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解決手段

特定酵素基質培地法において、発色酵素基質から分解して生じたインディゴ物質により呈色した培地色を判定するための比色液であって、インディゴカルミン及びo−ニトロフェノールを含有することを特徴とする微生物判定用比色液。

効果

特定酵素基質培地法における微生物判定の陽性限界肉眼で明確に判断することができる。また、本発明比色液は室温に保管しても色調の変化がなく、保存安定性がよいことから、微生物判定用キットとして培地と共に提供することが可能である。

概要

背景

食品飲料水中大腸菌及び大腸菌群の有無の判定は、食品や水の糞便汚染の有無を確認するための日常検査として重要である。特に、飲料水中の大腸菌群の検出には、簡便且つ迅速に判定できる方法が望まれ、上水試験法においても、従来から用いられていた乳糖ブイヨンブリリアントグリーン乳糖胆汁ブイヨン培地法(LB−BGLB法)に加え、1993年には、迅速法として特定酵素基質培地法が追加された。

斯かる特定酵素基質培地法は、微生物、例えば大腸菌や大腸菌群に特異的に存在するβ−グルタロニダーゼ又はガラクトシダーゼを利用するものであって、培地に添加されたo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(ONPG)、5−ブロモ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド(Blugal)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−Gal)等の発色酵素基質や4−メチルウンベリフリル−β−D−グルクロニド(MUG)等の蛍光酵素基質から当該酵素によって分解されて生じた発色物質蛍光物質の色や蛍光により微生物を検出するものである。中でも発色酵素基質として5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−Gal)を用いた場合、生じる青色反応産物(ブロモクロロインディゴ)は、肉眼的に明瞭であることから、X−Galを添加した培地は、大腸菌群を迅速且つ特異的に検出するための好適な培地とされている。

しかし、菌の濃度が低い場合は、肉眼では判定が難しく分光光度計を用いて吸光値を測定する必要があり、簡易性・迅速性の点で問題があった。一方、培地中には、栄養成分等の複数の有機無機物質が含有され、培地自体が着色されていることから、培地中でのインディゴ青色の色調は変化し、肉眼で陽性を判断する場合には対照色を示す必要があるが、発色酵素基質から生じるインジゴ色素水溶性が低く、水溶性の色素溶液として用いることはできなかった。

概要

特定酵素基質培地法において、発色酵素基質から分解して生じたインディゴ系物質により呈色した培地色を判定するための比色液であって、インディゴカルミン及びo−ニトロフェノールを含有することを特徴とする微生物判定用比色液。

特定酵素基質培地法における微生物判定の陽性限界を肉眼で明確に判断することができる。また、本発明比色液は室温に保管しても色調の変化がなく、保存安定性がよいことから、微生物判定用キットとして培地と共に提供することが可能である。

目的

本発明は、特定酵素基質培地法において、微生物の存在によりインディゴ青色を発色した培地色を、肉眼で確実に判定するために用いられる比色液を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

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請求項1

特定酵素基質培地法において、発色酵素基質から分解して生じたインディゴ物質により呈色した培地色を判定するための比色液であって、インディゴカルミン及びo−ニトロフェノールを含有することを特徴とする微生物判定用比色液。

請求項2

発色酵素基質が、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−Gal)である請求項1記載の微生物判定用比色液。

請求項3

波長610nmにおける吸光値が、0.07〜0.12である請求項1又は2記載の微生物判定用比色液。

請求項4

インディゴカルミンを0.01〜1mg/100ml、o−ニトロフェノールを0.1〜10mg/100ml含有するものである請求項1〜3のいずれか1項記載の微生物判定用比色液。

