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図面 (10)

課題

免疫疾患新規治療剤の提供。

解決手段

溶性TLA4タンパク質を含んで成る免疫疾患の治療剤。

概要

背景

脊椎動物の免疫系の特徴は、「自己」と「非自己」とを区別する能力である。この性質は、最適な免疫活性化を達成するために多数のシグナルを必要とする系の進化に導いた(Janeway, Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol. 54 : 1-14(1989)) 。T細胞B細胞相互作用免疫応答に対して必須である。T細胞およびB細胞上に見いだされる多数の付着分子のレベルは、免疫応答の間に増加する(Springerら、(1987)、前掲;およびShimizu, Current Opinion in Immunology, KindtおよびLong編、1:92-97 (1988)) ;およびHemler, Immunology Today 9:109-113 (1988)) 。

これらの分子のレベルの増加は、活性化されたB細胞が、抗原特異的T細胞の増殖を刺激するとき、休止のB細胞よりもいっそう有効である理由の説明を促進することができる(Kaiuchi ら、J. Immunol. 131 : 109-114 (1983) ; Krcigerら、J. Immunol. 135 : 2937-2945 (1985) ; McKenzie, J. Immunol. 141 : 2907-2911 (1988) ; およびHawrylowicz およびUnanue, J. Immunol. 141 : 4083-4088 (1988)) 。

Tリンパ球(「T細胞」)の免疫応答の発生は、細胞−細胞の相互作用(Springerら、A. Rev. Immunol.5:223-252 (1987)) 、とくにT細胞とアクセサリー細胞、例えば、B細胞との間の相互作用、および可溶性仲介因子サイトカインまたはリンホカイン)の生産を含む複雑なプロセスである(Dinarello およびMier, New Engl. Jour. Med. 317 : 940-945 (1987))。この応答は、T細胞レセプター複合体(Weiss ら、Ann. Rev. Innunol.4:593-619 (1986)) および他の「アクセサリー表面分子(Springerら、(1987)前掲)を含む、いくつかのT細胞表面レセプターにより調節される。これらのアクセサリー分子の多数は、細胞の表面上のモノクローナル抗体反応性により定められる、天然に見いだされる細胞表面の分化(CD)抗原である(McMichacl 編、Leukocyte TypingIII ,Oxford Univ. Press 、オックスフォードニューヨーク(1987))。

リンパ球のアクセサリー分子を含む抗原独立の細胞間の相互作用は、免疫応答に対して必須である(Springerら、(1987)前掲)。例えば、T細胞関連タンパク質CD2のそのリガンドLFA 3(広く発現される糖タンパク質(ShawおよびShimuz、前掲の中に概観されている))への結合は、抗原特異的T細胞の活性化を最適化するために重要である(Moigcon ら、Nature 339 : 314(1988))。他の重要な付着系は、リンパ球、マクロファージ収量顆粒球上に見いだされるLFA-1糖タンパク質(Springerら、(1987)前掲;ShawおよびShimuz (1988) 前掲)のそのリガンドICAM-1(Makgoba ら、Nature 311 : 86-88 (1988)) およびICAM−2(Staunton ら、Nature 339 : 61-64 (1989)) への結合を含む。

T細胞のアクセサリー分子CD8およびCD4は、それぞれ、MHCクラスI(Norment ら、Nature 336 : 79-81 (1988)) およびクラスII(Doyle およびStrominger, Nature 330 : 256-259 (1987))分子との相互作用により、T細胞の付着を強化する。「ホーミングレセプター(homing receptor)」はリンパ球の移動のコントロールのために重要である(Stoolman, Cell 56 : 907-910 (1989))。VLA糖タンパク質は、細胞外マトリックス成分への付着を必要とするリンパ球の機能を仲介するように思われるインテグリン(integrin) である(Hemler、前掲)。CD2/LFA-3,LFA-1/ICAM-1、およびVLA 付着系は、広範な種類のタイプの細胞上に存在する(Springerら、(1987)、前掲;ShawおよびShimuz、(1989)、前掲およびHemler、(1988))、前掲)。

B−リンパ球の活性化は2つのシグナルを必要とすることがかなり以前に提案され(Bretscher およびCohn, Science 169 : 1042−1049 (1970))そして現在すべてのリンパ球はそれらの最適な活性化のための2つのシグナル、抗原特異的またはクローナルシグナル、ならびに抗原非特異的シグナルを必要とすると信じられている(Janeway 、前掲)。Freeman ら(J. Immunol. 143 (8) : 2714-2722(1989))は、mAB B7により認識されるB細胞活性化抗原をコードするcDNAクローンを単離しそして配列決定した(Freeman ら、J. Immunol. 138 : 3260 (1987))。

このcDNAでトランスフェクションしたCOS細胞は、標識化mAB B7およびmAB BB−1の両者により染色されることが示された(Clark ら、Human Immunol. 16 :100-113 (1986);Yokochi ら、J. Immunol. 128 : 823 (1981)) ; Freeman ら、(1989)前掲;およびFreeman ら、(1987)、前掲))。さらに、この抗原の発現は他の系統の細胞、例えば、単球上に検出された(Freeman ら、前掲)。

ヘルパー細胞(Th )抗原の応答のために要求されるシグナルは、抗原を提示する細胞(APC)により提供される。T細胞レセプター複合体(Weiss, J. Clin, Invest. 86 : 1015 (1990)) を、 APC上のクラスIIの主要な組織適合性複合体MIIC)分子に関係して提示された抗原と相互作用させることによって、第1シグナルは開始される(Allen, Immunol. Today 8 : 270 (1987)) 。この抗原特異的シグナルは完全な応答を発生するために不十分であり、そして第2シグナルの存在下に、クローナルの不活性化またはアネルギーに実際に導くことがある (Schwartz, Science 248 : 1349 (1990))。

MHCにより提供される第2「共同刺激(costimulatory)」シグナルについての要件は、ある数の実験の系において証明された(Schwartz,前掲;WeaverおよびUnanue, Immunol. Today 11 : 49 (1990))。これらの1または2以上のシグナルの分子の性質は完全には理解されないが、ある場合において、可溶性分子、例えば、インターロイキンIL)−1(WeaverおよびUnanuc, 前掲)および細胞間付着に関係する膜レセプターの両者は共同刺激シグナルを提供できることが明らかである。

CD28抗原、すなわち、免疫グロブリン上科ホモ量体の糖タンパク質(AruffoおよびSeed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 8573-8577 (1987))は、ほとんどの成熟ヒトT細胞上に見いだされるアクセサリー分子である(Damle ら、J. Immunol. 131 : 2296-2300 (1983)) 。現在の証拠示唆するように、T細胞反応複合体により開始されるものと区別される別のT細胞活性化の経路において、この分子は機能する(Juneら、Mol. Cell. Bicl. 7 : 4472-4481 (1987)) 。CD28抗原と反応性のモノクローナル抗体(mAb)は、種々のポリクローナルの刺激により開始されるT細胞の応答を増強することができる(Juneら、前掲、の中に概観されている)。

これらの刺激作用はmAb 誘発サイトカインの生産(Thompsonら、Proc. Natl.Acad. Sci. 86 : 1333-1337 (1989) ; およびLindstenら、Scicnce 244 : 339-343 (1989)から、mRNA安定化の増加 (Lindstenら、(1989)、前掲)の結果としてを生ずることができる。抗CD28mAb は、また、阻止作用を有することができ、すなわち、それらはオートロガス混合リンパ球反応(Damle ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096-6001 (1981)) および抗原特異的T細胞クローンの活性化(Lesslauer ら、Eur. J. Immunol. 16 : 1289-1296 (1986)) をブロックすることができる。

CD28はB細胞活性化抗原であるB7/BB−1のための対レセプターであることが研究において示された(Linsley ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 5031-5035 (1990)) 。便宜上、B7/BB−1抗原を以後「B7抗原」と呼ぶ。CD28とB7抗原との間の相互作用は、B7抗原およびCD28レセプターの細胞外部分、および免疫グロブリン(Ig)Cγ1(一定領域の重鎖)の遺伝学的融合を使用して特徴づけられた(Linsley ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991))。

同定化B7Ig融合タンパク質ならびにB7陽性CHO細胞は、T細胞の増殖を共同刺激(costimulate)することが示された。B7陽性CHO 細胞によるT細胞の刺激は、また、IL−2のための転写レベルの増加を特異的に刺激する。追加の研究において、抗CD28mAb は、ある種のT細胞白血病細胞系においてB細胞系白血病系統との細胞の相互作用により誘発されたIL−2の生産を阻止することが示された(Kohno ら、Cell Immunol. 131-1-10 (1990))。

CD28は単一の細胞外可変領域(V)様ドメインを有する(AruffoおよびSeed、前掲) 。相同性分子のCTLA4は、ネズミ細胞溶解性T細胞のcDNAライブラリー分別スクリーニングにより同定された(Brunetら、Nature 328 : 267-270 (1987))。この分子の転写細胞障害活性を有するT細胞の集団の中に見いだされ、CTLA4が細胞溶解性応答において機能するであろうことを示唆した (Brunetら、前掲;およびBrunetら、Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)) 。

研究者らの報告によると、CTLA4のヒトの対 (Dariavach ら、Eur. J.Immunol. 18 : 1901-1905 (1988)) の遺伝子はクローニングされそしてCD28と同一の染色体領域(2g 33-34) にマッピングされた(Lafage-Pochitalodd)ら、Immunogenetics 31 : 198-201 (1990)) 。このヒトCTLA4のDNA とCD28タンパク質をコードするものとの間の配列の比較は、膜近傍領域および細胞質領域において最高度の相同性をもつ、配列の有意な相同性を明らかにする(Brunetら、1988、前掲;Dariavach ら、1988、前掲)。

CD28とCTLA4との間の高度の相同性は、それらの遺伝子の共同局在化一緒に、これらの分子がまた機能的に関係するかどうかという問題を発生する。しかしながら、CTLA4のタンパク質生産物はまだ首尾よく発現されてきていないので、これらの問題は未解決のままである。

免疫グロブリン遺伝子の上科における細胞表面の糖タンパク質の可溶性誘導体の発現は、CD4,HIV-1のレセプター、およびCD28およびB7のレセプターについて、ハイブリッド融合分子を使用して活性化され、これらのハイブリッド融合分子は抗体ドメインに融合されたCD4 レセプターの細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDNA 配列から成る(免疫グロブリンγ1(Capon ら、Nature 337 : 525-531 (1989)(CD4)およびLinsley ら、J. Exp. Med.、前掲)(CD28およびB7) 。

従来発現されていないCTLA4遺伝子の可溶性タンパク質生産物を得ること、およびT細胞の機能的応答に関係するCTLA4のための天然のリガンドを同定することは有用であろう。次いで、可溶性タンパク質生産物を使用してT細胞のin vivo応答を調節して病理学的状態処置することができるであろう。

発明の要約
したがって、本発明はCTLA4レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をコードする完全なかつ正しいDNA 配列を提供し、そしてCTLA4レセプターのために天然のリガンドとしてB7抗原を同定する。本発明は、また、CTLA4免疫グロブリン(Ig)融合タンパク質生産としてDNA を発現する方法を提供する。本発明の態様は、CTLA4Ig融合タンパク質、およびCD28Ig/CTLA4 Ig 融合タンパク質を包含するハイブリッドの融合タンパク質を包含する。また、CTLA4融合タンパク質、B7Ig融合タンパク質、およびそれらの断片および/または誘導体、例えば、CTLA4およびB7抗原と反応性のモノクローナル抗体を使用して細胞の相互作用および免疫応答を調節する方法が提供される。

本発明のヒトCTLA4レセプタータンパク質は187アミノ酸によりコードされ、そして新しく同定されたN連鎖グリコシル化部位を包含する。本発明のCTLA4Ig融合タンパク質は、活性化B細胞、および他の系統上に発現されたB7抗原、T細胞上のCD28レセプターのためのリガンドと結合する。CTLA4Igは、CD28レセプターに結合するB7よりも有意により高い親和性でB7抗原と結合する。

CTLA4Ig構成体は、ヒトIgCγ1ドメインに相当する第2アミノ酸配列に融合したCTLA4レセプターの細胞外ドメインに相当する第1アミノ酸配列を有する。第1アミノ酸配列は、アミノ酸配列の約位置1から約位置125 のアミノ酸残基を含有し、これらのアミノ酸残基はヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸残基を含有する第2アミノ酸配列に接合したCTLA4の細胞外ドメインに相当する。融合タンパク質は好ましくは2量体の形態で生産される。可溶性CTLA4IgはTおよびBリンパ球の応答の効力のあるin vivoインヒビターである。

また、本発明において、ハイブリッド融合タンパク質、例えば、第1アミノ酸配列を有するCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質が包含され、この第1アミノ酸配列はCTLA4Igの細胞外ドメインの断片に相当する第2アミノ酸配列およびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列に接合したCD28の細胞外ドメインの断片に相当する。

ハイブリッド融合タンパク質の1つの態様は、CD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置1から約94のアミノ酸残基を含有する第1アミノ酸配列を有するCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質であり、CD28の細胞外ドメインはCTLA4の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置94から約位置125 のアミノ酸残基を含有する第2アミノ酸配列を接合し、CTLA4の細胞外ドメインはヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸残基を含有する第3アミノ酸配列に接合している。

また、本発明において、T細胞をCTLA4レセプターのリガンドと反応させることによって、CTLA4陽性T細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することによる、他の細胞とのT細胞の相互作用を調節する方法が包含される。リガンドはB7Ig融合タンパク質、CTLA4レセプターと反応性のモノクローナル抗体、および抗体断片を包含する。本発明は、また、B7抗原のためのリガーゼを使用する、B7陽性細胞とのT細胞の相互作用を調節する方法を提供する。このようなリガンドは、本発明のCTLA4Ig融合タンパク質、その断片または誘導体、CD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。

本発明は、さらに、B7抗原と反応性のリガンドを投与してB7陽性細胞とのT細胞の相互作用を調節することによって、B7陽性細胞とのT細胞の相互作用により仲介される免疫系の疾患を処置する方法を包含する。このリガンドは、CTLA4Ig融合タンパク質、CD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。

CTLA4Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体およびCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体を、細胞の相互作用の調節における使用について記載する。CTLA4Ig融合タンパク質を安定に発現する新規チャイニーズハムスター卵巣細胞系をまた開示する。

発明の実施の形態
ここに記載する本発明を完全に理解することができるように、次の説明を記載する。本発明は、T細胞表面上に見いだされ、活性化B細胞および他の系統の細胞上に発現されたB7抗原に結合する、ヒトCTLA4レセプターの単離およびクローニング、およびCTLA4レセプター遺伝子の可溶性融合タンパク質生産物の発現に関する。本発明は、また、発現されたCTLA4レセプターを使用して、B7陽性細胞とのT細胞の相互作用を包含する細胞の相互作用を調節する方法を提供する。

好ましい態様において、本発明のヒトCTLA4レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をコードする完全なかつ正しいDNA 配列をPCRによりクローニングする。CTLA4の完全な予測されたコーディング配列を含有するcDNAを、下の実施例の中に詳細に記載されているように、H38RNAから増幅されたPCR 断片からアセンブリングし、そして発現ベクターCDM8の中に挿入した。単離物をCOS細胞の中にトランスフェクションし、そしてB7Ig、すなわち、Linsley ら、J. Exp. Med.173 : 721-730 (1991) 記載されているように、B7の細胞外ドメインおよびヒト免疫グロブリン(Ig)Cγ1領域に相当するアミノ酸配列を有する可溶性融合タンパク質の結合について試験した。

次いで、OMCTLA4と表示する1つの単離物のDNA 配列を決定し、そしてN末端においてオンコスタインMからのシグナルペプチドに融合した、予測されたヒトCTLA4配列に正確に相当することが発見された。CTLA4レセプターは187アミノ酸(シグナルペプチドおよび停止コドンを除外する)によりコードされ、そしてアミノ酸位置109-111 に新しく同定されたN連鎖グリコシル化部位を含む(下の第3図を参照)。オンコスタチインMのシグナルペプチドを使用して、CTLA4レセプターを発現させる。

他の好ましい態様において、CTLA4の細胞外ドメインに相当する第1アミノ酸配列およびヒトIgCγ1ドメインに相当する第2アミノ酸配列を有する融合タンパク質を使用して、CTLA4レセプター遺伝子(CTLA4Ig)のタンパク質生産物の可溶性の形態を調製する。ここに記載するcDNA配列に基づくヒトCTLA4レセプターに相当するアミノ酸配列の部分をコードするcDNAを含有するクローニングおよび発現のプラスミド(CDM8およびπLN)を構成し、ここでCTLA4レセプター遺伝子の細胞外ドメインの断片に相当する第1アミノ酸配列をコードするcDNAを、発現されたCTLA4タンパク質の可溶性の変更によりCTLA4レセプター遺伝子の発現を可能とするIgC領域に相当する第2アミノ酸配列をコードするDNA に接合する。

こうして、可溶性CTLA4Ig融合タンパク質は第1アミノ酸配列によりコードされ、この第1アミノ酸配列はヒトIgのCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸残基を含有する第2アミノ酸配列に接合したCTLA4の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置1〜約125 のアミノ酸残基を含有する。融合タンパク質は好ましくは2量体の形態で生産される。次いでこの構成体をCOSまたはCHO細胞の中にトランスフェクションし、そしてCTLA4Igを精製しそして2量体として同定した。

CTLA4Ig融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA は、ブダベスト条約の規定に従いアメリカン・タイプ・カルチャーコレクション(American Type Culture Collcction)(ATCC)(米国マリイランドロックビレ)に1991年5月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号68629 を与えられた。本発明は、可溶性融合タンパク質の形態でCTLA4転写体の第1タンパク質生産物を提供する。CTLA4タンパク質はほぼ50,000サブユニットのMr のジサルファイド連鎖の2量体を形成し、天然のCTLA4がT細胞表面上にジサルファイド連鎖ホモ2量体として多分存在することを示す。

B7抗原はT細胞上のCD28レセプターのためのリガンドであることが示された(Linsley ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、前掲)。CTLA4レセプター分子はCD28レセプターに機能的にかつ構造的に関係すると思われる;両者はB細胞活性化抗原のためのレセプターであるが、CTLA4は、リンパ系付着系についてこれまで報告された最高のもの中で、B7に対するより高い親和性を有するように思われる。しかしながら、CTLA4IgはCD28IgよりB7陽性(B7+ ) 細胞系にいっそう強く結合することが示された。他の実験において、CTLA4はB7抗原に対してCD28レセプターより高い親和性のレセプターであることが証明された。さらに、CTLA4IgはB7抗原に大きさが類似するリンパ芽球球細胞上の単一のタンパク質に結合することが示された。CTLA4IgはT細胞増殖を阻止し、そしてTh 誘発IgM生産を阻止した。

他の好ましい態様において、異なるレセプタータンパク質の断片に相当するアミノ酸配列を有するハイブリッド融合タンパク質を構成した。例えば、CD28およびCTLA4の細胞外ドメインの選択した断片に相当するアミノ酸配列を連鎖して、CD28Ig/CTLA4Igハイブリッド融合タンパク質を形成した。こうして、第1アミノ酸配列を有するCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質が得られ、この第1アミノ酸配列はCTLA4Igの細胞外ドメインの断片に相当する第2アミノ酸配列およびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列に接合した、CD28の細胞外ドメインの断片に相当するアミノ酸残基を含有する。

ハイブリッド融合タンパク質の1つの態様は第1アミノ酸配列を有するCD28Ig/CTLA4Ig融合構成体であり、この第1アミノ酸配列はCD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置1〜約位置94のアミノ酸残基を含有し、CD28はCTLA4の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置94〜約位置125 のアミノ酸残基を含有する第2アミノ酸配列に接合し、CTLA4はヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列に接合している。

CTLA4レセプタータンパク質、可溶性融合タンパク質およびハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA 配列をクローニングしそして発現する技術、例えば、オリゴヌクレオチドの合成、PCR、細胞の形質転換ベクターの構成、発現系などはこの分野においてよく確立されており、そしてほとんどの熟練者は特定の条件および手順のための標準的源材料をよく知っている。しかしながら、必要に応じて便利および変更の注釈のために次の節を準備し、そしてこれらの節はカイドラインの役Hをするであろう。

レセプターおよび融合タンパク質のためのコーディング配列のクローニングおよび発現
本発明のCTLA4Igを特性決定しかつCD28Ig/CTLA4Ig融合ハイブリッドを調製するためのCD28IgCγ1およびB7IgCγ1に相当する融合タンパク質の構成体を、Linsley ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991)(これを引用によって加える)に記載されているように調製した。あるいは、B7抗原およびCD28レセプターを発現する細胞から、これらのタンパク質について発表された知識(AruffoおよびSccd、およびFreeman 、前掲)に基づいて標準的手順を使用して、cDNAクローンを調製することができる。

CTLA4の細胞外ドメインおよびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するに相当するアミノ酸配列をコードするDNA から成るCTLA4Ig融合体を、PCR断片の結合により構成した。アミノ酸をコードするcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR 」)技術に従い増幅する(米国特許第4,683,195 号および米国特許第4,683,202 号(Mullisら)、およびMullisおよびFaloona, McthodsEnzymol. 154 : 335-350 (1987) を参照のこと)。CTLA4Ig融合ポリペプチドを構成し、これらのポリペプチドはCTLA4の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置1〜約位置125 のアミノ酸残基を含有するアミノ酸配列をコードするDNA 、およびIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA を有した。

トリンパ系細胞の中のCTLA4レセプタータンパク質の発現は従来報告されてきていないので、CTLA4のmRNA源を探すことが必要であった。いくつかのヒト白血病細胞系の全体の細胞のRNA から作ったPCRのcDNAを、プライマーとして、CTLA4遺伝子の発表された配列かのオリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングした(Dariavach ら、前掲)。試験したcDNAのうちで、H38 細胞(HTLV II関連白血病系統)は期待したサイズを有するPCR生産物の最良の収量を提供した。

