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技術 プロトン付加または酸性化された核酸および使用法

出願人 レイクウッド−アメディックス,インコーポレーテッド
発明者 デイル,ロデリック・エム・ケイアロウ,エイミーガットン,スティーヴン・エルトンプソン,テリー
出願日 1999年12月15日 (19年8ヶ月経過) 出願番号 2000-592299
公開日 2002年10月15日 (16年10ヶ月経過) 公開番号 2002-534433
状態 拒絶査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 糖類化合物 医薬品製剤 化粧料 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬
主要キーワード 消費品 分岐型炭化水素 殺菌性成分 組成体 アルカリ塩溶液 生物静力学的 公共空間 リステリン
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (1)

課題・解決手段

プロトン付加核酸細菌増殖阻害するという新規発見報告し、細菌感染処置または予防するための、ヒトを含む動物への投与用のヌクレアーゼ耐性および酸耐性プロトン付加/酸性化された核酸の調製法および治療使用を記載する。

概要

背景

概要

プロトン付加核酸細菌増殖阻害するという新規発見報告し、細菌感染処置または予防するための、ヒトを含む動物への投与用のヌクレアーゼ耐性および酸耐性プロトン付加/酸性化された核酸の調製法および治療使用を記載する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
3件

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請求項1

天然ヌクレオチドポリマー核酸骨格構造から修飾された核酸骨格構造を有するヌクレオチドポリマーと、前記ポリマー上の反応部位に導入された1つ以上の外来性プロトンとを含んでなる修飾核酸であって、前記核酸は37℃で約1〜約10のpHで少なくとも1時間のpH安定性を特徴とし、前記核酸は実質的に抗細菌活性を示す修飾核酸。

請求項2

天然ヌクレオチドモノマーの構造から修飾された構造を有するヌクレオチドモノマーと、前記モノマー上の反応部位に導入された1つ以上の外来性プロトンとを含んでなる修飾核酸であって、前記核酸は0.01〜7.0のpHで少なくとも1時間のpH安定性を特徴とし、前記核酸は実質的に抗細菌活性を示す修飾核酸。

請求項3

前記ポリマーの少なくとも一端またはその付近遮断化学修飾をさらに含んでなり、前記核酸は同じ数のヌクレオチドを有する天然ポリマーヌクレアーゼ耐性の少なくとも2倍のヌクレアーゼ耐性を有する請求項1または2の核酸。

請求項4

前記分子は約2〜約100ヌクレオチドを含んでなる請求項1の核酸。

請求項5

核酸分子はpH0.5〜7.0を有する請求項1、2または3の核酸分子。

請求項6

骨格構造は、ホスホジエステル結合ホスホトリエステル結合、ホスホルアミデート結合、シロキサン結合カーボネート結合カルボキシメチルエステル結合アセトアミド結合、カルバメート結合チオエーテル結合架橋ホスホルアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、モルホリノ、架橋ホスホロチオエート結合、スルホンヌクレオチド間結合、3’−3’結合、5’−2’結合、5’−5’結合、2’−デオキシエリトロペントフラノシル、2’−フルオロ、2’−O−アルキルヌクレオチド、2’−O−アルキル−n(O−アルキル)ヌクレオチド、モルホリノ結合、p−エトキシオリゴヌクレオチド、PNA結合、p−イソプロピルオリゴヌクレオチド、またはホスホルアミデートからなる群の1つ以上を含む請求項1、2または3の核酸。

請求項7

核酸は、病原体相補的な配列を有する請求項1または3の核酸。

請求項8

医薬的に許容される担体と、治療有効量の実質的に酸に耐性プロトン付加核酸とを含む医薬組成物

請求項9

特定の微生物細胞毒性である修飾核酸を産生する方法であって、a)微生物株からヌクレオチド配列を単離する工程と、b)単離した配列を複製する工程と、c)複製した配列を修飾して、単離ヌクレオチド配列と比べて、ヌクレアーゼ消化に対するより高い耐性およびpH可変性に対するより高い耐性を与る工程と、d)修飾配列を、ヌクレオチド配列を単離した微生物株と接触させる工程と、e)微生物の生存度に対する修飾ヌクレオチド配列の効果を決定する工程とを含んでなる方法。

請求項10

複数の異なるヌクレオチド配列に対して工程a)からe)を実施し、そして、微生物の生存度に対して最大の効果を有する修飾ヌクレオチド配列を同定することをさらに含んでなる請求項9の方法。

請求項11

請求項9または10の方法により得られる修飾オリゴヌクレオチド配列

請求項12

天然ヌクレオチドポリマーの核酸骨格構造から修飾された核酸骨格構造を有するヌクレオチドモノマーまたはヌクレオチドポリマーと、ポリマー上の反応部位(群)に導入された1つ以上の外来性プロトンと、美容的に適切な担体とを含んでなる局所皮膚組成物

請求項13

天然ヌクレオチドポリマーの核酸骨格構造から修飾された核酸骨格構造を有するヌクレオチドモノマーまたはヌクレオチドポリマーと、ポリマー上の反応部位(群)に導入された1つ以上の外来性プロトンと、担体とを含んでなる消毒溶液

請求項14

カルボン酸金属塩をさらに含む、請求項13の溶液

請求項15

請求項13の組成物コーティングを有する表面。

0001

(発明の分野)
本発明は、一般に、修飾核酸の分野、より特定すると抗生物質として使用する核酸に関する。
(発明の背景

0002

感染症関与する病原性細菌は、かつて、ペニシリンストレプトマイシンテトラサイクリン、およびその他などの一連の抗生物質の使用により制御できると考えられていた。しかし、抗生物質の多用が1950年代に始まって以来、より多くの細菌が進化して、1つ以上の抗生物質に耐性となってきた。多剤耐性株は、特に病院において、次第に一般的なものとなっている。

0003

現在、院内スタフィロコッカス感染は多剤耐性を示す。例えば、Archerら、1994、Antimicrob.Agents Chemother.38:2231〜2237参照。現時点では、大半のスタフィロコッカス株の死滅能を示す残りの抗生物質は、バンコマイシンである。しかし、バンコマイシンに耐性なスタフィロコッカスおよびエンテロコッカスの両方の株がすでに単離され、Zabranskyら、1995、J.Clin.Microbiol.33(4):791〜793により報告されている。さらに、エンテロコッカスからスタフィロコッカスへの耐性の移行が、以前に、Woodfordら、1995、J.Antimicrob.Chemother.35:179〜184により記述されている。ストレプトコッカスニューモニエは、米国での罹患および死亡頭の原因である(M.M.W.R.、1996年2月16日、第45巻、No.RR−1)。毎年、これらの細菌は3,000症例の髄膜炎、50,000症例の菌血症、500,000症例の肺炎、および7,000,000症例の中耳炎を引き起こす。致死率は、抗生物質療法にも関わらず、菌血症で40%以上、髄膜炎で55%以上である。過去に、ストレプトコッカス・ニューモニエは、一様に抗生物質に感受性であったが、抗生物質耐性株が出現し、いくつかの地域社会では蔓延してきている。

0004

さらに、抗生物質耐性は問題ではないが、特定の細菌が、従来の抗生物質を使用した処置に依然として難治性である場合もある。これは、食中毒および火のよく通っていない肉による死亡の原因物質である、エシェリヒアコリ0157:H7の場合である。米国農務省は、毎日10人が死亡し、さらに14,000人がこの細菌により病気になると推定している。残念なことに、従来の抗生物質は、この生物に対して完全に無効である。

0005

病原性細菌の抗生物質による処置の歴史は、循環的である。細菌は、極めて適合性のある生物であり、開発された各々の新規抗生物質について、耐性細菌株が抗生物質の多用により生じる。従って、次世代の抗生物質耐性細菌を駆除するために、新規抗生物質を製造する必要が常にある。伝統的な新規抗生物質の開発法は減速しており、過去2年間に、僅か1つの新規抗生物質がFDAにより認可されたのみである。さらに、Kristinsson(Microb.Drug Resistance 1(2):121(1995))によると、「耐性グラム陽性菌に対する活性をもつ新規クラスの抗生物質の兆しは全く見えない」。

0006

アンチセンス療法は、細胞での望まれない遺伝子発現を特異的に阻害する核酸を使用する。アンチセンス核酸を使用して、RNA、典型的にはメッセンジャーRNAハイブリッドし、RNaseHを活性化、またはリボソームまたはタンパク質の結合を物理的に遮断し、よってmRNA翻訳を防ぐことにより、その機能を阻害することができる。アンチセンス核酸はまた、触媒活性リボザイム)をもつRNAを含み、これは、標的RNA上の相補的配列に選択的に結合し、切断反応を媒介することにより物理的に標的を破壊できる。

0007

正しい位置でDNAに結合するアンチセンス核酸はまた、DNAがRNAに転写されるのを防ぐことができる。これらのアンチセンス核酸は、二本鎖DNAに結合し(三本鎖DNAを形成して)、よって遺伝子発現を阻害すると考えられている。

0008

核酸はまた、その作用形態が、DNAまたはRNA以外の分子、例えばタンパク質との相互作用の結果である、アプタマーとしての使用を見出した。

0009

核酸はまた、CGモチーフの存在に応答して、免疫系を刺激することが示されている(Yamamotoら、1994、Antisense Res.Devel.4:119〜122;Kriegら、1995、Nature 374:546〜549)。この刺激の機序は明らかでないが、アンチセンス機序には関与していないようである。

0010

内部化核酸の運命は、核酸療法の成功に重要であることが実証されている(Bennett、1993、Antisense Res.Devel.3:235〜241)。核酸の迅速な細胞内での分解は、その使用の障害であり得る。天然ホスホジエステル核酸の使用における主な問題の1つは、哺乳動物細胞または血清含有培養培地中でのヌクレアーゼによるその迅速な分解である(Cohen、1989、オリゴデオキシヌクレオチド:遺伝子発現のアンチセンス阻害剤、ボーカラトーンFLCRCプレス)。核酸の骨格の修飾は、様々な程度のヌクレアーゼ耐性を付与する多くの証拠がある。Hokeら、1991、Nucl.Acids.Res.19:5743は、ホスホジエステル骨格核酸を、完全に修飾したホスホロチオエート骨格核酸と、およびキメラホスホジエステルおよびホスホロチオエート骨格核酸と比較した。Hokeらは、ホスホロチオエート核酸は、ホスホジエステルまたはキメラ骨格核酸よりも45倍以下ゆっくりと分解したことを実証した。

0011

ヌクレアーゼ耐性骨格結合末端キャップしたキメラ核酸は分解に耐性であるという報告がある(Cohen、1989、オリゴデオキシヌクレオチド:遺伝子発現のアンチセンス阻害剤、ボーカラトーン、FL、CRCプレス)。しかし、Hokeらは、キャップした核酸は、細胞内エンドヌクレアーゼにより迅速に分解し、よって核酸をヌクレアーゼ耐性修飾でキャップしても、細胞における核酸の薬理活性持続するのに十分ではないであろうことを教義する。最後に、Hokeらは、核酸のキャッピングは、細胞培養液中のエキソヌクレアーゼからの保護を提供し得るが、細胞内エンドヌクレアーゼの作用は、核酸が細胞に侵入した場合に、これらのキャップした核酸を分解するのに十分であると結論している。

