

請求項6

該脂肪酸が、抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

該抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体が、該組成物中に存在する全脂質の少なくとも5重量%の量で存在する、請求項6に記載の方法。

請求項8

該成分(b)がC8、C10、C12、C14及びC16の脂肪酸又はそれらの誘導体、若しくはそれらの混合物から選択される抗菌性脂肪酸であるか又はそれを含有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

該成分(b)が抗菌性の脂肪酸エステル又はそれらの塩であるか又はそれを含有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

該成分(b)が、モノラウリン(1−モノドデカノイル−rac−グリセロール)又はその塩、ドデシル硫酸ナトリウムであるか又はそれを含有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

該成分(b)がモノラウリンである、請求項10に記載の方法。

請求項12

該組成物が、1又はそれ以上の該成分を、それ以外の成分を既に含有している予め形成された混合物に添加することによって形成される、前項いずれか一項に記載の方法。

請求項13

該予め形成された混合物が、食品化粧品又はヘルスケア製品である、請求項12に記載の方法。

請求項14

該食品が、ダイエット補助食品栄養補助食品乳製品食肉製品又は魚肉製品である、請求項13に記載の方法。

請求項15

該食品が動物飼料である、請求項13に記載の方法。

請求項16

形成される際、該組成物が混合物中に該成分を含有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項17

請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって調製される、耐微生物組成物。

請求項18

下記から選択される少なくとも2成分を含有する、耐微生物組成物の調製に使用するのに適する予備組成物。(i)ペルオキシダーゼ(ii)過酸化物源(iii)抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子、及び、(iv) 少なくとも1種の抗菌性脂肪酸又は抗菌性のそれらの脂肪酸誘導体ここで、該ペルオキシダーゼ及び過酸化物源の両方が存在する場合には、別々に保存される。

請求項19

該ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼである、請求項18に記載の予備組成物。

請求項20

別々の容器に、ペルオキシダーゼ及び少なくとも1種の抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体を含有する、耐微生物組成物の調製に使用するのに適する予備パック

請求項21

該ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼである、請求項20に記載の予備パック。

請求項22

該パックが更に、過酸化物源及び/又は抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子を含有する、請求項20又は請求項21に記載の予備パック。

請求項23

ペルオキシダーゼ、抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子、及び少なくとも1種の抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体を含有する抗菌性組成物であって、該脂肪酸又はそれらの誘導体が、過酸化物の存在下で、該ペルオキシダーゼ及び該補助因子と相乗効果的に相互作用して、高い抗菌効果を生じさせるのに効果的な量で存在することを特徴とする、前記抗菌性組成物。

請求項24

更に過酸化物源を含有する、請求項23に記載の抗菌性組成物。

請求項25

該ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼである、請求項23又は請求項24に記載の抗菌性組成物。

請求項26

更なる抗菌剤又はキレート剤、若しくはその両方を含有する、請求項23〜25のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。

請求項27

該更なる抗菌剤が、フェノール有機酸バクテリオシン、これらの誘導体及びこれらの混合物、又は、乳汁から抽出されるか乳汁中に見出される抗菌成分若しくは成分の混合物から選択される、請求項26に記載の抗菌性組成物。

請求項28

該キレート剤がEDTAである、請求項26に記載の抗菌性組成物。

請求項29

該抗菌性脂肪酸又は誘導体が、C8、C10、C12、C14及びC16の脂肪酸又はそれらの誘導体、若しくはそれらの混合物から選択される、請求項23〜28のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。

請求項30

該抗菌性脂肪酸又は誘導体が、抗菌性の脂肪酸エステル又はそれらの塩である、請求項23〜28のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。

請求項31

該抗菌性脂肪酸又は誘導体が、モノラウリン(1−モノドデカノイル−rac−グリセロール)又はそれらの塩であるか又はそれを含有する、請求項23〜28のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。

請求項32

該抗菌性脂肪酸又は誘導体が、モノラウリンの塩として、ドデシル硫酸ナトリウムであるか又はそれを含有する、請求項31に記載の抗菌性組成物。

請求項33

該抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体が、該組成物中に存在している全脂質の少なくとも5重量%の量で存在している、請求項23〜32のいずれか一項に記載の抗菌性組成物。

請求項34

下記成分を含有する製品であって、微成物の増殖に耐性があることを特徴とする前記製品。:(i)ペルオキシダーゼ(ii)過酸化物源(iii)抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子、及び、(iv) 少なくとも1種の抗菌性脂肪酸又は抗菌性のそれらの誘導体

請求項35

該ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼである、請求項34に記載の製品。

請求項36

グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方の増殖に対して耐性がある、請求項34又は請求項35に記載の製品。

請求項37

該抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体が、該組成物中に存在している全脂質の少なくとも5重量%の量で存在している、請求項34〜36のいずれか一項に記載の製品。

請求項38

食品である、請求項項34〜37のいずれか一項に記載の製品。

請求項39

ダイエット補助食品、栄養補助食品、乳製品、食肉製品、魚肉製品又は動物飼料である、請求項38に記載の食品。

請求項40

化粧品である、請求項34〜37のいずれか一項に記載の製品。

請求項41

ヘルスケア製品である、請求項34〜37のいずれか一項に記載の製品。

請求項42

請求項23〜33のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を、効果的な量該表面に使用する工程を含有する、表面の処理方法

請求項43

該表面が、食品の調製及び/又は食品の取り扱いに使用される表面である、請求項42に記載の方法。

請求項44

請求項23〜33のいずれか一項に記載の抗菌性組成物を、効果的な量該製品に添加する工程を含有する、製品に耐微生物性を与える目的のための製品の処理方法。

0001

(技術分野)
本発明は、耐微生物組成物及びそれらの調製に関する。更にはその様な組成物使用方法及びその様な組成物の添加又は使用により微生物に対する耐性が付与される製品に関する。
背景技術

