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技術 高温性Clostridium属細菌の検出用培地

出願人 アサヒ飲料株式会社
発明者 青山冬樹
出願日 2000年8月18日 (20年3ヶ月経過) 出願番号 2000-248970
公開日 2002年2月26日 (18年8ヶ月経過) 公開番号 2002-058474
状態 特許登録済
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理
主要キーワード 変色反応 促進物 芽胞形成菌 高温性 pH指示薬 指標菌 低酸性飲料 加温販売
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2002年2月26日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

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課題

レトルト缶飲料中の高温性Clostoridium属細菌簡易迅速に検出することができる培地を提供する。

解決手段

高温性Clostoridium属細菌検出用培地ニュートラルレッドピルビン酸若しくはピルビン酸塩とを含ませることにより、高温性Clostoridium属細菌が増殖したことを培地の色の変化を確認することにより短期間で容易に菌体判別ができるようにした。

概要

背景

コーヒーやしるこ等のレトルト缶飲料は、通常、出荷前に120℃から125℃で20分から40分程度の加熱殺菌が行われるが、このような殺菌によっても死滅しない細菌がある。かかる細菌は一般に高温菌と呼ばれているが、この細菌は40℃以下の温度下においては増殖することもなく、何ら問題とはならない。

しかし、ホットベンダー加温販売される可能性のあるレトルト缶入り飲料にこのような菌が混入していた場合には、ホットベンダー内の温度がそのような細菌の最適増殖温度(55℃から60℃付近)にあたるために、細菌が増殖し、飲料に変敗を起こしてしまう可能性があり、そのような事態が生じないように事前対策を講じておく必要がある。

ここで、このような高温における変敗を防止する際の指標となる菌(変敗指標菌)として、嫌気性高温性Clostridium属細菌がある。この菌は発育不適当な環境下では芽胞を形成して活動を停止しているが、発育条件が整うと通常の菌体に戻って増殖を始めるため、その存否につき出荷前に綿密な検査を行うことは製品管理上極めて重要である。このようなことから、事前に変法TGC培地を使った混釈法や試験管による検査法によって高温性Clostridium属細菌を検出し、当該菌が検出されたものを出荷工程から排除するようにしている。

しかしながら、高温性Clostridium属細菌については増殖速度が遅いことに加え、乳入り飲料において検出を行おうとした場合には、乳成分拡散等によって菌体の確認をすることが極めて困難となるため、上記従来の検出法によっては迅速に検出することができなかった。より具体的に言えば、通常の菌についてはその検出期間が一般の細菌の2日程度であるのに対し、高温性Clostridium属細菌の場合には5日から7日間と検出期間としては極めて長期間を要していた。

概要

レトルト缶飲料中の高温性Clostoridium属細菌簡易迅速に検出することができる培地を提供する。

高温性Clostoridium属細菌検出用培地ニュートラルレッドピルビン酸若しくはピルビン酸塩とを含ませることにより、高温性Clostoridium属細菌が増殖したことを培地の色の変化を確認することにより短期間で容易に菌体の判別ができるようにした。

目的

本発明は、以上のような問題を解決すべくなされたものであり、その目的は、レトルト飲料製品に対する変敗指標菌である高温性Clostridium属細菌を、簡易かつ迅速に判別できるような培地を提供することにある。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

高温性Clostridium属細菌を検出するための培地であって、菌体の代謝によって変色する色素と、当該菌体の増殖を促進させる細菌増殖促進物と、を含むことを特徴とする高温性Clostridium属細菌検出用培地

請求項2

高温性Clostridium属細菌を検出するための培地であって、ニュートラルレッドを含むことを特徴とする高温性Clostridium属細菌検出用培地。

請求項3

高温性Clostridium属細菌を検出するための培地であって、更に、当該菌体の増殖を促進させる細菌増殖促進物を含むことを特徴とする請求項2記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

請求項4

前記細菌増殖促進物がピルビン酸またはピルビン酸塩であることを特徴とする請求項3記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

