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技術 細胞巨大分子合成の阻害が減少したアルファウイルスベクター

出願人 ノバルティスバクシンズアンドダイアグノスティックス,インコーポレーテッドワシントンユニバーシティ
発明者 デュベンスキー,トーマスダブリュー.ジュニアポロ,ジョンエム.ベリー,バーバラエイ.シュレシンガー,ソンドラドライガ,サーゲイエイ.フロロブ,イリャ
出願日 1997年4月4日 (23年7ヶ月経過) 出願番号 1997-536512
公開日 2001年11月6日 (19年0ヶ月経過) 公開番号 2001-521369
状態 特許登録済
技術分野 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 微生物、その培養処理 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 ペプチド又は蛋白質 動物,微生物物質含有医薬
主要キーワード 妨害粒子 連続周期 共晶点温度 フィードバックサイクル 正十二面体 誘導性成分 自己調節的 コア中間体
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2001年11月6日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

単離された核酸分子が開示され、これは、組換えアルファウイルス粒子真核生物重層ベクター開始系、またはRNAベクターレプリコン作動可能に組み込まれた場合に、野生型と比較して減少したレベルのベクター特異的RNA合成を有し、そして野生型組換えアルファウイルス粒子と比較して同一またはより大きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたRNAによりコードされるタンパク質を有する、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む。上記の核酸分子を含む、RNAベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、および真核生物重層ベクター開始系もまた開示される。

概要

背景

概要

単離された核酸分子が開示され、これは、組換えアルファウイルス粒子真核生物重層ベクター開始系、またはRNAベクターレプリコン作動可能に組み込まれた場合に、野生型と比較して減少したレベルのベクター特異的RNA合成を有し、そして野生型組換えアルファウイルス粒子と比較して同一またはより大きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたRNAによりコードされるタンパク質を有する、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む。上記の核酸分子を含む、RNAベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、および真核生物重層ベクター開始系もまた開示される。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
4件

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請求項1

単離された核酸分子であって、組換えアルファウイルス粒子作動可能に組み込まれた場合に、野生型アルファウイルスと比較して、哺乳動物細胞における発現後に宿主細胞指向される巨大分子合成の50%阻害に到達するのに必要な時間を増加させる、改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む、核酸分子。

請求項2

単離された核酸分子であって、組換えアルファウイルス粒子に作動可能に組み込まれた場合に、野生型と比較して減少したレベルベクター特異的RNA合成を有し、そして野生型組換えアルファウイルス粒子と比較して同一またはより大きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたRNAによりコードされるタンパク質を有する、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む、核酸分子。

請求項3

アルファウイルスベクター構築物であって、cDNAからのインビトロでのウイルスRNAの合成を開始する5'プロモーター、アルファウイルスRNAの転写を開始する5'配列、請求項1または2に記載の核酸分子を含む4つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル域を含む、アルファウイルスベクター構築物。

請求項4

真核生物系において翻訳可能なアルファウイルスRNAベクターレプリコンであって、アルファウイルスRNAの転写を開始する5'配列、請求項1または2に記載の核酸分子を含む4つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル域を含む、アルファウイルスRNAベクターレプリコン。

請求項5

薬学的組成物であって、請求項4に記載のアルファウイルスRNAベクターレプリコンおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。

請求項6

組換えアルファウイルス粒子であって、1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、および請求項4に記載のRNAベクターレプリコンを含む、組換えアルファウイルス粒子。

請求項7

前記アルファウイルス構造タンパク質および脂質エンベロープが異なるアルファウイルス種に由来する、請求項6に記載の組換えアルファウイルス粒子。

請求項8

請求項6または7に記載の組換えアルファウイルス粒子および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。

請求項9

請求項6または7に記載の組換えアルファウイルス粒子で感染させた、宿主細胞。

請求項10

ゲノム核酸またはRNAベクターレプリコン核酸を実質的に全く含まない、トガウイルスキャプシド粒子

請求項11

1つ以上のアルファウイルス糖タンパク質を含む脂質エンベロープをさらに含む、請求項10に記載のキャプシド粒子。

請求項12

アルファウイルスエンベロープをさらに含む、請求項10に記載のキャプシド粒子。

請求項13

前記キャプシドが、アルファウイルス、ルビウイルス、フラビウイルス、およびペスチウイルスからなる群より選択されるトガウイルスに由来する、請求項10に記載のキャプシド粒子。

請求項14

請求項10〜13のいずれか1項に記載のキャプシド粒子および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。

請求項15

アルファウイルス構造タンパク質発現カセットであって、DNAからのRNAの合成を開始する5'プロモーター、1つ以上の機能的なアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子、発現カセットの転写に作動可能に連結された選択マーカー、および転写終結を制御する3'配列を含む、アルファウイルス構造タンパク質発現カセット。

請求項16

アルファウイルスパッケージング細胞株であって、請求項15に記載のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含む細胞を含む、アルファウイルスパッケージング細胞株。

請求項17

アルファウイルスプロデューサー細胞株であって、安定に形質転換されたアルファウイルス構造タンパク質発現カセット、ならびに請求項4に記載のRNAベクターレプリコン、請求項3に記載のアルファウイルスベクター構築物、および請求項18に記載の真核生物重層ベクター開始系からなる群より選択されるベクターを含む細胞を含む、アルファウイルスプロデューサー細胞株。

請求項18

真核生物重層ベクター開始系であって、cDNAからのアルファウイルスRNAのインビボでの5'合成を開始し得る5'プロモーター、アルファウイルスRNAの転写を開始する、該5'プロモーターに続く配列、請求項1または2に記載の核酸分子を含む4つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル域を含む、真核生物重層ベクター開始系。

請求項19

請求項18に記載の真核生物重層ベクター開始系を含む、宿主細胞。

請求項20

請求項18に記載の真核生物重層ベクター開始系および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。

請求項21

選択された異種配列脊椎動物または昆虫送達するための方法であって、請求項3に記載のアルファウイルスベクター構築物、請求項4に記載のアルファウイルスRNAベクターレプリコン、請求項6に記載の組換えアルファウイルス粒子、または請求項18に記載の真核生物重層ベクター開始系を、脊椎動物または昆虫に投与する工程を包含する、方法。

請求項22

組換えアルファウイルス粒子を作製する方法であって、以下の工程:(a)請求項18に記載の真核生物重層ベクター開始系、請求項4に記載のRNAベクターレプリコン、および請求項6に記載の組換えアルファウイルスベクター粒子からなる群より選択されるベクターを、組換えアルファウイルス粒子の生成を可能にするに十分な条件下および時間で、請求項16に記載のパッケージング細胞集団に導入する工程;ならびに(b)組換えアルファウイルス粒子を収集する工程、を包含する、方法。

請求項23

選択されたタンパク質を作製する方法であって、以下の工程:(a)選択された異種タンパク質をコードし、そして、請求項18に記載の真核生物重層ベクター開始系、請求項4に記載のアルファウイルスRNAベクターレプリコン、および請求項6に記載の組換えアルファウイルスベクター粒子からなる群より選択されるベクターを、該選択されたタンパク質の生成を可能にするに十分な条件下および時間で、請求項16に記載のパッケージング細胞の集団に導入する工程;ならびに(b)該パッケージング細胞により生成されるタンパク質を収集する工程、を包含する、方法。

請求項24

選択されたタンパク質を作製する方法であって、請求項18に記載の真核生物重層ベクター開始系を、該選択されたタンパク質の発現を可能にするに十分な条件下および時間で、宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。

請求項25

請求項4に記載のアルファウイルスRNAベクターレプリコンを含む、宿主細胞株

--

0001

政府の利権の記載
本発明は、部分的に、国立衛生研究所により認可された助成金番号AI17377の
下での政府の援助でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
発明の技術分野

0002

本発明は、一般的に組換えDNA技術に関する;さらに詳細には、1つ以上の異
遺伝子産物発現指向するために有用な組換えベクターの開発に関する。

背景技術

0003

アルファウイルスは、トガウイルス科一群血清学的に関連した、節足動物
運搬されるウイルスを含む。これらのウイルスは全世界に分布しており、そし
て自然界ではから脊椎動物へのサイクルを介して存続する。齧歯類
霊長類およびヒトは、アルファウイルス脊椎動物病原性物質保有者(reservoir)
宿主として規定されるものの仲間である。

0004

赤血球凝集阻害(HI)アッセイを利用して、アルファウイルス属内で、26の公
知のウイルスおよびウイルスサブタイプ分類されている。このアッセイは26の
アルファウイルスを3つの大きな複合種(complex)に分ける:ヴェネズエラウマ
脳炎(Venezuelan equine encephalitis)(VEE)複合種、セムリキ森林(Semliki
Forest)(SF)複合種、そして西部ウマ脳炎(westerne quine encephalitis)(W
EE)複合種。さらに、HI血清学的アッセイに基づき、4つの他のウイルス、東部
ウマ脳炎(eastern equine encephalitis)(EEE)、バーマー森林(Barmah Forest
)、ミッデルブルグ(Middelburg)、およびヌヅム(Ndumu)が、個々に分類されてい
る。

0005

アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるそれらの相対的な臨床的
特徴に基づき分類される:主に脳炎に関連するアルファウイルス、および主に発
熱、発疹そして多発性関節炎に関連するアルファウイルス。前者の群に含まれる
のは、VEEおよびWEE複合種、ならびにEEEである。一般的にこの群による感染は
永続的な後遺症行動変化および学習障害を含む)、または死に至り得る。後
者の群ではSF複合種であり、個々のアルファウイルスであるセムリキ森林、シン
ビス、ロスリバー、チクングンヤ(Chikungunya)、オニオニオン(O'nyong-nyon
g)、およびマヤロ(Mayaro)よりなる。この群に関しては、重大な流行報告
れているが、感染は一般的に自己制限型(self-limiting)であり、永続的な後遺
症はない。

0006

シンドビスウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属の原型メンバ
ーである。細胞の感染後のその複製ストラテジー図1を参照のこと)は、ニワ
トリ線維芽細胞(CEF)およびベビーハムスター腎臓(BHK)細胞により十分に特徴
付けられている。ここで、シンドビスウイルスは迅速に成長して高力価になり、
そして他のアルファウイルスのモデルとして作用する。簡潔には、シンドビス
イル由来ゲノムは、(他のアルファウイルスと同様に)約12kb一本鎖ポジ
ティセンスRNA分子であり、これはキャップされポリアデニル化され、そして
ウイルスコードキャプシドタンパク質殻内に含まれる。ヌクレオキャプシドは、
さらに宿主由来脂質エンベロープにより囲まれる。2つのウイルス特異的タン
パク質であるE1およびE2は、このエンベロープに挿入され、そしてヌクレオキャ
プシドに固着される。特定のアルファウイルス(例えば、SF)はまた、さらなる
タンパク質であるE3(これはE2前駆体タンパク質であるPE2の切断産物である)
を維持する。標的細胞へのウイルス粒子の吸収、浸透、およびウイルスゲノムRN
Aを細胞質へ放出するためのヌクレオキャプシドの脱コートの後、複製プロセス
が、ウイルスゲノムの5'側の3分の2からの非構造タンパク質(nsP)の翻訳によ
り開始される。4つのnsP(nsP1〜nsP4)は、ゲノムRNAテンプレートから、2つ
ポリタンパク質(nsP123またはnsP1234)の1つとして直接翻訳され、そしてC
末端ドメインnsP2において活性プロテアーゼによりモノマー単位に翻訳後プロセ
シングされる。大部分のアルファウイルスのnsP3とnsP4との間に存在するリーキ
オパール(leaky opal)(UGA)コドンは、nsP123ポリタンパク質と比較してnsP12
34ポリタンパク質の10〜20%の量を占める。両方の非構造ポリタンパク質および
それら由来のモノマー単位は、RNA複製プロセスに関与し得る。このプロセスは
、5'および3'末端に存在する保存されたヌクレオチド配列エレメント(CSE)、な
らびにゲノムの内部に配置される連結領域サブゲノムプロモーターへの結合を含
む(以下でさらに議論される)。

0007

ポジティブ鎖ゲノムRNAは、全長相補的ネガティブ鎖のnsP触媒合成のため
のテンプレートとして作用する。相補的なネガティブ鎖の合成は、ポジティブ鎖
ゲノムRNAの3'末端CSEへのnsP複合体の結合の後に触媒される。次には、ネガ
ィブ鎖は、順番に、さらなるポジティブ鎖ゲノムRNAおよび大量に発現される26S
サブゲノムRNA(連結領域プロモーターで内部に開始される)の合成のためのテ
プレートとして作用する。さらなるポジティブ鎖ゲノムRNAの合成は、相補的
なネガティブ鎖ゲノムRNAテンプレートの3'末端CSEへのnsP複合体の結合の後に
生じる。ネガティブ鎖ゲノムRNAテンプレートからのサブゲノムmRNAの合成は、
連結領域プロモーターから開始される。従って、ポジティブ鎖ゲノムRNAの5'末
端および連結領域CSEは、それらがネガティブ鎖ゲノムRNA相補体転写された後
にのみ機能的である(すなわち、5'末端CSEは、それがゲノムネガティブ鎖相補
体の3'末端である場合に機能的である)。構造タンパク質(sP)は、サブゲノム26
S RNAから翻訳される。これは、ゲノムの3'側の3分の1を示し、そしてnsPと同
様に、個々のタンパク質に翻訳後プロセシングされる。

0008

いくつかのグループは、アルファウイルス属の特定のメンバーを発現ベクター
として利用することを示唆している。これには、例えば、シンドビスウイルス(
Xiongら、Science 243:1188-1191,1989;Hahnら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:26
79-2683,1992;Dubenskyら、J.Virol 70:508-519,1996)、セムリキ森林ウイルス
(Liljestrom、Bio/Technology 9:1356-1361,1991)、およびヴェネズエラウマ
脳炎ウイルス(Davisら、J.Cell.Biochem.Suppl.19A:10,1995)が挙げられる。
さらに、1つのグループは、インビボでの治療的遺伝子送達のためにアルファ
ウイルス由来ベクターを使用することを示唆している。しかし、上述のベクター
に伴う一つの問題点は、宿主細胞に指向される巨大分子合成(すなわち、タンパ
ク質またはRNA合成)の阻害が感染後数時間以内に始まり、そして細胞変性効果(
CPE)が12〜16時間の感染後時間(hpi)以内に生じることである。宿主細胞タンパ
ク質合成の阻害および遮断は、構造タンパク質発現の存在下または非存在下にお
いて、組換えウイルス粒子で感染されたBHK細胞において2hpi以内に始まる。こ
のことは、ウイルス感染後初期事象(例えば、nsPおよび一鎖RNAの合成)が、
宿主細胞タンパク質合成の阻害およびそれに続くCPEの発達および細胞死に直接
的に影響し得ることを示唆する。

0009

SIN-1は、野生型シンドビスに由来する改変体株であり、そして1ヶ月の期間
にわたりシンドビスウイルスで持続的に感染させたBHK細胞の培養物から単離さ
れた(Weissら、J.Viol.33:463-474,1980)。単一のプラークからの拡大により
得られた純粋なSIN-1ウイルスのストックは、それが感染するBHK細胞を殺傷しな
い。重要なことには、ウイルス収率(>103PFU/細胞)は、野生型シンドビスウ
イルスまたは改変体SIN-1ウイルスで感染させたBHK細胞において同一である。従
って、感染させたBHK細胞におけるSIN-1の主な表現型は、ウイルス誘導細胞死の
非存在下における野生型レベル感染性ウイルスの生成により特徴付けられる。

0010

本発明は、種々の適用(例えば、遺伝子療法および組換えタンパク質生成を含
む)における使用のための選択された所望の表現型を有する組換えベクターを提
供し、そして他の関連した利点をさらに提供する。

