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技術 D−アラビトールの製造方法及びその実施に用いる新規微生物

出願人 三菱商事フードテック株式会社
発明者 兎束保之長沼孝文西村克史小島貴士近藤敏弘尾藤幸枝
出願日 2000年12月28日 (20年6ヶ月経過) 出願番号 2000-401267
公開日 2002年7月9日 (19年0ヶ月経過) 公開番号 2002-191388
状態 特許登録済
技術分野 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理
主要キーワード 原料消費量 キヤン 進捗度 発酵性試験 偽菌糸 グルコース消費量 成分構成 生成能力
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この項目の情報は公開日時点(2002年7月9日)のものです。
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課題

資化可能な炭素源原料とした微生物によるD−アラビトール生成反応において、グリセロールエリスリトールなどの多価アルコール類生産することが無く、高い選択性を有し、なおかつ、原料消費量に対して高収率でD−アラビトールを製造する方法を提供する。

解決手段

カンジダパラシロシスに属し、資化可能な炭素源からD−アラビトールを選択的に生産する能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスFERM P−18006を用いてD−アラビトールを製造する。

概要

背景

概要

資化可能な炭素源原料とした微生物によるD−アラビトール生成反応において、グリセロールエリスリトールなどの多価アルコール類生産することが無く、高い選択性を有し、なおかつ、原料消費量に対して高収率でD−アラビトールを製造する方法を提供する。

カンジダパラシロシスに属し、資化可能な炭素源からD−アラビトールを選択的に生産する能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスFERM P−18006を用いてD−アラビトールを製造する。

目的

効果

実績

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請求項1

カンジダパラシロシスに属し、資化可能な炭素源からD−アラビトールを選択的に生産する能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスFERM P−18006を用いた、D−アラビトールの製造方法。

請求項2

D−アラビトールの製造にあたり、培地中のpHを1.0〜6.0とすることを特徴とする、請求項1に記載のD−アラビトールの製造方法。

請求項3

受託番号 FERM P−18006として寄託されている、カンジダ・パラプシロシスに属する新規微生物。

0001

本発明は、D−アラビトールの製造方法及びその方法を実施するために用いる新規微生物に関し、詳細には、甘味料として有用であるだけでなく、キシロースキシリトール原料としても有用であるD−アラビトールについて、選択的且つ高収率で製造することを可能とするカンジダパラシロシス(Candida parapsilosis)に属する新規微生物、及びそれを実施するために用いた資化可能な炭素源からのD−アラビトールの製造方法に関する。

0003

従来、微生物を用いたD−アラビトールの生産には様々な方法が検討されていたが、何れも選択性や収率に問題が有り、これらの要望を同時に満たすことは困難であった。

0005

例えば、カンジダ(キヤンジダ)属、サッカロミセス属、ピヒヤ属、デバリオミセス属に属する微生物を利用した、発酵法によるD−アラビトールの生成は既に知られているが、D−アラビトール以外にグリセロールエリスリトールなどの多価アルコール類がかなりの割合で同時に生成するという欠点があり、また、原料消費量に対するD−アラビトールの生成収率においても満足できるものではなかった。

0006

さらに、特開昭54−145284号公報では、カンジダ・トルロプシス(Candida toruropsis)に属する微生物を採用することにより、グリセロール、エリスリトールなどの多価アルコール類を生成しない製造方法を紹介しているが、原料消費量に対するD−アラビトールの生成収率は十分なものとは言えなかった。

0007

本発明が解決しようとする課題は、資化可能な炭素源を原料とした微生物によるD−アラビトールの生成反応において、グリセロールやエリスリトールなどの多価アルコール類を生産することが無く、高い選択性を有し、なおかつ、原料消費量に対するD−アラビトールへの生成収率が高い、D−アラビトールの製造方法、及びD−アラビトールの生産能力を有する新規微生物を提供することにある。

0009

本発明者らの鋭意研究の結果、カンジダ・パラプシロシスに属し、山梨県の菓子工場敷地内から発見された新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスNo.123(工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに平成12年8月29日付けでFERM P−18006として寄託されている。)が、D−アラビトールの製造において高選択性と高収率が望める菌体であることを見出し、本発明を完成するに至った。

0011

すなわち、本発明の課題を解決するための手段は、次のとおりである。

0012

第1に、カンジダ・パラプシロシスに属し、資化可能な炭素源からD−アラビトールを選択的に生産する能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスFERM P−18006を用いた、D−アラビトールの製造方法。第2に、D−アラビトールの製造にあたり、培地中のpHを1.0〜6.0、好ましくは1.1〜5.0、更に好ましくは1.2〜4.0とすることを特徴とする、上記第1に記載のD−アラビトールの製造方法。第3に、受託番号 FERM P−18006として寄託されている、カンジダ・パラプシロシスに属する新規微生物。

