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技術 アツモリソウ属植物用培養液,アツモリソウ属植物用培地及びアツモリソウ属植物の培養方法

出願人 岩手県遠野市
発明者 小山田智彰菊池純
出願日 2000年3月14日 (20年8ヶ月経過) 出願番号 2000-070066
公開日 2001年9月18日 (19年2ヶ月経過) 公開番号 2001-251962
状態 特許登録済
技術分野 植物の育種及び培養による繁殖 肥料 植物の栽培
主要キーワード 無菌室内 人工交配 植物活性剤 生育サイクル 発芽能力 フェノール物質 発芽促進 ベーシン
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (14)

課題

発芽率を向上させ、また、発後の培養中の褐変死の発生を抑えて生存率を高め一度に大量の生産することができるようにする。

解決手段

種子選別工程と、種子を培養液に混合して培地播種する無菌播種工程と、発芽するまで培養する発芽培養工程と、発芽し器官分化したものを培地を替え継代培養する継代培養工程と、継代培養工程で生育した培養苗低温の環境下にさらす低温処理工程と、その後、用土に植え替える鉢上げ工程とを備えた。上記培養液を、当該培養液1000ml中に添加物として、サッカロース0〜10gと、木酢液0.1〜2.0mlと、ビタミン類8〜45mgと、植物活性剤0.1〜1.0mlとを含有して構成し、上記培地を当該培地用水溶液1000ml中に添加物として、窒素リン及びカリウムを含有する肥料1〜3gと、ぺプトン1〜3gと、糖類10〜30gと、植物活性剤0.2〜1.0mlと、ビタミン類16〜70mgとを含有して構成した。

概要

背景

一般に、アツモリソ属植物とは、ラン(蘭)科の一種で、シプリペジュウム属とも言われ、例えば、その種類として、アツモリソウ,ホテイアツモリソウ,レブンアツモリソウ,カラフトアツモリソウ等が知られている。アツモリソウ属植物はの山野草と言われ、特にアツモリソウは、乱獲のため、絶滅危機に瀕していて絶滅のおそれのある野生動植物譲渡規制等に関する法律によって希少野生動植物に登録されている植物である。また、アツモリソウ属植物は、増殖しにくい植物であり、その理由のひとつに発芽率が低いということが挙げられる。自然界での発芽率は、10万分の1とも言われる。これは、普通の草花では、葉や根に成長する部分や発に必要な栄養分が含まれる胚乳が存在しているが、アツモリソウの種子にはそれらがなく、があるのみで、この種子の構造から発芽率が低いと考えられている。そのため、近年、このアツモリソウ属植物の種の保存を図るため、バイオテクノロジー技術を利用して発芽率を向上させて増殖させる研究が行なわれている。尚、国の許可を受けアツモリソウの培養に取り組んでいる研究施設は、現在の所、国内で12カ所ある。

従来、アツモリソウ属植物の培養方法としては、例えば、無菌播種により、寒天質の培地上に滅菌水流し込み種子を散らすという方法が知られている。滅菌水としては、例えば、次亜塩素酸ナトリウムを添加した水溶液等が知られている(例えば、特開平5−148115号公報掲載)。

概要

発芽率を向上させ、また、発芽後の培養中の褐変死の発生を抑えて生存率を高め一度に大量の生産することができるようにする。

種子選別工程と、種子を培養液に混合して培地に播種する無菌播種工程と、発芽するまで培養する発芽培養工程と、発芽し器官分化したものを培地を替え継代培養する継代培養工程と、継代培養工程で生育した培養苗低温の環境下にさらす低温処理工程と、その後、用土に植え替える鉢上げ工程とを備えた。上記培養液を、当該培養液1000ml中に添加物として、サッカロース0〜10gと、木酢液0.1〜2.0mlと、ビタミン類8〜45mgと、植物活性剤0.1〜1.0mlとを含有して構成し、上記培地を当該培地用水溶液1000ml中に添加物として、窒素リン及びカリウムを含有する肥料1〜3gと、ぺプトン1〜3gと、糖類10〜30gと、植物活性剤0.2〜1.0mlと、ビタミン類16〜70mgとを含有して構成した。

目的

本発明は、このような問題点に鑑みてなされたもので、発芽率を向上させ、また、発芽後の培養中の褐変死の発生を抑えて生存率を高め一度に大量の苗を生産することができるアツモリソウ属植物用培養液,アツモリソウ属植物用培地及びアツモリソウ属植物の培養方法を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ツモリソ属植物を種子から培養する際に用いられ水に添加物を添加してなるアツモリソウ属植物用培養液において、当該培養液1000ml中に添加物として、木酢液0.1〜2.0mlと、ビタミン類8〜45mgと、植物活性剤0.1〜1.0mlとを含有したことを特徴とするアツモリソウ属植物用培養液。

請求項2

上記培養液をpH5.5〜6.0とすることを特徴とする請求項1記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項3

上記添加物として糖類を含有したことを特徴とする請求項1または2記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項4

上記培養液1000ml中に糖類を1〜10g含有したことを特徴とする請求項3記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項5

上記糖類をサッカロースとしたことを特徴とする請求項3または4記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項6

上記ビタミン類を塩酸チアミンとしたことを特徴とする請求項1,2,3,4または5記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項7

上記塩酸チアミンを1〜10mg含有したことを特徴とする請求項6記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項8

上記ビタミン類をニコチン酸としたことを特徴とする請求項1,2,3,4,5,6または7記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項9

上記ニコチン酸を1〜5mg含有したことを特徴とする請求項8記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項10

上記ビタミン類を塩酸ピリドキシンとしたことを特徴とする請求項1,2,3,4,5,6,7,8または9記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項11

