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課題

生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法において、化学分析による測定値と高い相関を有する値を簡単な操作のもとに得る測定方法を提供しようとする。

解決手段

マスター試料群を構成する試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を化学的に測定して個々の該試料に対応する測定値A1,A2・・・Anを得て、一方、生物反応を指標として測定し、個々の該試料に対応する指標測定値B1,B2・・・Bnを得て、α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・αn=An/Bnの調和平均値αを求め、ある測定物についてそれに含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を同様な生物反応を指標として測定し、その指標測定値をBとし、A=α・Bを測定値とする。ダイオキシン類の毒性に作用する遺伝子組み換え細胞ルシフェリンにより生成したルシフェラーゼ発光基質を加えて発光量を測定し、前記指標測定値を得ることが出来る。

概要

背景

近来、化学物質による、大気水域土壌等の環境の汚染が、大きな問題となっている。この問題に対処するためには、環境の汚染の度合いの測定が不可欠であり、測定の高精度化能率化のための測定技術の開発が進められている。しかし、ダイオキシン等の微量の化学物質による環境の汚染の度合いの測定については、ppbあるいはそれ以上の測定精度が必要とされ、非常に高価な測定装置と、それを扱う高度な操作技術が必要であり、かつ、ダイオキシン等の範疇に該当する多種の異性体等の化合物ごとに濃度を測定せねばならず、多大の工数を要するのが現状である。

この測定は、通常、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)を用いて、微量の分子質量スペクトルを測定して行なわれ、一検体について1乃至1.5ヵ月の測定分析の期間を要している。

この点に鑑み、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法、即ち、バイオアッセイの手法を応用して、被測定物の毒性や生物活性感度良くかつ短期間に測定する方法が採用されてきている。この方法は、被測定物の毒性や生物活性を、その被測定物に含有されている化学物質や薬物の種類や種類の多さにかかわらずトータルとしての毒性や生物活性を生物反応を利用して測定するので、化学物質や薬物の構成要素である各化合物ごとに特有化学分析の難しさを回避でき、能率的な方法といえる。

しかし、バイオアッセイの手法を応用したこの方法は、あくまで相対的な値を得るものであり、化学分析による測定値との対応をつける必要がある。従って、この対応をつけるための検量線の作成や、統計処理に労力を要する。

化学分析による測定値yと、バイオアッセイによる測定値xとの対応は、通常、両者の関係を表す回帰曲線を求めることにより行なわれ、y=f(x)となるような統計的に最適な関数fを回帰分析により求める。関数fが非線形であると回帰分析が非常に複雑になるので多くの場合回帰直線が適用される。即ち、y=ax+bとなるような最適のa、bを求めることが行なわれる。くわしくは、各測定値の組(x1,y1),(x2,y2)・・・(xn,yn)をxy座標における点の位置として、その各点から直線y=ax+bに至る距離の二乗和を最小とするa0,b0を求め、一次式y=a0x+b0を回帰直線とする。

しかし、生物反応に関する測定値は、生物反応に特有の、反応のばらつき従ってデータのばらつきや、データのバイアスを伴うので、このような線形相関モデルでは、よい相関がとれないことがある。他方、複雑な非線形モデルでは回帰分析の計算も複雑になり、実用的でない。

また、被測定物に含有される化合物や薬物の種類の構成が、標準となる検量線の作成のために採取した試料と大きく異なる場合は、その検量線の適用が大きな誤差生むこともあり、被測定物が、検量線の作成のために採取した試料の母集団に属しているかどうかの確認が必要である。この確認にはそのための各種の試料についての測定が必要となり、その分余分に労力がかかることになる。

概要

生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法において、化学分析による測定値と高い相関を有する値を簡単な操作のもとに得る測定方法を提供しようとする。

マスター試料群を構成する試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を化学的に測定して個々の該試料に対応する測定値A1,A2・・・Anを得て、一方、生物反応を指標として測定し、個々の該試料に対応する指標測定値B1,B2・・・Bnを得て、α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・αn=An/Bnの調和平均値αを求め、ある測定物についてそれに含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を同様な生物反応を指標として測定し、その指標測定値をBとし、A=α・Bを測定値とする。ダイオキシン類の毒性に作用する遺伝子組み換え細胞ルシフェリンにより生成したルシフェラーゼ発光基質を加えて発光量を測定し、前記指標測定値を得ることが出来る。