0013

以下、この新菌株菌学的性質を説明する。

0014

なお、以下の説明、発明の実施の形態、各実施例、比較例において使用する培地の成分構成は、次のとおりである。

0015

0016

カンジダ・パラプシロシスNo.123(FERM P−18006)の菌学的性質

0017

(1)生育状態
栄養細胞の大きさ:5.4×4.9μm(注1)
栄養細胞の形:楕円形卵形(注1)
栄養細胞の増殖法:多極出芽(注1)
菌糸体偽菌糸を形成した(注2)
コロニーの様子:なめらかクリーム
D.B.B染色:呈色せず(子嚢菌と判定)
胞子の形成:形成せず(注3)

0018

(注1)カンジダ・パラプシロシスNo.123の保存菌体をプレート状のYM培地に1白金耳接種し、25℃で2日間、菌体の前培養を行った。培養後の菌体を、Malt extract液体培地に1白金耳接種し25℃、120strokes/minで振盪培養し、サンプリングした菌体を光学顕微鏡を用いて測定した。
(注2)注1と同様の方法で菌体を前培養した後、Corn meal agarプレートに1白金耳接種し25℃で培養し、2日ごとに顕微鏡観察した。
(注3)注1と同様の方法で菌体を前培養した後、Fowell’s acetateプレートとMaClary’s acetateプレートにそれぞれ1白金耳ずつ接種し25℃で18日間培養し、顕微鏡で観察した。

0019

(2)生理的性
酸素要求性:好気
生育温度:20〜37℃
最適生育温度:25℃
ビタミン要求性:Biotin free、ビタミン9種(Biotin、Ca−Pantothenate、Folic acid、Inositol、Niacin、p−Aminobenzoic acid、Prydoxine、Riboflavin、Thiamin)freeで生育なし

0020

(3)炭素源の発酵性
発酵性試験用培地の調製
発酵性試験用基本培地を、Durham管を逆さに入れた試験管に4.0ml分注し、次いで発酵性評価を行う炭素源を溶解した10%(w/v)炭素源溶液(ただし、Soluble starch 、Inulinは5%で実施)を1.0ml、BT溶液0.3mlを無菌的に添加したものを調製した。なお、発酵性評価を行う炭素源がSoluble starch、Inulin、Raffinoseの場合、発酵性試験用基本培地の添加量を3.0ml、炭素源溶液の添加量を2.0mlとして調製した。
培養
カンジダ・パラプシロシスNo.123の保存菌体をYM液体培地に1白金耳摂取し、OD660≒1.0(分光光度計による660nmでの濁度測定値)となるまで振盪培養(25℃、120strokes/min.)した。振盪培養後、遠心集菌を行い、滅菌蒸留水で2回洗浄を行った後、滅菌蒸留水でOD660≒0.1の菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液0.1mlを上記発酵性試験用培地に接種し、25℃、静置培養を行い、Durham管内の気体蓄積の様子を観察した。炭素源の発酵性は表2に記載の基準に従って評価した。各種炭素源の発酵性の結果は表3に記載した。

0021

0022

0023

(4)炭素源の資化性
資化性試験用培地の調製
Yeast Nitogen base(Difco社製)水溶液(13.4g/100ml)と、10%(w/v)炭素源水溶液を調製し、それぞれの水溶液250μlと滅菌蒸留水4.5mlを、滅菌済みの試験管に無菌的に分注し、これを炭素源資化性試験用培地とした。なお、炭素源を含まない培地として、Yeast Nitogen base水溶液(13.4g/100ml)250μlと滅菌蒸留水4.75mlからなる培地も調製した。
培養
カンジダ・パラプシロシスNo.123の保存菌体をGPY液体培地に1白金耳接種し、OD660≒1.0となるまで振盪培養(25℃、120strokes/min.)した。滅菌蒸留水による遠心洗浄を2回行った後、3〜6mlの滅菌蒸留水を用いて菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を炭素源資化性試験用培地がOD660≒0.01となるように接種し、振盪培養(25℃、120strokes/min.)を行った。
評価
振盪培養中の生育の様子について、1日目、3日目、7日目、14日目、21日目に肉眼比濁黒線(3/4mm幅の黒線を引いた白い紙)を用いて、肉眼比濁用黒線の前に試験管(7ml/18×180mm)を置き、その線の見え方を表4の基準で評価した。21日間の培養終了時に菌の生育が観測されなかった培地については、培養液のOD660の値を測定した。炭素源資化性については、菌体の生育状況と培地の濁度を総合した表5の基準に基づいた評価で判定し、その結果を表6にまとめた。