上記塩酸ピリドキシンを1〜10mg含有したことを特徴とする請求項10記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項12

上記ビタミン類をミオイノシトールとしたことを特徴とする請求項1,2,3,4,5,6,7,8,9,10または11記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項13

上記ミオイノシトールを5〜20mg含有したことを特徴とする請求項12記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項14

上記植物活性剤は、粗タンパク質0.05〜0.15重量%、粗脂肪0.3〜0.5重量%、無機質として、Na35〜45mg/l、Ca30〜35mg/l、Fe1.5〜2.0mg/l、Mg3.0〜4.0mg/l、Si7.0〜8.0mg/l、N90〜100mg/lを備えていることを特徴とする請求項1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12または13記載のアツモリソウ属植物用培養液。

請求項15

アツモリソウ属植物を種子から培養する際に用いられ、水に添加物を添加した水溶液ゲル化剤によりゲル状にしたアツモリソウ属植物用培地において、上記水溶液1000ml中に添加物として、窒素リン及びカリウムを含有する肥料1〜3gと、ぺプトン1〜3gと、糖類10〜30gと、植物活性剤0.2〜1.0mlと、ビタミン類16〜70mgとを含有したことを特徴とするアツモリソウ属植物用培地。

請求項16

上記植物活性剤の替わりにポテトキューブを培地50ml中0.5〜1.5g添加することを特徴とする請求項15記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項17

上記水溶液をpH5.5〜6.0とすることを特徴とする請求項15または16記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項18

上記糖類をサッカロースとしたことを特徴とする請求項15,16または17記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項19

上記ビタミン類を塩酸チアミンとしたことを特徴とする請求項15,16,17または18記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項20

上記塩酸チアミンを5〜20mg含有したことを特徴とする請求項19記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項21

上記ビタミン類をニコチン酸としたことを特徴とする請求項15,16,17,18,19または20記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項22

上記ニコチン酸を1〜10mg含有したことを特徴とする請求項21記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項23

上記ビタミン類を塩酸ピリドキシンとしたことを特徴とする請求項15,16,17,18,19,20,21または22記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項24

上記塩酸ピリドキシンを5〜20mg含有したことを特徴とする請求項23記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項25

上記ビタミン類をミオイノシトールとしたことを特徴とする請求項15,16,17,18,19,20,21,22,23または24記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項26

上記ミオイノシトールを5〜20mg含有したことを特徴とする請求項25記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項27

上記植物活性剤は、粗タンパク質0.05〜0.15重量%、粗脂肪0.3〜0.5重量%、無機質として、Na35〜45mg/l、Ca30〜35mg/l、Fe1.5〜2.0mg/l、Mg3.0〜4.0mg/l、Si7.0〜8.0mg/l、N90〜100mg/lを備えていることを特徴とする請求項15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25または26記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項28

上記ゲル化剤としてゲランガムを用いたことを特徴とする請求項15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26または27記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項29

上記水溶液中に添加物として活性炭を含有したことを特徴とする請求項15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27または28記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項30

上記活性炭を0.5〜3g含有したことを特徴とする請求項29記載のアツモリソウ属植物用培地。

請求項31

アツモリソウ属植物を種子から培養するアツモリソウ属植物の培養方法において、選別して使用する種子を得る種子選別工程と、得られた種子を培養液に混合して無菌的に固形培地播種する無菌播種工程と、播種後、発するまで培養する発芽培養工程と、発芽培養工程において発芽し器官分化したものを培地を替え継代培養する継代培養工程と、継代培養工程で生育した培養苗低温の環境下にさらす低温処理工程と、低温処理終了後、用土に植え替える鉢上げ工程とを備えたことを特徴とするアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項32

上記培養液を培地とは異なる組成の培養液とすることを特徴とする請求項31記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項33

上記発芽培養工程において、播種した培地を暗黒下において培養することを特徴とする請求項31または32記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項34

上記発芽培養工程において、播種した培地を10〜25℃の環境において培養することを特徴とする請求項31,32または33記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項35

上記継代培養工程において、培地に培養液を添加することを特徴とする請求項31,32,33または34記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項36

上記継代培養工程において、培地を10〜25℃の環境において培養することを特徴とする請求項31,32,33,34または35記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項37

上記低温処理工程において、低温処理期間を30〜90日としたことを特徴とする請求項31,32,33,34,35または36記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項38

上記低温処理工程において、低温処理期間を60日±5日としたことを特徴とする請求項37記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項39

上記低温処理工程において、低温処理温度を0〜10℃としたことを特徴とする請求項31,32,33,34,35,36,37または38記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

請求項40

上記低温処理工程において、低温処理温度を3〜5℃としたことを特徴とする請求項39記載のアツモリソウ属植物の培養方法。

技術分野

0001

本発明は、ラン科のアツモリソ属植物を大量に増殖させ、生育させるためのアツモリソウ属植物用培養液,アツモリソウ属植物用培地及びアツモリソウ属植物の培養方法に関する。

背景技術

0002

一般に、アツモリソウ属植物とは、ラン(蘭)科の一種で、シプリペジュウム属とも言われ、例えば、その種類として、アツモリソウ,ホテイアツモリソウ,レブンアツモリソウ,カラフトアツモリソウ等が知られている。アツモリソウ属植物はの山野草と言われ、特にアツモリソウは、乱獲のため、絶滅危機に瀕していて絶滅のおそれのある野生動植物譲渡規制等に関する法律によって希少野生動植物に登録されている植物である。また、アツモリソウ属植物は、増殖しにくい植物であり、その理由のひとつに発芽率が低いということが挙げられる。自然界での発芽率は、10万分の1とも言われる。これは、普通の草花では、葉や根に成長する部分や発に必要な栄養分が含まれる胚乳が存在しているが、アツモリソウの種子にはそれらがなく、があるのみで、この種子の構造から発芽率が低いと考えられている。そのため、近年、このアツモリソウ属植物の種の保存を図るため、バイオテクノロジー技術を利用して発芽率を向上させて増殖させる研究が行なわれている。尚、国の許可を受けアツモリソウの培養に取り組んでいる研究施設は、現在の所、国内で12カ所ある。