CTLA4の単一のペプチドはCTLA4遺伝子の中で同定されなかったので、CTLA4の予測された配列のN末端をオンコスタチインMのシグナルペプチド(Malik ら、Molec. and Cell. Biol. 9 : 2847 (1989))に、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドを使用して融合した。PCR反応の生産物を、IgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸配列をコードするcDNAを使用して、発現ベクター、例えば、CDM8またはπLNの中に結合した。

全長のヒトCTLA4をコードするDNA を得るために、CTLA4のトランスメンブレンおよび細胞質ドメインをコードするcDNAをH38細胞からPCRにより構成し、そしてCTLA4のN末端に融合したオンコスタチインMシグナルペプチドをコードする、前述したように構成した、CTLA4Igからの断片と、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して接合した。PCR 断片をプラスミドCDM8の中に結合して、全長のCTLA4をコードする発現プラスミドを生成し、そしてこれをOMCTLA4と表示した。

ハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA を構成するために、1つのレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDNA を、他のレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDNA 、およびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA に、B7Ig、CD28IgおよびCTLA4Ig構成体について前述した手順を使用して接合する。こうして、例えば、CD28レセプターの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約1位置〜約94位置のアミノ酸残基をコードするDNA を、CTLA4レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸配列の約位置94〜約位置125 のアミノ酸残基をコードするDNA 、およびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA に接合する。

大量のクローニングしたDNA を生産するために、本発明の融合構成体をコードするDNA を含有するベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌細胞系の大腸菌(E.coli)MC1061/p3株(Invitrogen Corp. 、カリフォルニアサンディエゴ)の中に標準的手順を使用して形質転換し、そしてコロニーを適当なプラスミドについてスクリーニングする。

次いで、前述したようにして得られた融合構成体をコードするDNA を含有するクローンを、発現のために適当な宿主細胞の中にトランスフェクションする。使用する宿主細胞に依存して、このような細胞に適当な標準的技術を使用してトランスフェクションを実施する。例えば、哺乳動物細胞中のトランスフェクションは、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、CaPO4共沈リポフェクション(lipofection)、エレクトロレイションまたは原形質体の融合、および他のこの分野において知られている方法により達成し、ここで後者の方法は次のものを包含する:リゾチームの融合または赤血球の融合、スクレイピング、直接的吸収、浸透圧またはスクロースショック、直接的マイクロインジェクション間接的マイクロインジェクション、例えば、赤血球仲介技術を介するマイクロインジェクション、および/または宿主細胞を電流暴露する。遺伝的情報を細胞の中に導入する他の手順は疑いなく開発されるであろうから、上に列挙したトランスフェクションの技術は網羅的であるお考えられない。

多細胞生物から誘導化された真核生物の宿主細胞の培養物の中の発現は好ましい(Tissure Cultures, Academic Press, CruzおよびPatterson 編、(1973)を参照のこと)。これらの系はイントロンスプライスする能力をもつという追加の利点を有し、こうしてゲノム断片の発現に直接使用することができる。有用な宿主細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、サル腎臓(COS)細胞、VERO細胞およびHeLa細胞を包含する。本発明において、融合構成体を安定に発現する細胞系は好ましい。

このような細胞のための発現ベクターは、通常、哺乳動物細胞と適合性プロモーターおよびコントロール配列、例えば、CMV プロモーター(CDM8ベクター)および鳥類肉腫ウイルス(ASV)(πLNベクター)を包含する。他の普通に使用される前期および後期のプロモーターは、サルのウイルス40(SV40)(Fiersら、Nature 273 : 113 (1973)) 、または他のウイルスのプロモーター、例えば、ポリオーマから誘導化されたもの、アデノウイルス2、およびウシ乳頭腫ウイルスを包含する。

コントロール可能なプロモーター、hMTII(Karin ら、Nature 299 : 797-802(1982))をまた使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系の形質転換についての一般的面は、Axel(米国特許第4,399,216 号、1983年8月16日発行)により記載された。現在明らかなように、「エンハンサー」領域は発現を最適化するとき重要である;これらは、一般に、非コーディング領域の中のプロモーター領域の上流または下流に見いだされる配列である。必要に応じて、複製の由来ウイルス源から得ることができる。しかしがら、染色体中の組み込みは真核生物におけるDNA の複製のための普通のメカニズムである。

融合構成体の発現のために好ましい真核生物の細胞、例えば、COS またはCHO細胞を包含するが、他の真核生物の微生物を使用できる。サッカロミセスセレビシアエ(Saccharomyces ccrevisiae)、イースト実験室用菌株をたいてい使用するが、他の菌株、例えば、シゾサッカロミセス・ポンペ(Schizosaccharomyces pombe)を使用できる。例えば、Broach, McthodsEnzymol. 101 : 307 (1983) の2μの複製由来、または他の酵母適合性の複製由来(例えば、Stinchcombら、Nature 282 : 39 (1979)) ; Tschempeら、Gene 10 : 157 (1980) ;およびClarkeら、Methods Enzymol. 101 : 300 (1983)を参照のこと)を用いるベクターを使用することができる。

酵母のベクターのためのコントロール配列は、グリコール分解酵母の合成のためのプロモーターを包含する(Hessら、J. Adv. Enzyme Reg. 7 : 149 (1968) ;Hollandら、Biochcmistry. 17 : 4900 (1978)) 。この分野において知られている追加のプロモーターは、CDM8ベクターの中に提供されたCMV プロモーター(ToyamaおよびOkayama, FEBS268 : 217-221 (1990) ;3−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター(Hitzemanら、J. Biol. Chem. 255 : 2073)) 、および他のグリコール分解酵素のためのプロモーターを包含する。

成長条件によりコントロールされる転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC酸性ホスファターゼ窒素の代謝に関連する分解酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関係する酵素のためのプロモーター領域である。また、ターミネーター配列はコーディング配列の3′末端において望ましいと信じられる。このようなターミネーターは、酵母誘導化遺伝子の次の3′−非翻訳領域の中に見いだされる。

あるいは、原核生物の細胞を発現のための宿主として使用することができる。原核生物の細胞は、大腸菌(E.coli)の種々の株により最も頻繁に発現される;しかしながら、他の微生物の菌株も使用できる。ここにおいて転写開始のためのプロモーターを、必要に応じてオペレーターとともに含むと定義される、普通に使用される原核生物のコントロール配列は、リボソーム結合部位の配列と一緒に、ベータラクタマーゼペニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プロモーター系(Chang ら、Nature 198 : 1056 (1977)) 、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel ら、核酸の研究(Nucleic AcidsRes. 8 : 4057 (1980)) およびラムダ誘導化Pl プロモーターおよびN−遺伝子リボソーム結合部位(Shimatake ら、Nature 292 : 128 (1981))のような普通に使用されているプロモーターを包含する。

CD28IgおよびCTLA4Igタンパク質、および融合ハイリッドタンパク質、例えば、CD28Ig/CTLA4Igを後述するように種々の系の中で発現することができる。cDNAを適当な制限酵素切り出し、そしてこのような発現について適当な原核生物または真核生物の発現ベクターの中に結合することができる。CD28およびCTLA4レセプターのタンパク質は天然に2量体として存在するので、これらのタンパク質の首尾よい発現はこれらのタンパク質を2量体として形成することを可能とする発現系を必要とすると信じられる。これらのタンパク質の切頭バージョン(すなわち、タンパク質のトランスメンブレン領域より上流の位置において配列の中に停止コドンを導入することによって形成される)は発現されると思われない。CD28およびCTLA4レセプターの融合タンパク質としての発現は、これらのタンパク質の2量体の形成を可能とする。こうして、CTLA4タンパク質の融合生産物としての発現は、本発明において好ましい。

チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA4Ig−24と表示する本発明の安定なCHO 系はCTLA4Igの発現のために好ましく、そしてブダベスト条約の規定に従いATCCに1991年5月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号10762 を与えられた。本発明のCTLA4レセプターの発現は、細胞系、例えば、COS 細胞をトランスフェクションし、そしてCTLA4トランスフェクションした細胞をCTLA4レセプターに結合することによって、例えば、細胞のB7Ig融合タンパク質への結合について経験することによって、発現を検出して達成される。

生ずる構成体の配列は、既知の手順、例えば、Sangerら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74 : 5463 (1977) に記載されている、さらにMcssing ら、Nucleic AcidsRes. 9 : 309 (1981) に記載されている手順を使用するDNA の配列決定によるか、あるいはMaxam ら、Mcthods Enzymol. 65 : 499 (1980)の方法により確証される。

タンパク質生産物の回収
前述したように、CD28およびCTLA4レセプターの遺伝子は、切頭タンパク質をコードするDNA の直接の発現を使用して成熟タンパク質として容易に発現されない。ホモ2量体の形成を可能とするために、CD28およびCTLA4の細胞外ドメインに相当し、そしてシグナル配列、例えば、適当なプロセシングを行うことができる細胞中のオンコスタチインMの配列のためのコドンを含むアミノ酸配列をコードするDNA を、天然に2量体のタンパク質のFcドメインに相当するアミノ酸配列をコードするDNA と融合する。こうして、細胞から分泌された後のこれらの融合タンパク質の生産物の精製は、融合タンパク質の抗免疫グロブリン部分と反応性の抗体を使用して促進される。融合タンパク質の生産物は、培地の中に分泌されると、タンパク質の標準的精製技術、例えば、プロテインAカラムへの適用により回収される。

使 用
CTLA4Ig融合タンパク質および/またはその融合タンパク質の断片を使用してB7陽性細胞、例えば、B細胞と反応させて、B7抗原陽性細胞とのT細胞の相互作用により仲介される免疫応答を調節することができる。CTLA4Ig融合タンパク質およびCTLA4Ig/CD28Igハイブリッドタンパク質、および/またはこれらのタンパク質の断片および誘導体を、また、使用して、B7陽性細胞、例えば、B細胞と反応させて、T細胞依存性B細胞の応答により仲介される免疫応答を調節することができる。用語「断片」は、ここにおいて使用するとき、「CTLA4」と呼ぶタンパク質をコードするアミノ酸配列の部分を意味する。使用できるCTLA4Ig融合のタンパク質の断片は、ここに記載するCTLA4Ig融合タンパク質を得るために使用するCTLA4レセプターに相当するアミノ酸配列のある部分に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

活性化されたB細胞および他の系統の細胞上で発現されたB7抗原、およびT細胞上で発現されたCD28レセプターを互いに直接結合することができ、そしてこの相互作用は細胞−細胞の相互作用を仲介することができる。このような相互作用は、T細胞の増殖、および免疫グロブリン生産細胞へのB細胞の分化に導く、T細胞の中のCD28活性化経路を直接トリガーする。起こるB細胞の活性化は、B7抗原の発現を増加し、さらにCD28を刺激して、慢性の炎症の状態、例えば、自己免疫疾病異種移植拒絶移植片対宿主の疾患または慢性のアレルギー反応に導くことがある。この反応をブロックまたは阻止することは、T細胞のサイトカインの調製を防止し、こうして炎症反応を防止または逆転するとき有効であることがある。

CTLA4Igは、ここにおいて、T細胞およびB細胞の相互作用を必要とするin vitroリンパ球機能の効力のあるインヒビターであることが示された。これはB7抗原およびその対レセプター、CTLA4および/またはCD28の間の相互作用の重要性を示す。ネズミおよびヒトのCTLA4の細胞質ドメインは類似し(Dariavach ら、前掲、1988)、この領域が重要な機能的性質を有することを示唆する。また、CD28およびCTLA4の細胞質ドメインは相同性を共有する。

CTLA4は、抗BB1または抗CD28モノクローナル抗体よりも、いっそう効力のあるリンパ球の応答のin vitroインヒビターである。CTLA4Igは、その阻止作用と反作用するT細胞の増殖に対する直接の刺激作用をもたない。したがって、CTLA4Ig融合タンパク質は抗CD28モノクローナル抗体よりもすぐれたin vivo インヒビターとして働くことができる。CTLA4Igのin vitro免疫抑制作用は、異常なT細胞の活性化またはIgの生産を包含する自己免疫疾患の処置の治療におけるその使用を示唆する。

CTLA4Ig融合タンパク質は、in vivo 阻止性質を示すことが期待された。こうして、CTLA4Igは、同様なin vivo 条件下に抗CD28抗体について観察される作用に類似する方法で、T細胞を阻止する作用をすることが期待される。T細胞/B細胞の相互作用がT細胞とB細胞との間の接触の結果として起こる条件下に、B7抗原陽性細胞、例えば、B細胞と反応させために導入されたCTLA4Igの結合は、T細胞/B細胞の相互作用を妨害、すなわち、阻止して免疫応答の調節を生ずることができる。この独占的な阻止作用のために、CTLA4Igは生体内でT細胞の活性のインヒビターとして、非特異的インヒビター、例えば、シクロスポリンまたはグルコステロイドよりも有用であることが期待される。

1つの態様において、CTLA4Ig融合タンパク質またはCTLA4Ig/CD28Igハイブリッドタンパク質は、適当な製剤学的担体と組み合わせてin vivo 導入する、すなわち、病理学的状態、例えば、免疫系の疾患または癌の処置のためにヒトの投与することができる。融合タンパク質のin vivo 導入は、T細胞と他の細胞、例えば、B細胞との相互作用を、B7陽性細胞へのリガンドの結合の結果として、妨害することが期待される。正常のT細胞の相互作用の防止は、T細胞の活性を減少し、例えば、T細胞の増殖を減少することができる。

さらに、融合タンパク質のin vivo投与はサイトカインのin vivoレベルの調節して被検体において所望の作用を促進することが期待され、ここでサイトカインは次のものを包含するが、これらに限定されない:インターロイキン、例えば、インターロイキン(「IL」)−2,IL−3,IL−4,IL−6,IL−8,成長因子、例えば、腫瘍成長因子(「TFG 」)、コロニー刺激因子(「CSF」)、インターフェロン(「IFN」)および腫瘍壊死因子(「TNF 」)。例えば、融合タンパク質をin vivo 導入するとき、それは悪性の増殖、例えば、腫瘍細胞の増殖に寄与するサイトカインの生産をブロックすることができる。融合タンパク質は、また、T細胞の活性化に依存するウイルス、例えば、エイズを引き起こすウイルス、HTLV1の増殖をブロックすることができる。

ある環境下に、前述したように、CTLA4Ig融合タンパク質またはその断片のinvivo投与の作用は阻止であり、T細胞/B細胞の接触から生ずるCTLA4およびCD28のトリガーの融合タンパク質によるブロッキングから生ずる。例えば、CTLA4Igタンパク質はT細胞の増殖をブロックすることができる。こうして、CTLA4Ig融合タンパク質のin vivo 導入は、T細胞およびB細胞の両者が仲介する免疫応答に対する作用を生成するであろう。また、融合タンパク質をサイトカインまたは他の治療用試薬の導入と組み合わせて被検体に投与することができる。

本発明の追加の態様において、CTLA4Ig融合タンパク質またはCTLA4レセプターと反応性の誘導体を包含する他の試薬を使用してT細胞の相互作用を調節する。例えば、CTLA4レセプターと反応性の抗体および/または抗体断片をスクリーニングして、B7抗原へのCTLA4Ig融合タンパク質の広いスペクトルのを阻止することができるものを同定することができる。次いで、抗体または抗体断片、例えば、FabまたはF(ab′)2 断片を使用して、例えば、T細胞と反応させてT細胞の増殖を阻止することができる。

CTLA4レセプターと反応性のモノクローナル抗体は、既知の手順、例えば、KohlerおよびMilstein (KohlerおよびMilstein, Nature, 256 : 495-97 (1975))により導入された手順、およびその変更により生成して、細胞の相互作用を調節することができる。

これらの技術は、特定の抗体を生産するようにプライミングした動物の使用を包含する。動物は免疫原(例えば、B7Ig融合タンパク質、CTLA4Ig融合タンパク質またはCD28Ig/CTLA4Igハイブリッド融合タンパク質)の注入によりプライミングして、所望の免疫応答、すなわち、プライミングされた動物からの抗体の生産を引き出すことができる。また、プライミングされた動物は疾患を発現する動物である。

プライミングされた病気の動物のリンパ節脾臓または末梢血液から誘導化されたリンパ球を使用して、特定の抗体を探索することができる。所望の免疫グロブリンをコードするリンパ球の染色体を、一般に融合剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)の存在下に、リンパ球を骨髄腫細胞と融合することによって、永久分裂能化する。ある数の骨髄腫細胞系、例えば、P3−NS1/1−Ag4−1,P3−x63−Ag8,653, Sp2/0−Ag14、またはHLI-653骨髄腫系統の任意のものを、標準的技術に従い、融合相手として使用することができる。これらの骨髄腫系統はATCC(米国マリイランド州ロックビレ)から入手可能である。

次いで、所望のハイブリドーマを包含する生ずる細胞を選択培地、例えば、HAT培地の中で成長させ、ここで未融合の親の骨髄腫またはリンパ球の細胞は究極的に死亡する。ハイブリドーマ細胞のみは生き残り、そして制限希釈の条件下に成長して単離されたクローンを得ることができる。ハイブリドーマの上澄み液を、例えば、免疫化に使用したCTLA4Igタンパク質を使用するイムノアッセイ技術により、所望の選択性の存在についてスクリーニングする。次いで、陽性のクローンを制限希釈の条件下にサブクローニングし、そして生成したモノクローナル抗体を単離することができる。

モノクローナル抗体の単離および精製の種々の普通の方法を使用して、他のタンパク質および汚染物質を含有しない抗体を得ることがてきる。モノクローナル抗体を精製する普通に使用されている方法は、硫酸アンモニウム沈澱イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーを包含する(Zolaら、Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, Hurell編、p. 51-52 (CRCPress, 1982 を参照のこと)。これらの方法に従い生産されたハイブリドーマは、この分野において知られている技術を使用してin vitroまたはin vivo (腹水の中で)増殖することができる(一般に、Finkら、Prog. Clin. Pathol., 9 : 121-33 (1984), Fig. 6-1, p. 123 を参照のこと)。

一般に、個々の細胞系を、例えば、実験室用容器の中でin vivo 増殖させ、そして高い濃度の単一の特定のモノクローナル抗体を含有する培地をデカンテーション濾過または遠心により収穫することができる。さらに、CTLA4レセプターの細胞外ドメインと反応性の活性結合領域を含有するこれらの抗体の断片、例えば、Fab,F(ab′)2 およびFv断片を生成することができる。このような断片は、この分野においてよく確立された技術を使用して生成することができる(例えば、Rousseaux ら、MethodsEnzymol. 121 : 663-69, Academic Press (1986) を参照のこと)。

前述したようにして調製した抗B7モノクローナル抗体を使用してB7抗原に結合させて、CD28陽性またはCTLA4陽性のT細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することができる。抗CTLA4モノクローナル抗体を使用してCTLA4レセプターと結合させて、CTLA4陽性T細胞と他の細胞との相互作用を阻止することができる。他の態様において、CTLA4Ig融合タンパク質を使用して、CTLA4とB7抗原との間の相互作用を調節できる追加の化合物を同定することができる。このような化合物は、B細胞および/またはT細胞と反応させるために使用できる天然に見いだされる小さい分子を包含することができる。例えば、発酵ブロスをCTLA4/B7の相互作用を阻止する能力について試験することができる。

さらに、前述のCTLA4Ig融合タンパク質の誘導体を使用してT細胞の増殖を調節することができる。例えば、断片または誘導体を使用して、異種移植の骨髄移植に伴う移植片対宿主(GVH)の疾患におけるT細胞の増殖をブロックすることができる。CD28仲介T細胞増殖経路は、CD3/T細胞のレセプター複合体により与えれる増殖(Juneら、1987、前掲)と対照的に、シクロスポリン耐性である。シクロスポリンはGVH 疾患のための処置として比較的無効である(Storb, Blood68 : 119-125 (1986)) 。GVH 疾患は、CD28抗原を発現するTリンパ球により仲介されると考えられる(Storb およびThomas, Immunol. Rev. 88:215-238 (1985)) 。こうして、CTLA4Ig融合タンパク質は、単独で、あるいは免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンと組み合わせて、GVH 疾患におけるT細胞の増殖のブロッキングに有用であることができる。

こうして、B細胞を包含するB7陽性細胞とのCTLA4陽性T細胞の相互作用の本発明の方法による調節を使用して、病理学的状態、例えば、自己免疫性、移植、感染症および新形成を処置することができる。次の実施例によって、本発明をさらに説明しかつ当業者による本発明の実施および使用を助ける。これらの実施例は本発明を限定しない。

例 1
B7Ig及びCD28Ig融合タンパク質の調製
レセプター−免疫グロブリンCγ(IgCγ)融合タンパク質B7Ig及びCD28Igを、本発明において引用により組込まれる、Linsley など., J. Exp. Med. 173 :721 〜730 (1991)により記載されているようにして調製した。簡単に言えば、それぞれのレセプタータンパク質(たとえばB7)に対応するアミノ酸配列をコードするDNA を、ヒトIgCγ1のヒンジ、CH2及びCH3領域に対応するアミノ酸配列をコードするDNA に連結した。これは次のようにして達成される。

ポリメラーゼ鎖反応(PCR)。PCR のために、DNAフラグメントを、個々の融合タンパク質について下記のようにしてプライマー対を用いて増幅した。PCR 反応(0.mlの最終体積)を、Tag ポリメラーゼ緩衝液(Stratagene, La Jolla, CA)において行ない、ここで前記緩衝液は、個々のdNTP20μモル;前記に示されたプライマー50〜100 pモル;鋳型(引用により本明細書において組込まれる、Kauasaki, PCR Protocols, Academic Press, 21 〜27ページ(1990)により記載されるようにして、ランダムヘキサマープライマーを用いて合計≦1μgのRNA から合成されたプラスミド又はcDNA1ng);及びTag ポリメラーゼ(Stratagene)を含んだ。反応は、16〜30回のサイクル(典型的なサイクルは、94℃で1分、50℃で1〜2分及び72℃で1〜3分の段階から成る)のためにサーモサイクラー(Perkin Elmer Corp. Norwalk, CT) 上で行なわれた。

