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技術 ATPを連鎖的に増幅させる方法及び該方法を利用して極微量のATPを検査する方法

出願人 株式会社サタケ大竹久夫株式会社バイオエネックス
発明者 大竹久夫黒田章夫
出願日 2000年4月20日 (19年10ヶ月経過) 出願番号 2000-119798
公開日 2001年10月30日 (18年3ヶ月経過) 公開番号 2001-299390
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 化学反応による材料の光学的調査・分析 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード ルミノール反応 ポリリン酸化合物 反応回数 ポリリン酸キナーゼ 低水準 衛生管理 生物発光法 スルフヒドリル化合物
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この項目の情報は公開日時点(2001年10月30日)のものです。
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図面 (1)

課題

新規ATPを連鎖的に増幅させる方法を発明するとともに、該方法を利用して生物発光の測定の感度と精度を獲得して微量ATPを検査する方法を提供する。

解決手段

微量のATPの存在下に、AMPアデニレートキナーゼと反応させて2分子ADPに変換せしめる第1の反応と、ポリリン酸化合物の存在下で、該2分子のADPをポリリン酸キナーゼと反応させて2分子のATPとポリリン酸化合物に変換せしめる第2の反応とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返して反応させることにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増幅させる。

概要

背景

ATPは生きた生物指標である。従って、微生物由来のATPを生物発光に供することによって、光を指標にした微生物の衛生検査が行われている。(例えば、特公平6-34757,登録第1911659号)しかし、微量の微生物の場合にはATPに由来する生物発光が十分に行われない。

そこで、特開平8-47399号公報には、「ルシフェラーゼにより発生する生物発光を測定する方法において、ポリリン酸化合物又はその塩、及びスルフヒドリル化合物共存下で生物発光反応を行う」ことを特徴とする技術が開示されている。これにより、生物発光の増強という新規な効果を得られ、一般的なルミノメータの使用により生物発光反応の測定が可能で、普及率が高まるという効果がある。

しかしながら、上記特開平8-47399に開示される方法は、生物発光の安定の技術であって、ATP量を増加させる技術ではなく、ATPが消費されるに従い、経時的に発光減衰する欠点を有する。

また、特開平9-234099号には、以下の反応式で示される生物発光法によるサイクリックAMP定量法が開示されている。

概要

新規にATPを連鎖的に増幅させる方法を発明するとともに、該方法を利用して生物発光の測定の感度と精度を獲得して微量ATPを検査する方法を提供する。

微量のATPの存在下に、AMPアデニレートキナーゼと反応させて2分子ADPに変換せしめる第1の反応と、ポリリン酸化合物の存在下で、該2分子のADPをポリリン酸キナーゼと反応させて2分子のATPとポリリン酸化合物に変換せしめる第2の反応とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返して反応させることにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増幅させる。

目的

本発明は、上記従来技術とは全く異なる観点でATP量を連鎖的に増加させる方法を発明するとともに、該方法を利用して生物発光を検出することで、従来検出できなかった極微量のATPを検出する方法を提供することを技術的課題とする。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
5件

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請求項1

微量のATPの存在下に、AMPアデニレートキナーゼと反応させて2分子ADPに変換せしめる第1の反応と、ポリリン酸化合物の存在下で、該2分子のADPをポリリン酸キナーゼと反応させて2分子のATPとポリリン酸化合物に変換せしめる第2の反応とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返して反応させることにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増幅させることを特徴とするATPを連鎖的に増幅させる方法。

請求項2

前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜100個のリン酸が直鎖状重合したものを用いてなる請求項1記載のATPを連鎖的に増幅させる方法。

請求項3

前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜1000個のリン酸が直鎖状に重合したものを用いてなる請求項1記載のATPを連鎖的に増幅させる方法。

請求項4

前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素触媒作用により、ATPから生合成してなる請求項3記載のATPを連鎖的に増幅させる方法。

請求項5

請求項1から請求項4のいずれかに記載のATPを連鎖的に増幅させる方法により極微量のATPを増幅させ、ルシフェリン及び溶存酸素の存在下でルシフェラーゼと反応させてAMP及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定することにより極微量のATPを検査する方法。

--

0001

本発明は、動植物の代謝・生合成系において生成されるATPの量を、連鎖的に増加させる方法であり、該方法を利用して生物発光を検出することで、従来検出できなかった極微量のATPが検出できるために、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度検査したり、食肉鮮魚野菜など食物鮮度を測定することに応用できるものである。