0002

ラクトペルオキシダーゼLP)は、乳汁及び粘液質分泌物唾液及び腸分泌物等)における先天的非免疫防衛系の一部である酵素である。LPは、様々な自然に発生する補助因子と共に、抗菌活性を表すラクトペルオキシダーゼ系(LPS)を形成する。

0003

LPSは、LP(牛乳から抽出される)、過酸化物源及び補助因子(一般的にはチオシアネート)を混和している。多くの状況では、グルコースオキシダーゼ微生物源からの)及びグルコースが、過酸化水素源を与えるために混和される。酵素系の使用は、それによって過酸化物送達を確実に持続させるので、好ましいことが多い。しかしながら、これは好気性条件を必要とするので、嫌気性条件では過酸化物の直接源が必要とされることもある。

0004

LPで触媒作用を及ぼされ、補助因子がチオシアネートである反応によって、抗菌活性を示すチオシアネートの一時的な中間酸化生成物が生じる。LPは、水の存在下でチオシアネートイオン酸化に触媒作用を及ぼすために過酸化物を使用して、ヒポチオシアイトイオン(OSCN-)を生じさせる。次いで、ヒポチオシアナイトは、細菌に壊滅的な効果を与えて、細菌膜スルフィドリル基と反応すると考えられる。チオシアネートの大部分は、この過程再生させられる。

0005

LPSは、グラム陰性菌(例えば、エシェリヒアコリ(E. Coli)、イェルシニアエンテルコリティカ(Yersinia entercolitica)、シュードモナス・spp(Pseudomonas spp)、サルモネラ・SPP(Slamonella spp)、Campylobacter spp)に対して殺菌性であり、グラム陽性菌リステリアモノトゲン(Listeria monocytogenes)、スタフィロコッカスアウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・spp(Sterptococcus spp))に対して静菌性であると見なされている。LPSはまた、或る状況では抗ウイルス活性を有することが示唆されている。

0006

LPSへの焦点はラクトペルオキシダーゼを使用することに置かれるが、しかしながらそれは或る環境下では、他のペルオキシダーゼ、特にはGRAS認定されたものを使用し得ることが認識されるであろう。LPSは1つの例にすぎないが、この様な系は一般的に、ペルオキシダーゼ系(PS)と呼ばれている。

0007

幾つかの脂肪酸抗菌効果も文献でよく報告されている。最も活性があるものは、中程度の鎖の脂肪酸であるラウリン酸ドデカン酸)及びミリスチン酸テトラデカン酸)である。脂肪酸は、グラム陽性菌に対して特に効果的であると見なされており、脂肪酸誘導体であるモノラウリン(1−モノドデカノイル−rac−グリセロール)が一般的には、最も活性があるものであると見なされている。加えて、抗ウイルス活性(包膜されているウイルスに対して)は、ドデシル硫酸ナトリウム等の脂肪酸誘導体に対して主張されてきた。

0008

モノラウリンは、乳化剤としてGRAS認定されていて、大部分が野菜ショートニングに使用されており、アイスクリーム及び焼き製品に或る程度使用される。

0009

モノラウリンは、食物系において抗菌性として使用するためのラウリシジン(Lauricidin)FEとして市場売買されている。しかしながら、必要とされる濃度及び処理される食品官能性能に対して与える効果のために、抗菌性であるとは広くは受け入れられていない。

0010

本出願人は、PS(LPS等の)及び脂肪酸/モノラウリン等の脂肪酸誘導体を組み合わせて使用することができ、組み合わせた際に、各成分の知られている特性に基づいて予期され得る抗菌効果をしのぐことを、ここで見出した。それ故に、本発明は、抗菌効果又は相乗効果的な相互作用が高いというこの予期せぬ知見に広く基づいている。
(発明の開示)

0011

驚いたことに、第一の見地によると、本発明は、下記成分からなる混合物を形成することからなる耐微生物組成物の調製方法を提供する。:
(a)下記からなるペルオキシダーゼ系(PS):
(i) ペルオキシダーゼ
(ii)過酸化物源、及び
(iii)抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子、及び、
(b)少なくとも1種の脂肪酸又は脂肪酸の誘導体
ここで、該脂肪酸又はその誘導体が該PSと相互作用して高い抗菌効果を生じさせるのに効果的な量で存在している。

0012

用語「高い抗菌効果」は、個々の成分の知られている特性から予期されるよりも、少なくとも1種のタイプの微生物に対してより高い殺菌性である抗菌効果を意味する。

0013

明細書中で使用される通り、用語「微生物」は、細菌、ウイルス、カビ又は原生動物源等の、細菌性病原体、効果を及ぼさない粒子及び損傷有機体を意味する。

0014

好ましくは、該脂肪酸は、抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体である。

0015

好ましくは、ペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼである。

0016

都合のよいことには、過酸化物は、過酸化水素である。

0017

好ましくは、補助因子は、チオシアネート又はヨウ化物から選択され、最も好ましくはチオシアネートである。

0018

好ましくは、成分(b)は、C8、C10、C12、C14及びC16の脂肪酸又はそれらの誘導体から選択される抗菌性脂肪酸であるか又はそれを含有する。

0019

より好ましくは、成分(b)は、抗菌性の脂肪酸エステル又はそれらの塩であるか又はそれを含有する。

0020

更により好ましくは、成分(b)は、モノラウリン(1−モノドデカノイル−rac−グリセロール)又はその塩、ドデシル硫酸ナトリウムであるか又はそれを含有する。

0021

現在最も好ましい実施態様においては、成分(b)はモノラウリンである。

0022

都合のよいことには、抗菌性脂肪酸又は脂肪酸の誘導体は、組成物中に存在する全脂質の少なくとも5重量%の量で存在する。

0023

好ましくは、該組成物は、1又はそれ以上の該成分を、それ以外の成分を既に含有している予め形成された混合物に添加することによって形成される。

0024

都合のよいことには、予め形成された混合物は、食品、化粧品又はヘルスケア製品である。

0025

食品は、ダイエット補助食品又は栄養補助食品(nutraceutical)であり得る。またそれは、乳製品食肉製品又は魚肉製品であってもよい。

0026

食品はまた、動物飼料であってもよく、その最も簡単な形体は水であり得る。

0027

あるいは、該組成物が、形成された際は、混合物中の該成分からなる。

0028

更なる見地において、本発明は、下記から選択される少なくとも2成分を含有する耐微生物組成物の調製に使用するのに適する予備組成物を提供する。:
(i)ペルオキシダーゼ
(ii)過酸化物源
(iii)抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子、及び、
(iv) 少なくとも1種の抗菌性脂肪酸又は抗菌性のそれらの脂肪酸誘導体
ここで、該ペルオキシダーゼ及び過酸化物源の両方が存在する場合には、別々に保存される。