0012

核酸の治療使用に対する別の制限は、そのバイオアベイラビリティーの低さである。経口バイオアベイラビリティーは、腸における酸による分解、小腸における酵素的切断、小腸吸収の低さ、および肝初回通過効果により影響され得る(Hughesら、1995、Pharmaceutical Research 12:817)。Crookeは、齧歯類における非常にわずかな(<5%)核酸のバイオアベイラビリティーを報告した(S.Crooke、1997、アンチセンス核酸およびアンチセンスRNA:新規薬理および治療剤、B.Weiss編、CRCプレス、ボーカラトーン、FL、17項)。での胃液塩酸(HCl)の正常なpHは、1ないし2である(A.Goth、1974、医療薬理学原理および概念、C.V.Mosby Company、セントルイス、MO)。核酸は、酸によるDNAまたはRNA骨格の脱プリン化および切断に感受性である。10分間という短い時間、核酸を、室温でpH1〜2に曝露すると、脱プリン化が引き起こされる。

0013

現在までに抗生物質として核酸を使用する唯一努力は、特異的な細菌遺伝子にハイブリッドし、その発現を阻害し、よって細菌増殖を阻害することに標的化した、アンチセンス分子としてのその使用を含む。Lupskiら、米国特許第5,294,533号(’533特許)およびPCT国際公開第WO96/29399号参照。この方法は効果的であり得るが、使用の範囲において限定され、効果の強度およびアンチセンス分子の使用は、特定の標的化した生物または密接に関連した生物に限定される。

0014

従来の多くの抗生物質に耐性な細菌を含む、広範囲の細菌に対して効果的な新規なクラスの広域抗生物質が必要である。さらに、処置した宿主無毒性な広域抗生物質が必要である。
(発明の要約)

0015

本発明は、インビトロおよびインビボで、薬剤耐性および感受性細菌の両方に対して効果的な抗生物質である、プロトン付加酸性化された核酸を提供する。これらの修飾核酸は、核酸分子の具体的な配列または長さに関係なく、殺細菌剤および/または静細菌剤として効果的である。本発明の核酸は、プロトン付加/酸性化され、ヌクレアーゼ耐性骨格、酸耐性骨格を有し、およびその好ましい実施形態において、酸耐性骨格およびヌクレアーゼ耐性骨格の両方を有する。本発明の核酸は、プロトン付加/酸性化されると、水に溶かした場合に、pH7以下から約1まで、より好ましくはpH4.5以下から約1まで、さらにより好ましくはpH2以下から約1までのpHを与える。

0016

1つの実施形態において、本発明は、抗細菌剤としての、プロトン付加/酸性化された核酸の治療使用を提供する。特に、本発明のプロトン付加/酸性化された核酸は、全ての細菌種に対して効果的な抗細菌剤であり、ヒトおよび他の動物細菌感染を処置または予防するために医薬的にまたは美容的に使用できる。好ましい処置法は、細菌増殖を阻害または予防、細菌増殖の症状を軽減するに十分な量、または、細菌感染の処置に効果的な量の、プロトン付加/酸性化された核酸の動物への投与を含む。

0017

別の実施形態において、本発明は、ウイルス感染炎症疾患、癌、真菌感染等を含む疾患の処置または予防のための核酸の治療使用を提供し、ここでの前記核酸は、細菌感染を同時に予防または処置するためにさらにプロトン付加されている。

0018

本発明はさらに、動物、より好ましくはヒトを含む哺乳動物での細菌感染の処置用薬用組成物の調製のための、許容される医薬担体と共に、記載した抗細菌核酸の使用を提供する。

0019

本発明はさらに、許容される美容的担体と共に、局所的皮膚クリームでの記載した抗細菌核酸の使用を提供する。かかる局所的皮膚クリームは、軟化剤加湿剤、芳香剤等の添加剤を含み得る。

0020

本発明はさらに、記載した抗細菌核酸からなる消毒溶液を提供する。消毒剤は、その無毒性から、皮膚上での使用に適し得るか、または院内器具などの表面の消毒に使用し得る。

0021

本発明はまた、病原性細菌に対する静細菌効果または殺細菌効果を付与するための、核酸をプロトン付加/酸性化する数個の方法を提供する。得られたプロトン付加/酸性化された核酸は、細菌病原体により引き起こされた疾病に罹患した、ヒトを含む動物の処置に使用できる。

0022

本発明の目的は、臨床関連病原性細菌を含む、任意の細菌の増殖を阻害するために、プロトン付加/酸性化された核酸を使用することである。

0023

本発明の利点は、プロトン付加/酸性化された核酸の作用機序は、比較的非特異的のようであり、これによりそれらは、臨床関連病原性細菌を含む任意の細菌に対して効果的であることである。

0024

本発明の別の利点は、プロトン付加/酸性化された核酸は、修飾核酸で処置した対象(被検者)に無毒性であることである。

0025

さらなる利点は、プロトン付加/酸性化された核酸の抗細菌効力は、長さ依存的でも配列依存的でもないことである。

0026

本発明の特徴は、プロトン付加/酸性化された核酸が、細菌性病原体により引き起こされる様々な病気の処置に効果的であることである。

0027

本発明のこれらおよび他の目的、利点および特徴は、以下により完全に記載した核酸およびその使用の詳細を読めば、当業者には明らかとなろう。
(好ましい実施形態の詳細な説明)

0028

本発明は、記載した特定の方法論プロトコル、細胞系、動物種または属、作成物および試薬に限定されず、勿論、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書に使用した用語は、特定の実施形態を説明する目的ためだけのものであり、本発明の範囲を限定するとは捉えず、これは添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。

0029

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用したような、単数形の「a」、「an」、および「the」は、内容から明らかに他を示す場合以外、複数の対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「細菌」への言及は、複数の細菌種を含み、「オリゴヌクレオチド」は、複数のオリゴヌクレオチドおよび当業者には公知のその等価体を含み得る、等である。

0030

特記しない限り、本明細書に使用した全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の普通程度の技術的理解力を有する者には一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似または等価な任意の方法、装置および物質を、本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法、装置および物質をここでは記載する。

0031

本明細書に記載した全ての刊行物は、例えば、今回記載した発明と関連して使用し得る、刊行物に記載された、細胞系、作成物および方法論を説明および開示する目的のために、本明細書に参考として取込む。上記および文書全体を通じて議論した刊行物は、単に本出願の提出日より前に開示されたために提供される。本明細書のどの記載事項も、発明者は、前の発明により、かかる開示の日付を早める権利がないという承認とは捉えない。
(定義)

0032

本明細書では同義語として使用した「核酸」および「核酸分子」なる語は、ヌクレオチド、すなわち、リボヌクレオチドデオキシリボヌクレオチドまたは両方からなる分子を意味する。この語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドは、ポリマーの場合、5’から3’結合を介して共に接続している。しかし、結合は、例えば、5’から2’結合を含む核酸を含む、核酸合成分野で既知の任意の結合を含み得る。核酸分子に使用されるヌクレオチドは、天然であっても、または、天然塩基対と塩基対形成関係を形成できる、合成的に製造した類似体でもよい。塩基対形成関係を形成できる非天然塩基の例は、アザおよびデアザピリミジン類似体、アザおよびデアザプリン類似体、および他のヘテロ環塩基類似体プリンまたはピリミジン環炭素および窒素原子の1つ以上が、ヘテロ原子、例えば酸素硫黄セレンリン等により置換されている)を含むがこれに限定されない。

0033

本明細書に使用した「オリゴヌクレオチド」なる語は、約2〜約100のヌクレオチド、より好ましくは2〜80のヌクレオチド、さらにより好ましくは約4〜約35のヌクレオチドを含む核酸分子を意味する。

0034

本明細書に使用した「モノマー」なる語は、1つのヌクレオチドを含んでなる核酸分子およびその誘導体を意味する。

0035

本明細書に使用した「修飾オリゴヌクレオチド」、「修飾モノマー」および「修飾核酸分子」は、核酸塩基、糖部分、ヌクレオシドリン酸結合の全てまたはいずれかの天然分子構造の分子レベルでの1つ以上の化学的修飾を有する核酸、並びに、これらの部位に、ジアミンコレステリルまたは他の親油性基、または修飾の組合せなどの追加の置換基を有する分子を意味する。ヌクレオシド間リン酸結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステルホスホルアミデートシロキサンカーボネートカルボキシメチルエステルアセトアミデード、カルバメートチオエーテル架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート、および/またはスルホンヌクレオチド間結合、または3’−3’、2’−5’、または5’−5’結合、および(混合骨格修飾オリゴヌクレオチドを産生する)かかる類似の結合の組合せであり得る。修飾は、内部(単一または反復)またはオリゴヌクレオチド分子末端(群)であり得、アミノ基と末端リボースデオキシリボースの間に様々な数の炭素残基を有する、コレステリル、ジアミン化合物などの、ヌクレオシド間リン酸結合の分子への付加、および、反対の鎖または会合した酵素または他のタンパク質を切断または架橋するリン酸修飾を含み得る。リボース−ジアルデヒドなどの求電子性基は、かかるタンパク質のリシル残基のεアミノ基と共有結合的に連結できる。オリゴマーに繋がったn−エチルマレイミドなどの求核性基は、mRNAの5’末端または別の求電子性部位に共有結合的に付着できる。修飾オリゴヌクレオチドなる語はまた、2’−置換リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマーなどの糖部分への修飾を含むオリゴヌクレオチドを含み、そのいずれも5’から3’結合を介して共に接続している。修飾オリゴヌクレオチドはまた、配列の標的特異性が維持されている、PNAまたはモルホリノ修飾骨格からなり得る。

0036

本明細書に使用した「核酸骨格」なる語は、分子中のヌクレオチドを連結している化学部分の構造を意味する。これは、ヌクレオチドを化学的に連結しているいずれかおよび全ての手段から形成された構造を含み得る。本明細書に使用した修飾骨格は、ヌクレオチド間の化学結合への修飾、並びに、糖構造への修飾などの、安定性および親和性を増強するために使用し得る他の修飾を含む。例えば、デオキシリボースのα−アノマーを使用し得、ここでの塩基は、天然β−アノマーに関して反転している。好ましい実施形態において、糖基の2’−OHを、2’−O−アルキルまたは2’−O−アルキル−n(O−アルキル)に変化させ得、これは、親和性に影響を及ぼすことなく分解に対する耐性を与える。

0037

本明細書に同義語として使用した「酸性化」および「プロトン付加/酸性化」なる語は、プロトン(すなわち陽性水素イオン)が、核酸上のプロトン受容部位に加えられるプロセスを意味する。プロトン受容部位は、核酸の塩基構造上のアミン基およびホスホジエステル結合リン酸を含む。pHが低下すると、プロトン付加されるこれらの受容部位の数は増加し、より高度にプロトン付加/酸性化された核酸が得られる。

0038

「プロトン付加/酸性化された核酸」なる語は、1mlあたり約16のA260の濃度で水に溶かした場合に、生理学的pHより低い、すなわち、約pH7より低いpHを有する核酸を意味する。修飾核酸、ヌクレアーゼ耐性核酸、およびアンチセンス核酸は、この定義に包含されると意味する。一般に、核酸は、核酸上の反応部位にプロトンを加えることによりプロトン付加/酸性化されるが、核酸のpHを減少させる他の修飾も使用でき、この語により包含されると捉えられる。