0003

従来、アツモリソウ属植物の培養方法としては、例えば、無菌播種により、寒天質の培地上に滅菌水流し込み種子を散らすという方法が知られている。滅菌水としては、例えば、次亜塩素酸ナトリウムを添加した水溶液等が知られている(例えば、特開平5−148115号公報掲載)。

発明が解決しようとする課題

0004

ところで、このような従来のアツモリソウ属植物の培養方法にあっては、必ずしも満足できる発芽率を達成できていないという問題があった。本願発明者らは、平成7年から研究に取り組んでおり、その間、100数種類前後の培地を用い、これらの培地上に上記の次亜塩素酸ナトリウムを添加した滅菌水を使用して種子を広げて試験を行なったが、発芽率が延びないことが分かった。また、このアツモリソウ属植物では発芽してもに育つ前に植物が褐変死する確率が高いという問題もあった。褐変死は、植物体黒色に変化したフェノール物質を出して褐変して死んでしまう現象である。従って、従来の培養方法,培地,培養液では発芽率の向上は難しく、また、発芽しても培養中に植物が褐変死することが多く大きな問題となっている。

0005

本発明は、このような問題点に鑑みてなされたもので、発芽率を向上させ、また、発芽後の培養中の褐変死の発生を抑えて生存率を高め一度に大量の苗を生産することができるアツモリソウ属植物用培養液,アツモリソウ属植物用培地及びアツモリソウ属植物の培養方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0006

このような課題を解決するため本願発明者らは、播種する際、培地上に種子を広げるために使っていた滅菌水の代替用として栄養素を含んだ培養液を用いることを研究し、その開発に取り組み、褐変の発生を抑え、発芽率を向上させることのできる以下のアツモリソウ属植物用培養液,アツモリソウ属植物用培地及びアツモリソウ属植物の培養方法を開発した。本発明のアツモリソウ属植物用培養液は、アツモリソウ属植物を種子から培養する際に用いられ水に添加物を添加してなるアツモリソウ属植物用培養液において、当該培養液1000ml中に、添加物として、糖類0〜10gと、木酢液0.1〜2.0mlと、ビタミン類8〜45mgと、植物活性剤0.1〜1.0mlとを含有した構成とした。この培養液を無菌播種に用いると、木酢液,ビタミン類及び植物活性剤の相互作用によって、種子が栄養分を吸収し易くなり、プロトコーム形成の促進が図られ、発芽率が大幅に向上させられる。また、発芽後の継代培養中に添加することにより植物体の褐変の発生が抑えられ、褐変死させることが抑制され、更に植物体が栄養分を良く吸収して順調に生育させられ、生存率が大幅に向上させられる。

0007

そして、必要に応じ、上記培養液をpH5.5〜6.0とすることが有効である。pHをアツモリソウの自生地のpHに近い値にすることにより、発芽及び培養の環境を最適にでき、発芽率の向上と生育良好とすることができる。また、必要に応じ、上記添加物として糖類を含有した構成とした。この場合、上記培養液1000ml中に糖類を1〜10g含有したことが有効である。そして、必要に応じ、上記糖類をサッカロースとした。そしてまた、必要に応じ、上記ビタミン類を塩酸チアミンとした構成とした。この場合、上記塩酸チアミンを1〜10mg含有したことが有効である。また、必要に応じ、上記ビタミン類をニコチン酸とした構成とした。この場合、上記ニコチン酸を1〜5mg含有したことが有効である。また、必要に応じ、上記ビタミン類を塩酸ピリドキシンとした構成とした。この場合、上記塩酸ピリドキシンを1〜10mg含有したことが有効である。更にまた、必要に応じ、上記ビタミン類をミオイノシトールとした構成とした。この場合、上記ミオイノシトールを5〜20mg含有したことが有効である。ラン科植物の培養ではビタミン類が培養を促進させる効果があることが多く、その選択は重要であるが、上記のビタミンを添加することにより、発芽及び継代培養中、植物体にビタミンがバランス良く有効に作用する。

0008

そして、必要に応じ、上記植物活性剤は、粗タンパク質0.05〜0.15重量%、粗脂肪0.3〜0.5重量%、無機質として、Na35〜45mg/l、Ca30〜35mg/l、Fe1.5〜2.0mg/l、Mg3.0〜4.0mg/l、Si7.0〜8.0mg/l、N90〜100mg/lを備えている。植物活性剤の添加により、栄養バランスが良く、発芽を促進させる効果を発揮させる。

0009

そして、本発明のアツモリソウ属植物用培地は、アツモリソウ属植物を種子から培養する際に用いられ、水に添加物を添加した水溶液をゲル状にしたアツモリソウ属植物用培地において、上記水溶液1000ml中に添加物として、窒素リン及びカリウムを含有する肥料1〜3gと、ぺプトン1〜3gと、糖類10〜30gと、植物活性剤0.2〜1.0mlと、ビタミン類16〜70mgとを含有している。この培地を無菌播種に用いることにより、プロトコーム形成の促進を図るので発芽率を向上させることができる。また、必要に応じ、上記植物活性剤の替わりにポテトキューブを培地50ml中0.5〜1.5g添加する構成とした。そして、必要に応じ、上記水溶液をpH5.5〜6.0とする構成とした。pHをアツモリソウの自生地のpHに近い値とすることにより、発芽及び培養の環境を最適にでき、発芽率の向上と生育良好とすることができる。