目的

効果

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請求項1

生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法において、該被測定物を含む母集団Sからマスター試料群を準備し、該マスター試料群を構成するそれぞれの試料について、該試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を化学的に測定して個々の該試料に対応する測定値A1,A2・・・An(nは該試料の数)を得て、該マスター試料群を構成するそれぞれの該試料について、該試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を生物反応を指標として測定し、個々の該試料に対応する指標測定値B1,B2・・・Bnを得て、α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・αn=An/Bnを計算し、α1,α2・・・αnの調和平均値αを求め、該被測定物について該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を該生物反応を指標として測定し、その指標測定値をBとし、H=α*Bを計算し、Hを該被測定物の、該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定値とすることを特徴とする、生物反応を利用した、被測定物の、該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定方法

請求項2

生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法において、母集団Sからマスター試料群を準備し、該マスター試料群を構成するそれぞれの試料について、該試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を化学的に測定して個々の該試料に対応する測定値A1,A2・・・An(nは該試料の数)を得て、該マスター試料群を構成するそれぞれの該試料について、該試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を生物反応を指標として測定し、個々の該試料に対応する指標測定値B1,B2・・・Bnを得て、α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・αn=An/Bnを計算し、α1,α2・・・αnの調和平均値αを求め、被測定物を含み、母集団Sと同一でない母集団S´から、m個(m≧4)の試料から成る副マスター試料群を準備し、該副マスター試料群を構成するそれぞれの該試料について、該要因の効果を化学的に測定して個々の該試料に対応する測定値C1,C2・・・Cmを得て、該副マスター試料群を構成するそれぞれの該試料について、該要因の効果を生物反応を指標として測定し、個々の該試料に対応する指標測定値D1,D2・・・Dmを得て、β1=C1/D1,β2=C2/D2・・・βm=Cm/Dmを計算し、β1,β2・・・βmの調和平均値βを求め、|((α−β)/α)|≦0.5のとき該母集団S´から採取した被測定物について該要因の効果を該生物反応を指標として測定し、その指標測定値をDとし、H´=α・Dを計算し、H´を該母集団S´から採取した該被測定物の,該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定値とすることを特徴とする、生物反応を利用した、被測定物の、該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定方法。

請求項3

前記マスター試料群が4個以上の試料から成ることを特徴とする請求項1又は2に記載の生物反応を利用した要因の効果の測定方法。

請求項4

前記被測定物に含まれる化学物質や薬物を構成する個々の要素化学物質や要素薬物それぞれの、該被測定物に対する含有濃度をP1,P2・・・Pr(rは要素化学物質や要素薬物の数)とし、該要素化学物質や要素薬物それぞれの要因の効果の係数をQ1,Q2・・・Qrとしたとき、化学的に測定された前記被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果Eが、

請求項

ID=000002HE=020 WI=044 LX=1280 LY=1100であることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の生物反応を利用した化学物質や薬物の要因の効果の測定方法。

請求項5

前記被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果が、ダイオキシン類に起因する毒性であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の生物反応を利用した化学物質や薬物の要因の効果の測定方法。

請求項6

前記要素化学物質や要素薬物が、2,3,7,8位塩素置換ダイオキシン類又はコプラナーPCBに属する化合物であることを特徴とする請求項5に記載の生物反応を利用した化学物質や薬物の要因の効果の測定方法。

請求項7

前記生物反応を指標として測定した指標測定値の測定が、要因の効果の値が判っていてかつ該値が異なる複数の標準試料をそれぞれ細胞暴露し、該細胞を薬品で溶解し、溶解した該細胞のそれぞれにルシフェリンを添加し、この添加により生成したルシフェラーゼ発光基質を加えて発光量をそれぞれ測定し、検量線を作成し、被測定試料を該細胞と同種の細胞に暴露し、該同種の細胞を薬品で溶解し、溶解した該同種の細胞にルシフェリンを添加し、この添加により生成したルシフェラーゼに発光基質を加えて発光量を測定し、前記検量線により検量して得た要因の効果の値を該被測定試料の指標測定値とするものであることを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の生物反応を利用した化学物質や薬物の要因の効果の測定方法。

技術分野

0001

本発明は、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、被測定物の要因の効果、例えば毒性や薬学的な効能等の、生物反応を利用した測定方法に関する。なかでも、ダイオキシン等の化学物質に起因する被測定物の毒性の測定に特に有効な、生物反応を利用した測定方法に関する。