背景技術

0002

ATPは生きた生物指標である。従って、微生物由来のATPを生物発光に供することによって、光を指標にした微生物の衛生検査が行われている。(例えば、特公平6-34757,登録第1911659号)しかし、微量の微生物の場合にはATPに由来する生物発光が十分に行われない。

0003

そこで、特開平8-47399号公報には、「ルシフェラーゼにより発生する生物発光を測定する方法において、ポリリン酸化合物又はその塩、及びスルフヒドリル化合物共存下で生物発光反応を行う」ことを特徴とする技術が開示されている。これにより、生物発光の増強という新規な効果を得られ、一般的なルミノメータの使用により生物発光反応の測定が可能で、普及率が高まるという効果がある。

0004

しかしながら、上記特開平8-47399に開示される方法は、生物発光の安定の技術であって、ATP量を増加させる技術ではなく、ATPが消費されるに従い、経時的に発光減衰する欠点を有する。

0005

また、特開平9-234099号には、以下の反応式で示される生物発光法によるサイクリックAMP定量法が開示されている。

0006

この方法は、サイクリックAMPをサイクリック3’,5’−ヌクレオチドホスホエステラ−ゼで加水分解して反応系にAMPを生成せしめる(反応1)と、マグネシウムイオン、微量のATPの存在下に、該AMPをアデニレートキナーゼと反応させてADPに変換せしめる(反応2)と、マグネシウムイオン、ホスホエノールピルビン酸の存在下で、該ADPをピルビン酸キナーゼと反応させて、ATP及びピルビン酸に変換せしめる(反応3)と、ルシフェリン、マグネシウムイオン(又は他の金属イオン)及び溶存酸素の存在下で、ATPをルシフェラーゼと反応させ発光を生成せしめる(反応4)と、(反応4)で生成した発光量を測定することによりサイクリックAMPを定量する方法(METHODS IN ENZYMOLOGY 38,62-65;1974)を特徴としている。

0007

しかしながら、この方法は、サイクリックAMPから変換されたAMPを、ADPに変換し、さらに該ADPをホスホエノールピルビン酸の存在下でピルビン酸キナーゼの反応によりATPとしてATPのリサイクルが行われるが、ATP量が増加しているわけではない。

発明が解決しようとする課題

0008

本発明は、上記従来技術とは全く異なる観点でATP量を連鎖的に増加させる方法を発明するとともに、該方法を利用して生物発光を検出することで、従来検出できなかった極微量のATPを検出する方法を提供することを技術的課題とする。

課題を解決するための手段

0009

上記課題を解決するため請求項1の発明は、微量のATPの存在下に、AMPをアデニレートキナーゼと反応させて2分子のADPに変換せしめる第1の反応と、ポリリン酸化合物の存在下で、該2分子のADPをポリリン酸キナーゼと反応させて2分子のATPとポリリン酸化合物に変換せしめる第2の反応とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返して反応させることにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増幅させる、という技術的手段を講じた。

0010

反応系の1回目の反応において、アデニレートキナーゼによってATPとAMPとが直ちに反応し、2分子のADPに変換される(第1の反応)。次いで、該2分子のADPはポリリン酸キナーゼによってポリリン酸と反応し、2分子のATPとポリリン酸に変換される(第2の反応)。そして、反応系の2回目の反応に移るが、このとき、反応系1回目で生じた前記2分子のATPが2分子のAMPと反応し、4分子のADPに変換される(第1の反応)。次いで、該4分子のADPはポリリン酸キナーゼによってポリリン酸と反応し、4分子のATPとポリリン酸に変換される(第2の反応)。以下、反応系の3回目、反応系の4回目、反応系の5回目…と複数回繰り返されることによりATPが増加する。この反応は、反応系の1回目に添加する微量のATPが引き金になり、以降、連鎖的に起こり、AMPとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて2のべき乗でATPが増加することになる。

0011

また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜100個のリン酸が直鎖状重合したものを用いるとよい。ポリリン酸化合物(PolyPn)とはn個のリン酸がつながったもので、請求項2の発明では、ポリリン酸化合物の1分子中にリン酸(MI3P)が少なくとも10〜100個つながっているので、請求項1の第2の反応におけるADPからATPへの変換が容易に行われ、ATPを再生する際のリン酸の補給が少量となり経済的になる。また、多数のリン酸により反応系の反応時間が継続する。