0039

本明細書に使用した「末端遮断」なる語は、例えばヌクレアーゼ作用による、選択したヌクレオチドの分解を防ぐ、分子レベルでの化学的修飾を含む核酸を意味する。この化学的修飾は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドのコード領域などの、核酸の必要不可欠な部分を保護するように位置する。末端遮断は、3’末端遮断または5’末端遮断であり得る。例えば、核酸の必要不可欠な配列が3’にある場合、3’末端遮断は、分子のまさに3’の部位であり得るか、または、3’末端の内部であり得る。

0040

「実質的にヌクレアーゼに耐性」なる語は、天然または非修飾核酸に比べて、ヌクレアーゼによる分解に耐性である核酸を意味する。本発明の修飾核酸は、その非修飾対応物よりも、ヌクレアーゼによる分解に対して、少なくとも1.25倍耐性であり、その非修飾対応物よりも、より好ましくは少なくとも2倍耐性で、さらにより好ましくは少なくとも5倍耐性であり、最も好ましくは少なくとも10倍耐性である。このような実質的にヌクレアーゼに耐性な核酸は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、エチルホスホトリエステル、2’−O−メチルホスホロチオエート、2’−O−メチル−p−エトキシリボヌクレオチド、2’−O−アルキル、2’−O−アルキル−n(O−アルキル)、2’−フルオロ、2’−デオキシエリトロペントフラノシル、2’−O−メチルリボヌクレオシドメチルカルバメートメチルカーボネート、反転塩基(例えば反転T’s)、またはこれらの骨格のキメラ型を含むがこれに限定されない。

0041

本明細書に使用した「実質的に酸に耐性」なる語は、非修飾核酸に比べて、酸による分解に耐性である核酸を意味する。典型的には、核酸の相対的な酸耐性は、耐性核酸の分解比率を、非修飾対応物(すなわち、「正常な」骨格、塩基、およびホスホジエステル結合をもつ対応する核酸)の分解比率と比較することにより測定する。酸耐性である核酸は、その非修飾対応物よりも、好ましくは、酸による分解に対して少なくとも1.5倍耐性、少なくとも2倍耐性、さらにより好ましくは少なくとも5倍耐性、そして最も好ましくは少なくとも10倍耐性である。

0042

本明細書に使用した「LD50」なる語は、全ての処置した実験動物で、50%致死率をもたらす活性物質の用量である。これは通常、経口、非経口等の観血的投与を対象とするが、活性物質の局所適用などの、より観血的ではない投与法を使用した毒性にも適用し得る。

0043

本明細書に使用した「アルキル」なる語は、メチル、エチル、プロピル、tert−ブチルn−ヘキシル等の、1〜6炭素原子を含む、分枝または非分枝飽和炭化水素鎖を意味する。

0044

「処置」、「処置している」なる語は、一般に、所望の薬理および/または生理効果を得ることを意味するために本明細書で使用する。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する点で予防的であり得、および/または、疾患および/または疾患に起因する副作用の完全または部分的な治癒の点で治療的であり得る。本明細書に使用した「処置」なる語は、哺乳動物、特にヒトの疾患の任意の処置を網羅し、
(a)疾患の素因があり得るが、疾患を有するとはまだ診断されていない対象(被検者)において、細菌症が起こることを予防すること、
(b)細菌症を阻害、すなわち、その発達を停止すること、または
(c)細菌症を軽減、すなわち、疾患の減退および/または寛解を引き起こすことを含む。本発明は、任意の感染性細菌に罹患した患者の処置に関する。
(発明の総論)

0045

本発明は、任意の配列および任意の長さのプロトン付加/酸性化された核酸が、インビトロおよびインビボで、薬剤耐性および抗生物質感受性細菌の両方に対して効果的な、新規なクラスの抗生物質を示すという発見に基づく。特に、本発明のプロトン付加/酸性化された核酸は、全ての細菌種に対して効果的な抗細菌剤であり、ヒトおよび動物の細菌感染の処置または予防に使用できる。従って、本発明は、プロトン付加ヌクレアーゼ耐性核酸、および、細菌の死滅または細菌増殖の阻害に効果的なそれらの産生法を含む。特に、本発明は、殊に、病原性細菌に対する核酸の抗細菌作用を促進するプロトン付加のプロセスに関する。

0046

さらに、他の疾患または疾病の処置に今回治療使用する核酸、例えば、特定の遺伝子に標的化したアンチセンス核酸もプロトン付加/酸性化でき、よってかかる核酸に、さらなる抗細菌活性治療効果を付与する。従って、本発明はまた、細菌感染を同時に処置または予防するためにさらにプロトン付加された、ウイルス感染、癌、真菌感染等に関与する疾患の処置または予防のための核酸の使用を含む。

0047

プロトン付加/酸性化は、抗細菌剤として機能する能力を核酸に付与するために使用できる。核酸の酸性化は、プロトン(すなわち陽性水素イオン)を核酸上の反応部位に加えるプロセスである。プロトン付加される反応部位の数が増加するにつれて、pHは低下し、核酸の細菌阻害活性は増加する。従って、本発明の核酸は、プロトン付加/酸性化されると、水に溶かした場合に、pH7以下〜約pH1まで、または好ましい実施形態において、pH6〜約1またはpH5〜約1までのpHを与える。他の好ましい実施形態において、溶解した核酸は、pH4.5〜約1、または、好ましい実施形態において、4.0〜1のpH、または、より好ましい実施形態において、3.0〜約1のpH、または、別のより好ましい実施形態において、2.0〜約1のpHを有する。

0048

好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法のプロトン付加/酸性化された核酸は、実質的にヌクレアーゼに耐性、実質的に酸に耐性、および好ましくは、実質的にヌクレアーゼに耐性および実質的に酸に耐性の両方である。この実施形態は、ホスホロチオエート結合、2’−O−メチル−ホスホジエステル、2’−O−アルキル、2’−O−アルキル−n(O−アルキル)、2’−フルオロ、2’−デオキシ−エリトロペントフラノシル、p−イソプロピル核酸、ホスホルアミデート、キメラ結合、および任意の他の骨格修飾により完全に誘導体化された核酸を含む。この実施形態はまた、核酸を、実質的に内因性ヌクレアーゼ活性に耐性にする他の修飾を含む。核酸をヌクレアーゼに耐性にする方法は、核酸を含むプリンまたはピリミジン塩基の共有結合的修飾を含むがこれに限定されない。例えば、修飾塩基を含む核酸が実質的にヌクレアーゼに耐性となるように、塩基を、メチル化ヒドロキシメチル化、または別様に置換(例えばグルコシル化)し得る。

0049

最も好ましい実施形態において、プロトン付加/酸性化された核酸は、酸分解、エキソヌクレアーゼ消化、およびエンドヌクレアーゼ消化に対して実質的に耐性である骨格を有する。

0050

典型的には、核酸の相対的なヌクレアーゼ耐性は、耐性核酸の消化比率を、その非修飾対応物(すなわち、「正常な」骨格、塩基、およびホスホジエステル結合をもつ対応する核酸)の消化比率と比較することにより測定できる。消化比率は、定性HPLCを使用して、全長核酸の消失を評価することにより、または任意の他の適切な方法により(例えば、染色、オートラジオグラフィー蛍光等を使用してシークエンスゲル上の産物を可視化、または光学密度シフトを測定することにより)決定し得る。分解は、一般に、時間の関数として測定する。

0051

非修飾核酸と修飾核酸の比較は、無傷修飾核酸の比率を、無傷非修飾核酸の比率に割当てることにより実施できる。例えば、15分間ヌクレアーゼに曝露した後、非修飾核酸の25%が無傷であり(すなわち75%分解)、修飾核酸の50%が無傷である場合(すなわち50%分解)、修飾核酸は、非修飾核酸よりもヌクレアーゼによる分解に対して2倍(50%を25%で割る)耐性であると言われる。一般に、実質的にヌクレアーゼに耐性な核酸は、15分間ヌクレアーゼに曝露した後に、ヌクレアーゼによる分解に対して、対応する配列を有する非修飾核酸よりも、少なくとも約1.25倍耐性、典型的には少なくとも約1.5倍耐性、好ましくは約1.75倍耐性、そしてより好ましくは少なくとも約10倍耐性である。

0052

酸分解比率は、定性HPLCを使用して、全長核酸の消失を評価することにより、または任意の他の適切な方法により(例えば、染色、オートラジオグラフィー、蛍光等を使用してシークエンスゲル上の産物を可視化、または光学密度のシフトを測定することにより)決定し得る。分解は、一般に、時間の関数として測定する。

0053

非修飾核酸と修飾核酸の比較は、無傷修飾核酸の比率を、無傷非修飾核酸の比率に割当てることにより実施できる。例えば、30分間低いpH環境に曝露した後、非修飾核酸の25%が無傷であり(すなわち75%分解)、修飾核酸の50%が無傷である場合(すなわち50%分解)、修飾核酸は、非修飾核酸よりもヌクレアーゼによる分解に対して2倍(50%を25%で割る)耐性であると言われる。一般に、実質的に「酸に耐性な」核酸は、30分間37℃で約1.5〜約4.5のpHに曝露した後に、酸による分解に対して、対応する配列を有する非修飾核酸よりも、少なくとも約1.25倍耐性、典型的には少なくとも約1.5倍耐性、好ましくは約1.75倍耐性、そしてより好ましくは少なくとも約10倍耐性である。

0054

今回記載した精製核酸は、単独で治療剤として使用しても、追加の抗細菌剤と複合させてもよい。例えば、記載したヌクレアーゼ耐性抗細菌核酸は、従来の抗生物質または細菌遺伝子発現を阻害する他の化学基に連結させ得る。別に、精製核酸は、他の疾病および/または症状の軽減に設計された薬剤、例えば鬱血除去薬抗ヒスタミン剤、抗吐気剤、鎮静剤疼痛軽減剤等と共に治療組成物に含めてもよい。さらに、抗細菌核酸は、例えば、核酸のインビボ安定性をさらに増強する、またはその薬理特性を別様に増強する(例えば、インビボ半減期を増加、毒性を減少、バイオアベイラビリティーを促進等)、様々な十分に確立された化合物または構造と複合させ得る。

0055

本発明の核酸の配列は、修飾核酸の抗細菌効果が配列に依存的ではないので変化し得る。例えば、細菌感染の処置に指向した核酸は、細菌増殖に必要な既知の細菌遺伝子に相補的であり得る。別の例では、本発明の核酸は、感染の処置または予防を引き起こす、細菌のゲノムのどの配列とも実質的な配列相同性を有さなくてもよい。さらに別の例では、他の治療標的、例えばウイルス癌細胞、真菌感染に指向した核酸もまた、その基本的な治療機能に加えて、抗細菌剤として同時に機能するように、本発明に従ってプロトン付加/酸性化し得る。

