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技術 ボツリヌス毒素遺伝子の検出及び定量方法

出願人 郷田浩志東和科学株式会社
発明者 木村凡藤井健夫
出願日 2000年12月13日 (19年4ヶ月経過) 出願番号 2000-378793
公開日 2002年6月25日 (17年10ヶ月経過) 公開番号 2002-176982
状態 未登録
技術分野 生物学的材料の調査,分析 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 設計合成 食品製造業者 熱変成 フィレー 相違部分 調理済食品 PCR阻害物質 発ガン性物質
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2002年6月25日)のものです。
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図面 (7)

課題

解決手段

被検試料中のボツリヌス毒素遺伝子を定量的PCRによって検出及び定量することを特徴とするボツリヌス毒素遺伝子の検出・定量方法ボツリヌス菌の検出方法及びボツリヌス毒素の検出方法。

概要

背景

ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は、グラム陽性嫌気性桿菌で、ボツリヌス食中毒原因菌である。ボツリヌス食中毒は、ボツリヌス菌から放出されるタンパク質性毒素ボツリヌス毒素)によって引き起こされる。ボツリヌス菌は、毒素に対する血清型からA〜Gの7つの型に分けられ、特にA、B及びE型がヒトの食中毒の原因菌とされる。ボツリヌス毒素は、神経毒タンパク質で、1〜2μgの量でヒトを死に至らせる。毒素は通常80℃、30分間の熱処理によって不活化されるが、食品の不十分な殺菌処理によって生き残ったボツリヌス菌は、や袋等の嫌気的条件下で増殖して毒素を放出し得る。現在までに、欧米諸国では、肉類腸詰などの加工食品によるボツリヌス食中毒が、日本では、ニシンのいずし、真空包装辛子蓮根によるボツリヌス食中毒が知られている。

ところで、1990年代入り世界規模での食に対する新しい傾向として、消費者嗜好が、素材の自然な風味を生かし、可能な限り加熱処理をせず且つ食品添加物を使用しない食品への移行が見られるようになっている。また、調理をせずに、すぐ食べることのできる調理済食品に対するニーズは増加しており、前記の傾向と併せて、自然な風味を保持し且つ簡便な食品に対するニーズは高まる一方である。これらの食品は、変質を抑えるために、熱処理を極力抑え、密封包装された形態で提供される場合が多い。そのような状況の中、食品製造業者にとって嫌気的条件下で増殖するボツリヌス菌の汚染検査は極めて重要な検査項目となっている。

従来、食品のボツリヌス菌汚染検査は、ボツリヌス毒素又はボツリヌス菌の検出によって行われてきた。具体的には、ボツリヌス毒素の検出は、マウスを用いる毒性試験及び毒素型を決定するための中和試験により行われ、ボツリヌス菌の検出は、嫌気条件下での培養及び熟練者によるボツリヌス菌の同定により行われてきた。しかし、これらの方法は、前者はマウスを維持管理するための施設人手が必要とされ、後者は、ボツリヌス菌の検出に熟練日数を要し、迅速に検出結果を下すことは困難であった。

また、より迅速にボツリヌス毒素を検出する方法として、酵素結合イムノソルベントアッセイELISA)を利用する方法や、ボツリヌス菌を検出する方法として、PCRを用いる方法が開発されているが、前者は、エンドポイントアッセイであるために、きめ細かなリスク評価には適しておらず、後者はPCR増幅産物を通常電気泳動によって検出するため、ゲルの調製、電気泳動に要する時間、処理可能なサンプル数発ガン性物質エチジウムブロマイドを使用する点など、操作上及び安全性に問題があり、いずれも、簡便性、迅速性及び安全性等の求められる食品検査現場のニーズには適していない。

概要

ボツリヌス毒素遺伝子検出方法の提供。

被検試料中のボツリヌス毒素遺伝子を定量的PCRによって検出及び定量することを特徴とするボツリヌス毒素遺伝子の検出・定量方法、ボツリヌス菌の検出方法及びボツリヌス毒素の検出方法。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

一方のプライマーが配列番号2で、他方のプライマーが配列番号3で表される塩基配列からなるものであるボツリヌスA型毒素遺伝子増幅用プライマーペア、及び配列番号4で表される塩基配列中チミンが5-プロピン-2'-デオキシウリジン置換されている塩基配列からなるボツリヌスA型毒素遺伝子検出用標識プローブを含むボツリヌスA型毒素遺伝子の検出及び定量用キット

請求項2

一方のプライマーが配列番号6で、他方のプライマーが配列番号7で表される塩基配列からなるものであるボツリヌスB型毒素遺伝子増幅用プライマーペア、及び配列番号8で表される塩基配列からなるボツリヌスB型毒素遺伝子検出用標識プローブを含むボツリヌスB型毒素遺伝子の検出及び定量用キット。

請求項3

一方のプライマーが配列番号10で、他方のプライマーが配列番号11で表される塩基配列からなるものであるボツリヌスE型毒素遺伝子増幅用プライマーペア、及び配列番号12で表される塩基配列からなるボツリヌスE型毒素遺伝子検出用標識プローブを含むボツリヌスE型毒素遺伝子の検出及び定量用キット。

請求項4

請求項1〜3に記載のいずれかの検出及び定量用キットに、さらに、配列番号13で表される塩基配列からなるボツリヌスA型毒素mRNA逆転写用プライマー、配列番号14で表される塩基配列からなるボツリヌスB型毒素mRNA逆転写用プライマー及び配列番号15で表される塩基配列からなるボツリヌスE型毒素mRNA逆転写用プライマーのいずれかの逆転写用プライマーを加えてなるボツリヌスA型、B型又はE型毒素mRNAの検出及び定量用キット。

請求項5

請求項1〜4に記載のいずれかの検出及び定量用キットを用いて、ボツリヌスA型、B型又はE型毒素遺伝子を検出及び定量することを特徴とする、ボツリヌスA型、B型又はE型毒素遺伝子の検出及び定量方法

請求項6

請求項1〜4に記載のいずれかの検出及び定量用キットを用いて、ボツリヌスA型、B型又はE型毒素遺伝子を検出及び定量することを特徴とする、ボツリヌスA型、B型又はE型菌の増殖リスク評価方法

請求項7

請求項1〜4に記載のいずれかの検出及び定量用キットを用いて、ボツリヌスA型、B型又はE型毒素遺伝子を検出及び定量することを特徴とする、ボツリヌスA型、B型又はE型菌の検出方法