0024

0025

0026

0027

(6)窒素源の資化性
資化性試験用培地の調製
Yeast Carbon base(Difco社製)水溶液(23.4g/100ml)と、窒素源水溶液を調製し、それぞれの水溶液250μlと滅菌蒸留水4.5mlを、滅菌済みの試験管に無菌的に分注し、これを窒素源資化性試験用培地とした。窒素源水溶液の濃度は、Nitrate(硝酸カリウム)が0.78g/50ml、Nitrite(亜硝酸ナトリウム)が0.26g/50ml、Cadaverineが0.68g/50ml、L−lysineが0.56g/50ml、その他の窒素源については3.5g/50mlである。なお、窒素源を含まない培地として、Yeast Carbon base水溶液(23.4g/100ml)250μlと滅菌蒸留水4.75mlからなる培地を調製し、ブランクとして評価した。
培養
炭素源資化性試験と同様に行った。
評価
炭素源資化性試験と同様の評価方法を用いて資化性を判定し、結果を表7にまとめた。

0028

0029

本発明を実施するために使用する微生物としては、資化可能な炭素源からD−アラビトールを選択的かつ高収率に生産する能力を有するものであればよく、具体的にはカンジダ・パラプシロシスに属する、新規微生物であるカンジダ・パラプシロシスNo.123(工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにFERM P−18006として寄託されている。)を採用でき、また、その変異株包含する。変異株は、親株から、たとえば紫外線X線γ線などの照射、または適当な変異剤による処理などの慣行法によって得ることができる。カンジダ・パラプシロシスに属する菌体の培養方法は、液体培地を用いて好気的条件下攪拌培養することにより実施されることが望ましい。

0031

液体培地の主炭素源としてはグルコースフルクトーススクロース糖蜜または、これらの混合物など、各種糖質の使用が可能である。なお、これら糖質の培地中における量的割合としては、D−アラビトールの生成を妨げない範囲であれば自由に選択できる。液体培地に添加される糖類の濃度条件は、5〜40%(w/v)、好ましくは10〜30%(w/v)、更に好ましくは15〜20%(w/v)である。液体培地中の炭素源となる糖類の濃度が40%(w/v)を超えると、浸透圧が高くなり、微生物によるアラビトールの生成能力が低下するため好ましくない。また、液体培地に添加される糖類の濃度が5%(w/v)を下回った場合、液体培地中に含まれる炭素源の絶対量が少なくなり、D−アラビトールの製造が効率的に行われなくなるため好ましくない。

0032

液体培地に使用される窒素源としては、微生物が利用可能な窒素化合物であればよく、例えば酵母エキスなどが使用できる。また、液体培地には必要に応じて、リン酸カリウム硫酸アンモニウムなどの種々の無機塩類を添加することもできる。D−アラビトールの生成は、液体培地に菌体を直接接種するか、または別に種培養液を調製しそれを液体培地に接種しても良い。種培養液は、D−アラビトールの生成に用いられる培地と同組成の液体培地に直接菌体を接種し、25℃で1〜2日間程度培養することで得ることができる。

0033

培養温度は微生物が発育し得る範囲内で適宜設定されるが、通常10〜40℃、好ましくは20〜30℃、更に好ましくは25℃前後である。培地温度が40℃を超えたり10℃を下回ると、微生物の活性が急激に低下し、D−アラビトールの生成量が低下するため好ましくない。D−アラビトールの生成に用いられる培地のpHは、1.0〜6.0、好ましくは1.1〜5.0、更に好ましくは1.2〜4.0である。pHが7.0を超えると、D−アラビトールの生成量が著しく低下するため好ましくない。本発明における培養期間は、培地の種類及び主炭素源である糖質の濃度により異なるため、各種条件に応じて適宜変更すべきであるが、培地中の炭素源が最大限消費された時点か、もしくは培養液中のD−アラビトール生成量が最大となった時点で終了させることが望ましく、通常3〜10日程度である。培養の進捗度は、ガスクロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィーなどの方法を用い、培養液中のD−アラビトールを定量することで、容易に測定が可能である。また、培養の進行度、培養液調製、各種溶液の添加量などの目安として、それぞれの溶液の濁度(Optical Density:OD)を用いることも可能である。濁度は分光光度計によって特定波長散乱光を測定することで、求めることができる。

0034

本発明では、グリセロールやエリスリトールといった副生成物を生じること無く、選択的にD−アラビトールを生成することが可能であった。その結果、使用した炭素源消費量当たりのD−アラビトール生成収率(D−アラビトール生産量/炭素源消費量)は、30%以上、好ましくは40%以上であり、最大で50%を超えるものであった。