発明の要旨

0011

簡潔に述べると、本発明は、RNAベクターレプリコン、アルファウイルスベク
ター構築物真核生物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子
を提供する。これらは、細胞巨大分子合成(例えば、タンパク質またはRNA合成
)の阻害の減少、遅延、または非存在を示し、それによってCPEの発達または細
胞死が減少して、遅延して、または存在せずに、タンパク質発現、遺伝子療法な
どのためのこれらのベクターの使用を可能にする。このようなベクターは、広範
な種々のアルファウイルス(例えば、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイル
ス、ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス、またはシンドビスウイルス)から構築され
得、そして多数の異種配列(例えば、タンパク質に対応する配列、アンチセンス
RNAに対応する配列、非コードセンスRNA配列に対応する配列、またはリボザイム
に対応する配列)を発現するように設計され得る。

0012

本発明の1つの局面において、単離された核酸分子が提供される。この分子
組換えアルファウイルス作動可能に組み込まれた場合、野生型アルファウイ
ルスと比較して、哺乳動物細胞における発現後の宿主細胞に指向される巨大分子
合成の50%阻害に到達するのに必要な時間を増加させる、改変されたアルファウ
イルス非構造タンパク質遺伝子を含む。本発明の文脈内において利用される「改
変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子」は、アルファウイルスRNA
ベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクタ
開始系に作動可能に組み込まれた場合に、所望の表現型(例えば、細胞巨大
子合成の阻害の減少、遅延、または非存在)を生じる遺伝子をいう。このような
改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子は、野生型アルファウイル
ス遺伝子のヌクレオチド配列からの配列を改変する1つ以上のヌクレオチドの置
換、欠失、または挿入を有する。遺伝子は、人工的な(例えば、指示された選択
手順から;以下の実施例2を参照のこと)または天然に存在するウイルス改変体
(以下の実施例1を参照のこと)のいずれかに由来し得る。さらに、単離された
本発明の核酸分子が、上記のアルファウイルスRNAベクターレプリコン、組換え
アルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクター開始系へ組み込まれた場合
、特定の実施態様において、それらは宿主細胞に指向される巨大分子合成の50%
阻害に到達するのに必要な時間を、宿主細胞に指向される巨大分子合成の検出可
能な阻害が実質的に存在しない程度まで実質的に増加させることは理解されるは
ずである。宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害パーセントを検出するため
に適切なアッセイとしては、例えば、実施例1において記載されるアッセイが挙
げられる。

0013

本発明の他の局面において、単離された核酸分子が提供される。この核酸分子
は、改変されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含む。この遺伝子は
、組換えアルファウイルス粒子、真核生物重層ベクター開始系、またはRNAベク
ターレプリコンに作動可能に組み込まれた場合、野生型と比較して減少したレベ
ル(例えば、2倍、5倍、10倍、50倍、または100倍より多い)のベクター特異
的RNA合成を生じ、そして野生型組換えアルファウイルス粒子、野生型真核生物
重層ベクター開始系、または野生型RNAベクターレプリコンと比較して、同一の
また
はより大きいレベルの、ウイルス連結領域プロモーターから転写されたRNAによ
りコードされるタンパク質を生じる。RNAレベルを定量するための代表的なアッ
セイとしては、実施例1に記載されるような[3H]ウリジン取り込み、またはノー
ザンブロット分析により検出されるようなRNA蓄積(実施例4を参照のこと)が
挙げられる。タンパク質レベルを定量するための代表的なアッセイとしては、ス
キャンニングデンシトメトリー(実施例4を参照のこと)および種々の酵素アッ
セイ(実施例3〜5を参照のこと)が挙げられる。

0014

上記の実施態様の1つにおいて、単離された核酸分子は、非構造タンパク質2
(nsP2)をコードする。さらなる実施態様において、単離された核酸分子は、nsP2
のLXPGGモチーフにおいて変異を有する。

0015

本発明の別の局面において、上記の核酸分子の1つに作動可能に連結されたプ
モーターを含む発現ベクターが提供される。1つの実施態様において、発現ベ
クターはさらに、ポリアデニル化配列または核酸分子の3'側に転写終結配列を含
む。

0016

本発明のさらに別の局面において、アルファウイルスベクター構築物が提供さ
れる。この構築物は、cDNAからのインビトロでのウイルスRNA合成を開始する5'
プロモーター、アルファウイルスRNAの転写を開始する5'配列、4つ全てのアル
ファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子(上記のような
単離された核酸分子を含む)、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、お
よび3'ポリアデニル化域(polyadenylate tract)を含む。1つの実施態様におい
て、このような構築物はさらに、ウイルス連結領域の下流の、そしてその領域に
作動可能に連結された、選択された異種配列を含む。

0017

本発明のさらに他の局面において、真核生物系において翻訳し得るRNAベクタ
ーレプリコンが提供される。このレプリコンは、アルファウイルスRNAの転写を
開始する5'配列、4つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコ
ードする核酸分子(上記の単離された核酸分子を含む)、アルファウイルスRNA
ポリメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル化域を含む。別の実施態様におい
て、このようなRNAベクターレプリコンはさらに、ウイルス連結領域の下流の、
そしてその領域に作動可能に連結された、選択された異種配列を含む。本発明の
さらなる局面において、本明細書中に記載されるRNAベクターレプリコンの1つ
を含む宿主細胞が提供される。本発明のさらなる局面において、上記のRNAベク
ターレプリコンおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組
成物が提供される。

0018

本発明の他の局面において、組換えアルファウイルス粒子が提供される。この
粒子は、本明細書中に記載のように、1つ以上のアルファウイルス構造タンパク
質、脂質エンベロープ、およびRNAベクターレプリコンを含む。1つの実施態様
において、1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質は、RNAベクターレプリ
コンが由来するアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来する。他の
実施態様において、アルファウイルス構造タンパク質および脂質エンベロープは
異なる種に由来する。さらなる局面において、薬学的組成物が提供される。この
組成物は、上記のような組換えアルファウイルス粒子および薬学的に受容可能な
キャリアまたは希釈剤を含む。さらに、このような組換えアルファウイルス粒子
に感染させた哺乳動物細胞もまた、提供される。

0019

本発明の特定の実施態様において、上記のベクターまたは粒子はさらに、異種
配列とインフレームで融合された耐性マーカーを含み得る。このような耐性マー
カーの代表的な例としては、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび
ネオマイシンが挙げられる。

0020

本発明の他の局面において、アルファウイルスまたは組換えアルファウイルス
ベクター改変体を選択するための方法が提供される。これらの改変体は、本明細
書中に記載の、宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害が減少したか、遅延し
たか、または存在しない表現型を示す。このような方法の代表的な例としては選
択薬物または抗原性マーカーの使用が挙げられ、そして以下の実施例2において
より詳細に提供される。

0021

本発明の他の局面において、ゲノム(すなわち、野生型ウイルスゲノム)また
はRNAベクターレプリコン核酸を実質的に含まないトガウイルスキャプシド粒子
が提供される。トガウイルスの代表的な例としては、例えば、アルファウイルス
およびルビウイルス(例えば、風疹)が挙げられる。特定の実施態様において、
キャプシド粒子はさらに、1つ以上のアルファウイルス糖タンパク質を含む脂質
エンベロープを含む。他の実施態様において、キャプシド粒子はさらに、アルフ
ウイルスエンベロープ(すなわち、脂質二重層および糖タンパク質相補体)を
含む。本発明に関連する局面において、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈
剤と共に、上述のキャプシド粒子(脂質二重層(例えば、アルファウイルス糖タ
ンパク質を含むウイルスエンベロープ)を有するかまたは有しない)を含む薬学
的組成物が提供される。さらなる局面において、このようなキャプシド粒子(脂
二重層(例えば、アルファウイルス糖タンパク質を含むウイルスエンベロープ
)を有するかまたは有しない)または薬学的組成物は、所望のトガウイルスに対
する免疫応答誘導するために、ワクチン接種薬剤として利用され得る。

0022

本発明のさらなる局面において、誘導性プロモーターが提供される。このプロ
モーターは、コアRNAポリメラーゼプロモーター配列コアプロモーター配列か
らの転写を活性化するタンパク質のDNA結合を指向する作動可能に連結された核
酸配列、およびコアプロモーター配列からの転写を抑制するタンパク質のDNA結
合を指向する作動可能に連結された核酸配列を含む。このようなプロモーターは
、本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルにおいて、ならびに当業者に公知
の広範な種々の他のベクターにおいて利用され得る。

0023

他の局面において、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットが提供され
る。このカセットは、DNAからのウイルスRNAの合成を開始する5'プロモーター、
1つ以上の機能的なアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子、発
現カセットの転写に作動可能に連結された選択マーカー、および必要に応じて、
転写終結を制御する3'配列を含む。1つの実施態様において、このような発現カ
セットはさらに、アルファウイルスRNAの転写を開始する5'配列、ウイルス連結
領域プロモーター、およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列を含む。
別の実施態様において、発現カセットはさらに、触媒リボザイムプロセシング
列、核からのRNAの輸送を容易にする翻訳後転調節エレメント、および/また
は複数シストロン性の(multicistronic)mRNAの翻訳を可能にするエレメント(内
リボゾーム進入部位(Internal Ribosome Entry Site)エレメント、リボソー
ムの読み通し(read through)を促進するエレメント、およびBiP配列からなる群
より選択される)を含む。他の実施態様において、選択マーカーは、cDNAからの
アルファウイルスRNAの合成を開始し得る5'プロモーターに作動可能に連結され
る。さらなる実施態様において、選択マーカーは、連結領域プロモーターよりお
よびアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子より下流に配置され
る。なお他の実施態様において、5'プロモーターは、本明細書中に記載されるよ
うに誘導性プロモーターである。別の実施態様において、アルファウイルス構造
タンパク質発現カセットはさらに、アルファウイルスキャプシドタンパク質遺伝
子またはエンハンサー配列の3'側に位置する1つ以上の機能的なアルファウイル
構造タンパク質遺伝子の翻訳を増強し得る他の配列(例えば、タバコエッチ
イルス(tobacco etch virus)または「TEVリーダー)を含む。好ましくは、キ
ャプシドタンパク質遺伝子配列は、アルファウイルス構造遺伝子をコードする配
列が得られたアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来する。

0024

本発明のなお他の局面において、上記のようなアルファウイルス構造タンパク
質発現カセットを含む細胞を含むアルファウイルスパッケージング細胞株が提供
される。特定の実施態様において、アルファウイルスパッケージング細胞株は、
本明細書中に提供されるアルファウイルス構造タンパク質発現カセットで安定に
形質転換される。関連する局面において、アルファウイルスプロデューサー細胞
株が提供される。この細胞株は、安定に形質転換されたアルファウイルス構造タ
ンパク質発現カセット、ならびにRNAベクターレプリコン、アルファウイルスベ
クター構築物、および真核生物重層ベクター開始系からなる群より選択されたベ
クターを含む細胞を含む。
含む。

0025

本発明のなお他の局面において、真核生物重層ベクター開始系が提供される。
この系は、cDNAからのRNAのインビボでの5'合成を開始し得る5'プロモーター、
アルファウイルスRNAの転写を開始するこの5'プロモーターに続く配列;4つ全
てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子(上記
のような単離された核酸分子を含む)、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識
配列、および3'ポリアデニル域を含む。適切な5'プロモーターの代表的な例とし
ては、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNA
ポリメラーゼIIIプロモーター、HSV-TKプロモーター、RSVプロモーター、テトラ
サイクリン誘導性プロモーター、MoMLVプロモーター、SV40プロモーター、およ
びCMVプロモーターが挙げられる。好ましい実施態様において、5'プロモーター
は、本明細書中に記載されるような誘導性プロモーターである。

0026

特定の実施態様において、ウイルス連結領域に作動可能に連結された異種配列
、および/または核からのRNA輸送を容易にする転写後調節エレメントをさらに
含む真核生物重層ベクター開始系が提供される。さらなる実施態様において、本
明細書中で提供される真核生物重層ベクター開始系はさらに、転写終結シグナル
を含み得る。

0027

関連する実施態様において、本発明はまた、上記のような安定に形質転換され
た真核生物重層ベクター開始系を含む宿主細胞(例えば、脊椎動物または昆虫
を提供する。本発明のさらなる局面において、選択された異種配列を脊椎動物ま
たは昆虫に送達するための方法が提供される。この方法は、本明細書中に記載の
ような、アルファウイルスベクター構築物、RNAベクターレプリコン、組換えア
ルファウイルス粒子、または真核生物重層ベクター開始系を脊椎動物または昆虫
投与する工程を含む。特定の実施態様において、アルファウイルスベクター構
築物、RNAベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物
重層ベクター開始系は脊椎動物の細胞にエクスビボで投与され、続いてベクター
または粒子を含む細胞が温血動物に投与される。

0028

他の局面において、上記のような真核生物重層ベクター開始系および薬学的に
受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。特定の実施
態様において、薬学的組成物はリポソーム製剤として提供される。

0029

さらなる局面において、組換えアルファウイルス粒子を作製する方法が提供さ
れる。この方法は、(a)ベクター(例えば、上記のような真核生物重層ベクター
開始系、RNAベクターレプリコン、またはアルファウイルスベクター粒子)を、
組換えアルファウイルス粒子の生成を可能にするに十分な条件下および時間でパ
ケージング細胞の集団に導入する工程、ならびに(b)組換えアルファウイルス
粒子を収集する工程を含む。関連する局面において、選択されたタンパク質を作
製する方法が提供される。この方法は、(a)選択された異種タンパク質をコード
するベクター(例えば、上記の真核生物重層ベクター開始系、RNAベクターレプ
リコン、またはアルファウイルスベクター粒子)を、選択されたタンパク質の生
成を可能にするに十分な条件下および時間でパッケージング細胞または他の細胞
の集団に導入する工程、ならびに(b)ベクター含有細胞により生成されるタンパ
ク質を収集する工程を包含する。なお他の局面において、選択されたタンパク質
を作製する方法が提供される。この方法は、選択された異種タンパク質を生成し
得る真核生物重層ベクター開始系を、選択されたタンパク質の発現を可能にする
に十分な条件下および時間で宿主細胞に導入する工程を含む。さらなる局面にお
いて、本明細書中に記載されるようなRNAベクターレプリコンを含む宿主細胞株
が提供される。

0030

本発明のなお他の局面において、アルファウイルスワクチンが提供される。こ
のワクチンは、上記のアルファウイルスベクター構築物、RNAベクターレプリコ
ン、真核生物ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒子の一つを含む
。これらは、本明細書中で提供される異種配列の1つを発現するかもしれないし
、発現しないかもしれない(例えば、それらは、アルファウイルス疾患を処置
たは予防するためのワクチンとして単独で利用され得る)。例えば、本発明の1
つの実施態様において、核酸またはRNAベクターレプリコン核酸を実質的に全く
有しない組換えトガウイルス粒子が提供される。さらなる実施態様において、異
ウイルス核酸(すなわち、トガウイルス粒子とは異なるウイルス由来)を含む
組換えトガウイルス粒子が提供される。なお別の実施態様において、組換えトガ
ウイルス粒子はT=3以上である。

0031

本発明のさらなる局面において、組換えキメラトガウイルス粒子(空かまたは
核酸を含むかのいずれか)が提供される。ここで、ウイルス粒子は、異なるトガ
ウイルス科から得られたかまたは由来するウイルス構造成分を有する(例えば、
キャプシドタンパク質および糖タンパク質が異なるアルファウイルス供給源から
得られる)。

0032

本発明のこれらのおよび他の局面および実施態様は、以下の詳細な説明および
添付された図面を参照すれば明白となる。さらに、より詳細に特定の手順または
組成物(例えば、プラスミド、配列など)を記載する種々の参考文献が本明細書
中に記載され、従って、各々が援用について個々に記述されたかのように、それ
らの全体が参考として援用される。

