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技術 血清コレステロールを調節するための組成物及び方法。

出願人 ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
発明者 サブロト・カテルジー
出願日 2000年2月23日 (20年10ヶ月経過) 出願番号 2000-601138
公開日 2002年11月5日 (18年1ヶ月経過) 公開番号 2002-537407
状態 未査定
技術分野 医薬品製剤 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 生物学的材料の調査,分析 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬
主要キーワード 例示的実施 多重被覆 ソルトレーク ミリ単位 込み器具 非共有化学結合 受入者 反応性炭素
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図面 (20)

課題

本発明は、血清コレステロールを調節するための組成物及び方法に関する。

解決手段

対象哺乳類において血清コレステロールを調節するための組成物及び方法を提供する。1つの態様では、発明は、少なくとも1つの同定された低密度リポタンパク質(LDL)受容体及び少なくとも1つの同定された血清コレステロール阻害剤包含する新規抗脂血剤を特徴とする。詳細には、薬剤は、同定された、血清コレステロール阻害剤に結合する、同定されたスフィンゴ脂質もしくはそのタンパク質改変を包含し、更に、哺乳類、特にヒト患者において血清コレステロールのレベルを安定化する又は下げることが可能な医薬剤を同定するために設計されるアッセイを含む、LDL受容体、特にSREBP−1の成熟を調節することが可能な抗脂血剤を同定する方法を提供する。

概要

背景

概要

本発明は、血清コレステロールを調節するための組成物及び方法に関する。

対象哺乳類において血清コレステロールを調節するための組成物及び方法を提供する。1つの態様では、発明は、少なくとも1つの同定された低密度リポタンパク質(LDL)受容体及び少なくとも1つの同定された血清コレステロール阻害剤包含する新規抗脂血剤を特徴とする。詳細には、薬剤は、同定された、血清コレステロール阻害剤に結合する、同定されたスフィンゴ脂質もしくはそのタンパク質改変を包含し、更に、哺乳類、特にヒト患者において血清コレステロールのレベルを安定化する又は下げることが可能な医薬剤を同定するために設計されるアッセイを含む、LDL受容体、特にSREBP−1の成熟を調節することが可能な抗脂血剤を同定する方法を提供する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

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請求項1

ステロール調節要素結合タンパク質(SREBP−1)の少なくとも1つの有効成分の治療上有効な量を含む抗脂血剤

請求項2

治療上有効な量が、好適な対照哺乳類に比べて、哺乳類における血清コレステロールのレベル下げるのに十分である請求項1に記載の抗脂血剤。

請求項3

薬剤が、さらに、コレステロール生合成に関係する酵素の合成阻害剤又は半合成阻害剤を少なくとも1つ含む請求項1に記載の抗脂血剤。

請求項4

該酵素がHMGCoA還元酵素又はHMGCoA合成酵素である請求項3に記載の抗脂血剤。

請求項5

薬剤が、さらに、カスパーゼを少なくとも1つ含む請求項1に記載の抗脂血剤。

請求項6

カスパーゼがcpp32プロテアーゼ(カスパーゼ3)である請求項5に記載の抗脂血剤。

請求項7

阻害剤が、フルバスタチンシムバスタチンロバスタチンプラバスタチンメビノリンコンパクチン)、アトルバスタチン又はそれらの誘導体から成る群より選ばれる薬剤である請求項3に記載の抗脂血剤。

請求項8

少なくともSREBP−1のエフェクターの1つが、スフィンゴ脂質中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又は治療上有効なその断片である請求項2に記載の抗脂血剤。

請求項9

スフィンゴ脂質がセラミドである請求項8に記載の抗脂血剤。

請求項10

セラミドが天然に生じるセラミド、又はC−2、4、6若しくは8セラミドのいずれかである請求項9に記載の抗脂血剤。

請求項11

薬剤が、HMGCoA還元酵素の阻害剤又はHMGCoA合成酵素に関係するスフィンゴ脂質を含む請求項1に記載の抗脂血剤。

請求項12

薬剤が、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン(コンパクチン)、アトルバスタチン又はそれらの誘導体の1つと共有結合するスフィンゴ脂質を含む請求項11に記載の抗脂血剤。

請求項13

スフィンゴ脂質がセラミドであり、該セラミドが阻害剤上のヒドロキシル(−OH)基を介して阻害剤の1つと結合する請求項12に記載の抗脂血剤。

請求項14

阻害剤上のヒドロキシル(−OH)基がセラミドのC−3基に共有結合する請求項13に記載の抗脂血剤。

請求項15

抗脂血剤が、順に共有結合した1 )セラミド、2)セラミドのC−3基に結合したヘテロ二官能性スペーサー基、及び、3)ヘテロ二官能性スペーサー基上の反応性炭素原子に結合したフルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン(コンパクチン)、アトルバスタチン又はそれらの誘導体のヒドロキシル(−OH)基を含む請求項14に記載の抗脂血剤。

請求項16

薬剤が、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又は治療上有効なその断片;HMGCoA還元酵素の阻害剤又はHMGCoA合成酵素と会合するN−SMase又は断片を含む請求項1に記載の抗脂血剤。

請求項17

薬剤が、さらに、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン(コンパクチン)、アトルバスタチン又はそれらの誘導体の1つと共有結合した中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその断片を含む請求項16に記載の抗脂血剤。

請求項18

薬剤が、セラミド、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又は治療上有効なその断片を含む請求項1に記載の抗脂血剤。

請求項19

中性スフィンゴミエリナーゼが、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列で表される配列に少なくとも70%の配列同一性を有する配列によってコードされている請求項16又は18に記載の抗脂血剤。

請求項20

中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)の有効な断片が、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列のヌクレオチド862〜1414に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む請求項19に記載の抗脂血剤。

請求項21

中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)の治療上有効な断片が、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列のヌクレオチド862〜1414から成る請求項20に記載の抗脂血剤。

請求項22

中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその断片が、N−SMase又は断片のアミド結合を介して阻害剤の1つに結合する請求項8〜21のいずれか1項に記載の抗脂血剤。

請求項23

抗脂血剤が、順に共有結合した1 )中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又は治療上有効なその断片、2 )N−SMase又はその断片のアミド基に結合するヘテロ二官能性スペーサー、及び、3 )ヘテロ二官能性スペーサーの反応性炭素原子に結合したフルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン(コンパクチン)、アトルバスタチン又はそれらの誘導体のヒドロキシル(−OH)基を含む請求項8〜22のいずれか1項に記載の抗脂血剤。

請求項24

局所用に又は関連した使用のために薬剤が特別に調製される請求項1〜23のいずれか1項に記載の抗脂血剤。

請求項25

薬剤が、リポソーム製剤としての薬剤を提供するのに十分な成分をさらに含む請求項24に記載の抗脂血剤。

請求項26

請求項1〜25のいずれか1項に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類において血清コレステロールのレベルを調節する方法。

請求項27

請求項1〜25のいずれか1項に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてSREBP−1のレベルを調節する方法。

請求項28

請求項1〜25のいずれか1項に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてLDL受容体のレベルを調節する方法。

請求項29

哺乳類がアテローム性動脈硬化症又は関連疾患の認知された動物モデルである請求項28の方法。

請求項30

哺乳類がワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ又はアポリポタンパク質陰性マウスである請求項29の方法。

請求項31

哺乳類が霊長類である請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。

請求項32

霊長類が、コレステロール関連疾患を有すると診断されている、有することが疑われている、又はそれに感受性が高いヒト患者である請求項31の方法。

請求項33

コレステロール関連疾患が、高コレステロール血症を含む高リポタンパク質血症、卒中、肥満、アテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患大脳性アテローム性動脈硬化症、コレステロールエステル貯蔵病臓器移植不全及び肝硬変を含む肝疾患胆汁系疾患、脳炎亢進するウイルス感染の少なくとも1つである請求項32の方法。

請求項34

ヒト患者の感受性がコレステロール関連疾患に対する遺伝的又は環境的素因に関係する請求項32又は33の方法。

請求項35

血清高コレステロールレベルに関連した哺乳類の疾患を治療する方法であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投与することを含んでなる方法。

請求項36

哺乳類が霊長類である請求項35に記載の方法。

請求項37

霊長類が、血清の高コレステロールレベルを有すると診断されている、有することが疑われている、又はそれに感受性が高いヒト患者である請求項36に記載の方法。

請求項38

請求項1に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投与することを含み、その際、SREBP−1のエフェクターが、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又は治療上有効なその断片;又はスフィンゴ脂質である、哺乳類において血清のコレステロールを調節する方法。

請求項39

哺乳類がアテローム性動脈硬化症又は関連疾患に対する認知されたモデルである請求項38に記載の方法。

請求項40

哺乳類がワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ又はアポリポタンパク質E陰性マウスである請求項39に記載の方法。

請求項41

請求項1に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投与することを含み、その際、SREBP−1のエフェクターが、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又は治療上有効なその断片;又はスフィンゴ脂質である、哺乳類においてSREBP−1のレベルを調節する方法。

請求項42

請求項1に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投与することを含み、その際、SREBP−1のエフェクターが、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又は治療上有効なその断片;又はスフィンゴ脂質である、哺乳類においてLDL受容体のレベルを調節する方法。

請求項43

中性スフィンゴミエリナーゼが、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列で表される配列に少なくとも70%の配列同一性を有する配列によってコードされている請求項38〜42のいずれか1項に記載の方法。

請求項44

中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)の有効な断片が、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列のヌクレオチド862〜1414に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む請求項38〜42のいずれか1項に記載の方法。

請求項45

スフィンゴ脂質がセラミドである請求項38〜42のいずれか1項の方法。

請求項46

哺乳類が霊長類である請求項38〜42のいずれか1項の方法。

請求項47

霊長類が、コレステロール関連疾患を有すると診断されている、有することが疑われている、又はそれに感受性が高いヒト患者である請求項46の方法。

請求項48

コレステロール関連疾患が、高コレステロール血症を含む高リポタンパク質血症、卒中、肥満、アテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、大脳性アテローム性動脈硬化症、コレステロールエステル貯蔵病、臓器移植不全及び肝硬変を含む肝疾患、胆汁系疾患の少なくとも1つである請求項47の方法。

請求項49

ヒト患者の感受性がコレステロール関連疾患に対する遺伝的又は環境的素因に関係する請求項47又は48に記載の方法。

請求項50

抗脂血剤がリポソーム製剤として提供される請求項26〜49のいずれか1項に記載の方法。

請求項51

リポソーム製剤が具体的に肝臓への投与に適合される請求項50に記載の方法。

請求項52

リポソーム製剤が、経口、筋肉内、腹腔内、又はステント若しくは関連する埋め込み器具で肝臓に投与される請求項50又は51に記載の方法。

請求項53

各方法が、標準コレステロールアッセイにより測定されるとき、好適な対照哺乳類に比べた場合、哺乳類において少なくとも20%血清コレステロールのレベルを下げる請求項26〜52のいずれか1項に記載の方法。

請求項54

インビトロ(in vitro)標準HMGCoA還元酵素アッセイで測定されるとき、薬剤が約20%〜90%の間のID50を示す請求項1〜25のいずれか1項に記載の抗脂血剤。

請求項55

標準血清コレステロール結合アッセイによって測定されるとき、好適な対照哺乳類に比べた場合、薬剤が哺乳類において少なくとも約20%血清コレステロールを下げることができる請求項54に記載の抗脂血剤。

請求項56

ステロール調節要素結合タンパク質−1(SREBP−1)のエフェクターを検出する方法であって、a)SREBP−1を発現することができる細胞集団を提供すること、b)SREBP−1の成熟誘導するのに十分な量で候補エフェクターを細胞に接触させること、c)培地中で細胞を培養すること;及び、d)SREBP−1のエフェクターであることを示すSREBP−1の成熟を検出することを含んでなる方法。

請求項57

SREBP−1のエフェクターが、腫瘍壊死因子(TNF−α)、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)若しくはその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、cpp32、又はコレステロールである請求項56に記載の方法。

請求項58

SREBP−1のエフェクターを示すこととしてのLDL受容体の活性をさらにモニターすることを含む請求項56又は57に記載の方法。

請求項59

LDL受容体の生合成のエフェクターを検出する方法であって、a)セラミドに反応性で且つSREBP−1を発現することができる細胞集団を提供すること、b)SREBP−1の成熟を誘導するのに十分な量で候補エフェクターを細胞に接触させること、c)培地中で細胞を培養すること;及び、d)LDL受容体のエフェクターを示すLDL受容体の生合成を検出することを含んでなる方法。

請求項60

LDL受容体のエフェクターが、腫瘍壊死因子(TNF−α)、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)若しくはその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、cpp32、又はコレステロールである請求項58又は59に記載の方法。

請求項61

哺乳類においてコレステロール関連疾患を治療するためにSREBP−1のエフェクターの治療能力を決定する方法であって、a)SREBP−1を発現することができる細胞集団を提供すること、b)SREBP−1の成熟を誘導するのに十分な量で候補化合物を細胞に接触させること、c)培地中で細胞を培養すること;及び、d)疾患を治療することにおけるエフェクターの治療能力を示すSREBP−1の成熟を検出することを含んでなる方法。

