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技術 微生物を用いた代謝生産物の製造方法

出願人 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明者 石崎文彬
出願日 2001年7月3日 (19年4ヶ月経過) 出願番号 2001-202716
公開日 2002年3月26日 (18年7ヶ月経過) 公開番号 2002-085083
状態 拒絶査定
技術分野 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理
主要キーワード 内部マグネット pH電極 複合ガラス電極 pH測定 オフセット幅 エネルギー獲得 高希釈率 乳酸液
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (3)

課題

L−乳酸などの微生物による代謝反応生産物を連続的に生産することを可能とする新しい方法を提供する。

解決手段

微生物による反応系において、最大活性の微生物を一定の濃度で生存させて、供給される原料物質生物的に反応させて代謝生産物を製造する。

概要

背景

概要

L−乳酸などの微生物による代謝反応生産物を連続的に生産することを可能とする新しい方法を提供する。

微生物による反応系において、最大活性の微生物を一定の濃度で生存させて、供給される原料物質生物的に反応させて代謝生産物を製造する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
7件

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請求項1

微生物による反応系において、最大活性の微生物を一定の濃度で生存させて、供給される原料物質生物的に反応させて代謝生産物を製造することを特徴とする微生物を用いた代謝生産物の製造方法。

請求項2

反応系において、所定の上限値と下限値の範囲内にpH値を制御すること、および濁度を一定に制御することで微生物の最大活性を維持する請求項1の製造方法。

請求項3

pHの上限値と下限値との差を0.1以下とする請求項2の製造方法。

請求項4

反応系から不活性の菌を流出させる請求項1ないし3のいずれかの製造方法。

請求項5

微生物がホモ型L-乳酸発酵菌であり、微生物の代謝生産物がL-乳酸である請求項1ないし4のいずれかの製造方法。

請求項6

微生物がアルコール生菌であり、微生物の代謝生産物がアルコール類である請求項1ないし4のいずれかの製造方法。

請求項7

微生物がバクテリオシン生産ホモ型L-乳酸発酵菌であり、微生物の代謝生産物がL-乳酸および/またはバクテリオシンである請求項1ないし4のいずれかの製造方法。

請求項8

バクテリオシンがナイシンAである請求項7の製造方法。

請求項9

バクテリオシンがナイシンZである請求項7の製造方法。

請求項10

バクテリオシン生産ホモ型L-乳酸発酵菌が、LactococcuslactisNCDO497、Lactococcus lactis NCDO2111、Lactococcus lactis NIZO R5、Lactococcus lactis INRA1、Lactococcus lactis INRA2、Lactococcus lactisINRA3、Lactococcus lactis INRA4、Lactococcus lactis INRA5、Lactococcuslactis INRA6、Lactococcus lactis NP4G、Lactococcus lactis NZI、Lactococcus lactis SI、またはLactococcus lactisILC13である請求項8の製造方法。

請求項11

バクテリオシン生産ホモ型L-乳酸発酵菌が、Lactococcuslactis IO-1(JCM7638)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Chizuka (JCM 11180)、 Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 5B(JCM 11181)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 7B (JCM11181)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 8B (JCM 11181)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 9B (JCM 11181)、Lactococcus lactis NIZO22186、Lactococcus lactis NIZO N9、Lactococcus lactisATCC7962、Lactococcus lactisNCDO2597、Lactococcus lactis NCDO2091、Lactococcus lactis NCK400、Lactococcus lactis LJN80、Lactococcus lactisILC11、Lactococcus lactis ILC19、Lactococcus lactis ILC126、Lactococcuslactis ILCSL5、またはLactococcus lactis ILCSL20である請求項9の製造方法。

技術分野

0001

この出願の発明は、L-乳酸エタノールおよび/またはバクテリオシン等の有用物質を、微生物を用いた発酵法によって高効率で製造する方法に関するものである。

0002

嫌気性菌好気性菌と異なり、代謝や増殖のためのエネルギー獲得電子伝達系を利用するので、電子受容体としての有機酸アルコールなど代謝生産物蓄積を伴うことが知られている。また、CO2の発生は、嫌気的脱炭酸に限られ、好気性菌に見られるような有機物の完全酸化によるCO2発生とは根本的に異なる。この特徴から、嫌気性菌を用いる生化学反応は環境へのCO2負荷を低減し、反応熱の発生を少なくするので、環境調和型バイオプロセスとして有利である。

0003

一方、石油化学産業の代表である合成プラスチックは、堅牢なるがゆえの問題が生じており、環境にやさしい生分解性を持つプラスチックの開発が求められている。たとえばポリ乳酸はその目的にかなう有望な開発商品である。だが、合成に用いる原料光学異性体選択性があってL-乳酸に限られる。石油化学で生産される乳酸は当然ながらDL-体であるため、ポリ乳酸の原料にはならない。ポリ乳酸を工業化するには、光学異性体選択性がある発酵法による高純度L-乳酸の実用的な技術開発が待望されている。