図面の簡単な説明

0033

図1は、シンドビスゲノムの編成および複製ストラテジーの模式図である。

0034

図2は、SIN-1、SIN-1/nsP1-4、Toto1101,またはSIn-1/nsP2ウイルスでMOI1
0で感染されたBHK細胞からのウイルス放出のグラフである。培養上清は、感染の
3、6、9および12時間後に採集した。ウイルスカ価は、プラークアッセイによ
り決定した。

0035

図3は、Toto1101、SIN-1/nsP2、SIN-1/nsP1-4、またはSIN-1ウイルスによる
感染後のBHK細胞におけるウイルスRNA合成を示すグラフである。細胞はMOI10で
感染させ、そして感染1時間後、アクチノマイシンDおよび3Hウリジンを添加
した。3、6、9、および12hpiで、3Hウリジン取り込みの量を決定した。

0036

図4は、SIN-1/nsP1、SIN-1/nsP2、SIN-1/nsP3、SIN-1/nsP3-4、SIN-1/nsP4、
SIN-1/nsP2-C、SIN-1/nsP2-N,Toto1101、SIN-1またはSIn-1/nsP1-4により感染
されたBHK細胞におけるウイルスRNA合成を示すグラフである。3Hウリジン取り
込みのレベルを野生型(Toto1101)感染に対して表す。

0037

図5は、SIN-InsP1-4、SIN-1、SIN-1nsP2、またはToto1101ウイルスにより感
染されたBHK細胞における宿主細胞タンパク質合成の遮断を示すグラフである。

0038

図6は、SIN-1ウイルスの8000塩基cDNA配列である(配列番号101)。

0039

図7は、SINCGウイルスの8000塩基のcDNA配列である(配列番号102)。

0040

図8は、Toto1101ウイルスのcDNA配列である(配列番号103)。

0041

図9Aは、pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAPまたはpBG/wt ELVS 1.5-SEAPプラスミドD
NAでトランスフェクトされたBHK-21細胞から単離され、そして放射性標識ウイル
RNAプローブハイブリダイズしたRNAのノーザンブロットである。図9Bは、
pBG/SIN-1 ELVS 1.5-SEAPまたはpBG/wt ELVS 1.5-SEAPプラスミドDNAでトランス
フェクトされたBHK細胞におけるアルカリホスファターゼ発現の7日の時間経過
を示すグラフである。

0042

図10は、pBG/SIN-1 ELVS 1.5-lucまたはpBG/wt ELVS 1.5-lucプラスミドDNA
でトランスフェクトされたBHK細胞におけるルシフェラーゼ発現の4日の時間経
過を示すグラフである。

0043

図11Aは、pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-galまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-galプラ
スミドDNAでトランスフェクトされたBHK-21細胞から単離され、そして放射性
識ウイルスRNAプローブとハイブリダイズしたRNAのノーザンブロットである。図
11Bは、pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-galまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-galプラス
ドDNAのいずれかでトランスフェクトされたBHK-21細胞におけるβ-gal発現を検
出しているウエスタンブロットである。図11Cは、pBG/SIN-1 ELVS-1.5-β-ga
lまたはpBG/wt ELVS 1.5-β-galプラスミドDNAでトランスフェクトされたBHK細
胞におけるアルカリホスファターゼ発現の5日の時間経過を示すグラフである。

0044

図12AおよびBは、RLU(相対的光単位)により測定した、HBVPRE配列を有
するまたは有さないELVS β-galベクターでトランスフェクトされたHT1080およ
びBHK-21細胞におけるβ-gal発現を示すグラフである。

0045

図13は、ベクター誘導性アルファウイルスパッケージング細胞株によるRNA
増幅、構造タンパク質発現、およびベクターパッケージングの模式図である。

0046

図14は、アルファウイルスパッケージング細胞株の生成において用いられる
ベクター誘導性構造タンパク質発現カセットの模式図である。

0047

図15は、異なるアルファウイルスパッケージング細胞株によるルシフェラー
ゼベクターパッケージング(発現の移行)を示すグラフである。

0048

図16は、アルファウイルスパッケージング細胞株によるベクター誘導性構造
タンパク質発現を示すウエスタンブロットである。

0049

図17Aは、pDCMV-intSINrbz構造タンパク質発現カセットを含むC6/36蚊細胞
によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。図17Bは
、プラスミドpBGSVCMVdlneoで安定に形質転換されたヒト293パッケージング細胞
によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。

0050

図18は、異なるアルファウイルスパッケージング細胞株によるルシフェラー
ゼベクターパッケージングを示すグラフである。

0051

図19は、アルファウイルスパッケージング細胞株から生成されたSINrep/Lac
Zベクター粒子で感染されたBHK細胞からの3Hウリジン標識RNAを示すRNAゲル
トラジオグラフである。

0052

図20は、アルファウイルスパッケージング細胞株から生成されたSINrep/Lac
Zベクター粒子で感染されたBHK細胞からの35Sメチオニン標識タンパク質を示す
タンパク質ゲルオートラジオグラフである。

0053

図21は、キャプシド細胞株のβ-galまたは糖タンパク質ベクタートランスフ
クション後のベクター誘導性キャプシドタンパク質発現を示すウエスタンブロ
ットである。

0054

図22は、野生型または欠失変異体ロスリバーウイルスキャプシドタンパク質
遺伝子を含む構造タンパク質発現カセットの領域の模式図である。

0055

図23は、野生型または欠失変異体ロスリバーウイルスキャプシドタンパク質
遺伝子を含むベクター誘導性構造タンパク質発現カセットの模式図である。

0056

図24は、シンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子の上流にロスリバーウイル
スキャプシドタンパク質遺伝子配列を含む「分割(split)」構造タンパク質遺伝
子発現カセットによるベクターパッケージングの模式図である。

0057

図25は、1つのカセットにおいてシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子の
上流にロスリバーウイルスキャプシドタンパク質遺伝子配列、そして別のカセッ
トにおいてシンドビスウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を含む「分割」構造
タンパク質遺伝子発現カセットによるベクターパッケージングの模式図である。

0058

図26は、上記「分割」構造タンパク質遺伝子発現カセットを用いるベクター
粒子パッケージングの結果を示す表である。

0059

図27は、パッケージング化ベクター粒子調製物の増幅および組換えタンパク
質の大規模生成のためのアルファウイルスパッケージング細胞株の使用の模式図
である。

0060

図28は、アルファウイルスパッケージング細胞株を用いる経時的なβ-galタ
ンパク質の増幅および生成を示すグラフである。

0061

図29は、インビボにおけるcDNAからのアルファウイルスベクターRNAの発現
を制御するためのテトラサイクリン調節プロモーター系の使用の模式図である。

0062

図30は、インビボにおけるcDNAからのアルファウイルスベクターRNAの発現
を制御するための連結転写リプレッサーおよび転写インデューサーアクチベー
ター調節プロモーター系の使用の模式図である。

0063

図31AおよびBは、SINrep/LacZレプリコン、およびDH構築物を含む種々のR
RVキャプシド由来のDH RNAでエレクトロポレートされたBHK細胞から、およびエ
レクトポレーションの18時間後の培養液に存在するベクター粒子から単離され
変性グリオキサールゲル上で電気泳動された[3H]ウリジン標識RNAのオート
ジオグラフである。

0064

図32AおよびBは、SINrep/LacZレプリコン、およびDH構築物を含む種々のR
RVキャプシド由来のDH RNAでエレクトロポレートされたBHK細胞から、およびエ
レクトロポレーションの18時間後の培養液に存在するベクター粒子からの35Sメ
チオニン標識タンパク質を示すタンパク質ゲルオートラジオグラフである。

0065

図33A〜Dは、野生型遺伝子(A)および3つの欠失変異体CΔ1rrv、CΔ
2rrv、およびCΔ3rrv(それぞれB〜D)から発現された種々のロスリバーウイ
ルス(RRV)キャプシドタンパク質のKyte-Doolittle疎水性プロットである。

0066

図34は、野生型遺伝子(配列番号114)および3つの欠失変異体CΔ1rrv(
配列番号115)、CΔ2rrv(配列番号116)、およびCΔ3rrv(配列番号117)か
ら発現されたアミノ末端RRVキャプシドタンパク質を示す模式図である。RRVキャ
プシド遺伝子変異体において欠失されたリジン残基が示される。

0067

図35は、Toto1101野生型ウイルスで高いMOIで感染されたBHK細胞においてウ
イルス粒子に取り込まれた[35S]メチオニンおよび[3H]ウリジンの相対的レベ
ルを示すグラフである。

0068

図36は、SINrep/lacZおよびDH-BB(5’tRNA)Crrv DHRNAでエレクトロポレ
ートされたBHK細胞においてウイルス粒子に取り込まれた[35S]メチオニンおよ
び[3H]ウリジンの相対的レベルを示すグラフである。

0069

図37は、SINrep/lacZおよびRRVキャプシド欠失変異体DH-BB(5’tRNA)CΔ
3rrv DH RNAでエレクトロポレートされたBHK細胞においてウイルス粒子に取り
込まれた[35S]メチオニンおよび[3H]ウリジンの相対的レベルを示すグラフで
ある。

0070

図38は、SINrep/lacZおよびDH RNAでエレクトロポレートされた、またはTot
o1101野生型ウイルスで感染されたBHK細胞においてウイルス粒子に取り込まれた
[35S]メチオニンおよび[3H]ウリジンの相対的レベルを示す、図35〜37に
示す結果をまとめるグラフである。

0071

図39は、pBGSVCMVdlhygで安定に形質転換されたBHK細胞によるルシフェラー
ゼベクターパッケージングを示すグラフである。
用語の定義

0072

以下の用語を明細書を通して使用する。他に示されていなければ、これらの用
語を以下のように定義する:

0073

「ゲノムRNA」とは、標的細胞内でインビボにおけるそれ自身の増幅または自
己複製を指向するのに必要な遺伝情報の全てを含むRNAをいう。それ自身の複製
を指向するために、RNA分子は、1)1つ以上のポリメラーゼ、レプリカーゼ
あるいはウイルスもしくは宿主細胞由来タンパク質、核酸、またはリボヌクレオ
タンパク質と相互作用し、RNA増幅過程を触媒し得る他のタンパク質をコードし
得;そして2)複製に必要なシスRNA配列(これは、その自己コード化タンパク
質、または非自己コード化細胞由来タンパク質、核酸もしくはリボヌクレオタン
パク質、あるいはこれらの任意の成分間の複合体により、複製過程で結合され得
る)を含み得る。アルファウイルス由来ゲノムRNA分子は、以下の順でのエレ
ントを含むべきである:複製のためにシスで必要な5'ウイルスまたは欠陥干渉性
RNA配列(単数または複数)、発現されたとき生物学的に活性なアルファウイル
ス非構造タンパク質(例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)をコードする配列、複
製のためにシスで必要な3'ウイルス配列、およびポリアデニル化域。アルファウ
イルス由来ゲノムRNAベクターレプリコンはまた、特定の実施態様において、サ
ブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させ
るように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、および発
現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質(例えば、C、E
3、E2、6K、E1)をコードする配列を含み得る。一般に、用語ゲノムRNAは、+極
の分子、または「メッセージ」センスをいい、そしてゲノムRNAは、任意の公知
の天然に存在するアルファウイルスとは異なる長さであり得る。好ましい実施態
様において、ゲノムRNAは、任意のアルファウイルス構造タンパク質(単数また
は複数)をコードする配列を含まず、むしろそれらの配列は、異種配列と置換
れる。ゲノムRNAが組換えアルファウイルス粒子中にパッケージングされる場合

これは、アルファウイルス構造タンパク質と相互作用を開始させるように作用し
て粒子形成に至る1つ以上の配列を含まなければならず、好ましくは、用いられ
るパッケージング系により効率的にパッケージングされる長さである。

0074

「サブゲノムRNA」(または「26S」RNA)とは、それが由来するゲノムRNAより
小さい長さまたはサイズのRNA分子をいう。サブゲノムRNAは、配列がゲノムRNA
またはその相補体内に位置する内部プロモーターから転写されるべきである。サ
ブゲノムRNAの転写は、ウイルスコード化ポリメラーゼ(単数または複数)、宿
主細胞コード化ポリメラーゼ(単数または複数)、転写因子(単数または複数)
リボヌクレオタンパク質(単数または複数)、またはそれらの組み合わせによ
り媒介され得る。好ましい実施態様では、サブゲノムRNAは、本発明に従ってベ
クターから生成され、そして目的の遺伝子(単数または複数)または配列(単数
または複数)をコードするか、または発現させる。サブゲノムRNAは、必ずしも2
6の沈降係数を有するわけではない。

0075

「アルファウイルスベクター構築物」とは、目的の配列(単数または複数)ま
たは遺伝子(単数または複数)の発現を指向し得るアセンブリをいう。このよう
なベクター構築物は、アルファウイルスRNAの転写を開始させ得る5'配列(背景
では、5’CSEとも称される)、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルフ
ァウイルス非構造タンパク質(例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)をコードする
配列、およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列(背景では、3’CSEと
も称される)で構成される。さらに、ベクター構築物は、特定の実施態様におい
て、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減
少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、お
よびまたポリアデニル化域を含むべきである。ベクターはまた、1つ以上の構造
タンパク質遺伝子由来の配列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能
にするのに充分なサイズである外来性核酸分子(単数または複数)、cDNAからの
インビトロでのウイルスRNAの合成を開始させ得る5'プロモーター、発現される
べき異種配列、ならびに異種配列の挿入のための1つ以上の制限部位を含み得る

0076

「アルファウイルスRNAベクターレプリコン」、「RNAベクターレプリコン」お
よび「レプリコン」とは、標的細胞内でインビボにおけるそれ自身の増幅または
自己複製を指向し得るRNA分子をいう。それ自身の増幅を指向するために、RNA分
子は、1)1つ以上のポリメラーゼ、レプリカーゼ、あるいはウイルスもしくは
宿主細胞由来タンパク質、核酸、またはリボヌクレオタンパク質と相互作用し、
RNA増幅を触媒し得る他のタンパク質をコードし得;そして2)複製に必要なシ
スRNA配列(これは、その自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞
由来タンパク質、核酸もしくはリボヌクレオタンパク質、あるいはこれらの任意
の成分間の複合体により、複製過程で結合され得る)を含み得る。特定の実施態
様では、増幅はまた、インビトロで生じ得る。アルファウイルス由来RNAベクタ
ーレプリコン分子は、以下の順でのエレメントを含むべきである:複製のために
シスで必要な5'ウイルス配列(背景では、5’CSEとも称される)、発現されたと
き生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質(例えば、nsP1、nsP2、
nsP3、nsP4)をコードする配列、複製のためにシスで必要な3’ウイルス配列(
背景では、3’CSEとも称される)、およびポリアデニル化域。アルファウイルス
由来RNAベクターレプリコンはまた、特定の実施態様において、サブゲノムフラ
グメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変
され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、1つ以上の構造タンパ
ク質遺伝子由来の配列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能にする
のに充分なサイズである外来性核酸分子(単数または複数)、ならびに発現され
るべき異種配列(単数または複数)を含み得る。細胞におけるRNAベクターレプ
リコンの供給源は、ウイルスまたは組換えアルファウイルス粒子での感染、ある
いはプラスミドDNAまたはインビトロ転写RNAのトランスフェクションに由来し得
る。

0077

「組換えアルファウイルス粒子」とは、アルファウイルスRNAベクターレプリ
コンを含むビリオン単位をいう。一般に、組換えアルファウイルス粒子は、1つ
以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、およびRNAベクタ
ーレプリコンを含む。好ましくは、組換えアルファウイルス粒子は、宿主細胞由
来脂質二重層(例えば、原形質膜)内に含まれるヌクレオキャプシド構造を含み
、ここには、アルファウイルスコード化エンベロープ糖タンパク質包埋されて
いる。粒子はまた、アルファウイルスが由来する粒子の指向性を指向する他の成
分(例えば、ビオチンのような標的化エレメント、他のウイルス構造タンパク質