0056

本発明の核酸の殺細菌および/または静細菌活性は、当業者に利用可能な任意の数の方法を使用して測定し得る。かかる方法の一例は、抗生物質による細菌感染の処置におけるインビボ効力予測すると認められる、MIC最小阻害濃度)の使用による、抗細菌活性の測定である。本発明の核酸は、膜を透過するように細菌を前処理しなくても、および核酸をPEG修飾しなくても、この試験で抗細菌活性を示す。

0057

一連の化学的変化を有する核酸のプロトン付加/酸性化を、本発明で使用し得るが、本発明の好ましい実施形態は、水に溶かした場合に、3〜1のpHを有する、5’−ブタノール−2’−O−アルキルRNA−ブタノール−3’または2’−O−アルキル−O−アルキルの化学構造を有するプロトン付加/酸性化された核酸である。本発明の特に好ましい実施形態は、水に溶かした場合に、3〜1のpHを有する、5’−ブタノール−2’−O−メチルRNA−ブタノール−3’の化学骨格構造をもつプロトン付加/酸性化された核酸である。

0058

核酸合成

0059

核酸は、商業的に購入したDNA合成器で、<1μMから>1mMの規模で、標準的なホスホルアミジト化学および当分野で公知の方法、例えば、Stecら、1984、J.Am.Chem.Soc.106:6077〜6089、Stecら、1985、J.Org.Chem.50(20):3908〜3913、Stecら、1985、J.Chromatog.326:263〜280、LaPlancheら、1986、Nuc.Acid.Res.14(22):9081〜9093、およびFasman、1989、生化学および分子生物学実践的なハンドブック、1989、CRCプレス、ボーカラトーン、フロリダ(本明細書に参考として取込む)に記載の方法を使用して合成できる。

0060

核酸は、当分野で公知の任意の方法により精製できる。好ましい実施形態において、核酸は、市販で入手可能な逆相またはイオン交換媒体、例えばウォーターズプロテインパックファルマシアソースQ等でクロマトグラフィーにより精製する。ピーク画分を合わせ、サンプルを脱塩し、ポリスチレンジビニルベンゼン)をベースとした媒体ハミルトンPRP1またはPRP3、またはポリマーLab’sPLRPレジンで、逆相クロマトグラフィーにより濃縮できる。別に、エタノール沈降、ダイアフィルトレーション、またはゲルろ過、次いで凍結乾燥またはSavant’s Speed Vacなどの市販で入手可能な装置での真空下での溶媒蒸発を使用し得る。所望により、少量の核酸を、ポリアクリルアミドゲルを使用して電気泳動により精製し得る。

0061

凍結乾燥または乾燥させた核酸の調製物を、発熱性物質非含有無菌生理食塩水(すなわち0.85%食塩水)、無菌シグマ水に溶かし、0.45μのゲルマンフィルター(または無菌の0.2μの発熱性物質非含有フィルター)を通してろ過する。記載した核酸は、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、2’−O−メチル、2’−修飾RNA、モルホリノ基、リン酸エステルプロピン基、または上記の基または他の結合(またはその類似体)の任意の組合せのキメラを含むがこれに限定されない、任意の多種多様な化学基または結合で部分的にまたは完全に置換し得る。

0062

様々な標準的方法を使用して、今回記載した抗細菌核酸を精製できる。簡潔には、本発明の抗細菌核酸は、クロマトグラフィーにより、市販で入手可能な逆相媒体(例えば、RAININインストルメンツ社、DYNAMAX(登録商標)−300A、Pure−DNA逆相カラム、1989、またはその現在のアップデート版の説明書参照、本明細書に参考として取込む)またはイオン交換媒体、例えばウォーターズプロテインパックまたはファルマシアのソースQで精製できる(一般に、WarrenおよびVella、1994、「高速液体クロマトグラフィーによる合成核酸の分析および精製」、Methodsin Molecular Biology、第26巻;核酸コンジュゲートのプロトコル、S.Agrawal編、Humanaプレス社、Totowa、NJ;Aharonら、1993、J.Chrom.698:293〜301;およびMillipore Technical Bulletin、1992、アンチセンスDNA:合成、精製および分析)。ピーク画分を合わせ、サンプルを濃縮し、アルコール(エタノール、ブタノール、イソプロパノール、およびその異性体および混合物等)沈降、逆相クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、またはゲルろ過により脱塩できる。

0063

核酸は、所望の核酸の合成中に産生される、とりわけ、不完全な核酸産物を実質的に含まないように単離した場合に、純粋と考える。好ましくは、精製核酸はまた、オリゴヌクレオチドの抗細菌活性を妨害または別様にマスクし得る汚染物質を実質的に含まない。開示された方法の1つによる、または当業者に既知の任意の他の方法による酸性化後の、精製核酸は、とりわけ、過剰のプロトン付加/酸性化試薬を実質的に含まないように単離したプロトン付加/酸性化された核酸である。一般に、核酸が標的細胞に結合するか、またはそれに侵入して、目的の生理活性を調節できる場合、核酸をより有用でなくする汚染物質は実質的に含まれていないとする。

0064

特定の実施形態において、本発明の核酸は、以下の1つ以上からなる。部分的または完全に置換されたホスホロチオエート、ホスホネート、リン酸エステル、ホスホロアデート、2’−修飾RNA、3’−修飾RNA、ペプチド核酸、プロピンまたはその類似体。核酸は、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミデート結合、シロキサン結合カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合アセトアミド結合、カルバメート結合チオエーテル結合、架橋ホスホルアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、モルホリノ、架橋ホスホロチオエート結合、スルホンヌクレオチド間結合、3’−3’結合、5’−2’結合、5’−5’結合、2’−デオキシ−エリトロペントフラノシル、2’−フルオロ、2’−O−アルキルヌクレオチド、2’−O−アルキル−n(O−アルキル)ホスホジエステル、モルホリノ結合、p−エトキシオリゴヌクレオチド、PNA結合、p−イソプロピルオリゴヌクレオチド、またはホスホルアミデートを含むがこれに限定されない、化学部分により完全にまたは部分的に誘導体化され得る。

0065

プロトン付加/酸性化された核酸

0066

上記の合成および精製段階後に、またはその最中に、プロトン付加/酸性化形の記載の核酸は、精製、または部分精製、または粗核酸を、低pH環境すなわち酸性環境におくことにより作成できる。精製または粗核酸は、リン酸、硝酸、塩酸、酢酸等を含むがこれに限定されない、酸でプロトン付加/酸性化できる。例えば、酸を、溶液中で核酸と合わせても、別に、核酸を酸性溶液中に溶かしてもよい。過剰の酸はクロマトグラフィーにより、またはいくつかの場合には核酸を乾燥させることにより除去し得る。

0067

当業者には既知のプロトン付加核酸を調製する他の手順も、等しく本発明の範囲内と考えられる。一旦、本発明の核酸がプロトン付加されると、例えば過剰の酸などの任意の望まれない成分から分離し得る。当業者は、望まれない成分からオリゴヌクレオチドを分離する多くの方法を知っている。例えば、オリゴヌクレオチド溶液を、プロトン付加後に、クロマトグラフィーにかけ得る。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド溶液を、プロトン付加後に、ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)をベースとしたレジン(例えばハミルトンPRP−1pr3およびポリマーLab’sPLRP)にかける。

0068

プロトン付加/酸性化された核酸は、直接使用できるか、または好ましい実施形態において、さらに処理して、任意の過剰の酸および塩を、沈降、逆相クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、またはゲルろ過により除去できる。プロトン付加/酸性化オリゴは、沈降、凍結乾燥、溶媒蒸発等により濃縮できる。水または食塩水に懸濁すると、本発明の酸性化された核酸調製物は、典型的には、プロトン付加/酸性化のレベルに応じて(これは、どれだけの酸を酸性化プロセスに使用するかにより決定できる)、1〜4.5のpHを示す。別に、核酸を、水素イオンを装填したカチオン交換カラムを通過させることによりプロトン付加できる。

0069

酸およびヌクレアーゼに耐性な核酸

0070

一般に、pH2〜1近くの核酸調製物は、pH4.5でまたはその近くでの核酸よりも良好な抗細菌活性を示す。多くのオリゴ骨格はpH2では安定ではなく、脱プリン化を受けるが、多くの骨格は4〜5のpHで比較的安定である。2’−O−アルキル、3’−O−アルキル、および2’−O−アルキル−n(O−アルキル)核酸は、2〜1の望ましいpHで安定であることが発見された。

0071

1つの実施形態において、本発明は、実質的にヌクレアーゼに耐性な核酸を使用する。これは、ホスホロチオエート結合、2’−O−メチルホスホジエステル、2’−O−アルキル、2’−O−アルキル−n(O−アルキル)、2’−フルオロ、2’−デオキシ−エリトロペントフラノシル、p−エトキシ、モルホリノ核酸、p−イソプロピル核酸、ホスホルアミデート、キメラ結合、および任意の他の骨格修飾、並びに、核酸を実質的に内因性ヌクレアーゼ活性に対して耐性とする他の修飾により、完全に誘導体化された核酸を含む。核酸をヌクレアーゼ耐性にするさらなる方法は、核酸を含むプリンまたはピリミジン塩基を共有結合的に修飾することを含むがこれに限定されない。例えば、修飾塩基を含む核酸が実質的にヌクレアーゼに耐性となるように、塩基を、メチル化、ヒドロキシメチル化、または別様に置換(例えばグリコシル化)し得る。

0072

2’−O−アルキル置換核酸および類似の修飾を有する分子は、顕著な酸安定性およびエンドヌクレアーゼ耐性を示すが、それらは3’エキソヌクレアーゼに感受性である。2’−O−アルキル置換核酸のエキソヌクレアーゼ耐性を増強するために、リボ核酸配列の5’および3’末端を、好ましくは、エキソヌクレアーゼ遮断官能基に付着する。例えば、1つ以上のホスホロチオエートヌクレオチドを、オリゴリボヌクレオチドのどちらかの末端に配置できる。さらに、1つ以上の反転塩基を、オリゴリボヌクレオチドのどちらかの末端に配置できるか、または1つ以上のアルキル、例えばブタノール−置換ヌクレオチドまたは化学基を、オリゴリボヌクレオチドの1つ以上の末端に配置できる。酵素耐性ブタノールは、好ましくは、C4スペーサーとも称される、構造OH−CH2CH2CH2CH2(4−ヒドロキシブチル)を有する。従って、本発明の好ましい実施形態は、以下の構造:
A−B−C
[式中、「B」は、約1〜約78塩基長の、2’−O−アルキルまたは2’−O−アルキル−O−アルキルオリゴリボヌクレオチドであり、そして、「A」および「C」は、それぞれ5’および3’末端遮断基(例えば、1つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド(しかし典型的には6以下)、反転塩基結合、またはアルキル、アルケニル、またはアルキニル基または置換ヌクレオシド)である]
を有する抗細菌核酸を含むプロトン付加/酸性化された核酸である。遮断基の一部リストは、反転塩基、ジデオキシヌクレオチド、メチルホスフェートアルキル基アリール基コルジセピンシトシンアラバノシド、ホスホロチオエート結合を有する2’−または3’−O−メチル塩基、3’−O−メチル塩基、フルオレセインコレステロールビオチンアクリジンローダミンソラレン、およびグリセリルを含む。