0012

さらに、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜1000個のリン酸が直鎖状に重合したものを用いるとよい。請求項3の発明では、ポリリン酸化合物の1分子中にリン酸(MI3P)が少なくとも10〜1000個つながっているので、ADPからATPへの変換がさらに容易に行われ、リン酸の補給が少量となり経済的となる。また、多数のリン酸により反応系の反応時間が長時間継続する。

0013

そして、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素触媒作用により、ATPから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。

0014

ATPを連鎖的に増幅させる方法により極微量のATPを増幅させ、ルシフェリン及び溶存酸素の存在下でルシフェラーゼと反応させてAMP及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定すると、増加した分のATPに相当する光量が得られるため、従来検出できなかった極微量のATPが検出できるようになる。原理的には、最初の反応系に存在する一分子のATPをも検出できるものである。

発明を実施するための最良の形態

0015

本発明の実施の形態を説明する。以下に本発明の理論的な反応式を示す。

0016

反応の触媒となるアデニレートキナーゼ(ADK)は、アデノシン一リン酸(AMP)とアデノシン三リン酸(ATP)とを反応させたとき、2分子のアデノシン二リン酸(ADP)を生じさせる酵素である。また、ポリリン酸キナーゼ(PPK)は、ADPとポリリン酸(PolyP)とを反応させ、ATPとポリリン酸(PolyPn-2)とに変換する酵素である。

0017

本発明では、微量のATPの存在下に、AMPをアデニレートキナーゼと反応させて2分子のADPに変換せしめる第1の反応(1式)と、ポリリン酸化合物の存在下で、該2分子のADPをポリリン酸キナーゼと反応させて2分子のATPとポリリン酸化合物に変換せしめる第2の反応(2式)とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返して行うことにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増幅させるのである。

0018

これにより、反応系の1回目の反応において、アデニレートキナーゼによってATPとAMPとが直ちに反応し、2分子のADPに変換される(式1)。次いで、該2分子のADPはポリリン酸キナーゼによってポリリン酸と反応し、2分子のATPとポリリン酸に変換される(式2)。そして、反応系の2回目の反応に移るが、このとき、反応系1回目で生じた前記2分子のATPが2分子のAMPと反応し、4分子のADPに変換される(式3)。次いで、該4分子のADPはポリリン酸キナーゼによってポリリン酸と反応し、4分子のATPとポリリン酸に変換される(式4)。以下、反応系の3回目、反応系の4回目、反応系の5回目…と複数回繰り返されることによりATPが増加する。この反応は、反応系の1回目に添加する微量のATPが引き金になり、以降、連鎖的に起こり、AMPとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて2のべき乗でATPが増加することになる。

0019

ポリリン酸(PolyP)とはn個のリン酸がつながったもので、例えば、化学合成されたポリリン酸は100個ほどのリン酸がつながったものである。また、バクテリアから取り出したものは1000個近いリン酸がつながったものである。

0020

例えば、本発明で用いられるポリリン酸化合物(PolyPn)は、以下の構造式によって表される。ここで、(PolyPn)は10≦n≦1000の範囲が好ましい。

0021

前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜1000個のリン酸(MI3P)が重合しているので反応性が向上する。

0022

ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ATPから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。例えば、以下の反応式に示すようにポリリン酸化合物を、ATPから生合成する。

0023

上記反応式によるポリリン酸化合物の生合成は、例えば、特開平5-153993号公報などに開示された従来のポリリン酸の製造方法を利用すればよい。本実施形態では、ポリリン酸合成酵素を触媒として、ポリリン酸合成酵素とATPと酵素の失活抑制を目的としたマグネシウムなどの金属イオンを反応させ、ポリリン酸化合物を生合成する。本実施形態に使用されるポリリン酸合成酵素はポリリン酸合成酵素を生合成し得るものであればよい。

0024

本発明者らは、ATPの連鎖的増幅反応について、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼの代わりにクレアチンキナーゼ及びクレアチンリン酸を使用しても反応が起こることを確認した。すなわち、2分子のADPを2分子のATPに変換することのできるリン酸化合物と酵素であれば、原理的にはATPを連鎖的に増幅反応を起こさせると考えられる。しかし、ポリリン酸はポリリン酸キナーゼと組み合わせることにより、一分子で多数のATPを合成する能力があるので、連続して起こるATPの増幅反応に有利である。