または他のレセプター結合リガンド)、または他のRNA分子を含み得る。

0078

「構造タンパク質発現カセット」とは、1つ以上のアルファウイルス構造タン
パク質の合成を指向し得る核酸分子をいう。発現カセットは、cDNAからのRNAの
合成をインビボで開始させ得る5'プロモーター、ならびに発現されたとき1つ以
上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質(例えば、C、E3、E2、6
K、E1)をコードする配列、および転写終結を制御する3'配列を含むべきである
。発現カセットはまた、アルファウイルスRNAの転写を開始させ得る5'配列(背
景では、5’CSEとも称される)、ウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター
、およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列(背景では、3’CSEとも称
される)を含み得る。特定の実施態様において、発現カセットはまた、スプライ
ス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、選択マーカーをコードする配列
、核輸送シグナル、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。さらに、アルファ
ウイルス構造タンパク質(単数または複数)の発現は、特定の実施態様において
、誘導性プロモーターの使用により調節され得る。

0079

「安定な形質転換」とは、生細胞への核酸分子の導入、および連続周期の細胞
分裂を通した子孫細胞におけるその核酸分子の長期または恒久的な維持をいう。
核酸分子は、任意の細胞区画に維持され得、このような区画には、核、ミトコン
ドリア、または細胞質が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様
では、核酸分子は、核において維持され得る。維持は、染色体内(組み込み)ま
たは染色体外エピソーム事象として)であり得る。

0080

「アルファウイルスパッケージング細胞株」とは、アルファウイルス構造タン
パク質発現カセットを含み、かつアルファウイルスベクター構築物、RNAベクタ
ーレプリコン、真核生物重層ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒
子の導入後、組換えアルファウイルス粒子を生成する細胞をいう。親細胞は、哺
動物起源であるか、または哺乳動物起源でなくてもよい。好ましい実施態様で
は、パッケージング細胞株は、構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換さ
れている。

0081

「アルファウイルスプロデューサー細胞株」とは、組換えアルファウイルス粒
子を生成し得る細胞株をいう。この細胞株は、アルファウイルスパッケージング
細胞株を含み、この中にはまた、アルファウイルスベクター構築物、RNAベクタ
ーレプリコン、真核生物重層ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒
子が含まれる。好ましくは、アルファウイルスベクター構築物は真核生物重層ベ
クター開始系であり、そしてプロデューサー細胞株はそのベクター構築物で安定
に形質転換される。好ましい実施態様では、アルファウイルスベクター構築物の
転写および続く組換えアルファウイルス粒子の生成は、1つ以上の因子またはア
ルファウイルスプロデューサー細胞株の分化状態に応じてのみ生じる。

0082

「欠陥ヘルパー構築物」とは、トランスで供給された生物学的に活性なアルフ
ァウイルス非構造タンパク質に応じて、RNA増幅または複製、および1つ以上の
アルファウイルス構造タンパク質の発現を行い得るアセンブリをいう。欠陥ヘル
パー構築物は、以下の順でのエレメントを含むべきである:複製のためにシスで
必要な5'ウイルスまたは欠陥干渉性RNA配列、ウイルスサブゲノム連結領域プロ
モーター、発現されたとき1つ以上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タ
ンパク質(例えば、C、E3、E2、6K、E1)をコードする配列、複製のためにシス
で必要な3'ウイルス配列、およびポリアデニル化域。欠陥ヘルパー構築物はまた
、cDNAからのウイルスRNAの合成を開始させ得る5'プロモーター、転写終結を制
御する3'配列、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、選択マ
ーカーをコードする配列、および核輸送シグナルを含み得る。

0083

「真核生物重層ベクター開始系」とは、目的の配列(単数または複数)または
遺伝子(単数または複数)の発現を指向し得るアセンブリをいう。真核生物重層
ベクター開始系は、cDNAからのインビボ(即ち、細胞内)でのRNAの合成を開始
させ得る5'プロモーター、および真核生物細胞におけるそれ自身の複製を指向し
、かつ異種配列を発現させ得る核酸ベクター配列を含むべきである。それ自身の
増幅を指向し得る核酸配列は、ウイルス起源であってもなくてもよい。特定の実
施態様では、核酸ベクター配列はアルファウイルス由来配列であり、そして、ア
ルファウイルスRNAの転写を開始させ得る5'配列(背景では、5’CSEとも称され
る)、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパ
ク質(例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)をコードする配列、およびアルファウ
イルスRNAポリメラーゼ認識配列(背景では、3’CSEとも称される)で構成され
る。さらに、ベクター配列は、特定の実施態様において、サブゲノムフラグメン
トのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、または減少させるように改変され得
るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター、1つ以上の構造タンパク質遺
伝子由来の配列またはその部分、至適な増幅を可能にするのに充分なサイズであ
る外来性核酸分子(単数または複数)、発現されるべき異種配列、異種配列の挿
入のための1つ以上の制限部位、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。真核
生物重層ベクター開始系はまた、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシ
ング配列、核輸送シグナル、および転写終結配列を含み得る。特定の実施態様で
は、cDNAからのベクター核酸配列のインビボ合成は、誘導性プロモーターの使用
によって調節され得る。

0084

「アルファウイルスcDNAベクター構築物」とは、目的の配列(単数または複数
)または遺伝子(単数または複数)の発現を指向し得るアセンブリをいう。ベク
ター構築物は、アルファウイルスRNAの転写を開始させ得る5'配列(背景では、5
’CSEとも称される)、ならびに発現されたとき生物学的に活性なアルファウイ
ルス非構造タンパク質(例えば、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)をコードする配列、
およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列(背景では、3’CSEとも称さ
れる)で構成される。さらに、ベクター構築物は、cDNAからのウイルスRNAの合
成をインビボで開始させ得る5'プロモーター、および転写終結を制御する3'配列
を含むべきである。特定の実施態様では、ベクター構築物は、特定の実施態様に
おいて、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を防ぐか、増大させるか、また
は減少させるように改変され得るウイルスサブゲノム「連結領域」プロモーター
をさらに含み得る。ベクターはまた、1つ以上の構造タンパク質遺伝子由来の配
列またはその部分、生存可能なウイルスの生成を可能にするのに充分なサイズで
ある外来性核酸分子(単数または複数)、発現されるべき異種配列、異種配列の
挿入のための1つ以上の制限部位、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセ
シング配列、核輸送シグナル、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。特定の
実施態様では、cDNAからのウイルスRNAのインビボ合成は、誘導性プロモーター
の使用によって調節され得る。

0085

「遺伝子送達ビヒクル」とは、目的の遺伝子または配列を送達するために利用
され得る構築物をいう。代表例は、アルファウイルスRNAベクターレプリコン、
アルファウイルスベクター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換え
アルファウイルス粒子を含む。

0086

本発明の多数の局面および利点は、以下の詳細な説明を考慮すると当業者に明
らかである。この詳細な説明により、本発明の実施の啓発が提供される。
発明の詳細な説明

0087

上記のように、本発明は、例えば、RNAベクターレプリコン、アルファウイル
スベクター構築物、真核生物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイル
ス粒子を含む、新規な遺伝子送達ビヒクルを提供する。簡略には、プラスミドDN
A、インビトロで転写されたRNA、または粒子に基づく、本発明のベクターの細胞
への導入は、野生型由来アルファウイルスベクターの発現レベルと比較して等価
であるかまたは高いレベルの異種遺伝子発現をもたらす。しかし、予想外に、合
成されるベクター特異的RNAのレベルは、本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む培
養細胞においては、野生型由来ベクターと比較して少なくとも約5〜10倍低い。
さらに、このような遺伝子送達ビヒクルは、宿主細胞中への導入の後に、野生型
由来ベクターと比較して阻害が減少した、遅延した、または存在しない、宿主細
胞に指向される巨大分子合成を示す。

0088

以下でより詳細に議論するように、本発明は、以下を提供する:(A)本発明の
遺伝子送達ビヒクルの構築のために適切な野生型アルファウイルスの供給源;(B
)所望の表現型を有するアルファウイルスを選択するための方法;(C)アルファウ
イルスベクター構築物およびアルファウイルスRNAベクターレプリコンの構築;(
D)真核生物重層ベクター開始系の構築;(E)組換えアルファウイルス粒子の構築
;(F)本発明の遺伝子送達ビヒクルにより発現され得る異種配列;(G)アルファウ
イルスパッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株の構築;(H)薬学的組
成物;および(I)アルファウイルスに基づくベクターを利用するための方法。
A.野生型アルファウイルスの供給源

0089

上記のように、本発明は、アルファウイルスに基づく広範囲な種々のベクター
(例えば、RNAベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生
物重層ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子)ならびにこのよう
なベクター構築物および粒子を利用するための方法を提供する。簡略には、上記
のベクターの調製における使用のために適切な野生型アルファウイルスをコード
する配列は、本明細書中に提供される開示が与えられれば、天然に存在する供給
源または寄託所(例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション,Rockvill
e,Maryland)から容易に入手され得る。さらに、野生型アルファウイルスは、
野生型アルファウイルスに感染した細胞における宿主細胞に指向される巨大分子
合成のレベルと、本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む細胞における宿主細胞に指
向される巨大分子合成のレベルとを比較するために利用され得る。

0090

適切なアルファウイルスの代表例は、アウラウイルス(ATCCVR-368)、ベバ
ルウイルス(ATCC VR-600、ATCC VR-1240)、キャバソウ(Cabassou)ウイルス
(ATCC VR-922)、チクングンヤウイルス(ATCC VR-64、ATCC VR-1241)、東部
ウマ脳脊髄炎ウイルス(ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、フォートモルガン(Fort
Morgan)ウイルス(ATCC VR-924)、ゲタウイルス(ATCC VR-369,ATCC VR-124
3)、キジルアガハ(Kyzylagach)ウイルス(ATCC VR-927)、マヤロウイルス(
ACTT VR-66、ATCC VR-1277)、ミッデルブルグウイルス(ATCC VR-370)、ムカ
ボウイルス(ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、ヌヅムウイルス(ATCC VR-371)
、ピクスナウイルス(ATCC VR-372,ATCC VR-1245)、ロスリバーウイルス(ATC
C VR-373、ATCC VR-1246)、セムリキ森林ウイルス(ATCC VR-67、ATCC VR-1247
)、シンドビスウイルス(ATCC VR-68、ATCC VR-1248;以下に記載されるCMCC番
号4640もまた参照のこと)、トナテ(Tonate)ウイルス(ATCC VR-925)、トリニティ
ウイルス(ATCC VR-469)、ウナウイルス(ATCC VR-374)、ヴェネズエラウマ脳脊髄
炎ウイルス(ATCC VR-69、ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR-1249、ATCC VR-
532)、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス(ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、AT
CC VR-1252)、ワタロアウイルス(ATCC VR-926)、およびY-62-33ウイルス(ATCC V
R-375)を含む。

0091

細胞巨大分子合成のレベルを比較する目的のために、以下のプラスミドもまた
、野生型アルファウイルスストックの標準的な供給源として利用され得る。これ

のプラスミドは、以下を含む:セムリキ森林ウイルスのためには、pSP6-SFV4(L
iljestromら,J.Virol.65:4107-4113,1991);ヴェネズエラウマ脳炎ウイルス
のためには、pV2000(Davisら,Vir.183:20-31,1991);ロスリバーウイルスの
ためには、pRR64(Kuhnら,Vir.182:430-441,1991)。簡略には、これらのプ
ラスミドのためには、プラスミド由来のインビトロで転写されたゲノムRNAでト
ランスフェクトされたBHK細胞からウイルスが入手され得る。シンドビスウイル
スのためには、感染性ウイルスは、pVGELVIS(ATCC番号75891)プラスミドDNAで
トランスフェクトされたBHK細胞から直接単離され得るか、あるいは野生型ウイ
スストックとして入手され得る(ATCC番号VR-2526に関して以下に提供される
寄託情報を参照のこと)。
B.所望の表現型を有するアルファウイルスの選択

0092

アルファウイルスに基づくベクターからのインビボ異種遺伝子発現の持続は、
いくつかの機構(宿主細胞に指向される巨大分子合成の阻害を含む)により影響
される。しかし、本発明の前には、非細胞変性表現型をもたらす、コードまたは
コードベクターウイルス特異的配列の変化を選択するかまたは同定するための
明白な方法は存在しなかった。従って、本発明の1つの局面では、宿主細胞に指
向される巨大分子合成の阻害が減少しているかまたは存在しない、アルファウイ
ルス由来遺伝子送達ビヒクルを単離および/または構築するための方法が提供さ
れる。

0093

1.ウイルス改変体の生物学的選択
a.DI粒子を含むウイルスストックからの選択

0094

非細胞変性性アルファウイルス改変体を単離するための1つのアプローチは、
野生型ウイルス調製物における欠陥妨害(DI)粒子の存在を利用する。簡略には
、特定のRNAウイルス(例えば、ラブドウイルス(例えば、水庖性口内炎ウイル
ス)およびアルファウイルス(例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林
ウイルス))は高度に細胞変性性であるが、これらはそれにもかかわらずDI粒子
の存在下で培養細胞において長期間持続した感染を確立する。定義によれば、DI
粒子は、野生型ウイルスに由来し、そしてDIによる自律的複製を防ぐ野生型ゲノ
ムからの1つ以上の変異(例えば、欠失、再編、ヌクレオチド置換など)を含む
。一般に、DI粒子のゲノムは、野生型ウイルスと比較して小さく、かつ複雑度
低く、そしてタンパク質をコードする領域を欠失しているが、複製のためにシス
で必要とされる領域は維持している。このようなシス配列は、しばしば重複およ
び/または再編されている。特定のアルファウイルス(例えば、シンドビスウイ
ルス)の場合、DI RNAゲノムの配列および編成は分析されており、そして野生型
ウイルスゲノムの一番端の3'末端由来の最小限50ntを含み、そしてその5'末端で
は、野生型配列または細胞tRNA(例えば、tRNAAsp)配列のいずれかをウイルス
配列に加えて含むことが見出されている。全ての場合において、変異DIゲノムの
増殖および維持は、感染細胞において親のヘルパーウイルスの同時存在を必要と
する。しかし、それらの遺伝構造の結果として、DIゲノム複製は、その野生型対
応物に対して非常に優れており、そして比較して豊富である。この特徴は、野生
型ゲノム複製の妨害、感染性ウイルスの非存在または低レベルの生成、および細
胞の長期間存続する感染の確立をもたらす。

0095

従って、以下で実施例1および2に記載のように、DI粒子の集団を含む混合ア
ルファウイルスストックでの感染により許容細胞(例えば、ヒト起源の細胞を含
む、哺乳動物細胞)において長期間存続する感染を確立する能力は、DI粒子の非
存在下でさえも存続する感染を確立し得る完全にインタクトなウイルス改変体を
経時的に単離するための機構を提供する。このような感染性ウイルス改変体は、
長期間存続する感染性培養物から、複数回のプラーク精製により単離され得、そ
して宿主細胞において増殖性(productive)、存続性、および非細胞変性性の感
染を開始することが見出されている。さらに、このような増殖性、存続性、およ
び非細胞変性性の感染から生成される改変体ウイルスのレベルは、野生型ウイル
ス感染と区別できない。この観察は、DI粒子の混台物を含むウイルスストックで
の存続性感染の確立の以前の必要要件とは明らかに対照的である。
b.DI粒子を含まないウイルスストックからの選択