背景技術

0002

近来、化学物質による、大気水域土壌等の環境の汚染が、大きな問題となっている。この問題に対処するためには、環境の汚染の度合いの測定が不可欠であり、測定の高精度化能率化のための測定技術の開発が進められている。しかし、ダイオキシン等の微量の化学物質による環境の汚染の度合いの測定については、ppbあるいはそれ以上の測定精度が必要とされ、非常に高価な測定装置と、それを扱う高度な操作技術が必要であり、かつ、ダイオキシン等の範疇に該当する多種の異性体等の化合物ごとに濃度を測定せねばならず、多大の工数を要するのが現状である。

0003

この測定は、通常、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)を用いて、微量の分子質量スペクトルを測定して行なわれ、一検体について1乃至1.5ヵ月の測定分析の期間を要している。

0004

この点に鑑み、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法、即ち、バイオアッセイの手法を応用して、被測定物の毒性や生物活性感度良くかつ短期間に測定する方法が採用されてきている。この方法は、被測定物の毒性や生物活性を、その被測定物に含有されている化学物質や薬物の種類や種類の多さにかかわらずトータルとしての毒性や生物活性を生物反応を利用して測定するので、化学物質や薬物の構成要素である各化合物ごとに特有化学分析の難しさを回避でき、能率的な方法といえる。

0005

しかし、バイオアッセイの手法を応用したこの方法は、あくまで相対的な値を得るものであり、化学分析による測定値との対応をつける必要がある。従って、この対応をつけるための検量線の作成や、統計処理に労力を要する。

0006

化学分析による測定値yと、バイオアッセイによる測定値xとの対応は、通常、両者の関係を表す回帰曲線を求めることにより行なわれ、y=f(x)となるような統計的に最適な関数fを回帰分析により求める。関数fが非線形であると回帰分析が非常に複雑になるので多くの場合回帰直線が適用される。即ち、y=ax+bとなるような最適のa、bを求めることが行なわれる。くわしくは、各測定値の組(x1,y1),(x2,y2)・・・(xn,yn)をxy座標における点の位置として、その各点から直線y=ax+bに至る距離の二乗和を最小とするa0,b0を求め、一次式y=a0x+b0を回帰直線とする。

0007

しかし、生物反応に関する測定値は、生物反応に特有の、反応のばらつき従ってデータのばらつきや、データのバイアスを伴うので、このような線形相関モデルでは、よい相関がとれないことがある。他方、複雑な非線形モデルでは回帰分析の計算も複雑になり、実用的でない。

0008

また、被測定物に含有される化合物や薬物の種類の構成が、標準となる検量線の作成のために採取した試料と大きく異なる場合は、その検量線の適用が大きな誤差生むこともあり、被測定物が、検量線の作成のために採取した試料の母集団に属しているかどうかの確認が必要である。この確認にはそのための各種の試料についての測定が必要となり、その分余分に労力がかかることになる。

発明が解決しようとする課題

0009

本発明は、これら従来の測定方法の問題点に鑑み、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法において、化学分析による測定値と高い相関を有する値を簡単な操作のもとに得る測定方法を提供しようとする。

課題を解決するための手段

0010

本発明の要旨とするところは、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法において、該被測定物を含む母集団Sからマスター試料群を準備し、該マスター試料群を構成するそれぞれの試料について、該試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を化学的に測定して個々の該試料に対応する測定値A1,A2・・・An(nは該試料の数)を得て、該マスター試料群を構成するそれぞれの該試料について、該試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を生物反応を指標として測定し、個々の該試料に対応する指標測定値B1,B2・・・Bnを得て、α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・αn=An/Bnを計算し、α1,α2・・・αnの調和平均値αを求め、該被測定物について該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を該生物反応を指標として測定し、その指標測定値をBとし、H=α*Bを計算し、Hを該被測定物の、該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定値とすることを特徴とする、生物反応を利用した、被測定物の、該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定方法であることにある。

0011

又、本発明の要旨とするところは、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法において、母集団Sからマスター試料群を準備し、該マスター試料群を構成するそれぞれの試料について、該試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を化学的に測定して個々の該試料に対応する測定値A1,A2・・・An(nは該試料の数)を得て、該マスター試料群を構成するそれぞれの該試料について、該試料に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果を生物反応を指標として測定し、個々の該試料に対応する指標測定値B1,B2・・・Bnを得て、α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・αn=An/Bnを計算し、α1,α2・・・αnの調和平均値αを求め、被測定物を含み、母集団Sと同一でない母集団S´から、m個(m≧4)の試料から成る副マスター試料群を準備し、該副マスター試料群を構成するそれぞれの該試料について、該要因の効果を化学的に測定して個々の該試料に対応する測定値C1,C2・・・Cmを得て、該副マスター試料群を構成するそれぞれの該試料について、該要因の効果を生物反応を指標として測定し、個々の該試料に対応する指標測定値D1,D2・・・Dmを得て、β1=C1/D1,β2=C2/D2・・・βm=Cm/Dmを計算し、β1,β2・・・βmの調和平均値βを求め、|((α−β)/α)|≦0.5のとき該母集団S´から採取した被測定物について該要因の効果を該生物反応を指標として測定し、その指標測定値をDとし、H´=α・Dを計算し、H´を該母集団S´から採取した該被測定物の,該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定値とすることを特徴とする、生物反応を利用した、被測定物の、該被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定方法であることにある。