プラスミドの構成。Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573 (1987)により記載されるような、CD28をコードするcDNAを含む発現プラスミドが、Drs. Aruffo and Seed (Mass General Hospital Boston, MA)により供給された。Aruffo, Cell 61 : 1303(1990)により記載されるような、CD5をコードするcDNAを含むプラスミドがDr. Aruffoにより供給された。Freeman など.,J.Immunol. 143 : 2714 (1989) により記載されるような、B7をコードするcDNAを含むプラスミドは、Dr. Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA)により供給された。

CD28及びB7の可溶性形の発現での初期試みのために、構成体をLinsley など.,J. Exp. Med.,前記により記載されているようにして製造し(OMCD28及びOMB7)、ここで停止コドンがトランスメンブランドメインの上流に導入され、そして生来のシグナルペプチドがオンコスタチインM(oncostatin M)(Malik など., Mol. Cell Biol. 9 : 2847 (1989)) からのシグナルペプチドにより置換された。それらは、再構成のための合成オリゴヌクレオチド(OMCD28)を用いて又はPCRのためのプライマー(OMB7)として製造された。OMCD28は、シグナルペプチドをオンコスタチインMからの類似領域により置換することによってより効果的な発現のために変性されたCD28cDNAである。CD28Ig及びB7Ig融合構成体を2つに分けて製造した。

5′部分を、鋳型としてOMCD28及びOMB7及び前方プライマーとしてオリゴヌクレオチド、
CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC
(配列番号1)(オンコスタチインMシグナルペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする)及び逆方向プライマーとして
TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA (配列番号2)
又は、TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT (配列番号3)
のいづれかをそれぞれ用いて製造した。PCR反応の生成物を、PCR プライマーに導入される部位として制限エンドヌクレアーゼ(HindIII 及びBcl I)により切断し、そしてゲル精製した。

ヒトIgCγ1配列に対応する融合構成体の3′部分を、鋳型として、ヒト−マウスキメラmAB L6を生成する骨髄細胞系(Dr. P. Fell and M. Gayle, Bristol-Myers Squibb Conyany, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA により供給される)からのRNA を用いて、連結された逆転写酵素(トリ骨髄ウィルスからの;Life Sciences Associates, Bayport, NY)-PCR反応により製造した。

オリゴペプチド、すなわちAAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG(配列番号4)を前方プライマー及びCTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (配列番号5)を逆方向プライマーとして使用した。反応生成物をBal I及びXba Iにより切断し、そしてゲル精製した。最終生成物を、IgCγ1配列を含む、Bcl I/Xba I切断されたフラグメントと共に、CD28又はB7配列を含む、HindIII /Bcl I切断されたフラグメントを、HindIII /Xba I切断されたCD28中に連結することによってアセンブリーした。連結生成物を用いてMC1061/p3 E.コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドのためにスクーンした。得られた構成体の配列を、DNA配列決定により確認した。

B7をコードする構成体は、B7の細胞外ドメインの約1位〜約215 位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNを含んだ。CD28をコードする構成体は、CD28の細胞外ドメインの約1位〜約134 位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNA を含んだ。

CD5Igを、前方プライマーとしてCATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (配列番号6)及び逆方向プライマーとしてATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC (配列番号7)を用いて、同じ態様で構成した。PCR生成物を制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして上記のようにしてIgCγ1フラグメントにより連結した。得られた構成体(CD5Ig)は、CD5に対応する配列の1位〜347 位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する成熟タンパク質、前記構成工程により導入された2つのアミノ酸(アミノ酸DQ)、次にIgCγ1領域に対応するアミノ酸をコードするDNA をコードした。

細胞培養及びトランスフェクション。COS(モンキー腎細胞)を、引用により本発明に組込まれる、Seed and Aruffo (Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 3365 (1987))の方法の変法を用いて、CD28及びB7を発現する発現プラスミドによりトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクトする18〜24時間前、10cmの直径の培養皿当たり106 個で接種した。プラスミドDNA を、0.1mMのクロロキン(cloroquine) 及び600 μg/mlのDEAEDextranを含む血清フリーDMEM5mlに添加し(約15μg/皿)、そして細胞を37℃で3〜3.5時間インキュベートした。

次に、トランスフェクトされた細胞をすぐに、PBS中、10%ジメチルスルホキシドにより処理し(約2分)、そして10%FCSを含むDMEMにおいて37℃で16〜24時間インキュベートした。トランスフェクションの24時間後、培養培地を除去し、そして血清フリーDMEMにより変換した(6ml/皿)。インキュベーションを37℃で3時間続け、この時点で、古い培地を集め、そして新鮮血清フリー培地を添加した。37℃でさらに3日後、古い培地を再び集め、そして細胞を捨てた。

CD28,CD5又はB7を発現するCHO細胞を、次の通りに、Linsley など., (1991) 前記により記載されるようにして単離した:簡単に言及すれば、CD28,CD5又はB7を発現する安定したトランスフェクタントを、適切な発現プラスミド及び選択マーカー、pSV2dhfr(Linsleyなど., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 87 : 5031(1990))の混合物によるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣(dhfr- CHO)細胞の同時トランスフェクションの後次に、トランスフェクトを、1μMの最終レベルまでメトトレキヤートの徐々に高まる濃度で増殖し、そして10%ウシ胎児血清(FBS)、0.2mMのプロリン及び1μMのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持した。

高レベルのCD28(CD28+ CHO)又はB7(B7+ CHO)を発現するCHO 系を、mAbs9.3又はBB−1による間接的な免疫染色に従って、複数回の螢光活性化細胞ソーチングFACS(R))により単離した。CD28又はB7の表面発現のために陰性の増幅されたCHO細胞をまた、CD28−トランスフェクトされた集団からFACS(R)により単離した。

免疫染色及びFACS(R)分析。トランスフェクトされたCHO 又はCOS細胞又は活性化されたT細胞を、間接的免疫染色法により分析した。染色の前、CHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBSにおけるインキュベーションによりそれらの培養器から除去した。細胞をまず、ネズミmAbs9.3(Hansenなど., Immunogenetics 10 :247 (1980))又はBB−1(Yokochi など., J. Immunol. 128 : 823 (1981))と共に、又はIg融合タンパク質(10%のFCSを含むDMEMにおいて10μg/mlで)と共に4℃で1〜2時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、そしてさらに05〜2時間、4℃で、FITC−接合の第2段階試薬(ネズミmAbsのためにヤギ抗−マウスIg血清又は融合タンパク質のためにヤギ抗−ヒトIgCγ血清(Tago, Inc.,Burlingama, CA))と共にインキュベートした。螢光を、40対数増幅器(four decade logarithmic amplifier) を備えたFACS IV(R)細胞ソーター(Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA )上で分析した。

Ig融合タンパク質の精製。トランスフェクトされたCOS細胞からの古い血清フリー培養培地の第1,第2及び第3回収集物を、Ig融合タンパク質の精製のための源として使用した。高速遠心分離により細胞残物を除去した後、培地を、0.05Mのクエン酸ナトリウム溶液(pH8.0)により平衡化された、固定されたプロテインA(Repligen Corp., Cambridge, MA)のカラム(約200 〜400 mlの培地/ml充填層体積)に適用した。その培地の適用の後、カラムを1μのリン酸カリウム溶液(pH8)により洗浄し、そして結合されたタンパク質を0.05Mのクエン酸ナトリウム溶液(pH3)により溶出した。

画分を集め、そしてすぐに、2Mのトリス(pH8)1/10体積の添加により中和した。A280吸収材料ピークを含む画分をプールし、そして使用の前、PBSに対して透析した。それぞれCD28Ig及びB7Igのための吸光係数は、既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により2.4及び2.8nl/mgであった。精製されたCD28Ig及びB7Ig結合活性回収率は、B7+ 及びCD28+ CHO細胞の間接的な螢光染色の後、FACS(R)分析により判断される場合、ほぼ定量的であった。

例 2
CTLA4Ig融合タンパク質の調製
CTLA4の細胞外ドメインとIgCγ1ドメインとの間にCTLA4Igをコードする可溶性遺伝子融合体を、CD28Ig構成体についての上記方法に類似する方法で構成した。CTLA4遺伝子の細胞外ドメインを、公開された配列(Dariarach など., Eur. Jour. Immunol. 18 : 1901〜1905 (1988))に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRによりクローン化した。

CTLA4のためのシグナルペプチドはCTLA4遺伝子において同定されていないので、CTLA4の示された配列のN−末端を、オーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて2段階で、オンコスタチインM(Melik など., Mol. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989))のシグナルペプチドに融合せしめた。第1段階に関しては、オリゴヌクレオチド、CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC (配列番号8)(CTLA4のN末端側の7個のアミノ酸に融合されるコンスタチンMシグナルペプチドからのC末端側の15個のアミノ酸をコードする)を、前方プライマーとして、及びTTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (配列番号9)(Bcl I制限酵素部位を含み、そしてCTLA4レセプターをコードするアミノ酸配列のアミノ酸残基119 〜125 をコードする)を逆方向プライマーとして使用した。

この段階のための鋳型は、H38細胞(Drs. Salahudin and Gallo,NCI, Bethesda, MDにより供給されるHTLVII感染性T細胞白血球細胞系)からの合計1μgのRNA から合成されたcDNAであった。第1段階からのPCR生成物の一部を、オンコスタチインMシグナルペプチドのN末端部分をコードし、そしてHindIII制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオーバーラップ前方プライマー、CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC(配列番号10)及び同じ逆方向プライマーを用いて再増幅した。PCR 反応の生成物をHindIII 及びBcl Iにより消化し、そしてBcl I/Xha Iにより切断された、IgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に対応するアミノ酸配列をコードするcDNAフラグメントと共に、HindIII /Xha I切断された発現ベクター、CDM8又はHindIII /XbaI切断された発現ベクター、πLN(Dr. Aruffoにより供給される)中に連結した。

得られたCTLA4Ig融合構成体の地図は図1に示される。その図に示される配列は、CTLA4(上方の文字、黒くない部分)とコンスタチンMのシグナルペプチドSP(黒い部分)及びIgCγ1のヒンジH(点描模様の部分)との間の連結を示す。括弧内のアミノ酸は、構成の間に導入された。星印(★)は、IgCγヒンジ領域に導入されたシステインセリン変異を示す。CTLA4に存在する免疫グロブリンスーパーファミリーV−株ドメインは、IgCγ1のCH2及びCH3ドメインであるように示される。

次に、CTLA4Igを含む発現プラスミド、CDM8を、Seed and Aruffo, 1987, 前記により記載される方法の変法(Linsley など., 1991,前記)により、DEAE/テキストラントランスフェクションを用いてCOS細胞中にトランスフェクトした。CTLA4Igのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む発現プラスミド構成体(πLN又はCDM8)を、標準方法を用いてのリポフェクションによりdhfr- CHO 系中にトランスフェクトし、CTLA4Igを安定して発現する新規細胞系を得た。CTLA4Igに対応するアミノ酸配列をコードするDNA は、1991年5月31日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そしてATCC受託番号68629 を得た。

チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA4Ig−24と称する、CTLA4Igを発現する好ましい安定性のトランスフェクタントを、免疫染色法を用いて、培地におけるB7結合活性についてB7陽性CHO 細胞系をスクリーンすることによって製造した。トランスフェクタントは、10%ウシ胎児血清(FBS)、0.2mMのプロリン及び1μMのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持された。CTLA4Ig−24CHO 細胞系は、1991年5月31日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そしてATCC受託番号10762 を得た。

CTLA4Igを、血清フリーに条件付けられた上清液からプロテインAクロマトグラフィー処理により精製した(図2)。CTLA4Igの濃度を、280 nmで1.6の吸光係数(既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により実験的に決定された)を仮定して、決定した。CTLA4Igのサンプル(1μg)(レーン2及び4)及び分子量標準(レーン1及び3、図2)を、非還元条件(−βME、レーン1及び2)又は還元条件(+βME、レーン3及び4)下でSDS-PAGE(4〜12%のアクリルアミドグラジエント)にゆだねた。タンパク質は、クーマシーブリリアドブルーによる染色により可視化された。

非還元条件下で、CTLA4IgはMrが約100,000 である種として移動し、そして還元条件下でそれは、Mrが約50,000である種として移動した(図2)。IgCγヒンジのジスルフィドが構成の間に排除されたので、CD28IgのようなCTLA4Igは、生来のジスルフィド結合を通してたぶん連結されたダイマーである。

例 3
CTLA4レセプター
十分な長さのヒトCTLA4遺伝子に対応するアミノ酸をコードするDNA を再構成するために、CTLA4のトランスメンブラン及び細胞質ドメインのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAを、PCRによりクローン化し、そして次に、CTLA4のN−末端に融合されるオンコスタチンMシグナルペプチドに対応する、CTLA4Igからのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAにより連結した。PCR のための方法、及び細胞培養及びトランスフェクションは、COS細胞及びDEAE−デキストラントランスフェクションを用いて、例1に記載されている通りであった。

ヒトリンパ球細胞におけるCTLA4レセプタータンパク質の発現はこれまで報告されていないので、CTLA4mRNAの源を示す必要はなかった。上記に示されるような、H38 細胞の全体の細胞RNA から逆転写されるPCRcDNAを、PCR によるクローニングのために使用した。この目的のためには、オリゴヌクレオチド、GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (配列番号11)(推定されるコード配列に初めの11個のアミノ酸をコードする)を、前方プライマーとして及び逆方向プライマーとして、TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (配列番号12)CTLA4における最後の8個のアミノ酸に相同であり、且つXba I部位を含む)を使用した。

鋳型は再び、H38細胞からの1μgのRNA から合成されたcDNAであった。PCR反応の生成物を制限エンドヌクレアーゼNco I及びXba Iにより切断し、そして得られた316 bpの生成物をゲル精製した。上記CTLAIg融合からの340 bpのHindIII /Nco Iフラグメントをまたゲル精製し、そして両制限フラグメントを、HindIII /Xba I切断されたCDM8中に連結し、OMCTLAを形成した。

得られる構成体は、完全な長さのCTLA4(配列番号13及び14)及びオンコスタチンMシグナルペプチドに対応した。その構成体は図3に示され、そしてOMCTLA4と称した。図3に示されるCTLA4のための配列は、示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置111 でのこれまで達告されたアラニントレオニンをコードするような塩基変化により、推定されるヒトCTLA4DNA 配列(Dariavach など.,前記)とは異なる。このトレオニンは、融合タンパク質の好結果をもたらす発現のために重要である、新しく同定されたN−連結グリコシル化部位の一部である。連結生成物を用いて、MC1061/p3 E.コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドについてスクリーンした。得られる構成体の配列を、DNA配列分析により確かめた。

例 4
CTLA4Igの特徴化
CTLA4Ig構成体を特徴づけるために、いくつかの単離体、CD28Ig,B7Ig及びCD5Igを上記のようにして調製し、そして例2及び3に記載されるようにしてCOS細胞をトランスフェクトし、そしてB7Igの結合のためにFACS(R)分析により試験した。上記構成体の他に、Aruffo and Seed (EMBO Jour. 6 : 3313〜3316 (198)) により記載されるようなCD7をコードするcDNAを含むCDM8プラスミドをまた使用した。

mAbs.ネズミモノクローナル抗体(mAba)9.3(抗−CD28)及びG19-4(抗−CD3)、G3−7(抗−CD7),BB−1(抗−B7抗原)及びラットmAb 187.1(抗−マウスK鎖)はこれまで記載されており(Ledbetter など., Pruc. Natl. Acad.Sci. 84 : 1384 〜1388 (1987) ; Ledbetter など., Bloud 75 : 1531 (1990); Yokochi など.,前記)、そして使用の前、腹水から精製した。mAb OKT8を生成するハイブリドーマをATCC, Rockville, MD から得、そしてmAb をまた、使用の前、腹水から精製した。mAb 4G9(抗−CD19)は、Dr. E. Engleman (StanfurdUninersity, Palo Altu, (A)により提供された。精製されたヒト−マウスキメラmAb L6(ヒトCγ1Fc部分を有する)は、Dr. P. Fell and M. Gayle (Bristal-Myers Squibb Pharmacentical Research Institute, Seattle, WA) の贈与である。

免疫染色及びFACS(R)分析。染色の前、COS 又はCHO細胞を、10mMのEDTAを含むPBSにおいてインキュベートすることによってそれらの培養容器から除去した。細胞をまず、mAbs又はIg融合タンパク質と共に、10%FBSを含むDMEMにおいて10μg/mlで4℃で1〜2時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、そしてFITC−接合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン又はFITC−接合ヤギ抗−ヒトIgCγ血清(両者とも、Tago, Burlingam, CA からである)と共に、4℃でさらに0.5〜2時間インキュベートした。両mAbs及びIg融合タンパク質の結合が同じ実験において測定される場合、FITC−接合抗−マウス及び抗−ヒト第2段階試薬を、使用の前、一緒に混合した。合計10,000個の細胞に基づく螢光を次に、FACS(R)により分析した。

末梢血液リンパ球分離及び刺激。末梢血液リンパ球(PBLs)を、リンパ球分離媒体(Litton Bionetics, Kensington, MD) を通しての遠心分離により単離した。アロ反応性T細胞を、一次混合リンパ球反応(MLR)におけるPBL の刺激により単離した。PBL を、106 /mlの照射された(5000ラド)T51 LCL で培養した。EBV-形質転換リンパ球芽細胞系(LCL),PM(Bristol-Myers Squibb Co.) 及びT51(Bristol-Myers Squibb Co.)を、10%FBSにより補充されたRPMIに維持した。6日後、アロ反応性“幼芽”細胞を凍結保存した。

二次MLR を、mAbs及びIg融合タンパク質の存在及び不在下で、新鮮な照射T51LCL と共に融解されたアロ反応性幼芽を培養することによって行なった。細胞を、10%FBSを含むRPMIを有する96ウェル平底プレート(0.2mlの体積、4×104個のアロ反応性幼芽及び1×104 個の照射T51 LCL 細胞/ウェル)において培養した。四重培養物の細胞増殖を、2〜3日の培養の最後の6時間、〔 3H〕−チミジンの摂取により測定した。

PHA-活性化されたT細胞を、1μg/mlのPHA (Wellcome, Charlotte,NC)と共にPBLを5日間、培養することによって、及びPHA を欠く培地において1日間、培養することによって調製した。生存細胞を、使用の前、リンパ球分離媒体を通しての沈殿により集めた。細胞をmAbsにより刺激し、又はCHO 細胞により37℃で4〜6時間トランスフェクトせしめ、遠心分離により集め、そしてRNA を調製するために使用した。

CD4+ T細胞を、健康なドナーからのPBLを、羊赤血球ロゼット技法を用いてT及び非−T細胞に分離し、そしてさらに、Damle など., J. Immunol. 139 : 1501 (1987)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるようにCD4+細胞をパンニングすることによりT細胞を分離することによってPBLsから単離した。B細胞をまた、抗−CD19mAb 4G9 を用いて、Wysocki and Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. 75 : 2844 (1978)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるようにパンニングすることにより末梢血液から精製した。

Th −誘発されたIg生成を測定するために、106 個のCD4+ T細胞を、10%のFBSを含むRPMI1mlにおいて106 個のCD19+B細胞と共に混合した。37℃での6日間の培養に続いて、ヒトIgMの生成を、Volkman など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2528 (1981)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるようにして固相ELISAを用いて培養上清液において測定した。簡単に言及すれば、96−ウェル平底マイクロタイターELISAプレート(Corning, Corning, NY)を、10μg/mlのアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG又はIgM 抗体(Tago, Burlingame, CA) を含む200 μl/ウェルの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)により被覆し、4℃で一晩インキュベートし、そして次に、PBSにより洗浄し、そしてウェルをさらに、PBS 中、2%BSA (BSA-PBS) によりブロックした。

アッセイされるべきサンプルを、それらのウェルに適切な希釈度で添加し、そして200 μl/ウェルの1:1000希釈度のアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG又はIgM抗体(Tago)のホスラディシュペルオキシダーゼ(HRP)−接合F(ab′)2 画分と共にインキュベートした。次に、プレートを洗浄し、そして100 μl/ウェルのo−フェニレンジアミン(Signa Chemical Co., St. Louis,MO)溶液(pH5のクエン酸リン酸緩衝液ml当たり0.6ng及び0.045 %の過酸化水素)を添加した。色の進行を、2Nの硫酸により止めた。

490 nmでの吸光度を、自動ELISAプレートリーダーにより測定した。試験及び対照サンプルは3通り行なわれ、そして吸光度の値を、培養上清液におけるIgの濃度が定量化される標準曲線を生成するために、上清液サンプルにより同時に行なわれた既知のIgG又はIgM標準により得られた値と比較した。データを、三重反復又は四重反復培養物のIg±SEMのng/mlとして表わされる。

免疫沈殿分析及びSDS PAGE。細胞を、125Iにより表面ラベル化し、そして免疫沈殿分析にゆだねた。簡単に言及すれば、PHA-活性化されたT細胞を、Vitettaなど., J. Exp. Med. 134 : 242 (1971)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるように、ラクトペルオキシターゼ及びH2O2を用いて125Iにより表面ラベル化した。SDS-PAGEクロマトグラフィー処理を、5%のアクリルアミドの積み重ねゲルを有する直線アクリルアミドグラジエントゲル上で行なった。ゲルをクーマシーブルにより染色し、脱色し、そして写真を取り、又は乾燥せしめ、そしてX線フィルム(Kodak XAR-5)に露光せしめた。