0096

欠陥妨害粒子を含むウイルスストックからの選択に加えて、本発明での使用に
適切なウイルス改変体は、精製ウイルスストック(DI粒子を含まない)から入手
され得る。このウイルスストックは、感受性培養細胞の感染の前にランダム変異
誘発に供されるか、または培養細胞でのRNA複製の間に非特異的変異を作製させ
るかのいずれかである。簡略には、最初のウイルスストックは、天然の単離株
たはそれに由来する生物学的改変体として入手され得るか、または培養細胞を、
ゲノムcDNAクローンまたはインビトロで転写されたRNAを含む感染性核酸分子で
トランスフェクトすることにより作製され得る。所望の場合、次いで、ウイルス
ストックは、物理的または化学的変異誘発に供され得る(好ましいとはいえ、こ
のような変異誘発は必要ではない)。化学的変異誘発の場合、好ましい実施態様
は、容易に利用され得る変異誘発剤(例えば、亜硝酸、5-アザシチジン、N-メチ
ル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、またはエチルメタンスルホン酸(Sigma,
St.Louis,MO))をウイルス感染の前に利用する。ランダム変異誘発の後に、
特異的選択手順を適用して、以下の実施例2により詳細に記載するような所望の
表現型を有するウイルス改変体が単離される。

0097

2.ウイルス改変体の遺伝的選択

0098

関連するアプローチにおいて、変異は、ウイルスストックを用いずに、むしろ
ウイルスのクローン化ゲノムcDNAを用いて入手され得る。このウイルスは、その
後、感染性ウイルスRNAをインビトロで(例えば、シンドビスウイルス(Riceら,
J.Virol.61:3809-3819,1987;Dubenskyら,J.Virol.70:508-519,1996)、
183:20-31,1991)、ロスリバーウイルス(Kuhnら,Virology 182:430-441,199
1)、ポリオウイルス(Van Der Werfら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2330-23
34,1986))またはインビボで(シンドビスウイルス(Dubenskyら、同書)、ポリ
オウイルス(RacanielloおよびBaltimore,Science 214:916-919,1981))転写
するために使用され得る。簡略には、感染性核酸は、直接に、または上記の方法
の1つを用いて行った変異誘発の後のいずれかに、感受性培養細胞(例えば、ヒ
ト起源の細胞を含む、哺乳動物細胞)中に導入される。あるいは、ベクター核酸
は、粒子中に最初にパッケージングされ得、そして粒子は選択のために標的細胞
集団にベクターを送達するために使用され得る。続いて、所望の表現型を有する
ウイルス改変体を単離するための特異的選択手順が適用され、そして以下に記載
される。

0099

特定の実施態様において、ランダム変異誘発は、E.coliのXL1-Red株(Stratag
ene,San Diego,CA)においてウイルスcDNAを含むプラスミドの増殖により最初
に実施され得る。この株は、mutS、mutD、およびmutT変異に起因して、3つの主
要なDNA修復経路欠損している。しかし、他の変異誘発手順(リンカースキャ
ニング変異誘発(Haltinerら,Nucleic AcidsRes.13:1015,1985;Barany,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82:4202,1985)、ランダムオリゴヌクレオチド特異
的変異誘発(Kunkelら,Methods Enzymol.155:166,1987;ZollerおよびSmith,
Mathods Enzymol.154:329,1987;Hillら,Methods Enzymol.155:558,1987;He
rmesら,Gene 84:143,1989)、およびPCR変異誘発(HerlitzeおよびKoenen,Ge
ne 91:143,1990)を含むがこれらに限定されない)が、公開されたプロトコル
を利用して容易に置換され得る。得られる変異cDNAクローンの混合集団は、感受
性培養細胞中に、直接的にまたはインビトロでの転写の後に導入される。所望の
表現型の変異ウイルスを含むトランスフェクト細胞についての富化は、以下のよ
うに、野生型ウイルスに感染した細胞を越える増加した生存時間に基づいて達成
される。

0100

3.ウイルス由来ベクターを用いる改変体の遺伝的選択

0101

別のアプローチにおいて、変異は、ウイルス由来発現ベクターの任意の領域(
調節領域、非翻訳領域、またはタンパク質コード遺伝子領域を含む)において作
製され得る。例えば、本発明の1つの局面において、宿主細胞に指向される巨大
分子合成の阻害が低減しているかまたは存在しないウイルス改変体を選択するた
めの方法が提供される。この方法は、(a)細胞に真核生物重層ベクター開始系、R
NAベクターレプリコン、または免疫原性細胞表面タンパク質の発現を行う(ベク
ター含有細胞の検出に適切な)組換えアルファウイルス粒子、あるいは選択マー
カー(薬物または非薬物マーカーのいずれかであって、ここで、非ベクター含有
細胞は、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、gpt、ピ
ューロマイシン、またはヒスチジノールのような薬物の添加の際に殺傷される)
を導入する工程;(b)所望の表現型を示すベクター含有細胞を選択する条件下で
そしてそれに十分な時間で細胞をインキュベートまたは培養する工程;その後、
(c)所望の表現型のベクターを含む細胞を単離する工程、および(d)原因の変
異についてベクターを分析する工程を含む。

0102

上記のように、本発明のウイルスベクターは、広範囲な種々のウイルス(例え
ば、シンドビスウイルス(Xiongら,Science 243:1188-1191,1989;Hahnら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA89:2679-2683,1992;Schlesinger,TrendsBiotechnol
.11:18-22,1993;Dubenskyら,同書)、セムリキ森林ウイルス(Liljestromお
よびGaroff,Bio/Technology 9:1356-1361,1991)、ヴェネズエラウマ脳炎ウイ
ルス(Davisら,J.Cell.Biochem.Suppl.19A:310,1995)、ポリオウイルス
(Choiら,J.Virol.65:2875-2883,1991;Ansardiら,Cancer Res.54:6359-63
64,1994;およびAndinoら,Science 265:1448-1451,1994))に由来し得る。上
記の方法の代表例は、以下の実施例2により詳細に議論される。

0103

4.ウイルス改変体の使用

0104

本明細書中でより詳細に議論するように、本明細書中に提供される方法を利用
して選択または作製されたウイルス改変体は、所望の表現型を示す広範囲な種々
組換え遺伝子送達ビヒクルを構築するために利用され得る。特定の実施態様で
は、遺伝子送達ビヒクルは、nsP2遺伝子のLeu-Xaa-Pro-Gly-Gly(「LXPGG」)モ
チーフ内に変異を含む。簡略には、nsP2遺伝子の公開された配列が利用可能であ
るアルファウイルスについては、高度に保存されたアミノ酸モチーフ-Leu-Xaa-P
ro-Gly-Gly-(「LXPGG」)が観察される。標準的なタンパク質モデリングアルゴ
リズム(ChouおよびFasman,Adv.Enzym.47:45-148,1978)により推定された
ように、このモチーフの残基は、構造中におそらくβターンを含む。シンドビス
ウイルスにおけるnsP2のプロリン726は、このモチーフの中心の残基である。他
のアルファウイルスにおける対応するモチーフを以下の表に例示する。
*公開されたnsP2配列を有するアルファウイルス株:(1)Straussら,Virology 13
3:92-110,1984;(2)Simpsonら,Virology 222:464-4691996:(3)Shirakoら,Vir
ology 182:753-764,1991;(4)Rumenapfら,Virology 208:621-633,1995;(5)Tak
kinen,Nucleic AcidsRes.14:5667-5682,1986;(6)Kinneyら,Virology 170:1
9-30,1989;および(7)Faragherら,Virology 163:509-526,1988。

0105

それ故、本発明の種々の実施態様においては、遺伝子送達ビヒクルが提供され
る。ここで、遺伝子送達ビヒクルは、LXPGGモチーフに変異を有するnsP2遺伝子
を含む。1つの実施態様では、Leuコドンは、Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、G
ln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Lys、MeLPhe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、
または別の稀なもしくな非タンパク質性のアミノ酸(例えば、Lehninger,Bioch
emistry,Worth Publishers,Inc.N.Y.N.Y.,1975を参照のこと)からなる群
より選択される別のアミノ酸に変異される。別の実施態様では、Proコドンは、A
la,Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Glu、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Mel
、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、または別の稀なもしくな非タンパク質性のア
ミノ酸からなる群より選択される別のアミノ酸に変異される。他の実施態様では
、Glyコドンのいずれかまたは両方は、Ala、Arg、Asn、Asp、Asx、Cys、Gln、Gl
u、
Glx、His、Ile、Leu、Lys,Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、または
別の稀なもしくな非タンパク質性のアミノ酸からなる群より選択される別のアミ
ノ酸に変異され得る。さらに他の実施態様では、Xaaアミノ酸またはLXPGGモチー
フの1〜3残基上流もしくは下流のアミノ酸は、得られる遺伝子送達ビヒクルの
表現型に影響を与えるために、野生型アミノ酸から変異され得る。本発明の特定
の実施態様では、LXPGGモチーフは、1つより多くのコドンの改変、あるいは1
つ以上の挿入または欠失を含むように変異され得る。
C.アルファウイルスベクター構築物およびアルファウイルスRNAベクターレプ
リコン

0106

上記のように、本発明は、アルファウイルスに由来するDNAおよびRNAの両方の
構築物を提供する。簡略には、本発明の1つの局面では、cDNAからのウイルスRN
Aの合成をインビトロで開始する5'プロモーター、アルファウイルスRNAの転写を
開始する5'配列、4つの全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能に
コードする核酸分子(上記のような単離された核酸分子、アルファウイルスRNA
ポリメラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル化域を含む)を含むアルファウイ
ルスベクター構築物が提供される。他の局面では、アルファウイルスRNAの転写
を開始する5'配列、4つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能に
コードする核酸分子(上記の単離された核酸分子、アルファウイルスRNAポリメ
ラーゼ認識配列、および3'ポリアデニル化域を含む)を含むRNAベクターレプリ
コンが提供される。上記の好ましい実施態様では、上記の構築物はさらに、ウイ
ルス連結領域を含む。これらの局面のそれぞれは、以下でより詳細に議論される

0107

1.ウイルスRNAの合成を開始する5'プロモーター

0108

上記のように、本発明の特定の実施態様において、インビトロ転写のプロセス
によりcDNAからのウイルスRNAの合成を開始する5'プロモーター(例えば、DNA依
存性RNAポリメラーゼプロモーター)を含むアルファウイルスベクター構築物が
提供される。好ましい実施態様では、このようなプロモーターは、例えば、バク
リオファージT7、T3、およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含む。同様
に、インビボで(すなわち細胞内で)cDNAからのウイルスRNAの合成を開始する5
'プロモーター(例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター)を含む真核
生物重層ベクター開始系が提供される。特定の実施態様では、このようなRNAポ
メラーゼプロモーター(アルファウイルスベクター構築物または真核生物重層
ベクター開始系のいずれか)は、原核生物および真核生物の両方に由来し得、そ
して例えば、細菌のβ-ガラクトシダーゼおよびtrpEプロモーター、ならびに真
核生物ウイルスのシミアンウイルス40(SV40)(例えば、初期または後期)、サ
イトメガロウイルス(CMV)(例えば、即時型)、モロニーマウス白血病ウイル
ス(MoMLV)またはラウス肉腫ウイルス(RSV)LTR、および単純ヘルペスウイル
ス(HSV)(チミジンキナーゼ)のプロモーターを含む。

0109

2.転写を開始する配列

0110

上記のように、好ましい実施態様では、本発明のアルファウイルスベクター構
築物およびRNAベクターレプリコンは、アルファウイルスRNAの転写を開始し得る
5'配列(5'末端CSEまたは5'シス複製配列ともいう)を含む。このような配列の
代表例は、野生型シンドビスウイルスのヌクレオチド1〜60、および塩基150〜21
0に沿ったより少ない範囲のヌクレオチド、tRNAAspのヌクレオチド10〜75(アス
パラギン酸、Schlesingerら、米国特許第5,091,309号)、ならびに転写を開始す
る他のアルファウイルス由来の5'配列を含む。一鎖ゲノムコピーの3'末端に対応
する配列、nsPレプリカーゼ複合体により結合される配列、およびおそらくさら
なる宿主細胞因子(ここからポジティブ鎖ゲノムRNAの転写が開始される)は、
これらの配列相補物である。

0111

3.アルファウイルス非構造タンパク質

0112

本明細書中に提供されるアルファウイルスベクター構築物およびRNAベクター
レプリコンはまた、4つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質(上記の所望
の表現型を提供する配列を含む)をコードする配列を必要とする。簡略には、ア
ルファウイルス非構造タンパク質をコードする広範な種々の配列は、本明細書中
に明白に提供されるものに加えて、本発明において利用され得、従って、用語「
アルファウイルス非構造タンパク質」の範囲内にあると判断される。例えば、遺
伝コードの縮重のために、1つより多くのコドンが、所定のアミノ酸をコードし
得る。従って、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする広範な種々の
核酸配列が作製され得る。さらに、多数の任意の位置でのアミノ酸の置換、付加
、または欠失は、機能的または生物学的に活性な非構造タンパク質を依然として
提供し得る。本発明の状況においては、アルファウイルス非構造タンパク質は、
これらがベクター構築物の自己複製(すなわち、ウイルス核酸の複製および必然
的にではないが感染性ウイルスの生成)を促進する場合、生物学的に活性である
と判断され、そして経時的に行われる代謝的標識またはRNase保護アッセイによ
り容易に決定され得る。このような誘導体を作製するための方法は、本明細書中
に提供される開示が与えられれば、当業者により容易に達成され得る。

0113

アルファウイルスは、4つの非構造タンパク質(nsp1、nsp2、nsp3、およびns
p4と称される)を発現する。アルファウイルスに由来する本発明のベクターは、
4つの非構造タンパク質をコードする配列を含むべきである。野生型シンドビス
ウイルスでは、非構造タンパク質1〜3はヌクレオチド60〜5747によりコードさ
れるが、nsP4はヌクレオチド5769〜7598によりコードされる(図1を参照のこと
)。非構造タンパク質は、(1)nsP3のコード領域とnsP4のコード領域との間にオ
パール終結コドンが存在するか否か、および(ii)このようなオパールコドンが存
在する場合、新生ポリペプチドの翻訳終結がその点に存在するか、または読み通
され、それゆえP1234の生成となるかに依存して、ゲノムのポジティブ鎖RNAから
、それぞれ、P123またはP1234として知られる2つの大きなポリタンパク質の1
つとして翻訳される。オパール終結コドンは、アルファウイルスSIN(株AR339お
よび本明細書中に記載されるSIN-1株)、アウラ、WEE、EEE、VEE、およびRRのns
P3/nsP4連結部に存在し、従ってP123およびP1234種は、これらのウイルスで感染
した細胞において発現される。対照的に、終結コドンは、アルファウイルスSIN
(株AR86、SF、およびONN)のnsP3/nsP4連結部に存在せず、従ってこれらのウイ
ルスで感染した細胞においてはP1234種のみが発現される。ポリタンパク質およ
びプロセシングされたモノマー形態の非構造タンパク質は、アルファウイルスRN
Aゲノムの複製において機能する。アルファウイルス非構造タンパク質の切断変
異体の増殖特徴を調べる実験は、ポリタンパク質は、ゲノムのネガティブ鎖RNA
の合成に関与するが、個々のモノマータンパク質は、ゲノムおよびサブゲノムの
ポジティブ鎖RNA種の合成を触媒することを示した(ShirakoおよびStrauss,J.
Virol.68:1874-1885,1994)。翻訳読み通しは、一般に、nsP3/nsP4連結部にオ
パール終結コドンを含む野生型シンドビスウイルスで感染した細胞において、1
回に約10%〜20%で生じる。P123およびP1234のプロセシングは、非構造タンパ
ク質の1つによりコードされるプロテイナーゼ活性によるものであり、そして以
下にさらに議論される。シスかまたはトランスかのプロセシングの順番は、種々
要因感染段階を含む)に依存する。例えば、シンドビスウイルスおよびSFV
は、P123およびnsp4を感染の初期に、そしてP12およびP34を感染の後期に生成す
る。次いでさらなるプロセシングが個々の非構造タンパク質を放出する。各非構
造タンパク質は、いくつかの機能を有する。これらのいくつかを以下に記載する

a.nsP1

0114

非構造タンパク質1は、一鎖RNA合成の開始(または継続)のために必要とさ
れる。これはまた、転写の間に、ゲノムおよびサブゲノムのアルファウイルスRN
Aの5'末端のキャッピングにおいて役割を果たす。なぜなら、nsP1は、メチル
ランスフェラーゼ活性(MiおよびStollar,Vir.184:423-427,1991)およびグ
アニトランスフェラーゼ活性(StraussおよびStrauss,Microbiol.Rev.58(3
):491-562,1994)の両方を有するからである。nsP1はまた、nsP2のプロテイ
ーゼ活性を調節する。なぜなら、nsP1含有ポリタンパク質は、nsP2とnsP3との間
で非効率的に切断されるからである(de Grootら,EMBO J.9:2631-2638,1990
)。
b.nsP2