請求項62

細胞が、さらに、細胞内セラミドレベルの増減に反応することができる請求項61に記載の方法。

請求項63

候補化合物の治療活性を示すLDL受容体の活性をモニターすることをさらに含む請求項61又は62に記載の方法。

請求項64

候補化合物が、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)若しくはその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、cpp32、又はコレステロールである請求項63に記載の方法。

請求項65

中性スフィンゴミエリナーゼが、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列で表される配列に少なくとも70%の配列同一性を有する配列によってコードされている請求項57〜64のいずれか1項に記載の方法。

請求項66

中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)の有効な断片が、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列のヌクレオチド862〜1414に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む請求項43〜51のいずれか1項に記載の方法。

請求項67

哺乳類においてコレステロール関連疾患を治療するために請求項1〜25に記載の抗脂血剤のいずれか1つの治療能力を決定する方法であって、a)SREBP−1を発現することができる細胞集団を提供すること、b)SREBP−1の成熟を誘導するのに十分な量で抗脂血剤を細胞に接触させること、c)培地中で細胞を培養すること;及び、d)疾患を治療することにおける抗脂血剤の治療能力を示すSREBP−1の成熟を検出することを含んでなる方法。

請求項68

細胞が細胞内セラミドレベルの増減にさらに反応することができる請求項67に記載の方法。

請求項69

抗脂血剤の治療活性を示すLDL受容体の活性をモニターすることをさらに含む請求項67又は68に記載の方法。

請求項70

抗脂血剤が、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)若しくはその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、cpp32又はコレステロールである請求項69に記載の方法。

請求項71

中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)が、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列で表される配列に少なくとも70%の配列同一性を有する配列によってコードされている請求項70に記載の方法。

請求項72

中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)の有効な断片が、配列表1(SEQID NO:1)又はその相補的な配列のヌクレオチド862〜1414に対して少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む請求項56〜57に記載のいずれか1項の方法。

請求項73

ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ又はアポリポタンパク質陰性マウスにおいて請求項1〜25に記載の抗脂血剤のいずれか1つの治療能力を決定する方法であって、a)少なくとも約10〜20%血清コレステロールレベルを下げるのに十分な量で、ウサギ又はマウスに少なくとも1つの抗脂血剤を投与すること、及び、b)ウサギ又はマウスにおいて、コレステロール関連疾患を治療するための抗脂血剤の治療能力を示す血清コレステロールの低下を検出することを含んでなる方法。

請求項74

対象哺乳類に請求項1〜25に記載の抗脂血剤のいずれか1つの治療上有効な量を投与することを含む、アミロイド前駆体タンパク質(BAPP)の調節生産のための方法。

請求項75

対象哺乳類に請求項1〜25に記載の抗脂血剤のいずれか1つの治療上有効な量を投与することを含む脂肪酸合成を調節する方法。

0001

本出願は、その全体を参考として本明細書に組み入れられている1999年2月24日に出願された米国特許仮出願、第60/121,447号の利益を請求する。
(米国政府の利害に関する陳述)

0002

本発明の資金の一部分は、米国政府により、国立衛生研究所助成金RO−1 DK−31722及びP50−HL4812によって、提供された。従って、米国政府は本明細書にて請求される発明において及びそれに対して確実な権利を有する。
(発明の分野)

0003

本発明は、血清コレステロールを調節するための組成物及び方法に関する。1つの態様では、発明は、低密度リポタンパク質(LDL)の少なくとも1つの同定されたエフェクター及び少なくとも1つの同定された血清コレステロール阻害剤を含む新規抗脂血剤を特徴とする。詳細な態様では、抗脂血剤は血清コレステロール阻害剤に結合したスフィンゴ脂質又はタンパク質修飾スフィンゴ脂質を包含する。さらに、対象哺乳類及び特にヒト患者において血清コレステロールのレベルを有意に安定化する又は低下させるために抗脂血剤を使用する方法を提供する。
(発明の背景

0004

コレステロール細胞膜の鍵となる脂質構成物質であるという、ほとんど普遍的な意見の一致がある。コレステロールは、一般に、ほとんどの高等生物の正常な発育及び生存に必須であると理解されている。多過ぎる血清コレステロールは、高リポタンパク質血症、卒中、冠動脈心臓疾患及びアテローム性動脈硬化症並びにその関連症状を含む、生命脅かす脂質関連疾患相関を持っている。一般に、Stryer, L のBiochemistry 第3版(1988年)の547〜574ページ(Ed. W. H. Freeman and Co. New York)及びM.S. Brown and Goldstein, J.LのThe Pharmacological Basis of Therapeutics(第8版)の874〜896ページ(Gilman, A.G. et al., eds., McGraw~Hill/New york)を参照のこと。

0005

哺乳類及び特に霊長類における血清コレステロールの調節は十分に注目を浴びてきた。ヒト及びその他の哺乳類におけるコレステロール恒常性の調節には、コレステロール産生、胆汁酸生合成及び特定の血清コレステロールキャリア異化の調節が関与していると報告されることが多い。重要な血清コレステロールキャリアは、LDL(低密度リポタンパク質)粒子と呼ばれる。LDL受容体は、コレステロールが必要な細胞へのLDL粒子の取り込みを促進すると報告されてきた。Brown, M.S. and Goldstein, J.L.のScience 232号(1986年)の34〜47ページ;Goldstein, J.L. and BrownのNature 348巻(1986年)の425ページ及びその中で引用されている参考文献を参照のこと。

0006

LDL受容体は、ヒトにおいて血清コレステロールのレベルに影響を及ぼすとして開示された。例えば、コレステロールが足りている細胞は、満足なLDL受容体を作らず、それによって細胞によるコレステロールの取り込みを減らす、さらに阻止さえするという認識がある。この例では、血清コレステロールは実質的に上昇し、疾患の進展又は重症度に寄与することがあり得る。逆に、コレステロールが必要な細胞は、より多くのLDL受容体を作る能力を有し、それによって血清コレステロールの低下を促進する。従って、ヒトの患者において血清コレステロールのレベルを安定化する又は軽減するための1つの治療アプローチとして、LDL受容体を調節することに焦点が置かれて特別に注目された。

0007

特に、LDL受容体遺伝子の転写は、ステロール蓄積した場合抑制され、ステロールが足りない場合誘導されることが報告されている。ステロール感受性は、ステロール調節要素(SRE)として知られる、LDLr遺伝子の上流10塩基対(bp)配列により与えられていると考えられている。ステロール調節要素結合タンパク質(SREBP−1)の成熟型はSREに結合し、転写を促進することが開示されている。

0008

ステロールが誘導するタンパク質分解によってSREBP−1の活性が影響を受けるという追加の報告もある。SREBP−1のタンパク質分解は、『サイトカイン腫瘍壊死因子』(TNF−α)と呼ばれる細胞受容体による設定の一部によって影響を受けるという認識がある。

0009

特に、TNF−α受容体は、幅広い範囲の生物学的効果に影響すると報告されている。しかしながら、TNF−αの性状は完全には明らかにされていない。TNF−α経路解明は、少なくとも2つのTNF−α受容体の存在によって複雑なものになることが多い。受容体は、下流の共通のエフェクターの一部を分かち合うが、受容体特異的な経路を介するシグナルも分かち合う。TNF−α受容体に関する更なる開示については以下に引用した参考文献を参照のこと。

0010

TNF−αのシグナル伝達結末の1つが中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)の活性化であることは理解されてきた。中性スフィンゴミエリナーゼは、至適pH7.4でスフィンゴミエリンセラミドホスフォコリンへの加水分解触媒する膜結合型酵素である。シグナル伝達における中性スフィンゴミエリナーゼの役割は主として、脂質セカンドメッセンジャーであるセラミドを生成する能力に関係している。TNF−αに加えて、Fas受容体リガンドビタミンD3、インターロイキン−1β、神経成長因子、抗CD28抗体及びγ−インターフェロンはすべてセラミドのレベルを高めることが明らかにされている。

0011

特に、スフィンゴミエリナーゼC型(E.C.3.1.4.12)は、以下の反応(1)を介してスフィンゴミエリンの加水分解による切断を触媒するホスホリパーゼ一群である。
スフィンゴミエリン→セラミド+ホスホコリン(1)
S. Chatterjeeの Adv. Lipid Res 26巻(1993年)25〜48ページ; S. Chatterjee, et al.,の J. Biol. Chem., 264巻(1989年)12543〜12561ページ;及び S. Chatterjee, et al., Method in Enzymology , Phospholipase の197巻(1991年)540〜547ページを参照のこと。

0012

シグナル伝達経路におけるスフィンゴミエリンとセラミドの生物学的な役割に加えて、ごく最近、スフィンゴミエリナーゼがコレステロールの恒常性及び特にLDL受容体活性の誘導に関与していることを示唆する証拠が現れてきた。S. Chatterjeeの Adv. Lipid Res 26巻(1993年)25〜48ページを参照のこと。更なる研究は、プログラム細胞死及び/又は『アポトーシス』並びに核内因子(NF)−κBに対する遺伝子の活性化におけるセラミドの潜在的役割を支持している。A. Alessenko and S. Chatterrjee, のMol. Cell Biochem., 143巻(1995年)の169ページを参照のこと。

0013

コレステロール産生に関与する酵素はコレステロールの恒常性に有意な効果を発揮することが示唆されてきた。従って、特に認容可能な範囲に血清コレステロールを安定化する又は軽減するこのような酵素を調節する能力を持った薬剤発見することに実質的な関心があった。例証となる薬剤には、フルバスタチンシムバスタチンロバスタチンプラバスタチン、及びアトルバスタチンのような市販の血清コレステロール阻害剤が挙げられる。これらの及びメビノリンコンパクチン)のようなその他の薬剤に関する更なる開示については、Brown MS and Goldstein JL(1993年)上記を参照のこと。

0014

このような及びその他の血清レベル低下剤の使用に臨床効果が伴うことがあることも報告されているが、有意な副作用の報告がある。例えば、Brown MS and Goldstein JL(1993年)上記;及びPhysician's Desk Referenceの1997年版(51版)(Medical Economics Co.)を参照のこと。従って、高められた有効性及びより優れた患者への認容性のようなさらに望ましい性状を示す薬剤を有するというニーズがある。患者の一部には投与されたコレステロール低下剤のレベルを軽減するという特別のニーズがある。

0015

さらに、SREBP−1タンパク質及び特にLDL受容体を調節することができる薬剤を発見するというニーズもある。その上、自動化された、処理時間の速い薬剤スクリーニングによる当該医薬品の同定のための方法は、種々の医薬品及びバイオ薬剤の開発プログラムにおいてますます信頼されるものになっている。残念ながら、そのような処理時間の速いスクリーニングアッセイに必須の薬剤は広く行き渡ってはいない。この領域における進歩がない大きな理由は、SREBP−1及びLDL受容体に影響を及ぼす分子(即ち、エフェクター)についての不十分な理解である。

0016

従って、LDL受容体レベル及び血清コレステロールのレベルを調節する二重の能力を持った抗脂血剤を有することが望ましい。多数の血清コレステロール阻害剤で現在用いられているものに近い又はそれより低い用量で対象哺乳類にかかる抗脂血剤を投与することができれば特に望ましい。特にSREBP−1タンパク質の突然変異を含むLDL受容体を調節する可能性を持つ薬剤を同定するためにin vivo及びin vitroのアッセイで有効性を有することがさらに望ましい。
(発明の要約)

0017

本発明は一般に、対象哺乳類における血清コレステロールを調節するための組成物及び方法に関する。1つの態様では、本発明は、低密度リポタンパク質(LDL)の少なくとも1つの同定されたエフェクター及び少なくとも1つの同定された血清コレステロール阻害剤を含む新規の抗脂血剤を特徴とする。より詳細な態様としては、薬剤は血清コレステロール阻害剤に結合した1つの同定されたスフィンゴ脂質又はタンパク質修飾スフィンゴ脂質を包含する。さらに、対象哺乳類及び特にヒト患者において血清コレステロールのレベルを安定化する又は低下させることが可能な医薬剤を同定するよう意図されたアッセイを含む、LDL受容体及び特にSREBP−1突然変異を調節することが可能な抗脂血剤を同定するための方法を提供する。

0018

我々は、コレステロールにより調節された疾患を治療する又は防ぐための、幅広いスペクトルの組成物及び方法を発見した。疾患は本明細書では、『コレステロール関連疾患』又は同様の用語で呼ぶことがある。さらに具体的には、我々は、LDL受容体の少なくとも1つの同定されたエフェクター、及び特にSREBP−1のエフェクター並びに少なくとも1つの同定された血清コレステロール阻害剤を含む抗脂血剤を同定した。複数のエフェクター及び阻害剤(例えばそれぞれ、約2〜5)を有する薬剤を考慮しているが、本発明の特別の抗脂血剤は、通常各成分を1つ有する。好ましい抗脂血剤は、以下に記載するin vitro又はin vivoのアッセイによって測定されるとき、対象哺乳類において血清コレステロールのレベルを安定化する又は軽減する能力のような具体的に定義された性状を特徴とする。

0019

さらに具体的には、本発明は、種々の抗脂血剤及び対象哺乳類において1又はそれより多くのコレステロール関連疾患を治療する又は予防するために該抗脂血剤を使用する方法を提供する。例示となる疾患は公知であり、高コレステロール血症を含む高リポタンパク質血症、卒中、肥満過食症、アテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、脳アテローム性動脈硬化症、コレステロールエステル貯蔵病臓器移植不全及び肝硬変を含む肝疾患胆汁系疾患、及びウイルス感染、特に脳炎又は関連疾患を亢進するような感染が挙げられる。