請求項5

30g/L程度の変法TGC培地中に、1〜40mg/lの濃度のニュートラルレッド、1〜30mmol/lの濃度のピルビン酸若しくはピルビン酸塩を含むものからなることを特徴とする高温性Clostridium属細菌検出用培地。

請求項6

レトルト飲料製品中の高温性Clostridium属細菌の検出用培地であることを特徴とする請求項1から5いずれか記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

請求項7

低酸性飲料中の高温性Clostridium属細菌検出用培地であることを特徴とする請求項1から5いずれか記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

請求項8

入り低酸性飲料製品中の高温性Clostridium属細菌の検出用培地であることを特徴とする請求項1から5いずれか記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

請求項9

高温性Clostridium属細菌の検出のためにニュートラルレッドを使用する方法。

技術分野

0001

本発明は、レトルト缶飲料製品に対する変敗指標菌である高温性Clostridium属細菌簡易かつ迅速に検出する培地に関するものである。

背景技術

0002

コーヒーやしるこ等のレトルト缶飲料は、通常、出荷前に120℃から125℃で20分から40分程度の加熱殺菌が行われるが、このような殺菌によっても死滅しない細菌がある。かかる細菌は一般に高温菌と呼ばれているが、この細菌は40℃以下の温度下においては増殖することもなく、何ら問題とはならない。

0003

しかし、ホットベンダー加温販売される可能性のあるレトルト缶入り飲料にこのような菌が混入していた場合には、ホットベンダー内の温度がそのような細菌の最適増殖温度(55℃から60℃付近)にあたるために、細菌が増殖し、飲料に変敗を起こしてしまう可能性があり、そのような事態が生じないように事前対策を講じておく必要がある。

0004

ここで、このような高温における変敗を防止する際の指標となる菌(変敗指標菌)として、嫌気性の高温性Clostridium属細菌がある。この菌は発育不適当な環境下では芽胞を形成して活動を停止しているが、発育条件が整うと通常の菌体に戻って増殖を始めるため、その存否につき出荷前に綿密な検査を行うことは製品管理上極めて重要である。このようなことから、事前に変法TGC培地を使った混釈法や試験管による検査法によって高温性Clostridium属細菌を検出し、当該菌が検出されたものを出荷工程から排除するようにしている。

0005

しかしながら、高温性Clostridium属細菌については増殖速度が遅いことに加え、乳入り飲料において検出を行おうとした場合には、乳成分拡散等によって菌体の確認をすることが極めて困難となるため、上記従来の検出法によっては迅速に検出することができなかった。より具体的に言えば、通常の菌についてはその検出期間が一般の細菌の2日程度であるのに対し、高温性Clostridium属細菌の場合には5日から7日間と検出期間としては極めて長期間を要していた。

発明が解決しようとする課題

0006

このように、従来法によれば、高温性Clostridium属細菌の検出には長期間を要し、また、例えば乳入り飲料については判別が困難というように、飲料の種類によっては菌体の判別が困難な場合がある、というような問題もあった。

0007

本発明は、以上のような問題を解決すべくなされたものであり、その目的は、レトルト飲料製品に対する変敗指標菌である高温性Clostridium属細菌を、簡易かつ迅速に判別できるような培地を提供することにある。

課題を解決するための手段

0008

以上のような目的を達成するために本発明者らが鋭意研究を行った結果、ニュートラルレッド検出用培地に含ませることによって、高温性Clostridium属細菌検出を簡易に行うことができるようになり、かつ、同培地にピルビン酸を含ませることによって高温性Clostridium属細菌の検出を簡易かつ迅速に行うことができるようにし、本発明を完成するに至ったのである。

0009

即ち、本発明によれば、ニュートラルレッドが高温性Clostridium属細菌によって代謝され、それが「変色」という結果となって表れるため、視認が容易であり、乳入り飲料のような視認が困難なものについても適確かつ簡易に検出を行うことができるようになるのである。また、ピルビン酸は高温性Clostridium属細菌の増殖を活性化するために、これを培地中に添加することによって実用上問題を生じない程度にまで検出速度を高めることができるようになる。