0010

また、必要に応じ、上記糖類をサッカロースとした構成とした。そして、必要に応じ、上記ビタミン類を塩酸チアミンとした構成とした。この場合、上記塩酸チアミンを5〜20mg含有したことが有効である。そしてまた、必要に応じ、上記ビタミン類をニコチン酸とした構成とした。この場合、上記ニコチン酸を1〜10mg含有したことことが有効である。更にまた、必要に応じ、上記ビタミン類を塩酸ピリドキシンとした構成とした。この場合、上記塩酸ピリドキシンを5〜20mg含有したことが有効である。また、必要に応じ、上記ビタミン類をミオイノシトールとした構成とした。この場合、上記ミオイノシトールを5〜20mg含有したことが有効である。ラン科植物の培養ではビタミン類が培養を促進させる効果があることが多く、その選択は重要であるが、上記のビタミンを添加することにより、発芽及び継代培養中、植物体にビタミンがバランス良く有効に作用する。

0011

そして、必要に応じ、上記植物活性剤は、粗タンパク質0.05〜0.15重量%、粗脂肪0.3〜0.5重量%、無機質として、Na35〜45mg/l、Ca30〜35mg/l、Fe1.5〜2.0mg/l、Mg3.0〜4.0mg/l、Si7.0〜8.0mg/l、N90〜100mg/lを備えている。植物活性剤の添加により、栄養バランスが良く、発芽の促進させる効果を発揮させる。そして、必要に応じ、上記ゲル化剤としてゲランガムを用いた構成とした。このことにより、発芽及び発育に効果がある。

0012

また、必要に応じ、上記水溶液中に添加物として活性炭を含有した構成とした。活性炭を添加することにより、発芽後の継代培養中において植物体の褐変の発生を抑えるので褐変死させることなく生育させて生存率を高めることができる。この場合、上記活性炭を0.5〜3g含有したことが有効である。

0013

また、本発明のアツモリソウ属植物の培養方法は、アツモリソウ属植物を種子から培養するアツモリソウ属植物の培養方法において、選別して使用する種子を得る種子選別工程と、得られた種子を培養液を用いて無菌的に固形培地に播種する無菌播種工程と、播種後、発芽するまで培養する発芽培養工程と、発芽し器官分化したものを培地を替えて継代培養する継代培養工程と、培養苗がある一定の大きさに生育したら低温の環境下にさらす低温処理工程と、低温処理終了後、用土に植え替える鉢上げ工程とを備えた構成とした。これにより、培地に種子を播種した後、プロトコームが形成され発芽率が驚異的に向上する。培地に種子を播種して無菌播種から栄養、温度、湿度等の条件を理想的な状態で生育して苗まで成長させたアツモリソウ属植物を自然の栽培環境に移す鉢上げ前に低温処理が行なわれ、苗が環境の変化に対して夫になり順化が順調に行なわれる。

0014

そして、必要に応じ、上記培養液を培地とは異なる組成の培養液とする構成とした。このことにより、培地の成分による要素だけでなく、培養液の成分の要素も加わるので栄養が豊富となり、発芽を促進させることができる。また、必要に応じ、上記発芽培養工程において、播種した培地を暗黒下において培養する構成とした。アツモリソウ属植物は光に敏感で、光に当てると褐変が発生して褐変死してしまう。また、必要に応じ、上記発芽培養工程において、播種した培地を10〜25℃の環境において培養する構成とした。アツモリソウ属植物の培養において最適な温度であり、25℃より高いと褐変が発生して褐変死してしまう。また、10℃に満たない温度では、生育が遅く、褐変も発生して褐変死してしまう。

0015

そして、必要に応じ、上記継代培養工程において、培地に培養液を添加する構成とした。種子や発芽直後の植物体及び幼い苗において乾燥に耐えることができず死んでしまう危険性が高いが、培養液を添加することにより乾燥することなく、また、液体のため栄養素を吸収し易く、更には発芽後の培養中の褐変死の発生を抑えて生存率を高めることができる。また、必要に応じ、上記継代培養工程において、培地を10〜25℃の環境において培養する構成とした。アツモリソウ属植物の培養において最適な温度であり、25℃より高いと褐変が発生して褐変死してしまう。また、10℃に満たない温度では、生育が遅く、褐変も発生して褐変死してしまう。

0016

そして、必要に応じ、上記低温処理工程において、低温処理期間を30〜90日とした構成とした。この場合、望ましくは、上記低温処理工程において、低温処理期間を60日±5日としたことが有効である。アツモリソウ属植物において、培養によって順調に生育した苗を自然環境においても生育させるために低温下に置く春化処理が90日以上必要とされている。しかし、本発明の培養方法では、60日±5日程度の低温処理工程において春化処理と同様の効果が得られる。

0017

更にまた、必要に応じ、上記低温処理工程において、低温処理温度を0〜10℃とした構成とした。0℃より低温であると、幼苗が凍り、壊死してしまう。また、10℃より温度が高くなると、低温処理の効果が見られず順調に成長しない。この場合、望ましくは、上記低温処理工程において、低温処理温度を3〜5℃としたことが有効である。

0018

また、この培養方法において用いる培養液は「請求項1〜14」に挙げた培養液が望ましく、同様に培地も「請求項15〜30」に挙げた培地を用いることが望ましい。この場合、発芽率が80%以上になり、発芽後の生存率も70%以上となり、アツモリソウ属植物の大量増殖が可能となり、鉢上げ後の苗を供給できる。

発明を実施するための最良の形態

0019

以下、添付図面に基づいて本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物用培養液,アツモリソウ属植物用培地及びアツモリソウ属植物の培養方法を説明する。アツモリソウ属植物用培養液及びアツモリソウ属植物用培地はアツモリソウ属植物の培養方法において用いられるので、この培養方法の説明において説明する。