結合アッセイ。B7Igを、約2×106cpm/pモルの比活性に125Iによりラベルした。96のウェルのプラスチック皿を、CTLA4Ig(10mMのトリス(pH8)0.05mlの体積において0.5μg)を含む溶液により16〜24時間、被覆した。ウェルを、競争体の存在又は不在下で、125I B7Ig(約5×105 cpm)を含む溶液(0.09ml)の添加の前、結合緩衝液(50mMのBES(Sigma Chemical Co), pH6.8,0.1%BAS及び10%FCSを含むDMEM) によりブロックした。23℃で2〜3時間のインキュベーションに続いて、ウェルを結合緩衝液により1度洗浄し、そしてPBSにより4度洗浄した。次に、結合された放射能を0.5NのNaOHの添加により溶解し、そしてr計数により定量化した。

B7Igへの結合。完全なヒトCTLA4DNA 遺伝子をコードするOMCTLA4構成体の官能多活性が、図4に示される実験に示される。COS細胞を、上記のようにして発現プラスミドCD7,OMCD28及びOMCTLA4によりトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を集め、そして培地のみ(添加なし)と共に又はmAbs 9.3,B7Ig,CD5Ig又はG3−7と共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、そして結合性を、FITC−接合ヤギ抗−マウスIg及びFITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第2段階試薬の混合物により検出した。トランスフェクトされた細胞を、間接的免疫染色法により適切な細胞表面マーカーの発現について試験し、そして螢光を上記のようにしてFACS(R)分析を用いて測定した。

図4に示されるように、mAb 9.3は、CD28−トランスフェクトされたCOS細胞に結合したが、しかしCTLA4−トランスフェクトされる細胞には結合しなかった。対照的に、B7Ig融合タンパク質(但し、対照のCD5Ig融合タンパク質ではない)は、CD28−及びCTLA4−トランスフェクトされた細胞の両者に結合した。CD7−トランスフェクトされたCOS 細胞は、mAb 9.3にも融合タンパク質のいづれにも結合しなかった。これは、CD28及びCTLA4の両者がB細胞活性化抗原、B7を結合することを示唆する。さらに、mAb 9.3は検出できるほどは、CTLA4を結合しなかった。

B7陽性CHO細胞上へのCTLA4Igの結合。CTLA4Ig及びB7の結合をさらに特徴づけるために、B7+ CHO 細胞及びリンパ芽球細胞系(PMLCL)上への精製されたCTLA4Igの結合活性を、図5に示される実験において測定した。増幅された、トランスフェクトされたCHO 細胞系及びPM LCLを、培地のみ(添加なし)又はCD5Ig,CD28Ig又はCTLA4Igの同濃度のヒトIgCγ1−含有タンパク質(10μg/ml)と共にインキュベートした。結合性を、FITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第二段階試薬の添加に続いて、FACS(R)により検出した。合計10,000個の染色された細胞を、FACS(R)により分析した。

図5に示されるように、CD28IgはB7+ CHO細胞に結合するが、しかしPM LCLには結合せず、すなわち細胞系は比較的低レベルのB7抗原を発現する(Linsley など.,前記,1990)。CTLA4IgはCD28Igよりも両細胞系により強く結合し、これは、それが高い親和性を伴って結合することを示唆する。CD28IgもCTLA4Igも、CD28+ CHO 細胞に結合しなかった。

CTLA4Ig及びB7Igの結合の親和性。次に、CTLA4IgとB7Igとの間の相互作用の見掛け親和性を、固相競争結合アッセイを用いて測定した。96−ウェルプラスチック皿を、上記のようにしてCTLA4Igにより被覆した。B7Igを125I(5×105cpm, 2×106 cpm/pモル)により放射ラベルし、そして添加し、示される濃度(図6を参照のこと)のラベルされていないキメラmAb L6, mAb 9.3,mAb BB−1又はB7Igの存在下で、4nMの濃度にした。プレート−結合放射能を測定し、そして競争体なしに処理されたウェルに結合される放射能の百分率として表わされた(28,300cpm)。個々の点は二重反復測定の平均を示し;反復試験は一般的に平均から20%以下変化した。濃度を、mAb に関して結合部位当たり75,000のMrに基づいて及びB7Igに関して結合部位当たり51,000のMrに基づいて計算した。

図6に示されるように、mAb BB−1及びラベルされていないB7Igが125I−B7Ig結合のために有意に競争した(それぞれ約22nM及び約175 nMで最大の半分の効果)。キメラmAb L6もmAb 9.3も、試験された濃度で効果的に競争しなかった。他の実験においては、使用されるmAb の濃度は、固定されたCD28Ig又は90%以上、CD28を発現する細胞表面への125I−B7Igの結合を阻害するのに十分であった。図6からの競争データスキャッチャートプロットでプロットされる場合、約12nMの解離定数Kdが、固定されたCTLA4Igへの125I−B7の結合性について計算した(図7)。この値は、125I−B7IgとCD28との間で前で測定されたKdよりも約20倍低く(約200 nM)(Linsley など, (1991), 前記)、これは、CTLA4がCD28レセプターよりもB7抗原のためにより高い親和性レセプターであることを示唆する。

CTLA4Igを結合したリンパ芽球細胞上の分子を同定するために(図7)、125I−表面ラベルされた細胞を、免疫沈殿分析にゆだねた(図8)。B7+ CHO 及びPMLCL細胞を125Iにより表面ラベルし、そして上記のようにして非イオン性界面活性剤溶液により抽出した。約1.5×107cpmを有する、0.1mlの体積での抽出物アリコートを、添加を伴わないで、又はそれぞれ2μgのCD28Ig,CTLA4Ig又はCD5Igを伴って、上記のようにして免疫沈殿分析にゆだねた。

次に、洗浄された免疫沈殿物を、還元条件下でSDS-PAGE (10〜20%のアクリルアミドグラジエント)により分析した。次に、ゲルを乾燥せしめ、そしてオートラジオグラフィーにゆだねた。図8の左側のパネルは、1日間の暴露の後に得られたオートラジオグラムを示す。図8の右側のパネルは、10日間の暴露の後の同じゲルのオートラジオグラムを示す。図8の中央のパネルにおけるオートラジオグラムはまた、10日間、暴露された。分子量標準の位置はまた、この図に示される。

図8により示されるように、分散的に移動する(約50,000〜75,000;約60,000での中央)、放射性ラベルされたタンパク質を、CTLA4Igにより(但し、CD28Ig又はCD5Igによってではない)免疫沈殿せしめた。この分子は、CTLA4Igにより、B7+ CHO細胞から免疫沈殿されたB7と共に同時移動し、そしてCD28Igより免疫沈殿されたB7と共には、より一層弱く同時移動した。これらの発見は、CTLA4Igが、B7抗原に大きさが類似する、リンパ芽球細胞上の単一タンパク質を結合することを示唆する。

CTLA4Igによるインビトロでの免疫応答の阻害
増殖の阻害。これまでの研究は、抗−CD28 mAb, 9.3及び抗−B7 mAb, BB−1が、アロ抗原を表わすB細胞により、アロ抗原特異的Tn の増殖及び免疫グロブリン分泌を阻害することを示している(Damle, など., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096 (1981) ; Lesslauer など., Eur. J. Immunol. 16 : 1289 (1986)) 。CTLA4は本明細書に示されるようにB7抗原のために高い親和性レセプターであるので、可溶性CTLA4Igは、それらの応答を阻害するその能力について試験された。T細胞増殖に対するCTLA4Igの効果は、図9に示される実験で試験された。

一次混合リンパ球反応(MLR)幼若を、ネズミmAb9.3Fabフラグメント、又はB7Ig,CD28IgもしくはCTLA4Ig免疫グロブリンCγ融合タンパク質の濃縮物の不在又は存在下で、照射されたT51リンパ芽球細胞(IC)により刺激した。細胞増殖を、4日後、〔 3H〕−チミジン組込みにより測定し、そして未処理の培養物による組込みの百分率として表わす、(21,000cpm)。図9は、4重反復測定の平均を表わす(SEM≦10%)。

図9に示されるように、CTLA4Igは、約30ng/ml(約0.8nM)で、1/2最大応答を伴って最大90%以上、投与量−依存性態様でMLR 反応を阻害した。完全なmAb 9.3よりもより可能性あるMLR のインヒビターであることがこれまで示されている、mAb 9.3のFabフラグメント(Damle など., J. Immunol. 140 : 1753〜1761 (1988))はまた、MLR を阻害したが、しかしその濃度は、より高い濃度(約800 ng/ml又は1/2最大応答のためには約30nM)であった。B7Ig及びCD28Igは、高濃度でさえ、MLR を有意に阻害しなかった。他の実験においては、CTLA4Igと共にB7Igの添加は、CTLA4IgによるMLR の阻害を一部克服し、この事は、その阻害がB7抗原との特異的な相互作用によることを示唆する。

免疫グロブリン分泌の阻害。ヘルパーT細胞(Tn )−誘発性免疫グロブリン分泌に対するCTLA4Igの効果をまた試験した(図10)。CD4+ T細胞を、上記のようにして、指示された免疫グロブリン分子の存在又は不在下で、同種CD19+B細胞と共に混合した。ネズミmAbs OKT8, 9.3及びBB−1を20μg/mlで添加し、そしてIg融合タンパク質を10μg/mlで添加した。6日間の培養の後、培養上清液におけるヒトIgMの濃度(SEM<5%)を、上記のようにして酵素イムノアッセイ(ELISA)により測定した。CD4+ T細胞の不在下で培養されたB細胞によるIgM 生成は11ng/mlであった。

図10に示されるように、CD4+ T細胞は同種CD19+B細胞によるIgM生成を刺激した(CD4+ T細胞の不在下で、IgM レベルは93%減じられた)。mAbs 9.3及びBB−1は、Th −誘発されたIgM 生成を有意に阻害した(それぞれ63%及び65%の阻害率)。CTLA4Igは、それらのmAbsよりもインヒビターとしてより効果的であった(89%の阻害率)。対照分子、mAb OKT8及びCD5Igによる阻害は、より低かった(30%以下の阻害率)。それらの分子は、スタフィロコーカルアウレウス(Staphylococcal aureus)エンテロトキシンBの存在下で測定されるIg生成を有意に阻害しなかった。類似する結果が、他のドナーに由来するB細胞及びCD4+ T細胞により得られた。それらの結果は、CTLA4Igによる阻害が特異的であることを示す。

上記データはまた、CTLA4及びCD28レセプターが機能的及び構造的に関連していることを示す。CD28のように、CTLA4はまた、B細胞活性化抗原、B7のためのレセプターでもある。CTLA4Igは、約12nMの親和性定数Kdを伴って125I−B7を結合し、その値は、CD28とB7Igとの間の親和性よりも20倍高い(約200 nM)。従って、CTLA4及びCD28は、同じリガンド、すなわちB7抗原のために、それぞれ高い及び低い親和性レセプターとして考えられる。

CD28とB7との間の見掛け親和性は、ネズミT細胞ハイブリドーマのT細胞レセプターへの可溶性アロ抗原の結合について報告される親和性に類似し(約100 nM;Schnekなど.,Cell 56 : 47 (1989))、そしてCD2とLFA3との間(Recny など.,J. Biol. Chem. 265 : 8542 (1990))又はCD4とMHCクラスII分子との間(Clayton など., Nature 339 : 548 (1989))の相互作用よりも高い親和性である。

CTLA4とB7との間の見掛け親和性定数Kdはさらに大きく、そして好都合には、より高い親和性のmAbsに匹適する(K2 2−10,000nM;Alzariなど.,Ann. Rev.Immuno. 6 : 555 (1988)) CTLA4とB7との間のKdは、インテグリンレセプター及びそれらのリガンドのKdに類似するか又はそれの値よりも大きい(10〜2000nM:Hautanenなど., J. Biol. Chem. 264 : 1437 〜1442 (1989) ; Di Minnoなど.,Blood 61 : 140〜148 (1983) ; Thiagarajan and Kelley, J. Biol. Chem. 263: 3035〜3038 (1988))。従って、CTLA4とB7との間の相互作用の親和性は、リンパ芽球付着システムについて報告される中で最高である。

それらの結果は、CTLA4転写体の官能的タンパク質生成物の最初の発現を示す。CTLA4Ig、すなわちIgCγ1ドメインに融合されるCTLA4の細胞外ドメインを含む融合構成体は、約50,000サブユニットのMrのジスルフィド結合ダイマーを形成する(図1)。鎖間ジスルフィドはこの融合のIg部分において形成することが予期されないので、CTLA4からのシステインはジスルフィト結合形成に包含される。同種CD28Ig融合タンパク質(Linsley など, 前記,1991)はまた鎖間ジスルフィド結合を含む。それらの結果は、CD28のようにCTLA4レセプター(Hansenなど., Immunogenetics 10 : 247〜260(1980)) がジスルフィド結合ホモダイマーとしてT細胞表面上に存在することを示唆する。CD28及びCTLA4は高い相同性のタンパク質であるが、それらは免疫学的に異なっている。なぜならば抗−CD28 mAb, 9.3はCTLA4を認識しないからである(図4及び5)。

CTLA4が、CD28に類似するシグナル化路によりT細胞を活性化できるかどうかについては知られていない。ネズミ及びヒトCTLA4の細胞質ドメインは同一であり(Dariavach., 前記 1988)、これは、この領域が重要な官能性質を有することを示唆する。CD28及びCTLA4の細胞質ドメインはまた、相同性を共有す。但し、これが2つの分子に類似するシグナル性質を付与するために十分であるかいづれかについては不明である。

CTLA4IgはT細胞及びB細胞協力を必要とするインビトロリンパ球機能の可能性あるインヒビターである(図9及び10)。前記研究と共に、これらの発現は、T及びBリンパ球応答を調節することにおいて、B7抗原とそのカウンターレセプター、CD28及び/又はCTLA4との間に相互作用の基本的重要性を示唆する。CTLA4Igは、免疫応答の間、それらの相互作用の役割上、未来調査のために有用な試薬であるべきである。

CTLA4Igは、mAb BB−1又はmAb 9.3のいづれよりもインビトロリンパ球応答のより可能性あるインヒビターである(図9及び10)。mAb BB−1よりもよりCTLA4Igの高い能力は、ほとんどそれらの分子間でのB7のための親和性の差異によると思われる(図6)。CTLA4Igはまた、mAb 9.3よりも可能性がある。なぜならば、たぶん、mAb とは異なって、それはその阻害効果を妨害するために、T細胞増殖に対して直接的な刺激効果を有さないからである(Juneなど.,ImmunologyToday 11 : 211 (1989)) 。インビトロでのCTLA4Igの免疫抑制効果は、未来の研究が、異常なT細胞活性化又はIg生成を包含する自己免疫疾患の処置のために、この分子の可能な治療効果保証されることを示唆する。

本発明が関与する当業者に明らかなように、本発明は、本発明の範囲内で、上記に特別に開示されるもの以外の形で具体化され得る。従って、上記本発明の特定の態様は例示的であると考えられるべきである。本発明の範囲は、例示的であって、本発明を制限するものではない。
配列表

概要

免疫疾患の新規な治療剤の提供。

可溶性CTLA4タンパク質を含んで成る免疫疾患の治療剤。

目的

効果

実績

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請求項1

溶性CTLA4タンパク質を含んで成る、免疫疾患治療するための医薬組成物

請求項2

前記免疫疾患が、自己免疫疾患である請求項1記載の医薬組成物。

請求項3

前記免疫疾患が、同種移植片拒絶である請求項1記載の医薬組成物。

請求項4

前記免疫疾患が、慢性アレルギー反応である請求項1記載の医薬組成物。

請求項5

前記免疫疾患が、移植片拒絶である請求項1記載の医薬組成物。

請求項6

前記免疫疾患が、移植片対宿主疾患である請求項1記載の医薬組成物。

請求項7

前記免疫疾患が、リウマチ様関節炎である請求項1記載の医薬組成物。

請求項8

可溶性CTLA4タンパク質を含んで成る、癌の治療のための医薬組成物。

請求項9

可溶性CTLA4タンパク質を含んで成る、T細胞増殖の調節のための医薬組成物。

請求項10

可溶性CTLA4タンパク質を含んで成る、ウィルス感染を治療するための医薬組成物。

請求項11

前記ウィルス感染が、HIV感染である請求項10記載の医薬組成物。

請求項12

前記ウィルス感染が、HTLV1感染である請求項10記載の医薬組成物。

請求項13

可溶性CTLA4タンパク質を含んで成る、細胞介在性免疫応答を調節するための医薬組成物。

請求項14

前記免疫応答が、リンパ球とのB7相互反応を阻止することによって調節される請求項13記載の医薬組成物。

請求項15

位置1でのアラニン又は位置2でのメチオニンにより開始し、そして位置187でのアスパラギン又は位置125でのアスパラギン酸終結する配列番号14に示されるCTLA4の細胞外ドメインを有する単離された可溶性CTLA4分子を含んで成る、免疫疾患を治療するための医薬組成物。

請求項16

前記免疫疾患が、自己免疫疾患である請求項15記載の医薬組成物。

請求項17

前記免疫疾患が、同種移植片拒絶である請求項15記載の医薬組成物。

請求項18

前記免疫疾患が、慢性アレルギー反応である請求項15記載の医薬組成物。

請求項19

前記免疫疾患が、移植片拒絶である請求項15記載の医薬組成物。

請求項20

前記免疫疾患が、移植片対宿主疾患である請求項15記載の医薬組成物。

請求項21

前記免疫疾患が、リウマチ様関節炎である請求項15記載の医薬組成物。

請求項22

位置1でのアラニン又は位置2でのメチオニンにより開始し、そして位置187でのアスパラギン又は位置125でのアスパラギン酸で終結する配列番号14に示されるCTLA4の細胞外ドメインを有する単離された可溶性CTLA4分子のいずれかの組成物を含んで成る、癌を治療するための医薬組成物。

請求項23

位置1でのアラニン又は位置2でのメチオニンにより開始し、そして位置187でのアスパラギン又は位置125でのアスパラギン酸で終結する配列番号14に示されるCTLA4の細胞外ドメインを有する単離された可溶性CTLA4分子のいずれかの組成物を含んで成る、T細胞増殖を調節するための医薬組成物。

請求項24

位置1でのアラニン又は位置2でのメチオニンにより開始し、そして位置187でのアスパラギン又は位置125でのアスパラギン酸で終結する配列番号14に示されるCTLA4の細胞外ドメインを有する単離された可溶性CTLA4分子のいずれかの組成物を含んで成る、ウィルス感染を治療するための医薬組成物。

請求項25

前記ウィルス感染が、HIV感染である請求項24記載の医薬組成物。

請求項26

前記ウィルス感染が、HTLV1感染である請求項24記載の医薬組成物。

請求項27

位置1でのアラニン又は位置2でのメチオニンにより開始し、そして位置187でのアスパラギン又は位置125でのアスパラギン酸で終結する配列番号14に示されるCTLA4の細胞外ドメインを有する単離された可溶性CTLA4分子のいずれかの組成物を含んで成る、細胞介在性免疫応答を調節するための医薬組成物。

請求項28

前記免疫応答が、リンパ球とのB7相互反応を阻止することによって調節される請求項27記載の医薬組成物。

請求項29

CTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質を含んで成る免疫疾患を治療するための医薬組成物。

請求項30

前記免疫疾患が、自己免疫疾患である請求項29記載の医薬組成物。

請求項31

前記免疫疾患が、同種移植片拒絶である請求項29記載の医薬組成物。

請求項32

前記免疫疾患が、慢性アレルギー反応である請求項29記載の医薬組成物。

請求項33

前記免疫疾患が、移植片拒絶である請求項29記載の医薬組成物。

請求項34

前記免疫疾患が、移植片対宿主疾患である請求項29記載の医薬組成物。

請求項35

前記免疫疾患が、リウマチ様関節炎である請求項29記載の医薬組成物。

請求項36

CTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質を含んで成る癌を治療するための医薬組成物。

請求項37

CTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質を含んで成るT細胞増殖を調節するための医薬組成物。

請求項38

CTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質を含んで成るウィルス感染を治療するための医薬組成物。

請求項39

前記ウィルス感染が、HIV感染である請求項38記載の医薬組成物。

請求項40

前記ウィルス感染が、HTLV1感染である請求項38記載の医薬組成物。

請求項41

CTLA4/CD28Igハイブリッド融合タンパク質を含んで成る細胞介在性免疫応答を調節するための医薬組成物。

請求項42

前記免疫応答が、リンパ球とのB7相互反応を阻止することによって調節される請求項41記載の医薬組成物。

請求項43

137−陽性細胞とのT細胞相互作用により介在される免疫系疾患処理方法であって、前記137−陽性細胞とB7抗原のためのリガンドとを、CTLA4と内因性B7抗原との反応を妨げるのに有効な量で接触せしめることを含んで成る方法。

請求項44

前記T細胞相互作用が阻害される請求項43記載の方法。

請求項45

前記リガンドが可溶性CTLA4分子である請求項43記載の方法。

請求項46

前記B7リガンドが、B7を結合する、CTLA4の細胞外ドメインの一部を含む融合タンパク質である請求項43記載の方法。

請求項47

前記リガンドがCTLA4Ig融合タンパク質である請求項46記載の方法。

請求項48

前記リガンドがCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質ハイブリッドである請求項43記載の方法。

請求項49

前記免疫系疾患が移植片拒絶、移植片対宿主疾患(GVHD)、自己免疫障害感染性疾患又は新形成である請求項43記載の方法。

技術分野

180 185

背景技術

0001

本発明は、CTLA4レセプター遺伝子、前記レセプターとB7抗原発現する細胞との間の相互作用の同定、およびCTLA4レセプターを含む細胞の相互作用を調節する方法に関する。