0115

非構造タンパク質2は、ウイルスRNAの複製および非構造ポリタンパク質のプ
ロセシングに関与する多機能性タンパク質である。このタンパク質のN末端ドメ
イン(最初の460アミノ酸にほぼまたがる)は、RNA複製および転写の間に二重鎖
ねじれを戻すのに活性であるヘリカーゼであると考えられる。本発明によるベ
クターにおける26SサブゲノムmRNA(目的の遺伝子(単数または複数)をコード
する)の合成は、機能的nsP2を必要とする。シンドビスウイルスのアミノ酸残基
460〜807の間のnsP2のC末端ドメインは、非構造ポリタンパク質を、nsP1/nsP2
、nsP2/nsP3、およびnsP3/nsP4連結部の間でトランスおよびシスでタンパク質分

により切断する。アルファウイルスnsP2 C末端ドメインの一次配列アライン
メントは、nsP2がパパイン様プロテイナーゼであることを示唆する(Hardyおよ
びStrauss,J.Vlrol.63:4653-4664,1988)。

0116

nsP2の他の観察された特徴は、アルファウイルスの増殖に直接関連する機能に
未だに割り当てられていない。例えば、nsP2が、SFV感染細胞においてリボソー
ムと密接に関連し、そしてUV照射によりrRNA架橋され得ることが示されている
(Rankiら,FEBSLett.108:299-302,1979)。さらに、50%のnsP2は、SFV感染
BHK細胞の核マトリックス、特に核小体の領域に局在する(Perinenら,J.Virol
.64:1888-1896,1990)。核へのnsP2の局在は、おそらく活性な輸送により進行
される。なぜなら、これは核コア複合体を通しての拡散により核に侵入し得る小
タンパク質および代謝産物のサイズ(約20〜60kD)を越えるからである(Paine
ら,Nature 254:109-114,1975)。推定のNLS配列は、アルファウイルスSFV、SI
N、RR、ONN,OCK、およびVEEにおいて同定されている(Rikkonenら,Vir.189:4
62-473,1992)。
c.nsP3

0117

非構造タンパク質nsP3は、ウイルス複製におけるそれらの正確な役割は十分に
は理解されていないとはいえ、2つの異なるドメインを含む。種々のアルファウ
イルスにおいてN末端ドメインは、322〜329残基長の範囲であり、そして任意の
2つのアルファウイルス間で最小51%のアミノ酸配列同一性を示す。しかし、C
末端ドメインは、公知のアルファウイルス間で長さも配列も保存されておらず、
そして複数の変化が許容される(Liら,Virology,179:416-427)。タンパク質
は、高度にリン酸化された状態で複製複合体と会合して見出される。そのゲノム
中にnsP3/nsP4連結部の間でオパール終結コドンを含むアルファウイルスにおい
て、オパール終結シグナルの読み通しが存在するか否かに依存して、2つの異な
るタンパク質が生成される。読み通しは、ポリタンパク質の切断後に7個のさら
なるカルボキシ末端アミノ酸を含むnsP3タンパク質を生じる。nsP3がウイルスRN
A合成の何らかの能力に必要とされることは明白である。なぜなら、このタンパ
ク質の特定の変異体はRNAネガティブであり、そしてP123ポリタンパク質は一鎖R
NA合成に必要とされるからである。
d.nsP4

0118

nsP4は、ウイルスにコードされるRNAポリメラーゼであり、そしてこのような
酵素に特有GDDモチーフを含む(KamerおよびArgos,Nucleic AcidsRes.12:7
269-7282,1984)。従って、nsP4は、アルファウイルスRNA複製に不可欠である
。nsP4の濃度は、感染細胞において厳密に調節される。ほとんどのアルファウイ
ルスにおいて、nsP4の翻訳は、nsP3コード領域とnsP4コード領域との間のオパー
ルコドンの読み通しを必要とし、他の非構造タンパク質と比較して細胞内レベル
が低い。さらに、nsP4の大半は、N末端規則経路(Gondaら,J.Biol.Chem.26
4:16700-16712,1989)による分解を通して代謝的に不安定である。しかし、分
シグナルを隠す複製複合体とのその会合に起因して、いくらかのnsP4は安定で
ある。従って、アミノ末端残基を改変することによる酵素の安定化は、本明細書
中に記載されるベクターによりコードされるタンパク質のより長期間の発現を促
進するのに有用であることを証明し得る。安定化アミノ末端残基は、メチオニン
アラニン、およびチロシンを含む。

0119

4.ウイルス連結領域

0120

アルファウイルスウイルス連結領域は、通常、サブゲノムmRNAの転写開始を制
御する;従って、このエレメントはまた、サブゲノムmRNAプロモーターとも呼ば
れる。シンドビスウイルスの場合、通常のウイルス連結領域は、代表的には、ほ
ぼヌクレオチド数7579で始まり、そして少なくともヌクレオチド数7612を通って
連続する(そしておそらくそれを越える)。最小では、ヌクレオチド7579〜7602
(5'-ATCTCTACGGTG GTC CTA AAT AGT-配列番号1)が、サブゲノムフラグメ
ントの転写に必要であると考えられる。この領域(ヌクレオチド7579〜7602)を
、本明細書中以下で「最小の連結領域コア」という。

0121

本発明の特定の局面では、ウイルス連結領域は、サブゲノムフラグメントの合
成を防ぐために不活化される。本発明の状況において利用されるように、「不活
化」は、記載されたように(FrolovおよびSchlesinger,J.Virol.68:1721-172
7,1994)、サブゲノムmRNAに対応する種が、これらのベクターを含む細胞から
精製され、そして1μg/mlダクチノマイシンで処理され、そして[3H]−ウリ
ジンで標識され、電気泳動されたRNAの変性ゲルからのオートラジオグラムにお
いて観察されないことを意味する。

0122

本発明の1つの実施態様では、遺伝子送達ビヒクルは、リボゾームの読み通し
または無能力化された連結領域プロモーターのすぐ下流の内部リボゾーム侵入の
いずれかを促進するシグナルの置換により構築され得る。このベクター構成にお
いて、サブゲノムメッセージの合成は起こり得ない;しかし、異種タンパク質は
リボゾームの読み通し(スキャニング)または内部リボゾーム侵入のいずれかに
より、ゲノム長のmRNAから発現される。

0123

本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルの特定の適用において、1つより
多くの異種遺伝子の発現が所望される。例えば、ゴシェ症候群(Gaucher's synd
rome)のような代謝性疾患の処置のためには、治療用緩和剤の持続が限定され得
るため、遺伝子送達ビヒクルまたは粒子の複数回投与が必要であり得る。従って
、本発明の特定の実施態様においては、グルコセレブロシダーゼ遺伝子のような
治療用緩和剤とともに、標的細胞においてアデノウイルス2 E3遺伝子を同時発現
することが所望され得る。野生型ウイルスでは、構造タンパク質(「sP」)ポリ
シストロン性メッセージは単一のポリタンパク質に翻訳され、これは次に部分的
にsPキャプシドプロテイナーゼにより切断されて個々のタンパク質にプロセシン
グされる。従って、キャプシドsPのプロテアーゼ活性、または切断のために認識
されるペプチドがアルファウイルスベクターの置換領域内に存在しないため、ポ
リシストロン性メッセージからの複数の異種遺伝子の発現は、野生型ウイルスと
は異なる機構を必要とする。従って、本発明のさらなる実施態様では、複数の独
立の異種配列の翻訳を可能にする機能的エレメント(リボゾームの読み通し、キ
ャップとは独立の翻訳、内部リボゾーム侵入、または最小連結領域コア配列を含
む)が利用され得る。

0124

5.アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列およびポリ(A)域

0125

上記のように、本発明のアルファウイルスベクター構築物またはRNAベクター
レプリコンはまた、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列(「アルファウ
イルスレプリカーゼ認識配列」、「3'末端CSE」、または「3'シス複製配列」と
もいう)を含むべきである。簡略には、ポジティブ鎖ゲノムRNAの3'末端領域に
位置するアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列は、このウイルスがネガテ
ィブ鎖の合成によって複製を始める認識部位を提供する。アルファウイルスRNA
ポリメラーゼ認識配列として、広範な種々の配列が利用され得る。例えば、1つ
の実施態様において、ポリメラーゼ認識が、認識配列としてなお機能し得る最小
の領域(例えば、ヌクレオチド11,684〜11,703)まで端が切断されているシンドビ
スウイルスベクター構築物が利用され得る。本発明の別の実施態様において、E1
sP遺伝子の下流の非翻訳領域全体からウイルスゲノムの3'末端までがポリメラ
ーゼ認識部位を含む(例えば、ヌクレオチド11,382〜11,703)、シンドビスウイ
ルスベクター構築物が利用され得る。

0126

本発明の好ましい実施態様において、アルファウイルスベクター構築物または
RNAベクターレプリコンはさらにポリ(A)域を含み得る。これは、アルファウイル
ス由来ベクターでトランスフェクトした細胞における異種遺伝子発現の観察レベ
ルを劇的に増加させる(例えば、Dubenskyら、前出を参照のこと)。簡略には、
ポリ(A)域は、細胞質中での安定性を促進し、それにより、ウイルスの生活環
開始効率を上昇させるに十分な任意のサイズであり得る。本発明の種々の実施態
様において、ポリ(A)配列は少なくとも10アデノシンヌクレオチド、そして最も
好ましくは、少なくとも25アデノシンヌクレオチドを含む。1つの実施態様にお
いて、ポリ(A)配列は、シンドビスウイルスヌクレオチド11,703に直接結合され
る。
D.真核生物重層ベクター開始系

0127

全長ゲノムアルファウイルスcDNAクローンのサイズのため、インビトロでの全
長のキャップされたRNA分子の転写は、むしろ効率が悪い。これは、トランスフ
ェクトされたRNAのインビトロ転写量に対して、ウイルスの感染中心に関して低
トランスフェクション効率をもたらす(プラーク形成により測定される)。こ
のような効率の悪さはまた、インビトロでのアルファウイルス発現ベクターの転
写に関連する。従って、感染サイクルを開始する能力または異種配列の発現を指
向する能力について候補cDNAクローンおよび他のアルファウイルスcDNA発現ベク
ターを試験することは、cDNAクローンが、DNA分子として感受性細胞にトランス
フェクトされ、これが次いでインビボでウイルスRNAの合成を指向する場合、非
常に促進され得る。

0128

従って、本発明の1つの局面において、インビボでのウイルスRNA(ゲノムま
たはベクター)の合成を指向し得る、DNAに基づくベクター(「真核生物重層ベ
クター開始系」という)が提供される。一般に、真核生物重層ベクター開始系は
、インビボ(すなわち、細胞内)でcDNAからのRNAの5'合成を開始し得る5'プロ
モーター、細胞中でのそれ自身の複製を指向し得る構築物(この構築物はまた、
異種核酸配列を発現し得る)、および転写終結を制御する3'配列(例えば、ポリ
アデニル化域)を含む。このような真核生物重層ベクター開始系は、異種ヌクレ
オチド配列の発現を制御する、2段階または「重層」機構を提供する。簡略には
、第1の層は第2の層の転写を開始し、そしてインビボでcDNAからのRNAの5'か
ら3'への合成を開始し得るプロモーター(例えば、5'真核生物プロモーター)を
含み、そしてさらに他のエレメント(3'転写終結/ポリアデニル化部位、1つ以
上のスプライス部位を含む)、ならびに他のRNA核輸送エレメント(例えば、B型
肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント(PRE)(Huangら,Mol.Cell.Biol.13:74
76,1993;Huangら,J.Virol.68:3193,1994;HuangらMol.Cell.Biol.15:386
4-3869,1995)、メイソン-ファイザーサルウイルスの構成性輸送エレメント(C
TE)(Brayら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1256-1260,1994)、HIVRev応
答性エレメント(Malimら,Nature 338:254-257,1989;Cullenら,TrendsBioche
m.Sci.16:346,1991)を含む)、および、所望であれば、他の同様のエレメント
を含み得る。本発明での使用に適切な代表的なプロモーターは、真核生物性(例
えば、pol I、II、またはIII)および原核生物性プロモーター、ならびに誘導性
または非誘導性(すなわち、構成性)プロモーター(例えば、モロニーマウス
血病ウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコ
ドプロモーター、Drosophilaアクチン5C遠位プロモーター、SV40プロモーター
熱ショックタンパク質65プロモーター、熱ショックタンパク質70プロモーター
免疫グロブリンプロモーター、マウスポリオーマウイルスプロモーター(Py)
、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、BK
ウイルスおよびJCウイルスのプロモーター、マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロ
モーター、アルファウイルス連結領域、CMVプロモーター、アデノ
ウイルスE1またはVAIRNAのプロモーター、rRNAプロモーター、tRNAメチオニンプ
ロモーター、CaMV 35Sプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、テト
ラサイクリン応答性プロモーター、およびlacプロモーターを含む。

0129

本発明のなお他の実施態様では、誘導性プロモーターが利用され得る。例えば
、1つの実施態様において、DNAからのRNAの合成を開始する誘導性プロモーター
が提供される。誘導性プロモーターは、コアRNAポリメラーゼプロモーター配列
、および転写アクチベータ一タンパク質のDNA結合を指向する作動可能に連結さ
れた核酸配列、および転写リプレッサータンパク質のDNA結合を指向する作動可
能に連結された核酸配列を含む。さらなる実施態様において、転写アクチベータ
ータンパク質のDNA結合を指向する核酸配列は、テトラサイクリンリプレッサー
/VP16トランスアクチベーター融合タンパク質を結合する配列である。さらに別
の実施態様において、転写リプレッサータンパク質のDNA結合を指向する核酸配
列は、ラクトースリプレッサー/Kruppelドメイン融合タンパク質を結合する配
列である。

0130

第2の層は、1つ以上の異種ヌクレオチド配列を発現し得、そして自律的にま
たは1つ以上の因子(例えば、誘導性である)に応答してのいずれかで細胞中で
それ自身の複製を指向し得る、自己触媒ベクター構築物を含む。第2の層は、ウ
イルス起源または非ウイルス起源であり得る。本発明の1つの実施態様において
、第2の層の構築物は、上記のアルファウイルスベクター構築物であり得る。

0131

真核生物重層ベクター開始系の第1の層として広範な種々のベクター系が使用
され得、以下のDNAウイルスから開発されるウイルスベクター構築物を含む:例
えば、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスを含むポックスウイ
ルス科(例えば、Fisher-Hochら、PNAS 86:317-321、1989;Flexnerら、Ann.N.Y
.Acad.Sci.569:86-103、1989;Flexnerら、Vaccine 8:17-21,1990;米国特
許第4,603,112号、同第4,769,330号、および同第5,017,487号;WO 89/01973);B
KV、JCVまたはSV40のようなパポーバウイルス科(例えば、Mulliganら、Nature 2
77:108-114、1979);アデノウイルスのようなアデノウイルス科(例えば、Berkner
ら、Biotechniques 6:616-627、1988;Rosenfeldら、Science 252:431-434、1991
);アデノ関連ウイルスのようなパルボウイルス科(例えば、Samulsk
iら、J.Vir.63:3822-3828、1989;Mendelsonら、Virol.166:154-165、1988;PA
7/222,684);単純ヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルス科(例えば、Kit
,Adv.Exp.Med.Biol.215:219-236、1989);およびヘパドナウイルス科(例
えば、HBV)、ならびにレトロウイルス科のようなDNA中間体を通して複製される
特定のRNAウイルス(例えば、米国特許第4,777,127号、GB 2,200,651、EP 0,345
,242、およびWO91/02805;MoMLVのような白血病中のウイルスおよびHIVのような
免疫不全症ウイルスを含むレトロウイルス科(例えば、Ponzansky.J.Virol.65
:532-536、1991を参照のこと)。