0020

本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養方法は、図1乃至3に示すように、選別して使用する種子を得る種子選別工程(1)と、得られた種子を無菌的に固形培地に播種する無菌播種工程(2)と、播種後、発芽するまで培養する発芽培養工程(3)と、発芽し器官分化したものを培地を替えて継代培養する継代培養工程(4)と、培養苗がある一定の大きさに生育したら低温の環境下にさらす低温処理工程(5)と、低温処理終了後、用土に植え替える鉢上げ工程(6)からなる。以下に各工程を詳しく説明する。

0021

(1)種子選別工程
先ず、無菌播種に使用する培養に適した優良なアツモリソウの種子を以下のようにして得る。
人工交配
開花から30日以内、望ましくは開花から1週間以内までの花を選び花粉採取して交配先となる株の受精先に花粉を受粉させ交配を完了させる。
さやの保護
人工交配終了後、交配が確認できたら直ちに病害虫による被害から防ぐためさや全体を袋で覆う。また、袋で覆わない場合には、定期的に殺菌剤をさやにかける。
さやの採取時期
人工交配終了後、40〜120日までのさや、望ましくは、60〜80日のさやを採取し無菌播種の材料として使用する。ここで、アツモリソウでは胚の形成が始まる交配後60日前後の種子が最も発芽率が高く、望ましい。交配後40日に満たないと胚が充分に形成されておらず、交配後80日を過ぎると発芽率が低下する。
種子選別
採取したさやを殺菌処理した後、さやから種子を取出し、顕微鏡にて種子内部にある胚を観察し選別する。種子は、発芽能力が高いものの特徴である胚の形状が丸みを帯びていて、かつ、胚の色が白又は黄色のものを選ぶ。胚の色が白又は黄色のものは、発芽抑制物質の影響を受けていないため、発芽し易い。逆に胚の形状が細く、米状のものは発芽能力が低い。また、胚の色が色又は黒っぽいものは発芽能力が極めて低い。

0022

(2)無菌播種工程
選別した種子を培養液に入れて、無菌的に発芽の際に用いる発芽用培地に播種する。培養液中の種子を培地に流し入れて種子が培地全体に広がるように拡散する。このときフラスコ内の種子は約300〜1000個である。

0023

ここで用いる培養液は、本発明の実施の形態に係る培養液であり、サッカロース0〜10gと、木酢液0.1〜2.0mlと、ビタミン類として塩酸チアミン1〜10mg,ニコチン酸1〜5mg,塩酸ピリドキシン1〜10mg及びミオイノシトール5〜20mgと、植物活性剤0.1〜1.0mlとを用い、これらの添加物に蒸留水を加え、0.1Nの塩酸や0.1Nの水酸化ナトリウムを用いてpH5.5〜6.0に調整した培養液1000mlを得た。その後、オートクレーブ高圧殺菌し、無菌室内放冷する。ここで、植物活性剤としては、例えば、市販されている商品であるHB101(株式会社フローラ社製)やメネデール(株式会社メネデール化学研究所社製)が用いられる。植物活性剤は、粗タンパク質0.05〜0.15重量%、粗脂肪0.3〜0.5重量%、無機質として、Na35〜45mg/l、Ca30〜35mg/l、Fe1.5〜2.0mg/l、Mg3.0〜4.0mg/l、Si7.0〜8.0mg/l、N90〜100mg/lを備えている。例えば、植物活性剤としては、市販されている商品であるHB101(株式会社フローラ社製)やメネデール(株式会社メネデール化学研究所社製)が用いられる。

0024

また、ここで用いる培地は、本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物用培地であり、窒素が6.5,リン酸が6及びカリウムが19の比率(重量%)で含有されている肥料(市販されている商品名「ハイポネックス」(株式会社ハイポネックス社製))1〜3gと、ペプトン1〜3gと、サッカロース10〜30gと、ビタミン類として塩酸チアミン5〜20mg,ニコチン酸1〜10mg,塩酸ピリドキシン5〜20mg及びミオイノシトール5〜20mgと、植物活性剤0.1〜1.0mlとを用い、これらの添加物に蒸留水を加え、0.1Nの塩酸や0.1Nの水酸化ナトリウムを用いてpH5.5〜6.0に調整して1000mlの水溶液を得る。そして、この水溶液に、ゲル化剤としてゲランガム3〜4gを加え、その後、攪拌しながら加熱してゲランガムを溶かし、フラスコに約50mlずつ分注し、オートクレーブで高圧殺菌して、無菌室内で放冷して、凝固させる。植物活性剤としては、上述したと同様の成分を有し、例えば、市販されている商品であるHB101(株式会社フローラ社製)やメネデール(株式会社メネデール化学研究所社製)が用いられる。尚、培地に含まれるビタミン類は上述した培養液の2倍の重量となる。

0025

(3)発芽培養工程
無菌播種終了後、室温を15〜20℃に設定し暗黒下に置き培養を開始する。尚、培養を暗黒下で行なうのは、光に当たると種子が褐変して死滅してしまうためである。播種後、約2〜3カ月で、PLB(プロトコーム)が見られ発芽する。その後、器官分化が見られるまで、培養する。
(4)継代培養工程
発芽し器官分化したものを培地を替えて継代培養する。ここで用いる培地は、発芽用培地に活性炭を0.5〜3.0g加えた組成の継代培養用培地である。活性炭を加えた継代培養用培地にピンセット使い移して、培地上に培養液を培地50ml中に約0.5〜1.0ml添加した後、暗黒下に置き、室温を10〜25℃に設定して培養を開始する。継代培養は1〜6カ月行なう。この間、培地の植え替えを上記と同様に1〜5回行ない、その際に培養液も添加する。ここで、培養苗の生育を進めたいとき、茎葉部の発生が見られたらごくわずかな光(光量は、0〜2000lux(ルクス))を照射しても差支えない。