0073

抗細菌核酸の治療使用

0074

疾患の治療処置に使用する場合、適切な抗細菌プロトン付加/酸性化された核酸、またはその混合物の用量は、数個の十分に確立された方法のいずれかにより決定し得る。例えば、動物試験を一般に使用して、1kgの体重あたりの、生物活性剤の最大耐用用量、すなわちMTDを決定する。一般に、試験した動物種の少なくとも1つは哺乳動物である。当業者は、定期的に効果的な用量を推定し、ヒトを含む他の種への毒性を回避する。さらに、治療用量はまた、感染の重度、宿主の体格または種などの因子に応じて変化し得る。

0075

今回記載した抗細菌核酸の治療使用を考える場合、抗細菌核酸は、好ましくは、医薬的に許容される担体中で、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内、皮下、経皮気管内法または類似の方法を介して投与する。

0076

典型的であって、必ずしもではないが、ある抗細菌核酸の好ましい製剤は、ある感染性生物が最初に侵入するであろう、またはある感染性生物がコロニーを形成または集中すると予測される、宿主の場所に依存する。例えば、局所感染は、好ましくは、局所適用用に設計された製剤により処置または予防される。例えば、好ましい実施形態において、酸性化された核酸は、局所投与用の、水、エタノール、およびプロピレングリコール基剤で製剤化する。別に、標的病原体が、胃腸管にコロニーを形成する場合、酸安定性プロトン付加/酸性化された核酸の調製物は、経口投与により提供され得る。さらに、肺感染は、非経口的に、および吸入療法または鼻腔内投与によりに適切な製剤化形の抗細菌核酸を直接適用することの両方により処置し得る。

0077

適切に製剤化した核酸を非経口投与する場合、核酸は、腎臓肝臓脾臓リンパ腺副腎大動脈膵臓骨髄心臓、および唾液腺に比較的高いレベルで蓄積できる。核酸はまた、骨格筋膀胱、胃、食道十二指腸脂肪、および気管に、より低い程度で蓄積する傾向がある。さらに低い濃度が、典型的には、大脳皮質脳幹小脳脊髄軟骨、皮膚、甲状腺、および前立腺に見られる(一般に、Crooke、1993、アンチセンス研究および適用、CRCプレス、ボーカラトーン、FL参照)。興味深いことに、病原性細菌はまた、多くの上記器官にも蓄積する傾向がある。結果として、今回記載した抗細菌核酸は、特定の標的器官および組織の細菌感染を標的化するのに使用できる。

0078

好ましくは、本発明の核酸を使用して処置し得る動物宿主は、無脊椎動物脊椎動物トリ、哺乳動物、例えばブタヤギヒツジウシイヌネコ、および特にヒトを含むがこれに限定されない。今回記載したプロトン付加/酸性化抗細菌核酸はまた、実験培養液での細菌汚染の駆除、消費品食物または飲料調製物)、または産業プロセスに効果的であると考えられる。

0079

細菌感染は特に、免疫無防備状態の個体、例えば後天性免疫不全疾患症候群エイズ)に罹患した患者、HIV感染個体、化学療法または放射線療法を受けている患者等において特に問題となる合併症であり、今回記載した発明の追加の実施形態は、免疫無防備状態の患者の処置のための、今回記載した抗細菌核酸の使用である。

0080

今回記載した発明の別の実施形態は、ウイルス、癌、真菌または他の標的を有する治療核酸の使用であり、ここでの核酸は、さらに、プロトン付加/酸性化され、よってそれは抗細菌核酸として作用できる。オリゴは、その主な標的を伝え続けるが、さらに、次いでそれは抗細菌剤としても機能する。

0081

本発明の方法が効果的である細菌生物の例は、グラム陽性細菌グラム陰性細菌抗酸菌、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびエシェリヒア・コリを含む。本発明の方法は、以下の属のメンバーを含む、全ての細菌生物による感染に対して効果的である:エロコッカス属、リステリア属ストレプトミセス属クラミジア属アクチノズラ属、ラクトバシラス属ユウバクテリウム属、アラクニア属ミコバクテリウム属ペプトストレプトコッカス属スタフィロコッカス属コリネバクテリウム属エリジペロトリックス属、デルマトフィルス属、ロードコクス属、リボバクテリウム属シュードモナス属、ストレプトコッカス属、バチラス属、ペプトコッカス属ニューモコッカス属、ミクロコッカス属ナイセリア属クレブシエラ属クルシア属ノカルジア属、ノカルジオプシス属、セラチア属ロシア属、エシェリヒア属プロピオニバクテリウム属アクチノミセス属ヘリコバクター属エンテロコッカス属シゲラ属ビブリオ属クロストリジウム属サルモネラ属エルシニア属、およびヘモフィルス属
医薬品組成体及びデリバリー

0082

本記載のプロトン付加/酸性化型抗細菌核酸は各種生理学的キャリアー分子と共に製剤化されるだろう。本記載の抗細菌核酸は、それらの標的細胞への浸入能力を増強する分子とも複合体化するだろう。この様な分子の例は細菌増殖にとって重要な炭水化物ポリアミンアミノ酸ペプチド、脂質及びその他生体分子を含むが、それに限定されるものではない。例えば、抗細菌核酸は脂質、陽イオン脂質、又は陰イオン性脂質(プロトン付加/酸性化された核酸に関し好適であろう)と組み合わされてもよい。生じた核酸/脂質乳剤、又はリポソーム性の懸濁液は、とりわけ核酸のインビボ半減期を効果的に延ばすだろう。プロトン付加/酸性化された核酸との利用に適した好適陰イオン性脂質の例は、カルジオリピン、ジミリスオールジパルミトイル、又はジオレオイルホスファチジルコリンあるいはホスファチジルグリセロールパルミトイルオレオイルホヅファチジルコリン又はホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸リソホスファチジン酸、ホフファチジルセリンホスファチジルイノシトール及びコレステロールの陰イオン型が含まれるが、これに限定されない。陽イオン性、陰イオン性及び/又は中性脂質組成体、又はリポゾームの利用は、参照されここに取り込まれている国際公開番号第WO90/14074号、第WO91/16024号、WO91/17424号及び米国特許第4,897,355号に一般的に記載されている。脂質連関構造内に抗細菌核酸を組み込むことにより、プロトン付加/酸性化抗細菌核酸は核酸/脂質複合体内に好適な標的作用物質(即ち、特異的抗体又は受容体)を取り込み、特定の細菌細胞型に導かれるだろう。

0083

混合体中の発明の核酸を医薬品キャリアーと共に含む医薬品組成体は、通常の製薬調剤技術に従い調製することができる。キャリアーは、例えば静脈内、経口、局所、エアゾール(局所又は肺への供給)、座薬腸管外、又は脊髄注射等の投与方法に関し望ましい製剤の形状に合わせた各種形状をとるだろう。

0084

経口投与形状にある組成体の調製では、通常の医薬品媒体、例えば経口液体製剤(例えば懸濁剤エリキシル剤及び液剤)の場合では水、グリコール、油、アルコール、芳香剤、保存剤着色剤等が利用され、経口固形製剤(例えば粉末剤カプセル剤及び錠剤)の場合には、澱粉、糖、希釈剤顆粒剤光沢剤結合剤崩壊剤等が利用されるだろう。これらを投与する場合、その中に固体医薬品キャリアーが明瞭に使用されている錠剤及びカプセルが最も有益な投与単位形状である。必要に応じ、錠剤は通常の技術によって糖コーティング及び腸溶性コーティングが施されるだろう。抗細菌核酸の経口投与形状は、細菌感染による(例えばヘリコバクターピロリ感染等)胃腸管の細菌感染及び潰瘍の治療に有用である。

0085

注射による非腸管的応用に関しては、製剤は水溶性の、又は適当な塩溶液可溶化された医薬品として受け入れ可能な形状にある抗細菌核酸の水性液を含むだろう。適当な液体キャリアー、懸濁剤、等張性調製剤、保存剤等を利用し注射懸濁液も調製されるだろう。非腸管的に投与できる組成体の調製に適した、及び被験者への投与に必要な調製に関する実際の方法は当業者にとって既知、または明瞭であり、そしてより詳細には例えば参照されここに取り込まれているRanington’s Pharmaceutical Science、15版、マック出版社、イーストン、ペンシルニア州(Mack Publishing Company、Easton、PA)(1980)に記載されている。ここに記載の核酸は、抗細菌核酸に関し確立された最大耐性投与量(MTD)以下の濃度で非腸管的に投与しなければならない。

0086

局所投与の場合、キャリアーはそのクリーム、ドレッシング、ゲル、ローション軟膏又は液剤であろう製剤に応じ広範な各種形状を取るだろう。

0087

エアゾールは、核酸をエチルアルコールの様な噴射剤、又は噴射剤と水の相に溶解、又は懸濁することで調製できる。局所又はエアゾール形状の医薬品組成体は一般に使用する具体的形状に応じて約0.01重量%(核酸の)ないし約40重量%、好ましくは約0.02重量%ないし約10重量%、そしてより好ましくは約0.05重量%ないし約5重量%含まれる。

0088

懸濁剤は核酸をカカオ脂カカオバターグリセリンゼラチン、又はポリオキシエチレングリコールの様な脂質賦形剤と混合することで調製される。

0089

ここに記載の抗細菌核酸は通常の抗生物質の投与に用いられる何れかの手段により体に投与される。動物内の細菌に生物活性化合物を供給することに関しては、各種のデリバリーシステムが良く知られている。これらシステムには、静脈内又は筋肉内、あるいは気管内注射、鼻内噴霧吸入用エアゾール、経口又は座薬投与が含まれるが、これに限定されない。具体的なデリバリーシステムは細菌の部位に依存しており、細菌の位置を特定し、適当なデリバリーシステムを選択することは当業者に良く知られている。

0090

発明の核酸は、それらがいずれの投与形状に於いても極めて非毒性であるという利点を有する。例えば発明のオリゴヌクレオチド溶液の非腸管的に投与はマウスに於いて10mg/マウスでも非毒性であり、そのLD50が400mg/kgより小さいことが示されている。

0091

抗細菌核酸の化粧品への利用

0092

発明のプロトン付加/酸性化された核酸はローション、クリーム、局所水の様な化粧品に利用されるだろう。発明の核酸は、ローション中での様に抗菌剤としても、そして化粧品中の細菌の増殖の防止及び/又は遅らせるための防腐剤としても利用されるだろう。即ち、核酸は既知化粧品と共に利用でき、得られた製剤の組成体はプロトン付加された核酸の活性を保持するのに十分た程度に低pH、例えば7.0以下である。核酸は抗菌効果を持つのに十分な程度の量、好ましくは0.25重量%ないし10重量%、より好ましくは0.5重量%ないし5.0重量%の量存在している。

0093

発明の化粧品組成体は、グリコール酸又はアルファヒドロキシ酸ビタミンAパルチミン酸塩(レチニルパルチミン酸エステル)及びビタミンE酢酸塩トコフェリル酢酸エステル)の様なそれ自体活性である成分を幾種類か含むだろう。これらのバッチは約0.5重量%ないし約5重量%の量存在するのが好ましい。更に、PABAの様なUV吸収又は阻止物質も利用してもよいだろう。