0132

同様に、広範な種々のベクター系は、真核生物重層ベクター開始系の第2の層
として利用され得、例えば、以下の科のウイルス由来のベクター系を含む:ピコ
ルナウイルス科(例えば、ポリオウイルス、ライノウイルスコクサッキーウイ
ルス)、カリチウイルス科、トガウイルス科(例えば、アルファウイルス、風疹
)、フラビウイルス科(例えば、黄熱病、HCV)、コロナウイルス科(例えば、H
CV、TGEV、IBV、MHV、BCV)、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科レトロ
イルス科(例えば、RSV、MoMLV、HIV、HTLV)、デルタ型肝炎ウイルス、および
アストロウイルス。さらに、非哺乳動物RNAウイルス(ならびにそれら由来の成
分)もまた利用され得、それは、例えば、細菌およびバクテリオファージレプリ
カーゼ、ならびにポテックスウイルス(例えば、PVX)、カルラウイルス(例え
ば、PVM)、トブラウイルス(例えば、TRV、PEBV、PRV)、トバモウイルス(例
えば、TMV、ToMV、PPMV)、ルテオウイルス(例えば、PLRV)、ポティウイルス
(例えば、TEV、PPV、PVY)、トムブスウイルス(例えば、CyRSV)、ネポウイル
ス(例えば、GFLV)、ブロモウイルス(例えば、BMV)、およびトパモウイルス
(topamovirus)のような植物ウイルス由来の成分を含む。

0133

真核生物ベクター開始系の第2の層に含まれる自己触媒ベクター構築物の複製
能力は、例えば、ダクチノマイシンのような細胞RNA合成阻害剤の存在下で、ト
ランスフェクトされた細胞中でのポジティブセンスRNAおよびネガティブセンスR
NAの両方の増加を経時的に測定するリボヌクレアーゼ保護アッセイ、およびまた
トランスフェクトされた細胞中のサブゲノムRNAの合成または異種レポーター
伝子の発現を測定するアッセイを含む、当業者に公知の種々のアッセイで測定さ
れ得る。

0134

本発明の特に好ましい実施態様において、インビボでcDNAからのアルファウイ
ルスRNAの合成を開始し得る5'プロモーター(すなわち、RNA合成のDNAプロモ
ター)、続いてアルファウイルスRNAの転写を開始し得る5'配列、4つ全てのア
ルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸配列(組換えアル
ファウイルス粒子に作動可能に取り込まれた場合に、所望の表現型をもたらす上
記の核酸分子を含む)、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、および転
写終結/ポリアデニル化を制御する3'配列を含む真核生物重層ベクター開始系が
提供される。さらに、発現されるべき異種配列に作動可能に連結されたウイルス
連結領域が含まれ得る。種々の実施態様において、ウイルス連結領域は、不活化
されるというよりむしろサブゲノムフラグメントのウイルス転写が増加または減
少するように改変され得る。他の実施態様において、第2のウイルス接合領域は
、第1の不活化ウイルス連結領域に続いて挿入され得、その第2のウイルス連結
領域は、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が増加または減少するように活
性であるかまたは改変されているかのいずれかである。

0135

真核生物重層ベクター開始系の転写に引き続いて、得られるアルファウイルス
RNAベクターレプリコン分子は、アルファウイルスRNAの転写を開始し得る5'配列
、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列、ウイルス連結領域、異種ヌクレオチド配列、アルファウイルスRNAポリ
メラーゼ認識配列、およびポリアデニル化配列から構成される。

0136

アルファウイルスcDNAベクター構築物の種々の局面が上記で議論されており、
アルファウイルスの転写を開始し得る5'配列、アルファウイルス非構造タンパク
質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス連結領域(サブゲノムフラグメント
のウイルス転写を妨害するように不活化された連結領域を含む)、およびアルフ
ァウイルスRNAポリメラーゼ認識配列を含む。さらに、改変された連結領域およ
縦列連結領域もまた、上記で議論されている。

0137

本発明の別の実施態様において、真核生物重層ベクター開始系は、特定の真核
生物種、特に哺乳動物種(例えば、ヒト)由来の1つ以上の細胞株において複製
するように適合されたアルファウイルスベクター(例えば、シンドビスベクター
構築物)に由来する。例えば、発現されるべき組換えタンパク質をコードする遺
伝子がヒト起源のものであり、そしてタンパク質がヒトの治療的使用を意図され
る場合、適切なヒト細胞株における産生は、そのタンパク質がヒトにおいて生じ
ることが期待されるように、翻訳後に改変されるために好ましいかもしれない。
このアプローチは、(以下でより詳細に議論するように)組換えタンパク質の産
生をさらに増強する際に有用であり得る。ウイルスレプリカーゼの不正確さ(in
fidelity)に起因したアルファウイルスゲノムの全体的な可塑性仮定すれば、
選択された真核生物細胞(例えば、ヒト、マウス、イヌネコなど)における高
力価増殖性感染を確立する増強された能力を有する改変体株が単離され得る。さ
らに、真核生物細胞における高力価存続性感染を確立する増強された能力を有す
る改変体アルファウイルス株もまた、このアプローチを用いて単離され得る。次
いで、アルファウイルス発現ベクターは、これらの改変体株のcDNAクローンから
、本明細書中に提供される手順に従って構築され得る。

0138

本発明の別の実施態様において、真核生物重層ベクター開始系は、分化した細
胞型においてのみ転写時に活性がある、最初のアルファウイルスベクター転写の
ためのプロモーターを含む。簡略には、培養中の哺乳動物細胞(例えば、ハム
ター(例えば、ベビーハムスター腎臓細胞)またはニワトリニワトリ胚線維
細胞)に由来する細胞)のアルファウイルス感染が、典型的には細胞傷害性を生
じることが十分に確立されている。従って、安定的に形質転換またはトランスフ
ェクトされた宿主細胞株を産生するために、真核生物重層ベクター開始系が宿主
細胞中に導入され得る。ここで、最初のベクター増幅を可能にするプロモーター
は転写時に不活性なプロモーターであるが、誘導性プロモーターである。特に好
ましい実施態様において、このようなプロモーターは、分化状態依存性である。
この構成において、プロモーターの活性化およびその後のアルファウイルスDNA
ベクターの活性化は、細胞分化の誘導と同時に起きる。このような安定に形質
換またはトランスフェクトされた宿主細胞株の特定の細胞数への増殖の際に、適
切な分化刺激が提供され、それによりベクター構築物の転写、ならびに所望の遺
伝子およびコードされるポリペプチド(単数または複数)の増幅された発現が開
始される。多くのこのような分化状態依存性プロモーターは、特定の刺激の適用
により分化するように誘導され得る細胞株と同様に当業者に公知である。代表例
は、それぞれ、レチノイン酸ウマ血清、およびDMSOにより活性化される、細胞
株F9およびP19、HL60、ならびにフロイント赤白血病細胞株および有ELを含む。

0139

好ましい実施態様において、このようなプロモーターは、2つの別々の成分に
より調節され得る。例えば、実施例7に記載のように、転写アクチベーターおよ
び翻訳リプレッサーの両方についての結合部位は、作動可能に依存した様式で「
コア」プロモーターに隣接して位置する。この構成において、誘導されていない
状態は、転写アクチベーターがその認識部位を見出す能力をブロックするが、転
写リプレッサーが構成的に発現され、そしてその認識部位に結合することを可能
にすることにより維持される。誘導は、転写リプレッサーをブロックし、そして
トランスアクチベーターブロックを除去することにより可能になる。例えば、テ
トラサイクリン応答性プロモーター系(GossenおよびBujard,Proc.Natl.Acad
.Sci.89:5547-5551,1992)は、アルファウイルスベクターRNAの誘導性転写の
ために利用され得る。この系において、テトラサイクリンリプレッサーおよびHS
V-VP16トランスアクチベータードメインの「融合」タンパク質(rTA)としての
発現は、最小「コア」プロモーター(例えば、CMV)にすぐ隣接して位置するテ
トラサイクリンオペレーター配列(tet0)に特異的に結合することにより、アル
ファウイルスベクターRNAのインビボ転写を刺激する。結合およびトランス活性
化事象は、テトラサイクリンの存在により可逆的にブロックされ、そして培養培
地からテトラサイクリンを除去することにより「オン」にされ得る。転写の誘導
されない基底レベルは、異なる細胞型の間で異なるので、他の異なる最小のコア
プロモーター(例えば、HSV-tk)は、アルファウイルスベクターヌクレオチド1
と並んでいるかまたはそのすぐ近くに位置することを可能にするためにテトラサ
クリンオペレーター配列(ただし、転写開始部位は公知である)に連結され得
る。

0140

rTAトランスアクチベーターは、同じ細胞株に安定に形質転換されてもいる、
さらなる発現カセットにより提供され得る;そして特定の実施態様において、rT
A発現カセットは、それ自身自己調節され得る。自己調節rTA発現カセットの使用
は、rTAそれ自身が結合する同一のteto連結プロモーターによって発現を転写制
御とリンクさせることにより、rTAの構成的な高レベル発現に関連する潜在的な
毒性の問題を回避する。この型の系は、テトラサイクリンの存在下ではrTAがほ
とんど生成されないことを保証するが、テトラサイクリンが除去された場合には
高度に活性となるネガティブフィードバックサイクルを作製する。このような自
調節性rTA発現カセットは、プラスミドpTet-tTAk(Shockettら,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 92:6522-6526,1995)において提供される。

0141

転写抑制のために、特定のジンクフィンガータンパク質のKRAB抑制ドメインも
ノ末端領域に存在する、高度に保存された配列である。このドメインは、2つの
推定両親媒性α-ヘリックスを含み、そしてDNA結合依存性RNAポリメラーゼII転
写リプレッサーとして機能することが示されている(例えば、Lichtら,Nature3
46:76-79,1990)。他の転写因子と同様に、活性な抑制ドメインおよびDNA結合
ドメインは、別々でありそして分離し得る。従って、抑制ドメインは、融合タン
パク質として、標的化のために任意の配列特異的DNA結合タンパク質に結合さ
れ得る。従って、DNA結合タンパク質成分は、可逆的に、調節可能な様式で結合
を妨げられ得、それにより転写サイレンシングを「オフ」にし得る。例えば、ヒ
トKoxl(Thiesen,New Biol.2:363-374,1990)からのKRABドメインは、DNA結
ラクトース(lac)リプレッサータンパク質に融合されて、tet応答性プロモー
ターのすぐ近くに操作されたlacオペレーター配列への可逆的な配列特異的結合
を有するハイブリッド転写サイレンサーを形成し得る。この構成において、lac
リプレッサー/KRABドメイン融合物(rKR)の構成的な発現は、lacオペレーター
配列への結合および誘導されていないtet応答性プロモーターからの何らかの「
漏出性の」基底転写の消去をもたらす。ベクター発現が所望され、そしてテトラ
サイクリンが系から除去される場合、IPTGが添加されてrKR媒介性転写サイレン
シングを防ぐ。

0142

さらに、他のジンクフィンガータンパク質からのKRABドメイン(例えば、ZNF13
3(Tommerupら,Hum.Mol.Genet.2:1571-1575,1993)、ZNF91(Bellefroidら
,EMBO J.12:1363-1374,1993)、ZNF2(Rosatiら,Nucleic AcidsRes.1
9:5661-5667,1991))、ならびに他の移入可能なリプレッサードメイン(例えば、
Drosophila enまたはeve遺伝子(Jaynesおよび0'Farrell,EMBO J.10:1427-143
3,1991;HanおよびManley,Genes Dev.7:491-503,1993)、ヒトジンクフィン
ガータンパク質YY1(Shiら,Cell 67:377-388,1991)、ウィルムス腫瘍抑制タ
ンパク質WT1(Maddenら,Science 253:1550-1553,1991)、甲状腺ホルモンレセ
プター(Baniahmadら,EMBO J.11:1015-1023,1992)、レチノイン酸レセプタ
ー(Baniahmadら,同書)、Kid-1(Witzgallら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91
:4514-4518,1994))は、本明細書に提供される遺伝子送達ビヒクルにおいて同様
に容易に使用され得る。さらに、本システムのlacリプレッサー/lacオペレータ
ー成分は、他の供給源(例えば、トリプトファンおよびマルトースオペロン、ま
たはGAL4)に由来する任意の数の他の調節可能な系により置換され得る。
E.組換えアルファウイルス粒子、ならびに「空の」トガウイルス粒子または非
相同ウイルスRNAを含有するトガウイルス粒子の作製および使用

0143

本発明の別の局面では、真核生物標的細胞に感染し得るRNAアルファウイルス
ベクターを含有する組換えアルファウイルス粒子の作製が記載される。簡略には
、このような組換えアルファウイルス粒子は、一般に、本明細書中に記載される
ような1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、および
RNAベクターレプリコンを含む。

0144

組換えアルファウイルスベクター粒子の作製方法は、例えば、相補するベクタ
ーとインビトロで転写されたRNAに由来する欠陥ヘルパー(DH)分子あるいはプ
ラスミドDNAとの同時トランスフェクションにより、またはウイルスとの同時感
染(Xiongら,Science 243:1188-1191,1989,Bredenbeekら,J.Virol.67:643
9-6446,1993,Dubenskyら,J.Virol 70:508-519,1996およびDubenskyら,W/O
95/07994を参照のこと)により容易に達成され得る。

0145

他の局面では、アルファウイルス由来パッケージング細胞株またはプロデュ
サー細胞株から組換えアルファウイルスベクター粒子を作製するための方法が提
供される。簡略には、このようなPCLおよびそれらの安定に形質転換された構造
タンパク質発現カセットは、W/O 95/07994に記載される方法を用いて、または本
発明に記載される新規な方法を用いて誘導され得る。例えば、PCLによる組換え
アルファウイルスベクター粒子の生成は、望ましい特性を有するアルファウイル
スに基づくベクター粒子のPCLへの導入の後に達成され得る(実施例6を参照の
こと)。このベクターは、インビトロで転写されたRNA、プラスミドDNA、または
以前に得られた組換えアルファウイルス粒子に由来する。なおさらなる実施例に
おいて、アルファウイルスベクタープロデューサー細胞株からの組換え粒子の生
成が記載される(実施例7を参照のこと)。

0146

他の実施態様では、ゲノムRNAを含まない(すなわち、実質的にウイルスRNAを
含まない)またはRNAベクターレプリコンを全く含まない、高力価の安定なトガ
ウイルスキャプシド粒子を生成するための方法が提供される。本発明で利用され
るように、ゲノムまたはRNAベクターレプリコン核酸が「実質的にない」とは、3
5Sメチオニン対3Hウリジンのウイルス粒子への取り込みの、(野生型と比較し
て)10:1より大きな、そして好ましくは15:1より大きな比をいうことが理解され
るべきである(例えば、実施例8および図38を参照のこと)。例えば、1つの実
施態様において、空のキャプシド粒子(好ましくは脂質二重層および糖タンパク
質相補体を有する)が、トガウイルス科から選択された病原性ウイルス(例えば
、アルファウイルスまたはルビウイルス)から構築され、そして免疫原として使
用されて野生型トガウイルスによる感染に対する防御免疫を確立する。空のウイ
ルス粒子は、望ましい免疫原性代替物である。なぜなら、これらは、ウイルスを
複製および生成することができないが、細胞性および体液性の両方の免疫応答を
生じ得るからである。従って、実施例8により詳細に記載される方法を利用して
、トガウイルスに由来する空のキャプシド粒子(脂質二重層および糖タンパク質
相補体を有するかまたは有さない)が、広範な種々のトガウイルスから作製され
得る。このトガウイルスは、アルファウイルス(例えば、シンドビスウイルス(
例えば、SIN-1または野生型シンドビスウイルス)、ヴェネズエラウマ脳炎ウイ
ルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、お
よびルビウイルス(例えば、風疹))を含むがこれらに限定されない。