0026

(5)低温処理工程
培養苗が約10mm以上に成長したら、温度を3〜5℃に設定して60日以上、低温の環境に置く。アツモリソウ属植物において、培養によって順調に生育した苗を自然環境においても生育させるために低温下に置く春化処理が90日以上必要とされている。しかし、本発明の培養方法では、60日以上の低温処理工程において90日以上の春化処理と同様の効果が得られる。
(6)鉢上げ工程
低温処理終了後、用土に植え替えて鉢上げする。鉢上げは、培地上で生育した培養苗をピンセットを使い取り出し、水又は殺菌剤を加えた水に浸けて苗を充分に湿らせる。次に、予め準備したに用土を加え、その土中に深さ約1cm程度の穴をつくり苗全体が埋没するように(植物体を外に出さないようにする)植えつけて鉢上げする。栽培開始後、土から植物体が伸長し、生育を開始する。

0027

従って、この実施の形態に係る培養方法によれば、発芽率が著しく高く、また、培養中に褐変の発生を抑えて生育させることができるので生存率も高くアツモリソウ属植物の大量増殖を図ることができる。また、鉢上げ工程をに行なうように培養を行なうと、アツモリソウの生育サイクル季節が一致して鉢上げ後もアツモリソウを順調に成長させることができる。

0028

(A)培養液(「遠野培養液」と命名)
本発明の実施例に係る培養液は、図4に示すように、サッカロース10gと、木酢液1.0〜2.0mlと、ビタミン類として塩酸チアミン5mg,ニコチン酸2.5mg,塩酸ピリドキシン5mg及びミオイノシトール10mgとを用い、これらの添加物に蒸留水を加えるとともに、植物活性剤としてのHB101(株式会社フローラ社製)を0.1〜1.0ml適宜に滴下し、更に、0.1Nの塩酸や0.1Nの水酸化ナトリウムを用いてpH5.65に調整して、1000mlの培養液を得た。この植物活性剤としてのHB101は、粗タンパク質0.1%、粗脂肪0.4%、無機質として、Na41mg/l、Ca33mg/l、Fe1.8mg/l、Mg3.3mg/l、Si7.4mg/l、N97mg/lを備えている。水素イオン濃度原液)は、pH4.0である。その後、オートクレーブで高圧殺菌し、無菌室内で放冷した。

0029

(B)発芽用培地(「遠野培地」と命名)
本発明の実施例に係る培地は、図5に示すように、肥料として「ハイポネックス」(株式会社ハイポネックス社製)を用いた。ここで、「ハイポネックス」は、窒素が6.5,リン酸が6及びカリウムが19の比率(重量%)で含有されている肥料である。そして、「ハイポネックス」2gと、ペプトン2gと、サッカロース20gと、ビタミン類として塩酸チアミン10mg,ニコチン酸5mg,塩酸ピリドキシン10mg及びミオイノシトール20mgとを用い、これらの添加物に蒸留水を加えるとともに、植物活性剤としてのHB101(株式会社フローラ社製)0.1〜1.0mlを適宜に滴下し、更に、0.1Nの塩酸及び0.1Nの水酸化ナトリウムを用いてpH5.65に調整して、1000mlの水溶液を得た。この状態の水溶液に、ゲル化剤としてゲランガム3〜4gを、攪拌しながら加熱して溶かし、フラスコに約50mlずつ分注し、オートクレーブで高圧殺菌して、無菌室内で放冷して、凝固させる。
(C)継代培養用培地(「遠野培地」と命名)
本発明の実施例に係る継代培養用培地は、上記水溶液中に添加物として活性炭を0.5〜3.0g含有させた組成のものを用いた。

0030

培養方法は、上述した実施の形態に従って行なった。尚、継代培養工程(4)において、継代培養は1〜6カ月で、培地の植え替えを1〜5回行ない、培養苗が約10mm以上に成長させた。そして茎葉部が発生しても光を照射することなく培養した。また、低温処理工程(5)においては、苗を温度を3〜5℃に設定して暗所に60日間、低温の環境に置いた。

0031

(I−I)発芽用培地の実験
先ず、本発明の実施例に係る培地(B)について比較例とともに以下の実験をした。発芽用培地の比較例として、MS培地,ハイポネックス培地,MT培地,ナドソンB培地,ナドソンC培地,リングマイヤー・スクーグ培地,ホワイト培地,ベーシンベント培地,ウインバー培地,Burgeft.H.Eg−1培地,カーチス.J培地,山田培地,バナナ蜂蜜(唐澤)培地,フイツシュ・ソリュブル培地,洋ラン用タマネギ培地,GS培地,京都ソリューション培地,Burgeft N3 F培地,ガンボーグB5培地,ハーバース培地の計20種類の培地を用いた。これらの培地に、アツモリソウの種子を無菌播種した。尚、播種の際に種子の拡散のために用いたのは滅菌水のみであり、他の工程は、上述した培養方法と同様である。結果を図6に示す。この結果、本発明の培地は調整が比較的簡易に行なうことができ、発芽,生育ともに良好であった。