0012

前記マスター試料群は4個以上の試料から成り得る。

0013

前記生物反応を利用した化学物質や薬物の要因の効果の測定方法は、該被測定物に含まれる化学物質や薬物を構成する個々の要素化学物質や要素薬物それぞれの、該被測定物に対する含有濃度をP1,P2・・・Pr(rは要素化学物質や要素薬物の数)とし、該要素化学物質や要素薬物それぞれの要因の効果の係数をQ1,Q2・・・Qrとしたとき、化学的に測定された前記被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の値Eを

0014

0015

となし得る。

0016

前記被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果は、ダイオキシン類に起因する毒性であり得る。

0017

前記要素化学物質や要素薬物はいずれも、2,3,7,8位塩素置換ダイオキシン類又はコプラナーPCBに属する化合物であり得る。

0018

前記生物反応を指標として測定した指標測定値の測定は、要因の効果の値が判っていてかつ該値がおのおの異なる複数の標準試料をそれぞれ細胞暴露し、該細胞を薬品で溶解し、溶解した該細胞のそれぞれにルシフェリンを添加し、この添加により生成したルシフェラーゼ発光基質を加えて発光量をそれぞれ測定し、検量線を作成し、被測定試料を該細胞と同種の細胞に暴露し、該同種の細胞を薬品で溶解し、溶解した該同種の細胞にルシフェリンを添加し、この添加により生成したルシフェラーゼに発光基質を加えて発光量を測定し、前記検量線により検量して得た要因の効果の値を該被測定試料の指標測定値とするものであり得る。

発明を実施するための最良の形態

0019

本発明の、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法の手順を説明する。

0020

先ず、特定の化学物質や薬物を含む物体の母集団からその特定の化学物質や薬物が異なる割合で含まれている複数個の試料を採取する。特定の化学物質や薬物は一種類であってもよいが、母集団の物体が複数種の特定の化学物質や薬物を含んでいる場合には本発明の方法が特に有効である。この複数個の試料から成る試料群をマスター試料群と称する。

0021

先ず、マスター試料群を構成する個々の試料について、この特定の化学物質や薬物の含有率をその化学物質や薬物のそれぞれの組成ごとに化学分析の手法により測定する。個々の試料についての特定の化学物質や薬物の要因の効果(A)、例えば、毒性、薬効等は、各組成物の含有率(c1,c2・・・ct:tは組成物の種類の数)と、予め定められている各組成物の要因の効果に対する係数(e1,e2・・・et)との積を、各組成物について足し込んだ数値(A=c1*e1+c2*e2+・・・+ct*et)として求められる。

0022

化学分析の手法により測定された試料ごとの要因の効果を(A1,A2・・・An:nは試料の数)とする。nは4以上であることが本発明の測定精度を確かにするうえで好ましい。

0023

一方、このマスター試料群を構成する個々の試料について、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果Bを測定する。この効果は、生物反応により生じた酸素炭酸ガス等の化学物質や呈色や、発光や、電位等の物理現象である。これらを化学量あるいは物理量として測定した、要因の効果の指標測定値を(B1,B2・・・Bn)とする。

0024

ここで、(A1,A2・・・An)と(B1,B2・・・Bn)とを数式で関係づけてBからAを求める式を得ることにより、測定が非常に熟練と工数を要するAの測定に代えてBを測定し、数式で換算して、化学分析の手法により測定された要因の効果Aに相当する要因の効果Hを求めるようにするのである。

0025

前述のように、この換算式としては、線形即ち一次式が用いられるのであるが、必ずしも良い相関が得られず、又、一次式といえども式の確定や、値の換算にはかなりの手間がかかった。

0026

一次式で必ずしも良い相関が得られないのは、生物反応特有の原因によるものと考え、これに替わる換算方式があると思い、A/Bの比に基づく測定値の導出に想達した。以下にこの態様を説明する。