0004

以上のような観点から、L-乳酸の発酵法により製造が考慮されるが、発酵プロセスを決定する要素は生産性をいかに大きくするかが最も重要である。そのためには、連続発酵技術の開発が必要である。連続発酵は、一部の好気性菌ではすでに確立された技術である。とくに菌体生産を目的とした連続発酵技術は、比増殖速度μと基質フィード速度のパラメータである希釈率(dilution rate=D)を同調させることで、定常状態が形成されることが明らかになっている。また基質フィードのタイミングを検出する方法も培養液溶存酸素DO指標とする方法や、pHの変化でタイミングをはかる方法がよく知られており、すでに広く使われている。しかしながら、このような技術開発が進んでいるにも関わらず、連続培養は、好気性菌であっても、増殖連動型(growth associated)の発酵の一部で実用化されているにすぎず、グルタミン酸発酵抗生物質生産などの非増殖連動型(non-growth associated)の発酵では、依然として回分発酵や流加培養が用いられている。

0005

嫌気性菌は、増殖に酸素を必要としないことから連続発酵の手段として固定化菌体を用いる方法が検討されてきた。エタノール生産細菌Zymomonas属菌アセトンブタノール発酵菌Clostridium属菌では盛んに包括固定化法による連続発酵型バイオリアアーが検討されたが、いずれも実用に耐える評価は得られていない。その理由は主として2つある。1には、固定化に用いる光硬化樹脂などのコストが高いこと、2には、固定化された菌の一部が固定床中で失活するため発酵速度減衰する上、新しい菌との入れ替えも困難であることである。これらの問題の解決は現在も全く目処が立っていない。また、嫌気性菌による連続発酵も検討されていて、特に乳酸発酵では高密度菌体濃度によるケモスタット(chemostat)で、非常に高い生産性(100 g/L以上の菌体濃度で最大60 g/1hの乳酸生産性を得た例もある)が報告されている。しかし、これらの報告は菌濃度の制御や比乳酸生産速度で代表される活性維持、工業化では最も重要な残糖濃度の制御などが全くなされておらず、実用化からはほど遠いものである。

0006

このような事情から、この出願の発明者は、自然界から分離したL-体のみを選択的に生産するホモ乳酸菌を用いて、連続培養技術を開発してきた。L-乳酸発酵で、生産性を低下させている原因は2つある。1つは、生産蓄積する乳酸濃度が高くなると顕著になる生産物阻害である。このため、乳酸濃度が30 g/Lを越えると急激な発酵速度の低下が起こり、発酵は事実上停止してしまう。その2は発明者らが不稔性細胞生成(sterilecell formation)と定義している失活菌の生成である。乳酸菌のみならず、Zymomonas属菌やClostridium属菌などの嫌気性菌は一般に好気性菌では対数増殖期に相当する増殖初期でも、一定の比率増殖能を失った菌が生成する。このため、嫌気性菌の培養は低い菌濃度で頭打ちとなる。このことも嫌気性菌による発酵の生産性が高くならない本質的な原因を作っている。

0007

そこで、生成してくる乳酸を逐次電気透析によって培養系外に取り除いて生産物阻害を軽減する電気透析培養を行ったところ、その効果は確認できたが、この方法では、菌の失活対策や、糖濃度の管理などができず、培養は不安定で実用に耐えるものではなかった。一方、cross flow UF(限外ろ過)膜を組み込んで培養液を循環し菌濃度を増加させた培養系の高密度化を検討した。しかし、この培養法ではろ液の抜き出しの制御が不可能で、安定した成績は得られなかった。

0008

さらにまた、培養環境に存在するほとんどの微生物は、乳酸ラセマーゼを有しているか、乳酸ラセミ体を代謝生産するので、たとえL−乳酸だけしか生産しないホモL−乳酸菌を用いて発酵しても、雑菌汚染を引き起こせばたまちL−乳酸の純度が低下し、目的とする高純度のL−乳酸の製造は困難となる。また、連続発酵で長時間培養系を稼働させるとなれば、雑菌汚染の危険はさらに大きくなる。

0009

この出願の発明は、以上のとおりの従来の技術と、この出願の発明者による検討を踏まえてなされたものであって、L-乳酸などの微生物による代謝反応生産物を連続的に生産することを可能とする新しい方法を提供することを課題としている。

0010

また、この出願の発明は、雑菌汚染を回避して、高純度のL−乳酸を効率的に製造する方法を提供することを課題としている。

課題を解決するための手段

0011

この出願の発明は、上記のとおりの課題を解決すること、すなわち、L-乳酸などの代謝生産物の効率よい生産を目的として、菌体を固定化することなく培養系内から増殖能を失った活性の弱い菌、発酵能劣化した増殖能の衰えた菌を取り除き、常にフレッシュで活性の強い菌だけを滞留させて連続的に生産することを可能とする。