0010

このような本発明は、それを一般化すると、菌体の代謝によって変色する色素細菌増殖促進物とを検出用培地に含ませることにより、高温性Clostridium属細菌検出を簡易迅速に検出することを可能にした手法として把握することができる。そして、より詳しく説明すると、本発明は、従来法による培地、例えば変法TGC培地に、ニュートラルレッドのような菌の増殖に伴う菌体の代謝により分解される色素とピルビン酸のような細菌の増殖を促進する物とを添加することにより、色素の分解による培地の色の変化を確認するだけで(菌体の増殖を確認するよりも早く)菌体の確認ができるというものである。

0011

より具体的に本発明の内容を示すと、それは以下のようなものである。

0012

(1)高温性Clostridium属細菌を検出するための培地であって、菌体の代謝によって変色する色素と、当該菌体の増殖を促進させる細菌増殖促進物と、を含むことを特徴とする高温性Clostridium属細菌検出用培地。

0013

本明細書において「含む」としたのは、本発明による変色工程等を阻害しない限り、色素や細菌増殖促進物以外のものが培地中に含まれていても良いことを表明するためである。このような本発明は、対象菌が増殖すると、菌体の代謝によって色素が分解され、これにより培地が変色することによって菌体を判別するものであるところ、菌を培養した後に色素を添加したのでは、かかる変色反応が確認できなくなってしまうからである。

0014

なお、添加した色素の変化により菌の存否を確認する方法は、特開昭59−2699号公報や特開昭57−68796号公報においても明らかにされているが、これらはいずれも細菌検出用培地のpHの変化に伴う色の変化により菌の存否を確認するものである。従って、菌体による代謝によって生じる色の変化から細菌を判別する本発明とは明らかに異なるものである。

0015

(2)高温性Clostridium属細菌を検出するための培地であって、ニュートラルレッドを含むことを特徴とする高温性Clostridium属細菌検出用培地。

0016

「ニュートラルレッド」はpH指示薬として広く知られているが、本明細書においては菌体の代謝によって変色する色素として用いている。即ち、「ニュートラルレッド」がpHの変化に伴って変色するからではなく、培地中で高温性Clostridium属細菌が増殖すると、菌体の代謝によって「ニュートラルレッド」が分解され、これに伴って培地が黄色に変色することから本発明に有効であるということになる。

0017

(3)高温性Clostridium属細菌を検出するための培地であって、更に、当該菌体の増殖を促進させる細菌増殖促進物を含むことを特徴とする(2)記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

0018

ニュートラルレッドのほか、更に、細菌増殖促進物をも添加するのは、芽胞形成菌である高温性Clostridium属細菌の増殖が他の一般細菌より増殖が遅いことによる。即ち、飲料製造の現場においては、ニュートラルレッドの添加によって、簡易かつ確実に菌体の確認ができるというだけでは不十分で、細菌増殖促進物を添加して菌の増殖を早めることによって検査速度加速させる必要があることによる。

0019

(4) 前記が細菌増殖促進物ピルビン酸またはピルビン酸塩であることを特徴とする(3)記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

0020

ピルビン酸はエネルギー代謝中間生成物であるが、本発明における細菌増殖促進物として有効である。なお、Clostridium属細菌グルコースフルクトースキシロースの3種の糖の資化性があるが、後述する実施例3に示す通り、これらと比較しても、ピルビン酸が好適である。

0021

しかし、ピルビン酸は冷蔵保存が必要とされる粘性の高い液体であり、また、培地調整時にリン酸水素二カリウムの添加によってpHの調整が必要となる。このような手順を簡素化するために、ピルビン酸塩で代用することもできる。

0022

(5) 30g/L程度の変法TGC培地中に、1〜40mg/lの濃度のニュートラルレッド、1〜30mmol/lの濃度のピルビン酸若しくはピルビン酸塩を含むものからなることを特徴とする高温性Clostridium属細菌検出用培地。