技術分野

列番号32:合成DNA

背景技術

0001

本発明は、ボツリヌス毒素遺伝子の検出及び定量用キット、それを用いるボツリヌス毒素遺伝子の検出及び定量方法に関する。

0002

ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は、グラム陽性嫌気性桿菌で、ボツリヌス食中毒原因菌である。ボツリヌス食中毒は、ボツリヌス菌から放出されるタンパク質性毒素ボツリヌス毒素)によって引き起こされる。ボツリヌス菌は、毒素に対する血清型からA〜Gの7つの型に分けられ、特にA、B及びE型がヒトの食中毒の原因菌とされる。ボツリヌス毒素は、神経毒タンパク質で、1〜2μgの量でヒトを死に至らせる。毒素は通常80℃、30分間の熱処理によって不活化されるが、食品の不十分な殺菌処理によって生き残ったボツリヌス菌は、や袋等の嫌気的条件下で増殖して毒素を放出し得る。現在までに、欧米諸国では、肉類腸詰などの加工食品によるボツリヌス食中毒が、日本では、ニシンのいずし、真空包装辛子蓮根によるボツリヌス食中毒が知られている。

0003

ところで、1990年代入り世界規模での食に対する新しい傾向として、消費者嗜好が、素材の自然な風味を生かし、可能な限り加熱処理をせず且つ食品添加物を使用しない食品への移行が見られるようになっている。また、調理をせずに、すぐ食べることのできる調理済食品に対するニーズは増加しており、前記の傾向と併せて、自然な風味を保持し且つ簡便な食品に対するニーズは高まる一方である。これらの食品は、変質を抑えるために、熱処理を極力抑え、密封包装された形態で提供される場合が多い。そのような状況の中、食品製造業者にとって嫌気的条件下で増殖するボツリヌス菌の汚染検査は極めて重要な検査項目となっている。

0004

従来、食品のボツリヌス菌汚染検査は、ボツリヌス毒素又はボツリヌス菌の検出によって行われてきた。具体的には、ボツリヌス毒素の検出は、マウスを用いる毒性試験及び毒素型を決定するための中和試験により行われ、ボツリヌス菌の検出は、嫌気条件下での培養及び熟練者によるボツリヌス菌の同定により行われてきた。しかし、これらの方法は、前者はマウスを維持管理するための施設人手が必要とされ、後者は、ボツリヌス菌の検出に熟練日数を要し、迅速に検出結果を下すことは困難であった。

発明が解決しようとする課題

0005

また、より迅速にボツリヌス毒素を検出する方法として、酵素結合イムノソルベントアッセイELISA)を利用する方法や、ボツリヌス菌を検出する方法として、PCRを用いる方法が開発されているが、前者は、エンドポイントアッセイであるために、きめ細かなリスク評価には適しておらず、後者はPCR増幅産物を通常電気泳動によって検出するため、ゲルの調製、電気泳動に要する時間、処理可能なサンプル数発ガン性物質エチジウムブロマイドを使用する点など、操作上及び安全性に問題があり、いずれも、簡便性、迅速性及び安全性等の求められる食品検査現場のニーズには適していない。

課題を解決するための手段

0006

本発明は、ボツリヌス毒素遺伝子の検出及び定量用キット、それを用いるボツリヌス毒素遺伝子の検出及び定量方法に関する。

0007

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、定量的PCRを採用することによって、非常に特異的且つ高感度にボツリヌス毒素遺伝子を検出及び定量することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

0008

すなわち、本発明は、一方のプライマーが配列番号2で、他方のプライマーが配列番号3で表される塩基配列からなるものであるボツリヌスA型毒素遺伝子増幅用プライマーペア、及び配列番号4で表される塩基配列中チミンが5-プロピン-2'-デオキシウリジン置換されている塩基配列からなるボツリヌスA型毒素遺伝子検出用標識プローブを含むボツリヌスA型毒素遺伝子の検出及び定量用キットである。

0009

さらに、本発明は、一方のプライマーが配列番号6で、他方のプライマーが配列番号7で表される塩基配列からなるものであるボツリヌスB型毒素遺伝子増幅用プライマーペア、及び配列番号8で表される塩基配列からなるボツリヌスB型毒素遺伝子検出用標識プローブを含むボツリヌスB型毒素遺伝子の検出及び定量用キットである。

0010

さらに、本発明は、一方のプライマーが配列番号10で、他方のプライマーが配列番号11で表される塩基配列からなるものであるボツリヌスE型毒素遺伝子増幅用プライマーペア、及び配列番号12で表される塩基配列からなるボツリヌスE型毒素遺伝子検出用標識プローブを含むボツリヌスE型毒素遺伝子の検出及び定量用キットである。

0011

さらに、本発明は、上記のいずれかの検出及び定量用キットに、さらに、配列番号13で表される塩基配列からなるボツリヌスA型毒素mRNA逆転写用プライマー、配列番号14で表される塩基配列からなるボツリヌスB型毒素mRNA逆転写用プライマー及び配列番号15で表される塩基配列からなるボツリヌスE型毒素mRNA逆転写用プライマーのいずれかの逆転写用プライマーを加えてなるボツリヌスA型、B型又はE型毒素mRNAの検出及び定量用キットである。

0012

さらに、本発明は、上記のいずれかの検出及び定量用キットを用いて、ボツリヌスA型、B型又はE型毒素遺伝子を検出及び定量することを特徴とする、ボツリヌスA型、B型又はE型毒素遺伝子の検出及び定量方法である。

0013

さらに、本発明は、上記のいずれかの検出及び定量用キットを用いて、ボツリヌスA型、B型又はE型毒素遺伝子を検出及び定量することを特徴とする、ボツリヌスA型、B型又はE型菌の増殖リスク評価方法である。

発明を実施するための最良の形態

0014

さらに、本発明は、上記のいずれかの検出及び定量用キットを用いて、ボツリヌスA型、B型又はE型毒素遺伝子を検出及び定量することを特徴とする、ボツリヌスA型、B型又はE型菌の検出方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