請求項5

判定微生物が、大腸菌及び/又は大腸菌群である請求項1〜4のいずれか1項記載の微生物判定用比色液。

技術分野

0001

本発明は、インディゴ物質により呈色した培地色を判定するために用いられる微生物判定用比色液に関する。

背景技術

0002

食品飲料水中大腸菌及び大腸菌群の有無の判定は、食品や水の糞便汚染の有無を確認するための日常検査として重要である。特に、飲料水中の大腸菌群の検出には、簡便且つ迅速に判定できる方法が望まれ、上水試験法においても、従来から用いられていた乳糖ブイヨンブリリアントグリーン乳糖胆汁ブイヨン培地法(LB−BGLB法)に加え、1993年には、迅速法として特定酵素基質培地法が追加された。

0003

斯かる特定酵素基質培地法は、微生物、例えば大腸菌や大腸菌群に特異的に存在するβ−グルタロニダーゼ又はガラクトシダーゼを利用するものであって、培地に添加されたo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(ONPG)、5−ブロモ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド(Blugal)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−Gal)等の発色酵素基質や4−メチルウンベリフリル−β−D−グルクロニド(MUG)等の蛍光酵素基質から当該酵素によって分解されて生じた発色物質蛍光物質の色や蛍光により微生物を検出するものである。中でも発色酵素基質として5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−Gal)を用いた場合、生じる青色反応産物(ブロモクロロインディゴ)は、肉眼的に明瞭であることから、X−Galを添加した培地は、大腸菌群を迅速且つ特異的に検出するための好適な培地とされている。

0004

しかし、菌の濃度が低い場合は、肉眼では判定が難しく分光光度計を用いて吸光値を測定する必要があり、簡易性・迅速性の点で問題があった。一方、培地中には、栄養成分等の複数の有機無機物質が含有され、培地自体が着色されていることから、培地中でのインディゴ青色の色調は変化し、肉眼で陽性を判断する場合には対照色を示す必要があるが、発色酵素基質から生じるインジゴ色素水溶性が低く、水溶性の色素溶液として用いることはできなかった。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明は、特定酵素基質培地法において、微生物の存在によりインディゴ青色を発色した培地色を、肉眼で確実に判定するために用いられる比色液を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0006

本発明者らは、斯かる実状に鑑み、培地中でインディゴ青色が発色し呈色した培地色の陽性対照となり得る水溶性色素について種々検討した結果、インディゴカルミンとo−ニトロフェノールを配合した溶液が、インディゴ青色が発色した培地色に極めて近くしかも安定であり、微生物判定の陽性限界を示す比色液となり得ることを見出し、本発明を完成した。

0007

すなわち本発明は、特定酵素基質培地法において、発色酵素基質から分解して生じたインディゴ系物質により呈色した培地色を判定するための比色液であって、インディゴカルミン及びo−ニトロフェノールを含有することを特徴とする微生物判定用比色液を提供するものである。

発明を実施するための最良の形態

0008

本発明の微生物判定用比色液は、特定酵素基質培地法において、微生物の存在により発色酵素基質から分解して生じたインディゴ系物質により呈色した培地色を判定するために用いられるものである。

0009

ここで、特定酵素基質培地法とは、培地に添加された発色酵素基質や蛍光酵素基質が、微生物、例えば大腸菌や大腸菌群に特異的に存在する酵素(β−グルタロニダーゼ又はガラクトシダーゼ等)により分解され、生じた発色物質や蛍光物質の色や蛍光により微生物を検出する方法をいい、上水試験法にも採用されているものであるが、本発明においては、このうち特に、インディゴ系の発色物質を生成する発色酵素基質を用いたものをいう。

0010

斯かる発色酵素基質としては、例えば5−ブロモ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド(Blugal)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−Gal)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルコピラノシド(X−Gluc)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−D−ガラクトピラノシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−D−グルコピラノシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロニックアシドサイクロヘキシルアンモニウム塩、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロニックアシド・ナトリウム塩等が挙げられ、特に大腸菌群の検出に用いられるX−Galが好ましい。

0011

本発明の比色液は、特定酵素基質培地法を用いて微生物の存在を判定する際に用いられるものであるが、ここでいう微生物とは、特定酵素基質培地法が適用できる細菌類であれば特に制限されるものではなく、例えば大腸菌(E.coli)や大腸菌群が挙げられる。