0002

脊椎動物の免疫系の特徴は、「自己」と「非自己」とを区別する能力である。この性質は、最適な免疫活性化を達成するために多数のシグナルを必要とする系の進化に導いた(Janeway, Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol. 54 : 1-14(1989)) 。T細胞B細胞の相互作用は免疫応答に対して必須である。T細胞およびB細胞上に見いだされる多数の付着分子のレベルは、免疫応答の間に増加する(Springerら、(1987)、前掲;およびShimizu, Current Opinion in Immunology, KindtおよびLong編、1:92-97 (1988)) ;およびHemler, Immunology Today 9:109-113 (1988)) 。

0003

これらの分子のレベルの増加は、活性化されたB細胞が、抗原特異的T細胞の増殖を刺激するとき、休止のB細胞よりもいっそう有効である理由の説明を促進することができる(Kaiuchi ら、J. Immunol. 131 : 109-114 (1983) ; Krcigerら、J. Immunol. 135 : 2937-2945 (1985) ; McKenzie, J. Immunol. 141 : 2907-2911 (1988) ; およびHawrylowicz およびUnanue, J. Immunol. 141 : 4083-4088 (1988)) 。

0004

Tリンパ球(「T細胞」)の免疫応答の発生は、細胞−細胞の相互作用(Springerら、A. Rev. Immunol.5:223-252 (1987)) 、とくにT細胞とアクセサリー細胞、例えば、B細胞との間の相互作用、および可溶性仲介因子サイトカインまたはリンホカイン)の生産を含む複雑なプロセスである(Dinarello およびMier, New Engl. Jour. Med. 317 : 940-945 (1987))。この応答は、T細胞レセプター複合体(Weiss ら、Ann. Rev. Innunol.4:593-619 (1986)) および他の「アクセサリー表面分子(Springerら、(1987)前掲)を含む、いくつかのT細胞表面レセプターにより調節される。これらのアクセサリー分子の多数は、細胞の表面上のモノクローナル抗体反応性により定められる、天然に見いだされる細胞表面の分化(CD)抗原である(McMichacl 編、Leukocyte TypingIII ,Oxford Univ. Press 、オックスフォードニューヨーク(1987))。

0005

リンパ球のアクセサリー分子を含む抗原独立の細胞間の相互作用は、免疫応答に対して必須である(Springerら、(1987)前掲)。例えば、T細胞関連タンパク質CD2のそのリガンドLFA 3(広く発現される糖タンパク質(ShawおよびShimuz、前掲の中に概観されている))への結合は、抗原特異的T細胞の活性化を最適化するために重要である(Moigcon ら、Nature 339 : 314(1988))。他の重要な付着系は、リンパ球、マクロファージ収量顆粒球上に見いだされるLFA-1糖タンパク質(Springerら、(1987)前掲;ShawおよびShimuz (1988) 前掲)のそのリガンドICAM-1(Makgoba ら、Nature 311 : 86-88 (1988)) およびICAM−2(Staunton ら、Nature 339 : 61-64 (1989)) への結合を含む。

0006

T細胞のアクセサリー分子CD8およびCD4は、それぞれ、MHCクラスI(Norment ら、Nature 336 : 79-81 (1988)) およびクラスII(Doyle およびStrominger, Nature 330 : 256-259 (1987))分子との相互作用により、T細胞の付着を強化する。「ホーミング・レセプター(homing receptor)」はリンパ球の移動のコントロールのために重要である(Stoolman, Cell 56 : 907-910 (1989))。VLA糖タンパク質は、細胞外マトリックス成分への付着を必要とするリンパ球の機能を仲介するように思われるインテグリン(integrin) である(Hemler、前掲)。CD2/LFA-3,LFA-1/ICAM-1、およびVLA 付着系は、広範な種類のタイプの細胞上に存在する(Springerら、(1987)、前掲;ShawおよびShimuz、(1989)、前掲およびHemler、(1988))、前掲)。

0007

B−リンパ球の活性化は2つのシグナルを必要とすることがかなり以前に提案され(Bretscher およびCohn, Science 169 : 1042−1049 (1970))そして現在すべてのリンパ球はそれらの最適な活性化のための2つのシグナル、抗原特異的またはクローナルシグナル、ならびに抗原非特異的シグナルを必要とすると信じられている(Janeway 、前掲)。Freeman ら(J. Immunol. 143 (8) : 2714-2722(1989))は、mAB B7により認識されるB細胞活性化抗原をコードするcDNAクローンを単離しそして配列決定した(Freeman ら、J. Immunol. 138 : 3260 (1987))。

0008

このcDNAでトランスフェクションしたCOS細胞は、標識化mAB B7およびmAB BB−1の両者により染色されることが示された(Clark ら、Human Immunol. 16 :100-113 (1986);Yokochi ら、J. Immunol. 128 : 823 (1981)) ; Freeman ら、(1989)前掲;およびFreeman ら、(1987)、前掲))。さらに、この抗原の発現は他の系統の細胞、例えば、単球上に検出された(Freeman ら、前掲)。

0009

ヘルパー細胞(Th )抗原の応答のために要求されるシグナルは、抗原を提示する細胞(APC)により提供される。T細胞レセプター複合体(Weiss, J. Clin, Invest. 86 : 1015 (1990)) を、 APC上のクラスIIの主要な組織適合性複合体MIIC)分子に関係して提示された抗原と相互作用させることによって、第1シグナルは開始される(Allen, Immunol. Today 8 : 270 (1987)) 。この抗原特異的シグナルは完全な応答を発生するために不十分であり、そして第2シグナルの存在下に、クローナルの不活性化またはアネルギーに実際に導くことがある (Schwartz, Science 248 : 1349 (1990))。

0010

MHCにより提供される第2「共同刺激(costimulatory)」シグナルについての要件は、ある数の実験の系において証明された(Schwartz,前掲;WeaverおよびUnanue, Immunol. Today 11 : 49 (1990))。これらの1または2以上のシグナルの分子の性質は完全には理解されないが、ある場合において、可溶性分子、例えば、インターロイキンIL)−1(WeaverおよびUnanuc, 前掲)および細胞間付着に関係する膜レセプターの両者は共同刺激シグナルを提供できることが明らかである。

0011

CD28抗原、すなわち、免疫グロブリン上科ホモ量体の糖タンパク質(AruffoおよびSeed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 8573-8577 (1987))は、ほとんどの成熟ヒトT細胞上に見いだされるアクセサリー分子である(Damle ら、J. Immunol. 131 : 2296-2300 (1983)) 。現在の証拠示唆するように、T細胞反応複合体により開始されるものと区別される別のT細胞活性化の経路において、この分子は機能する(Juneら、Mol. Cell. Bicl. 7 : 4472-4481 (1987)) 。CD28抗原と反応性のモノクローナル抗体(mAb)は、種々のポリクローナルの刺激により開始されるT細胞の応答を増強することができる(Juneら、前掲、の中に概観されている)。

0012

これらの刺激作用はmAb 誘発サイトカインの生産(Thompsonら、Proc. Natl.Acad. Sci. 86 : 1333-1337 (1989) ; およびLindstenら、Scicnce 244 : 339-343 (1989)から、mRNA安定化の増加 (Lindstenら、(1989)、前掲)の結果としてを生ずることができる。抗CD28mAb は、また、阻止作用を有することができ、すなわち、それらはオートロガス混合リンパ球反応(Damle ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096-6001 (1981)) および抗原特異的T細胞クローンの活性化(Lesslauer ら、Eur. J. Immunol. 16 : 1289-1296 (1986)) をブロックすることができる。

0013

CD28はB細胞活性化抗原であるB7/BB−1のための対レセプターであることが研究において示された(Linsley ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 5031-5035 (1990)) 。便宜上、B7/BB−1抗原を以後「B7抗原」と呼ぶ。CD28とB7抗原との間の相互作用は、B7抗原およびCD28レセプターの細胞外部分、および免疫グロブリン(Ig)Cγ1(一定領域の重鎖)の遺伝学的融合を使用して特徴づけられた(Linsley ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991))。

0014

同定化B7Ig融合タンパク質ならびにB7陽性CHO細胞は、T細胞の増殖を共同刺激(costimulate)することが示された。B7陽性CHO 細胞によるT細胞の刺激は、また、IL−2のための転写レベルの増加を特異的に刺激する。追加の研究において、抗CD28mAb は、ある種のT細胞白血病細胞系においてB細胞系白血病系統との細胞の相互作用により誘発されたIL−2の生産を阻止することが示された(Kohno ら、Cell Immunol. 131-1-10 (1990))。

0015

CD28は単一の細胞外可変領域(V)様ドメインを有する(AruffoおよびSeed、前掲) 。相同性分子のCTLA4は、ネズミ細胞溶解性T細胞のcDNAライブラリー分別スクリーニングにより同定された(Brunetら、Nature 328 : 267-270 (1987))。この分子の転写細胞障害活性を有するT細胞の集団の中に見いだされ、CTLA4が細胞溶解性応答において機能するであろうことを示唆した (Brunetら、前掲;およびBrunetら、Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)) 。

0016

研究者らの報告によると、CTLA4のヒトの対 (Dariavach ら、Eur. J.Immunol. 18 : 1901-1905 (1988)) の遺伝子はクローニングされそしてCD28と同一の染色体領域(2g 33-34) にマッピングされた(Lafage-Pochitalodd)ら、Immunogenetics 31 : 198-201 (1990)) 。このヒトCTLA4のDNA とCD28タンパク質をコードするものとの間の配列の比較は、膜近傍領域および細胞質領域において最高度の相同性をもつ、配列の有意な相同性を明らかにする(Brunetら、1988、前掲;Dariavach ら、1988、前掲)。

0017

CD28とCTLA4との間の高度の相同性は、それらの遺伝子の共同局在化一緒に、これらの分子がまた機能的に関係するかどうかという問題を発生する。しかしながら、CTLA4のタンパク質生産物はまだ首尾よく発現されてきていないので、これらの問題は未解決のままである。

0018

免疫グロブリン遺伝子の上科における細胞表面の糖タンパク質の可溶性誘導体の発現は、CD4,HIV-1のレセプター、およびCD28およびB7のレセプターについて、ハイブリッド融合分子を使用して活性化され、これらのハイブリッド融合分子は抗体ドメインに融合されたCD4 レセプターの細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDNA 配列から成る(免疫グロブリンγ1(Capon ら、Nature 337 : 525-531 (1989)(CD4)およびLinsley ら、J. Exp. Med.、前掲)(CD28およびB7) 。

0019

従来発現されていないCTLA4遺伝子の可溶性タンパク質生産物を得ること、およびT細胞の機能的応答に関係するCTLA4のための天然のリガンドを同定することは有用であろう。次いで、可溶性タンパク質生産物を使用してT細胞のin vivo応答を調節して病理学的状態処置することができるであろう。

0020

発明の要約
したがって、本発明はCTLA4レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をコードする完全なかつ正しいDNA 配列を提供し、そしてCTLA4レセプターのために天然のリガンドとしてB7抗原を同定する。本発明は、また、CTLA4免疫グロブリン(Ig)融合タンパク質生産としてDNA を発現する方法を提供する。本発明の態様は、CTLA4Ig融合タンパク質、およびCD28Ig/CTLA4 Ig 融合タンパク質を包含するハイブリッドの融合タンパク質を包含する。また、CTLA4融合タンパク質、B7Ig融合タンパク質、およびそれらの断片および/または誘導体、例えば、CTLA4およびB7抗原と反応性のモノクローナル抗体を使用して細胞の相互作用および免疫応答を調節する方法が提供される。

0021

本発明のヒトCTLA4レセプタータンパク質は187アミノ酸によりコードされ、そして新しく同定されたN連鎖グリコシル化部位を包含する。本発明のCTLA4Ig融合タンパク質は、活性化B細胞、および他の系統上に発現されたB7抗原、T細胞上のCD28レセプターのためのリガンドと結合する。CTLA4Igは、CD28レセプターに結合するB7よりも有意により高い親和性でB7抗原と結合する。

0022

CTLA4Ig構成体は、ヒトIgCγ1ドメインに相当する第2アミノ酸配列に融合したCTLA4レセプターの細胞外ドメインに相当する第1アミノ酸配列を有する。第1アミノ酸配列は、アミノ酸配列の約位置1から約位置125 のアミノ酸残基を含有し、これらのアミノ酸残基はヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸残基を含有する第2アミノ酸配列に接合したCTLA4の細胞外ドメインに相当する。融合タンパク質は好ましくは2量体の形態で生産される。可溶性CTLA4IgはTおよびBリンパ球の応答の効力のあるin vivoインヒビターである。

0023

また、本発明において、ハイブリッド融合タンパク質、例えば、第1アミノ酸配列を有するCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質が包含され、この第1アミノ酸配列はCTLA4Igの細胞外ドメインの断片に相当する第2アミノ酸配列およびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列に接合したCD28の細胞外ドメインの断片に相当する。

0024

ハイブリッド融合タンパク質の1つの態様は、CD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置1から約94のアミノ酸残基を含有する第1アミノ酸配列を有するCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質であり、CD28の細胞外ドメインはCTLA4の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置94から約位置125 のアミノ酸残基を含有する第2アミノ酸配列を接合し、CTLA4の細胞外ドメインはヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸残基を含有する第3アミノ酸配列に接合している。

0025

また、本発明において、T細胞をCTLA4レセプターのリガンドと反応させることによって、CTLA4陽性T細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することによる、他の細胞とのT細胞の相互作用を調節する方法が包含される。リガンドはB7Ig融合タンパク質、CTLA4レセプターと反応性のモノクローナル抗体、および抗体断片を包含する。本発明は、また、B7抗原のためのリガーゼを使用する、B7陽性細胞とのT細胞の相互作用を調節する方法を提供する。このようなリガンドは、本発明のCTLA4Ig融合タンパク質、その断片または誘導体、CD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。

0026

本発明は、さらに、B7抗原と反応性のリガンドを投与してB7陽性細胞とのT細胞の相互作用を調節することによって、B7陽性細胞とのT細胞の相互作用により仲介される免疫系の疾患を処置する方法を包含する。このリガンドは、CTLA4Ig融合タンパク質、CD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。

0027

CTLA4Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体およびCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体を、細胞の相互作用の調節における使用について記載する。CTLA4Ig融合タンパク質を安定に発現する新規チャイニーズハムスター卵巣細胞系をまた開示する。

0028

発明の実施の形態
ここに記載する本発明を完全に理解することができるように、次の説明を記載する。本発明は、T細胞表面上に見いだされ、活性化B細胞および他の系統の細胞上に発現されたB7抗原に結合する、ヒトCTLA4レセプターの単離およびクローニング、およびCTLA4レセプター遺伝子の可溶性融合タンパク質生産物の発現に関する。本発明は、また、発現されたCTLA4レセプターを使用して、B7陽性細胞とのT細胞の相互作用を包含する細胞の相互作用を調節する方法を提供する。

0029

好ましい態様において、本発明のヒトCTLA4レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をコードする完全なかつ正しいDNA 配列をPCRによりクローニングする。CTLA4の完全な予測されたコーディング配列を含有するcDNAを、下の実施例の中に詳細に記載されているように、H38RNAから増幅されたPCR 断片からアセンブリングし、そして発現ベクターCDM8の中に挿入した。単離物をCOS細胞の中にトランスフェクションし、そしてB7Ig、すなわち、Linsley ら、J. Exp. Med.173 : 721-730 (1991) 記載されているように、B7の細胞外ドメインおよびヒト免疫グロブリン(Ig)Cγ1領域に相当するアミノ酸配列を有する可溶性融合タンパク質の結合について試験した。

0030

次いで、OMCTLA4と表示する1つの単離物のDNA 配列を決定し、そしてN末端においてオンコスタインMからのシグナルペプチドに融合した、予測されたヒトCTLA4配列に正確に相当することが発見された。CTLA4レセプターは187アミノ酸(シグナルペプチドおよび停止コドンを除外する)によりコードされ、そしてアミノ酸位置109-111 に新しく同定されたN連鎖グリコシル化部位を含む(下の第3図を参照)。オンコスタチインMのシグナルペプチドを使用して、CTLA4レセプターを発現させる。

0031

他の好ましい態様において、CTLA4の細胞外ドメインに相当する第1アミノ酸配列およびヒトIgCγ1ドメインに相当する第2アミノ酸配列を有する融合タンパク質を使用して、CTLA4レセプター遺伝子(CTLA4Ig)のタンパク質生産物の可溶性の形態を調製する。ここに記載するcDNA配列に基づくヒトCTLA4レセプターに相当するアミノ酸配列の部分をコードするcDNAを含有するクローニングおよび発現のプラスミド(CDM8およびπLN)を構成し、ここでCTLA4レセプター遺伝子の細胞外ドメインの断片に相当する第1アミノ酸配列をコードするcDNAを、発現されたCTLA4タンパク質の可溶性の変更によりCTLA4レセプター遺伝子の発現を可能とするIgC領域に相当する第2アミノ酸配列をコードするDNA に接合する。

0032

こうして、可溶性CTLA4Ig融合タンパク質は第1アミノ酸配列によりコードされ、この第1アミノ酸配列はヒトIgのCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸残基を含有する第2アミノ酸配列に接合したCTLA4の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置1〜約125 のアミノ酸残基を含有する。融合タンパク質は好ましくは2量体の形態で生産される。次いでこの構成体をCOSまたはCHO細胞の中にトランスフェクションし、そしてCTLA4Igを精製しそして2量体として同定した。

0033

CTLA4Ig融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA は、ブダベスト条約の規定に従いアメリカン・タイプ・カルチャーコレクション(American Type Culture Collcction)(ATCC)(米国マリイランドロックビレ)に1991年5月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号68629 を与えられた。本発明は、可溶性融合タンパク質の形態でCTLA4転写体の第1タンパク質生産物を提供する。CTLA4タンパク質はほぼ50,000サブユニットのMr のジサルファイド連鎖の2量体を形成し、天然のCTLA4がT細胞表面上にジサルファイド連鎖ホモ2量体として多分存在することを示す。

0034

B7抗原はT細胞上のCD28レセプターのためのリガンドであることが示された(Linsley ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、前掲)。CTLA4レセプター分子はCD28レセプターに機能的にかつ構造的に関係すると思われる;両者はB細胞活性化抗原のためのレセプターであるが、CTLA4は、リンパ系付着系についてこれまで報告された最高のもの中で、B7に対するより高い親和性を有するように思われる。しかしながら、CTLA4IgはCD28IgよりB7陽性(B7+ ) 細胞系にいっそう強く結合することが示された。他の実験において、CTLA4はB7抗原に対してCD28レセプターより高い親和性のレセプターであることが証明された。さらに、CTLA4IgはB7抗原に大きさが類似するリンパ芽球球細胞上の単一のタンパク質に結合することが示された。CTLA4IgはT細胞増殖を阻止し、そしてTh 誘発IgM生産を阻止した。

0035

他の好ましい態様において、異なるレセプタータンパク質の断片に相当するアミノ酸配列を有するハイブリッド融合タンパク質を構成した。例えば、CD28およびCTLA4の細胞外ドメインの選択した断片に相当するアミノ酸配列を連鎖して、CD28Ig/CTLA4Igハイブリッド融合タンパク質を形成した。こうして、第1アミノ酸配列を有するCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質が得られ、この第1アミノ酸配列はCTLA4Igの細胞外ドメインの断片に相当する第2アミノ酸配列およびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列に接合した、CD28の細胞外ドメインの断片に相当するアミノ酸残基を含有する。

0036

ハイブリッド融合タンパク質の1つの態様は第1アミノ酸配列を有するCD28Ig/CTLA4Ig融合構成体であり、この第1アミノ酸配列はCD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置1〜約位置94のアミノ酸残基を含有し、CD28はCTLA4の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置94〜約位置125 のアミノ酸残基を含有する第2アミノ酸配列に接合し、CTLA4はヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列に接合している。

0037

CTLA4レセプタータンパク質、可溶性融合タンパク質およびハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA 配列をクローニングしそして発現する技術、例えば、オリゴヌクレオチドの合成、PCR、細胞の形質転換ベクターの構成、発現系などはこの分野においてよく確立されており、そしてほとんどの熟練者は特定の条件および手順のための標準的源材料をよく知っている。しかしながら、必要に応じて便利および変更の注釈のために次の節を準備し、そしてこれらの節はカイドラインの役Hをするであろう。

0038

レセプターおよび融合タンパク質のためのコーディング配列のクローニングおよび発現
本発明のCTLA4Igを特性決定しかつCD28Ig/CTLA4Ig融合ハイブリッドを調製するためのCD28IgCγ1およびB7IgCγ1に相当する融合タンパク質の構成体を、Linsley ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991)(これを引用によって加える)に記載されているように調製した。あるいは、B7抗原およびCD28レセプターを発現する細胞から、これらのタンパク質について発表された知識(AruffoおよびSccd、およびFreeman 、前掲)に基づいて標準的手順を使用して、cDNAクローンを調製することができる。

0039

CTLA4の細胞外ドメインおよびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するに相当するアミノ酸配列をコードするDNA から成るCTLA4Ig融合体を、PCR断片の結合により構成した。アミノ酸をコードするcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR 」)技術に従い増幅する(米国特許第4,683,195 号および米国特許第4,683,202 号(Mullisら)、およびMullisおよびFaloona, McthodsEnzymol. 154 : 335-350 (1987) を参照のこと)。CTLA4Ig融合ポリペプチドを構成し、これらのポリペプチドはCTLA4の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置1〜約位置125 のアミノ酸残基を含有するアミノ酸配列をコードするDNA 、およびIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA を有した。

0040

トリンパ系細胞の中のCTLA4レセプタータンパク質の発現は従来報告されてきていないので、CTLA4のmRNA源を探すことが必要であった。いくつかのヒト白血病細胞系の全体の細胞のRNA から作ったPCRのcDNAを、プライマーとして、CTLA4遺伝子の発表された配列かのオリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングした(Dariavach ら、前掲)。試験したcDNAのうちで、H38 細胞(HTLV II関連白血病系統)は期待したサイズを有するPCR生産物の最良の収量を提供した。