0029

好ましくは、ペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼである。

0030

更に、更なる見地において、本発明は、別々の容器に、ペルオキシダーゼ及び少なくとも1種の抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体を含有する、耐微生物組成物の調製に使用するのに適する予備パックを提供する。

0031

好ましくは、ペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼである。

0032

好ましくは、該パックは更に、過酸化物源及び/又は抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子を含有する。供給される場合、過酸化物源及び/又は該補助因子は、別々の容器に存在する。

0033

更に、更なる実施態様において、本発明は、ペルオキシダーゼ、抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子、及び少なくとも1種の抗菌性脂肪酸又は抗菌性の脂肪酸誘導体を含有し、該脂肪酸又はそれらの誘導体が、過酸化物の存在下で、該ペルオキシダーゼ及び該補助因子と相乗効果的に相互作用して、高い抗菌効果を生じさせるのに効果的な量で存在することを特徴とする抗菌性組成物を提供する。

0034

好ましくは、ペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼである。

0035

好ましくは、該抗菌性組成物は更に、過酸化物源を含有する。

0036

組成物はまた、更なる抗菌剤又はキレート剤を含有する。

0037

好ましくは、更なる抗菌剤が、フェノール有機酸バクテリオシン、これらの誘導体及びこれらの混合物、又は、ラクトフェリン等の乳汁から抽出されるか乳汁中に見出される抗菌成分若しくは成分の混合物から選択される。

0038

好ましくは、キレート剤はEDTAである。

0039

更に、更なる実施態様において、本発明は、上記に定義される方法によって調製される耐微生物製品を提供する。

0040

更に、更なる見地において、本発明は下記成分を含有し、微成物の増殖に耐性がある製品を提供する。:
(i)ペルオキシダーゼ
(ii)過酸化物源
(iii)抗菌性酸化生成物を生じさせ得る補助因子、及び、
(iv) 少なくとも1種の抗菌性脂肪酸又は抗菌性のそれらの誘導体

0041

好ましくは、ペルオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼである。

0042

好ましくは、該製品は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方の増殖に対して耐性がある。

0043

1つの形態において、該製品は、ダイエット補助食品、栄養補助食品(nutraceutical)、乳製品、食肉製品、魚肉製品又は動物飼料等の食品である。

0044

他の形態において、該製品は化粧品である。

0045

更に更なる形態において、該製品はヘルスケア製品である。

0046

更に、更なる見地において、本発明は、上記に定義される通りの抗菌性組成物を、効果的な量該表面に使用する工程を含有する、表面の処理方法を提供する。

0047

1つの実施態様において、該表面は、食品の調製及び/又は食品の取り扱いに使用される表面である。

0048

最後の見地において、本発明は、上記に定義される通りの抗菌性組成物を、効果的な量該製品に添加する工程を含有する、製品に耐微生物性を与える目的のための製品の処理方法を提供する。
(発明を実施するための最良の形態)

0049

上記に定義される通り、本発明は広いが、それはまた、下記の詳細な説明が実施例を提供する実施態様を含むと認識されるであろう。更には、添付の図面を参照することによって、本発明はよりよく理解されるであろう。

0050

上記に定義される通り広いので、本発明の第一の焦点は、耐微生物組成物に置く。この様な組成物は、PSと抗菌性脂肪酸又は脂肪酸の誘導体成分との相乗効果的な組み合わせによって、抗菌効果を発揮する。

0051

本出願人によってなされた驚くべき知見は、PSの抗菌効力が抗菌性の脂肪酸成分の添加によって顕著に補われ得るということである。抗菌効力の向上は、性質が高められるか又は相乗効果的である。この相乗効果は特に、エシェリヒア・コリ(E.Coli、大腸菌)等のグラム陰性微生物に対して明らかである。

0052

PSは、3成分を必要とする。これらは順に、ペルオキシダーゼ、過酸化物源及び補助因子である。補助因子は、中間抗菌性酸化生成物を生じさせるものである。適する補助因子の例としては、チオシアネート及びハロゲン化物(特にはヨウ化物)が挙げられる。

0053

ペルオキシダーゼそれ自身は、商業的に入手可能な物質のいずれかであり得る。GRAS認定されたペルオキシダーゼが好ましく、ラクトペルオキシダーゼが特に好ましい。

0054

過酸化物は、直接添加されてもよいし(例えば過酸化水素等)、適当な基質の酵素による消化の産物であってもよい。例えば、グルコースオキシダーゼとグルコースの組み合わせによって、過酸化水素源が与えられ得る。過炭酸ナトリウムベースとする系も使用され得る。

0055

PSの成分は、当該技術における標準的な量で与えられるであろう。例えば、ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼであり、過酸化物源がグルコース/グルコースオキシダーゼであり、その補助因子がチオシアネートである場合、各成分は下記の量(mg/リットル)で液状媒体中に包含され得る。
LP6.85
グルコースオキシダーゼ 3.17
グルコース 31.7
SCN- 29.0