0027

本発明においては、化学分析の手法により測定された要因の効果Aに相当する、要因の効果の測定値Hとして、H=R*Bを用いる。即ち、生物反応を利用して測定された、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果の指標測定値Bに比例定数Rを乗ずることにより、Hを求める。比例定数Rは、次のようにして求められる。

0028

先ず、各試料についてA/Bを求める。即ち、(α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・αn=An/Bn)を求める。次いで、(α1,α2・・・αn)の調和平均値α=1/((1/α1+1/α2+・・・+1/αn)/n)を求める。

0029

これにより得られたαを比例定数Rとして用い、生物反応を利用して測定された、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果の指標測定値Bから、H=α*Bを計算する。このHが、求める化学分析の手法により測定された要因の効果Aに相当する、要因の効果の測定値である。

0030

なお、上述のαは計算上は小数点以下多くの桁数にわたって求められるが、本発明においては、αは、計算上のαを所定の桁或いは精度で切り捨て、切り上げ四捨五入、二捨三入、或いはその他の数値の丸めを行なったものとして定義される。又、Hの値に対しては、所定の桁で切り捨て、切り上げ、四捨五入、二捨三入、或いはその他の数値の丸めを行なってもよい。更に、本発明の測定方法により得られた測定値に微小定数を加えて微調整してもよい。

0031

従来の回帰分析により求めた直線回帰式により、Bの値から被測定物の要因の効果の換算された測定値を得る方法に比べ、本発明のこのように換算して得られた測定値は、同じ被測定物の化学分析により求められた要因の効果の値との相関が極めて高いのである。

0032

又、単に各試料についてA/Bを求め、即ち、(α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・αn=An/Bn)を求め、その算術平均値からH´=*Bを算出することも行なわれ得るが、この算術平均値を用いて換算して得られた測定値は、上記の調和平均値αを用いる方法に比べて、化学分析の手法により測定された要因の効果Aとの相関が低いのである。

0033

又、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定するときには、上述のように、本発明の場合においても、従来の手法を用いた場合でも、予め、組成の判っているマスター試料群を用意して、化学分析による要因の効果の測定と、生物反応を利用した要因の効果の指標測定値の測定を行ない、相互の関係を求め、この関係に基づいて、新たに採取した被測定物の、生物反応を利用して得られた指標測定値を換算することが行なわれる。従って、その新たに採取した被測定物が組成の判っているマスター試料群と同じ母集団に属していることが前提となる。ここで、同じ母集団に属さないとは、適用される生物反応が、その母集団に属している試料にはみられないような特異な生物反応を示すことを意味する。このようなケースは、被測定物が、その母集団に属している試料にはみられないような特異な化学物質や薬物を含む場合や、各組成の比率の構成がその母集団に属している試料にはみられないような特異なものであるときに発生し得る。

0034

新たに採取した被測定物が組成の判っているマスター試料群と同じ母集団に属しているかどうかの判定については、従来は、新たに採取した被測定物の群に対してマスター試料群について行なったと同様の化学分析による測定と、生物反応による指標測定値の測定を行い、同様に直線回帰式を求め、この直線回帰式がマスター試料群について求められた直線回帰式と同様なものとみなせれば新たに採取した被測定物がマスター試料群と同じ母集団に属していると判定する。これは煩雑であり、マスター試料群による直線回帰式を求める意味がなくなる場合もある。

0035

本発明の他の態様においては、このような、新たに採取した被測定試料から成る副マスター試料群が、組成の判っているマスター試料群の属する母集団と同一の、もしくは同一の性格の母集団に属しているかどうかの判定について、極めて簡易かつ有効な方法を提供する。

0036

副マスター試料群の属する母集団S´は、マスター試料群の属する母集団Sと全くは同一でない。全く同一とわかっていればこのような判定はもともと不要である。母集団S´が、マスター試料群の属する母集団Sと同一の性格の母集団に属していると推定される場合、母集団S´が母集団Sの一部であると推定される場合、母集団S´の一部が母集団Sに含まれると推定される場合、母集団S´が母集団Sに全く含まれないと懸念される場合、等に判定を行なう。以下にこの態様を説明する。