0015

本発明は、定量的PCRによるボツリヌス毒素遺伝子の検出及び定量方法である。ここで、「定量的PCR」とは、反応系中に存在する所望のDNA又はRNAをPCRを用いて検出及び定量することができる遺伝子増幅技術をいう。定量的PCRとしては、以下の工程:ボツリヌス毒素遺伝子増幅用プライマーペア、ボツリヌス毒素遺伝子検出用標識プローブ及びDNAポリメラーゼ存在下で、被検試料由来のDNAを鋳型として、ヌクレオチド鎖合成反応を行う工程、並びに得られる増幅産物を検出・定量する工程を包含する方法を採用することができ、定量的PCRによるボツリヌス毒素遺伝子の検出は、具体的には、以下のようにして行うことができる。

0016

1.定量的PCRによるボツリヌス毒素遺伝子の検出・定量
(1)標的配列選定
定量的PCRによってボツリヌス毒素遺伝子を検出・定量するためには、まず、ボツリヌス毒素遺伝子上から、毒素遺伝子に特異的な増幅反応用標的配列を選定する。ボツリヌス毒素は、前述のように、A〜G型の7つの型に分けられるが、この中で食品衛生上重要なのはA、B及びE型である。これらの毒素をコードするDNAの塩基配列は相違しており、標的配列としてこの相違部分を使用することによって、ボツリヌス毒素遺伝子を型特異的に検出及び定量することが可能である。

0017

なお、ボツリヌスA型毒素、ボツリヌスB型毒素及びボツリヌスE型毒素をコードするDNAの塩基配列は公知であり、遺伝子データベースGenBankに、ボツリヌスA型毒素遺伝子はアクセッション番号X52066として、ボツリヌスB型毒素遺伝子はアクセッション番号M81186として、ボツリヌスE型毒素遺伝子はアクセッション番号X62683として登録されており、当該技術分野に属する者であれば、容易にその塩基配列を入手することが可能である。

0018

標的配列は、特異性及び融点の高い領域であることが好ましい。例えば、本発明に使用することができるボツリヌスA型毒素遺伝子検出用の標的配列を配列番号1に、ボツリヌスB型毒素遺伝子検出用の標的配列を配列番号5に、ボツリヌスE型毒素遺伝子検出用の標的配列を配列番号9に示した。

0019

(2)ボツリヌス毒素遺伝子検出用キット
上記(1)において選定された標的配列に基づき、以下のようにして、ボツリヌス毒素遺伝子検出用プローブプライマーセットを作製する。すなわち、標的配列の5'末端及び3'末端の配列に基づき順方向プライマー及び逆方向プライマーを設計し、該両プライマーの設計に使用した配列の内側の配列に基づきプローブを設計する。ここで、標的配列へのプライマー及びプローブのハイブリダーゼーションが互いに競合しないように、プローブの設計に使用する配列はプライマーの設計に使用する配列とは重複がなく且つ互いに離れた領域を使用することが好ましい。ここで、ボツリヌス毒素遺伝子検出用のプローブは、プライマーより少なくとも5℃以上のTm値を持ち、且つ、Taqポリメラーゼ伸長反応温度(72℃が最適であるが、65℃付近まで低くすることは可能)でも標的DNAと結合し続けることが可能なために十分な高いTm値(少なくとも60℃以上)を有することが必要である。本発明において、プライマーの長さは、15〜40mer、好ましくは19〜30mer、最も好ましくは20〜28merであり、プローブの長さは、15〜40mer、好ましくは20〜30mer、最も好ましくは22〜27merである。なお、本発明において使用することができるボツリヌス毒素遺伝子検出用プライマープローブセットの塩基配列を標的配列とともに表1〜3に示した。

0020

0021

0022

0023

定量的PCRにおいて使用するボツリヌス毒素遺伝子検出用プローブは、通常、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(tetramethylrhodamin isothiocyanate)、ピレン(pyrene)等で蛍光標識されたものを用いる。特に、定量的PCRとして、TaqManPCRを採用する場合には、プローブは、その5'末端をリポーター色素で3'末端をクエンチャー色素で標識したものを使用する。前記リポーター色素は、前記クエンチャー色素と同一のプローブに結合している状態では、蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光が抑制されているが、プローブから遊離することにより蛍光が発生する。ここで、リポーター色素としては、FAM(6-カルボキシフルオレセイン)等のフルオレセイン蛍光色素が好ましく、クエンチャー色素としては、TAMRA(6-カルボキシテトラメチルローダミン)等のローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの色素は公知であり、容易に入手可能である。プローブ上でのリポーター色素及びクエンチャー色素の結合位置は、特に限定されないが、通常、プローブの一端(好ましくは5'末端)にリポーター色素を、他端にクエンチャー色素を結合させる。なお、プローブへの色素の結合は、当該技術分野で公知の手法[Noble et al., Nuc. AcidsRes. 12,3387-3403(1984);Iyer et al.,J. Am. Chem. Soc. 112,1253-1254 (1990)]により行うことができる。また、プローブ中のチミンを5-プロピン-2'-デオキシウリジンに置換することにより、プローブの融点を人為的に高めることが可能である。

0024

(3) 定量的PCRによるボツリヌス毒素遺伝子の検出・定量
上記(2)のプライマー/プローブセットを用い、被検試料由来のDNAを鋳型として定量的PCRを行うことにより、ボツリヌス毒素遺伝子を特異的且つ定量的に検出することが可能である。定量的PCRとしては、TaqManPCR法RT-PCR、NASBA、ライトサイクラー等が挙げられる。被検試料由来のDNAとしては、被検試料中に含まれる生物由来ゲノムDNAやmRNAより調製したcDNA等が挙げられる。なお、被検試料としては、食品衛生上、ボツリヌス菌汚染検査を必要とするあらゆる食品(例えば、魚介類水産加工品食肉食肉製品乳製品穀類野菜果物、農産加工品等)が挙げられる。被検試料からのDNAの調製は、従来のゲノムDNAの調製の場合と同様の手法により行うことができ、例えば、SDS溶解法フェノールクロロホルム抽出塩化セシウム密度勾配遠心法等を適宜組合わせて行うことができる。以下、各定量的PCRによるボツリヌス毒素遺伝子の検出・定量方法について、具体的に説明する。