0020

本発明に基づいた特別の抗脂血剤は、1つのSREBP−1のエフェクター及びコレステロール生合成に関連した酵素の1つの合成又は半合成阻害剤を包含する。好ましい酵素は、広範に性状が調べられており、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル(HMG)CoA還元酵素及びHMGCoA合成酵素が挙げられる。さらに考慮された抗脂血剤は、エフェクター成分として、同定されているカスパーゼ、特にcpp32プロテアーゼ(カスパーゼ−3)、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)、セラミド、SREBP−1(前駆体)又はSREBP−1(成熟型)を特徴とする。N−SMase、cpp32プロテアーゼ、SREBP−1(前駆体)又はSREBP−1(成熟型)の有効な断片は、発明の範囲内でエフェクター分子として考慮される。

0021

さらに、具体的な抗脂血剤は、エフェクターが例えば、スフィンゴミエリン又はセラミド;又はN−SmMase又はその有効な断片であってもよいSREBP−1のエフェクターを1つ包含する。抗脂血剤がセラミドを包含する実施態様では、該セラミド分子は好ましくは天然に生じたものである(即ち、生物資源から実質的に純粋に単離することができる)。薬剤の中で使用するのにさらに好ましいセラミドは、C−2、C−4、C−6、又はC−8セラミドのいずれか1つである。好ましいN−SMase分子は、該酵素及びその有効な断片の酵素的に活性のある型をコードするようなものを含む本明細書で開示される特定の核酸配列にコードされている。本発明に基づいた好ましいエフェクターは、以下に記載する具体的なアッセイで測定されるときLDL受容体及び特にSREBP−1の成熟を調節する実質的な能力を示す。

0022

考察されるように、必要に応じてその他の薬剤がその他のエフェクターを包含してもよいが、本発明の特定の抗脂血剤は、スフィンゴ脂質、特にスフィンゴミエリン又はセラミド、N−SMase又はその有効な断片のような好適なSREBP−1のエフェクターを包含する。この実施態様では、抗脂血剤はさらにHMGCoA還元酵素の阻害剤を包含する。薬剤が意図するものに対する機能を亢進するという意味でエフェクターと阻害剤を組合せることが一般に好まれる。好ましい機能は、以下に記載する従来のin vivoアッセイによって測定されるとき血清コレステロールを安定化すること又は軽減することである。ほとんどの例では、他の会合が適用の一部にとっては好適であるけれども、エフェクターと阻害剤の間の共有結合が好まれる。好ましいコレステロール阻害剤は、還元酵素を阻害する能力を認識しており、それによって血清コレステロールを低下させる。阻害剤の例としては、ヒトに許容されている市販の血清コレステロール阻害剤、例えば、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、パラバスタチン、メビノリン(コンパクチン)、アトルバスタチン又は臨床的許容可能なそれらの誘導体などが挙げられる。

0023

特定の実施態様では、抗脂血剤は、SREBP−1タンパク質のエフェクター、例えば、N−SMase又は有効な断片;又はスフィンゴ脂質を1つ包含する。この実施例では、エフェクターは好ましくはHMGCoA還元酵素とも会合する。用語『会合する』又は『関係する』によって、SPEBP−1と阻害剤が少なくとも1つの結合、好ましくは少なくとも共有結合で結合していることを意味する。結合の特定の実施例は、以下に記載される。例の一部では、共有結合と非共有化学結合の好適な組合せによって会合を提供することができる。別の方法としては、エフェクターと阻害剤の、所望の対象哺乳類に対する本質的な共投与によってSREBP−1のエフェクターと阻害剤との間の会合を提供することができる。本発明の薬剤を製造する方法及び使用する方法は以下の考察と実施例において提供される。

0024

1つの実施態様では、抗脂血剤は少なくとも1つの共有結合によって阻害剤に結合したスフィンゴ脂質を包含する。注意したように、好ましいのは、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン(コンパクチン)、アトルバスタチンのような認知されたコレステロール阻害剤である。この例示では、スフィンゴ脂質は好ましくはセラミド又は関連分子であり、特に、セラミドが阻害剤分子の反応性ヒドロキシル基と共有結合している前述した好ましいセラミドのいずれか1つである。また、この実施例では、阻害剤のヒドロキシル基は通常、C−3炭素のようなセラミド上の反応性炭素に共有結合している。

0025

本発明の更なる抗脂血剤は、少なくとも1つの二官能価スペーサー基、典型的にはヘテロ官能価のスペーサー基で、基が阻害剤又はその他の薬剤部分からSREBP−1エフェクターに間を空けるものを包含する。この型の抗脂血剤の特定の実施例には、ヘテロ官能性スペーサー基1つに共有結合した1つのSREBP−1エフェクターを包含する。スペーサー基は好ましくは血清コレステロール阻害剤に共有結合している。典型的には、二官能価スペーサーは、エフェクター及び阻害剤の好適に反応する化学基、通常、それぞれ、特異的に反応する炭素原子とヒドロキシル基に結合している。

0026

さらに、本発明に基づいた抗脂血剤は、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその有効な断片のようなSREBP−1のエフェクターを1つ包含する。好ましい薬剤は、前述したように、HMGCoA還元酵素の阻害剤又はHMGCoA合成酵素と会合してN−SMase又はその断片を包含する。N−SMase又はその断片の好ましい例は、以下に続く実施例及び考察で提供される。

0027

さらに考慮された抗脂血剤は、SREBP−1のエフェクター、好ましくは、エフェクターがHMGCoA還元酵素の1つの阻害剤と共有結合している、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその断片を包含する。還元酵素の好ましい阻害剤はすでに考察した。好ましくは、共有結合は、酵素又は断片上の化学的に活性のある基を結合することによって、好ましくはアミド結合によって作られる。さらに特別の抗脂血剤は、酵素又はその断片と血清コレステロール阻害剤の間のアミド結合を特徴として、以下で開示される。

0028

本発明の好ましい抗脂血剤は、一般に意図された用途に適応して調合され、具体的には、局所又は関連した用途のために調合された薬剤を包含する。さらに、本発明は、in vitro又はin vivoに好適なリポソーム製剤として薬剤を提供するのに十分な構成成分を含む抗脂血剤を包含する。かかる好ましい薬剤を製造し、使用する方法は以下に説明される。

0029

一般に、本発明に基づいた治療法は、特に霊長類のような哺乳類、特にヒトのような対象に、少なくとも1つの当該抗脂血剤の治療上有効な量を投与することを包含する。該薬剤は単に活性剤として投与することができる。別の方法として、抗脂血剤は、所望の医薬活性を示すその他の薬剤又は物質と組合せて投与してもよい。ほとんどの場合では、抗脂血剤の使用量は、以下に記載するようなin vitro又はin vivoのアッセイにおける基準で良好な活性を呈する量である。

0030

考察しているように、本発明の抗脂血剤は、即ち、LDL受容体活性を高めることによって、特にLDL受容体のレベルを高めることによって、及び血清コレステロールのレベルを下げることによって二重の『抗−コレステロール』活性を有利に提供する。このような活性を検出し、定量する特定のin vitro及びin vivoのアッセイが以下、及びそれに続く考察及び実施例で提供される。

0031

例示のように、本発明の好ましい抗脂血剤は、標準のSREBP−1タンパク質分解(成熟)アッセイで測定されるとき、少なくとも約2倍、SREBP−1の成熟型の産生(成熟)を刺激することができる。該アッセイには以下に提供され、一般に、時間依存的及び用量依存的にSREBP−1タンパク質の成熟をモニターすることが含まれる。成熟SREBP−1タンパク質は核に移行し、LDL受容体の産生を刺激すると考えられている。

0032

さらに、本発明の好ましい抗脂血剤は、ノーザンブロット及び関連するmRNA検出アッセイによって測定されるように、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%までLDL受容体のmRNAレベルを高めることができる。LDL受容体のmRNAレベルを検出し、任意で定量する例示となるノーザンブロットアッセイは以下に記載する。

0033

また、本発明の好ましい抗脂血剤は、標準HMGCoA還元酵素アッセイで測定されるとき、約20%、30%、40%、50%、60%、70%から約90%までのID50を示す。このアッセイでは、抗脂血剤の存在下及び非存在下(対照)にて還元酵素の活性がモニターされる。標準HMGCoA還元酵素アッセイの例は以下に提供される。

0034

さらに好ましい抗脂血剤は、標準血清コレステロールアッセイで測定されるとき血清コレステロールを有意に下げることができる。好ましくは、投与された抗脂血剤は、少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、又は70%まで対象哺乳類において血清コレステロールを下げることができる。アッセイの実施例は以下に提供される。典型的には、好適な対照被験者に関して血清コレステロールの低下がモニターされる。血清コレステロールのアッセイは任意でin vivoで行われ、好ましくは、以下に提供される具体的なウサギ及びマウス系統のような認知された動物モデルの使用を包含する。

0035

本明細書で開示される血清コレステロールのアッセイ又はその他の好適なアッセイで使用される好ましい動物モデルは、同定されたコレステロール関連疾患に関して認知された試験系である。典型的には、そのような動物モデルには、市販のウサギ又はマウスの近交系、例えば、ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ及びアポリポタンパク質欠損マウスが挙げられる。この実施例では、具体的な動物モデルの使用に適応される周知の試験戦略を用いて、血清コレステロールの低下を評価することができる。しかしながら、適用の中には、遺伝的に定義された(例えば、同系の)公知の野生型動物系統のような正常(野生型)動物において所望の抗脂血剤を調べることが有用なこともある。

0036

本発明の抗脂血剤は、好ましくは上記に要約された標準アッセイの少なくとも1つ、好ましくはそのすべてによって調べられる。好ましいのは、1又はそれより多くのアッセイにおいて明白に規定された活性範囲を示す抗脂血剤である。

0037

重要なことに、単一の抗脂血剤と共に複数の試験戦略(例えば、1つのin vitro及び/又はin vivoアッセイの組合せ)を使用することによって、必要に応じて試験の選択性及び有効性を広げることができる。すなわち、必要であれば、特定のコレステロール関連疾患又は患者群の治療又は予防のために試験戦略を誂えることができる。

0038

かかる広域スペクトルの試験は更なる利点を提供する。例えば、好ましい抗脂血剤はLDL受容体活性を高める能力を有し(典型的には、LDL受容体の産生を高めることによって)、血清コレステロールのレベルの低下を提供する。従って、かかる二重『抗−コレステロール』活性を提供することによって、本発明は、ある意味では、通常コレステロールの生合成を標的とすることにより血清コレステロールを下げると報告されてきた従来の治療及び薬剤を上回る有意な前進である。従って、本発明の好ましい抗脂血剤は、さらに優れた活性を特徴とし、従来の薬剤よりも低い用量で投与することができる。抗脂血剤に対する患者の認容度も、明確に影響を受ける。

0039

もう1つの態様では、本発明は、哺乳類において血清コレステロールを調節する、特に下げる方法を包含する。この実施態様では、本発明の方法は、本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも1つ、典型的には1つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する。

0040

また、本発明において、その方法が本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも1つ、典型的には1つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類においてLDL受容体のレベルを調節する方法も提供する。

0041

本発明はまた、高レベルの血清コレステロールを有する又は有することが疑われる哺乳類における疾患を治療する方法も提供する。本実施態様では、本方法は、本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも1つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する。好ましい哺乳類は、霊長類、特にヒト患者であり、例えば、冠動脈心臓疾患、肥満、過食症になりやすいヒト又は本明細書で記載されるその他のコレステロール関連疾患に罹り易いヒトである。従って、方法は、例えば有害な遺伝的影響又は食事の影響による、高レベルの血清コレステロールを有すると診断された、有することが疑われる、又はそれに感受性が高いヒト患者のような対象哺乳類に特に適用可能である。

0042

また、本発明により、その方法が本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも1つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類において血清コレステロールのレベルを調節する方法も提供される。本実施態様では、SREBP−1のエフェクターは、好ましくは中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその有効な断片;又はセラミドのようなスフィンゴ脂質である。好ましい方法はヒト患者のような霊長類を採用する。当該方法で使用するのに好ましい抗脂血剤は、典型的には、上記で考察したように、例えば、ワタナベ高脂血症遺伝性ウサギ又はアポリポタンパク質E陰性マウスのような、コレステロール関連疾患、特にアテローム性動脈硬化症に対して認知された動物モデルを用いて、活性が調べられる。

0043

さらに、本発明による方法が、本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも1つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類においてLDL受容体を調節する方法を熟考する。調節は好ましくはLDL受容体の合成を高めること(LDL受容体の分解を低下させることもある)である。本実施例では、SREBP−1のエフェクターは、好ましくは中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその有効な断片;又はセラミドのようなスフィンゴ脂質である。LDL受容体レベルの上昇又は低下を評価するための方法は公知であり、例えば、in vitro又はin vivoにおいてLDL受容体を検出し、定量することができる抗LDL抗体を用いた分子的及び免疫的アプローチが含まれる。