0056

固体基質の場合は、同じ成分が例えば下記量(mg/kg)で包含され得る。LP205
グルコースオキシダーゼ9.5
グルコース31.7
SCN- 200

0057

脂肪酸又は脂肪酸誘導体成分は一般的に、C8〜C16の脂肪酸又は誘導体であるであろう。しかしながら、C10、C12及びC14脂肪酸が一般的には、最も抗菌性であると見なされており、それ故に脂肪酸成分が脂肪酸のままの形体で添加されるべきである場合には、これらが好ましい。

0058

抗菌性誘導体の使用には、脂肪酸のエステル又はそれらの塩の使用も含まれる。出願人が有用であると見出した1つの特定のエステルは、モノラウリン(Lauricidin FE)である。ドデシル硫酸ナトリウム塩もまた、適する誘導体として使用され得る。

0059

脂肪酸成分は純粋な形態である必要がないことも強調されるべきである。有用な脂肪酸/脂肪酸誘導体は、脂質が、必須の割合の抗菌性成分が確実に存在するように処理される、乳脂肪又はココナッツオイル抽出物等の混合物中に含まれ得る。

0060

PSとの相乗効果を引き起こす脂肪酸成分のために、出願人は、脂肪酸/脂肪酸誘導体の相乗効果的に効果的な量が存在しなければならないことを見出した。この量は、抗菌性脂肪酸が標準的な牛乳(脂質は主にトリグリセライドの形体である)中に存在している量よりも多く、PSと脂肪酸成分が乳汁に注がれると、顕著に高く効果的な抗菌性の結果が達成されるという出願人の知見に反映される。

0061

特に、相乗効果的な抗菌効果が脂質を含有する組成物中で、生じさせられ得る場合、抗菌性脂肪酸/脂肪酸誘導体が組成物中の全脂質の少なくとも5重量%の量で存在しなければならないということを、出願人は決定した。
(実施例)

0062

本発明は、下記に限定される訳ではないが、実験例を参照して、ここで説明されるであろう。
セクション
物質
菌株培地及び化学物質

0063

リステリア・モノシトゲン(L. monocytogenes)株L45及びスタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus、黄色ブドウ球菌)株R37をニュージーランド食肉工業研究協会(Meat Industries Research Institute of New Zealand)の株培養収集のRoger Cook博士から入手し、エシェリヒア・コリO157:57株NCTC 12900を、オタゴ大学の微生物学部の株培養収集のHeather Brooks博士から入手した。全ての株の貯蔵培養を、−70℃のスキムミルク中で貯蔵し、必要になった時に、Plate Count Agar(PCA)(米国、ミシガン州デトロイトにあるDifco Laboratories製)又は血液寒天(BA)(人間全体の血液(NZ、Dunedin、Dunedin Public Hospital)の5%で補われたColumbia Agar Base(英国、ペーズリーの、Life Tech 社製、GIBCOBRL))で、継代培養した。通常に使用される株を、平板培養物として維持し、2週間毎に継代培養した。全ての市販の培地は、製造仕様書に従って調製された。モノラウリン(1−モノラウロイル−rac−グリセロール、米国、MO、セントルイスシグマ化学社製)を、10mlのエタノール中に1gを溶解させることによって調製し、1mlの体積に分け、必要になるまで−20℃で貯蔵した。全てのLPS成分を濾過滅菌した。グルコース(シグマ社製)を、MilliQ水100ml中にグルコース(シグマ社製)18.016gを溶解させることによって調製し、3mlの体積に分け、必要になるまで室温(RT)で貯蔵した。グルコースオキシダーゼ(GOX)及びグルコースオキシダーゼはシグマ社製であり、ラクトペルオキシダーゼはニュージーランドのMorrinsvilleにあるTatua Biologics社製であり、チオシアネートナトリウム又はカリウムは、フランスのMontolieuにあるBio SeraeSA社製であった。
方法
試験装置

0064

増殖実験を、Todd-Hewitt肉汁(THB)を8ml含有する100x15mmのネジでしめたキャップの付いたガラス試験管内で行った。必要に応じて、モノラウリンをそれぞれの管に添加して、その後121℃で15分間管をオートクレーブで処理した。必要に応じて、各成分を、細胞接種原、16LPX原料、グルコース原料、チオシアネート原料及びグルコースオキシダーゼ原料の順番で、オートクレーブで処理されている管に添加した。全てのケースにおいて、管は、適当な菌株をTHBで一晩培養した物を0.05%及び1.0%(v/v)で接種された。管を37℃で48時間培養し、適当な間隔で、分光光度計(米国、Milton Roy社製、Spectronic 20D+)を使用してそれらのOD600nmを読んだ。それぞれの菌株の生存数を、それぞれの株の5日間夜通しによる培養物生理食塩水中で希釈することによって、測定し、螺旋形培養装置(米国、シンシナティ州にある、Spiral Systems社製)を使用することによって、PCAでそれぞれの希釈液培養基で培養した。

0065

培養溶液中のLPSの各成分の濃度(mg/リットル)は、以下の通りであった。:ラクトペルオキシダーゼでは6.85、グルコースオキシダーゼでは3.17、グルコースでは31.7及びチオシアネートでは29.0
結果
試験装置

0066

実験に使用されたそれぞれの試験株に対して一晩培養された肉汁の生存数は、エシェリヒア・コリO157:57株NCTC 12900(αE. Coli”)、スタフィロコッカス・アウレウス株R37(αS. aureus”)及びリステリア・モノシトゲン株L45(αL. monocytogenes”)では、それぞれ3×109、8×108及び3×109cfu/mlであった。

0067

モノラウリン50〜150ppmの存在下で増殖させられたスタフィロコッカス・アウレウスの1%接種原で示される結果によって説明される通り、両方のグラム陽性株に対するモノラウリンの抑制の程度は、使用されたモノラウリンの濃度に比例すると思われる(図1)。モノラウリン及びLPSの両方で、観察された抑制の程度は、その系に負わせた細菌の量に逆比例した。即ち、初めの接種原が多ければ多い程、観察される抑制の程度が低くなる。モノラウリン及びLPSの両方では、リステリア・モノシトゲンは、抑制に対して最も感受性が高い株であり、エシェリヒア・コリは、抑制に対して最も感受性が低い株であった。
エシェリヒア・コリに対する効力