0147

第2の実施態様において、ゲノムウイルスRNAに結合するペプチドをコードす
る異種ウイルスに由来する配列は、欠陥ヘルパー(DH)発現カセット中に、アル
ファウイルスキャプシド遺伝子のアミノ末端領域で挿入され得る。この遺伝子は
、相同アルファウイルスゲノムRNAに結合するタンパク質の領域をコードする配
列が欠失している。例えば、BHK細胞は、アルファウイルスレプリコンRNA、相同
なウイルスゲノムRNA結合ペプチドをコードする配列を含むDH RNA、および同じ
異種ウイルス由来のレプリコンを用いてエレクトロポレーションされ得る。従っ
て生成されるアルファウイルス粒子は、異種ウイルス由来のゲノムRNAを含み、
そしてアルファウイルスの宿主域向性を有する。1つの可能な例として、レトロ
ウイルスRNA結合に必要とされるタンパク質をコードするgag配列は、DH発現カセ
ット構築物内に含まれる。この構成において、得られるアルファウイルス粒子は
レトロウイルスベクターRNAを含む。
F.異種配列

0148

上記のように、本発明の遺伝子送達ビヒクルにより、広範な種々のヌクレオチ
ド配列が担持および発現され得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生存可能
な(viable)ウイルスの生成を可能にするのに十分なサイズであるべきである。本
発明の状況では、組換えアルファウイルス粒子による任意の測定可能な力価(例
えば、プラークアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、またはβ-ガラクトシダ
ゼアッセイによる)の感染性ウイルスの適切な感受性単層での生成またはRNAも
しくはDNAベクターにより生成される異種遺伝子の検出可能なレベルの発現は、
「生存可能なウイルスの生成」であると考えられる。これは最小の場合、さらな
る異種配列を全く含有しないアルファウイルスベクター構築物であり得る。しか
し他の実施態様において、ベクター構築物はさらなる異種配列または外来配列
含有し得る。好ましい実施態様において、異種配列は、少なくとも約100塩基、
2kb、3.5kb、5kb、7kbの異種配列、または少なくとも約8kbの異種配列さえ
も含み得る。

0149

本明細書中に提供される開示が与えられれば当業者には明らかなように、組換
えアルファウイルス粒子のパッケージング効率、従ってウイルス力価は、ある程
度パッケージングされるべき配列のサイズに依存する。従ってパッケージングの
効率および生存可能なウイルスの生成を増大させるために、さらなる非コード配
列をベクター構築物に付け加え得る。さらに本発明の特定の実施態様において、
ウイルスの力価を増加または減少させることが所望され得る。この増加または減
少は異種配列のサイズ、従ってパッケージングの効率を増加または減少させるこ
とにより達成され得る。

0150

上記で簡略に述べたように、本明細書中に記載される遺伝子送達ビヒクルには
、例えばリンホカインまたはサイトカイントキシンプロドラッグ変換酵素
免疫応答を刺激する抗原、リボザイム、増殖因子または調節因子のような治療的
適用のためのタンパク質および免疫応答を補助または阻害するタンパク質のよう
な緩和剤をコードする配列、ならびにアンチセンス配列(または「アンチセンス
適用」のためのセンス配列)を含む広範な種々の異種配列が含まれ得る。さらに
上記のように、本明細書中に提供される遺伝子送達ビヒクルは2つ以上の異種配
列を含有(そして、特定の実施態様においては発現)し得る。

0151

1.リンホカイン

0152

本発明の1つの実施態様において、異種配列はリンホカインをコードする。簡
略には、リンホカインは、免疫エフェクター細胞を増殖、活性化または分化する
ように作用する。リンホカインの代表例としては、γインターフェロン腫瘍
死因子、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、
IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、GMCSF、CSF−1
、およびG−CSFが挙げられる。

0153

本発明の関連する実施態様において、異種配列は免疫制御補助因子をコード
する。簡略には、本発明の状況で利用される「免疫制御性補助因子」は、免疫応
答に関与する1つ以上の細胞により産生される場合、または細胞に外から加えら
れる場合、その補助因子の非存在下で生じた免疫応答とは質または強さにおいて
異なる免疫応答を引き起こす因子をいう。応答の質または強さは、当業者に公知
の種々のアッセイにより測定し得、これには例えば、細胞の増殖を測定するイン
ビトロアッセイ(例えば、3Hチミジンの取り込み)、およびインビトロ細胞傷
害性アッセイ(例えば、51Cr放出を測定するもの)(Warnerら、AIDS Res.and
Human Retroviruses 7:645-655,1991を参照のこと)がある。

0154

免疫制御性補助因子の代表例は、αインターフェロン(Finterら、Drugs 42
(5):749-765,1991;米国特許第4,892,743号;米国特許第4,966,843号;WO 85/
02862;Nagataら、Nature 284:316-320,1980;Famillettiら、Methodsin Enz
.78:387-394,1981;Twuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2046-2050,19
89;Faktorら、Oncogene 5:867-872,1990)、βインターフェロン(Seifら、J
.Virol.65:664-671,1991)、γインターフェロン(Radfordら、American So
ciety of Hapatology:2008-2015,1991;Watanabeら、PNAS 86:9456-9460,19
89;Gansbacherら、Cancer Research 50:7820-7825,1990;Maioら、Can.Immu
nol.Immunother.30:34-42,1989;米国特許第4,762,791号および同第4,727,1
38号)、G−CSF(米国特許第4,999,291号および同第4,810,643号)、GM−CSF(WO
85/04188)、TNF(Jayaramanら、J.Immunology 144:942-951,1990)、インタ
ロイキン−2(IL−2)(Karuplahら、J.Immunology 144:290-298,1990;W
eberら、J.Exp.Med.166:1716-1733,1987;Gansbacherら、J.Exp.Med.17
2:1217-1224,1990;米国特許第4,738,927号)、IL−4(Tepperら、Cell 57:
503-512,1989;Golumbekら、Science 254:713-716,1991;米国特許第5,017,6
91号)、IL−6(Brakenhofら、J.Immunol.139:4116-4121,1987;WO 90/063
70)、IL−12、IL−15(Grabsteinら、Science 264:965-968,1994;Genbank-E
MBL登録番号V03099)、ICAM−1(Altmanら、Nature 338:512-514,1989)、IC
AM−2、LFA-1、LFA-3、MHCクラスI分子、MHCクラスII分子β2ミクロ
ロブリンシャペロン、CD3、B7/BB1、MHC結合トランスポータータンパク質また
はこれらのアナログを含む。

0155

アルファウイルスベクター構築物中にどの免疫制御性補助因子を含めるかの選
択は、補助因子の公知の治療効果に基づき得るか、または実験的に決定され得る
。例えば、慢性B型肝炎感染では、患者免疫不全を補い、そしてそれゆえ、疾
患からの回復を助けるのに、αインターフェロンが有効であることが見出されて
いる。あるいは適切な免疫制御性補助因子を実験的に決定し得る。簡略には、肝
疾患の患者からまず血液サンプル採取する。自己細胞またはHLA適合細胞(例
えば、EBV形質転換細胞)でインビトロで末梢血リンパ球(PBL)を再刺激し、そし
肝炎抗原の免疫原性部分および免疫制御性補助因子の発現を指向するアルファ
ウイルスベクター構築物で形質導入する。HLA適合形質導入細胞を標的として用

て、刺激したPBLをCTLアッセイにおけるエフェクターとして使用する。HLA適合
刺激物質および抗原のみをコードするベクターで形質導入した標的細胞を用いて
行った同じアッセイで見られるCTL応答の増加は、有用な免疫制御性補助因子を
示す。本発明の1つの実施態様において、免疫制御性補助因子であるγインター
フェロンが特に好ましい。

0156

免疫制御性補助因子の別の例は、B7/BB1補助刺激因子である。簡略には、T細
胞の完全な機能活性の活性化には2つのシグナルが必要である。第1のシグナル
抗原特異的T細胞レセプターと主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子に結合
したペプチドとの相互作用により提供され、そして第2のシグナル(補助刺激と
呼ぶ)は抗原提示細胞によりT細胞に送達される。第2のシグナルはT細胞によ
インターロイキン−2(IL−2)生成に必要であり、そして抗原提示細胞上の
B7/BB1分子と、Tリンパ球上のCD28およびCTLA−4レセプターとの相互作用に関
与しているようである(Llnsleyら、J.Exp.Med.173:721-730,1991a、および
J.Exp.Med.174:561-570,1991)。本発明の1つの実施態様において、B7/BB1
はCD8+T細胞の補助刺激を起こすために腫瘍細胞に導入され得、その結果CD8+T細
胞は拡張し十分活性化するために十分なIL−2を生成する。これらのCD8+T細胞
は、さらなるCTL機能のために補助刺激がもはや必要ではないため、B7を発現し
ていない腫瘍細胞を殺傷し得る。補助刺激性B7/BB1因子および例えば免疫原性HB
Vコアタンパク質の両方を発現するベクターは、本明細書に記載した方法を利用
して作製され得る。これらのベクターで形質導入された細胞は、より有効な抗原
提示細胞となる。HBVコア特異的CTL応答は、補助刺激性リガンドB7/BB1を介して
、十分に活性化されたCD8+T細胞により増強される。

0157

2.トキシン

0158

本発明の別の実施態様において、異種配列はトキシンをコードする。簡略には
、トキシンは細胞の増殖を直接阻害するように作用する。トキシンの代表例は、
リシン(Lambら、Eur.J.Biochem.148:265-270,1985)、アブリン(Woodら、
Eur.J.Biochem.198:723-732,1991;Evensenら、J.of Biol.Chem.266:6
848-6852,1991;Collinsら、J.of Biol.Chem.265:8665-8669,1990;Chen
ら、Fed.of Eur.Biochem Soc.309:115-118,1992)、ジフテリア
キシン(Twetenら、J.Biol.Chem.260:10392-10394,1985)、コレラトキシ
ン(Mekalanosら、Nature 306:551-557,1983;SanchezおよびHolmgren,PNAS
86:481-485,1989)ゲロニン(gelonin)(Stirpeら、J.Biol.Chem.255:69
47-6953,1980)、アメリカヤマゴボウ(Irvin,Pharmac.Ther.21:371-387,
1983)、抗ウイルスタンパク質(Barbieriら、Biochem.J.203:55-59,1982;
Irvinら、Arch.Biochem.& Biophys.200:418-425,1980;Irvin,Arch.Bioc
hem.& Biophys.169:522-528,1975)、トリチン(tritin)、赤痢菌トキシン
(Calderwoodら、PNAS 84:4364-4368,1987;Jacksonら、Microb.Path.2:147
-153,1987)、シュードモナス外毒素A(CarrollおよびCollier,J.Biol.Chem
.262:8707-8711,1987)、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)(F
ieldら、J.Gen.Virol.49:115-124,1980)、およびE.coli.グアニンホスホ
シルトランスフェラーゼを含む。

0159

3.プロドラッグ変換酵素

0160

本発明の他の実施態様において、異種配列はプロドラッグ変換酵素をコードす
る。簡略には、本発明の状況で利用されるプロドラッグ変換酵素とは、ほとんど
または全く細胞傷害性のない化合物毒性産物プロドラッグ)に活性化する遺
伝子産物を意味する。このような遺伝子産物の代表例は、HSVTKおよびVZVTK(な
らびにそれらのアナログおよび誘導体)を含み、これらは特定のプリンアラビノ
シドおよび置換ピリミジン化合物を選択的にモノリン酸化して、これらを細胞傷
害性または細胞増殖抑制代謝物に変換する。さらに詳しくは、薬物であるガン
クロビルアシクロビルまたはそれらの任意のアナログ(例えば、FIAU、FIAC、
DHPG)のHSVTKへの曝露は、この薬物を対応する活性ヌクレオチド三リン酸形態
にリン酸化する。

0161

本発明の状況でまた使用され得る他のプロドラッグ変換酵素の代表例は:E.co
liグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(これはチオキサンチンを毒性の
あるチオキサンチン−リン酸に変換する)(Besnardら、Mol.Cell.Biol.7:4
139-4141,1987);アルカリホスファターゼ(これは不活性なリン酸化化合物
例えば、マイトマイシンリン酸およびドキソルビシンリン酸)を毒性の脱リン酸
化化合物に変換する);真菌性(例えば、Fusarium oxysporum)または細菌性
シトシンデアミナーゼ(これは5−フルオロシトシンを毒性の化合物5−フル
オロウラシルに変換する)(Mullen,PNAS 89:33,1992);カルボキシプチダ
ーゼG2(これはパラ−N−ビス(2−クロロエチルアミノベンゾイルグルタミ
ン酸からグルタミン酸を切断して、それにより毒性の安息香酸マスタードをつく
り出す);およびペニシリン−Vアミダーゼ(これはドキソルビシンおよびメル
ファランフェノキシアセトアビド誘導体を毒性化合物に変換する)(一般的に
は、Vrudhulaら、J.of Med.Chem.36(7):919-923,1993;Kernら、Canc.Imm
un.Immunother.31(4):202-206,1990を参照のこと)を含む。

0162

4.アンチセンス配列

0163

本発明の別の実施態様において、異種配列はアンチセンス配列である。簡略に
は、アンチセンス配列はRNA転写産物に結合するように設計され、これにより特
定のタンパク質の細胞性合成を防止するか、または細胞によるこのRNA配列の使
用を防止する。このような配列の代表例は、アンチセンスチミジンキナーゼ、ア
ンチセンスジヒドロ葉酸レダクターゼ(MaherおよびDolnick,Arch.Biochem.&B
iophys.253:214-220,1987;Bzikら、PNAS 84:8360-8364,1987)、アンチ
ンスHER2(Coussensら、Science 230:1132-1139,1985)、アンチセンスABL(Fai
nstelnら、Oncogene 4:1477-1481,1989)、アンチセンスMyc(Stantonら、Nat
ure 310:423-425,1984)およびアンチセンスras、ならびに任意の細胞周期
ナル伝達成分(例えば、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン
依存性阻害剤)またはヌクレオチド生合成経路の任意の酵素をブロックするアン
チセンス配列を含む。さらに本発明の他の実施態様において、インターフェロン
および2ミクログロブリンに対するアンチセンス配列は、免疫応答を減少させる
ために利用され得る。

0164

さらに、本発明のさらなる実施態様において、アンチセンスRNAは強力なクラ
スI制限応答を誘導するために抗腫瘍剤として利用され得る。簡略には、RNAへ
結合すること、そしてこれにより特異的mRNAの翻訳を防止することに加え、高レ
ベルの特異的アンチセンス配列が多量の2本鎖RNAの形成によりインターフェロ
ン(γ−インターフェロンを含む)の発現の増加を誘導すると考えられる。γ−
インターフェロンの発現の増加は、次いでMHCクラスI抗原の発現を増強する。
これに関する使用に好ましいアンチセンス配列は、アクチンRNA、ミオシンRNA、
およびヒストンRNAを含む。アクチンRNAとミスマッチを形成するアンチセンスRN
Aは特に好ましい。

0165

5.リボザイム

0166

本発明の他の局面において、宿主細胞の感染によりリボザイムを生成する遺伝
子送達ビヒクルが提供される。簡略には、リボザイムは特異的RNAを切断するた
めに使用され、そして1つの特異的RNA配列のみに作用し得るように設計される
。一般的には、リボザイムの基質結合配列は10〜20ヌクレオチド長である。この
配列の長さは、標的RNAとハイブリダイズし、そして切断されたRNAからリボザイ
ムを解離するのを可能にするのに十分である。

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