0032

(I−II)発芽用培地及び継代培養用培地の実験
各培地による発芽と生育の違いを調べるため、本発明の実施例に係る培地(B)及び(C)について比較例とともに以下の実験をした。発芽用培地及び継代培養用培地の比較例として、本発明の培地の成分を1/2にして作成した培地(本発明の培地の濃度の1/2の培地),ハーバース培地,MT培地,MS培地の計4種類の培地にアツモリソウの種子を無菌播種した。尚、播種用培地、継代培養用培地以外は、上述した培養方法と同様に行なった。そして、播種から2カ月後,4カ月後,6カ月後の生育した苗の高さを測定した。結果を図7及び8に示す。本発明の培地(B)及び(C)を順に使用した最終の発芽率は82.6%と最も高く、本発明の培地の成分を1/2にして作成した培地の発芽率は71.0%,ハーバース培地の発芽率は70.5%,MT培地の発芽率は1.4%,MS培地の発芽率は0.6%であった。また、図8において、播種から2カ月後,4カ月後,6カ月後の生育した苗の高さは、苗20〜30個の平均の値である。この結果、本発明の培地で培養したアツモリソウの苗は播種から6カ月後に平均値で50mmとなり、他の培地で培養した苗の平均値より生育したことが分かる。

0033

(II)培養液の実験
各培養液による発芽と生育の違いを調べるため、本発明の実施例に係る培養液について比較例とともに以下の実験をした。
滅菌水とサッカロースにHB101を添加した液,滅菌水とサッカロースに木酢液を添加した液,滅菌水とサッカロースにHB101と木酢液を添加した液,滅菌水とサッカロースに木酢液とビタミンを添加した液の培養液を用いて、培養を行なった。また、の液においてHB101の添加濃度を変えた液でも調べてみた。尚、培養液以外は、上述した培養方法と同様に行なった。結果を図9に示す。この結果から、滅菌水とサッカロースにHB101と木酢液とビタミンを添加した本発明の培養液が最も褐変の発生を抑え、生育が良好であった。

0034

(III)培養温度の実験
各培養温度による影響を調べるため、本発明の実施例に係る培養方法の発芽培養工程(3)において、培養温度を変えた比較例として以下の実験をした。培養は、10℃,15℃,20℃,25℃,30℃の各温度で行ない、各温度の試験数は50個として、培養中に褐変が発生して発芽しない割合(褐変死率)を調べた。尚、培養温度以外は、上述した培養方法と同様に行なった。結果は図10に示すように、25℃の培養では約70%、30℃の培養では約95%が褐変して死んでしまい、播種後の培養温度は10〜20℃で行なうことが最適であることが分かった。

0035

(IV−I)低温処理の効果を調べる実験
低温処理の効果を調べるため、本発明の実施例に係る培養方法と低温処理を行なわない比較例として以下の実験をした。低温処理を行なわないで20℃の暗所で60日間置いて鉢上げした苗と20℃の明所で60日間置いて鉢上げした苗の生存率を調べた。実施例において低温処理は、苗を3〜5℃の暗所で60日間であるが、この低温処理工程において明所においた場合の苗の鉢上げした後の生存率及びその後の生育も調べた。尚、低温処理以外の条件は上述した培養方法と同様に行なった。低温処理を行なわないで鉢上げしたときの苗の生存率の結果は、図11に示すように、暗所での生存率が7%でかなり低く、明所でも13%で生存率が低い。これに対し、低温処理したものは、暗所、明所ともに80%以上の高い生存率であり、わずかに明所での生存率が高かった。また、低温処理の暗所と明所のその後の生育の結果は、図12に示すように、暗所は明所と比較して生育は劣るが褐変は発生せず、明所では、茎葉部の色が薄くなったが生育は進んだ。しかし明所ではわずかに褐変が発生した。

0036

(IV−II)低温処理を行なうアツモリソウの成長状態の実験
次に、低温処理を行なうアツモリソウの成長状態を調べるために、本発明の実施例に係る培養方法と低温処理を行なわない比較例として以下の実験をした。実施例では、苗が10mm以上に成長した状態で低温処理を行なった。比較例では、発芽直後のプロトコーム,苗が5mm程度に成長した状態で低温処理を行なった後の状態及びその後の生育を調べた。低温処理以外の条件は上述した培養方法と同様に行なった。結果は図12に示すように、プロトコームでは生育が止まり褐変死したものが見られ、5mm程度の植物体では生育に変化が見られず、10mm以上の植物体(苗)では生育が順調に進んだ。

0037

(IV−III)低温処理を行なう期間の実験
次に、低温処理を行なう期間を調べるために、本発明の実施例に係る培養方法と低温処理を行なわない比較例として以下の実験をした。本発明の実施例では60日間低温処理を行なったが、比較例として、15日,30日,60日,90日の各期間、約10mmの植物体(苗)を暗所で3〜5℃で低温処理を行なった。結果は図13に示すように、60日間,90日間の低温処理を行なった苗の生育が良好であったことから、60日以上行なうと低温処理の効果が見られる。

0038

上記低温処理に関する各実験から、低温処理は10mm以上に生育した苗を3〜5℃で60日以上行なうことが最適であり、明るさは、暗所、明所どちらでも構わないということが分かった。

0039

尚、上記実施の形態において、培地に植物活性剤を添加したが、植物活性剤を添加することなく、ポテトキューブを用いても良い。

発明の効果

0040

以上説明したように、本発明のアツモリソウ属植物用培養液によれば、アツモリソウ属植物を種子から培養する際に用いられ水に添加物を添加してなるアツモリソウ属植物用培養液において、培養液1000ml中に、添加物として、木酢液0.1〜2.0mlと、ビタミン類8〜45mgと、植物活性剤0.1〜1.0mlとを含有した構成としたことから、液体のため種子が栄養分を吸収し易くプロトコームを形成させて発芽率を向上させることができ、また、発芽後の継代培養中に添加することにより植物体の褐変の発生を抑えるので褐変死させることなく、更に植物体が栄養分を吸収し易いため有効に作用し、順調に生育させて生存率を高めることができる。