0035

このようにして得られた培養液中のD−アラビトールは、常法によって培養液中から単離、精製することが可能であり、ろ過、遠心分離イオン交換さらには、吸着クロマトグラフィー結晶化など公知の手段を適宜組み合わせることで実施できる。例えば、培養液から遠心分離によって菌体を除去し、次いで活性炭処理により着色物質などを除き、さらにイオン交換樹脂により脱イオンし、生成した培養液を濃縮乾固する。これに熱エタノール等の有機溶媒を加えてD−アラビトールを抽出し、抽出液をそのまま室温または冷却下に放置すると白色のD−アラビトール結晶が晶析する。このようにして得たD−アラビトール結晶をエタノールなどの有機溶媒を用いて再結晶を行うことにより、純粋なD−アラビトール結晶を得ることができる。以下に、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲は以下の例に制限されるものではない。

0036

なお、以下の実施例、比較例で使用する液体培地の成分組成は、次のとおりである。

0037

0038

カンジダ・パラプシロシスNo.123(FERM P−18006)の保存菌体を、0.2NのNaOHでpH5.5に調整した5%グルコース液体培地(7ml/18mm×180mm試験管)に1白金耳接種し、25℃、120strokes/minで振盪培養を行い、液体培地の濁度が分光光度計(HITACHI model 101 Spectrometer)による測定でOD660≒1.0になるまで振盪培養を行い、前々培養液を得た。この前々培養液を、YM液体培地の濁度がOD660≒0.01となるまで接種させ、その中の100mlを500ml容振盪フラスコに分注し、48時間振盪培養し前培養液を得た。この前培養液を滅菌済み遠沈管(500ml容ポリアロマ製)に全量入れ、冷凍遠心機(HITACHI・20PR−52D)を用いて遠心分離(4500rpm、20min、4℃)を行い、上清廃棄し菌体を回収した。回収した菌体に、12M−HClでpH1.8に調整した15%グルコース液体培地を添加、懸濁させて、液体培地がOD660≒100になるように調製した。菌体を添加した上記液体培地100mlをメスシリンダーに計りとり、500ml容振盪フラスコに分注し、これを25℃、120strokes/minで振盪培養を行った。振盪培養120時間目でこの培養液のHPLC分析を行ったところ、培養液中のD−アラビトールの生産量は70.74g/L(収率50.7%=D−アラビトール生産量/グルコース消費量)であった。

0040

カンジダ・パラプシロシスNo.123(FERM P−18006)の保存菌体を、0.2NのNaOHでpH5.5に調整した5%グルコース液体培地(8ml/18mm×180mm試験管)に1白金耳接種し、25℃、120strokes/minで振盪培養を行った。振盪培養は液体培地の濁度がOD660≒1.0になるまで行い、これを前培養液とした。前培養終了後、前培養液を滅菌済み綿栓付き試験管に全量入れ、遠心機を用いて遠心分離を行い、菌体を回収した。その後滅菌水を加えて懸濁した後、再び遠心分離を行い菌体を回収する操作を2回行い、菌体洗浄を行った。集菌洗浄後、0.1NのNaOHでpHを4.8に調整した15%フルクトース液体培地に対して、OD660≒0.01となるように洗浄済みの菌体を接種し、滅菌済み綿栓付き500ml容振盪フラスコに100ml分注した。この溶液を25℃、120strokes/minで10日間振盪培養した。振盪培養240時間目でこの培養液中に含まれるD−アラビトールは、76.40g/L(収率50.9%=D−アラビトール生産量/フルクトース消費量)であった。

0042

カンジダ・オレオフィラNo.161の保存菌体を、実施例2と同様の方法で前培養及び前培養した菌体の集菌洗浄を行った。集菌洗浄後、0.1NのNaOHでpHを5.5に調整した15%グルコース液体培地に対して、OD660≒0.01となるように洗浄済みの菌体を接種し、25℃、120strokes/minで10日間振盪培養した。D−アラビトール生産量は、31.14g/L(収率20.8%=D−アラビトール生産量/グルコース消費量)であり、リビトール2.45g/L(収率1.6%)も同時に生成した。また、この菌体は培養時に高い発泡性を有した。

0044

各実施例及び比較例の培養結果を、表9に示す。

0045

0046

本発明によれば、資化可能な炭素源を原料とした微生物によるD−アラビトールの生成反応において、グリセロールやエリスリトールなどの多価アルコール類を生産することが無く、高い選択性を有し、なおかつ、原料からD−アラビトールへの生成収率が高いD−アラビトールの製造方法を提供できる。

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