0012

そのために、この出願の発明は、微生物による反応系において、最大活性の微生物を一定の濃度で生存させて、供給される原料物質生物的に反応させて代謝生産物を製造することを特徴とする微生物を用いた代謝生産物の製造方法を提供する。

0013

この発明方法の一つの態様は、反応系において、所定の上限値と下限値の範囲内にpH値を制御すること、および濁度を一定に制御することで微生物の最大活性を維持すること、さらに具体的には、pHの上限値と下限値との差を0.1以下とすることである。

0014

この発明方法の別の態様は、反応系から不活性の菌を流出させることである。この発明方法のさらに別の態様においては、微生物はホモ型L-乳酸発酵菌であり、微生物の代謝生産物はL-乳酸である。

0015

この発明方法のさらにまた別の態様においては、微生物はアルコール生産菌であり、微生物の代謝生産物がアルコール類である。この発明方法のまたさらに別の態様においては、微生物がバクテリオシン生産ホモ型L-乳酸発酵菌であり、微生物の代謝生産物はL-乳酸および/またはバクテリオシンである。バクテリオシンは、具体的にはナイシンAまたはナイシンZであることを好ましい態様としている。また、バクテリオシンがナイシンAの場合の微生物がLactococcus lactisNCDO497、Lactococcus lactis NCDO2111、Lactococcus lactis NIZO R5、Lactococcus lactis INRA1、Lactococcus lactis INRA2、Lactococcus lactis INRA3、Lactococcus lactis INRA4、Lactococcus lactisINRA5、Lactococcus lactis INRA6、Lactococcus lactis NP4G、Lactococcus lactis NZI、Lactococcus lactis SI、またはLactococcus lactisILC13であること、バクテリオシンZである場合の微生物が、Lactococcus lactis IO-1(JCM7638)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Chizuka (JCM 11180)、 Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 5B (JCM 11181)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 7B (JCM 11181)、Lactococcuslactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 8B (JCM 11181)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 9B (JCM 11181)、Lactococcus lactis NIZO22186、Lactococcus lactis NIZO N9、Lactococcus lactisATCC7962、Lactococcus lactis NCDO2597、Lactococcus lactis NCDO2091、Lactococcus lactisNCK400、Lactococcus lactis LJN80、Lactococcus lactis ILC11、Lactococcuslactis ILC19、Lactococcus lactis ILC126、Lactococcus lactis ILCSL5、またはLactococcus lactis ILCSL20であることをそれぞれ好ましい態様としている。

0016

すなわち、この出願の発明者は、上記の方法、特にpH上限(upper limit for substrate feed)と下限(lower limit for alkaline feed) の2点制御で、かつその2点の設定間隔を極力小さく制御する方法が菌の失活を防ぎ、増殖を活発にし、糖消費速度を促進する大きな効果を生み出すことを見出し、この発明を完成している。なお、1点制御でもそのオフセット幅が上記2点の制御幅と同一になる場合も同様の結果が得られることがあるので、このような場合も2点制御に含まれる。

0017

実際、この出願の発明においては、コンピューターを用いたDDCによって、Lactococcus lactis IO-1(JCM7638)の培養では、この菌のグルコース培地における最大比増殖速度μmax=1.25h-1とほぼ同じ希釈率D=1.1h-1でもwash-outが起こらないという結果を得ている。このような高い希釈率で培養すれば、希釈効果によって培養系内の乳酸濃度が低下して、電気透析培養による阻害軽減効果に劣らぬ効果が得られている。pH−dependent法だけでなく、残糖濃度の制御を工業的に行うためには、pH dependent feedにレーザー濁度計によるfeed back controlを組み込んだturbidostatを組み合わせることがさらに有効である。これによって、高いdilution rateを維持しながら、高い比糖消費速度と比乳酸生産速度を保つことができ、結果として安定した高速・高効率連続発酵が可能で、残糖濃度も低いレベルに安定して維持することができる。

0018

またこの発明の製造方法では、前記の態様に示したように、バクテリオシン生産ホモ型L-乳酸発酵菌を用いてバクテリオシン(抗菌性ペプチド)を蓄積させながらL−乳酸の発酵を行う。バクテリオシンの高濃度の蓄積によって、培養系に進入する雑菌死滅させ、L−乳酸の純度を低下させることなく、高純度のL−乳酸の製造が可能となる。実際に、バクテリオシン(ナイシンZ)を生産するホモL−乳酸菌であるLactococcus lactis IO-1(JCM7638)等を用いた培養系では、回分法に比べて3-5倍の濃度のIナイシンZが蓄積し、長時間に渡って雑菌汚染が発生せず、高純度のL−乳酸を大量に製造することが可能である。さらに、このようなバクテリオシン生産ホモ型L-乳酸発酵菌を用いた培養系は、バクテリオシンの大量製造にも有効である。