0094

更に湿潤作用を獲得し、組成体の粘調度を改良するためのその他化合物も加えられるだろう。この様な化合物の例には、セルチルエステルワックスステアリルアルコールセチルアルコール、グリセリン、メチルパラベンプロピルパラベン、クオテリニウム−15、湿潤剤揮発性メチルシロキサン液、及びポリジオールガノシロキサン−ポリオキシアルキレンが含まれるが、これに限定されるものではない。例えば共に参照され取り込まれている米国特許第5,153,230号及び第4,421,769号を参照せよ。組成体が更に洗浄作用を持つことが望まれる場合には、ラルリル硫酸ナトリウム又はカルボン酸金属塩の様な化学物質が加えられるだろう。

0095

発明の核酸は広い細菌スペクトラムに対し良好な作用を持つこと、皮膚に対する刺激が低いこと、そして化学的に安定していることから、特に局部用アクネ組成体中に有用であろう。油をベースとした組成体はアクネの状態を悪化させることから、この様な組成体は好ましくは水性である。

0096

この場合には各種非揮発性皮膚軟化剤が有用であり、その非限定的な例はその全てが参照され、ここに取り込まれているMcCutcheon’s、2巻、機能材料(Functional Materials)、北米版(North American Edition)、(1992)、pp。137−168、及びその全てが参照され、ここに取り込まれている、pp572−575に皮膚コンディショニング剤を、そしてp580に皮膚保護剤掲載しているCTFA化粧品成分ハンドブック(Cosmetic Ingredient Handbook)、第2版(1992)に掲載されている。

0097

ここでは特に有用なものの非揮発性の皮膚軟化剤材料の中で、シリコン炭化水素、エステル、及びそれらの混合物が好ましい。

0098

非揮発性皮膚軟化剤の例にはポリアルキルシロキサン環式ポリアルキルシロキサン及びポリアルキルアリールシロキサンを含む。ここで有用なポリアルキルシロキサンは、例えば25℃にて約0.5ないし約100,000センチストークの粘度を有するポリアルキルシロキサンを含む。この様なポリアルキルシリコキサンは、所望分子量を得る様に選択された、式中のRがアルキル基(好ましくはRはメチル又はエチル、より好ましくはメチルである)であり、xは0から約500までの整数である一般式R3SiO[R2SiO]xSiR3に相当する。市販のポリアリルシリコキサンはジメチコンとしても知られ、非限定例としてジェネラルエレクトリック社(General Electric Company)のVicasil(登録商標)及びダウコーニング社(Dow Corning Company)の販売するダウコーニング(登録商標)200シリーズがあるポリジメチルシリコキサンが含まれる。ここでの皮膚軟化剤として有用なポリジメチルシロキサンの具体例には、0.65センチストークの粘度と100℃より高い沸点を持つダウコーニング200液及び10センチストークの粘度と200℃より高い沸点を持つダウコーニング225液、及び50、350並びに12,500センチストークの粘度をそれぞれ持ち、沸点が200℃より高いダウコーニング200液が含まれる。ここで有用な環式ポリアルキルシリコキサンは、式中のRがアルキル基(好ましくはRはメチル又はエチル、より好ましくはメチルである)でありnが約3ないし約8までの整数であり、好ましくはnは約3ないし約7までの性Sunであり、最も好ましくはnは約4ないし約6までの整数である一般化学式[SiR2O]nに相当するものを含む。Rがメチルの場合、これら材料は一般にはシクロメチコンと呼ばれる。市販のシクロメチコンには、粘度2.5センチストーク、沸点が172℃であり、原則的にはシクロメチコンテトラマー(即ちn=4)を含むダウコーニング244液、粘度2.5センチストーク、沸点178℃であり、原則的にはシクロメチコンペンタマー(即ちn=5)を含むダウコーニング344液、粘度が4.2センチストークであり、沸点が205℃であり、原則的にはシクロメチコンテトラマー及びペンタマー(即ちn=4及び5)の混合体を含むダウコーニング245液、及び粘度が4.5センチストークであり、沸点が217℃であり、原則的にはシクロメチコンテトラマー、ペンタマー及び壁サマー(即ちn=4、5及び6)の混合体を含むダウコーニング345液を含む。同様に有用なものは、式中のxが約1ないし約500までの整数であり、yは約1ないし約500までの整数である一般化学式[(CH
2)3SiO1/6]x[SiO2]yのトリメチルシリコキシケイ酸塩である。市販のトリメチルシリコキシケイ酸塩は、ジメチコンとの混合体の形でダウコーニング
R593液として販売されている。ここで同様に有用なものは、ヒドロキシ末端ジメチルシリコンであるジメチコノールである。これら物質は式中のRがアルキル基(好ましくはRはメチル又はエチル、より好ましくはメチルである)であり、xは0ないし約500までの整数である、所望分子量を得られる様に選択された一般化学式R3SiO[R2SiO]xSiR2OH及びHOR2SiO[R2SiO]xSiR2OHにより表すことができる。市販のジメチコノールは典型的にはジメチコン又はシクロメチコン(例えばダウコーニング1401、1402及び1403液)の混合体として販売されている。ここで更に有用なものは25℃において約15ないし約65センチストロークまでの粘度を持つポリメチルフェニルシロキサンによるポリアルキルアリールシロキサンである。これら材料は例えばSF1075メチルフェニル液(ジェネラルエレクトリック社より販売)及び566化粧品等級トリメチコン液(ダウコーニング社より販売)として入手できる。

0099

ここに有用な炭化水素には、約10ないし約30個の炭素原子、より好ましくは約12ないし約24個の炭素原子、及び最も好ましくは約16ないし約22個の炭素原子を有する直鎖型及び分岐型炭化水素を含む。これら炭化水素の非限定例にはドデカンスクアランクレステロール、5水素ポリイソブチレンドコサン(即ちC22炭化水素)、ヘキサデカンイソヘキサデカン(PermethylR101としてプレスパース社、サウスプレイスフィールド、ニュージャージー州(Presperse、South Plainsfield、N.J.)として市販されている)が含まれている。その他ここに有用な炭化水素物質にはパラフィン及びUSPライト軽油(例えばウイチコ社、メルローズパークイリノイ州(Witco Corp.,Melrose Park,Ill.)の入手可能Klearol(登録商標)、及びUSP重油(例えばウイチコ社製Kearol(登録商標)、メルローズパーク、イリノイ州)が含まれる。

0100

更に非揮発性皮膚軟化剤として有用なものは、アルコール及びポリオール(即ち2又はそれ以上のヒドロキシ基を有するアルコール)でエステル化された1官能基型及び2官能基型脂肪酸のエステルである。広い範囲のエステルがここでは有用であり、長鎖型脂肪酸の長鎖型エステルが好ましい(即ちC10−40脂肪アルコールでエステル化されたC10−40脂肪酸)。ここで有用なエステルの非限定例には、ジイソプロピルアジパートイソプロピルミリスチン酸エステルイソプロポマルミチン酸エステル、ミリスチルプロピオン酸エステルエチレングリコールジステアリン酸エステル、2−エチルベキシルパルミチンサンエステル、イソデシルネオペンタン酸エステルC12-15アルコール安息香酸、ジ−2−エチルへキシルマレイン酸エステルセチルパルミチンサンエステル、ミリスチルミリステリン酸エステル、ステアリルステアリン酸エステル、セチルステアリン酸エステル、ベヘニルベヘン酸エステル及びその混合体を含む。

0101

消毒剤への抗細菌核酸の利用

0102

発明の核酸は消毒剤としての利用、特に生物静力学又は好ましくは殺菌特性を有する液体消毒製剤としての利用も見いだされるだろう。消毒液は少なくとも発明の核酸を十分量含み、更に生物静力学的及び/又は殺菌特性を持つその他活性成分も含むだろう。例えば、消毒薬は発明の核酸を、例えばジメチルベンジルドデシル塩化アンモニウム、ジメチルベンジル塩化デシルアンモニウム、ジメチルベンジルデシル臭化アンモニウム、ジメチルベンジルオクチル塩化アンモニウム及びココスアルキルジメチルベンジル塩化アンモニウムの様な4級アンモニウム化合物の好適濃度と共に含むだろう。

0103

その他の例では、オリゴヘキサメチルブグアニド塩やビスビグアンジドの様な好適抗菌性ビグアニンジン化合物が利用できる。例えば参照されここに取り込まれている米国特許第5,030,659号を参照せよ。更なる殺菌性成分にはアルデヒドフェノール誘導体及びハロゲンフェニル誘導体が含まれる。例えば参照されここに取り込まれている米国特許第5,767,054号を参照せよ。当業者により認識される様に、この様な活性を持つその他化合物も発明の核酸と結びつけて利用されるだろう。

0104

所望の活性成分に加え、発明の殺菌剤は所望される製剤の利用に依存し、その他典型的な成分を含むだろう。具体的には、殺菌液のpHを7未満に維持するためには酸性化剤が利用されるだろう。核酸及び/又はその他活性成分に関しては好適溶媒が用いられるが、好ましくは水又は水混合有機溶媒であろう。この様な液体は加圧された空気又は当分野既知のその他噴射剤を用い容易に噴霧できるだろう。

0105

発明のこれら製剤は特に病院、動物病院歯科及び診療所等の医療関連環境に於ける表面殺菌に好適である。外科用具滅菌への発明の液体の利用は特に好ましい。これら製剤は学校、公共交通レストランホテル及びランドリーの様な公共空間にも有用である。消毒剤は家庭に於いては、トイレ浴室及び台所の殺菌剤としても利用されるだろう。

0106

発明のプロトン付加/酸性化された核酸は皮膚用消毒液にも利用されるだろう。この様な組成体は、局所利用に好適な賦形剤中に存在する溶液中に発明の核酸を含む。消毒剤は速乾性であり、核酸はエタノールベース中にあることが望ましいだろう。この様な液は、アルコールが皮膚を過度に乾燥させる傾向があることから、好ましくは皮膚に適した皮膚軟化剤も含むだろう。好適皮膚軟化剤の例は、ポリエチレングリコール、グリセリン、ジグリセリンプロピレングリコールブチレングリコールエリスリトールジプロピレングリコール及びソルビトールの様な多価アルコールを含むが、これに限定されない。皮膚軟化剤の量は0.1−13重量/重量%の範囲であり、より好ましくは0.2−1.5重量/重量%の範囲であろう。皮膚軟化剤含有量が0.1重量%より少ない場合には、それはそれほど効果的ではなく、また3.0%を越えると液は過度に粘着性になるだろう。

0107

皮膚用消毒剤は特に医療処置又は廃棄物管理後の手の消毒に有用である。消毒剤は手術現場でも、医療スタッフ及び患者の手術域の消毒の両方に有用であろう。

0108

実施例

0109

以下の実施例は本発明の作製及び利用に関する完全な開示と記述を当業者に提供することを目的とするものであり、発明に関するその範囲を限定することを意図しない。使用する数値(例えば量、温度、濃度等)に関し正確性を保証することに努めているが、幾つかの実験的誤差及び変動は許されるべきであろう。特に記さない限り、割合は重量に対する割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力はで、又はほぼ大気圧である。