0037

新たに採取した複数の試料から成る副マスター試料群の、化学分析の手法により測定されたその試料ごとの要因の効果Cを(C1,C2・・・Cm:mは被測定物の数)とする。又、生物反応を利用して、に含まれる化学物質や薬物に起因する、その試料の要因の効果を測定する。この効果は、生物反応により生じた酸素、炭酸ガス等の化学物質や呈色や、発光や、電位等の物理現象である。これらを化学量あるいは物理量として測定し、そのまま、もしくは所定の検量線を用いて変換した、要因の効果の指標測定値Dを(D1,D2・・・Dm)とする。前述の場合と同様にC/Dの調和平均βを求める。即ち、(β1=C1/D1,β2=C2/D2・・・βn=Cn/Dn)を求める。次いで、(β1,β2・・・βn)の調和平均値β=1/((1/β1+1/β2+・・・+1/βn)/n)を求める。このβの値が、マスター試料群についての上述の調和平均αと|((α−β)/α)|≦0.5の関係のとき、副マスター試料群が採取された母集団S´が、マスター試料群の属する母集団Sと同一もしくは同一の性格を有する母集団に属するとみなすことが出来る。

0038

このようにみなすことが出来るとき、母集団S´から採取した被測定物について該要因の効果を該生物反応を指標として測定し、その指標測定値をDとし、H´=α・Dを計算し、H´を母集団S´から採取した被測定物の,その被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定値とすることが出来る。

0039

又、|((α−β)/α)|≦0.25の関係のときには、更に確実に副マスター試料群をマスター試料群の属する母集団と同一もしくは同一の性格の母集団に属するとみなすことが出来、上記の換算による方法の確実性が更に向上する。

0040

副マスター試料群を構成する被測定物即ち試料の数mは、少なくとも4であればよく、上述の、被測定物の群に対して直線回帰式を求める従来の方法に比べはるかに少ない試料により、被測定物が属する母集団の群が、マスター試料群の属する母集団と同一の母集団もしくは同一の性格の母集団に属するか否かを判定出来る。

0041

次に、実施例をもって本発明の効果を説明するが、本発明は以下の実施例の態様に限定されるものではなく、生物反応を利用して、被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する、該被測定物の要因の効果を測定する方法に汎用的に適用出来るものである。

0042

(実施例)ヒトの脂肪組織を21個採取し、21個の試料から成るマスター試料群とした。

0043

各試料について、ダイオキシン類を構成する化合物(ダイオキシン9種、ジベンゾフラン11種、コプラナーPCB12種)の含有量を、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)を用いて測定した。ダイオキシン9種とは、1,3,6,8−TeCDD、1,3,7,9−TeCDD、2,3,7,8−TeCDD、1,2,3,7,8−PeCDD、1,2,3,4,7,8−HxCDD、1,2,3,6,7,8−HxCDD、1,2,3,7,8,9−HxCDD、1,2,3,4,6,7,8−HpCDD、OCDDであり、ジベンゾフラン11種とは、1,2,7,8−TeCDF、2,3,7,8−TeCDF、1,2,3,7,8−PeCDF、2,3,4,7,8−PeCDF、1,2,3,4,7,8−HxCDF、1,2,3,6,7,8−HxCDF、1,2,3,7,8,9−HxCDF、2,3,4,6,7,8−HxCDF、1,2,3,4,6,7,8−HpCDF、 1,2,3,4,7,8,9−HpCDF、OCDFであり、コプラナーPCB12種とは、3,4,4´,5−TeCB(#81)、3,3´,4,4´−TeCB(#77)、3,3´4,4´,5−PeCB(#126)、3,3´4,4´,5,5´−HxCB(#169)、2´,3,4,4´,5−PeCB(#123)、2,3´,4,4´,5−PeCB(#118)、2,3,3´,4,4´−PeCB(#105)、2,3,4,4´,5−PeCB(#114)、2,3´,4,4´,5,5´−HxCB(#167)、2,3,3´,4,4´,5−HxCB(#156)、2,3,3´,4,4´,5´−HxCB(#157)、2,3,3´,4,4´,5,5´−HpCB(#189)である。

0044

それぞれの化合物について、測定された濃度に、それぞれの化合物についての毒性等価係数TEF(WHO−1977)を乗じて、個々の毒性等量EQを求め、そのそれぞれの化合物についての毒性等量TEQを、すべての化合物について合計して総毒性等量Total TEQ を求め、このTotal TEQをその試料の要因の効果の測定値とした。表1に測定結果の一例を示す。

0045

0046

即ち、この測定においては、該被測定物に含まれる化学物質や薬物を構成する個々の要素化学物質や要素薬物(ここではダイオキシン類を構成する化合物(ダイオキシン9種、ジベンゾフラン11種、コプラナーPCB12種)それぞれの、該被測定物に対する含有濃度をP1,P2・・・Pr(rは要素化学物質や要素薬物の数、ここでは32)とし、該要素化学物質や要素薬物それぞれの要因の効果の係数それぞれの化合物の毒性等価係数TEF)をQ1,Q2・・・Qrとしたとき、化学的に測定された前記被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果E(ここでは総毒性等量(Total TEQ))が、