0044

本発明の方法の詳細としては、本明細書で考察するように、血清コレステロールの同定された阻害剤と会合したSREBP−1の1つのエフェクターを含む少なくとも1つの好適な抗脂血剤を含む。本実施例では、該エフェクターは、好ましくはセラミドのようなスフィンゴ脂質である。セラミドの好ましい例には天然で生じるセラミド及び上記で考察したその他の型のセラミドが挙げられる。考察するように、霊長類、特に、開示されたようなコレステロール関連疾患を有すると診断された、有することが疑われた、又はそれに感受性であるヒト患者のような哺乳類対象を用いて、好ましい方法は実施される。

0045

本明細書で開示された方法の実施態様では、抗脂血剤は好ましくはリポソーム製剤として処理される。本実施例では、リポソーム製剤は標準診療に従った肝投与に適合することができる。また、本実施例では、リポソーム製剤は、例えば、経口、筋肉内、腹腔内、ステント又は関連した器具による投与を含む標準的な医療技術に従ってヒト患者において肝臓又は関連する臓器に投与することができる。投与の特定の経路は以下に提供される。

0046

発明のその他の態様は以下で考察される。
(発明の詳細な説明)

0047

考察したように、発明はヒト患者又は対象哺乳類において血清コレステロールのレベルを安定化する又は下げる抗脂血剤及び抗脂血剤を使用する方法に関する。好ましい抗脂血剤は一般に、1つの同定された血清コレステロール阻害剤に会合したSREBP−1タンパク質の1つの同定されたエフェクターを包含する。エフェクター成分と阻害剤成分が単一の製剤として特異的に共に共有結合している抗脂血剤がさらに好ましい。

0048

用語『抗脂血剤』は、対象哺乳類においてLDL受容体を調節し、血清コレステロールのレベルを安定化する又は下げることによって血清コレステロールのレベルを調節する二重の能力を有する、一般的に本発明の組成物、好ましくは、具体的な合成薬剤又は半合成薬剤を称して本明細書では使用される。 好ましいのは、以下に記載されるin vitro及びin vivoの具体的なアッセイによって測定されるとき、LDL受容体レベルを下げる且つ血清コレステロールのレベルを下げる能力を示す抗脂血剤である。以下に考察するように、阻害剤成分によって血清コレステロールのレベルを下げる能力には、一般にHMGCoA還元酵素の調節、典型的には血清コレステロールを下げるのに十分な該酵素の阻害が介在している。同様に考察されるように、エフェクター部分は好ましくはLDL受容体の産生を高める。

0049

本明細書で開示される抗脂血剤は公知の認知された方法によって製造することができる。例えば、具体的なスフィンゴ脂質及び特にセラミド及びセラミド関連化合物の製造方法は、その開示が参考として本明細書に組み入れられている、現在、米国特許第5,972,928号として1999年10月26日に発行された『ラクトシルセラミドに会合する条件の処理方法』と題する、1997年12月24日に提出された米国特許同時係属出願、出願番号第08/998,262号の中で開示されている。Abe, A, et al.,の J. Biochem.111巻(1992年)の191〜196ページ; Inokuchi, J. et al., のJ. Lipid Res., 28巻(1987年)の565〜571ページ;Shukla, A, et al., J.の Lipid Res.,32巻(1991年)の73ページ Vunnam, R. R., et al., のChem. and Physics of Lipids26巻(1980年)の265ページ Carson, K. et al.,の Tetrahedron Lets.,35巻(1994年)の2659ページ;及び Akira A. et al., の J. Lipid Research36巻(1995年)の611ページも参照のこと。

0050

本発明のさらに具体的な抗脂血剤には、共有結合した構成成分としてのエフェクター及び血清コレステロール阻害剤が挙げられる。しかしながら、適用の中には、非共有結合した構成成分を含むものなどのようなその他の抗脂血剤が適当である場合もある。実施例は、本質的に共に投与される製剤として提供されるような薬剤を包含する。

0051

詳細には、抗脂血剤の分子量は、例えば選択されるSREBP−1のエフェクター及び血清コレステロール阻害剤によって、並びに薬剤を作るエフェクター及び阻害剤の数によって異なる。しかしながら、ほとんどの場合では、特にエフェクター分子が、本明細書で開示されるN−SMase配列又はその断片のようなタンパク質又はポリペプチド配列である場合、抗脂血剤は約10,000kD〜35,000kD未満の分子量を有する。エフェクターがスフィンゴミエリン又は関連分子である場合、分子量は一般に、例えば約100kD〜1000kDの間、好ましくは約200kD〜500kDの間のように有意に低くなる。分子量を決定する方法は既知であり、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法のような標準分子サイズ法が挙げられる。

0052

本発明に基づいた具体的な抗脂血剤の例示的実施例を図25に示す。図25は特に、種々のヒト病態においてSREBP−1成熟の上方調節を行う(エフェクター)セラミド、N−SMase、及び種々の脂質を下げる分子;HMGCoA還元酵素阻害剤(スタチン)の組合せを使用することを示す。

0053

LDL受容体及び特にSREBP−1タンパク質の『エフェクター』は、以下に記載する標準SREBP−1成熟アッセイによって測定されるようなLDL受容体及び特にSREBP−1タンパク質の成熟を調節する能力を示す、分子、通常、アミノ酸配列リポタンパク質、脂質などの分子である。例示となるエフェクターは、実施例及び図19に提供されている。

0054

用語としての『血清コレステロール阻害剤』は、対象哺乳類特にヒト患者において血清コレステロールのレベルを下げることができる認知された化合物を称して本明細書で使用される。好ましい血清コレステロール阻害剤はコレステロールの生合成、特に例えば肝臓におけるHMGCoA還元酵素の活性を妨害する。さらに好ましい血清コレステロール阻害剤は、手軽に市販されているものであり、メバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、及びシムバスタチンが挙げられる。図26及び以下の考察を参照のこと。

0055

TNF−αが、N−SMaseの作用を介して細胞においてSREBP−1の成熟を有意に刺激することは予想外に見い出された。すなわち、我々は、TNF−αが時間依存的及び用量依存的にSREBP−1の成熟を誘導することができることを見い出した。この誘導は、TNF−αが介在する中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)の活性化の反応動態に一致した。N−SMaseに対する抗体がTNF−α誘導のSREBP−1の成熟を阻害したということは、N−SMaseがこのシグナル伝達経路に必要な分子であることを示唆している。スフィンゴミエリンの加水分解産物である、セラミドもまた、SREBP−1の成熟を誘導する能力があることが見い出されている。理論に束縛されることを望まずに、TNF−α、スフィンゴミエリナーゼ又はセラミド処理により生じるSREBP−1の成熟型は、核に移行して、ステロール調節要素(SRE)に結合すると思われる。このことは、SREの上流の遺伝子の転写を促進すると考えられている。この知見の模式図については図19を参照のこと。さらに、SREBP−1のエフェクターは、特にSREBP−1の成熟を高めることによってLDL受容体を刺激し、それによって対象哺乳類の血清コレステロールを安定化する又は下げると思われる。

0056

本発明の治療法は一般に、例えば霊長類、特にかかる治療におけるヒト患者のような対象哺乳類に、本明細書で開示される少なくとも1つの、典型的には1つの抗脂血剤の治療上有効な量を投与することを含む。治療的処置法は、さらに具体的には、対象に、特に本明細書で開示される適応に対するかかる治療の必要なヒトのような哺乳類に抗脂血剤の有効量を投与することを包含する。

0057

問題とされる典型的な対象には、例えば、高コレステロール血症を含む高リポタンパク質血症、卒中、過食症を含む肥満、アテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、脳アテローム性動脈硬化症、コレステロールエステル貯蔵病、臓器移植不全及び肝硬変を含む肝疾患;胆汁系疾患及び特に脳炎又は関連疾患を亢進するような感染を含むウイルス感染のような、本明細書で開示される症状、障害又は疾患に罹っている、罹っていることが疑われる、又はそれらに感受性の高いヒトが挙げられる。このような疾患をスクリーニングし、診断するための認知された方法を含むこのような及びその他のコレステロール関連疾患に関するさらに具体的な開示が報告されている。Brown, MA and Goldstein, J.L(1993年)上記及びその中で引用されている文献を参照のこと。

0058

本発明で、特に記載される治療方法において種々の具体的な抗脂血剤を用いることができる。日常的な試験、例えば、任意選択でその他のin vitro及び/又はin vivoアッセイと組合せた標準的なin vitroのアッセイによって、ほとんどの場合、標的となる障害又は疾患に関して所望の選択性及び活性を呈する好適な抗脂血剤を容易に同定することができる。注意したように、好ましい抗脂血剤は、N−SMase、又はその有効な断片、スフィンゴ脂質、及び特にセラミド、例えばcpp32タンパク質(カスパーゼ3)のようなカスパーゼ、又はその有効な断片のようなSREBP−1タンパク質の詳細なエフェクター及び本明細書で考察するその他の詳細なエフェクターを特徴とする。

0059

さらに、以下に続く実施例及び考察においてエフェクターの詳細を開示する。例えば、本発明の抗脂血剤の1つは、配列において共有結合した:1)化学的に反応性である基を含むSREBP−1;及び2)エフェクターの反応基と一般に共有結合で特異的に結合することができるもう1つの化学的に反応性である基を含む、本明細書で開示されるもののような血清コレステロール阻害剤を包含する。任意選択で、抗脂血剤はさらに、1)と2)との間で共有結合した例えばヘテロ二官能性スペーサーのような二官能性スペーサーを包含する。

0060

さらに好ましい抗脂血剤は、配列において共有結合した1)スフィンゴ脂質及び特にスフィンゴミエリン又はセラミド、及び2)本明細書で開示される具体的な血清コレステロール阻害剤を包含する。本実施態様では、セラミドは好ましくは天然に生じたものであり、C−2、C−4、C−6又はC−8セラミドのいずれであってもよい。SREBP−1エフェクターがセラミドである実施態様では、反応基は典型的にはC−3群のセラミドである。好ましいのは、例えば、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン(コンパクチン)又はアトルバスタチンのような好適に化学的に反応性であるヒドロキシル(−OH)基を含む血清コレステロール阻害剤である。任意選択で、抗脂血剤は、1)と2)の間に共有結合した、即ちC3基とヒドロキシル基の間に共有結合を提供する二官能性スペーサーを包含してもよい。

0061

スフィンゴミエリン及び特定のセラミド(C−2セラミド、ジヒドロC−2セラミド)の化学構造図27及び28に示す。

0062

また、配列において共有結合した1)中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその有効な断片、及び2)本明細書で開示されるような特定の血清コレステロール阻害剤を包含する抗脂血剤も好ましい。SREBP−1エフェクターがN−SMase又はその断片である本実施態様では、化学的に反応性である基は好適なアミド結合である。例えば、フラバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン(コンパクチン)、又はアトルバスタチンのような好適に化学的に反応性であるヒドロキシル基(−OH)を含む血清コレステロール阻害剤が好ましい。任意選択で、抗脂血剤は、1)と2)の間に共有結合で、二官能性スペーサー及び特にヘテロニ官能性スペーサーを包含してもよい。好適なリンカーの配列は、公知であり、一般にアミノ酸配列のような好適なポリマー配列の各端に化学的に反応性である基を包含する。

0063

本発明に基づいて使用するのに例示となるN−SMase及びその断片は、その開示が参考として本明細書に組み入れられる、1999年6月6日に発行された米国特許第5,919,687号で、『組換えN−SMase及びそれをコードする核酸』と題する1996年12月24日に提出された米国特許同時係属出願、出願番号第08/774,104と同様に、以下に続く実施例及び考察に提供されている。

0064

特に、好ましい中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)は、図24(SEQ.ID NO.:1)又はその相補物に示される配列に少なくとも70%、80%、90%又は95%の配列同一性を有する配列によってコードされる。N−SMaseの好ましい断片は、SEQ.ID NO.:1又はその相補物のヌクレオチド862〜1414に少なくとも70%、80%、又は90%の配列同一性を有する配列を包含する。さらに特に好ましいのは、SEQ ID NO:1又はその相補物のヌクレオチド862〜1414から成るN−SMase断片である。ヌクレオチド配列同一性を決定する方法は公知であり、FASTA及びBLASTのような周知のコンピュータによるプログラムの使用が含まれる。BLAST及び関連するプログラムに関する開示については、S. Altschul et al., のJ. Mol. Biol. 215巻(1990年)の403ページ及びS. Altschul et al., のNuc. AcidsRes25巻(1997年)の3389〜3402ページを参照のこと。

0065

好ましいN−SMaseのヌクレオチド断片に関するとき、用語『有効な断片』は、以下に記載する標準in vitroSREBP−1成熟アッセイにおいて有意な活性を有する特定のヌクレオチドを称して本明細書では使用される。N−SMaseの有効な断片の特別に好ましい例は、SEQID NO:1のヌクレオチド862〜1414である。