0110

実施例1:核酸の合成

0111

核酸は市販のDNA合成装置に市販のフォスフォルアミダイトを用い、例えば参照されここに取り込まれているStecら、1984、J.Am.Chem,.Soc.106:6077−6089、Stecら、1985、J.Org.Chem.50(20);3908−3913、Stecら、1985、J.Chromatog.326−263−280、LaPlancheら、1986、Nuc.Acid.Res.14(22):9081−9093及びFasman、1989、Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology、CRCPress,Boca Raton、FL、に開示されている様な標準的な当分野良く知られているホスホールアミダイト化学及び方法を用い、<1uMないし>1mMのスケールで合成された。

0112

核酸はホスホールアミダイト製造メーカープロトコールに従い脱保護された。非精製核酸は真空下に乾燥するか、又は沈殿してから乾燥した。核酸のナトリウム塩は市販のDNA−Mate(バルコシガン社(Barkosigan Inc.))試薬、又は例えばDowex(デュポン(Dupont))の様な市販の交換樹脂の様な通常の技術を用い、あるいはナトリウム塩を添加した後にに、沈殿、透析濾過又はゲル濾過等を行うことにより調製されるか、又は精製工程に取り込まれた。

0113

実施例2:核酸の精製

0114

各種標準法を用い、本記載の抗細菌核酸を精製/産生した。簡単に述べると、抗細菌核酸は市販の逆相(例えば参照されここに取り込まれているレイニンインスツルメント社(RAININ Instrumetnt Co.,Inc),DYNAMAX(登録商標)−300A、Pure−DNA逆相カラム、1989の操作マニュアル、又はその現行改訂版を参照せよ)又はWater’s Protein Pak又はPharmacia’s Source Qの様なイオン交換媒体(一般には、Methodsin Molecular Biology、vol.26;Protocols for Nucleic Acid Conjugates、S.Agrawal編集、Hurnana Press、Inc.,Totowa、NJ、の中のWarrenとVella、1994、「高性能液体クロマトグラフィーによる合成核酸の分析と精製(Analysis and Purification of Synthetic Nucleic Acids by High−Performance Liquid Chromatography」;Aharonら、1993、J.Chrom.698:293−301;及びMillipore Technical Bulletin、1992、アンチセンスDNA:合成、精製及び分析(Synthesis、Purification、and Analysis)を用いたクロマトグラフィーにより精製された。ピーク分画を合わせ、サンプルを濃縮し、アルコール(エタノール、ブタノール、イソプロパノール及びイソマー、並びにその混合体等)沈殿により脱塩し、逆相クロマトグラフィー、透析濾過又はゲル濾過した。

0115

実施例3:核酸のプロトン付加/酸性化

0116

続いて、又は上記工程中に、精製、部分精製又は粗精製された核酸を低pH(例えば酸性)環境に曝すことで記載の核酸をプロトン付加/酸性化することができる。精製又は粗核酸はリン酸、硝酸、塩酸及び酢酸を含む酸によりプロトン付加/酸性化される。

0117

陰イオン交換(SAX)−精製オリゴヌクレオチド(約2−25A260/ml)のプール分画をPRP(ハミルトン社(Hamilton Co.))カラムポンプで送る。続いて直ぐに過剰の希釈酸(例えば25mMのHCl)を溶出液が酸性になるまで送る。次にカラムを溶出液の伝導度及びpHがバックグランドのレベルに戻るまで精製水(塩または緩衝液ではない)にて洗浄した。次にオリゴヌクレオチドを市販の真空エバポレーターで乾燥させた。あるいは、オリゴヌクレオチドを希釈酸中に懸濁し、上記同様にPRP又は同等のカラムのクロマトグラフィーにかけるか、又は溶媒として水を用いる分子篩カラム(例えばBioRad BiogeP2又はP4)のクロマトグラフィーにかけた。あるいは、所望の核酸をアルカリ塩溶液(例えば0.4MのNaCl及びpH12,25mMのNaOH)に溶解し、PRPカラムにかけ、酸で洗浄した後水で洗浄し、続いて上記同様にして溶出した。あるいは、核酸はH+形状にある陽イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィーにかけ、上記同様に採取し、乾燥させた。

0118

核酸は酸、例えばHCl(0.1N)を溶液のpHが1ないし3になるまで核酸溶液に直接加える(約300A260/ml)ことでも酸性化される。酸性化された核酸は次にBioRad BiogelP2又はP4カラムの様な酸安定型分子篩カラムにかけることができる。

0119

細菌実験で利用される凍結乾燥または乾燥沈殿体は発熱物質を含まない、滅菌された生理食塩水(即ち、0.85%食塩)、滅菌シグマ(Sigma)水に溶解されるか、そして0.45ミクロンゲルマンフィルターで濾過される(又は動物実験前に0.2ミクロン無発熱物質フィルターにかける)。

0120

水または生理食塩水中に懸濁する場合、核酸沈殿体は酸性化の工程に用いられた酸の量により決定されるプロトン付加/酸性化のレベルに応じ、典型的には1ないし4.5の間のpHを示した。

0121

実施例4:細菌増殖試験

0122

限定栄養増殖試験

0123

限定栄養増殖試験では、細胞をプレートから剥がし取り、PBSに懸濁して最終濃度105CFU/ml及び最終容積1mlを得た。ミューラーヒントブロスを加えた(S.aureusACC#13301に関しては40μl、P.aeruginosaACC#10145に関しては20μl)。水100μl又は核酸100μl(32A260単位、2’−O−メチルリボヌクレオチド、ホスホジエステル結合、5’及び3’逆転末端ブロック、配列CGCCATTGG、配列番号1)を加え、チューブ振盪せずに35℃で約24時間インキュベーションした。A625を測定し、コントロール対照)の%として%阻害を計算した。結果を下表に示す。

0124

定常増殖試験

0125

核酸の抗細菌活性に及ぼすpHの作用を研究するために、定常増殖試験も実施した。細胞をプレートから剥がし取り、PBS1ml中にS.aureusが最終濃度107CFU/mlになるように生理食塩水中に希釈した。水100μl又は核酸100μl(32A260単位、2’−O−メチルリボヌクレオチド、ホスホジエステル結合、5’及び3’逆転T末端ブロック、配列CGCCATTGG、配列番号1)を加え、チューブを振盪せずに35℃で約24時間インキュベーションした。一部を直接、又は希釈した後にプレートに播き、37℃にてインキュベーションし、24時間後にコロニー数を測定した。結果を下表に示す。

0126

これらの結果より、ヌクレオチドのpHを低下するとその殺菌及び静菌作用が付与されると結論した。次に、配列同一性と長さの効果について調べた。

0127

実施例5:抗細菌活性に及ぼす配列の作用

0128

まず定常増殖アッセイを行い、配列長の作用について調べた。細胞をプレートから剥がし取り、PBS1ml中にStrep.mutantsが最終濃度10
7CFU/mlになるように生理食塩水中に希釈した。水50μl又は核酸50μl(16A260単位)を加え、チューブを振盪せずに35℃で約24時間インキュベーションした。使用した各核酸は5’及び3’に逆転T末端ブロッキングを結合した2’−O−メチル置換リボヌクレオチドホスホジエステルより構成された。配列は:114.6−CGCCAT(配列番号2);114.12−ACGCGCCATTGG(配列番号3);114.21−GGAACGCGCCATTGGTTATC(配列番号4)であった。各核酸に関する下表記載の長さは5’及び3’末端の逆転Tsを含む。一部を直接、又は希釈した後にプレートに播き、37℃にてインキュベーションし、24時間後にコロニー数を測定した。結果を下表に示す。

0129

次に、限界栄養増殖アッセイを実施し、ヌクレオチドホモポリマー(AAAAAAAAAAAA、配列番号5;UUUUUUUUUUUU、配列番号6;GGGGGGGGGGGG、配列番号7;CCCCCCCCCCCC、配列番号8)の効果について調べた。使用した各ホモポリマーは、3’及び5’に逆転T末端ブロッキングを結合した、2’−O−メチル置換リボヌクレオチドホスホジエステルより構成された。細胞をプレートから剥がし取り、最終濃度105CFU/mlになるようにPBS1ml中に懸濁した。ミューラーヒントンブロスを加えた(S.aureusACC#13301に関しては40μl、P.aeruginosaACC#10145に関しては20μl)。水100μl又はpH1.5の核酸100μl(32A260単位)を加え、チューブを振盪せずに35℃で約24時間インキュベーションした。A625を測定し、コントロールの%として%阻害を計算した。結果を下表に示す。

0130

次に、限定栄養増殖アッセイを実施し、モノマー、ダイマー及びトリマーの作用について調べた。使用した各核酸は、ブタノールでブロッキングされた3’及び5’末端が連結された、2’−O−メチル置換リボヌクレオチドホスホジエステルより構成された。114.12と命名された核酸はACGCGCCATTAT、配列番号9の配列を有する。細胞をプレートから剥がし取り、最終濃度10
5CFU/mlになるようにPBS1ml中に懸濁した。ミューラーヒントンブロスを加えた(S.aureusACC#13301に関しては40μl、E.coliACC#35218に関しては20μl)。水25μl又はpH1.5の核酸25μl(8A260単位)を加え、チューブを振盪せずに35℃で約24時間インキュベーションした。A625を測定し、コントロールの%として%阻害を計算した。一部を直接、又は希釈後にプレートに播き、37℃にてインキュベーションし、24時間後にコロニー数を測定しCFUを決定した。結果を下表に示す。

0131

定常相アッセイを実施し、モノマー、ダイマー及びトリマーの作用について調べた。用いた各核酸は、ブタノールでブロッキングされた3’及び5’末端が連結された2’−O−メチル置換リボヌクレオチドホスホジエステルより構成された。114.12と命名された核酸はACGCGCCATTAT、配列番号9の配列を有する。細胞をプレートから剥がし取り、1mlのPBS中のA625がS.aureusに関しては0.08、E.coliに関しては0.12及びK.pneumoniaeに関しては0.1になる様に生理食塩水中に懸濁した。水25μl又は核酸25μl(8A260単位)を加え、チューブを振盪せずに35℃で約24時間インキュベーションした。一部を直接、又は希釈後にプレートに播き、37℃にてインキュベーションし、24時間後にコロニー数を測定しCFUを決定した。結果を下表に示す。

0132

結論として、これら結果はプロトン付加/酸性化された核酸の抗細菌作用物質として機能する能力が配列同一性には依存していないことを示している。更に、ホモポリマー及びモノマー同様に短い核酸も有用である。これら結果は、配列はオリゴヌクレオチドの活性にある役割を果たしているが、アンチセンスには依存しない、従って配列に依存しない別の抗細菌作用のメカニズムが存在することを示している。

0133

実施例6:インビボアッセイ

0134

抗細菌剤として本発明の作用を決定するためのインビボ研究の例を幾つか提供する。以下の実験は局所皮膚、及び外耳上皮、及び敗血症に関する全身治療の例に焦点をあてている。