発明を実施するための最良の形態

0019

この出願の発明については、微生物による代謝生産物の生成反応は各種であってもよく、たとえば代謝生産物がアルコール類、L−乳酸および/またはバクテリオシン等の各種のものであってよい。

0020

L-乳酸の生成について、以下のようにさらに説明することができる。ホモL−乳酸菌によってブドウ糖からL−乳酸をほぼ100%の転換率で生産する菌を培養するものとする。主発酵槽には必ずpH電極、on-line濁度測定装置をセットして、pHおよびODがonlineで正確に測定できるようにする。たとえばレーザー濁度計などは最も優れた濁度測定装置である。pH制御法はpH上限で基質フィード、pH下限でアルカリフィードを行うもので、フィード液としては、pH制御のためのアルカル液、濁度制御のための水、および基質補充のための糖を主成分とする基質フィード液の3種を用いる。また、菌体を濃縮するため発酵槽外部循環型ホローファイバー限外ろ過膜を設置する。これらの液を輸送流量制御するためのポンプが必要である。全体の装置構成をたとえば図1として例示することができる。図中の符号は次のものを示している。

0021

0022

たとえば次表

0023

0024

に見られるように、この出願の発明の方法によるLactococcus lactis IO-1(JMC7368)のL−乳酸連続発酵では、D=0.5h-1からD=1.1h-1の間において、菌の再生率は約5%程度に留まっており、また、このような高い希釈率で運転されているにもかかわらず、菌の実比増殖速度μは低い値を示している。このような特殊な培養システム成立は世界で最初にみいだされ確立されたものである。このことから、この培養系は、菌を固定化していないにもかかわらず、低い菌再生率で、実質的には固定化菌体法とほとんど変わらない培養プロセスが形成されていることを示している。すなわち、この発明の方法は、失活した分だけ菌体が再生され、活性の極めて高い菌体を固定化することなく永続的に利用する連続発酵法であり、先に述べた包括固定化法の諸問題を解決し、嫌気性菌による培養の最も合理的なプロセスとなっている。

0025

かくして、世界にも例のない包括固定化法にかわる嫌気性菌の新しい培養法としてこの出願の発明が提供される。この発明の製造方法は、例えば、L−乳酸を製造する場合には、Lactococcuslactis属に属する公知の菌株を用いて実施することができる。また、アルコール類を製造する場合には、エタノール生産細菌Zymomonas属菌やアセトン・ブタノール発酵菌Clostridium属菌等の公知の菌株を用いて実施することができる。

0026

さらにまた、この発明の方法は、バクテリオシン生産ホモ型L−乳酸発酵菌を用いることによって、高濃度のバクテリオシンの蓄積により長時間に渡って高純度のL−乳酸の生産をも可能とする。

0027

バクテリオシン生産ホモ型L−乳酸発酵菌は、ナイシンA生産菌として、Lactococcus lactisに属するNCDO497、NCDO2111、NIZO R5、INRA1、INRA2、INRA3、INRA4、INRA5、INRA6、NP4G、NZI、SIまたはILC13を使用することができ、バクテリオシンZ生産菌としては、Lactococcus lactis IO-1(JCM7638)、Lactococcuslactis subsp.lactis A. Ishizaki Chizuka (JCM 11180)、Lactococcus lactissubsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 5B (JCM 11181)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 7B (JCM 11181)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 8B (JCM 11181)、Lactococcus lactis subsp.lactis A. Ishizaki Yasaka 9B (JCM 11181)、およびLactococcus lactisに属するNIZO22186、NIZO N9、ATCC7962、NCDO2597、NCDO2091、NCK400、LJN80、ILC11、ILC19、ILC126、ILCSL5またはILCSL20を使用することができる。

0028

これらの菌株のうち、括弧内にJCM番号が付されているものは、この出願の発明者らが独自に分離した菌株であり、分譲可能な状態で「理化学研究所微生物系統保存施設」に寄託されている。また、Lactococcus lactisNCDO497がナイシンA生産菌であることは当該技術分野において広く認められており、多くの先行技術文献が存在する。その他の菌株がそれぞれナイシンAおよびナイシンZ生産菌であることは文献(J. Appl. Environ. Mictrobiol. 59(1):214, 1993)によって公知である。これらの公知菌株は、それぞれ文献の著者等から入手可能であり、またそれぞれの寄託機関(NCDOやATCC等)から分譲可能である。