0066

考察するように、本発明の好ましい抗脂血剤は、標準SREBP−1成熟アッセイにおいて有意な活性を呈する。好ましくは、アッセイで測定されるとき、該薬剤は、少なくとも2倍、好ましくは約2〜10倍の間、さらに好ましくは約2〜5倍の間を呈する。好ましいアッセイには一般に:
a)例えばHH−25細胞のような好適な細胞を培地中で培養し、約2〜60分の間、好ましくは約10〜30分の間、一般的には約15分が好ましいがその間抗脂血剤を加え、次いで洗浄し、そして、
b)以下に記載するような抗SREBP−1抗体でウエスタン免疫ブロットを行うことにより成熟SREBP−1(即ちタンパク質分解で切断された)及びSREBP−1前駆体を検出することが含まれる。一般に、前駆型に対してSREBP−1の成熟型の質量を決定することができる。成熟型の存在は、SREBP−1の成熟とタンパク質分解を示している。アッセイを行うさらに具体的な方法は、以下に続く実施例中に提供されている。典型的には、好適な対照細胞は、細胞が薬剤に暴露されていない参照として含まれる。
また、考察するように、本発明の好ましい抗脂血剤は、LDL受容体のmRNAを検出する、好ましくは定量するためのノーザンブロットにおいて良好な活性を呈する。さらに、好ましい抗脂血剤は、ノーザンブロットアッセイ又は関連するmRNA検出アッセイで測定するとき、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約20%〜50%までの間でLDL受容体mRNAのレベルを高めることができる。ノーザンブロットアッセイを行う方法は一般に知られており、Sambrook et al の分子クローニング実験室マニュアル(Molecular Cloning; A Laboratory Manual、第2版、1898年)及び Ausubel et al の分子生物学現代プロトコール( Current Protocol in Molecular Biology、1988年) (John Wiley & Sons, New York)に記載されている。

0067

LDLのmRNAを検出するための好適なプローブは一般に入手可能であり、Genbankから入手できるヒトLDL受容体のクローニングした配列及び関連した哺乳類の配列が挙げられる。Genbankに関する情報は、米国医療図書館(National Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, MD, 20894)から入手することができる。Genbankはインターネットアドレスhttp//www.ncbi.nlm.nih.govからも利用できる。Genbankに関するさらに完全な説明については一般にBenson, D. A. et al., のNucl AcidsRes.25巻(1997年)1ページを参照のこと。

0068

LDL受容体mRNAのレベルを検出する及び任意選択で定量するための例示となるノーザンブロットアッセイは以下で考察される。

0069

HMGCoA還元酵素の好ましい阻害剤は一般に、肝臓においてコレステロールの合成を低下させ又は阻止し、それによって血漿LDLの還元を導くことができる代償性反応を促進する。この現象を測定する好ましいアッセイは標準HMGCoA還元酵素アッセイである。前述したように、本発明の好ましい抗脂血剤は、HMGCoA還元酵素アッセイで測定されるとき、約20%、30%、40%、50%、60%、70%、又は80%〜約90%までの間、好ましくは約30%〜50%の間のID50を呈する。 標準HMGCoA還元酵素アッセイは、Brown et al の I. Biol. Chem.253巻(1978年)の1121ページに記載されている。本アッセイでは、好適な対照と比較した場合増加した酵素の量を蓄積することによる還元酵素の阻害に対して培養したヒト線維芽細胞が反応する。

0070

また、考察するように、さらに好ましい抗脂血剤は、標準コレステロールアッセイで測定されるとき、血清コレステロールを下げることができる。該薬剤はアッセイで測定されるとき、好ましくは、少なくとも 約5%又は10%〜20%、30%、40%又は50%の低下を記録し、好ましくは少なくとも約30%〜50%の低下を記録する。LDLコレステロールを測定する好ましいアッセイは、シグマ(ミズーリ州、セントルイス)から市販されており、免疫的な分離が含まれる。ヒトでの許容可能なコレステロールのレベルに関する情報については、米国コレステロール教育プログラムも参照のこと。

0071

『高い』又は『高いリスク』のコレステロールレベル又はそれに関連する用語は、さらに一般的に高血清コレステロールを示すことが理解されている240mgより高い又はそれと同等なレベルとともに、約200〜240mgの間のコレステロールであるとして本明細書では定義される。本明細書では、正常血清コレステロールのレベルは約200mg未満であると定義される。コレステロール試験を行うことについては、1988年のNCEP報告の指針を考察しているBrown M.S. and Goldstein, J.Lの上記文献を参照のこと。

0072

従って、血清コレステロールの『安定化』又は『低下』は、そのような用語が本明細書で使用されるとき、対象哺乳類において正常又は正常に近い血清コレステロールレベル発現を意味すると理解されるであろう。また、本発明に基づいた好適な対象哺乳類は、標準血清コレステロール試験で測定されるとき、好ましくは正常又は正常に近い血清コレステロールのレベルを有する。

0073

本発明の追加の方法は、その方法が本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも1つ及び典型的には1つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する哺乳類におけるSREBP−1のレベルを調節することを包含する。典型的には、SREBP−1の調節は、以下の実施例に記載されるSREBP−1成熟試験によって測定されるとき、タンパク質の成熟を測定することによって評価される。

0074

本発明は、その方法が、本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも1つ及び好ましくは1つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類においてSREBP−1のレベルを調節するための方法を提供する。本実施態様では、SREBP−1のエフェクターは、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその治療上有効な断片;又はスフィンゴ脂質である。考察するように、SREBP−1の調節は典型的には、以下の実施例に記載されるSREBP−1成熟試験によって測定されるとき、タンパク質の成熟を測定することによって評価される。好ましいアッセイは、実施例で以下に記載されるSREBP−1タンパク質分解アッセイである。

0075

本発明の方法は、本明細書に開示されるもののような一次の、培養した又は不死化した細胞を用いてin vitro又はin vivoで実施することができる。一般に、このような細胞は、以下に記載されるHH−25ヒト肝細胞を含めて、本明細書で定義されるようなSREBP−1成熟型を示すことができる。当該抗脂血剤を調べる方法、及び特にヒト患者において使用する方法は好ましくはin vivoで実施され、使用される方法によって好適な動物モデルの使用を含めてもよい。別の方法としては、方法はヒト患者のような好適な霊長類において実施することができる。好ましいのは、上記で定義したようなコレステロール関連疾患を有する、有することが疑われる、又はそれに感受性が高いと診断されているヒト患者である。

0076

ヒト患者が1又はそれより多くのコレステロール関連疾患に感受性が高い実施態様では、感受性は、コレステロール関連疾患に対する遺伝的又は環境的素因に関係しうる。かかる素因を決定する方法は公知であり、遺伝的試験が含まれる。Brown M.S. and Goldstein, J.Lの上記文献を参照のこと。

0077

従って発明は、不適切な(即ち高い)血清コレステロールレベル及びそれに関連した疾患又は症状を治療する方法を提供する。一般に、このような方法は、高血清コレステロールレベルに悩んでいる又は感受性が高い対象哺乳類、特にヒトに、本発明の抗脂血剤化合物の1又はそれより多くの治療上有効な量を投与することを包含する。さらに、不適当な血清コレステロールレベルの発生を防ぐ又はその重症度を軽減するためのタンパク質分解薬剤としての本抗脂血剤を熟考する。

0078

本発明の化合物は、本明細書で開示されるようなコレステロールに関連した疾患、障害又は症状を有する又は有することが疑われるヒト患者に特に有用である。発明の化合物は、ヒト患者において血清コレステロールを正常又は正常に近いレベルまで下げるのに特に有用である。発明に従って治療してもよい疾患の具体例には、高リポタンパク質血症、卒中、心臓血管系疾患及び特にアテローム性動脈硬化症、並びに本明細書で言及されるその他の具体的な疾患の症状が挙げられる。

0079

単に理論にしばられることから離れれば、本発明の複数の区別できる共有結合した化合物(即ち、少なくとも1つの同定されたSREBP−1エフェクターと組合せられた少なくとも1つの同定された抗脂血剤)が、例えば対象細胞においてLDL受容体の合成を高めることによって抗脂血剤の有効性を有意に高めることができると考えられている。

0080

その上、共有結合によって、本発明の共役体は、化合物を共有結合せずに薬剤の『カクテル』製剤で同じ化合物を投与することによっては容易に達成することができない効果である、対象細胞に抗脂血剤とSREBP−1エフェクターを本質的に同時に提示している。

0081

1つの薬剤による治療が今度はもう1つの薬剤に対して患者を感作することも報告されている。従って、発明の共役体を介して対象細胞に対して抗脂血剤とSREBP−1エフェクターを本質的に同時に提示することは、例えば、相乗効果を提供することによって及び/又はLDL受容体の産生を高めることによって、薬剤の活性を高める可能性がある。問題とされる特定のSREBP−1エフェクターには、スフィンゴミエリン及び特にセラミド及び関連化合物が挙げられる。また、好ましいのは、N−SMase及び該酵素の治療上有効な断片である。

0082

本発明の化合物の投与は、経口、局所(経皮、経又は下を含む)、内及び非経口(腹腔内、皮下、静脈内、皮内、又は筋肉内注射を含む)を含む種々の好適な経路によって行ってよく、経口又は非経口が一般的には好ましい。好ましい投与方法及び投与量は、例えば、受入者の症状及び年齢によって異なってもよい。

0083

本発明の化合物は、血漿リポタンパク質の濃度を下げるような認知された薬学活性をもったものなどのその他の薬剤と併せて治療に用いてもよい。Brown M.S. and Goldstein, J.Lの上記文献を参照のこと。例示となる薬剤は、レスコールTM(登録商標名:サンド薬品のフルバスタチン)、メバコールTM及びゾコールTM(それぞれメルクのシムバスタチン及びロバスタチン)、プラバコールT
M(ブリストルイヤーズ・スクイブのプラバスタチン)及びメビノリン(コンパクチン)のような認知された血清コレステロール阻害剤(即ち、HMGCoA還元酵素を阻害すると報告されている)である。

0084

本発明の化合物は、単独で、又は例えば、ゲンブロジル、クロフィブレートフェノフィブレート、シプロフィブレート、又はベザフィブレートのようなフィブリン酸コレスチラミン又はコレスチポールのような胆汁酸結合樹脂;及びプロブコールの使用を実施するようなものを含むその他の許容されている抗−脂肪血療法と併用で使用してもよい。本発明の化合物は、必要に応じてかかる療法の前、最中又は後に投与することができる。
発明の1又はそれより多くの化合物は単独で投与されてもよいが、それらはまた、活性のある化合物に対して有害に反応しない且つそれらの受入者に有害ではない、非経口、経口、又はその他の所望の投与に好適な、例えば薬学的に許容可能な有機又は無機キャリアのような従来の賦形剤との混合物における医薬組成物の一部として存在してもよい。薬学的に許容可能な、好適なキャリアには、水、塩溶液アルコール植物油ポリエチレングリコール類ゼラチンラクトースアミロースステアリン酸マグネシウムタルク珪酸粘性パラフィン芳香油脂肪酸モノグリセリド並びにジグリセリド石油エーテル脂肪酸エステルヒドロキシメチルセルロースポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されない。医薬調製物滅菌することができ、所望であれば、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤乳化剤浸透圧に影響を与える塩、緩衝液着色剤矯味剤、及び/又は芳香族物質など、活性化合物と有害に反応しない補助剤と混合することができる。

0085

非経口の適用については、特に好適なのは、溶液、好ましくは油状溶液又は水溶液、及び懸濁液、エマルション、又は座薬を含む埋め込み剤である。アンプル都合の良い単位用量である。

0086

経腸適用については、特に好適なのは、タルク及び/又は炭水化物のキャリア結合剤などを有する錠剤糖衣錠又はカプセルであり、好ましくはキャリアはラクトース及び/又はコーンスターチ及び/又はポテトスターチである。甘味媒体を用いたシロップエリキシルなどを使用することもできる。例えば、マイクロカプセル化多重被覆などによって差次的に分解するコーティングで活性化合物が保護されるものを含めて、徐放性組成物を調合することができる。

0087

発明の治療用化合物リポソームに組み入れてもよい。例えば、高周波分解及び押出しのような既知のリポソーム調製法に従って組み入れを行うことができる。リポソーム調製の好適な従来の方法は、A.D. Bangham et al の J. Mol. Biol.の23巻(1965年)の238〜252ページ; F.Olson et al の Biochem. Biophys. Acta 557巻(1979年)の9〜23ページ; F. Szoka et al の Proc. Natl. Acad. Sci. 75巻(1978年)の4194〜4198ページ; S. Kim et al のBiochem. Biophys. Acta728巻(1983年)の339〜348ページ及びMayer et al のBiochem. Biophys. Acta 858巻(1986年)の161〜168ページにも記載されている。

0088

リポソームは、1又はそれより多くの上記で考察した共役体のみで作製してもよいし、さらに好ましくは、ホスファチジルコリンホスファチジルエタノールアミンホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシトールのような、、植物又は動物資源のような天然資源から得られたリン脂質を含む、従来の合成又は天然リン脂質リポソーム素材のいずれかと組合せて作製してもよい。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジコリン及び相当する合成ホスファチジルエタノールアミン並びにホスファチジルグリセロールのような合成リン脂質を用いてもよい。コレステロール、又はその他のステロール、コレステロールヘミスクシネート糖脂質、1,2−ビス(オレオイロキシ)−3−(トリメチルアンモニオプロパンDOAP)、N−[1−(2,3−オレオイルプロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)及びその他のカチオン系脂質をリポソームに組み入れてもよい。リポソームの中で使用される1又はそれより多くの化合物及び添加物の相対量は、相対的に幅広く変化してもよい。本発明のリポソームは、約60〜90モルパーセントの天然又は合成リン脂質を含有し; コレステロール、コレステロールヘミスクシネート、脂肪酸又はカチオン系脂質は、0〜50モルパーセントの範囲の量で使用されてもよく;及び発明の1又はそれより多い治療用化合物が約0.01〜約50モルパーセントの量で好適に存在してもよい。