0068

モノラウリンは、管が0.05%又は1%のいずれかで接種された場合には、エシェリヒア・コリの増殖を抑制しなかった。管が0.05%で接種された場合にはLPSは僅かにエシェリヒア・コリの増殖を抑制したが、1%で接種された場合には抑制しなかった。エシェリヒア・コリの増殖は、モノラウリン及びLPSの組み合わせによって強く抑制された(図2)。
スタフィロコッカス・アウレウスに対する効力

0069

0.05%で接種に接種されたスタフィロコッカス・アウレウスの増殖(図3)は、100及び150ppmの濃度のモノラウリンによって完全に抑制された。これらの培養物もまた、LPSによって強く抑制され、培養の定常期の時間が、LPSを含有しない培養物より、約20時間延びた。モノラウリン及びLPSの両方を含有する管では増殖が観察されなかった。1.0%で接種に接種されたスタフィロコッカス・アウレウスの増殖(図4)は、500ppmの濃度のモノラウリンによって完全に抑制されたが、100ppmの濃度のモノラウリンでは部分的しか抑制されなかった。100ppmのモノラウリンの培養物での1%接種原の場合では、定常期は、対照の管でよりも約10時間延び、これらの培養物は対照の管の密度と比較され得る密度には到達しなかった。これらの培養物は、LPSによって強く抑制され、定常期が、LPSを含有しない管のものより、約13時間延びた。顕著には、モノラウリン及びLPSの両方を含有する管で見られた増殖は、48時間の最後の時点で僅かにであるが、統計的には顕著に濁りが増加するのが示された、100ppmのモノラウリン+LPSの系でのみだった。
リステリア・モノシトゲンに対する効力

0070

リステリア・モノシトゲンは、100又は500ppmのいずれか一方でモノラウリンを含有する全ての系によって、全ての接種原密度で完全に抑制された(図5及び6)。LPS培養物での1.0%接種原の場合では、定常期は、抑制されない対照の管でのものよりも約22時間延びた。LPS培養物での0.05%接種原の場合では、定常期は、抑制されない対照の管でのものよりも約27時間延び、これらの培養物は対照の管の密度と比較され得る密度には到達しなかった。
議論

0071

この研究に使用された細菌の3種類の株は、食品が運ぶ病原体及びモノラウリンに対するそれらの報告されている感受性の範囲等のそれらの状態のために選択された。この研究に使用されたエシェリヒア・コリO157:H7株の増殖が、500ppmまでの濃度のモノラウリンによっては影響を受けないことは、Kabara等が1000ppmより高いモノラウリン濃度によってエシェリヒア・コリの増殖が影響を及ぼされ得ないことを報告していたので(Kabara等、1977年)、驚かなかった。対比によって、リステリア・モノシトゲンの増殖は、比較的中程度の濃度のモノラウリンによって抑制され得ることが報告されたが、僅か5ppmの低い濃度では、肉汁培養物における遅滞期の増殖を8時間まで遅らせられることが報告されていた(Wang等、1977年)。この研究に使用されたリステリア・モノシトゲンの株の増殖は、10ppmの濃度のモノラウリンによっては影響を受けなかったが、100及び500ppmの濃度のモノラウリンによって完全に抑制された。スタフィロコッカス・アウレウスは、約200ppmの濃度で抑制する程感受性があると報告されていたので(Kabara等、1977年)、モノラウリンによる増殖の抑制に対する中程度の感受性を有する細菌であり、結果は、この研究で使用された株の感受性と上手く比較される。

0072

LPSは、エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス及びリステリア・モノシトゲン等を含む広い範囲の細菌の増殖を抑制することが報告されている(Wolfson等、1993年)。残念ながら、これらの研究に使用された、成分(グルコース、H2O2、GOX、LPX及びSCN-)濃度、培養培地、及び培養温度が広い範囲であることによって、本発明の研究で直接比較することが難しくなる。一般的に考えられる通り、この研究で見られるLPS単独に対する株の相対的な感受性の程度は、他の人(Gaya等、1991年; Kamau等、1990年;Bjork等、1975年;Siragu等、1989年)によって報告されたものと矛盾がないことは明らかである。エシェリヒア・コリに対するLPSの作用の殺菌性に係わらず、この研究に使用されたO157:H7株の増殖の抑制の程度は、グラム陽性種に対して見られる抑制よりもかなり低かった。それは、エシェリヒア・コリ DH5α、即ち通常の実験用の株(Simmonds及びKennedy、未発表のデータ)に対して見られるものよりもかなり低かった。LPSに対するエシェリヒア・コリ株の感受性における広い変化は、他の人によって注目されており、Grieve等が、3.6〜7.3対数単位の範囲の異なる毒素原性株では、生存数が6時間減少することが報告されている(Grieve等、1992年)。

0073

上記に報告された結果は、モノラウリンとLPSの組み合わせが保存系として使用されるのに大きな可能性があるという、強い証拠を与えるものである。単独で使用されたモノラウリンによってはエシェリヒア・コリO157:H7は抑制されず、我々はいずれの濃度で使用されたモノラウリンに対しても、エシェリヒア・コリ株の報告されている感受性の程度に気が付かない。この様に、エシェリヒア・コリ O157:H7に対するモノラウリンとLPSの組み合わせの相乗効果は(LPS単独から予期される抑制よりもかなり過剰の抑制)、予期されなかった。対比によって、スタフィロコッカス・アウレウスに対するモノラウリンとLPSの組み合わせの抑制効果は、単独で使用されたそれぞれの剤によるその顕著な抑制を基準として驚く程ではなかった。しかしながら、1つの予期せぬ結果は、組み合わされた系で得られるスタフィロコッカス・アウレウスの抑制の程度であった。食品の保存剤としてモノラウリンを使用することによる1つの問題は常に、望まれるレベルの抑制を得るために必要とされるモノラウリンの量が、製造を不経済にし得るか、又は食物における望ましくない官能特性テクスチャー、味)を発現させてしまい得る様な量であるということである。モノラウリンとLPSの組み合わせが、モノラウリン単独を使用することによるのと等しい抑制効果を得るのに必要される濃度よりも大幅に低いモノラウリンの濃度で効果的であるであろうということを、上記に報告された結果は示している。
セクションB