0029

以下に実施例を示し、この発明の方法についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。

0030

実施例1
使用菌は発明者が独自に分離したLactococcus lactis IO-1(JCM7638)を使用した。種菌は-85℃の凍結保存菌をTGC培地植菌静置培養したものを用いた。これをグルコース3%、酵母エキス0.5%、ポリペプトン0.5%、NaCl 1%からなる培地100 mlをErlenmyer Flaskに分注して120℃5分autoclave滅菌したものに接種して12時間培養したものをシードとした。乳酸発酵に用いた培養装置図1に示す通りである。主発酵槽は全容1リッターガラスジャーで、内部にマグネットスターラー攪拌機を設置し約400 rpmの回転数でゆっくり攪拌している。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して温度を制御する。ジャーにpH測定複合ガラス電極を装着し、pH meter(東亜電波製)で測定し、その測定値をRS232にてコンピューターに転送し、自作プログラムによってpH上限、下限の2点制御を行った。連続運転に入れば、pH上限で基質フィールドを行い、pH下限でアルカリ(NaOH)フィールドを行う。また、ジャーにはプロセスオンライン濁度計プローブを設置し、その出力をDDCcontroller(Model LA-300エーエスアール)に入力し、ジャーの濁度制御を行うシステム構築した。ジャーから培養液を抜き出し、cross flow型限外ろ過膜(MICROZAPSP103、旭化成)を用いて培養液を循環し、微生物の濃縮を行うとともに、ろ過膜外側から除菌液を抜き出して、乳酸液を取り出す。一方、濁度コントロールのシステムとしては、殺菌した水をフィードし、培養液(含菌液)を抜き出す。このとき、水の供給と培養液の抜き出しはペリスタティックポンプによって同調させた。

0031

連結培養では、3種類の液を供給し、2種類の液の抜き出しを行う。すなわち、pH上限において基質の糖を含むフィード液を、pH下限においてpH制御のためのアルカリ液(1 M-NaOH)を添加する。このとき、フィード液もアルカリ液もジャーに供給時はペリスタティックポンプによって限外ろ過膜外側から除菌液を抜き出してジャーの液量を一定に保つ。また濁度制御のために、上述したように、水を供給し、培養液を抜き出すが、これもジャーの液量を一定に保つようにペリスタティックポンプを用いる。

0032

培養はグルコース5%、酵母エキス1%、ポリペプトン1%の組成のもの400mlにシード20 mlを植菌してpH 6.0を維持するようにアルカリフィードする培養でスタートする。約12時間後、培地の残糖濃度がほとんど0となった時点で上下限2点制御(pH 6.1の上限でアルカリフィード、pH6.0の下限で基質フィードを行う)の連続基質フィード(フィード液はグルコース35 g/L、酵母エキス1.0%、ポリペプトン1.0%)に切り替えると同時に、培養液を循環して細胞濃度を上昇させる。濁度制御で細胞濃度一定となったら、残糖、乳酸濃度が一定に維持されるようになる定常状態を形成させる。図2は、乳酸濃度を25 g/Lで一定にした場合の結果を例示したものである。菌体細胞濃度5 g/Lでdilution rate 0.5h-1で定常状態を形成した場合、乳酸生産性13.5 g/1h、流出液糖濃度(残糖濃度)0.25 g/Lであった。このときの細胞抜きだし量は全菌量の5%で0.25 g/hであった。また菌の乳酸発酵活性を示す比乳酸生産速度は3.3 g/ghであった。得られたL−乳酸の光学純度は99.8%であった。

0033

また、連続発酵において毎12時間おきに培養液を無菌的にサンプリングし、それを滅菌水で数段階に希釈後その100μlをグルコース含有完全培地(CMG)のプレート展開し、37℃で24時間培養し、生育してくるコロニーを監察した。その結果、雑菌汚染は全く監察されなかった。さらに、連続発酵状態での培養液のナイシンZ濃度は、同一菌を同じ培地で回分培養した場合のナイシンZ濃度3,500 AU/mlに比べ5倍に達していた。
実施例2
使用菌株は実施例1と同じくLactococcus lactis IO-1(JCM7638)で、保存株のrefresh、シードの調製は実施例1の通りである。培養装置は実施例1と同じで図1に示した通りである。

0034

培地に用いるブドウ糖はサゴヤシデンプン酵素糖化液を用いた。サゴヤシデンプンマレーシアサラワク大より入手乾物換算で300 gを水1リッターに懸濁させた。pH 6.5に調整後Bacillus subtilis由来耐熱性アミラーゼ液化酵素Klaistase T5 大和化成、5,000u/g)を0.2%(v/v)添加し、95℃で2時間酵素反応糊化させた後130℃で10分加熱処理して酵素を失活させた。Klaistase T5を0.1%(v/v)添加し再び95℃で1時間処理し液化反応を終了した。冷却後ph 5.5に調整し、Rhizopus delemar由来のグルコアミラーゼ糖化酵素Glucozyme 天野製薬、4,200U/g)をデンプン1 g当たり8 U添加し、50℃で24時間糖化反応を行った。糖化反応後Glucose analyzerによって得られたグルコースを求めたところ、1 gの乾物デンプンから1.05 gのグルコースが得られた。