0023

(6)レトルト缶の飲料製品中の高温性Clostridium属細菌の検出用培地であることを特徴とする(1)から(5)いずれか記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

0024

レトルト缶飲料はホットベンダーで加温販売されることがあるため、芽胞形成菌である高温性Clostridium属細菌の検出が必要とされる飲料製品である。

0025

(7)低酸性飲料中の高温性Clostridium属細菌検出用培地であることを特徴とする(1)から(5)いずれか記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

0026

pH4.6以下の酸性飲料においては、高温性Clostridium属細菌の耐熱性は低下し、また発育も抑制されるためにあまり問題とはならないが、低酸性飲料においては当該菌の増殖が可能であることから、低酸性飲料におけるかかる菌の検出は極めて重要である。なお、低酸性飲料には、紅茶、烏龍等の茶系飲料、その他、コーヒー、ココア、缶入りしるこやスープなど様々な飲料が含まれる

0027

(8) 乳入り低酸性飲料製品中の高温性Clostridium属細菌の検出用培地であることを特徴とする(1)から(5)いずれか記載の高温性Clostridium属細菌検出用培地。

0028

本明細書において「乳入り飲料」と言うときには、乳成分を含有するあらゆる飲料が含まれる。乳成分が含まれていればその拡散のため、従来法によるClostridium属細菌の検出は困難となってしまうが、本発明によれば、乳成分の有無にかかわらず簡易迅速に菌の検出が可能となる。

0029

(9)高温性Clostridium属細菌の検出のためにニュートラルレッドを使用する方法。

発明を実施するための最良の形態

0030

基礎となる培地の調整は常法による。例えば変法TGC培地や鉄サルファイト培地などを用いることができる。また菌の測定は、高温性Clostridium属細菌が嫌気性であることを考慮する必要がある。そのため、例えば、平板培養法ではなく半流動培地法で行う方法がある。

0031

以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明の本質が菌体の代謝によって変色する色素と細菌増殖促進物とを培地中に含ませるものであることは明らかであるから、その本質部分が変更されない限りにおいて種々の変更を行うことが可能である。従って、本発明は以下の実施例だけに限定されるものではない。

0032

従来の変法TGC培地に、ニュートラルレッド(NR)、ブロモチモールブルーBTB)、ブロモクレゾールパープル(BCP)、クロルフェノールレッド(CPR)フェノールレッド(PR)といった5種類のpH指示薬を添加して、Clostoridium.thermohydrosulfuricum及びClostoridium.thermaceticum発芽処理後の胞子液103cfu/mlを1ml摂取した。各pH指示薬の添加は、培地調整時に添加する方法と、5日間の培養後に添加する方法との2通りを行って比較した。その結果は以下の表1に示す通りである。

0033

0034

Clostoridium.thermaceticumは成長が遅く、5日間ではpHが十分に下がらないため、培養後に色素を添加して菌を判別するというのは不可能であった。また、培地調整時に添加した一部のpH指示薬については、pHの変化があまりないにもかかわらず色が変化していたことから、この変化はpHの変化によるものではなく、菌の代謝等によって色素が分解されたことによるものであると考えられる。このことから、色素は培地調整時に添加することが必要であることが明らかとなった。

0035

変法TGC培地に色素を添加して培地を調整し、その後、Clostoridium.thermohydrosulfuricum及びClostoridium.thermaceticum発芽処理後の芽胞液103〜10−1cfu/mlと缶入りコーヒー(乳入り)を1ml摂取し、MPN法による検出感度及び判定期間の検討を行った。

0036

ここで、MPN法とは、まず、菌液希釈していき各希釈段階毎に5本の試験管に摂取する。そして、細菌の培養後に何本の試験管に菌が増殖したかを見ることにより、統計的に菌の濃度を算出する方法である。検出感度等を比較するのに有効な手法である。以下の表2に各種色素を細菌培養前に添加した場合におけるMPN法による比較結果を示す。なお、この表において、例えば4/5とあるのは、5本摂取したうち4本に菌が生えていることを意味する。