0041

CTLA4の単一のペプチドはCTLA4遺伝子の中で同定されなかったので、CTLA4の予測された配列のN末端をオンコスタチインMのシグナルペプチド(Malik ら、Molec. and Cell. Biol. 9 : 2847 (1989))に、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドを使用して融合した。PCR反応の生産物を、IgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸配列をコードするcDNAを使用して、発現ベクター、例えば、CDM8またはπLNの中に結合した。

0042

全長のヒトCTLA4をコードするDNA を得るために、CTLA4のトランスメンブレンおよび細胞質ドメインをコードするcDNAをH38細胞からPCRにより構成し、そしてCTLA4のN末端に融合したオンコスタチインMシグナルペプチドをコードする、前述したように構成した、CTLA4Igからの断片と、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して接合した。PCR 断片をプラスミドCDM8の中に結合して、全長のCTLA4をコードする発現プラスミドを生成し、そしてこれをOMCTLA4と表示した。

0043

ハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA を構成するために、1つのレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDNA を、他のレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDNA 、およびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA に、B7Ig、CD28IgおよびCTLA4Ig構成体について前述した手順を使用して接合する。こうして、例えば、CD28レセプターの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約1位置〜約94位置のアミノ酸残基をコードするDNA を、CTLA4レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸配列の約位置94〜約位置125 のアミノ酸残基をコードするDNA 、およびヒトIgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA に接合する。

0044

大量のクローニングしたDNA を生産するために、本発明の融合構成体をコードするDNA を含有するベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌細胞系の大腸菌(E.coli)MC1061/p3株(Invitrogen Corp. 、カリフォルニアサンディエゴ)の中に標準的手順を使用して形質転換し、そしてコロニーを適当なプラスミドについてスクリーニングする。

0045

次いで、前述したようにして得られた融合構成体をコードするDNA を含有するクローンを、発現のために適当な宿主細胞の中にトランスフェクションする。使用する宿主細胞に依存して、このような細胞に適当な標準的技術を使用してトランスフェクションを実施する。例えば、哺乳動物細胞中のトランスフェクションは、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、CaPO4共沈リポフェクション(lipofection)、エレクトロレイションまたは原形質体の融合、および他のこの分野において知られている方法により達成し、ここで後者の方法は次のものを包含する:リゾチームの融合または赤血球の融合、スクレイピング、直接的吸収、浸透圧またはスクロースショック、直接的マイクロインジェクション間接的マイクロインジェクション、例えば、赤血球仲介技術を介するマイクロインジェクション、および/または宿主細胞を電流暴露する。遺伝的情報を細胞の中に導入する他の手順は疑いなく開発されるであろうから、上に列挙したトランスフェクションの技術は網羅的であるお考えられない。

0046

多細胞生物から誘導化された真核生物の宿主細胞の培養物の中の発現は好ましい(Tissure Cultures, Academic Press, CruzおよびPatterson 編、(1973)を参照のこと)。これらの系はイントロンスプライスする能力をもつという追加の利点を有し、こうしてゲノム断片の発現に直接使用することができる。有用な宿主細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、サル腎臓(COS)細胞、VERO細胞およびHeLa細胞を包含する。本発明において、融合構成体を安定に発現する細胞系は好ましい。

0047

このような細胞のための発現ベクターは、通常、哺乳動物細胞と適合性プロモーターおよびコントロール配列、例えば、CMV プロモーター(CDM8ベクター)および鳥類肉腫ウイルス(ASV)(πLNベクター)を包含する。他の普通に使用される前期および後期のプロモーターは、サルのウイルス40(SV40)(Fiersら、Nature 273 : 113 (1973)) 、または他のウイルスのプロモーター、例えば、ポリオーマから誘導化されたもの、アデノウイルス2、およびウシ乳頭腫ウイルスを包含する。

0048

コントロール可能なプロモーター、hMTII(Karin ら、Nature 299 : 797-802(1982))をまた使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系の形質転換についての一般的面は、Axel(米国特許第4,399,216 号、1983年8月16日発行)により記載された。現在明らかなように、「エンハンサー」領域は発現を最適化するとき重要である;これらは、一般に、非コーディング領域の中のプロモーター領域の上流または下流に見いだされる配列である。必要に応じて、複製の由来ウイルス源から得ることができる。しかしがら、染色体中の組み込みは真核生物におけるDNA の複製のための普通のメカニズムである。

0049

融合構成体の発現のために好ましい真核生物の細胞、例えば、COS またはCHO細胞を包含するが、他の真核生物の微生物を使用できる。サッカロミセスセレビシアエ(Saccharomyces ccrevisiae)、イースト実験室用菌株をたいてい使用するが、他の菌株、例えば、シゾサッカロミセス・ポンペ(Schizosaccharomyces pombe)を使用できる。例えば、Broach, McthodsEnzymol. 101 : 307 (1983) の2μの複製由来、または他の酵母適合性の複製由来(例えば、Stinchcombら、Nature 282 : 39 (1979)) ; Tschempeら、Gene 10 : 157 (1980) ;およびClarkeら、Methods Enzymol. 101 : 300 (1983)を参照のこと)を用いるベクターを使用することができる。

0050

酵母のベクターのためのコントロール配列は、グリコール分解酵母の合成のためのプロモーターを包含する(Hessら、J. Adv. Enzyme Reg. 7 : 149 (1968) ;Hollandら、Biochcmistry. 17 : 4900 (1978)) 。この分野において知られている追加のプロモーターは、CDM8ベクターの中に提供されたCMV プロモーター(ToyamaおよびOkayama, FEBS268 : 217-221 (1990) ;3−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター(Hitzemanら、J. Biol. Chem. 255 : 2073)) 、および他のグリコール分解酵素のためのプロモーターを包含する。

0051

成長条件によりコントロールされる転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC酸性ホスファターゼ窒素の代謝に関連する分解酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関係する酵素のためのプロモーター領域である。また、ターミネーター配列はコーディング配列の3′末端において望ましいと信じられる。このようなターミネーターは、酵母誘導化遺伝子の次の3′−非翻訳領域の中に見いだされる。

0052

あるいは、原核生物の細胞を発現のための宿主として使用することができる。原核生物の細胞は、大腸菌(E.coli)の種々の株により最も頻繁に発現される;しかしながら、他の微生物の菌株も使用できる。ここにおいて転写開始のためのプロモーターを、必要に応じてオペレーターとともに含むと定義される、普通に使用される原核生物のコントロール配列は、リボソーム結合部位の配列と一緒に、ベータラクタマーゼペニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プロモーター系(Chang ら、Nature 198 : 1056 (1977)) 、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel ら、核酸の研究(Nucleic AcidsRes. 8 : 4057 (1980)) およびラムダ誘導化Pl プロモーターおよびN−遺伝子リボソーム結合部位(Shimatake ら、Nature 292 : 128 (1981))のような普通に使用されているプロモーターを包含する。

0053

CD28IgおよびCTLA4Igタンパク質、および融合ハイリッドタンパク質、例えば、CD28Ig/CTLA4Igを後述するように種々の系の中で発現することができる。cDNAを適当な制限酵素切り出し、そしてこのような発現について適当な原核生物または真核生物の発現ベクターの中に結合することができる。CD28およびCTLA4レセプターのタンパク質は天然に2量体として存在するので、これらのタンパク質の首尾よい発現はこれらのタンパク質を2量体として形成することを可能とする発現系を必要とすると信じられる。これらのタンパク質の切頭バージョン(すなわち、タンパク質のトランスメンブレン領域より上流の位置において配列の中に停止コドンを導入することによって形成される)は発現されると思われない。CD28およびCTLA4レセプターの融合タンパク質としての発現は、これらのタンパク質の2量体の形成を可能とする。こうして、CTLA4タンパク質の融合生産物としての発現は、本発明において好ましい。

0054

チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA4Ig−24と表示する本発明の安定なCHO 系はCTLA4Igの発現のために好ましく、そしてブダベスト条約の規定に従いATCCに1991年5月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号10762 を与えられた。本発明のCTLA4レセプターの発現は、細胞系、例えば、COS 細胞をトランスフェクションし、そしてCTLA4トランスフェクションした細胞をCTLA4レセプターに結合することによって、例えば、細胞のB7Ig融合タンパク質への結合について経験することによって、発現を検出して達成される。

0055

生ずる構成体の配列は、既知の手順、例えば、Sangerら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74 : 5463 (1977) に記載されている、さらにMcssing ら、Nucleic AcidsRes. 9 : 309 (1981) に記載されている手順を使用するDNA の配列決定によるか、あるいはMaxam ら、Mcthods Enzymol. 65 : 499 (1980)の方法により確証される。

0056

タンパク質生産物の回収
前述したように、CD28およびCTLA4レセプターの遺伝子は、切頭タンパク質をコードするDNA の直接の発現を使用して成熟タンパク質として容易に発現されない。ホモ2量体の形成を可能とするために、CD28およびCTLA4の細胞外ドメインに相当し、そしてシグナル配列、例えば、適当なプロセシングを行うことができる細胞中のオンコスタチインMの配列のためのコドンを含むアミノ酸配列をコードするDNA を、天然に2量体のタンパク質のFcドメインに相当するアミノ酸配列をコードするDNA と融合する。こうして、細胞から分泌された後のこれらの融合タンパク質の生産物の精製は、融合タンパク質の抗免疫グロブリン部分と反応性の抗体を使用して促進される。融合タンパク質の生産物は、培地の中に分泌されると、タンパク質の標準的精製技術、例えば、プロテインAカラムへの適用により回収される。

0057

使 用
CTLA4Ig融合タンパク質および/またはその融合タンパク質の断片を使用してB7陽性細胞、例えば、B細胞と反応させて、B7抗原陽性細胞とのT細胞の相互作用により仲介される免疫応答を調節することができる。CTLA4Ig融合タンパク質およびCTLA4Ig/CD28Igハイブリッドタンパク質、および/またはこれらのタンパク質の断片および誘導体を、また、使用して、B7陽性細胞、例えば、B細胞と反応させて、T細胞依存性B細胞の応答により仲介される免疫応答を調節することができる。用語「断片」は、ここにおいて使用するとき、「CTLA4」と呼ぶタンパク質をコードするアミノ酸配列の部分を意味する。使用できるCTLA4Ig融合のタンパク質の断片は、ここに記載するCTLA4Ig融合タンパク質を得るために使用するCTLA4レセプターに相当するアミノ酸配列のある部分に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

0058

活性化されたB細胞および他の系統の細胞上で発現されたB7抗原、およびT細胞上で発現されたCD28レセプターを互いに直接結合することができ、そしてこの相互作用は細胞−細胞の相互作用を仲介することができる。このような相互作用は、T細胞の増殖、および免疫グロブリン生産細胞へのB細胞の分化に導く、T細胞の中のCD28活性化経路を直接トリガーする。起こるB細胞の活性化は、B7抗原の発現を増加し、さらにCD28を刺激して、慢性の炎症の状態、例えば、自己免疫疾病異種移植拒絶移植片対宿主の疾患または慢性のアレルギー反応に導くことがある。この反応をブロックまたは阻止することは、T細胞のサイトカインの調製を防止し、こうして炎症反応を防止または逆転するとき有効であることがある。

0059

CTLA4Igは、ここにおいて、T細胞およびB細胞の相互作用を必要とするin vitroリンパ球機能の効力のあるインヒビターであることが示された。これはB7抗原およびその対レセプター、CTLA4および/またはCD28の間の相互作用の重要性を示す。ネズミおよびヒトのCTLA4の細胞質ドメインは類似し(Dariavach ら、前掲、1988)、この領域が重要な機能的性質を有することを示唆する。また、CD28およびCTLA4の細胞質ドメインは相同性を共有する。

0060

CTLA4は、抗BB1または抗CD28モノクローナル抗体よりも、いっそう効力のあるリンパ球の応答のin vitroインヒビターである。CTLA4Igは、その阻止作用と反作用するT細胞の増殖に対する直接の刺激作用をもたない。したがって、CTLA4Ig融合タンパク質は抗CD28モノクローナル抗体よりもすぐれたin vivo インヒビターとして働くことができる。CTLA4Igのin vitro免疫抑制作用は、異常なT細胞の活性化またはIgの生産を包含する自己免疫疾患の処置の治療におけるその使用を示唆する。

0061

CTLA4Ig融合タンパク質は、in vivo 阻止性質を示すことが期待された。こうして、CTLA4Igは、同様なin vivo 条件下に抗CD28抗体について観察される作用に類似する方法で、T細胞を阻止する作用をすることが期待される。T細胞/B細胞の相互作用がT細胞とB細胞との間の接触の結果として起こる条件下に、B7抗原陽性細胞、例えば、B細胞と反応させために導入されたCTLA4Igの結合は、T細胞/B細胞の相互作用を妨害、すなわち、阻止して免疫応答の調節を生ずることができる。この独占的な阻止作用のために、CTLA4Igは生体内でT細胞の活性のインヒビターとして、非特異的インヒビター、例えば、シクロスポリンまたはグルコステロイドよりも有用であることが期待される。

0062

1つの態様において、CTLA4Ig融合タンパク質またはCTLA4Ig/CD28Igハイブリッドタンパク質は、適当な製剤学的担体と組み合わせてin vivo 導入する、すなわち、病理学的状態、例えば、免疫系の疾患または癌の処置のためにヒトの投与することができる。融合タンパク質のin vivo 導入は、T細胞と他の細胞、例えば、B細胞との相互作用を、B7陽性細胞へのリガンドの結合の結果として、妨害することが期待される。正常のT細胞の相互作用の防止は、T細胞の活性を減少し、例えば、T細胞の増殖を減少することができる。

0063

さらに、融合タンパク質のin vivo投与はサイトカインのin vivoレベルの調節して被検体において所望の作用を促進することが期待され、ここでサイトカインは次のものを包含するが、これらに限定されない:インターロイキン、例えば、インターロイキン(「IL」)−2,IL−3,IL−4,IL−6,IL−8,成長因子、例えば、腫瘍成長因子(「TFG 」)、コロニー刺激因子(「CSF」)、インターフェロン(「IFN」)および腫瘍壊死因子(「TNF 」)。例えば、融合タンパク質をin vivo 導入するとき、それは悪性の増殖、例えば、腫瘍細胞の増殖に寄与するサイトカインの生産をブロックすることができる。融合タンパク質は、また、T細胞の活性化に依存するウイルス、例えば、エイズを引き起こすウイルス、HTLV1の増殖をブロックすることができる。

0064

ある環境下に、前述したように、CTLA4Ig融合タンパク質またはその断片のinvivo投与の作用は阻止であり、T細胞/B細胞の接触から生ずるCTLA4およびCD28のトリガーの融合タンパク質によるブロッキングから生ずる。例えば、CTLA4Igタンパク質はT細胞の増殖をブロックすることができる。こうして、CTLA4Ig融合タンパク質のin vivo 導入は、T細胞およびB細胞の両者が仲介する免疫応答に対する作用を生成するであろう。また、融合タンパク質をサイトカインまたは他の治療用試薬の導入と組み合わせて被検体に投与することができる。

0065

本発明の追加の態様において、CTLA4Ig融合タンパク質またはCTLA4レセプターと反応性の誘導体を包含する他の試薬を使用してT細胞の相互作用を調節する。例えば、CTLA4レセプターと反応性の抗体および/または抗体断片をスクリーニングして、B7抗原へのCTLA4Ig融合タンパク質の広いスペクトルのを阻止することができるものを同定することができる。次いで、抗体または抗体断片、例えば、FabまたはF(ab′)2 断片を使用して、例えば、T細胞と反応させてT細胞の増殖を阻止することができる。

0066

CTLA4レセプターと反応性のモノクローナル抗体は、既知の手順、例えば、KohlerおよびMilstein (KohlerおよびMilstein, Nature, 256 : 495-97 (1975))により導入された手順、およびその変更により生成して、細胞の相互作用を調節することができる。

0067

これらの技術は、特定の抗体を生産するようにプライミングした動物の使用を包含する。動物は免疫原(例えば、B7Ig融合タンパク質、CTLA4Ig融合タンパク質またはCD28Ig/CTLA4Igハイブリッド融合タンパク質)の注入によりプライミングして、所望の免疫応答、すなわち、プライミングされた動物からの抗体の生産を引き出すことができる。また、プライミングされた動物は疾患を発現する動物である。

0068

プライミングされた病気の動物のリンパ節脾臓または末梢血液から誘導化されたリンパ球を使用して、特定の抗体を探索することができる。所望の免疫グロブリンをコードするリンパ球の染色体を、一般に融合剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)の存在下に、リンパ球を骨髄腫細胞と融合することによって、永久分裂能化する。ある数の骨髄腫細胞系、例えば、P3−NS1/1−Ag4−1,P3−x63−Ag8,653, Sp2/0−Ag14、またはHLI-653骨髄腫系統の任意のものを、標準的技術に従い、融合相手として使用することができる。これらの骨髄腫系統はATCC(米国マリイランド州ロックビレ)から入手可能である。

0069

次いで、所望のハイブリドーマを包含する生ずる細胞を選択培地、例えば、HAT培地の中で成長させ、ここで未融合の親の骨髄腫またはリンパ球の細胞は究極的に死亡する。ハイブリドーマ細胞のみは生き残り、そして制限希釈の条件下に成長して単離されたクローンを得ることができる。ハイブリドーマの上澄み液を、例えば、免疫化に使用したCTLA4Igタンパク質を使用するイムノアッセイ技術により、所望の選択性の存在についてスクリーニングする。次いで、陽性のクローンを制限希釈の条件下にサブクローニングし、そして生成したモノクローナル抗体を単離することができる。

0070

モノクローナル抗体の単離および精製の種々の普通の方法を使用して、他のタンパク質および汚染物質を含有しない抗体を得ることがてきる。モノクローナル抗体を精製する普通に使用されている方法は、硫酸アンモニウム沈澱イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーを包含する(Zolaら、Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, Hurell編、p. 51-52 (CRCPress, 1982 を参照のこと)。これらの方法に従い生産されたハイブリドーマは、この分野において知られている技術を使用してin vitroまたはin vivo (腹水の中で)増殖することができる(一般に、Finkら、Prog. Clin. Pathol., 9 : 121-33 (1984), Fig. 6-1, p. 123 を参照のこと)。

0071

一般に、個々の細胞系を、例えば、実験室用容器の中でin vivo 増殖させ、そして高い濃度の単一の特定のモノクローナル抗体を含有する培地をデカンテーション濾過または遠心により収穫することができる。さらに、CTLA4レセプターの細胞外ドメインと反応性の活性結合領域を含有するこれらの抗体の断片、例えば、Fab,F(ab′)2 およびFv断片を生成することができる。このような断片は、この分野においてよく確立された技術を使用して生成することができる(例えば、Rousseaux ら、MethodsEnzymol. 121 : 663-69, Academic Press (1986) を参照のこと)。

0072

前述したようにして調製した抗B7モノクローナル抗体を使用してB7抗原に結合させて、CD28陽性またはCTLA4陽性のT細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することができる。抗CTLA4モノクローナル抗体を使用してCTLA4レセプターと結合させて、CTLA4陽性T細胞と他の細胞との相互作用を阻止することができる。他の態様において、CTLA4Ig融合タンパク質を使用して、CTLA4とB7抗原との間の相互作用を調節できる追加の化合物を同定することができる。このような化合物は、B細胞および/またはT細胞と反応させるために使用できる天然に見いだされる小さい分子を包含することができる。例えば、発酵ブロスをCTLA4/B7の相互作用を阻止する能力について試験することができる。

0073

さらに、前述のCTLA4Ig融合タンパク質の誘導体を使用してT細胞の増殖を調節することができる。例えば、断片または誘導体を使用して、異種移植の骨髄移植に伴う移植片対宿主(GVH)の疾患におけるT細胞の増殖をブロックすることができる。CD28仲介T細胞増殖経路は、CD3/T細胞のレセプター複合体により与えれる増殖(Juneら、1987、前掲)と対照的に、シクロスポリン耐性である。シクロスポリンはGVH 疾患のための処置として比較的無効である(Storb, Blood68 : 119-125 (1986)) 。GVH 疾患は、CD28抗原を発現するTリンパ球により仲介されると考えられる(Storb およびThomas, Immunol. Rev. 88:215-238 (1985)) 。こうして、CTLA4Ig融合タンパク質は、単独で、あるいは免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンと組み合わせて、GVH 疾患におけるT細胞の増殖のブロッキングに有用であることができる。

0074

こうして、B細胞を包含するB7陽性細胞とのCTLA4陽性T細胞の相互作用の本発明の方法による調節を使用して、病理学的状態、例えば、自己免疫性、移植、感染症および新形成を処置することができる。次の実施例によって、本発明をさらに説明しかつ当業者による本発明の実施および使用を助ける。これらの実施例は本発明を限定しない。

0075

例 1
B7Ig及びCD28Ig融合タンパク質の調製
レセプター−免疫グロブリンCγ(IgCγ)融合タンパク質B7Ig及びCD28Igを、本発明において引用により組込まれる、Linsley など., J. Exp. Med. 173 :721 〜730 (1991)により記載されているようにして調製した。簡単に言えば、それぞれのレセプタータンパク質(たとえばB7)に対応するアミノ酸配列をコードするDNA を、ヒトIgCγ1のヒンジ、CH2及びCH3領域に対応するアミノ酸配列をコードするDNA に連結した。これは次のようにして達成される。

0076

ポリメラーゼ鎖反応(PCR)。PCR のために、DNAフラグメントを、個々の融合タンパク質について下記のようにしてプライマー対を用いて増幅した。PCR 反応(0.mlの最終体積)を、Tag ポリメラーゼ緩衝液(Stratagene, La Jolla, CA)において行ない、ここで前記緩衝液は、個々のdNTP20μモル;前記に示されたプライマー50〜100 pモル;鋳型(引用により本明細書において組込まれる、Kauasaki, PCR Protocols, Academic Press, 21 〜27ページ(1990)により記載されるようにして、ランダムヘキサマープライマーを用いて合計≦1μgのRNA から合成されたプラスミド又はcDNA1ng);及びTag ポリメラーゼ(Stratagene)を含んだ。反応は、16〜30回のサイクル(典型的なサイクルは、94℃で1分、50℃で1〜2分及び72℃で1〜3分の段階から成る)のためにサーモサイクラー(Perkin Elmer Corp. Norwalk, CT) 上で行なわれた。