0035

この実施例2においては、シード培養までの培地は実施例1と全く同じである。主発酵用培地は、上記サゴヤシデンプン糖化液グルコース換算で50 gを計量し、これに大豆フレーク酸加水分解物0.5%(v/v)、天然ゴムラテックス分離母液乾燥粉末(natural rubber serum powder:NRSP)0.5%(v/v)、となるよう添加して1リットルとしオートクレーブ殺菌したものを用いた。また基質フィード液もサゴヤシデンプン糖化液グルコース換算で50 g/Lとなるよう調整して用いた。実施例1と同じようにシードを添加して回分培養で培養を立ち上げ、残糖濃度がほとんど0になった時点で培養液のリサイクル、濁度制御による細胞濃度の制御、pH2点制御(pH6.1の上限でアルカリフィード、pH6.0の下限で基質フィードで行う)による連続基質フィード(サゴヤシデンプン糖化液グルコース50 g/L、大豆フレーク酸加水分解物0.5%(v/v)、NRSP 0.5%)を行った。菌濃度10 g/L、dilution rate 0.75h-1で定常状態に達し、そのときの乳酸生産性は31.5 g/Lh、流出液の残糖濃度は0.3 g/Lであった。細胞抜きだし量は全菌量の3%で0.35 g/hであった。また菌の乳酸発酵活性を示す比乳酸生産速度は3.15 g/ghであった。得られたL−乳酸の光学純度は99.8%であった。

0036

図3は、菌体濃度10 g/Lで一定とした場合のL−乳酸連続生産の希釈率と反応器内乳酸濃度との関係を例示した図である。また、実施例1と同様の雑菌汚染試験を実施したが、全培養期間に渡って雑菌汚染は認められなかった。さらに、連続発酵状態での培養液のナイシンZ濃度は回分培養法の約3.5倍であった。
実施例3
使用菌株は実施例1と同じくLactococcus lactis IO-1(JCM7638)で、保存株のrefresh、シードの調製、および培養装置(図1)は実施例1と同一とした。

0037

培地に用いるブドウ糖はコーンスターチ(corn starch)酵素糖化液を用いた。コーンスターチ乾物換算で300 gを水1リッターに懸濁させた。pH 6.5に調整後Bacillus licheniformis由来の耐熱性アミラーゼ(液化酵素Thermamyl Novo Nordisk, 120 KNU/g)を0.1%(v/v)添加し、90℃で2時間酵素反応し糊化させた後130℃で10分加熱処理して酵素を失活させた。冷却後pH 5.5に調整し、Aspergillusniger由来のグルコアミラーゼとBacillus acidpullulyticum由来のプルラナーゼ混合酵素(糖化酵素Dextroyme Nove Nordisk, 225AGU/g)をデンプン1g当たり4 U添加し、50℃で24時間糖化反応を行った。糖化反応後Glucose analyzerによって得られたグルコースを求めたところ、1gの乾物デンプンから1.05 gのグルコースが得られた。

0038

この実施例3においては、シード培養までの培地は実施例1と全く同じである。主発酵用培地は、上記コーンスターチ糖化液グルコース換算で50 gを計量し、これに粉末CSL(コーンスティープリカー、庄野澱粉製)を1%となるよう添加して1リッターとしオートクレーブ殺菌したものを用いた。また基質フィード液もコーンスターチ糖化液グルコース換算で35 g/Lとなるよう調整して用いた。実施例1と同じようにシードを添加して回分培養で培養を立ち上げ、残糖濃度がほとんど0になった時点で培養液のリサイクル、濁度制御による細胞濃度の制御、pH2点制御(pH 6.1の上限でアルカリフィード、pH 6.0の下限で基質フィードで行う)による連続基質フィード(コーンスターチ糖化液グルコース50 g/L、CSL 1%)を行った。菌濃度12 g/L、dilution rate 1.1/hで定常状態に達し、そのときの乳酸生産性は36 g/Lh、流出液の残糖濃度は2.5 g/Lであった。細胞抜きだし量は全菌量の2%で0.2 g/hであった。また菌の乳酸発酵活性を示す比乳酸生産速度は3.0 g/ghであった。得られたL−乳酸の光学純度は99.8%であった。