0037

0038

Clostoridium.thermohydrosulfuricumにおいては、ニュートラルレッド、クロルフェノールレッド、フェノールレッドの3種につき、従来法と同等の結果が得られた。また、Clostoridium.thermac eticumでは、ニュートラルレッドについてのみ、判定が可能だった。このことから、Clostoridium属細菌の検出用の培地に添加する色素として、ニュートラルレッドを使用することが有効であることが明らかとなった。

0039

Clostoridium.thermohydrosulfuricumは3日間の培養で判定が可能であったがClostoridium.thermaceticumの培養には4日間を要したことから、この菌の増殖を早めるべく、グルコース、フルクトース、キシロース、ピルビン酸及びピルビン酸塩を培地に添加し、菌の増殖への貢献度を比較した。その結果、フルクトース、キシロースを添加しても効果はなく、また、グルコースを添加しても若干成長が良くなっただけであった。これに対し、ピルビン酸を添加した場合には、培養が促進された。このことから、細菌増殖促進のための培地改良にはピルビン酸が有効であることが明らかとなった。

0040

ピルビン酸の最適添加濃度を検討するため、変法TGC培地にニュートラルレッドを添加し、以下の組成でピルビン酸を添加し、リン酸水素カリウムでpHを調整した

0041

変法TGC
変法TGC+pyruvate 0.63g/l+K2HPO42g/l
変法TGC+pyruvate 1.26g/l+K2HPO43g/l
変法TGC+pyruvate 5.04g/l+K2HPO418g/l

0042

この培地にClostoridium.thermohydrosulfuricum及びClostoridium.thermaceticumを摂取したところ、以下の表3に示す結果が得られた。

0043

0044

30g/Lの変法TGC培地中に、1%のニュートラルレッド溶液を1ml添加し、ピルビン酸塩を下記の組成で調整した。

0045

変法TGC
変法TGC+0.55g/l sodium pyruvate
変法TGC+0.8g/l sodium pyruvate
変法TGC+1.1g/l sodium pyruvate

0046

この培地に、control、各濃度をそれぞれ5本づつ添加し、Clostoridium.thermaceticumの胞子液103cfu/mlを摂取したところ、以下の表4に示す結果を得ることができた。

0047

0048

この結果、30g/Lの変法TGC培地中に、1%のニュートラルレッド溶液を1ml添加した場合には、ピルビン酸塩の添加量は0.8gが適切であることがわかった。

0049

Clostoridium.thermohydrosulfuricum、Clostoridium.thermaceticum、Bacillus.stearothermophilusATCC7953を試験菌株とし、従来の培地と改良培地の検出感度及び判定期間の比較をMPN5本法を用いて行ったところ、以下の表5に示す結果が得られた。

0050

0051

Bacillus.stearothermophilusについては色素の変化現象がみられないことから、本発明に係る培地による検出はこの菌にとって不適であることが明らかとなった。一方、Clostoridium.thermohydrosulfuricum 及びClostoridium.thermaceticumについては色素の変化がみられ、しかも72時間の培養でこの変化がみられたことから、従来法と比べ、飛躍的に短時間で菌体の確認ができることが明らかとなった。

0052

比較例1同様の実験を他の飲料によって行ったところ、以下の結果が得られた。

0053

0054

0055

0056

0057

0058

この結果から、他のレトルト缶飲料においても72時間の培養での細菌の検出ができることが明らかとなった。

0059

実際に製品を作る場合にはレトルト殺菌をしているため、菌体は損傷しているものと考えられることから、121℃20分間の熱処理を行った後、菌を試験管に摂取したところ、以下の表11に示す結果が得られた。

0060

0061

この結果、レトルト殺菌の有無にかかわらず、72時間で菌を検出できることが明らかとなった。

発明の効果

0062

以上のような本発明によれば、レトルト缶飲料中の高温性Clostridium属細菌が増殖したことを培地の色の変化を見ることにより、短期間(3日間)で容易に判別することができる。

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