0012

尚、大腸菌群とは、ラクトース分解酵素を産生する能力を有する一群の微生物で、エシェリシア属、サイトロバクター属、クレブシエラ属エンテロバクター属等に属するものをいう。

0013

本発明の微生物判定用比色液は、インディゴカルミン及びo−ニトロフェノールを含有するものであるが、青色成分であるインディゴカルミンと共に黄色成分としてのo−ニトロフェノールを配合することにより、インディゴ青色が発色した培地色に極めて近い色調とすることができる。

0014

また、培地中の細菌数によってその呈色の色調も変化し、比色液としては、陽性限界を示す色と同一のものである必要がある。斯かる観点から、本発明の比色液は、波長610nmにおける吸光値が0.07〜0.12であることが好ましく、更に波長420nmにおける吸光値が0.1〜0.3であることが好ましい(参考例1参照)。

0015

そして、このような吸光値とするためには、例えばインディゴカルミンの濃度が0.2〜0.8mg/100ml、o−ニトロフェノールの濃度が0.4〜2mg/100mlであり、その混合比率は1:9〜4:6とすることが好ましい。発色酵素基質としてX−Galを用いた培地に対しては、インディゴカルミンの濃度を0.2mg/100ml、o−ニトロフェノールの濃度を0.48mg/100mlとした比色液とすることが最も好ましい。

0016

本発明の比色液は、特定量のインディゴカルミン及びo−ニトロフェノールを水、エタノールメタノール等の透明の溶媒に溶解して調製すればよいが、着色安定性に影響を与えない範囲で、適宜他の成分、例えば使用される培地に含有される成分、緩衝剤保存剤防腐剤等を添加することができる。

0017

例えば、大腸菌を検出する目的で、培地中に蛍光酵素基質である4−メチル−ウンベリフェリル−β−D−グルクロニド(MUG)が添加されている場合には、本発明の比色液に4−メチル−ウンベリフェロンを添加することにより、同時に大腸菌検出のための陽性対照液としても使用できる。尚、この場合は、波長366nmの紫外線照射による蛍光の有無で確認でき、また、比色液に添加される4−メチル−ウンベリフェロンの濃度は、0.1〜1mg/100mlとするのが好ましい。

0018

以下、実施例及び参考例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

0019

参考例1陽性反応の限界色の検討
E.coliATCCl1775、K.ascorbata ATCC 33433、A.hydrophilia JCM 3976、C.freundii ATCC 8090、C.diversus ATCC 25407、S.marcescens ATCC 8100、E.aerogenes ATCC 13048、E.cloacae ATCC 23355、E.intermedium ATCC 33421、E.cloaceae ATCC 13047、K.oxytoca ATCC 13182、K.pneumoniae ATCC 13883、K.ozaenae ATCC 11296及びH.alvei ATCC 13337の細菌(大腸菌、大腸菌群)計14株を、トリプトソーヤブイヨンで35℃、24時間培養した菌液供試して、E.coliを除く菌種は10-9まで滅菌生理食塩水希釈し、E.coliは10-10まで希釈し、各々の希釈液10mlをX−Gal含有培地(「ECブルー10」日水製薬(株)製)に接種し、35℃、24時間培養後、各菌種における陽性反応を肉眼判定及び610nm(光電光度計(ANA−7S)、丸型試料セル使用)における測定を行った。表1に示すように、波長610nmにおける吸光値が0.07以上の場合に肉眼判定において陽性と判定できた。