0074

このセクションは更に、本発明の見地を説明する。

0075

スタフィロコッカス・アウレウスS. aure R37又はエシェリヒア・コリO157:H7(−vt)のいずれか一方を用いて接種された肉汁培養系(Todd- Hewitt Broth、THB)を、異なる脂質成分を評価するためのスクリーニング系として使用した。株を37℃で一晩THB中で培養し、各管に分けた。初期装填量は、スタフィロコッカス・アウレウス R37又はエシェリヒア・コリの両方に対して1×105/mlであった。

0076

ラクトペルオキシダーゼ系、LPSの各成分は、ラクトペルオキシダーゼ20mg/リットル(c3000ユニット活性/リットル)、グルコースオキシダーゼ(c300ユニット活性/l)、チオシアネートイオン290mg/l(NaSCN 496mg/l)及びグルコース12000mg/lの濃度で存在していた。次いで、分光光度計(Spectronic 20D+)及び付属のデータ自記計測器を使用して、48時間に渡って定期的に肉汁の吸収(600nmでの)における増加を測定することによって、有機体の増殖をたどった。

0077

表1に要約されている実験に証拠付けられる通り、幾つかの脂質成分(脂肪酸及びモノエステル)が、ラクトペルオキシダーゼと組み合わされた際に抗菌効果を示す。モノラウリンが、スタフィロコッカス・アウレウスに対して、最も効果的な脂質成分であり、この単純な系においてLPSが含まれるか否かがまさに有効であった。表1のデータは、相乗効果はグラム陽性であるスタフィロコッカス・アウレウス及びグラム陰性であるエシェリヒア・コリに対して明らかであるが、その効果はスタフィロコッカス・アウレウスでの方が大きいことを示している。モノパルミトレイン酸エステルの効果は、エシェリヒア・コリ 単独又はLPSの存在下に対するモノラウリンの効果と非常に似ていた。しかしながら、ラウリル硫酸ナトリウムは、LPSが存在していようがいまいが、エシェリヒア・コリ に対して非常に効果的であった。

0078

表1:脂質成分とラクトペルオキシダーゼ系の組み合わせによる、肉汁培養における細菌増殖の抑制

0079

データは、細菌の増殖が48時間後に約50%又は100%まで抑制される際の脂質成分の濃度として表されている。例えば、100/250は、増殖が100ppmで約50%抑制され、脂質成分250ppmで完全に抑制されたことを意味する。*は1000ppmまでのいずれの濃度でも有機体は100%抑制されなかったことを示している。

0080

表2及び3は、乳汁及びミンスがスタフィロコッカス・アウレウスR37を用いて接種された実験の結果を示すものである。LPS/モノラウリンの組み合わせの相乗効果は明らかである。
表2:乳汁における、モノラウリン(1000ppm)+ラクトペルオキシダーゼ(ラクトペルオキシダーゼ20mg/リットルを有するLPS)系の評価(37℃、スタフィロコッカス・アウレウス;cfu/ml)
表3:ミンスにおける、モノラウリン(1000ppm)+ラクトペルオキシダーゼ(ラクトペルオキシダーゼ200mg/kgを有するLPS)系の評価(37℃、スタフィロコッカス・アウレウス R37;cfu/g)

0081

表4及び5は、E. coli O157:H7(グラム陰性有機体)又はスタフィロコッカス・アウレウスR37(グラム陽性有機体)を用いて、乳汁が接種された実験の結果を示すものである。
表4:グラム陰性有機体に対する乳汁における、モノラウリン+ラクトペルオキシダーゼ系の評価(12℃、エシェリヒア・コリO157:H7;cfu/ml)
GOXに対するLPXの比(酵素活性のユニット)は、9:1であり、チオシアネートイオン及びグルコースのそれぞれは12mg/l存在していた。
表5:グラム陽性有機体に対する乳汁における、モノラウリン+ラクトペルオキシダーゼ系の評価(37℃、スタフィロコッカス・アウレウス R37;cfu/ml;表4と同じ成分濃度

0082

再度、LPS/モノラウリンの組み合わせの効力が明らかである。

0083

表6は、或る環境下で、乳汁自身の存在が実際にモノラウリン処理の効力に抑制効果を有することを示す、2つの実験の結果を示すものである。即ち、モノラウリンの抗菌効果は、乳汁に天然に存在する通常の量の脂質(一般的にはトリグリセライドの形体)によって悪影響が及ぼされる。同様に、モノラウリンとLPSとの組み合わせの効力もまた、培養培地に存在する乳汁(及びそれ故に脂質)の濃度によって影響を及ぼされる(表7)。しかしながら、(競合する)脂質の含有量の効果は、モノラウリン単独よりも、モノラウリン+LPSの組み合わせで低く、換言すると、相乗効果が大きい。
表6:37℃でのTodd-Hewitt Broth(THB)/乳汁中のスタフィロコッカス・アウレウスR37(cfu/ml)に対する、モノラウリン系の効力における、乳汁(即ち脂質)の異なる量の比較
表7:37℃でのTHB/乳汁中のスタフィロコッカス・アウレウス R37(cfu/ml)に対する、モノラウリン+ラクトペルオキシダーゼ系(LPX5ppmを有する)の効力における、乳汁(即ち脂質)の異なる量の比較