0025

TaqManPCRは、リポーター色素とクエンチャー色素とが結合されたプローブの存在下でPCRを行い、標的核酸増幅に伴って増加する蛍光強度を測定することにより、被検試料中の標的核酸を検出・定量する技術である[Christian et al.,Genome Research 6: 986-994(1996)]。当該技術は、増幅反応と蛍光強度の測定とを同時に実施するものであり、鋳型にハイブリダイズした標識プローブの分解によって遊離する蛍光リポーター色素をリアルタイムで検出し、検出器に連結したコンピューターで増幅産物を自動的に分析する。ボツリヌス毒素遺伝子をTaqManPCRによって検出する場合、ボツリヌス毒素遺伝子検出用プライマー/プローブ存在下で、被検試料由来のDNAを鋳型として、PCRによる増幅反応を行う。反応の具体的な条件は、下記実施例に詳述した通りである。TaqManPCR用の装置は市販されており、本発明においては、そのような市販の装置(例えば、ABI社製PRISM7700 Sequence Detector、ロッシュ・ダイアノスディクス社製Light CyclerSystem等)を用いることができる。

0026

TaqManPCRにおいては、蛍光強度を測定しながらPCR反応を行う。被検試料中に標的配列を有するDNAが含まれている場合、DNAの増幅が起こり、増幅産物にハイブリダイズした蛍光標識プローブがDNAポリメラーゼの作用により分解する。蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、被検試料中の標的配列を有するDNAの量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が、急に増加する。従って、蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数を調べることにより、被検試料中の被検試料中の標的配列を有するDNAを定量することができる。具体的には、ボツリヌス菌由来DNAの量を横軸に蛍光強度の急激な増加が検出されたサイクル数を縦軸とし検量線を作成しておけば、被検試料由来のDNAを鋳型としたときの、検出限界を超えたときのサイクル数(検出限界サイクル数ともいう)を調べることにより、被検試料中のボツリヌス毒素遺伝子の量を調べることが可能である。被検試料中にボツリヌス遺伝子が検出された場合、それは当該被検試料中にボツリヌス菌が存在することを意味している。従って、前記の手順によるボツリヌス毒素遺伝子の検出方法は、ボツリヌス菌の検出方法として利用することが可能である。さらには、ボツリヌス菌は通常、ボツリヌス毒素を産生するので、ボツリヌス毒素遺伝子の検出方法は、ボツリヌス毒素の検出方法として利用することも可能である。そして、ボツリヌス菌の菌数と、各菌数のボツリヌス菌から抽出されたDNAの量との関係を示すグラフを作成しておくことにより、得られたボツリヌス菌由来DNAの量から、ボツリヌス菌の菌数を導き出すことも可能である。

0027

一方、被検試料中に標的配列を有するDNAが含まれていない場合、DNAの増幅が起こらないので、プローブはDNAにハイブリダイズせず、よってDNAポリメラーゼによって加水分解されることもないので、リポーター色素からの蛍光は、クエンチャー色素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しない。

0028

2.ボツリヌス毒素遺伝子検出キット及びボツリヌス毒素mRNA発現定量キット
上記定量的PCRによるボツリヌス毒素遺伝子検出方法の実施に必要な試薬類を、パッケージングし、キットとして供給することが可能である。より具体的には、例えば、以下の構成要素を含むものが挙げられる。
〔キットの構成要素〕
(a)順方向プライマー
(b)逆方向プライマー
(c)ボツリヌス毒素遺伝子検出用プローブ

0029

上記キットには、必要に応じて、さらに酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な試薬類、その他サンプル中にPCR阻害物質などが含まれている場合、サンプル中にボツリヌス毒素遺伝子含まれているにも関わらず、陰性の結果が得られてしまう場合がある。このような偽陰性の危険性を回避するため、PCR反応溶液中に、反応系中にPCR反応を阻害する物質が存在せずPCRが正常に進行し得ることを示す内部標準(Internal Positive Control;以下、IPCともいう)を加えることが可能である。

0030

また、上記キットにボツリヌス毒素mRNAを逆転写するためのプライマーを加えることによって、ボツリヌス毒素mRNA発現定量キットを作製することも可能である。ここで、ボツリヌスA型毒素mRNA逆転写用のプライマーとしては配列番号13で表されるものを、ボツリヌスB型毒素mRNA逆転写用のプライマーとしては配列番号14で表されるものを、ボツリヌスE型毒素mRNA逆転写用のプライマーとしては配列番号15で表されるものを使用することができる。

0031

以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

0032

〔実施例1〕 定量的PCR法によるボツリヌスA型毒素遺伝子の検出
(1) ボツリヌスA型毒素遺伝子検出用プローブ及びプライマーの作製
以下のようにして、ボツリヌスA型毒素遺伝子検出用のプローブ及びプライマーを作製した。すなわち、公知のボツリヌスA型毒素遺伝子の塩基配列に基づき、Primer Express Version1.0(Applied Biosystems社製)を用いて、特異性が高くかつTm値の最も高い場所として配列番号1で表される塩基配列からなる領域を標的領域として選択した。次いで、当該領域にハイブリダイズさせるボツリヌスA型毒素遺伝子検出用プローブを、5'-tctgtagcaaatttgcctgcacctaa-3'(配列番号4;Tm=65.5℃)の塩基配列に基づいて設計合成した。ここで、プローブのTm値をあげるため、プローブ配列の中の8箇所のチミジンの全てを5-プロピン-2'-デオキシウリジンに置換した。ここで、前記プローブには、5'末端にリポーター色素として6-カルボキシフルオレセイン(FAM)が、3'末端に消光色素として6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)を結合させた。一方、標的領域の増幅用プライマーとして、順方向プライマー:5'-ggagtcacttgaagttgatacaaatcc-3'(配列番号2;Tm=61.2℃)及び逆プライマー:5'-tctaacccactcatttcataataggca-3'(配列番号3;Tm = 61.8 ℃)を常法に従い、設計合成した。

0033

(2)ボツリヌスA型毒素遺伝子の検出
ボツリヌスA型菌、ボツリヌスB型菌、ボツリヌスE型菌及びその他の菌から、常法[Sambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]に従ってDNAを精製し、TaqManPCR法によりボツリヌスA型毒素遺伝子の検出を行った。すなわち、各菌株のDNA(5ng/PCR)、各々5μlについて、配列番号2に示すプライマー200nMと同量の配列番号3に示すプライマー、ならびに、配列番号4に基づいて設計合成したプローブ(200nM)を用いて、MgCl25.0mMで、95℃、15秒で増幅対象DNAを1本鎖とし、65℃、30秒でアニーリングおよび伸長反応をおこなう2ステップTaqMan PCR (40サイクル)により,検出および定量を行った。検出結果を表4に示した。表4から明らかなように、ボツリヌスA型毒素遺伝子はいずれも25 サイクル以下のPCRで検出されたのに対し、ボツリヌスB型毒素遺伝子、ボツリヌスE型毒素遺伝子及びその他の菌由来の遺伝子は40サイクル以上のPCRにおいてさえも検出されなかった。