0089

任意の治療において使用される活性化合物の実際の好ましい量は、利用される特定の化合物、調合される特定の化合物、適用方式、特定の投与部位などによって変化することは十分理解されるだろう。投与の任意のプロトコールに関する最適な投与速度は、前述の指針に関して行われる従来の用量決定試験を用いて当業者は容易に確認することができる。

0090

一般に、本明細書で開示されるような脂質関連疾患、及び特に高リポタンパク質血症、卒中、冠動脈心臓疾患特にアテローム性動脈硬化症の治療については、本発明の1又はそれより多くの化合物の好適な有効量は、1日当り、受入者の体重kg当り0.01〜100mgの範囲であり、好ましくは1日当り、受入者の体重kg当り0.1〜50mgの範囲であり、さらに好ましくは1日当り、受入者の体重kg当り1〜20mgの範囲である。所望の用量は好適には1日1回投与し、又は1日を通して適切な間隔で、又はその他の適切なスケジュールで、例えば2〜5回のように、数回に分けて投与する。

0091

本発明の多数の化合物の好ましい用量は、同定されたHMGCoA還元酵素阻害剤に対して許容された用量の範囲内であり、多数の患者に対して好ましい範囲よりも低いものである。抗−脂肪血活性を伴ったHMGCoA還元酵素阻害剤の推奨される用量に関するさらに具体的な情報については、Physicians' Desk reference、上記を参照のこと。

0092

もう1つの態様では、本発明は、ステロール調節要素結合タンパク質−1(SREBP−1)のエフェクターを検出する方法を提供する。1つの実施態様では、発明は:
a)SREBP−1を発現することができる細胞集団を提供する、
b)SREBP−1の成熟を誘導するのに十分な量でエフェクターの候補を細胞に接触させる、
c)培地中で細胞を培養する、及び、
d)SREBP−1のエフェクターであることを示す、SREBP−1の成熟を検出する工程を包含する。

0093

本発明の方法で使用するのに例示となるエフェクターには、例えば、腫瘍壊死因子(TNF−α)、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、cpp32、又はコレステロールのような、実施例及び図19に具体的に記載されたものが挙げられる。図25も参照のこと。

0094

本発明は、LDL受容体生合成のエフェクターを検出する方法も包含する。1つの実施態様では、方法は:
a)セラミドに反応性であり、SREBP−1を発現することができる細胞集団を提供する、
b)SREBP−1の成熟を誘導するのに十分な量でエフェクターの候補を細胞に接触させる、
c)培地中で細胞を培養する、及び、
d)LDL受容体のエフェクターであることを示す、LDL受容体の生合成を検出する工程を包含する。

0095

本発明の方法の1つの実施態様では、LDL受容体の例示となるエフェクターの候補は、腫瘍壊死因子(TNF−α)、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、cpp32、又はコレステロールである。

0096

本発明によって、哺乳類においてコレステロール関連疾患を治療するためのSREBP−1のエフェクターの治療能力を測定する方法も提供される。1つの実施態様では、その方法は:
a)SREBP−1を発現することができる細胞集団を提供する、
b)SREBP−1の成熟を誘導するのに十分な量で化合物の候補を細胞に接触させる、
c)培地中で細胞を培養する、及び
d)疾患を治療することにおいてエフェクターの治療能力を示す、SREBP−1の成熟を検出する工程を包含する。

0097

本発明はまた、哺乳類においてコレステロール関連疾患を治療するために本明細書で開示される抗脂血剤のいずれか1つの治療能力を測定する方法を提供する。1つの実施態様では、その方法は:
a)SREBP−1を発現することができる細胞集団を提供する、
b)SREBP−1の成熟を誘導するのに十分な量で抗脂血剤を細胞に接触させる、
c)培地中で細胞を培養する、及び
d)疾患を治療することにおいて抗脂血剤の治療能力を示す、SREBP−1の成熟を検出する工程を包含する。

0098

また、本明細書では、動物モデルとしてワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ又はアポリポタンパク質陰性マウスを用いて、本明細書で開示される1又はそれより多くの抗脂血剤の治療能力を測定する方法が提供される。1つの実施態様では、その方法は:
a)標準コレステロールアッセイで測定されるとき、少なくとも約10〜20%血清コレステロールのレベルを下げるのに十分な量で、ウサギ又はマウスに抗脂血剤の少なくとも1つを投与すること;及び
b)コレステロール関連疾患を治療するための抗脂血剤の治療能力を示すものとして、ウサギ又はマウスにおける血清コレステロールの減少を検出することを包含する。

0099

本発明の方法は、任意で、SREBP−1のエフェクターを示すものとしてLDL受容体活性をモニターすることを包含することができる。本実施態様では、好適に受容体活性をモニターすることができ、所望であれば、1つ又は標準戦略の組合せによってそれを定量することができる。例えば、LDL受容体活性をモニターするために、特にLDL受容体レベルにおける増加又は低下を検出するために種々の具体的な方法が報告されている。Brown, M.S. and Goldstein, J.L (1993年)上記及び数種の免疫的並びに分子的アプローチに関してその中で引用されている参考文献を参照のこと。好ましい方法は本明細書で開示される標準LDL受容体ノーザンブロットアッセイである。

0100

本発明の方法で使用するのに好適な細胞は、以下に続く実施例で記載される。

0101

SREBP−1を包含し、本明細書で開示される標準アッセイで測定されるとき、SREBP−1の成熟が可能である細胞が好ましい。さらに好ましいのは、以下の実施例で提供されるヒト肝細胞のような、細胞内スフィンゴ脂質、特にセラミド又は関連する化合物における増減に反応性の細胞である。

0102

本発明の方法と共に使用するのに好適なエフェクター又は候補化合物は、本明細書で開示される具体的な化合物のようなもの、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)又はその有効な断片;スフィンゴミエリン、セラミド、cpp32又はコレステロールである。例示となる中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)は、SEQID NO:1又はその相補物で示される配列に対して少なくとも70%、80%又は90%の配列同一性を有する配列によってコードされている。別の方法としては、中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)の有効な断片は、SEQ ID NO:1又はその相補物のヌクレオチド862〜1414に対して少なくとも70%、80%又は90%の配列同一性を有する配列を包含することができる。

0103

抗脂血剤は、その化合物(例えばセラミド)と同様に実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、薬剤は少なくとも90〜95%の均質性(w/w)で存在するであろう。薬学上、臨床上及び研究上の多数の適用には、少なくとも98〜99%の均質性(w/w)を有する抗脂血剤が最も好ましい。いったん実質的に精製されると、薬剤は治療用途として実質的に汚染物がゼロとなるべきである。いったん部分的に又は実質的に純粋に精製されれば、治療用に、又は本明細書で開示されるin vitro又はin vivoの好ましいアッセイを行うのに薬剤を使用することができる。クロマトグラフィ及びゲル電気泳動のような種々の標準法によって実質的な純度を決定することができる。

0104

以下の実施例1〜8は、ステロールの存在に関係なくTNF−αがSREBP−1のタンパク質分解を誘導する能力があることを例示する。外部から供給されたスフィンゴミエリナーゼ及びセラミドも時間及び用量依存的にSREBP−1のタンパク質分解を誘導することができる。SREBP−1の成熟の反応動態は、TNF−αによる中性スフィンゴミエリナーゼの活性化の速度に一致する。 さらに、抗N−SMase抗体によってSREBP−1の成熟を阻害することができるということは、中性スフィンゴミエリナーゼはTNF−αが誘導する、ステロールに無関係のSREBP−1の切断に必要であることを示している。ステロールに無関係なSREBP−1タンパク質分解の産物は核への転移が可能であり、ステロール調節要素に結合する。

0105

本明細書で記述した文献はすべて参考にされて本明細書に組み入れられている。

0106

以下の実施例を含め、本開示を通して、必要に応じて以下の略語を使用する:N−SMase、中性スフィンゴミエリナーゼ;LDLr、低密度リポタンパク質受容体;SREBP−1、ステロール調節要素結合タンパク質−1。数字の付いた引用は、以下に数字の順に掲げる。

0107

実施例1:中性スフィンゴミエリナーゼ活性に対するTNF−αの影響

0108

TNF−αの添加と共に中性スフィンゴミエリナーゼの活性は急速に増加した。図1を参照のこと。TNF−αを細胞に添加した後15分間で最大2.5倍の活性の増加が認められた。N−SMaseの活性は1時間以内に徐々に対照レベルまで戻り、急速な活性の立ち上がりとは対照的であり、観察された非対称性の反応動態に反映している。

0109

図1は中性スフィンゴミエリナーゼ活性におけるTNF−αの影響を示しており、以下のようにさらに詳細に説明される:集密的に培養したHH−25細胞をPBSにて1回洗浄し、TNF−α(10ng/ml)の添加に先だって30分間、血清を含まない培地中でインキュベートした。示されている時間で、細胞をPBS中に回収し、沈殿物にして凍結した。続いて、材料及び方法に記載するように細胞を溶解した。記載されるようにN−SMaseのアッセイは2つ1組で行った。エラーバーは平均からの±1標準偏差を表す。

0110

実施例2:SREBP−1タンパク質分解の反応動態

0111

TNF−αに反応した、ステロールに無関係なSREBP−1の成熟は、TNF−αが誘導したN−SMaseの活性化の反応動態に密接に並行していた。成熟型SREBP−1の質量は、TNF−αとのインキュベート5分後で2倍、15分後で3倍に増加することが見い出された。図2を参照のこと。成熟型SREBP−1の量は1時間以内に対照のレベルに戻った。EGF又はPDGFによる処理ではこの効果は再現できなかった。成熟SREBP−1レベルの増加には、SREBP−1前駆体に相当するバンドの強度における付随した低下を伴っていた。図3を参照のこと。60分後、有意に少なくなったSREBP−1前駆体が見られた。

0112

成熟型SREBP−1の観察された増加と前駆型SREBP−1の付随する低下を単一の変数に組み入れるために、前駆体SREBP−1対成熟型の比をプロットした。図3を参照のこと。TNF−αを培地に添加した45分後に、前駆体と成熟型の比は最大1.5倍低下した。前駆体と成熟型の比の低下は、処理してから最初の30分間ではさらに顕著だった。これもまた、TNF−αが誘導したN−SMaseの活性化の反応動態に一致している。

0113

原形質膜のスフィンゴミエリナーゼが、SREBP−1のタンパク質分解を導くシグナル伝達経路に関与している可能性を探求するために、外から供給された細菌由来のスフィンゴミエリナーゼで細胞を処理した。スフィンゴミエリナーゼは、前駆体SREBP−1と成熟型SREBP−1の相対量に劇的な変化を誘導した。図2及び図3に見られるように、処理15分後、成熟型SREBP−1レベルで2.5倍の増加が認められた。TNF−αとは異なって、スフィンゴミエリナーゼにより誘導された成熟型SREBP−1の増加は60分後も持続した。

0114

スフィンゴミエリナーゼも前駆体SREBP−1のレベルを下げることができた。図2及び図3を参照のこと。精製したヒト組換えスフィンゴミエリナーゼによる処理も同様の結果を生じた。

0115

N−SMaseのシグナル伝達能の大半は、その脂質セカンドメッセンジャーであるセラミドを生成する能力に帰する。従って、SREBP−1の成熟を誘導するために、細胞浸透性セラミド類縁体であるC2−セラミド(N−アセチルスフィンゴシン)の能力を調べた。C2−セラミドもまた、TNF−α又はスフィンゴミエリナーゼで観察されたよりも大きく、ステロールには無関係にSREBP−1の成熟を誘導する。処理後30分で、C2−セラミドは成熟型SREBP−1のレベルを4倍高めた。図2及び図3を参照のこと。スフィンゴミエリナーゼ処理で観察された成熟型SREBP−1レベルの持続した上昇は、C2−セラミド処理でも同様であった。成熟型SREBP−1における増加はウシの脳セラミドの添加で再現されたが、C−2ジヒドロセラミド、PL−A2又はリン脂質D処理では誘導できなかった。

0116

この実施例で提示されたSREBP−1成熟の反応動態は、SREBP−1のタンパク質分解が、アポトーシスを受けている細胞にコレステロールを提供することに関与する早期事象であることを示唆している。しかしながら、本試験で使用したHH−25ヒト肝細胞株ではアポトーシスの証拠はなかった。理論に束縛されることを望まなければ、肝細胞におけるステロールに無関係なSREBP−1成熟の誘導は、アポトーシスが誘導されることを必要としない生理的過程であると考えられる。代替的には、細胞がアポトーシスに向かう前に2つの経路が分岐する可能性があり、ステロールに無関係なSREBP−1のタンパク質分解がアポトーシスの誘導とは無関係に採用される様式が示唆される。

0117

ヒト肝細胞で観察されたステロールに無関係なSREBP−1の切断は、TNF−αが誘導するN−SMaseの活性化によって生成されるセラミドにより起きる。この現象は、N−SMase及び又はC2−セラミドの肝細胞への外からの添加によって再構築される可能性がある。