0084

表8及び9に報告される実験結果は更に、LPS/モノラウリンの組み合わせの相乗効果の効力を示す。
表8:37℃での乳汁中のグラム陽性菌であるスタフィロコッカス・アウレウス

0085

R37に対する、LPS又はモノラウリン系単独及びモノラウリン+LPSの効力の効果の比較による、各成分の相乗効果
表9:37℃でのグラム陽性菌であるスタフィロコッカス・アウレウスR37に対する、モノラウリン系単独及びモノラウリン+LPSの効力における、乳汁(即ち脂質)の異なる量の効果の比較による、各成分の相乗効果

0086

表8及び9に要約される通り、LPS単独はスタフィロコッカス・アウレウス

0087

R37に対して抑制効果を持たなかった。1000ppmのモノラウリン単独は、表8に報告される通り小さい効果(1〜2log)を有していたが、表9に報告される通り、500ppmの低めの量では効果を持たなかった。しかしながら、モノラウリン及びLPSの組み合わせの相乗効果(モノラウリン単独又はLPS単独と比較される)は、明らかにはっきりと判る。相乗効果の程度は、脂質の存在及び量の両方によって影響を受ける。脂質の存在下で、組み合わされた組成物の抗菌効力は、モノラウリン単独と比較して非常に高い。しかしながら、抗菌性組成物の効力は、存在する脂質の割合によって影響される。

0088

表10は、THB中のスタフィロコッカス・アウレウスにおけるモノラウリン単独の濃度の効果を評価した実験の結果を示すものである。この実験において、僅か25ppm又は50ppmの濃度しか、スタフィロコッカス・アウレウスの集団における顕著な効果を有するために必要とされなかった。50ppmのモノラウリンによる処理の効力は、表6において500ppmで達成された効力と等しかった。表10に報告される実験は、脂肪のない培地で行われたので、比較することによりモノラウリンの効力における他の脂質の存在の効果を妥協するという更なる証拠が与えられる。
表10:37℃でのTHB中のスタフィロコッカス・アウレウス R37(cfu/ml)の集団におけるモノラウリンの異なる量の比較

0089

表6〜10を参照すると、100%の乳汁からなる溶液は、約3%の乳脂肪を含有する。500ppmの濃度のモノラウリンは、100ml当たり0.05グラム(0.05%)を表す。上記から、選択された抗菌性脂質成分の或るしきい濃度(全脂質の割合として表される)は、組成物全体の顕著な抗菌効果を確かにするために多くなければならないことは明らかである。

0090

表11は、存在する実際の量及び全脂質の割合としての両方で、添加された抗菌性脂質(このケースではモノラウリン)の量によって分類された適切なデータの要約を提供するものである。効果は可変性であり、モノラウリン単独では、5又は6時間で、微生物数の減少が1log〜4logに渡り、モノラウリン+LPSでは減少が3log〜8logに渡るので、表11のデータは、3.2%のモノラウリンが限界であることを示している。
表11:表2、8、9及び10のデータの要約:存在するモノラウリンの量及びモノラウリンとして存在する全脂質中の割合によって影響される通りの、抗菌性組成物の各成分の効力及び各成分の相乗効果の証拠

0091

それ故に、選択された抗菌性脂質成分の濃度は、相乗効果的な抗菌効果を含めるためには、存在する全脂質の5%以上でなければならないというのが、出願人の見解である。

0092

それ故に、牛乳のケースでは、抗菌特性を有する遊離の脂肪酸(又はそれらの誘導体)は、実質的でかつ堅実な抗菌効果を達成するために、抗菌性組成物に変えられるべき乳汁に存在する全脂質の5%以上を占めなければならない。この様な組成物は、グラム陽性有機体(スタフィロコッカス・アウレウスで例示される通りの)及びグラム陰性有機体(エシェリヒア・コリによって例示される通りの、表5参照)の両方に対して効力があるであろう。

0093

この様な抗菌性脂質の量は、本発明によって選択された抗菌性脂質又は誘導体の添加でのみ達成され得る。

0094

効果的な抗菌性組成物を確実にする系の全ての成分の存在の重要性が、表12に要約される実験で試験された。

0095

下記成分からなる単純な培地を調製した。:

0096

バクトリプトンを有するリン酸緩衝化生食塩水(pH7)及び酵母菌抽出物PBS/T/Y):0.2MのNaH2PO4 195ml、0.2MのNa
2HPO4 305ml、及びNaCl 8.994g、バクトトリプトン10g、酵母菌抽出物5gを、MilliQ水を用いて1リットルにし、121℃で15分間ネジでしめたキャップの付いた管でオートクレーブ処理した。使用するまで管を培養温度(37℃)に保持した。

0097

2種類の株スタフィロコッカス・アウレウス又はエシェリヒア・コリO157:H7(−vt)を、実験で使用し(表1の実験に関して)、下記基本のモノラウリン及びLPSの組み合わせが、感受性を測定するために、モノラウリン+LPSに対する有機体の滴定に基づき2種類の株のために選択された。:スタフィロコッカス・アウレウス(LPS中、LPX(ラクトペルオキシダーゼ)100mg/リットル及びモノラウリン20mg/リットル)及びエシェリヒア・コリ(LPS中LPX100mg/リットル及びモノラウリン50mg/リットル)。グルコースオキシダーゼ(GOX)に対するLPXの比は、9:1であり、チオシアネート及びグルコースは、12mg/リットルで混合された。
表12:抗菌系の効力を確実にする際の個々の成分の重要性抑制の程度を、有機体の対数増殖期開始時間(培養37℃の時間)及び安定期での時間(最大限の吸収)によって決められる。

0098

再度、出願人の研究手法の効力が示される。
産業上の利用可能性

0099

LPS及びモノラウリンとの間の相乗効果(PS及び抗菌性脂肪酸/脂肪酸誘導体との間の相互作用を例示する)に関する出願人の知見は、多くの用途を有する。これらの中で、この相乗効果的な抗菌効果が、雑菌混入又は損傷しやすい製品において再生され得るということが重要である。この様な製品としては、食品、化粧品及びヘルスケア製品が挙げられる。