0034

0035

また、図1に、検出限界に達するまでのサイクル数とボツリヌスA型菌ゲノムDNAとの関係を示した。図1から明らかなように、前記サイクル数と前記ゲノムDNAとの間には、高い相関性(R2=0.997)が認められた。以上より、本発明の検出方法により、ボツリヌスA型毒素遺伝子を特異的且つ定量的に検出可能であることが判明した。

0036

〔比較例1〕 A型毒素のDNA検出
配列番号16で表される配列からなる公知のプライマーと配列番号17で表される配列からなる公知のプライマー[Takeshi, K. et al. Microbiol. Immunol.40: 5-11 、1996]の場合、電気泳動の結果は非特異的バンドスメアがあり、PCR増幅効率が低く、検出は可能であっても、定量を目的とするには不適切である。

0037

配列番号18で表される配列からなる公知のプライマーと配列番号19で表される配列からなる公知のプライマーを用いた報告例[Szabo, E. A. et al. Appl.Environ. Microbiol. 59: 3011-3020 (1993)]の場合では、特異性が認められるものの、プライマーのTm値がそれぞれ、48.2℃、41.8℃と低く、TaqMan定量PCR用のプローブには不適である。

0038

〔実施例2〕 定量的PCR法によるボツリヌスB型毒素遺伝子の検出
(1) ボツリヌスB型毒素遺伝子検出用プローブ及びプライマーの作製
実施例1と同様に、まず特異性が高くかつTm値の最も高い場所として配列番号5で表される塩基配列からなる領域を標的領域として選択し、次いで以下のボツリヌスB型毒素遺伝子検出用のプライマー及びプローブを作製した。
(ボツリヌスB型毒素遺伝子検出用プライマー)
順方向プライマー:5'-agacgtgttccactcgaagagttt-3'(配列番号6;Tm=59℃)
逆方向プライマー:5'-gccttcccttgatgcaaaatg-3'(配列番号7;Tm = 60℃)
(ボツリヌスB型毒素遺伝子検出用プローブ)
5'-tcagtaatccaggagaagtggagcgaa-3'(配列番号8;Tm=66℃)

0039

(2)ボツリヌスB型毒素遺伝子の検出
上記(1)のボツリヌスB型毒素遺伝子検出用プローブ及びプライマーを用い、実施例1の同様の手順によりボツリヌスB型毒素遺伝子の検出を行った。検出結果を表5に示した。表5から明らかなように、ボツリヌスB型毒素遺伝子はいずれも25サイクル以下のPCRで検出されたのに対し、ボツリヌスA型毒素遺伝子、ボツリヌスE型毒素遺伝子及びその他の菌由来の遺伝子は40サイクル以上のPCRにおいてさえも検出されなかった。

0040

0041

また、図2に、検出限界に達するまでのサイクル数とボツリヌスB型菌ゲノムDNAとの関係を示した。図2から明らかなように、前記サイクル数と前記ゲノムDNAとの間には、高い相関性(R2=0.999)が認められた。以上より、本発明の検出方法により、ボツリヌスB型毒素遺伝子を特異的且つ定量的に検出可能であることが判明した。

0042

〔比較例2〕B型毒素のDNA検出
配列番号20で表される配列からなる公知のプライマーと配列番号21で表される配列からなる公知のプライマー、配列番号22で表される配列からなる公知のプローブを用いた報告例[Szabo et al., Appl. Environ. Microbiol. 58: 418-420, 1992]では、プローブを用いることで目的菌のみの検出が可能であったものの、電気泳動の結果、他菌(A、C、D、E、F型tetani、sporogenes、butyricum)にもバンドが検出された。従って、プライマーの特異性が非常に低い。従って、検出は可能であっても、定量を目的とするには不適切である。

0043

配列番号23で表される配列からなる公知のプライマーと配列番号24で表される配列からなる公知のプライマー、配列番号25で表される配列からなる公知のプローブを用いた報告例[Takechi et al., Microbiol. Immunol. 40: 5-11, 1996]では、電気泳動の結果を見ると目的菌に対して非特異的バンドやスメアがかなり見られたため、PCR増幅効率が低く、検出は可能であっても、定量を目的とするには不適切である。

0044

〔実施例3〕 定量的PCR法によるボツリヌスE型毒素遺伝子の検出
(1) ボツリヌスE型毒素遺伝子検出用プローブ及びプライマーの作製
実施例1と同様に、まず特異性が高くかつTm値の最も高い場所として配列番号9で表される塩基配列からなる領域を標的領域として選択し、次いで以下のボツリヌスB型毒素遺伝子検出用のプライマー及びプローブを作製した。
(ボツリヌスE型毒素遺伝子検出用プライマー)
順方向プライマー:5'-gtgaatcagcacctggactttcag-3'(配列番号10;Tm=66℃)
逆方向プライマー:5'-gctgcttgcacaggtttattga-3'(配列番号11;Tm = 64.7℃)
(ボツリヌスE型毒素遺伝子検出用プローブ)
5'-atgcacagaaagtgcccgaaggtga-3'(配列番号12)

0045

(2)ボツリヌスE型毒素遺伝子の検出
上記(1)のボツリヌスE型毒素遺伝子検出用プローブ及びプライマーを用い、実施例1の同様の手順によりボツリヌスE型毒素遺伝子の検出を行った。検出結果を表5に示した。表5から明らかなように、ボツリヌスE型毒素遺伝子はいずれも25サイクル以下のPCRで検出されたのに対し、ボツリヌスA型毒素遺伝子、ボツリヌスB型毒素遺伝子及びその他の菌由来の遺伝子は40サイクル以上のPCRにおいてさえも検出されなかった。

0046

0047

また、図3に、検出限界に達するまでのサイクル数とボツリヌスE型菌ゲノムDNAとの関係を示した。図3から明らかなように、前記サイクル数と前記ゲノムDNAとの間には、高い相関性(R2=0.978)が認められた。以上より、本発明の検出方法により、ボツリヌスE型毒素遺伝子を特異的且つ定量的に検出可能であることが判明した。