0039

また、実施例1と同様の雑菌汚染試験を実施したが、全培養期間に渡って雑菌汚染は認められなかった。さらに、連続発酵状態での培養液のナイシンZ濃度は回分培養法の約3.5倍であった。
実施例4
使用菌はZymomonas mobilis NRRLB-14023を使用した。種菌は-85℃の凍結保存菌をYM培地に植菌し静置培養したものを用いた。これをグルコース100 g、酵母エキス10 g、KH2PO4 1 g、(NH4)2SO4 1 g、Mg(SO4)・7H2O 0.5 gを1Lの脱イオン水に溶解した培地100 mlをErlenmyer Flaskに分注して120℃5分autoclave滅菌したものに接種して約8時間培養したものをシードとした。エタノール発酵に用いた培養装置は図1に示すものと同じである。すなわち、主発酵槽は全容約1リッターのガラス製ジャーで、内部マグネットスターラーかくはん機を設置し約400 rpmの回転数でゆっくり撹拌している。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して温度を制御する。ジャーにpH測定用複合ガラス電極を装着し、pH meter(東亜電波製)で測定し、その測定値RS232にてコンピューターに転送し、自作プログラムによってpH上限、下限の2点制御を行った。連続運転に入れば、pH上限で基質フィードを行い、pH下限でアルカリ(NaOH)フィードを行う。また、ジャーにはプロセスオンライン濁度計プローブを設置し、その出力をDDCcontroller(Model LA-300エーエスアール)に入力、ジャーの濁度制御を行うシステムを構築した。ジャーから培養液を抜き出し、cross flow型限外ろ過膜(MICROZAPSP103、旭化成)を用いて培養液を循環し、微生物の濃縮を行うとともに、ろ過膜外側から除菌液を抜き出して、乳酸液を取り出す。一方、濁度コントロールのシステムとしては、殺酸した水をフィードし、培養液(含菌液)を抜き出す。このとき、水の供給と培養液の抜き出しはペリスタティックポンプによって同調させた。

0040

連結培養では、3種類の液を供給し、2種類の液の抜き出しを行う。すなわち、pH上限において基質の糖を含むフィード液を、pH下限においてpH制御のためのアルカリ液(1 M-NaOH)を添加する。このとき、フィード液もアルカリ液もジャーに供給時はペリスタティックポンプによって限外ろ過膜外側から除菌液を抜き出してジャーの液量を一定に保つ。また濁度制御のために、上述したように、水を供給し、培養液を抜き出すが、これもジャーの液量を一定に保つようにペリスタティックポンプを用いる。

0041

主発酵培養はシードと同一組成、すなわちグルコース10%、酵母エキス1%、KH2PO4 0.1%、(NH4)2SO4 0.1%、Mg(SO4)・7H2O 0.05gの培地400 mlにシード20 mlを植菌してpH5.5を維持するようにアルカリフィードする培養でスタートする。約8時間後、培地の残糖濃度がほとんど0となった時点で上下限2点制御(pH 5.55の上限でアルカリフィード、pH 5.50の下限で基質フィードを行う)の連続基質フィード(フィード液は水1L中グルコース35 g、酵母エキス10 g、KH2PO4 1 g、(NH4)2SO4 1g、Mg(SO4)・7H2O 0.05 g)に切り替えると同時に、培養液を循環して細胞濃度を上昇させる。濁度制御で細胞濃度一定となったら、残糖、乳酸濃度が一定に維持されるようになる定常状態を形成させる。

0042

細胞濃度7.5 g/L、dilution rate 0.7h-1で定常状態を形成し、エタノール生産速度26.25 g/hL、流出液糖濃度(残糖濃度)0.25 g/Lを得た。このときの細胞抜きだし量は全菌量の5%で0.26 g/hであった。
実施例5
使用菌株は、ホモL−乳酸発酵菌であり、かつナイシンA生産菌であるLactococcus lactisNCDO497であり、保存株のrefresh、シードの調製は実施例1の通りである。培養装置は実施例1と同じで図1に示した通りである。

0043

培地に用いるブドウ糖はサゴヤシデンプン酵素糖化液を用いた。サゴヤシデンプン(マレーシアサラワク大より入手)乾物換算で300 gを水1リッターに懸濁させた。pH 6.5に調整後Bacillus subtilis由来の耐熱性アミラーゼ(液化酵素Klaistase T5 大和化成、5,000u/g)を0.2%(v/v)添加し、95℃で2時間酵素反応し糊化させた後130℃で10分加熱処理して酵素を失活させた。Klaistase T5を0.1%(v/v)添加し再び95℃で1時間処理し液化反応を終了した。冷却後ph 5.5に調整し、Rhizopus delemar由来のグルコアミラーゼ(糖化酵素Glucozyme 天野製薬、4,200U/g)をデンプン1 g当たり8 U添加し、50℃で24時間糖化反応を行った。糖化反応後Glucose analyzerによって得られたグルコースを求めたところ、1 gの乾物デンプンから1.05 gのグルコースが得られた。

0044

この実施例5においては、シード培養までの培地は実施例1と全く同じである。主発酵用培地は、上記サゴヤシデンプン糖化液グルコース換算で50 gを計量し、これに大豆フレーク酸加水分解物0.5%(v/v)、天然ゴムラテックス分離母液乾燥粉末(natural rubber serum powder:NRSP)0.5%(v/v)、となるよう添加して1リットルとしオートクレーブ殺菌したものを用いた。また基質フィード液もサゴヤシデンプン糖化液グルコース換算で53 g/Lとなるよう調整して用いた。実施例1と同じようにシードを添加して回分培養で培養を立ち上げ、残糖濃度がほとんど0になった時点で培養液のリサイクル、濁度制御による細胞濃度の制御、pH2点制御(pH6.1の上限でアルカリフィード、pH6.0の下限で基質フィードで行う)による連続基質フィード(基質フィード液組成:サゴヤシデンプン糖化液グルコース53 g/L、大豆フレーク酸加水分解物5 ml/L、NRSP 7 ml/L)を行った。菌濃度7 g/L、dilution rate 0.8 L/hで定常状態に達し、以後215時間に渡って安定して連続発酵が継続できた。得られたL−乳酸は4.13 kg、光学純度は99.9%であった。