0100

食品用途において、脂肪酸成分がモノラウリンである場合、本発明は特に利点を有する。これは、モノラウリンがGRAS認定され、乳化剤としてある食品中に既に含有されているという事実を反映する。

0101

各成分が含有され得る食品は、損傷を受ける全ての食料品、並びにダイエット補助食品及び栄養補助食品(nutraceutical)である。本発明は、乳製品(例えばヨーグルト等)、魚肉製品(特に)及び食肉製品(ひき肉及び生肉の両方を含む)、並びに動物の飼料に特に適用される。しかしながら、「飼料」は、最も一般的な意味で意図され、限定されるものではないが、牛、ブタヤギ及び(飼鳥類等の)の畜産動物エサを与える水に含まれ得るということを理解すべきである。

0102

この様な製品に、個々の成分を、一緒に添加してもよいし、独立して添加してもよい。或る例において、製品が1又はそれ以上の成分を適当量本質的に含有し得る場合、残りの成分のみを添加する必要がある。

0103

各成分はまた、製品の部分として混合物を形成するために添加されてもよいし(例えば乳製品等)、製品を少なくとも部分的にコーティングする様に塗工されてもよい(例えば貝等)。

0104

各成分が個々に添加され得る場合、異なる容器に少なくともペルオキシダーゼ及び脂肪酸/脂肪酸誘導体を有する予備パックが、提供され得る。

0105

本発明はまた、一般的に使用するために、抗菌性組成物の形成にも適用され得る。この様な組成物は、適当な量で4種類全ての成分を含有するであろう。次いで、組成物は、抗菌性の集団を無くせない場合にでも少なくとも減少させるのを確実にするために、表面(例えば、食料品の調製又は取り扱い、若しくはヘルスケアに使用される表面)を処理するために使用され得る。

0106

本発明の抗菌性組成物はまた、他の剤の作用を補うために使用され得る。この様な環境において、更なる剤を、別々に使用してもよいし、又はより通常的には、本発明の成分との混合物の一部として使用してもよい。

0107

望ましい場合、含有され得る他の任意成分としては、更なる抗菌剤、キレート剤、酵素及び栄養のある栄養食品(nutraceutical)成分が挙げられる。特には、組成物は、下記のいずれかも含有し得る。

0108

−EDTA等のキレート剤

0109

−tert−ブチルヒドロキシアニソール(BHA)のメチルエチルプロピルブチル又はヘプチルエステルを含む、パラ−ヒドロキシ安息香酸パラベン)のエステル等の、フェノール

0110

ギ酸酢酸プロピオン酸乳酸ソルビン酸安息香酸クエン酸又はこれらの酸のいずれかの誘導体等の、有機酸(保存剤として認識されている)

0111

ナイシン等の殺菌剤

0112

−リゾチーム

0113

−乳汁の抽出物

0114

上記詳細な説明は、例のみによって提供されるものであること、及び本発明は法律上有効な特許請求の範囲の概念によってのみ限定されるので、それらに修正及び/又は変更を、本発明の概念から逸脱しない限り行い得るということが、当業者には理解されるであろう。
参考文献
Gaya, P.、M. Medina及びM Nunez著、1991年、冷蔵温度での原乳におけるリステリア・モノシトゲンの挙動へのラクトペルオキシダーゼ系の影響(Effect of the lactoperoxidase system on Listeria monocytogenes behaviour in raw milk at refrigeration temperatures.)、Appl. Environ. Microbiol、第57巻:3355〜3360頁
Kamau, D. N.、S. Doores及びK. M. Pruitt著、1990年、ラクトペルオキシダーゼ系によるリステリアモノシトゲン及びスタフィロコッカス・アウレウスの高い熱破壊(Enhanced thermal destruction of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus by the lactoperoxidase system.)、Appl. Environ. Microbiol、第56巻:2711〜2716頁
Bjorck, L.、C. Rosen、V. Marshall及びB. Reiter著、1975年、シュードモナス及びその他のグラム陰性菌に対する乳汁におけるラクトペルオキシダーゼ系の抗菌活性(Antibacterial activity of the lactoperoxidase system in milk against pseudomonadsandothergram-negative bacteria.)、Appl. Microbiol、第30巻:199〜204頁
Kabara, J. J.、R. Vrable及びM. S. F. Lie ken Jie著、1977年、抗菌性脂質:天然及び合成脂肪酸モノグリセライド(Antimicrobial lipids: Natural and synthetic fatty acids monoglycerides.)、Lipids、第12巻:753〜759頁
Wang, L. L.及びE. A. Johnson著、1997年、食物におけるモノグリセライドによるリステリア・モノシトゲンの制御(Control of Listeria monocytogenes by monoglycerides in foods.)、J. Food Prot.、第60巻:131〜138頁Wolfson, L. M.及びS. S. Summer著、1993年、ラクトペルオキシダーゼ系の抗菌活性:レビュー(Antibacterial activity of the lactoperoxidase system:A review.)、 J. Food Prot.、第56巻:887〜892頁
Siragusa, G. R.及びM. G. Johnson著、1989年、ラクトペルオキシダーゼ−チオシアネート−H2O2抗菌系によるリステリア・モノシトゲンの増殖の抑制(Inhibition of Listeria monocytogenes growth by the lactoperoxidase-thiocyanate- H2O2 antimicrobial system.)、Appl. Environ. Microbiol、第55巻:2802〜2805頁
Grieve, P. A.、D. D. Dionysius及びA. C. Vos.著、1992年、エシェリヒア・コリの毒素原生株に対するラクトペルオキシダーゼ系のインビトロ抗菌活性(In vitro antibacterial activity of the lactoperoxidase system towards enterotoxigenic strains of Escherichia coli.)、J. Vet. Med.、B39巻:537〜545頁

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