0048

〔比較例3〕 E型毒素のDNA検出
配列番号26で表される配列からなる公知のプライマーと配列番号27で表される配列からなる公知のプライマーを用いた報告例[Franciosa et al, J. Clin.Microbiol. 32:1911-1917, 1994]の場合、プライマーのTm値は43.4℃、49.8℃と低い。また、増幅産物が約780bpと長い点と、アニーリング温度が50℃と低いことから、PCR定量には不向きである。また、配列番号28に示す公知の順方向プライマーと配列番号29に示す公知の逆方向プライマーを用いた報告例[Szaboet al, Appl. Environ. Microbiol. 59:3011-3020, 1993]のプライマーは予測Tm値が50.9℃と45.2℃と低いため、PCR定量には不向きである

0049

配列番号30で表される配列からなる公知のプライマーと配列番号31で表される配列からなる公知のプライマー、配列番号32で表される配列からなる公知のプローブを用いた報告例[Takeshi et al., Microbiol. Immunol. 40:5-11, 1996]では、検出はサザンハイブリダイゼーションを用いての検出であるが,泳動写真によるとスメアが見られるため、PCR定量には不向きであることがわかる。また、予測Tm値は58.9℃と48.2℃と差が大きいことからも、PCR定量には不向きである。

0050

〔実施例4〕ボツリヌスE型菌の食品での増殖リスク評価
(1)サンプルの調整
サンプルは、ボツリヌスE型菌のGAM液体培地培養液段階希釈液、もしくはマアジフィレー25gに5x102CFUのボツリヌスE型菌の胞子植菌したものを用いた。GAM液体培地培養液はボツリヌスE型菌を30℃で一昼夜嫌気培養したものを用いた。マアジは植菌後、ただちに10℃に移し、冷蔵保存した。冷蔵保存したマアジは1日毎に1フィレーずつ取り出し、DNAの抽出に供した。

0051

(2)サンプルからのDNAの抽出
サンプルからのDNAの抽出は、GAM液体培地培養液の段階希釈液の場合にはその培養液1mlを、マアジフィレーの場合には75mlの希釈水を加えホモジナイズした液1mlを用いた。サンプル1mlを遠心分離上澄みを除去、4Mのグアニジンイソチオシアネートと2%Tween 20の混合液500μlにより菌体溶菌させた。15000×gで10分間遠心分離した後、上澄み400μlを別の新しいエッペンドルフチューブに移した。これをイソプロパノール沈殿、塩の除去をした後、160μlの滅菌蒸留水を加え、70℃3分で粗抽出DNAを溶解した。更に遠心分離後、上澄み5μlを反応に供した。

0052

(3)PCR反応
PCR反応はTaqManTMPCRCore Reagent Kit(PE Applied Biosystems)を用いて行った。PCR反応容量は50μlとし、x10 TaqManバッファーAを5μl、5mM MgCl2、dATP,dCTP,dGTPを各200μM、dUTPを400μM、プライマーペア(配列番号10、11)各200nM、TaqManプローブ(配列番号12)100nm、UNGを0.01units/μl、AmpliTaq GoldDNAポリメラーゼを0.5units/μl、サンプルを5μlの組成で行った。PCR反応条件は50℃2分間、95℃10分間の後、95℃15秒間の熱変成と65℃1分のアニーリングを1サイクルとして、60サイクル行った。反応はABIPRISM7700Sequence Detectorを用いて行った。この時、PCR反応管中の蛍光をモニタリングした。

0053

(4) 結果
培養液の段階希釈液を実験に供した結果、PCRチューブ当たりの菌数と検出限界サイクル数(検出に必要なPCRサイクル数)のプロットにおいて高い相関が得られた(図4)。また、本法の感度は、3x100〜3x101CFU/PCRチューブでの検出が可能であった(図4)。図4で得られた検量線を元に、純培養系において本法と培養法による増殖曲線を比較した。その結果、両者で極めて類似した曲線が得られた(図5)。図5において、破線は培養法により得られた増殖曲線、実線は本法により得られた増殖曲線である。

0054

また、マアジフィレー中での菌数を本法により測定し、従来法であるマウスアッセイでの毒化試験の結果と比較した。その結果を図6に示した。図6のAはボツリヌスE型菌を植菌しなかった場合の菌数を示した図であり、図6のBはボツリヌスE型菌を植菌した場合の菌数を示した図である。ここで、図中の□は一般生菌数、○はボツリヌスE型菌数、■及び●はマウスアッセイにおいて陽性であったものである。本菌以外の菌が多数(107CFU/g)存在しているにも関わらず、本菌の増殖をモニタリングすることが可能であった。さらに、マウスアッセイによる毒化よりも早期の段階でのモニタリングが可能であった。このことから、本法は実際の食品を用いても本菌の定量が可能であり、増殖リスク評価への応用が可能であることが判明した。

0055

〔実施例5〕ボツリヌスE型毒素遺伝子の検出キット
(1)キットの構成
以下の構成要素を含むボツリヌスE型毒素遺伝子の検出キットを構築した。
〔キットの構成要素〕
(a)順方向プライマー:5'-gtgaatcagcacctggactttcag-3'(配列番号10)
(b)逆方向プライマー:5'-gctgcttgcacaggtttattga-3'(配列番号11)
(c)ボツリヌスE型毒素遺伝子検出用プローブ:5'-atgcacagaaagtgcccgaaggtga-3'(配列番号12)

0056

(2)サンプルからのDNAの粗抽出
サンプルは、ボツリヌスE型菌のGAM液体培地培養液の段階希釈液、もしくは魚肉ホモジナイズ液(25gの魚肉に225mlの希釈水を加えホモジナイズした液)にGAM液体培地培養液の段階希釈液を加えたものを用いた。サンプル1mlを遠心分離し上澄みを除去後、4Mのグアニジンイソチオシアネートと2%Tween 20の混合液500μlより菌体を溶菌させた。15000×gで10分間遠心分離した後、上澄み400μlを別の新しいエッペンドルフチューブに移した。これをイソプロパノール沈殿、塩の除去をした後、160μlの滅菌蒸留水を加え、70℃3分で粗抽出DNAを溶解した。更に遠心分離後、上澄み5μlを反応に供した。