0118

図2図6は、SREBP−1成熟の反応動態におけるTNF−α、スフィンゴミエリナーゼ及びC2−セラミドの影響を例示している。図2図6は、以下のようにさらに詳細に説明される:実験の前24時間、1μg/mlの25−ヒドロキシコレステロール及び15μg/mlのコレステロールを添加した培地中で細胞を維持した。材料と方法に記載するように示された時間、細胞を処理した。次いでPBS中に細胞を回収し、沈殿物として凍結した。記載されたように、溶解及び核分画を行った。7.5%ポリアクリルアミドゲル上で核分画(50μgのタンパク質)を電気泳動してPVDF膜に移した。記載されたようにウエスタンブロットを行った。デンシトメータによってバンドの強度を定量した。誤差バーは平均からの±1標準誤差を表す。図2)成熟型SREBP−1の増加により測定されるときのSREBP−1成熟の反応動態をプロットしている。増加倍率は、各時点で相当する対照の値と比較することにより算出した(TNF−αは斜線棒で表し、細菌性スフィンゴミエリナーゼは明るい灰色で示し、C−2セラミドは暗い棒で表す)。図3)TNF−α(10ng/ml)で細胞を処理し、上記で記載したように調製した。前駆体SREBP−1及び成熟型SREBP−1に相当するバンドを定量してその比をプロットした。図4〜6)数値データが由来する代表的なウエスタンブロット。インキュベート時間は上に示し、全条件に適用される。膜をフィルムに15秒間暴露した。P及びMはそれぞれ前駆体SREBP−1及び成熟型SREBP−1を示す。

0119

実施例3:肝細胞のアポトーシスにおけるTNF−α、スフィンゴミエリナーゼ及びC2−セラミドの影響

0120

観察されたSREBP−1の成熟がアポトーシスによって誘導されるタンパク質分解というさらに一般的な現象に対する作為でないことを立証するために、我々は、DNAラダーアッセイを行った。アポトーシスを受けている細胞に特徴的な160塩基対のDNAラダーは試料のいずれにも観察されなかった。

0121

TNF−α、C2−セラミド及びスフィンゴミエリナーゼがアポトーシスを誘導しなかったということは、肝細胞におけるSREBP−1の成熟は、アポトーシスによって誘導されるタンパク質分解というさらに一般的な現象の一部ではないことを示している。

0122

実施例4:SREBP−1の成熟におけるTNF−α、スフィンゴミエリナーゼ及びC2−セラミドの濃度の影響

0123

TNF−αが誘導したSREBP−1成熟の程度は、濃度によって感知できるほど変化しなかった。最大の効果は10ng/mlのTNF−αで認められた。図7〜9を参照のこと。250ミリ単位のスフィンゴミエリナーゼ活性は、前駆体対成熟型の比で80%の低下を誘導した。1μMほどの少ない量のC2−セラミドが最大81%の効果を生じるのに有効であった。しかしながら、最大の効果は50Mの濃度のC2セラミドで得られた。図7〜9を参照のこと。

0124

図7〜9は、SREBP−1の成熟におけるTNF−α、スフィンゴミエリナーゼ及びC2−セラミドの濃度の影響を示す。図7〜9は以下のようにさらに詳細に説明される。示された濃度にてTNF−α、スフィンゴミエリナーゼ及びC2−セラミドのいずれかで細胞を処理した。核沈殿物を調製して電気泳動を行った(50μgのタンパク質)。前駆体及び成熟型のSREBP−1に相当するバンドを定量した。前駆体対成熟型の比を単一対照に対して標準化して比較を円滑にした。対照の比は任意に1という値を割り振った。スフィンゴミエリナーゼ1単位は37℃にて1分当り1.0μモルのスフィンゴミエリンを加水分解する。図7(μg/mlのTNF−α);図8(ミリ単位のスフィンゴミエリナーゼ);図9(ミリMのC2−セラミド)

0125

実施例5:TNF−αが介在するSREBP−1の成熟に対する抗N−SMase抗体の影響

0126

抗N−SMase抗体が利用できたので、我々はN−SMaseの活性化に無関係にこの経路におけるTNF−αの効果を調べることができた(10)。希釈倍率1:200にてポリクローナルの抗N−SMase抗体はTNF−α誘導のSREBP−1の成熟を完全に阻害した。図10を参照のこと。TNF−α誘導のSREBP−1の成熟の抑制は、抗体の希釈を増やすことによって解除された。同じ希釈倍率での免疫前の血清との予備インキュベートでは感知されるほどの影響はなかった。

0127

本実施例は、抗N−SMase抗体との事前のインキュベートによってTNF−α誘導のSREBP−1の成熟が効果的に阻止されることを示す。免疫前の血清による処理では阻害は認められず、阻害は抗体の希釈を高めることによって解除された。コレステロールエステル合成におけるTNF−α誘導の増加、[12
5]I−LDL結合におけるN−SMase誘導の増加、ヒト線維芽細胞における取り込みと分解を阻害する抗体の能力を示すようなほかの試験によっても、かかる知見は確認される(15、16)。

0128

図10は、TNF−αが誘導するSREBP−1の成熟における抗N−SMase抗体の影響を示す。図10は以下のようにさらに詳細に説明される。実験の前24時間、1μg/mlの25−ヒドロキシコレステロール及び15μg/mlのコレステロールを添加した培地中で細胞を維持した。血清を含まない培地に細胞を15分間移し、次いで、TNF−αを添加する前30分間、示された希釈で抗N−SMase抗体又は免疫前のウサギの血清と共にインキュベートした。次いで記載されたように、細胞を回収し、沈殿物として、溶解した。7.5%ポリアクリルアミドゲル上で試料を電気泳動してPVDF膜に移した。記載されたようにバンドを視覚化した。フィルムを15秒間感光した。

0129

実施例6:SREBP−1の細胞内局在におけるTNF−α、C2−セラミド及びスフィンゴミエリナーゼの影響

0130

TNF−α、C2−セラミド又はスフィンゴミエリナーゼによって生成されたSREBP−1の断片が核移行できるかどうかを確定するために、免疫蛍光試験を実行した。以前の免疫蛍光試験は前駆体と成熟型のSREBP−1の過剰発現を基にしていた(14)。SREBP−1のDNA結合ドメインに対するポリクローナル抗体で処理した細胞及び処理しない細胞において我々は、内因性SREBP−1を視覚化することができた。DNA結合ドメインは前駆体及び成熟型に共通なので、内因性SREBP−1の全体としての分布を調べることは可能だった。

0131

TNF−α、C2−セラミド及びスフィンゴミエリナーゼはすべてSREBP−1の細胞内局在の変化を誘導することができる。図11を参照のこと。無処理の細胞は、細胞体をとおして一様なパターンを示す。このことは前駆体SREBP−1の細胞内の膜への局在と一致する(14)。しかしながら、TNF−α、C2−セラミド又はスフィンゴミエリナーゼで処理した細胞は、核の染色の増加及び核外染色の低下を示す。図12〜14を参照のこと。SREBP−1の細胞内局在の迅速な変化は、2つの型の間の前駆体/産物の関係に一致し、処理により生成されたSREBP−1断片が核移行の能力を持つという追加の証拠を提供する。

0132

図11〜14はSREBP−1の間接免疫蛍光を示す。図11〜14は以下のようにさらに詳細に考察される。前駆体と成熟型の両方に共通であるDNA結合ドメインのN末端に対するポリクローナルのウサギ抗体でSREBP−1を視覚化した。実験の前24時間、1μg/mlの25−ヒドロキシコレステロール及び15μg/mlのコレステロールを添加した培地中で細胞を維持した。記載されたように免疫蛍光法を行った。拡大倍率はすべて40倍であり、写真はすべて、処理開始後30分で固定された試料から得た。図11)対照細胞、図12)TNF−α(10ng/ml)で処理した細胞、図13)スフィンゴミエリナーゼ(100ミリ単位で処理した細胞)、図14)C2−セラミド(10μM)で処理した細胞。

0133

実施例7:電気泳動移動度シフトアッセイ

0134

成熟型SREBP−1断片がさらにコンセンサス配列に結合することができることを明らかにするために、電気泳動移動度シフトアッセイを実行した。TNF−α処理の後、時間と共に電気泳動上で遅れたプローブの量が増加する。図15を参照のこと。この過程の反応動態は、N−SMaseの活性化に一致した。結合したプローブの量はスフィンゴミエリナーゼ及びセラミド処理と共に増加する。予想どおり、C2−セラミドは、TNF−α又はスフィンゴミエリナーゼよりも迅速な、活性型の核SREBP−1の蓄積を誘導する。図15〜17を参照のこと。SREBPのDNA結合ドメインに対する抗体は、結合についてオリゴヌクレオチドのプローブとうまく競合する。図18を参照のこと。プローブの結合は、無関係なオリゴヌクレオチドでは滴定できないが、非放射性競合プローブの添加によって低下する。

0135

図15〜18は電気泳動移動度シフトアッセイを示す。図15〜18は以下のようにさらに詳細に説明される。ステロールを補完した培地中で細胞を維持した。材料と方法に記載するように、核沈殿物を調製してアッセイを行った。成熟型SREBP−1によってすでに結合しているプローブは『結合型』として示す。結合していないプローブは『遊離型』として示す。(図15)TNF−α(10ng/ml)、(図16)スフィンゴミエリナーゼ(100ミリ単位)及び(図17)C2−セラミド(10M)での処理に反応したSREBP−1のプローブへの結合の反応動態(分で)(図18)。TNF−α(10ng/ml)、スフィンゴミエリナーゼ(100ミリ単位)又はC2−セラミド(10M)のいずれかで細胞を15分間処理した。次いで、SREBP−1のDNA結合ドメインに対する抗体によってスーパーシフトアッセイを行った。抗体の存在及び非存在はそれぞれ(+)及び(−)によって示す。免疫前のIgGを対照として用いた。

0136

図15〜18におけるゲル移動度シフト実験は、TNF−α、N−SMase及びC2−セラミドのすべてが肝細胞でSREBP−1のレベルを誘導することを明瞭に示している。TNF−αは培養したヒト線維芽細胞においてステロールの代謝を誘導し(15)、LDL受容体を誘導する(16、17)することが知られている。本データは、実際、TNF−αがヒト肝細胞においてLDL受容体のmRNAレベルを誘導することを示す。TNF−αが誘導する成熟型SREBP−1の増加には、LDL受容体の増加及びステロール代謝が伴うというのが1つの結果である。

0137

実施例8:培養ヒト肝細胞におけるステロール調節要素結合タンパク質−1の成熟及び低密度リポタンパク質受容体発現に対する中性スフィンゴミエリナーゼ(N−SMase)及び組換えN−SMaseの過剰発現の影響

0138

本実施例は、2つの別のプラスミドDNAを用いた(PHH−I、N−SMaseのcDNAにおける全ヌクレオチド配列を表す、及びPHH−II、ヌクレオチド配列862〜1414を表す)N−SMaseの過剰発現が、ヒト肝細胞株HH−11におけるSREBP−1の成熟及びLDL受容体のmRNA発現を高めるかどうかを解決するために行われた。のプラスミドcDNA(PSV−SPOT)を導入した細胞を対照とし、SREBP−1の成熟を誘導することが前に明らかにされているC−2セラミドと共にインキュベートした細胞を陽性対照とした。

0139

つまり、抗生物質を含まない、10%の透析した熱非働化ウシ胎児血清を含有する100mm2の無菌培地中にヒト肝細胞(1x104個)を播いた。24時間後培地を新鮮な9mlの血清を含まない培地に取り換えた。37℃にて30分間のインキュベート後、1mlのCaCl2溶液(HEPES緩衝液及びHEPES緩衝液pH6.95中の等容量の0.25〜2.5MのCaCl2溶液と混合した)中の5〜40μgのプラスミドDNA。穏かに混合した後、細胞のインキュベートを37℃にて5〜24時間継続した。遺伝子導入反応は、培地を取り除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄することにより停止した。次に、新鮮な培地を補完した培地を加え、さらに24時間インキュベートを継続して、適当な緩衝液に細胞を回収し、遠心してさらに分析するまで凍結して保存した。細胞沈殿物をホモジネートし、好適な部分試料を、以下及び上記実施例1〜7に記載のウエスタンブロット分析にかけた。上記のように遺伝子移入した別のバッチの細胞から全RNAを単離し、32Pで標識したLDL受容体コンセンサス配列を用いたノーザン解析を行った。オートラジオグラフ現像して写真撮影した。

0140

0.2μg/mlのPHHI又はPHHIIで遺伝子移入した細胞は、偽のcDNAを移入した細胞に比べてN−SMase活性で2倍の増加を示した。これには、ヒト肝細胞におけるSREBP−1の成熟でのPHHI及びPHHIIの濃度依存性の増加が伴っていた。図19を参照のこと。レーン3〜6で見られるように、ディシュ当り5、10、20、40μgのPHHIプラスミドで遺伝子移入した細胞は、偽のcDNAを移入した細胞に比べて、緩やかなしかし顕著なSREBP−1の成熟における増加を生じた(図19、レーン1)。それに対して、ディッシュ当り20μgのPHHIIプラスミドDNAで遺伝子移入した細胞(図19のレーン9)ではSREBP−1の成熟で顕著な増加が注目されたが、高い濃度では戻っていた。上記実施例1〜7から予想したように、C−2セラミド(μM)と共にインキュベートした細胞はSREBP−1の成熟を顕著に増加させた(図19のレーン2)。追加の実験で、我々は8時間から24時間の遺伝子移入の時間の増加が肝細胞においてSREBP−1の成熟を減らすことを認めた。その上、CaCl2の2.5Mから0.25Mの濃度の低下は有効ではなかった。