0077

プラスミドの構成。Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573 (1987)により記載されるような、CD28をコードするcDNAを含む発現プラスミドが、Drs. Aruffo and Seed (Mass General Hospital Boston, MA)により供給された。Aruffo, Cell 61 : 1303(1990)により記載されるような、CD5をコードするcDNAを含むプラスミドがDr. Aruffoにより供給された。Freeman など.,J.Immunol. 143 : 2714 (1989) により記載されるような、B7をコードするcDNAを含むプラスミドは、Dr. Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA)により供給された。

0078

CD28及びB7の可溶性形の発現での初期試みのために、構成体をLinsley など.,J. Exp. Med.,前記により記載されているようにして製造し(OMCD28及びOMB7)、ここで停止コドンがトランスメンブランドメインの上流に導入され、そして生来のシグナルペプチドがオンコスタチインM(oncostatin M)(Malik など., Mol. Cell Biol. 9 : 2847 (1989)) からのシグナルペプチドにより置換された。それらは、再構成のための合成オリゴヌクレオチド(OMCD28)を用いて又はPCRのためのプライマー(OMB7)として製造された。OMCD28は、シグナルペプチドをオンコスタチインMからの類似領域により置換することによってより効果的な発現のために変性されたCD28cDNAである。CD28Ig及びB7Ig融合構成体を2つに分けて製造した。

0079

5′部分を、鋳型としてOMCD28及びOMB7及び前方プライマーとしてオリゴヌクレオチド、
CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC
(配列番号1)(オンコスタチインMシグナルペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする)及び逆方向プライマーとして
TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA (配列番号2)
又は、TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT (配列番号3)
のいづれかをそれぞれ用いて製造した。PCR反応の生成物を、PCR プライマーに導入される部位として制限エンドヌクレアーゼ(HindIII 及びBcl I)により切断し、そしてゲル精製した。

0080

ヒトIgCγ1配列に対応する融合構成体の3′部分を、鋳型として、ヒト−マウスキメラmAB L6を生成する骨髄細胞系(Dr. P. Fell and M. Gayle, Bristol-Myers Squibb Conyany, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA により供給される)からのRNA を用いて、連結された逆転写酵素(トリ骨髄ウィルスからの;Life Sciences Associates, Bayport, NY)-PCR反応により製造した。

0081

オリゴペプチド、すなわちAAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG(配列番号4)を前方プライマー及びCTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (配列番号5)を逆方向プライマーとして使用した。反応生成物をBal I及びXba Iにより切断し、そしてゲル精製した。最終生成物を、IgCγ1配列を含む、Bcl I/Xba I切断されたフラグメントと共に、CD28又はB7配列を含む、HindIII /Bcl I切断されたフラグメントを、HindIII /Xba I切断されたCD28中に連結することによってアセンブリーした。連結生成物を用いてMC1061/p3 E.コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドのためにスクーンした。得られた構成体の配列を、DNA配列決定により確認した。

0082

B7をコードする構成体は、B7の細胞外ドメインの約1位〜約215 位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNを含んだ。CD28をコードする構成体は、CD28の細胞外ドメインの約1位〜約134 位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNA を含んだ。

0083

CD5Igを、前方プライマーとしてCATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (配列番号6)及び逆方向プライマーとしてATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC (配列番号7)を用いて、同じ態様で構成した。PCR生成物を制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして上記のようにしてIgCγ1フラグメントにより連結した。得られた構成体(CD5Ig)は、CD5に対応する配列の1位〜347 位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する成熟タンパク質、前記構成工程により導入された2つのアミノ酸(アミノ酸DQ)、次にIgCγ1領域に対応するアミノ酸をコードするDNA をコードした。

0084

細胞培養及びトランスフェクション。COS(モンキー腎細胞)を、引用により本発明に組込まれる、Seed and Aruffo (Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 3365 (1987))の方法の変法を用いて、CD28及びB7を発現する発現プラスミドによりトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクトする18〜24時間前、10cmの直径の培養皿当たり106 個で接種した。プラスミドDNA を、0.1mMのクロロキン(cloroquine) 及び600 μg/mlのDEAEDextranを含む血清フリーDMEM5mlに添加し(約15μg/皿)、そして細胞を37℃で3〜3.5時間インキュベートした。

0085

次に、トランスフェクトされた細胞をすぐに、PBS中、10%ジメチルスルホキシドにより処理し(約2分)、そして10%FCSを含むDMEMにおいて37℃で16〜24時間インキュベートした。トランスフェクションの24時間後、培養培地を除去し、そして血清フリーDMEMにより変換した(6ml/皿)。インキュベーションを37℃で3時間続け、この時点で、古い培地を集め、そして新鮮血清フリー培地を添加した。37℃でさらに3日後、古い培地を再び集め、そして細胞を捨てた。

0086

CD28,CD5又はB7を発現するCHO細胞を、次の通りに、Linsley など., (1991) 前記により記載されるようにして単離した:簡単に言及すれば、CD28,CD5又はB7を発現する安定したトランスフェクタントを、適切な発現プラスミド及び選択マーカー、pSV2dhfr(Linsleyなど., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 87 : 5031(1990))の混合物によるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣(dhfr- CHO)細胞の同時トランスフェクションの後次に、トランスフェクトを、1μMの最終レベルまでメトトレキヤートの徐々に高まる濃度で増殖し、そして10%ウシ胎児血清(FBS)、0.2mMのプロリン及び1μMのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持した。

0087

高レベルのCD28(CD28+ CHO)又はB7(B7+ CHO)を発現するCHO 系を、mAbs9.3又はBB−1による間接的な免疫染色に従って、複数回の螢光活性化細胞ソーチングFACS(R))により単離した。CD28又はB7の表面発現のために陰性の増幅されたCHO細胞をまた、CD28−トランスフェクトされた集団からFACS(R)により単離した。

0088

免疫染色及びFACS(R)分析。トランスフェクトされたCHO 又はCOS細胞又は活性化されたT細胞を、間接的免疫染色法により分析した。染色の前、CHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBSにおけるインキュベーションによりそれらの培養器から除去した。細胞をまず、ネズミmAbs9.3(Hansenなど., Immunogenetics 10 :247 (1980))又はBB−1(Yokochi など., J. Immunol. 128 : 823 (1981))と共に、又はIg融合タンパク質(10%のFCSを含むDMEMにおいて10μg/mlで)と共に4℃で1〜2時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、そしてさらに05〜2時間、4℃で、FITC−接合の第2段階試薬(ネズミmAbsのためにヤギ抗−マウスIg血清又は融合タンパク質のためにヤギ抗−ヒトIgCγ血清(Tago, Inc.,Burlingama, CA))と共にインキュベートした。螢光を、40対数増幅器(four decade logarithmic amplifier) を備えたFACS IV(R)細胞ソーター(Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA )上で分析した。

0089

Ig融合タンパク質の精製。トランスフェクトされたCOS細胞からの古い血清フリー培養培地の第1,第2及び第3回収集物を、Ig融合タンパク質の精製のための源として使用した。高速遠心分離により細胞残物を除去した後、培地を、0.05Mのクエン酸ナトリウム溶液(pH8.0)により平衡化された、固定されたプロテインA(Repligen Corp., Cambridge, MA)のカラム(約200 〜400 mlの培地/ml充填層体積)に適用した。その培地の適用の後、カラムを1μのリン酸カリウム溶液(pH8)により洗浄し、そして結合されたタンパク質を0.05Mのクエン酸ナトリウム溶液(pH3)により溶出した。

0090

画分を集め、そしてすぐに、2Mのトリス(pH8)1/10体積の添加により中和した。A280吸収材料ピークを含む画分をプールし、そして使用の前、PBSに対して透析した。それぞれCD28Ig及びB7Igのための吸光係数は、既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により2.4及び2.8nl/mgであった。精製されたCD28Ig及びB7Ig結合活性回収率は、B7+ 及びCD28+ CHO細胞の間接的な螢光染色の後、FACS(R)分析により判断される場合、ほぼ定量的であった。

0091

例 2
CTLA4Ig融合タンパク質の調製
CTLA4の細胞外ドメインとIgCγ1ドメインとの間にCTLA4Igをコードする可溶性遺伝子融合体を、CD28Ig構成体についての上記方法に類似する方法で構成した。CTLA4遺伝子の細胞外ドメインを、公開された配列(Dariarach など., Eur. Jour. Immunol. 18 : 1901〜1905 (1988))に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRによりクローン化した。

0092

CTLA4のためのシグナルペプチドはCTLA4遺伝子において同定されていないので、CTLA4の示された配列のN−末端を、オーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて2段階で、オンコスタチインM(Melik など., Mol. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989))のシグナルペプチドに融合せしめた。第1段階に関しては、オリゴヌクレオチド、CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC (配列番号8)(CTLA4のN末端側の7個のアミノ酸に融合されるコンスタチンMシグナルペプチドからのC末端側の15個のアミノ酸をコードする)を、前方プライマーとして、及びTTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (配列番号9)(Bcl I制限酵素部位を含み、そしてCTLA4レセプターをコードするアミノ酸配列のアミノ酸残基119 〜125 をコードする)を逆方向プライマーとして使用した。

0093

この段階のための鋳型は、H38細胞(Drs. Salahudin and Gallo,NCI, Bethesda, MDにより供給されるHTLVII感染性T細胞白血球細胞系)からの合計1μgのRNA から合成されたcDNAであった。第1段階からのPCR生成物の一部を、オンコスタチインMシグナルペプチドのN末端部分をコードし、そしてHindIII制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオーバーラップ前方プライマー、CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC(配列番号10)及び同じ逆方向プライマーを用いて再増幅した。PCR 反応の生成物をHindIII 及びBcl Iにより消化し、そしてBcl I/Xha Iにより切断された、IgCγ1のヒンジ、CH2およびCH3領域に対応するアミノ酸配列をコードするcDNAフラグメントと共に、HindIII /Xha I切断された発現ベクター、CDM8又はHindIII /XbaI切断された発現ベクター、πLN(Dr. Aruffoにより供給される)中に連結した。

0094

得られたCTLA4Ig融合構成体の地図は図1に示される。その図に示される配列は、CTLA4(上方の文字、黒くない部分)とコンスタチンMのシグナルペプチドSP(黒い部分)及びIgCγ1のヒンジH(点描模様の部分)との間の連結を示す。括弧内のアミノ酸は、構成の間に導入された。星印(★)は、IgCγヒンジ領域に導入されたシステインセリン変異を示す。CTLA4に存在する免疫グロブリンスーパーファミリーV−株ドメインは、IgCγ1のCH2及びCH3ドメインであるように示される。

0095

次に、CTLA4Igを含む発現プラスミド、CDM8を、Seed and Aruffo, 1987, 前記により記載される方法の変法(Linsley など., 1991,前記)により、DEAE/テキストラントランスフェクションを用いてCOS細胞中にトランスフェクトした。CTLA4Igのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む発現プラスミド構成体(πLN又はCDM8)を、標準方法を用いてのリポフェクションによりdhfr- CHO 系中にトランスフェクトし、CTLA4Igを安定して発現する新規細胞系を得た。CTLA4Igに対応するアミノ酸配列をコードするDNA は、1991年5月31日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そしてATCC受託番号68629 を得た。

0096

チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA4Ig−24と称する、CTLA4Igを発現する好ましい安定性のトランスフェクタントを、免疫染色法を用いて、培地におけるB7結合活性についてB7陽性CHO 細胞系をスクリーンすることによって製造した。トランスフェクタントは、10%ウシ胎児血清(FBS)、0.2mMのプロリン及び1μMのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持された。CTLA4Ig−24CHO 細胞系は、1991年5月31日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そしてATCC受託番号10762 を得た。

0097

CTLA4Igを、血清フリーに条件付けられた上清液からプロテインAクロマトグラフィー処理により精製した(図2)。CTLA4Igの濃度を、280 nmで1.6の吸光係数(既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により実験的に決定された)を仮定して、決定した。CTLA4Igのサンプル(1μg)(レーン2及び4)及び分子量標準(レーン1及び3、図2)を、非還元条件(−βME、レーン1及び2)又は還元条件(+βME、レーン3及び4)下でSDS-PAGE(4〜12%のアクリルアミドグラジエント)にゆだねた。タンパク質は、クーマシーブリリアドブルーによる染色により可視化された。

0098

非還元条件下で、CTLA4IgはMrが約100,000 である種として移動し、そして還元条件下でそれは、Mrが約50,000である種として移動した(図2)。IgCγヒンジのジスルフィドが構成の間に排除されたので、CD28IgのようなCTLA4Igは、生来のジスルフィド結合を通してたぶん連結されたダイマーである。

0099

例 3
CTLA4レセプター
十分な長さのヒトCTLA4遺伝子に対応するアミノ酸をコードするDNA を再構成するために、CTLA4のトランスメンブラン及び細胞質ドメインのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAを、PCRによりクローン化し、そして次に、CTLA4のN−末端に融合されるオンコスタチンMシグナルペプチドに対応する、CTLA4Igからのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAにより連結した。PCR のための方法、及び細胞培養及びトランスフェクションは、COS細胞及びDEAE−デキストラントランスフェクションを用いて、例1に記載されている通りであった。

0100

ヒトリンパ球細胞におけるCTLA4レセプタータンパク質の発現はこれまで報告されていないので、CTLA4mRNAの源を示す必要はなかった。上記に示されるような、H38 細胞の全体の細胞RNA から逆転写されるPCRcDNAを、PCR によるクローニングのために使用した。この目的のためには、オリゴヌクレオチド、GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (配列番号11)(推定されるコード配列に初めの11個のアミノ酸をコードする)を、前方プライマーとして及び逆方向プライマーとして、TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (配列番号12)CTLA4における最後の8個のアミノ酸に相同であり、且つXba I部位を含む)を使用した。

0101

鋳型は再び、H38細胞からの1μgのRNA から合成されたcDNAであった。PCR反応の生成物を制限エンドヌクレアーゼNco I及びXba Iにより切断し、そして得られた316 bpの生成物をゲル精製した。上記CTLAIg融合からの340 bpのHindIII /Nco Iフラグメントをまたゲル精製し、そして両制限フラグメントを、HindIII /Xba I切断されたCDM8中に連結し、OMCTLAを形成した。

0102

得られる構成体は、完全な長さのCTLA4(配列番号13及び14)及びオンコスタチンMシグナルペプチドに対応した。その構成体は図3に示され、そしてOMCTLA4と称した。図3に示されるCTLA4のための配列は、示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置111 でのこれまで達告されたアラニントレオニンをコードするような塩基変化により、推定されるヒトCTLA4DNA 配列(Dariavach など.,前記)とは異なる。このトレオニンは、融合タンパク質の好結果をもたらす発現のために重要である、新しく同定されたN−連結グリコシル化部位の一部である。連結生成物を用いて、MC1061/p3 E.コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドについてスクリーンした。得られる構成体の配列を、DNA配列分析により確かめた。

0103

例 4
CTLA4Igの特徴化
CTLA4Ig構成体を特徴づけるために、いくつかの単離体、CD28Ig,B7Ig及びCD5Igを上記のようにして調製し、そして例2及び3に記載されるようにしてCOS細胞をトランスフェクトし、そしてB7Igの結合のためにFACS(R)分析により試験した。上記構成体の他に、Aruffo and Seed (EMBO Jour. 6 : 3313〜3316 (198)) により記載されるようなCD7をコードするcDNAを含むCDM8プラスミドをまた使用した。

0104

mAbs.ネズミモノクローナル抗体(mAba)9.3(抗−CD28)及びG19-4(抗−CD3)、G3−7(抗−CD7),BB−1(抗−B7抗原)及びラットmAb 187.1(抗−マウスK鎖)はこれまで記載されており(Ledbetter など., Pruc. Natl. Acad.Sci. 84 : 1384 〜1388 (1987) ; Ledbetter など., Bloud 75 : 1531 (1990); Yokochi など.,前記)、そして使用の前、腹水から精製した。mAb OKT8を生成するハイブリドーマをATCC, Rockville, MD から得、そしてmAb をまた、使用の前、腹水から精製した。mAb 4G9(抗−CD19)は、Dr. E. Engleman (StanfurdUninersity, Palo Altu, (A)により提供された。精製されたヒト−マウスキメラmAb L6(ヒトCγ1Fc部分を有する)は、Dr. P. Fell and M. Gayle (Bristal-Myers Squibb Pharmacentical Research Institute, Seattle, WA) の贈与である。

0105

免疫染色及びFACS(R)分析。染色の前、COS 又はCHO細胞を、10mMのEDTAを含むPBSにおいてインキュベートすることによってそれらの培養容器から除去した。細胞をまず、mAbs又はIg融合タンパク質と共に、10%FBSを含むDMEMにおいて10μg/mlで4℃で1〜2時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、そしてFITC−接合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン又はFITC−接合ヤギ抗−ヒトIgCγ血清(両者とも、Tago, Burlingam, CA からである)と共に、4℃でさらに0.5〜2時間インキュベートした。両mAbs及びIg融合タンパク質の結合が同じ実験において測定される場合、FITC−接合抗−マウス及び抗−ヒト第2段階試薬を、使用の前、一緒に混合した。合計10,000個の細胞に基づく螢光を次に、FACS(R)により分析した。

0106

末梢血液リンパ球分離及び刺激。末梢血液リンパ球(PBLs)を、リンパ球分離媒体(Litton Bionetics, Kensington, MD) を通しての遠心分離により単離した。アロ反応性T細胞を、一次混合リンパ球反応(MLR)におけるPBL の刺激により単離した。PBL を、106 /mlの照射された(5000ラド)T51 LCL で培養した。EBV-形質転換リンパ球芽細胞系(LCL),PM(Bristol-Myers Squibb Co.) 及びT51(Bristol-Myers Squibb Co.)を、10%FBSにより補充されたRPMIに維持した。6日後、アロ反応性“幼芽”細胞を凍結保存した。

0107

二次MLR を、mAbs及びIg融合タンパク質の存在及び不在下で、新鮮な照射T51LCL と共に融解されたアロ反応性幼芽を培養することによって行なった。細胞を、10%FBSを含むRPMIを有する96ウェル平底プレート(0.2mlの体積、4×104個のアロ反応性幼芽及び1×104 個の照射T51 LCL 細胞/ウェル)において培養した。四重培養物の細胞増殖を、2〜3日の培養の最後の6時間、〔 3H〕−チミジンの摂取により測定した。

0108

PHA-活性化されたT細胞を、1μg/mlのPHA (Wellcome, Charlotte,NC)と共にPBLを5日間、培養することによって、及びPHA を欠く培地において1日間、培養することによって調製した。生存細胞を、使用の前、リンパ球分離媒体を通しての沈殿により集めた。細胞をmAbsにより刺激し、又はCHO 細胞により37℃で4〜6時間トランスフェクトせしめ、遠心分離により集め、そしてRNA を調製するために使用した。

0109

CD4+ T細胞を、健康なドナーからのPBLを、羊赤血球ロゼット技法を用いてT及び非−T細胞に分離し、そしてさらに、Damle など., J. Immunol. 139 : 1501 (1987)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるようにCD4+細胞をパンニングすることによりT細胞を分離することによってPBLsから単離した。B細胞をまた、抗−CD19mAb 4G9 を用いて、Wysocki and Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. 75 : 2844 (1978)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるようにパンニングすることにより末梢血液から精製した。

0110

Th −誘発されたIg生成を測定するために、106 個のCD4+ T細胞を、10%のFBSを含むRPMI1mlにおいて106 個のCD19+B細胞と共に混合した。37℃での6日間の培養に続いて、ヒトIgMの生成を、Volkman など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2528 (1981)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるようにして固相ELISAを用いて培養上清液において測定した。簡単に言及すれば、96−ウェル平底マイクロタイターELISAプレート(Corning, Corning, NY)を、10μg/mlのアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG又はIgM 抗体(Tago, Burlingame, CA) を含む200 μl/ウェルの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)により被覆し、4℃で一晩インキュベートし、そして次に、PBSにより洗浄し、そしてウェルをさらに、PBS 中、2%BSA (BSA-PBS) によりブロックした。

0111

アッセイされるべきサンプルを、それらのウェルに適切な希釈度で添加し、そして200 μl/ウェルの1:1000希釈度のアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG又はIgM抗体(Tago)のホスラディシュペルオキシダーゼ(HRP)−接合F(ab′)2 画分と共にインキュベートした。次に、プレートを洗浄し、そして100 μl/ウェルのo−フェニレンジアミン(Signa Chemical Co., St. Louis,MO)溶液(pH5のクエン酸リン酸緩衝液ml当たり0.6ng及び0.045 %の過酸化水素)を添加した。色の進行を、2Nの硫酸により止めた。

0112

490 nmでの吸光度を、自動ELISAプレートリーダーにより測定した。試験及び対照サンプルは3通り行なわれ、そして吸光度の値を、培養上清液におけるIgの濃度が定量化される標準曲線を生成するために、上清液サンプルにより同時に行なわれた既知のIgG又はIgM標準により得られた値と比較した。データを、三重反復又は四重反復培養物のIg±SEMのng/mlとして表わされる。