0057

(3)PCR反応
PCR反応には、上記(1)のキット、TaqManTMPCRCore Reagent Kit(PE AppliedBiosystems)及びTaqManTM Exogenous Internal Positive Control Reagents(PEApplied Biosystems)を用いた。PCR反応容量は50μlにて行い、x10 TaqManバッファーAを5μl、5mM MgCl2、dATP,dCTP,dGTPを各200μM、dUTPを400μM、プライマーペア各200nM、プローブ100nm、UNGを0.01units/μl、AmpliTaq GoldDNAポリメラーゼを0.5units/μl、x10 Exo IPC Mixを5μl、Exo IPC DNAを4fg、サンプルを5μlの組成で行った。ネガティブコントロールとして、サンプルの代わりに滅菌蒸留水を用いたもの(IPCのみ増幅するコントロール;NTC)と1% SDS溶液を用いたもの(増幅しないコントロール;NAC)を各3つ以上同時にPCR反応に供した。PCR反応条件は実施例4に従って行った。全ての反応はABIPRISM7700 Sequence Detectorを用いて行った。

0058

(4)蛍光測定と結果の判定
蛍光測定はPCR反応前と反応後の2回行った。このとき、本菌の存在の有無を示す蛍光FAMとIPCによる増幅の有無を示すVICの2つの蛍光値を測定し、PCR反応前と反応後での蛍光増加量をそれぞれ求めた。上記(3)で述べたネガティブコントロールそれぞれについて標準偏差t検定により、99.7%の危険率で結果の判定を行った。FAMの蛍光が認められたサンプルは陽性、VICのみ蛍光が認められたサンプルは陰性、どちらの蛍光も認められない場合は再試験と判定した。

0059

(5) 結果
培養液の段階希釈液を実験に供し、本法の感度を求めた結果、1.2x101CFU/PCRチューブまでの検出が可能であった(表7)。この結果はIPCを加えない系とほぼ同等の感度を持つと考えられた。また、魚肉ホモジナイズ液混合系においても1.2x101CFU/PCRチューブで検出可能であった。また、IPCの増幅もNACを除く全てのサンプルにおいて確認できた。この結果は本菌の胞子を用いても同様の結果が得られた。

0060

上記のことから、本法は食品製造現場での検出において有用であると考えられた。従来のPCR検出では反応後、電気泳動により増幅産物の有無を確認していたが、サンプル処理数が十数サンプルと少ない。しかし本法では96穴反応プレートから直接蛍光を測定し判定するため、大量処理が可能である。本法は電気泳動のような実験者主観的判定に頼ることなく結果を得ることが可能であり、さらに、蛍光測定値数値化されるため結果の文書化も容易である。しかも、従来本菌の検出はマウスアッセイで行われていたため、コストと時間と人件費を大幅に削減できると考えられる。

0061

0062

〔実施例6〕ボツリヌスE型毒素mRNA発現定量キット
(1)キットの構成
以下の構成要素を含むボツリヌス毒素mRNA発現定量キットを構築した。
〔キットの構成要素〕
(a)順方向プライマー:5'-gtgaatcagcacctggactttcag-3'(配列番号10)
(b)逆方向プライマー:5'-gctgcttgcacaggtttattga-3'(配列番号11)
(c)ボツリヌスE型毒素遺伝子検出用プローブ:5'-atgcacagaaagtgcccgaaggtga-3'(配列番号12)
(d)逆転写用プライマーRT-717:5'-tgctgactctctcccaagattga-3'(配列番号15)
なお、逆転写(以下、RTともいう)反応を行うための逆転写用プライマーRT-717は、PCR増幅領域の下流側から、本毒素遺伝子の遺伝子配列に特異的な配列を使用した。

0063

(2) 総RNAの抽出
GAMブイヨン(Gifu Anaerobic Medium Broth; Nissui, Tokyo, Japan)10mlをボツリヌスE型菌の培養に用い、30℃嫌気培養にて本菌が対数増殖期から定常期に移る際の菌体(O.D.660nmにて0.8前後)を実験に供した。本菌の総RNAの抽出は、RNA抽出キットTRIZOL(GibcoBRL)の付属説明書プロトコールに準じた。すなわち、培養液10mlを2190×gで5分間遠心分離した後、上澄みを除去した。これに1mlのTRIZOL液を加え、25G針付ディスポーザブルシリンジ(テルモシリンジSS-01T2525; Terumo Co. Ltd, Tokyo. Japan)を用いて十分に再懸濁し、室温5分放置した。この懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、クロロホルム0.2mlを加え、室温2分放置した。12000×gで15分間遠心分離した後、水層を別のエッペンドルフチューブに移した。等量のイソプロパノールを加え、室温10分間放置した後、12000×gで10分間遠心分離した。上澄みを除去し、75%エタノールを加え塩の除去をした後、12000×gで5分間遠心分離し、再び上澄みを完全に除去した。このペレットにDEPC処理を行った滅菌蒸留水88μlを加え、60℃10分間のヒートブロックによる加熱により完全に溶解した。さらに2μlのDNase(Nippon Gene)と付属のバッファーを10μl加え、室温30分放置した。フェノール:クロロホルム,5:1混合(Nacalai tesque,Inc. Kyoto, Japan.)溶液を用いてフェノール・クロロホルム処理後エタノール沈殿によりRNAを精製・回収した。この時、RNA溶液をDEPC処理を行った滅菌蒸留水に溶解し吸光光度計Model UV-160 spectrometer(Shimazu, Kyoto, Japan)により260nmの吸光度により濃度を求めた。また、同時にRNA溶液はエッペンドルフチューブに各5μlずつ小分けしておき、-80℃で冷凍保存した。サンプルRNAは逆転写反応直前に溶解し、滅菌蒸留水にて1000ng〜1pg/μlの濃度に段階希釈してから用いた。

0064

(3)RT及びPCR反応
RT及びPCR反応には、上記(1)のボツリヌスE型毒素mRNA発現定量キット、TaqMan Gold RT-PCRkit(PE Applied Biosystems)を用いた。RT反応組成及び反応条件はTaqMan Gold RT-PCR kitの付属プロトコールに準じた。RT反応容量は20μlにて行った。x10 RTバッファーを2μl; MgCl2を5mM; dNTPsを各々500μM;逆転写用プライマー(RT-717)を各200nM; MultiScribe Reverse Transcriptaseを1.25Units/μl;RNaseInhibitorを0.4Units/μl; Sample RNA2μlにて反応を行った。RT反応は、48℃30分のRT反応、95℃5分による逆転写酵素の不活化の条件で行った。