0141

ノーザンゲル解析は、偽のcDNAで遺伝子移入した細胞(図20、レーン1)に比べて、PHHI及びPHHII(それぞれ図20のレーン2及び3)による遺伝子移入はLDL受容体mRNAのレベルを有意に高めることを示した。

0142

もう1つの実験では、精製した細菌性の組換えN−SMaseと共に肝細胞をインキュベートした。組換えN−SMaseを作製し、使用する好ましい方法は、今や米国特許第5,919,687号として発行されている、米国特許同時係属出願、出願番号第08/774,104号に記載されている。SREBP−1に対する抗体を用いて、該N−SMaseでウエスタン免疫ブロット分析を行った。図21に示すように、C−2セラミドと共にインキュベートした細胞は、SREBP−1の成熟を顕著に高めた(レーン1)。比較においては、N−SMaseは、SREBP−1の成熟で濃度依存性の増加を発揮した(レーン2、3、4、5はそれぞれ0.4、0.8、2及び4μg/mlのrN−SMaseを表す)。

0143

本実施例は、N−SMaseの過剰発現又は肝細胞にN−SMaseを与えることは、SREBP−1の成熟を刺激し、その結果、LDL受容体のmRNAレベルを高めることを示している。

0144

上記実施例1〜8は、それによってステロール非依存性の方法でSREBP−1の成熟が影響を被る新規の経路を強調している。TNF−αは、ヒト肝細胞においてステロール非依存性にSREBP−1の成熟を誘導する能力があることが見い出された。このような知見は、それらがEGF又はPDGFで再現できないので、増殖因子に対する一般的な反応ではない。TNF−αに反応したSREBP−1の成熟、転移及びSRE結合活性は、N−SMase活性化の反応動態に密接に平行する。SREBP−1の成熟におけるTNF−αの効果は、細菌性又はヒトのスフィンゴミエリナーゼ、C2—セラミドの外部からの供給によって再構築されうるが、ジヒドロセラミド、PL−A2又はPL−Dでは再現できなかった。

0145

特に、実施例1〜7は、C2—セラミド、水溶性セラミド類縁体又は細菌性スフィンゴミエリナーゼの添加がSREBP−1の成熟におけるTNF−αの効果を模倣することを示している。C2−セラミドとスフィンゴミエリナーゼはTNF−αよりも強くSREBP−1の成熟を誘導した。単に理論にしばられるのでなければ、この知見は、外因性のセラミド又はスフィンゴミエリナーゼによって効果的に迂回されるセラミド生成の上流の調節事象の存在を反映している可能性がある。また、TNF−α処理で見られた明瞭な用量依存性の欠如は、TNF−α受容体の飽和可能な結合又はTNF−α受容体のシグナル伝達能を低減する内部調節事象に起因する可能性がある。

0146

本データ及び考察は、TNF−αがSREBP−1のタンパク質分解を開始するモデルを示している。1又はそれより多くのその細胞表面受容体へのTNF−αの結合及びそうしてN−SMaseの活性化を促進することを示すモデル(図19)。N−SMaseは膜のスフィンゴミエリンをセラミドとホスホコリンに加水分解する。セラミドは代わって、プロテアーゼ、おそらく、SREBP−1の成熟に介在するCPP32を活性化する。モデルに従って、成熟型SREBP−1は示されるように次いで核に移行し、上流のステロール調節要素と共に遺伝子の転写を作動させる。

0147

図19に例示されたモデルは、SREBP−1の成熟を抑制することが予測される、上昇した細胞質ステロールの存在下でステロールの恒常性がどのように生じうるのかを明らかにしている。コレステロールの恒常性に中性スフィンゴミエリナーゼが加わることによって得られる利点の1つは、原形質膜のコレステロールの移動を介してコレステロール不足短期の解決を提供することができ、SREBP−1の成熟を促進することによって長期の補完メカニズムを助長することができることである。

0148

図19で示されるモデルは、TNF−αは、ステロールの存在に関係なく、SREBP−1のタンパク質分解を誘導できることを示している。外から供給されたスフィンゴミエリナーゼ及びセラミドも時間及び用量依存的にSREBP−1のタンパク質分解を誘導することができる。SREBP−1成熟の反応動態は、TNF−αによるスフィンゴミエリナーゼの活性化と一致する。さらにヒト組換えN−SMaseも時間及び用量依存性のSREBP−1成熟の誘導を誘起する。さらに、抗N−SMase抗体はSREBP−1の成熟を阻止する。このような知見は、TNF−αが誘導する、ステロール非依存性のSREBP−1の切断には中性スフィンゴミエリナーゼが必要であることを示している。

0149

本実施例及び考察によって、SREBP−1の成熟を招くTNF−αにより開始されるシグナル伝達経路においてN−SMaseが同定され、セラミドが用いられるセカンドメッセンジャーであるという証拠が提供されている。また、コレステロールの恒常性の調節におけるTNF−αの重要な役割が示されている。

0150

本知見は以下のように要約される。SREBP−1成熟のメディエータとしてのTNF−αの役割がヒト肝細胞において調べられた。

0151

上記実施例及び考察における1つの重要な態様は、セラミドは、両者共にSREBP−1の成熟を抑制することが知られているコレステロール及び25−ヒドロキシコレステロールの存在下でさえ、SREBP−1の成熟を刺激したということである。このことは、セラミドが介在するSREBP−1の成熟は、新規の、それによってコレステロールの恒常性が調節される、ステロール非依存性のメカニズムであることを示している。

0152

上記実施例1〜8では必要に応じて以下の材料及び方法を用いた。

0153

1. 材料:HH−25と名付けられたヒト肝細胞の細胞株は、正常なヒト組織から調製された(18)。アルファ改変最小必須培地はメディテック(VA、ハーンドン)から購入した。ウシ胎児血清は、ユタ州ソルトレークティハイクローンから購入した。F10培地及びインスリントランスフェリンセリン添加剤ギブコBRL(MD、ゲーサーズバーグ)から購入した。ヒト組換えEGF、PDGF及びTNF−αは、アップステートバイオテクノロジー(NY、レークプラシッド)から購入した。C2−セラミド(N−アセチルスフィンゴシン)は、マトレヤ(PA、プレーザントギャップ)から入手した。[1
4C]−スフィンゴミエリン(比活性、50mCi/mmol)はアメリカン・ラジオベルドケミカルズ(MO、セントルイス)から入手した。抗SREBP−1抗体は、サンクルーズ・バイオテクノロジー(CA、サンタクルーズ)から購入した。ストレプトマイセス種由来のスフィンゴミエリナーゼ及びその他の試薬はすべてシグマから入手した。

0154

2.細胞培養:100単位/mlのペニシリン、100g/mlのストレプトマイシン、10g/mlのインスリン、0.1μMのセリン、5.5μg/mlのトランスフェリン、0.5μg/mlのリノレン酸及び10%のウシ胎児血清を添加したアルファ最少必須培地(培地A)にてHH−25細胞を増殖させた。TNF−α、C2−セラミド又はスフィンゴミエリナーゼでの処理を開始するのに先だって30〜60分間、血清を含まないF10培地にて細胞をインキュベートした。

0155

3.細胞の分画:処理後、5mlのPBSにて細胞を洗浄し、4℃にて1500xgで10分間により沈殿物とした。沈殿物を−70℃にて保存し、0.5mlの緩衝液A(10mMのHEESpH7.4、5mMのEDTA、0.25mMのEGTA、50mMのNaF、7mMのβメルカプトエタノール、0.35Mのスクロース、0.1%のNP40及びプロテアーゼ阻害剤、1mMのPMSF、2μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのリューペプチン及び5μg/mlのペプスタチン)中で溶解した。4℃にて12,000xgで15分間、溶解物を遠心して核分画を調製した。この試料のタンパク質濃度は、Lowry et al(19)の方法によって測定した。

0156

4.中性スフィンゴミエリナーゼアッセイ:示された時間間隔にてTNF−αで刺激した後、5mlのPBSで細胞を洗浄して回収した。沈殿物を−70℃に保存し、0.5mlの緩衝液B(トリスHCl pH7.4、0.1%のトリトンX−100、1mMのEDTA及びプロテアーゼ阻害剤)中に再浮遊した。超音波破壊プローブを用いて細胞浮遊液に3回(3秒間ずつ)超音波を当て、4℃にて5分間500xgで遠心した。酵素源として上清を用いた。

0157

50mMのトリスHCl、pH7.4、0.1%のトリトンX−100、0.1mgのBSA、5mMのMgCl及び50モルの[14C]スフィンゴミエリン(12,000dpm)から成る緩衝液中にて中性スフィンゴミエリナーゼについて100μgのタンパク質をアッセイした。37℃にて1.5時間アッセイをインキュベートし、10%のTCAを加えることにより停止した。析出物を遠心し(4℃にて1000xgで20分間)、1mlの無水ジエチルエーテルで1mlの上清を抽出した。液体シンチレーションカウントのために0.5mlの水性層を除いた。

0158

5.免疫ブロット:7.5%のポリアクリルアミドゲル上でのゲル電気泳動によって50μgの核タンパク質を分離した。高い範囲の分子量マーカー(NY、ニューヨークのバイオラッド、製品番号161−0303)でゲルを補正し、ポリビニルジフオリドPVDF)膜に移して、クマシー染色にて視覚化した。製造元指示書に従って0.5μg/mlで、SREBP−1に対するウサギのポリクローナル抗体を用いた。増強化発光ECL)ウエスタンブロット検出システムキットアマシャム)を用いて、ロバで作製した抗ウサギIgGに西ワサビペルオキシダーゼを結合したもので抗体を視覚化した。示された時間、PVDF膜をハイパーフィルムECL(アマシャム)に暴露した。SPARC IRCワークステーションに結合したPDIデンシトメータスキャナー(20J7型)で実行するデンシトメトリによって免疫ブロットを定量した。

0159

5.間接免疫蛍光法カバーグラス上で培養HH−25細胞を増殖させ、記載されたように処理した。処理後、1mMのMgCl2及び0.1mMのCaCl2を含有するPBS(溶液A)で5分間、細胞を3回洗浄した。溶液A中の3%パラホルムアルデヒドで10分間細胞を固定し、室温にて6分間、溶液A中の0.5%トリトンX−100で透過化した。次いで、溶液Aにて5分間、カバーグラスを3回洗浄した。

0160

一次抗体(抗SREBP−1)はPBS中で0.5mg/mlに希釈して用い、穏かに振盪しながら1時間適用した。上記のように細胞を洗浄し、製造元の指示書に従い、FITCを結合した抗ウサギIgG二次抗体を1/2時間適用した。カバーグラスを洗浄し、顕微鏡スライドに載せ、ツァイス・アキスオバート蛍光顕微鏡にて示された倍率で観察し、写真撮影した。

0161

6. DNAラダーアッセイ:SREBP−1の成熟試験で用いたのと同じ濃度にて、TNF−α、スフィンゴミエリナーゼ又はC2−セラミドのいずれかで細胞を処理した。次いで最小必須培地で細胞を2回洗浄し、培地Aにて6時間培養した。細胞を回収し、記載されたようにゲノムDNAを調製した(22)。ゲノムDNAを電気泳動して、臭化エチジウムで染色した。

0162

7.電気泳動移動度シフトアッセイ:以下のようにゲル移動度シフトアッセイを行った。各20μlの反応混合物は、結合緩衝液(10mMのHEPESpH7.5、0.5mMのスペルミジン、0.15mMのEDTA、10mMのジチオスレイトール、0.35mMのスクロース)中で8〜10μgの核タンパク質及びSREBP−1結合部位(14)を含有するα−[32P]標識25塩基対のオリゴヌクレオチドのプローブを含有していた。反応混合物を室温にて15分間インキュベートして、25mMのトリスホウ酸(pH8.0)、0.25mMのEDTA緩衝液中の6.5%ポリアクリルアミドゲル(49:0.6アクリルアミドビスアクリルアミド)上に直接載せた。実験の一部では、SREBPに特異的な血清又は免疫前の血清を反応混合物に加え、タンパク質−プローブ複合体組成を決定した。このような『スーパーシフト』アッセイについては、α−[32P]標識プローブを加える前に、1μlの免疫前血清又は等量の抗SREBP抗血清と共に、4℃にて30分インキュベートした。すべての実験で、室温にて200Vで2時間電気泳動することによってタンパク質を分離した。ゲルを乾燥し、増感紙とともにコダックXARフィルムに暴露した。3回の特定の実験で得られた核抽出物についてアッセイを反復し、写真画像解析によって評価して結果の再現性を確認した。
引用文
1) Goeddel, D.V., Aggarwal, B. B., Gray, P.W., Leung,D.W., Nedwin, G.E., Palladino, M.A., Patton, J.S., Pennica, D., Shepard, H.M., Sugarman, B.J. and Wong, G.H.W. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597-609.
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0163

本発明はその好ましい実施態様を引用して説明している。しかしながら、当業者が、本開示を考慮する際に、発明の精神及び範囲の中で、改変し、改善し得ることは十分理解されるであろう。

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