0020

0021

参考例2インデイゴカルミン溶液とo−ニトロフェノール溶液の配合検討
精製水1000ml当たりリン酸二水素カリウム1gとリン酸水素カリウム4gを溶かしたリン酸緩衝液を調製した。インディゴカルミン溶液は100mlのリン酸緩衝液にインディゴカルミンを0.2mg又は0.5mgを溶かして調製し、o−ニトロフェノール溶液は同様に100mlのリン酸緩衝液にo−ニトロフェノールを0.2mg、0.5mg、0.8mg又は1mgを溶かして調製した。各濃度の2種類の溶液を混ぜ合わせ、波長610nm(光電光度計(ANA−7S)、丸型試料セル)で吸光値を測定した。また、X−Gal含有培地(「ECブルー10」日水製薬(株)製)に各濃度のインディゴカルミン溶液を加えて、陽性色の指標とした。

0022

表2に示すように、ECブルー10にインディゴカルミン溶液(0.2mg/100ml)を10ml加えることにより陽性限界色に近い色になった。これを指標として、インディゴカルミン溶液とo−ニトロフェノール溶液を組合せて最も近い色を呈したのは、インディゴカルミン溶液(0.5mg/100ml)4mlとo−ニトロフェノール溶液(0.8mg/100ml)6mlの組合せであった。この時の溶液の波長610nmの吸光値は0.07、波長420nmの吸光値は0.11であった。これに対し、ECブルー10にインディゴカルミン溶液(0.2mg/100ml)を10ml加えた溶液の波長610nmの吸光値は0.10、波長420nmの吸光値は0.15であることから、ほぼ同等の比色液が調製できた。

0023

0024

参考例3蛍光確認液の検討
4−メチルウンベリフェロン(7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン)ナトリウム塩(SIGM)10mgを100mlの精製水に溶解し、精製水で10倍段階希釈した溶液を波長366nm(MODEL UVBL−25,UVP,INC)の紫外線照射による肉眼判定とMTP−32蛍光リーダー(365nm)による測定を行った。

0025

表3に示すように、4−メチルウンベリフェロンナトリウム溶液の濃度が0.1mg/100mlの時、蛍光として確認できる限界であることを認めた。よって、精製水1000ml当たり1mg 4−メチルウンベリフェロンナトリウムを加えて蛍光確認溶液とすることにした。

0026

0027

実施例1 比色液の調製
インディゴカルミン2mg、o−ニトロフェノール4.8mg、4−メチルウンベリフェロンナトリウム1mg、リン酸二水素カリウム1g、リン酸水素二カリウム4gを精製水で溶かして全量を1Lとした。尚、容器は使用する培地と同様のものを使用した。

0028

実施例2 比色液の性能
E.coliATCCl1775(2.1×109/ml)、C.diversus ATCC 25407(4.0×108/ml)、C.freundii ATCC 8090(2.0×107/ml)、E.aerogences ATCC 13048(9.0×108/ml)、E.cloacae ATCC 23355(8.0×108/ml)、K.oxytoca ATCC 13182(1.5×109/ml)、K.ozaenae ATCC 11296(2.7×108/ml)、K.pneumoniae ATCC 13883(9.0×108/ml)及びK.ascorbata ATCC 33433(6.3×108/ml)の供試菌株括弧内は35℃、24時間培養後のトリフトソイブロス中菌数を示す)を1ml当たり数個になるように希釈し(10-7〜10-10)、それを9mlの精製水を分注してあるX−Gal含有培地(「ECブルー10」日水製薬(株)製)に接種し、35℃で培養し、18時間〜48時間まで陽性反応を観察した。この時、実施例1で調製した比色液を対照として置き、陽性限界を見極め、その後、それが実際に陽性になるか否かを確認したところ、全ての菌株について、本発明の比色液と同等の発色を示した陽性限界の培地では、培養を続けるとすべて陽性になり、比色液の性能は十分であることが確認できた。E.coli ATCC l1775の場合及びC.diversus ATCC 25407の場合の結果を例として表4及び表5に示す。

0029

0030

発明の効果

0031

本発明の比色液を用いることにより、特定酵素基質培地法における微生物判定の陽性限界を肉眼で明確に判断することができる。また、該比色液は室温に保管しても色調の変化がなく、保存安定性がよいことから、微生物判定用キットとして培地と共に提供することが可能である。

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