0041

そして、培養液をpH5.5〜6.0とした場合には、発芽及び培養の環境を最適にでき、発芽率を向上させ生育を良好にすることができる。また、添加物として糖類を含有した場合には、種子に栄養分を与えることができ発芽率が向上する。この場合、培養液1000ml中に糖類を1〜10g含有したことが有効である。そしてまた、糖類をサッカロースとし、ビタミン類において、塩酸チアミンを1〜10mg、ニコチン酸を1〜5mg、塩酸ピリドキシンを1〜10mg、ミオイノシトールを5〜20mg含有した場合には、アツモリソウ属植物の発芽率を向上させ、生育を促進させることができる。そして、植物活性剤が、粗タンパク質0.05〜0.15重量%、粗脂肪0.3〜0.5重量%、無機質として、Na35〜45mg/l、Ca30〜35mg/l、Fe1.5〜2.0mg/l、Mg3.0〜4.0mg/l、Si7.0〜8.0mg/l、N90〜100mg/lを備えている場合には、バランスが良く、発芽促進をさせることができる。

0042

そして、本発明のアツモリソウ属植物用培地によれば、アツモリソウ属植物を種子から培養する際に用いられ水に添加物とゲル化剤を添加してゲル状にしたアツモリソウ属植物用培地において、窒素,リン及びカリウムを含有する肥料1〜3gと、ぺプトン1〜3gと、糖類10〜30gと、植物活性剤0.2〜1.0mlと、ビタミン類16〜70mgとを用い、これらの添加物を水に混合して1000mlとした水溶液をゲル状としたので、この培地を無菌播種に用いることにより、プロトコームを形成させて発芽率を向上させることができる。また、植物活性剤の替わりにポテトキューブを培地50ml中0.5〜1.5g添加する場合には、ポテトの養分を種子に与えることができる。そして、培地をpH5.5〜6.0とした場合には、発芽及び培養の環境を最適にでき、発芽率の向上と生育を良好にすることができる。

0043

そしてまた、糖類をサッカロースとし、ビタミン類において、塩酸チアミンを5〜20mg、ニコチン酸を1〜10mg、塩酸ピリドキシンを5〜20mg、ミオイノシトールを5〜20mg含有した場合には、アツモリソウ属植物の発芽率を向上させ、生育を促進させることができる。そして、植物活性剤が、粗タンパク質0.05〜0.15重量%、粗脂肪0.3〜0.5重量%、無機質として、Na35〜45mg/l、Ca30〜35mg/l、Fe1.5〜2.0mg/l、Mg3.0〜4.0mg/l、Si7.0〜8.0mg/l、N90〜100mg/lを備えている場合には、栄養バランスが良く、発芽を促進させることができる。更にまた、活性炭を添加した場合には、発芽後の継代培養において植物体の褐変の発生を抑えるので褐変死させることなく生育させて生存率を高めることができる。

0044

そして、本発明のアツモリソウ属植物の培養方法によれば、選別して使用する種子を得る種子選別工程と、得られた種子を培養液に混合して無菌的に固形培地に播種する無菌播種工程と、播種後、発芽するまで培養する発芽培養工程と、発芽培養工程において発芽し器官分化したものを培地を替えて継代培養する継代培養工程と、継代培養工程で生育した培養苗を低温の環境下にさらす低温処理工程と、低温処理終了後、用土に植え替える鉢上げ工程とを備えたので、プロトコームを形成させることができ発芽率が驚異的に向上する。

0045

そして、培養液を培地とは異なる組成の培養液とした場合には、培地の成分による要素だけでなく、培養液の成分の要素も加わり、種子の発芽に刺激を与え発芽を促進させることができる。また、発芽培養工程において、播種した培地を暗黒下において培養する場合には、褐変の発生による種子の死滅を抑えるので、発芽率を向上させることができる。また、発芽培養工程において、播種した培地を10〜25℃の環境において培養する場合には、褐変の発生による種子の死滅を抑えるので、発芽率を向上させることができる。

0046

そして、継代培養工程において、培地に培養液を添加する場合には、発芽後の培養中の褐変死の発生を抑えて生存率を高めることができる。また、継代培養工程において、培地を10〜25℃の環境において培養する場合には、褐変の発生による死滅を抑えるので、順調に生育させることができる。

0047

更にまた、低温処理工程において、低温処理温度を0〜10℃とした場合には0℃より低温であると、幼苗が凍り、壊死してしまう。また、10℃より温度が高くなると、順調に成長しない。この場合、望ましくは、低温処理工程において、低温処理温度を3〜5℃としたことが有効である。そして、低温処理工程において、低温処理期間を30〜90日とした場合には、従来90日以上必要とされていた期間を短縮しても、苗が環境の変化に対して丈夫になり順化が順調に行なわれ、生存率が向上する。更には、アツモリソウを大量増殖させることができ、苗を自然環境に供給することができる。

図面の簡単な説明

0048

図1本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養方法を示す工程図である。
図2本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養方法を示す工程図である。
図3本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養方法を示す工程図である。
図4本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物用培養液の組成を示す表図である。
図5本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物用培地の組成を示す表図である。
図6本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物用培地に係り他の培地での発芽を比較した結果を示す表図である。
図7本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物用培地に係り他の培地での発芽率を示す図である。
図8本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物用培地に係り他の培地で培養した苗の生育状況を示す図である。
図9本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養液に係り他の培養液による生育状況を示す図である。
図10本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養方法に係り培養温度による褐変の発生状況を示す図である。
図11本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養方法に係り、低温処理の効果を示す図である。
図12本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養方法に係り、低温処理を行なう時期を変えた場合の生育状況を示す図である。
図13本発明の実施の形態に係るアツモリソウ属植物の培養方法に係り、低温処理を行なう期間を変えた場合の生育状況を示す図である。

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