0025

ATPを無添加で反応させた条件と、ATPを添加して反応させた条件とを比較するため、以下の条件で発光の経時的変化を調べた。

0026

ID=000006HE=040 WI=070 LX=1150 LY=0300
上記(イ)〜(へ)の試料を混合し、測定時間ごとサンプリング(5μl)を行い、ベーリンガーマンハイム社製のATP測定キットにより、ATP容量を測定した。

0027

ID=000007HE=045 WI=070 LX=1150 LY=0950
と同様に上記(イ)〜(ト)の試料を混合し、測定時間ごとにサンプリング(5μl)を行い、ベーリンガーマンハイム社製のATP測定キットにより、ATP容量を測定した。

0028

上記の結果及びの結果を図2に示す。この結果から、ATPを添加して反応させた場合(反応)、反応後30分からATP量が急激に上昇し、180分経過後にはピークに達する。これに対し、ATP無添加で反応させた場合(反応)、ATP量が増加することはなく、低水準のまま推移する。従って、本発明では、微量ATPを添加したことが引き金となって、ATPの連鎖的増加が起こったことが分かる。従って、わずかな量のATPでもATP量を増加させて感度よく検出することができ、食品検査、衛生検査の精度を向上することが可能である。また、安価でかつ簡単なルミノメータによりATPを検出することができる。

発明の効果

0029

以上のように本発明によれば、微量のATPの存在下に、AMPをアデニレートキナーゼと反応させて2分子のADPに変換せしめる第1の反応と、ポリリン酸化合物の存在下で、該2分子のADPをポリリン酸キナーゼと反応させて2分子のATPとポリリン酸化合物に変換せしめる第2の反応とを一対の反応系となし、該一対の反応系を複数回繰り返して反応させることにより、その反応回数に応じて2のべき乗でATPを増幅させるので、反応系の1回目に添加する微量のATPが引き金になり、以降、連鎖的にATPの増加が起こる。そして、ATPの連鎖的増加は、AMPとポリリン酸が存在する限り長時間継続し、反応系の反応回数に応じて2のべき乗でATPが増加することになる。この後、増加したATPを生物発光で検出すると、反応系の1回目に添加する微量のATPに比べて、膨大な光量の増強が起こる。

0030

ポリリン酸とADPとを反応させてATPを合成する際、連鎖的にATPを増加させることが可能となる。これにより、生物発光の光量の増強効果を得るとともに、発光時間を持続させることのできる。

0031

また、前記ポリリン酸化合物は、化学合成により生成されたポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜100個のリン酸が直鎖状に重合したものを用いるとよい。これにより、ポリリン酸化合物の1分子中にリン酸(MI3P)が少なくとも10〜100個含まれているので、ADPからATPへの連続的な変換が容易に行われる。

0032

そして、前記ポリリン酸化合物は、バクテリア由来のポリリン酸化合物であって、少なくとも10〜1000個のリン化物が直鎖状に重合したものを用いると、ADPからATPへの変換がさらに容易に行われ、リン酸の補給が少量となり経済的となる。また、多数のリン酸により反応系の反応時間が長時間継続する。

0033

さらに、前記ポリリン酸化合物は、ポリリン酸合成酵素の触媒作用により、ATPから生合成すれば、ポリリン酸化合物の収率を向上して、ポリリン酸化合物を安価に生成することが可能となる。

0034

ATPを連鎖的に増幅させる方法により極微量のATPを増幅させ、ルシフェリン及び溶存酸素の存在下でルシフェラーゼと反応させてAMP及び発光を生成せしめ、生成した発光量を測定すると、増加した分のATPに相当する光量が得られるため、従来検出できなかった極微量のATPが検出できるようになり、例えば、ATPの増幅を伴わない方法と比較して1000倍以上の明るさで検出できることになり、生物発光の測定の感度と精度が格別に向上する。

0035

また、本発明ではATPの増幅が起こるため、従来の方法では検出できなかった極微量のATPを検出できる。そのために、食品工場などで目に見えない微生物を検出して清浄度を検査したり、食肉、鮮魚、野菜など食物の鮮度を測定することに応用できるものである。このように、微量有害微生物の検出による衛生管理に応用する他、ATPを生ずる、あるいは、ATPを消費するような一般的な生化学反応の検査にも応用できる。また、ATPを検出することによって、ルミノール反応にかわる科学捜査などへの応用も考えられる。また、ATPの合成生産などにも応用することができる。

図面の簡単な説明

0036

図1ATPの連鎖的増幅反応においてATPを無添加で反応させた場合とATPを添加して反応させた場合とを比較した図である。

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