0045

また、実施例1と同様の雑菌汚染試験を実施したが、全培養期間に渡って雑菌汚染は認められなかった。さらに、連続発酵状態での培養液のナイシンA濃度は、この菌を同一培地で回分培養した時のナイシンA濃度の約4倍の活性を有していた。
実施例6
使用菌株は、この出願の発明者らが独自に分離したLactococcus lactis subsp. lactis A. Ishizaki Chizuka(JCM11180)である。この菌株はホモL−乳酸発酵菌であり、かつナイシZ産生菌である。保存株のrefresh、シードの調製、および培養装置(図1)は実施例1と同一とした。

0046

培地に用いるブドウ糖はコーンスターチ(corn starch)酵素糖化液を用いた。コーンスターチ乾物換算で300 gを水1リッターに懸濁させた。pH 6.5に調整後Bacillus licheniformis由来の耐熱性アミラーゼ(液化酵素Thermamyl Novo Nordisk, 120 KNU/g)を0.1%(v/v)添加し、90℃で2時間酵素反応し糊化させた後130℃で10分加熱処理して酵素を失活させた。冷却後pH 5.5に調整し、Aspergillusniger由来のグルコアミラーゼとBacillus acidpullulyticum由来のプルラナーゼの混合酵素(糖化酵素Dextroyme Nove Nordisk, 225AGU/g)をデンプン1g当たり4 U添加し、50℃で24時間糖化反応を行った。糖化反応後Glucose analyzerによって得られたグルコースを求めたところ、1gの乾物デンプンから1.05 gのグルコースが得られた。

0047

この実施例6においては、シード培養までの培地は実施例1と全く同じである。主発酵用培地は、上記コーンスターチ糖化液グルコース換算で50 gを計量し、これに粉末CSL(コーン・スティープ・リカー、庄野澱粉製)を1%となるよう添加して1リッターとしオートクレーブ殺菌したものを用いた。また基質フィード液もコーンスターチ糖化液グルコース換算で35 g/Lとなるよう調整して用いた。実施例1と同じようにシードを添加して回分培養で培養を立ち上げ、残糖濃度がほとんど0になった時点で培養液のリサイクル、濁度制御による細胞濃度の制御、pH2点制御(pH 6.1の上限でアルカリフィード、pH 6.0の下限で基質フィードで行う)による連続基質フィード(コーンスターチ糖化液グルコース53 g/L、CSL 1g/L)を行った。菌濃度6 g/L、dilution rate 0.7 L/hで定常状態に達し、連続培養を150時間継続した。得られたL−乳酸は2.15 kg、光学純度は99.8%であった。

0048

また、実施例1と同様の雑菌汚染試験を実施したが、全培養期間に渡って雑菌汚染は認められなかった。さらに、連続発酵状態での培養液のナイシンZ濃度は回分培養法の約3倍に達していた。

発明の効果

0049

この出願の発明の方法により菌体を固定化しない微生物を永続的に使用することができるようになり、1.0h-1以上という(驚異的な)高希釈率による連続生産が可能で、このために反応系内の乳酸が低くなり、乳酸による阻害が生じないため、高い生産性を維持できる。しかも菌の活性が強いため、反応系内の糖のくいきりが良好で、そのため残糖濃度も低く保たれるため、原料の無駄も小さく押さえられる。この結果L−乳酸30 g/Lh以上の高い生産性が得られる。これは100 Klの反応槽で年間2万トンのL−乳酸の生産が可能であることを示すもので、高い生産性を誇る工業型発酵の代表であるL−グルタミン酸発酵の約20倍の生産性である。またアルコール生産菌を培養すれば、エタノール等を連続大量製造することも可能である。

0050

さらに、ナイシンA、Z等のバクテリオシン生産L−乳酸菌をこの発明の培養系に用いることによって、回分培養の3〜5倍濃度ものバクテリオシンを蓄積させることが可能となり、バクテリオシンの大量培養が可能となるばかりか、雑菌汚染を回避して高純度のL−乳酸を製造することも可能となる。

図面の簡単な説明

0051

図1この発明のための装置を例示した構成図である。
図2乳酸濃度一定の反応器でL−乳酸を連続生産する場合の希釈率とL−乳酸生産性との関係を示した図である。
図3菌体濃度10 g/LにおけるL−乳酸連続生産の希釈率と反応器内乳酸濃度の関係を示した図である。

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