0113

免疫沈殿分析及びSDS PAGE。細胞を、125Iにより表面ラベル化し、そして免疫沈殿分析にゆだねた。簡単に言及すれば、PHA-活性化されたT細胞を、Vitettaなど., J. Exp. Med. 134 : 242 (1971)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されるように、ラクトペルオキシターゼ及びH2O2を用いて125Iにより表面ラベル化した。SDS-PAGEクロマトグラフィー処理を、5%のアクリルアミドの積み重ねゲルを有する直線アクリルアミドグラジエントゲル上で行なった。ゲルをクーマシーブルにより染色し、脱色し、そして写真を取り、又は乾燥せしめ、そしてX線フィルム(Kodak XAR-5)に露光せしめた。

0114

結合アッセイ。B7Igを、約2×106cpm/pモルの比活性に125Iによりラベルした。96のウェルのプラスチック皿を、CTLA4Ig(10mMのトリス(pH8)0.05mlの体積において0.5μg)を含む溶液により16〜24時間、被覆した。ウェルを、競争体の存在又は不在下で、125I B7Ig(約5×105 cpm)を含む溶液(0.09ml)の添加の前、結合緩衝液(50mMのBES(Sigma Chemical Co), pH6.8,0.1%BAS及び10%FCSを含むDMEM) によりブロックした。23℃で2〜3時間のインキュベーションに続いて、ウェルを結合緩衝液により1度洗浄し、そしてPBSにより4度洗浄した。次に、結合された放射能を0.5NのNaOHの添加により溶解し、そしてr計数により定量化した。

0115

B7Igへの結合。完全なヒトCTLA4DNA 遺伝子をコードするOMCTLA4構成体の官能多活性が、図4に示される実験に示される。COS細胞を、上記のようにして発現プラスミドCD7,OMCD28及びOMCTLA4によりトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を集め、そして培地のみ(添加なし)と共に又はmAbs 9.3,B7Ig,CD5Ig又はG3−7と共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、そして結合性を、FITC−接合ヤギ抗−マウスIg及びFITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第2段階試薬の混合物により検出した。トランスフェクトされた細胞を、間接的免疫染色法により適切な細胞表面マーカーの発現について試験し、そして螢光を上記のようにしてFACS(R)分析を用いて測定した。

0116

図4に示されるように、mAb 9.3は、CD28−トランスフェクトされたCOS細胞に結合したが、しかしCTLA4−トランスフェクトされる細胞には結合しなかった。対照的に、B7Ig融合タンパク質(但し、対照のCD5Ig融合タンパク質ではない)は、CD28−及びCTLA4−トランスフェクトされた細胞の両者に結合した。CD7−トランスフェクトされたCOS 細胞は、mAb 9.3にも融合タンパク質のいづれにも結合しなかった。これは、CD28及びCTLA4の両者がB細胞活性化抗原、B7を結合することを示唆する。さらに、mAb 9.3は検出できるほどは、CTLA4を結合しなかった。

0117

B7陽性CHO細胞上へのCTLA4Igの結合。CTLA4Ig及びB7の結合をさらに特徴づけるために、B7+ CHO 細胞及びリンパ芽球細胞系(PMLCL)上への精製されたCTLA4Igの結合活性を、図5に示される実験において測定した。増幅された、トランスフェクトされたCHO 細胞系及びPM LCLを、培地のみ(添加なし)又はCD5Ig,CD28Ig又はCTLA4Igの同濃度のヒトIgCγ1−含有タンパク質(10μg/ml)と共にインキュベートした。結合性を、FITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第二段階試薬の添加に続いて、FACS(R)により検出した。合計10,000個の染色された細胞を、FACS(R)により分析した。

0118

図5に示されるように、CD28IgはB7+ CHO細胞に結合するが、しかしPM LCLには結合せず、すなわち細胞系は比較的低レベルのB7抗原を発現する(Linsley など.,前記,1990)。CTLA4IgはCD28Igよりも両細胞系により強く結合し、これは、それが高い親和性を伴って結合することを示唆する。CD28IgもCTLA4Igも、CD28+ CHO 細胞に結合しなかった。

0119

CTLA4Ig及びB7Igの結合の親和性。次に、CTLA4IgとB7Igとの間の相互作用の見掛け親和性を、固相競争結合アッセイを用いて測定した。96−ウェルプラスチック皿を、上記のようにしてCTLA4Igにより被覆した。B7Igを125I(5×105cpm, 2×106 cpm/pモル)により放射ラベルし、そして添加し、示される濃度(図6を参照のこと)のラベルされていないキメラmAb L6, mAb 9.3,mAb BB−1又はB7Igの存在下で、4nMの濃度にした。プレート−結合放射能を測定し、そして競争体なしに処理されたウェルに結合される放射能の百分率として表わされた(28,300cpm)。個々の点は二重反復測定の平均を示し;反復試験は一般的に平均から20%以下変化した。濃度を、mAb に関して結合部位当たり75,000のMrに基づいて及びB7Igに関して結合部位当たり51,000のMrに基づいて計算した。

0120

図6に示されるように、mAb BB−1及びラベルされていないB7Igが125I−B7Ig結合のために有意に競争した(それぞれ約22nM及び約175 nMで最大の半分の効果)。キメラmAb L6もmAb 9.3も、試験された濃度で効果的に競争しなかった。他の実験においては、使用されるmAb の濃度は、固定されたCD28Ig又は90%以上、CD28を発現する細胞表面への125I−B7Igの結合を阻害するのに十分であった。図6からの競争データスキャッチャートプロットでプロットされる場合、約12nMの解離定数Kdが、固定されたCTLA4Igへの125I−B7の結合性について計算した(図7)。この値は、125I−B7IgとCD28との間で前で測定されたKdよりも約20倍低く(約200 nM)(Linsley など, (1991), 前記)、これは、CTLA4がCD28レセプターよりもB7抗原のためにより高い親和性レセプターであることを示唆する。

0121

CTLA4Igを結合したリンパ芽球細胞上の分子を同定するために(図7)、125I−表面ラベルされた細胞を、免疫沈殿分析にゆだねた(図8)。B7+ CHO 及びPMLCL細胞を125Iにより表面ラベルし、そして上記のようにして非イオン性界面活性剤溶液により抽出した。約1.5×107cpmを有する、0.1mlの体積での抽出物アリコートを、添加を伴わないで、又はそれぞれ2μgのCD28Ig,CTLA4Ig又はCD5Igを伴って、上記のようにして免疫沈殿分析にゆだねた。

0122

次に、洗浄された免疫沈殿物を、還元条件下でSDS-PAGE (10〜20%のアクリルアミドグラジエント)により分析した。次に、ゲルを乾燥せしめ、そしてオートラジオグラフィーにゆだねた。図8の左側のパネルは、1日間の暴露の後に得られたオートラジオグラムを示す。図8の右側のパネルは、10日間の暴露の後の同じゲルのオートラジオグラムを示す。図8の中央のパネルにおけるオートラジオグラムはまた、10日間、暴露された。分子量標準の位置はまた、この図に示される。

0123

図8により示されるように、分散的に移動する(約50,000〜75,000;約60,000での中央)、放射性ラベルされたタンパク質を、CTLA4Igにより(但し、CD28Ig又はCD5Igによってではない)免疫沈殿せしめた。この分子は、CTLA4Igにより、B7+ CHO細胞から免疫沈殿されたB7と共に同時移動し、そしてCD28Igより免疫沈殿されたB7と共には、より一層弱く同時移動した。これらの発見は、CTLA4Igが、B7抗原に大きさが類似する、リンパ芽球細胞上の単一タンパク質を結合することを示唆する。

0124

CTLA4Igによるインビトロでの免疫応答の阻害
増殖の阻害。これまでの研究は、抗−CD28 mAb, 9.3及び抗−B7 mAb, BB−1が、アロ抗原を表わすB細胞により、アロ抗原特異的Tn の増殖及び免疫グロブリン分泌を阻害することを示している(Damle, など., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096 (1981) ; Lesslauer など., Eur. J. Immunol. 16 : 1289 (1986)) 。CTLA4は本明細書に示されるようにB7抗原のために高い親和性レセプターであるので、可溶性CTLA4Igは、それらの応答を阻害するその能力について試験された。T細胞増殖に対するCTLA4Igの効果は、図9に示される実験で試験された。

0125

一次混合リンパ球反応(MLR)幼若を、ネズミmAb9.3Fabフラグメント、又はB7Ig,CD28IgもしくはCTLA4Ig免疫グロブリンCγ融合タンパク質の濃縮物の不在又は存在下で、照射されたT51リンパ芽球細胞(IC)により刺激した。細胞増殖を、4日後、〔 3H〕−チミジン組込みにより測定し、そして未処理の培養物による組込みの百分率として表わす、(21,000cpm)。図9は、4重反復測定の平均を表わす(SEM≦10%)。

0126

図9に示されるように、CTLA4Igは、約30ng/ml(約0.8nM)で、1/2最大応答を伴って最大90%以上、投与量−依存性態様でMLR 反応を阻害した。完全なmAb 9.3よりもより可能性あるMLR のインヒビターであることがこれまで示されている、mAb 9.3のFabフラグメント(Damle など., J. Immunol. 140 : 1753〜1761 (1988))はまた、MLR を阻害したが、しかしその濃度は、より高い濃度(約800 ng/ml又は1/2最大応答のためには約30nM)であった。B7Ig及びCD28Igは、高濃度でさえ、MLR を有意に阻害しなかった。他の実験においては、CTLA4Igと共にB7Igの添加は、CTLA4IgによるMLR の阻害を一部克服し、この事は、その阻害がB7抗原との特異的な相互作用によることを示唆する。

0127

免疫グロブリン分泌の阻害。ヘルパーT細胞(Tn )−誘発性免疫グロブリン分泌に対するCTLA4Igの効果をまた試験した(図10)。CD4+ T細胞を、上記のようにして、指示された免疫グロブリン分子の存在又は不在下で、同種CD19+B細胞と共に混合した。ネズミmAbs OKT8, 9.3及びBB−1を20μg/mlで添加し、そしてIg融合タンパク質を10μg/mlで添加した。6日間の培養の後、培養上清液におけるヒトIgMの濃度(SEM<5%)を、上記のようにして酵素イムノアッセイ(ELISA)により測定した。CD4+ T細胞の不在下で培養されたB細胞によるIgM 生成は11ng/mlであった。

0128

図10に示されるように、CD4+ T細胞は同種CD19+B細胞によるIgM生成を刺激した(CD4+ T細胞の不在下で、IgM レベルは93%減じられた)。mAbs 9.3及びBB−1は、Th −誘発されたIgM 生成を有意に阻害した(それぞれ63%及び65%の阻害率)。CTLA4Igは、それらのmAbsよりもインヒビターとしてより効果的であった(89%の阻害率)。対照分子、mAb OKT8及びCD5Igによる阻害は、より低かった(30%以下の阻害率)。それらの分子は、スタフィロコーカルアウレウス(Staphylococcal aureus)エンテロトキシンBの存在下で測定されるIg生成を有意に阻害しなかった。類似する結果が、他のドナーに由来するB細胞及びCD4+ T細胞により得られた。それらの結果は、CTLA4Igによる阻害が特異的であることを示す。

0129

上記データはまた、CTLA4及びCD28レセプターが機能的及び構造的に関連していることを示す。CD28のように、CTLA4はまた、B細胞活性化抗原、B7のためのレセプターでもある。CTLA4Igは、約12nMの親和性定数Kdを伴って125I−B7を結合し、その値は、CD28とB7Igとの間の親和性よりも20倍高い(約200 nM)。従って、CTLA4及びCD28は、同じリガンド、すなわちB7抗原のために、それぞれ高い及び低い親和性レセプターとして考えられる。

0130

CD28とB7との間の見掛け親和性は、ネズミT細胞ハイブリドーマのT細胞レセプターへの可溶性アロ抗原の結合について報告される親和性に類似し(約100 nM;Schnekなど.,Cell 56 : 47 (1989))、そしてCD2とLFA3との間(Recny など.,J. Biol. Chem. 265 : 8542 (1990))又はCD4とMHCクラスII分子との間(Clayton など., Nature 339 : 548 (1989))の相互作用よりも高い親和性である。

0131

CTLA4とB7との間の見掛け親和性定数Kdはさらに大きく、そして好都合には、より高い親和性のmAbsに匹適する(K2 2−10,000nM;Alzariなど.,Ann. Rev.Immuno. 6 : 555 (1988)) CTLA4とB7との間のKdは、インテグリンレセプター及びそれらのリガンドのKdに類似するか又はそれの値よりも大きい(10〜2000nM:Hautanenなど., J. Biol. Chem. 264 : 1437 〜1442 (1989) ; Di Minnoなど.,Blood 61 : 140〜148 (1983) ; Thiagarajan and Kelley, J. Biol. Chem. 263: 3035〜3038 (1988))。従って、CTLA4とB7との間の相互作用の親和性は、リンパ芽球付着システムについて報告される中で最高である。

0132

それらの結果は、CTLA4転写体の官能的タンパク質生成物の最初の発現を示す。CTLA4Ig、すなわちIgCγ1ドメインに融合されるCTLA4の細胞外ドメインを含む融合構成体は、約50,000サブユニットのMrのジスルフィド結合ダイマーを形成する(図1)。鎖間ジスルフィドはこの融合のIg部分において形成することが予期されないので、CTLA4からのシステインはジスルフィト結合形成に包含される。同種CD28Ig融合タンパク質(Linsley など, 前記,1991)はまた鎖間ジスルフィド結合を含む。それらの結果は、CD28のようにCTLA4レセプター(Hansenなど., Immunogenetics 10 : 247〜260(1980)) がジスルフィド結合ホモダイマーとしてT細胞表面上に存在することを示唆する。CD28及びCTLA4は高い相同性のタンパク質であるが、それらは免疫学的に異なっている。なぜならば抗−CD28 mAb, 9.3はCTLA4を認識しないからである(図4及び5)。

0133

CTLA4が、CD28に類似するシグナル化路によりT細胞を活性化できるかどうかについては知られていない。ネズミ及びヒトCTLA4の細胞質ドメインは同一であり(Dariavach., 前記 1988)、これは、この領域が重要な官能性質を有することを示唆する。CD28及びCTLA4の細胞質ドメインはまた、相同性を共有す。但し、これが2つの分子に類似するシグナル性質を付与するために十分であるかいづれかについては不明である。

0134

CTLA4IgはT細胞及びB細胞協力を必要とするインビトロリンパ球機能の可能性あるインヒビターである(図9及び10)。前記研究と共に、これらの発現は、T及びBリンパ球応答を調節することにおいて、B7抗原とそのカウンターレセプター、CD28及び/又はCTLA4との間に相互作用の基本的重要性を示唆する。CTLA4Igは、免疫応答の間、それらの相互作用の役割上、未来調査のために有用な試薬であるべきである。

0135

CTLA4Igは、mAb BB−1又はmAb 9.3のいづれよりもインビトロリンパ球応答のより可能性あるインヒビターである(図9及び10)。mAb BB−1よりもよりCTLA4Igの高い能力は、ほとんどそれらの分子間でのB7のための親和性の差異によると思われる(図6)。CTLA4Igはまた、mAb 9.3よりも可能性がある。なぜならば、たぶん、mAb とは異なって、それはその阻害効果を妨害するために、T細胞増殖に対して直接的な刺激効果を有さないからである(Juneなど.,ImmunologyToday 11 : 211 (1989)) 。インビトロでのCTLA4Igの免疫抑制効果は、未来の研究が、異常なT細胞活性化又はIg生成を包含する自己免疫疾患の処置のために、この分子の可能な治療効果保証されることを示唆する。

0136

本発明が関与する当業者に明らかなように、本発明は、本発明の範囲内で、上記に特別に開示されるもの以外の形で具体化され得る。従って、上記本発明の特定の態様は例示的であると考えられるべきである。本発明の範囲は、例示的であって、本発明を制限するものではない。
配列表

0137

(1)一般情報
(i)出願者:Linsley, Peter S
Ledbetter, Jeffrey A
Damle, Nitin K
Brady, William
(ii)発明の表題:CTLA4レセプター及びその使用法
(iii )配列の数:14
(iv)通信住所
(A)あて先:Sheldon & Mak
(B)通り:201 South Lake Avenue, Suite 800
(C)市:パサデナ
(D)州:カリフォルニア
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:91101
(v)コンピューター読取りフォーム
(A)媒体型:プロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC compatible
(C)操作システム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:PatentIn Release ≠1.0,Version ≠1.25
(vi)現在の出願日:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分 類:
(viii)アトニーエージェントの情報:
(A)名 称:Mandel, SaraLynn
(B)登録番号:31,853
(C)参照/ドケット番号:7848
(ix)電信情報:
(A)電 話: (818) 796-4000
(B)テレファックス: (818) 795-6321

0138

(2)配列番号1についての情報
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:39個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号1:
CTAGCCACTG AAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC 39

0139

(2)配列番号2についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:39個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号2:
TGGCATGGGCTCCTGATCAG GCTTAGAAGG TCCGGGAAA 39

0140

(2)配列番号3についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:39個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号3:
TTTGGGCTCC TGATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGGTTGT39

0141

(2)配列番号4についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:84個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号4:
AAGCAAGAGCATTTTCCTGA TCAGGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA CACATCCCCA 60
CCGTCCCCAG CACCTGAACT CCTG 84

0142

(2)配列番号5についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:41個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号5:
CTTCGACCAG TCTAGAAGCATCCTCGTGCG ACCGCGAGAG C 41

0143

(2)配列番号6についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:47個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号6:
CATTGCACAG TCAAGCTTCC ATGCCCATGGGTTCTCTGGC CACCTTG 47

0144

(2)配列番号7についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:39個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号7:
ATCCACAGTG CAGTGATCAT TTGGATCCTGGCATGTGAC 39

0145

(2)配列番号8についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:65個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号8:
CTCAGTCTGG TCCTTGCACT CCTGTTTCCA AGCATGGCGA GCATGGCAAT GCACGTGGCC 60
CAGCC 65

0146

(2)配列番号9についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:33個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号9:
TTTGGGCTCC TGATCAGAAT CTGGGCACGG TTG 33

0147

(2)配列番号10についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:72個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号10:
CTAGCCACTG AAGCTTCACCAATGGGTGTA CTGCTCACAC AGAGGACGCT GCTCAGTCTG 60
GTCCTTGCAC TC 72

0148

(2)配列番号11についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:33個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号11:
GCAATGCACGTGGCCCAGCC TGCTGTGGTA GTG 33

0149

(2)配列番号12についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:45個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(xi)配 列:配列番号12:
TGATGTAACA TGTCTAGATCAATTGATGGG AATAAAATAA GGCTG 45

0150

(2)配列番号13についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:561 個の塩基対
(B)型 :核 酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA (ゲノム)
(iii )ハイポセティカル:NO
(iv)アンチセンス:NO
(vi)起 源:
(A)生物名:Homo sapiens
(ix)特 徴:
(A)名称キー:CDS
(B)位 置:1..561
(xi)配 列:配列番号13:
GCAATG CACGTGGCC CAGCCTGCT GTG GTA CTG GCC AGC AGCCGA GGC 48
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
ATCGCC AGCTTTGTGTGTGAGTATGCA TCT CCA GGC AAA GCC ACT GAG 96
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
GTC CGG GTG ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAA GTC 144
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
TGT GCG GCAACCTAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACCTTCCTA GAT GAT 192
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
TCC ATCTGCACGGGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA GTG AAC CTC ACT ATC 240
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTG GAG 288
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG GGC ATA GGC AAC GGA ACC CAG 336
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTC CTC 384
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu
115 120 125
TGG ATC CTT GCA GCAGTTAGT TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTT CTC 432
Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu
130 135 140
CTC ACA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCT CTT 480
Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu
145 150 155 160
ACA ACA GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGT GAA 528
Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu
165 170 175
AAG CAA TTT CAG CCT TAT TTT ATT CCC ATC AAT 561
Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
180 185

図面の簡単な説明

0151

(2)発明番号14についての情報:
(i)配列の特徴:
(A)長 さ:187 個のアミノ酸
(B)型 :アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配 列:配列番号14:
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu
115 120 125
Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu
130 135 140
Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu
145 150 155 160
Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu
165 170 175
Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn

0152

図1第1図は、下の実施例2に記載するCTLA4Ig融合構成体の線図的表示である。
図2第2図は、下の実施例2に記載するCTLA4IgのSDS-PAGEクロマトグラフィーの精製から得られたゲルの写真である。
図3第3図は、下の実施例3に記載する、オンコスタチイン(oncostatin) Mシグナルプライマー伸長(位置−25〜−1)に融合したヒトCTLA4レセプター(配列識別番号:13および14)をコードし、そして新しく同定されたN連鎖グリコシル化部位(位置109 〜111)を含む、完全なアミノ酸配列を示す。
図4第4図は、下の実施例4に記載する、CD28およびCTLA4でトランスフェクションしたCOS細胞へのB7Ig融合タンパク質の結合のFACSR分析の結果を示す。
図5第5図は、下の実施例4に記載する、B7抗原陽性(B7+ ) CHO 細胞およびリンパ芽球様細胞系(PM-LCL) 上の精製したCTLA4Igの結合のFACSR 分析の結果を示す。
図6第6図は、下の実施例4に記載する、同定化CTLA4Igへの125I標識化B7Igの競争結合の分析を示すグラフである。
図7第7図は、下の実施例4に記載する、同定化CTLA4Igへの125I標識化B7Igのスキャッチャード分析の結果を示すグラフである。
図8第8図は、下の実施例4に記載する、125Iで表面標識化したB7陽性CHO 細胞およびPM-LCL細胞の免疫沈澱分析のSDS-PAGEクロマトグラフィーからのゲルの写真である。
図9第9図は、下の実施例4に記載する、〔 3H〕−チミジンの組み込みにより測定した、CTLA4IgのT細胞の増殖への作用を示すグラフである。
図10第10図は、下の実施例4に記載する、酵素のイムノアッセイ(ELISA)により決定した、ヒトT細胞によるヘルパーT細胞(Th )誘発免疫グロブリンの分泌へのCTLA4Igの作用を示す棒グラフである。

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