0047

0048

として求められる。

0049

一方、このマスター試料群を構成する21種類の試料それぞれについて、生物反応を利用して、これらの試料に含まれるダイオキシン類に起因する毒性を、Xenobiotic Detection Systems International,Inc.社が USP 5854010 を取得しているCALUXTMAssayというバイオアッセイ法により測定した。この方法の原理を説明する。

0050

ダイオキシン類は脂溶性性質をもっていて、細胞膜を通り抜け、細胞内に入ることが出来る。ダイオキシン類は種類により程度の差はあるが、細胞内のAhレセプター(AhR)と結合するリガンドとしての性質を持つものが多く、リガンドとしてのダイオキシン類が細胞内に入ると、AhRを活性化してAhRとリガンドとのAhR複合体ができる。AhR複合体ができると、AhRの形が変化し、細胞の核に運搬される。核内では、活性化したAhRがAhR核運搬プロテイン(ARNT)と呼ばれるタンパク質と複合体を形成する。AhR核運搬プロテインは、DNAの特定の配列を認識しており、この配列に結合する。この特定の配列はXREと呼ばれる。活性化したAhRがXREと結合すると、XRE下流の遺伝子が発現する。このようなXREのコントロール下にある遺伝子には、チトクロムP450酵素(CYP1A1)を含みいくつかある。このような仕組みにおいて、リガンドが存在するとき、活性化したAhR−ARNTがXREに結合すると、遺伝子が転写される。転写されて作られるメッセンジャーRNAmRNA)は、核外に運搬され細胞質に入る。細胞質の中でmRNAが翻訳され、新しいタンパク質が合成される。このタンパク質がダイオキシン類の毒性発現と考えられている。

0051

CALUXTMAssay法においては、Ahレセプターのコントロール下にある別の遺伝子を組換えている。この遺伝子は、ホタルの光を発光させる酵素であるルシフェラーゼを作る。この結果、CALUXTMAssay法においては、この組換え細胞をダイオキシン類等のリガンドに触れさせることにより、CYP1A1・タンパク質とホタルのルシフェラーゼ・タンパク質との両方が増殖する仕組みになっている。この仕組みにより、ルシフェラーゼの発光量を測定すれば、それが試料中のダイオキシンTEQ濃度と直接対応する値として得られることになる。

0052

以下に測定の手順を記す。
1.標準物質の準備ダイオキシン類に起因する毒性を有する標準物質として、2,3,7,8−TCDDを準備し、段階的に希釈して、数段階の標準物質試料を作る。
2.被測定試料の前処理 被測定試料を溶媒処理し、ダイオキシン類を抽出する。その抽出液を2種類のカラムクロマトグラフィーで精製・分離処理を行ない、ポリ塩化ジベンゾパラ−ジオキシンポリ塩化ジベンゾフランとコプラナーPCBの分画を行なう。
3.標準物質試料及び被測定試料への細胞の暴露標準物質試料及び被測定試料を懸濁させた培地を組換え細胞に投与し、適当時間培養する。
4.細胞の溶解細胞膜を溶解するため薬品(界面活性剤溶液)を添加し、ダイオキシンの暴露によって生成されたルシフェラーゼを細胞外へ放出させる。
5.発光量の測定 得られたルシフェラーゼに発光基質を加え、発光される発光量をルミノメーターを用いて測定する。
6.検量線の作成 段階的に希釈した数段階の標準物質試料についての、発光量と濃度の関係を示す検量線を作成する。
7.2,3,7,8−TCDD毒性等量(TEQ)の決定 被測定試料の発光量から、得られた検量線に基づき標準物質に相当する2,3,7,8−TCDD毒性等量(TEQ)を求める。

0053

このような手順により、マスター試料群を構成する21種類の試料それぞれについてバイオアッセイ法により求めた総毒性等量(TEQ−CALUX)の値B(B1,B2・・・B21)と、表1におけると同様に高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)により求めた総毒性等量(TEQ—HRGCMS)の値A(A1,A2・・・A21)を表2に示す。

0054

0055

この2組の値の相関図及び回帰直線、回帰式図1に示す。又、この2組の値の相関を表す図を図2に示す。図中縦軸はTEQ値、横軸試料番号である。■点は(A1,A2・・・A21)、◆点は(B1,B2・・・B21)である。