0135

局所皮膚細菌感染での効果

0136

フルンケルと呼ばれる皮膚のオデキがプロトン付加/酸性化された核酸により治療された。フルンケルは典型的には毛嚢内に起因する局所性発熱性感染である。フルンケルは皮膚の円形の、柔らかなの溜まった領域であり、圧が加わると破裂する白色の頂部を発生する。フルンケルは毛嚢内最深部に感染することが多い。フルンケルは通常10−25日で治癒するだろう。治療しない場合、フルンケルは治癒する前に通常排膿する。これは2週間目に起こることが最も多い。フルンケルが深部障害の場合、フルンケルを開き排膿させる小さな手術に加え、細菌を除くための全身性抗生物質治療が必要である。要約すると、フルンケルは細菌の深部皮膚感染による痛みを伴う皮膚の膨潤であるが、治療なしに10日以内に治癒することは殆ど無い。

0137

ブドウ球菌フルンケルの治療に於けるプロトン付加/酸性化された核酸

0138

プロトン付加/酸化核酸は、36の健康な男性被験者の背にあった1.5cmのフルンケルの治療に効果を示した。8時間以内にプロトン付加/酸性化された核酸は迅速かつ劇的にフルンケルの痛みと/膨潤の両方を開放した。

0139

プロトン付加/酸性化された核酸(pH1.5、配列ACGCGCCATTAT、配列番号9)を用い、1.5cmのフルンケルが出現した1日後にそれを治療した。核酸は5’及び3’末端に逆転Tでブロックされた末端を結合した2’−O−メチル置換型リボヌクレオチドより構成された。具体的には100μlのプロトン付加/酸性化された核酸を水(18.9mモル)に溶解し、2−3mMのプステルを持つ隆起した赤い腫脹であり、且つ患者に痛みを与えていた1.5cmのフルンケルを処理した。処置8時間後、フルンケルは自然に排膿し、その大きさを約0.5cmと明瞭に縮小し、同時に腫脹及び発赤も減少した。被験者の痛みは大きく緩和された。この時点で50μlのプロトン付加/酸性化された核酸の2回目の適用を行った。

0140

最初の処置から16時間後、腫脹、痛み又は炎症は見られなかった。元のフルンケル域には<0.5cmの小さなピンク色の領域が残っていた。感染治療開始24時間後に最後のプロトン付加/酸性化された核酸の適用を行い、治癒のプロセスの加速を持続させた。フルンケルの瘢痕は、3回目の適用後1日以内に治癒した。

0141

結論すると、プロトン付加/酸性化された核酸はブドウ球菌フルンケルの迅速治療及び輸送媒体として水が利用に極めて有効であることが示された。プロトン付加/酸性化された核酸は特にフルンケルの痛み及び腫脹の迅速な解消に有用であった。

0142

感染局所治療での効果

0143

プロトン付加/酸性化された核酸Pseudomonas aeruginosa菌によるチンチラの外耳上皮感染に極めて有効であった。プロトン付加/酸性化された核酸治療を継続的に受けた全チンチラ感染例は、治療開始4日後には完全に治癒した。

0144

チンチラの耳はPseudomonas aeruginosa菌により感染させられた。具体的には、チンチラの耳の上皮層を長時間耳を水にさらし、これを浸軟化させた。これは、チンチラの耳管内の皮膚を裏打ちする上皮層にPseudomonas感染に関する受け入れ環境を作る上で役立つ。綿栓を洗浄したPseudomonas aeruginosaの懸濁液で飽和させ、それをチンチラの耳管内に挿入した。綿栓は48時間後に取り除いた。

0145

チンチラの治療は、耳鏡検査により耳に「レベル3」と判定された感染3日後に開始した。チンチラには2日間400μlのpH1.5のプロトン付加/酸性化された核酸配列、ACGCGCCATTAT、配列番号9の水溶液(2.8mモル)又は同一配列の400μlのプロトン付加/酸性化された核酸(2mモル)の賦形剤液(水/エタノール/プロピレングリコール)を与えた。核酸は5’及び3’の両端にブタノールでブロックされた末端を連結された2’−O−メチル弛緩型リボヌクレオチドである。チンチラは毎日耳感染の重症度の程度を基に治療有効性について調べられた。

0146

プロトン付加/酸性化された核酸治療の結果は、治療を受けた全てのチンチラの耳が、耳鏡検査による決定では耳感染の重症度を明確に軽減することを示した。明瞭な改善はプロトン付加/酸性化された核酸治療3回目以後に観察できた。チンチラは更に4ないし5日間治療を受けた。未治療のコントロールのチンチラはこの時間枠のなかでは改善を示さなかった。これに対し、持続的にプロトン付加/酸性化された核酸治療を受けた感染耳では、全例が感染7日目(即ち、プロトン付加/酸性化された核酸による治療開始から4日目)までに完治した。

0147

更に、2種類の輸送媒体、水又は賦形剤混合液(水/エタノール/プロピレングリコール)に溶解されたプロトン付加/酸性化された核酸には治癒の進行に若干差が認められた。耳鏡検査によれば、耳感染の治療では賦形剤混合液中のプロトン付加/酸性化された核酸の方が若干より効果的であった。

0148

結論すると、プロトン付加/酸性化された核酸は、Pseudomonas aeruginosaによるチンチラの外耳感染の治療に有効であることが示された。この菌は天然には抗生物質耐性菌であることから、有益である。

0149

イヌのStrep.pyogenes皮膚感染の治療に於ける効果

0150

135ポンド、2歳の雌ニューファンウンドラン腹部に持続的に創傷を作り、Strep.pyogenes感染を起こさせた。この領域は膨潤し、炎症を起こし、接触に対し痛みを発した。Neosporin(登録商標)(ワーナーランバート社(Warner−Lambert、Co)による3日間の治療は失敗し、何らの改善ももたらさなかった。12時間の間隔を開け2回、5’及び3’両端にブタノールでブロックされた末端、pH1.5がホスホジエステル結合されている、ACGCGCCATTAT(配列番号9)を持つ2’−O−メチル弛緩型リボヌクレオチドを直接創傷部に作用させたところ、完全に感染、膨潤、炎症及び接触に対する感受性が解消された。

0151

感染の局所Pseudomonas火傷モデルに於けるプロトン付加/酸性化された核酸の効果

0152

プロトン付加/酸性化された核酸は、免疫−易感染性マウスでの局所皮膚感染の治療に効果を示した。マウスは皮膚に火傷を進行させ免疫系を阻害するためにシクロホスファミド(200mg/kg、腹膜内投与)で処置された。3日後、火傷が誘導され、続いて109CFUのPseudomonas aeruginosaが火傷部に局所適用され、感染を起こさせた。治療は感染4時間及び8時間眼に行われた。実験に使用された核酸は、pH1.5に於いて、配列ACGCGCCATTAT、配列番号9を持つ、5’及び3’の両端にブタノールがホスホジエステル結合され、ブロックされている末端を持つ2’−O−メチル弛緩型リボヌクレオチドである。治療を受けた動物は100%生存し、全身性のPseudomonas感染は認められなかったが、一方コントロールの動物では90%が全身感染を起こし、死亡した。プロトン付加/酸性化された核酸は局所感染を治癒できた。更に、核酸の局所適用は局所Pseudomonas感染の致死的な全身性の感染への進行を防ぐこともできた。

0153

感染の全身性Pseudomonas火傷モデルに於けるプロトン付加/酸性化された核酸の効果

0154

マウスを皮膚火傷誘導後106又は107CFUのPseudomonas aeruginosaでS.C.(皮下)処理した。感染2時間後、酸性化された核酸による治療を開始した。投与量の40%はI.V.(静脈内)投与し、残りはS.C投与された。実験に使用された核酸は、pH1.5に於いて、配列ACGCGCCATTAT、配列番号9を持つ、5’及び3’の両端にブタノールがホスホジエステル結合され、ブロックされている末端を持つ2’−O−メチル弛緩型リボヌクレオチドである。操作は6時間後に繰り返された。2日目及び3日目に、追加の皮下注射が1日2回行われた。45匹のコントロール動物全例死亡したが、40匹の処置マウスは全例生存し、健康であった。これら処置、健康マウスを屠殺し、敗血症について調べた。Pseudomonas菌は脾臓、肝臓又は血液中には検出されなかった。

0155

結論として、プロトン付加/酸性化された核酸は未治療で放置すると致死的になる全身性Pseudomonas感染の治療に100%有効であった。

0156

実施例7:プロトン付加/酸性化された核酸の毒性

0157

45匹の動物(マウス、オス/C57Balb/c)にプロトン付加/酸性化された核酸治療を皮下、腹腔内注射又は局所適用した。マウスを無作為に選び、試験開始時は約6ないし8週齢であった(25−30グラム体重)。マウスを1箱に5匹づつ飼育し、環境管理された部屋の中で自由に食物と水を摂らせ維持した。

0158

マウス(1グループ5匹)には毎日、14日間、配列ACGCGCCATTAT、配列番号9のpH1.5のプロトン付加/酸性化された核酸又は水が注射された。核酸は5’及び3’の両端にブタノールがホスホジエステル結合され、ブロックされている末端を持つ2’−O−メチル弛緩型リボヌクレオチドである。治療は腹腔内投与皮下投与又は局所投与により実施された。

0159

処理期間中、いずれのマウスについても生存及び毒性徴候を毎日観察した。検死は最終注射24時間後に実施された。検死では全体腔及び臓器について完全な調査が実施された。選択した臓器は固定され、組織検査用に染色された。所見の要約は以下の通りである。

0160

死亡率及び臨床所見

0161

試験期間中、いずれのマウスも完全に活動的であり、最高用量100mg/kgにおいてさえ試験期間中異常行動臨床徴候は認められなかった。

0162

臨床化学

0163

試験した臨床化学パラメータの中では、肝臓酵素アルカリホスファターゼALTAST)及び総ビルルビン値に異常は認められなかった。平均血清アルカリホスファターゼ、ALT及びASL値は、賦形剤コントロール値有意差を示さず、毒性の証拠は無いことが示された。間接及び直接ビルルビン値は、これら賦形剤処理コントロールと差を示さず、腎臓又は肝臓異常がないことが示された。

0164

全体検死

0165

試験期間中、注射部位については、最高用量の核酸の場合でもそれに伴う局所炎症反応を示す全体的証拠はないことが観察により判明した。いずれの臓器についても、肥大又は壊死を示す視覚徴候は無かった。具体的には、14連続日100mg/kg/日を投与した場合でも、コントロール動物に比べ脾臓、肝臓、又は腎臓に肥大は認められなかった。

0166

組織学

0167

種組織のスライドは、コントロールと処置動物との間に差が無いことを示した。要約すると、主要結果は次の通りである:
(1)処置群コントロール群での酵素レベルに大きな増加は無かった。
(2)オリゴにて処置された動物の何れについても、大きな異常の徴候は無かった。
(3)いずれの動物も健康を維持し、試験期間中機敏であった。
(4)いずれの投与経路(腹腔内、皮下、局所)も同様の結果をもたらした。

0168

結果は、プロトン付加/酸性化された核酸は、100mg/kgの日投与量、14日間に於いてさえ、そしてその投与経路に関係なく無毒であることを示した。

0169

本発明をその特異的実施態様を参照しながら記載したが、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく各種変更が可能であり、そして等価物により置き換えることができることを、当業者は理解すべきである。更に、多くの改変を行うことで特定の状態、材料、物質組成、工程、工程段階又は複数段階、を本発明の目的、精神及び範囲に適合させることができるだろう。これら改変の全てはここに添付されたクレームの範囲内のものである。

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