0065

PCR反応組成及び条件は実施例3に従って行った。ただし、サンプルはRT反応後のサンプル2μlを用いた。すべての反応はABIPRISM7700 Sequence Detector(PE Applied Biosystems)にて行った。定量解析・検量線の作成についても実施例3に従って行った。ただし検量線の作成はDNA量ではなくRT反応時に供した総RNA量により検量線を作成した。

発明の効果

0066

(5)実験結果
RT-PCRの結果、2000ng〜2pgの総RNA量の範囲で検出・定量可能であり、相関係数がほぼ1に近い検量線を得ることに成功した(図7)。これはノザンブロットハイブリダイゼーションの感度を完全に上回るものであった。ノザンブロットハイブリダイゼーションの場合、測定するために必要な総RNA量はサンプル1つ当たり10〜30μgと多く(中山広樹ら、バイオ実験イラストレイテッド.2遺伝子解析基礎細胞工学別冊秀潤社、p.169)、これだけの総RNA量を得るためには、大量な抽出サンプルが必要となってしまい、貴重なサンプルであった場合検出が不可能である。一方、本法のmRNA定量法では10mlの培養液から十分な実験量の総RNAが確保できる。このため、増殖しにくい培養条件であっても、少量のサンプルが存在すれば定量が可能である。Competitive RT-PCRによる検出は少量のサンプルからの定量法として有用視されているが[Gilliland et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 87,2725-2729, 1990]、サンプル処理数とその手間を考えると、本法が勝っていた。最終的に、本法を用いて106copyの範囲で検量線を得ることが可能になり、サンプル処理数が多くても毒素遺伝子発現量を比較検討できる手段が確立できた。

0067

本発明により、特異性が高く且つ迅速なボツリヌス毒素遺伝子の検出及び定量方法が提供される。本発明の方法は、食品工業における簡便なボツリヌス菌汚染の検出に有用である。

0068

SEQUENCE LISTING

<110> HIROSHI GODA;TOWA KAGAKU Co.
<120> A method of detection and quantitative determination of botulinum
toxin gene
<130> P00-0519
<160> 32
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 180
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum

<400> 1
ggagtcactt gaagttgata caaatcctct tttaggtgca ggcaaatttg ctacagatcc 60
agcagtaaca ttagcacatg aacttataca tgctggacat agattatatg gaatagcaat 120
taatccaaat agggttttta aagtaaatac taatgcctat tatgaaatga gtgggttaga 180
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 2
ggagtcactt gaagttgata caaatcc 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 3
tctaacccac tcatttcata ataggca 27


<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 4
tctgtagcaa atttgcctgc acctaa 26
<210> 5
<211> 195
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<400> 5
agacgtgttc cactcgaaga gtttaacaca aacattgcta gtgtaactgt taataaatta 60
atcagtaatc caggagaagt ggagcgaaaa aaaggtattt tcgcaaattt aataatattt 120
ggacctgggc cagttttaaa tgaaaatgag actatagata taggtataca aaatcatttt 180
gcatcaaggg aaggc 195
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 6
agacgtgttc cactcgaaga gttt 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 7
gccttccctt gatgcaaaat g 21
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 8
tcagtaatcc aggagaagtg gagcgaa 27
<210> 9
<211> 280
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<400> 9
gtgaatcagc acctggactt tcagatgaaa aattaaattt aactatccaa aatgatgctt 60
atataccaaa atatgattct aatggaacaa gtgatataga acaacatgat gttaatgaac 120
ttaatgtatt tttctattta gatgcacaga aagtgcccga aggtgaaaat aatgtcaatc 180
tcacctcttc aattgataca gcattattag aacaacctaa aatatataca tttttttcat 240
cagaatttat taataatgtc aataaacctg tgcaagcagc 280
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 10
gtgaatcagc acctggactt tcag 24
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 11
gctgcttgca caggtttatt ga 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 12
atgcacagaa agtgcccgaa ggtga 25
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 13
gcatcatgtc ccccaaatgt tct 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 14
aatgtatata gttcttctgc ctg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 15
tgctgactct ctcccaagat tga 23

<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 16
tgcaggacaa atgcaaccag t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 17
tccaccccaa aatggtattc c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 18
tatggaatag caattaatcc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 19
gtgtaattta ccttaggtac 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 20
gatggaacca ccatttgcwa g 21

<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 21
wacatcwata cawattcctg g 21
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 22
tattataagg ctttcaaaat aacagataga atttggata 39
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 23
cctccatttg cgagaggtac g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 24
ctcttcgagt ggaacacgtc t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA

<400> 25
ccggaaagat atacttttgg a 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 26
aaaagtcata tctatggata 20
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 27
gtgttatagt atacattgta gtaatcc 27
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 28
tatatattaa accaggcgg 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 29
tagagaaata ttggaactg 19
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 30
caggcggttg tcaagaattt ta 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 31
attagctttt gacagttctt c 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 32
agtgatgaag aaaaggatag a 21

図面の簡単な説明

0069

配列番号2:合成DNA
配列番号3:合成DNA
配列番号4:合成DNA
配列番号6:合成DNA
配列番号7:合成DNA
配列番号8:合成DNA
配列番号10:合成DNA
配列番号11:合成DNA
配列番号12:合成DNA
配列番号13:合成DNA
配列番号14:合成DNA
配列番号15:合成DNA
配列番号16:合成DNA
配列番号17:合成DNA
配列番号18:合成DNA
配列番号19:合成DNA
配列番号20:合成DNA
配列番号21:合成DNA
配列番号22:合成DNA
配列番号24:合成DNA
配列番号25:合成DNA
配列番号26:合成DNA
配列番号28:合成DNA
配列番号29:合成DNA
配列番号30:合成DNA
配列番号31:合成DNA

0070

図1ボツリヌスA型菌のゲノムDNA濃度と検出限界サイクル数との関係を示した図である。
図2ボツリヌスB型菌のゲノムDNA濃度と検出限界サイクル数との関係を示した図である。
図3ボツリヌスE型菌のゲノムDNA濃度と検出限界サイクル数との関係を示した図である。
図4ボツリヌスE型菌の細胞数と検出限界サイクル数との関係を示した図である。
図5培養法と本方法で得られたボツリヌスE型菌の増殖曲線を示した図である。
図6本方法による魚肉(真アジ)中でのボツリヌスE型菌の増殖モニタリングを示した図である。
図7総RNA量と検出限界サイクル数との関係を示した図である。

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