0056

一方、各試料についてA/Bを求めた。即ち、(α1=A1/B1,α2=A2/B2・・・α21=A21/B21)を求めた。次いで、(α1,α2・・・α21)の調和平均値α=1/((1/α1+1/α2+・・・+1/α21)/21)を求め、α=0.75を得た。

0057

α=0.75を比例定数Rとして、それぞれのTEQ−CALUXの値に乗じて換算TEQとした。TEQ—HRGCMSの値の組と、換算TEQの値の組との値の相関を表す図を図3に示す。図中縦軸はTEQ値、横軸は試料番号である。■点はTEQ—HRGCMSの値の組(A1,A2・・・A21)、◆点は換算TEQの値の組である。

0058

他方、バイオアッセイ法により求めた総毒性等量(TEQ−CALUX)の値B(B1,B2・・・B21)から上記の回帰直線式により(A´1,A´2・・・A21´)を求めた。TEQ—HRGCMSの値の組とこの回帰式換算TEQの値A´との値の相関を表す図を図4に示す。図中縦軸はTEQ値、横軸は試料番号である。■点はTEQ—HRGCMSの値の組(A1,A2・・・A21)、◆点は回帰式換算TEQの値の組である。

0059

図2、3、4の結果が示すように、調和平均値αを用いて得られた換算TEQが最も高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)により求めた総毒性等量(TEQ—HRGCMS)の値との相関が高かった。

0060

又、(α1,α2・・・α21)の算術平均値として=0.79を得た。0.79を比例定数Rとして、それぞれのTEQ−CALUXの値に乗じて算術平均換算TEQとした。TEQ—HRGCMSの値の組と、算術平均換算TEQを用いて得られたの値の組と、調和平均値を用いて得られた換算TEQの値の組と、回帰式から換算した換算TEQの値の組とを表2に示す。表2において、各組のなかで、換算TEQの値と、高分解能能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)により求めた総毒性等量(TEQ—HRGCMS)の値との差の絶対値を求め、その平均値を求めた。平均値は、算術平均換算TEQの値の組によるものが8.41、調和平均換算TEQの値の組によるものが7.55、回帰式換算TEQの値の組によるものが8.09と、調和平均換算TEQの値の組によるものが最も小さく、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)により求めた総毒性等量(TEQ—HRGCMS)の値との相関が高い。

発明の効果

0061

本発明の、生物反応を利用した、被測定物の、その被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定方法は、測定の途中で得られる生データに単純な計算操作を施すだけで、化学分析で得られるその被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定値と極めて相関の高い測定値を得ることが出来る。

0062

更に、本発明の生物反応を利用した、被測定物の、その被測定物に含まれる化学物質や薬物に起因する要因の効果の測定方法を用いることにより、被測定物の測定結果を所定の換算式により換算するにあたり、その被測定物がその換算式を求めるときに測定に供した試料群を含む母集団から採取され、その換算式を用いて換算可能かどうかを、その被測定物が含まれるある集団から採取された少ない数の試料に対し、その換算式を求めるときに行なわれた測定と同様の測定による測定値に単純な計算操作を施すだけで、検定出来る。

図面の簡単な説明

0063

図1マスター試料群を構成する21種類の試料それぞれについてバイオアッセイ法により求めた総毒性等量(TEQ−CALUX)の値(B1,B2・・・B21)と、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)により求めた総毒性等量(TEQ—HRGCMS)の値(A1,A2・・・A21)との相関図及び回帰直線である。
図2マスター試料群を構成する21種類の試料それぞれについてバイオアッセイ法により求めた総毒性等量(TEQ−CALUX)の値(B1,B2・・・B21)と、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)により求めた総毒性等量(TEQ—HRGCMS)の値(A1,A2・・・A21)との相関を表す図である。
図3各試料について高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)により求めた総毒性等量(TEQ—HRGCMS)の値Aと、バイオアッセイ法により求めた総毒性等量(TEQ−CALUX)の値Bとの比A/Bを求め、次いで、その比の値の調和平均値α=0.75をそれぞれのTEQ−CALUXの値に乗じた換算TEQの値の組と、TEQ—HRGCMSの値の組との相関を表す図である。
図4高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGCMS)により求めた総毒性等量(TEQ—HRGCMS)の値Aと、バイオアッセイ法により求めた総毒性等量(TEQ−CALUX)の値Bとの回帰直線式により求めた、(TEQ−CALUX)を換算した回帰式換算TEQの値の組と、TEQ—HRGCMSの値の組との相関を表す図である。

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